CN103025357A - 选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类的组合物和方法 - Google Patents

选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种缀合物，其包含(i)核酸，其与靶标核酸序列互补并且其表达抑制或者减少靶标核酸的表达，和(ii)选择性试剂，其能够高亲和力地结合至神经递质转运体。本发明缀合物能用于将核酸递送至感兴趣的细胞，并因此用于治疗疾病，其需要下调由靶标核酸编码的蛋白，以及用于将显像剂递送至细胞的诊断目的。

Description

选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类的组合物和方法
发明领域
本发明涉及缀合物，其包含对感兴趣的靶标特异的核酸和基团，所述基团是通过其对所述细胞表面的神经递质转运体的亲和性的方式将核酸递送至中枢神经系统内特定的细胞的基团。
背景技术
核酸的使用已证明对细胞状态的改变是有效的。脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)引入到细胞中可以用于上调或下调细胞中的特定基因的表达，从而，影响一个或多个生化通路。在用于改变细胞生理学的基于核酸的技术中，RNA干扰(RNAi)是对多种生物中转录后水平上调控基因表达的总称。RNAi基因沉默可以用同源短(21-23bp)dsRNA片段来完成，后者被称为短干扰RNA或“siRNA”。当长的dsRNA被引入细胞系后，细胞酶Dicer将其切割成为短干扰RNA(siRNA)分子。这种短干扰RNA分子现在称为向导RNA。向导RNA将引导RNA-诱导-沉默复合物(RISC)至同源靶标mRNA。一旦其形成同源mRNA序列的杂交结构，RISC将切割mRNA。结果，mRNA编码的蛋白质将不再被产生，从而引起基因沉默。RNA干扰指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异的转录后基因沉默的过程。然而，发展基于RNAi的脑病理治疗途径的主要障碍在于血脑屏障(BBB)。脑通过两种屏障体系的存在而保护免受潜在的毒性物质伤害：血脑屏障(BBB)和血脑脊髓液屏障(BCSFB)。BBB被认为是摄入血清配体的主要途径，因为其表面积比BCSFB的表面积大大约5000倍。组成BBB的脑内皮，表现了利用针对CNS的多种病症的潜在药物的主要障碍。作为基本规则，只有小亲脂分子可以通过BBB，即，从循环系统的血液到脑。具有更大尺寸或更高疏水性的很多药物在动物研究中对治疗CNS紊乱显示出有希望的结果。
除了直接脑内给药，已经描述了不同的策略以通过全身给药RNA干扰分子实现CNS中的基因沉默。例如，库马尔(Kumar)等人(自然，2007年，第448卷：第39-44页)(Nature，2007，448：39-44)已经描述了siRNA与源自狂犬病毒糖蛋白的肽的缀合物，包含九聚精氨酸，以及它们静脉注射后在脑内沉默基因表达的能力。夏(Xia)等人(药学研究，2007年，第24卷：第2309-2316页)(Pharmaceutical Research，2007，24：2309-2316)已经描述了包含生物素化的siRNA的缀合物和包含抗生物素蛋白-抗-转铁蛋白受体抗体的缀合物，其能够在全身递送后在中枢神经系统中沉默基因表达。WO200979790描述了包含siRNA和总称为Angiopeps的一系列肽的缀合物，其能够通过受体介导的转胞吞作用(transcytosis)用低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(LRP-1)来穿过血脑屏障，并且其允许将全身给药的包含所述肽的缀合物递送至CNS。WO2007107789描述了能够引起RNA干扰的化合物的用途，其对CNS中存在的靶标是特异性的，并且通过利用鼻内给药而递送至CNS。
然而，虽然所有这些系统均允许将全身给药的siRNA递送至CNS，它们不允许递送至脑内的特定细胞类型。事实上，迄今尚没有描述的给药系统能允许将治疗性试剂递送至CNS内的特定细胞类型。递送具有对中枢神经系统的已知特异性的siRNA的可能性将对治疗由给定基因的非期望活性/表达引起的疾病很有用，包括抑郁、认知性障碍、帕金森病、阿尔茨海默病，等等。抑郁被认为是中枢神经系统的疾病。抑郁同时是生物学和遗传学的异源障碍，并具有表现在心理、行为和生理水平的症状。另外，抑郁显示了与焦虑障碍高度的共发性，焦虑自身(典型地预期性焦虑)是抑郁患者中的最流行症状之一。实际上，大多数焦虑障碍也用抗抑郁药物来治疗。
首先用于治疗主要的抑郁的药物是丙咪嗪型的三环类抗抑郁药(TCA)和单胺氧化酶抑制剂(MAOI)。这些药物发现于1950年代晚期并被证明是有效，然而它们表现出多种严重的副作用，这导致研发新的药物，例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)或选择性5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)。
TCA类(和更晚的SSRI和SNRI)抑制再摄取单胺5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NA)进入突触前细胞，增加突触间隙内5-HT的水平，从而增强其在突触后受体上的活性，这种发现导致抑郁的病原学的最初假设，即，它由脑中这些单胺能神经递质系统活性的不足而引起。从那时起，所有市场上的抗抑郁药物均靶向于5-羟色胺能和/或去甲肾上腺素能转运体或受体。
5-HT受体位于动物中神经细胞和其它类型细胞的细胞膜上。除了5-HT3受体，所有其它5-HT受体都是G蛋白偶联的七跨膜(或七螺旋)受体，其激活细胞内第二信使级联。一些鉴别的5-HT受体包括5-HT1A和5-HT1B/1D受体，其表达于突触前在5-羟色胺神经元(自身受体)和神经元突触后定位于5-HT神经末梢。更直接与SSRI的抗抑郁效果相连的5-HT受体是5-HT1A受体。
新的抗抑郁药物目前已经被注册，其作用机理是基于相对选择性的去甲肾上腺素再摄取抑制(NARI)，例如瑞波西汀，或在双重阻断(SNRI)，例如文拉法辛或度洛西汀。其它药物，例如萘法唑酮、曲拉唑酮或米他扎品对单胺转运体具有较弱活性并反而阻断单胺能受体。
然而，尽管SSRI商业上成功，这些化合物具有两个主要的限制：1)仅60％的患者表现出治疗性应答(降低至基线严重性的一半)，和2)应答仅在数周的连续治疗之后发生。这是由于在突触前神经元中发生的负反馈机制。简而言之，5-羟色胺再摄取的阻断诱导的高5-羟色胺水平将不仅激活突触后5-羟色胺受体，也激活突触前的自身受体，其作为细胞的反馈传感器。5-HT引起的5-HT1A自身受体活化(也称为突触前5-HT1A受体或突触前5-HT1AR)，或选择性激动剂，抑制细胞放电和刺激依赖性5-HT释放，反之5-HT1B受体控制在末端水平的5-HT合成和释放。5-HT1A和5-HT1B受体两者也位于5-HT神经末梢突触后神经元上，主要在皮质边缘区。舍曲林(SERT，一种SSRI)的再摄取阻断产生的细胞外5-HT的增加活化了中脑中缝核中的突触前5-HT受体，抑制细胞放电和末端释放，该效果削弱了再摄取阻断产生的细胞外5-HT增加。5-HT1B自身受体在自身水平上施加了类似的负反馈。重复给药SSRI之后，5-HT1A自身受体脱敏，其使得产5-羟色胺神经元能够恢复细胞放电并导致细胞外5-HT的增加，至单一治疗之后能看到的更高水平。这些(缓慢进行的)脑组织的神经生理学适应不仅是为什么通常多个星期的连续SSRI使用是抗抑郁效果的完全出现所需要的原因，也是为什么增加的焦虑是使用最初几天或星期内的常见副作用的原因。已知这些5-HT1A和/或5-HT1B受体拮抗剂的负反馈机制的阻断加强了SSRI产生的5-HT增加，从而，可能导致SSRI的临床效果的加速。
在SSRI给药期间加速由阻断突触前5-HT1A受体的活性引起的抗抑郁应答的药理学策略用(±)吲哚洛尔来测试。该化合物是β1-2肾上腺素能受体拮抗剂并具有推定的对5-HT1A受体的拮抗活性。(±)吲哚洛尔拮抗由中枢5-HT1A受体的活性介导的多种作用，例如低体温或激素分泌。通常，吲哚洛尔加入SSRI加速了抗抑郁应答。然而，尽管吲哚洛尔已经在一些研究中显示在临床剂量下在人脑中部分地占用5-HT1A受体，其它研究发现了低占用。另外，不能忘了5-HT1A受体位于5-羟色胺能神经元和5-羟色胺能神经元的突触后神经元。事实上，一个重要关系是这些试剂对突触前相对于突触后5-HT1A受体的选择性的缺失：突触后受体的完全阻断可能取消通过前脑中抗抑郁药物产生的5-HT1A受体的增加的传输。
因此，尽管开发抗抑郁药有所进展，仍然需要特异性作用于突触前5-HT1A受体的可选择的化合物。帕金森病(PD)是中枢神经系统退化病症，其通常削弱患者的运动技能，说话，和其它功能(奥兰诺(Olanow))。帕金森病的症状由黑质致密区(SNpc)的多巴胺能细胞活性大为降低而导致(奥兰诺，道森(Olanow，Dawson))。这些神经元投射至纹状体，其损失导致调节运动的基底神经节中神经回路的活性的改变，本质上是直接通路的抑制和间接通路的激发。直接通路促进运动，而间接通路抑制运动，从而这些细胞的损失导致运动功能衰退的运动病症。多巴胺的缺乏导致丘脑腹前核的抑制增加，其发出编码特性的兴奋性投射至运动皮层，从而导致运动功能衰退。
PD的特征是SNpc中的多巴胺能神经元的进行性损失和称为路易体(LB)的细胞内包涵体的存在。神经化学上，PD标记为线粒体复合物I功能障碍和氧化应激指数的增加。数种PD发病机理已经被提出，包括氧化和硝化应激，线粒体功能障碍，蛋白错误折叠和聚集，和细胞凋亡。PD通常是偶发的，但是一些PD病例已经显示出是家族性的。鉴别的第一个家族性的PD基因为α-突触核蛋白(α-syn)，其事实上是所有PD患者中LB的主要组分。α-突触核蛋白的常规功能尚不明确。α-突触核蛋白可以连接至脂类，并在神经元中很可能通过脂筏与突触前囊泡和质膜相联。α-突触核蛋白的沉积的病理型被凝集并显示比正常蛋白更低的溶解性。已经描述了三点突变引起家族性PD，但是也报道了SNCA基因的二倍体和三倍体是PD和路易体疾病的原因。从而，即使没有序列突变，α-突触核蛋白剂量也可以是路易体疾病的原因。
α-突触核蛋白影响线粒体并可能诱导细胞凋亡。实际上，有多份证据表明了α-突触核蛋白和氧化损伤之间的紧密联系：突变的α-突触核蛋白的过表达使神经元对氧化应激和多巴胺与复合物I抑制剂引起的损伤致敏，导致体外和体内蛋白碳羰基化和脂类过氧化的增加。反过来，线粒体复合物I的功能障碍与PD的偶发形式相关。复合物I依赖性氧化损伤和缺陷的线粒体功能是PD中神经元退行和细胞死亡的主要原因。从而削弱的线粒体功能和ROS产生增加了线粒体内膜空间的细胞色素c库(pool)水平，当细胞死亡激动剂Bax被活化时，使其快速释放。总而言之，PD的情况是神经元线粒体功能障碍和增加的ROS产生的状况，一方面将增加α-突触核蛋白聚集，另一方面将活化Bax介导的细胞死亡。进一步，α-突触核蛋白聚集从而将增加细胞ROS产生并诱导神经元退化。最广泛使用的PD治疗是各种形式的L-DOPA。然而，只有1-5％的L-DOPA进入多巴胺能神经元。其余的L-DOPA通常在别处代谢为多巴胺，引起多种副作用。Dopa脱羧酶抑制剂像卡比多巴和苄丝肼也用于治疗PD，因为它们有助于预防L-DOPA的代谢，在其到达多巴胺能神经元之前，并且通常作为卡比多巴/左旋多巴和苄丝肼/左旋多巴的组合制剂。另外，多巴胺激动剂适度有效并通过刺激一些多巴胺受体而作用。然而，它们引起多巴胺受体变得逐渐不敏感，从而最后增加症状。
反义途径也可能有用，并且已报道在大鼠和小鼠脑中起作用。该途径基于该想法，即α-突触核蛋白确实对人类CNS功能是不必需的，因为它显示在小鼠中但也许即使蛋白水平的适度降低也足以降低PD进程。
然而，尽管在研发PD疗法中做出的进展，仍然需要能够特异性预防黑质致密区的多巴胺能细胞的活性降低的可选择的化合物。
中脑皮层和中脑边缘多巴胺(DA)系统在包括精神分裂症的多种精神疾病中扮演关键角色。在精神分裂症中脑多巴胺能神经传递的常规增强被药理学证据所建议(西曼和李，1975年；克中斯等人，1976年)(Seeman andLee，1975；Creese et al，1976)。然而，最近的综述显示了皮质下DA传输的极度活跃和活力减退的中脑皮层。传统的(DA D2受体拮抗剂)和非典型的抗精神病药(APD，优选5-HT2A/2C对DA D2受体拮抗剂)治疗阳性(精神病)症状的总体效果是类似的。相反，后来组中的一些试剂，尤其是氯氮平，对治疗阴性症状和认知损伤是优于传统抗精神病药的。该临床特征至少部分与增加中脑皮层通路中的DA释放的能力相关，这是由非典型的-而不是传统-抗精神病药诱导的效果。实际上，最佳的前额叶DA功能对工作记忆和执行功能是至关重要的。
中脑皮层和中脑边缘DA通路中的DA释放由多种因子调节。首先，它依赖于VTA DA神经元的放电模式(紧张型/相位型)。其次，它被胞体树突和末端D2/3自身受体的活性紧密调节，其中的自身受体控制细胞放电和DA释放。最后，DA转运体(DAT)介导的再摄取是确定细胞外DA浓度的衰退动力学的关键机制之一。之前的研究显示了PFC中不同密度的DAT和纹状体。
另外，去甲肾上腺素(NA)轴突可能有助于DA从细胞外脑空间移除，因为NA转运体(NAT)显示对NA和DA相似的亲和力。从而，NAT抑制剂在中间PFC(mPFC)中，相比于尾状核和伏隔核(NAc)，优先增加细胞外DA浓度。因而，来自蓝斑核(LC)神经元的NA轴突可能有助于调节PFC中的细胞外DA浓度，通过摄取或共释放DA。一些研究者已经展示了基于NA-靶标药物(NAT抑制剂加α2-肾上腺素拮抗剂)的新组合治疗对选择性增强中脑皮层DA传输的效果。
然而，仍然需要能够增强中脑皮层DA传输的化合物。
发明概述
本发明人已研发包含对所给靶标基因特异的核酸和神经递质转运体的选择性抑制剂的核酸构建体。这些构建体显示出对递送感兴趣的核酸至表达神经递质转运体的细胞内部是特别地有用。不希望受任何理论的束缚，可以相信神经递质转运体的抑制剂将在表达转运体的细胞的表面上结合相应的神经递质转运体，其反过来转移复合核酸-抑制剂到细胞的内部。因此，如本发明的实施例3所描述的，给予包含对5-羟色胺5-HT1A受体特异的siRNA和特异性5-羟色胺-转运体抑制剂(舍曲林)的构建体导致5-HT1A受体mRNA的减少和响应8-OH-DPAT的体温降低响应(5-羟色胺源性信号的测量)的缺乏，其比从非缀合siRNA中获得的高许多。
本领域技术人员可以理解本发明不限制于用于递送至5-羟色胺能神经元的缀合物。相反地，本发明提供的结果说明了：神经元用来转运神经递质的机制是适当的手段用于促进递送至附着于对所述神经递质转运体显示亲和性的分子上的小分子细胞。
因此，在第一个方面中，本发明涉及缀合物，其包含：
i)至少一种选择性试剂，其特异性结合至一个或多个神经递质转运体，和
ii)至少一种核酸，其能够特异性结合至靶分子，其中所述靶分子在与神经递质转运体相同细胞中被表达。
在第二个方面中，本发明涉及本发明的缀合物用于药物中。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂，其选自选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，和
(ii)寡核苷酸，其能够特异性结合至靶标分子，所述靶标分子选自编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA或者编码5-羟色胺转运体(5-HHT转运体或SERT)的mRNA或者编码5-羟色胺受体1B型(5-HT1B)的mRNA或者编码TREK-1钾通道或Gir-K钾通道的mRNA。
用于治疗或预防抑郁症相关的病症。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或者去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或者5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)，和
(ii)寡核苷酸能够特异性结合至靶标分子，其中靶标分子是编码α-突触核蛋白的mRNA，用于治疗或预防与神经递质囊泡功能损伤和路易体沉积相关的疾病。在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码BAX的mRNA
用于治疗或预防与神经元细胞凋亡和细胞死亡相关的疾病(即，帕金森病和阿尔茨海默病)。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码多巴胺β羟化酶的mRNA或者编码去甲肾上腺素转运体(NET)多巴胺β羟化酶多肽的mRNA
用于治疗或预防去甲肾上腺素能突起上的多巴胺不足相关的疾病，像与痴呆、抑郁和神经变性疾病相关的记忆和认知过程。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码去甲肾上腺素转运体(NET)或去甲肾上腺素转运体(NET)多肽的mRNA
用于治疗或预防去甲肾上腺素能突起上的多巴胺不足相关的疾病，像与痴呆、抑郁和神经变性疾病相关的记忆和认知过程。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)的组，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码Tau的mRNA，用于治疗或预防与tau蛋白上的突变引起的神经变性相关的疾病，像阿尔茨海默病。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)的组，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码亨廷顿蛋白的mRNA，用于治疗或预防由亨廷顿蛋白的改变(基因内部复制)的表达而产生的神经变性疾病。
在进一步的方面中，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，和
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶标分子，其中靶标分子是编码多巴胺β羟化酶的mRNA或编码去甲肾上腺素转运体(NET)的mRNA
用于治疗或预防去甲肾上腺素能突起上的多巴胺不足相关的疾病，像与痴呆、抑郁和神经变性疾病相关的记忆和认知过程。
在另一方面中，本发明涉及缀合物，包含
(i)至少一种选择性试剂，其特异性结合至一个或多个神经递质转运体上，和
(ii)造影剂或标记试剂。
还有另一个方面，本发明涉及包含标记试剂的造影剂的缀合物用作诊断试剂。
本发明的这些和其他目的将在以下的具体说明部分进一步地描述，并且它们不旨在限制本发明。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本领域技术人员通常理解的相同意思。类似或等同于本文所述的那些的方法和材料可以用于本发明的实践中。贯穿整个说明书和权利要求书，词“包含”及其变化不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分，或者步骤。
附图说明
图1.已经接受局部5-HT1AR-靶向-siRNA(裸的或缀合的)至背缝神经核(DRN)的小鼠中(R)-(+)-8-羟基-2-(二-n-丙胺)四氢化萘氢溴酸盐(8-OH-DPAT，选择性5-HT1AR激动剂)诱导的体温降低响应不存在，作为5-HT1AR突触前活性的功能性测量的例子。小鼠接受：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(0.3μg/1μl/2天至DRN)。5-HT1AR敲除(5-HT1AR-KO)小鼠的其它组也做了评价。体温在8-OH-DPAT给药(1mg/kg腹腔注射)之前5分钟和之后15，30，60和120分钟进行评估。数据显示为体温变化的平均值±每组5-7只小鼠的SEM。**p＜0.01分别与载体，ns裸siRNA和ns NLF-siRNA有显著差异，利用重复测量ANOVA(方差分析)，在被试内变量的因子和时间之间进行处理，随后进行多重比较Newman-Keuls检验(纽曼-科伊尔斯检验)。
图2.5-HT1AR-靶向-siRNA(裸的或缀合的)局部注入至背缝神经核(DRN)诱导5-HT1AR蛋白水平的特异性下调。小鼠接受：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(0.3μg/1μl/2天至DRN内)。图柱显示小鼠DRN内结合至5-HT1AR的[3H]-8-OH-DPAT的光密度定量，表达为5-HT1ARfmol/mg组织蛋白的平均值±SEM(每只动物的背缝神经核的3AP水平的2次观察，每组4-5只动物)。*p＜0.05，**p＜0.01与载体、ns裸siRNA和ns NLF-siRNA有显著差异，利用单因素ANOVA，随后进行Newman-Keuls post hoc检验(纽曼-科伊尔斯事后检验)。
图3.脑室内(i.c.v)给药缀合的5-HT1AR-NLF-siRNA导致的选择性5-HT1A自身受体沉默。A)中缝核中5-HT1AR的表达通过原位杂交来评估。小鼠接受单一给药至背侧第三脑室(D3V)的：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(30μg/2.5μl/1天)。a1-a555显示在3个不同的前后(AP)坐标处，与33P-标记的寡核苷酸结合的小鼠中缝核的冠状断面以mm计：离前囟-4.84/-4.96，-4.36/-4.60和-4.24/-4.36(吻尾从左至右)。比例尺，2mm。B)a111-a555中显示的部分的高倍放大。比例尺，500μm。C)柱图显示5-HT1AR-NLF-siRNA诱导的背缝神经核中的5-HT1AR mRNA水平的降低。膜上测量的5-HT1AR mRNA阳性颗粒的光密度定量显示为平均光密度(OD)百分比数值±SEM(n＝4-5只小鼠每组和在背缝神经核的3AP水平的2-4次观察)。**p＜0.01与载体、ns NLF-siRNA和裸5-HT1AR-siRNA有显著差异，利用单因素ANOVA随后Newman-Keuls post hoc检验。
图4.5-HT1AR-NLF-siRNA诱导突触前5-HT1AR的特异性下调，而不在突触后位点。背缝神经核(A)，额叶前皮质(B)和海马区(C)的5-HT1AR蛋白水平通过放射自显影结合利用3[H]-8-OH-DPAT来评估。小鼠接受单一给药至背侧第三脑室(D3V)的：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(30μg/2.5μl/1天)。图柱代表5-HT1AR fmol/mg组织蛋白的平均值±SEM(n＝4-5只小鼠每组和在背缝神经核的3AP水平的2次观察和在额叶前皮质和海马区的左和右位点的2次观察)。*p＜0.05与所有其它处理有显著差异，利用单因素ANOVA随后是Newman-Keuls post hoc检验。
图5.5-羟色胺-5-HT转运体(5-HTT)和5-HT1B受体(5-HT1BR)在背缝神经核的结合水平不被5-HT1AR-siRNA处理所改变。A)背缝神经核中的5-HTT蛋白水平通过放射自显影结合利用3[H]-西酞普兰来评价。B)背缝神经核中的5-HT1BR蛋白水平通过放射自显影结合利用125[I]氰基吲哚洛尔在异丙基肾上腺素存在下阻断β-肾上腺素位点来评价。小鼠接受单一给药至背侧第三脑室
(D3V)的：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(30μg/2.5μl/1天)。柱状图显示：A)5-HTT fmol/mg组织蛋白平均值±SEM和B)平均光密度(OD)百分比数值±SEM(n＝4只小鼠每组和在背缝神经核的3AP水平的2次观察)。
图6.(R)-(+)-8-羟基-2-(二-n-丙胺)四氢化萘氢溴酸盐(8-OH-DPAT，选择性5-HT1AR激动剂)诱导的体温降低响应作为突触前5-HT1AR活性的功能性测量。小鼠接受单一给药至背侧第三脑室(D3V)的：i)载体，ii)无义裸siRNA(ns裸siRNA)，iii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iv)裸5-HT1AR-siRNA或v)5-HT1AR-NLF-siRNA(30μg/2.5μl/1天)。也评价了其它组的5-HT1AR敲除(5-HT1AR-KO)小鼠。体温在8-OH-DPAT给药(1mg/kg腹腔注射)之前5分钟或之后15，30，60和120分钟评价。注意在缀合的5-HT1AR-NLF-siRNA和5-HT1AR-KO小鼠中8-OH-DPAT对体温的影响并不存在。数值显示为体温改变的平均值±来自每组7-10只小鼠的SEM。**p＜0.01分别与载体，ns裸siRNA，ns NLF-siRNA和裸5-HT1AR-siRNA有显著差异，利用重复测量ANOVA，在被试内变量的因子和时间之间进行处理，最后是多重比较Newman-Keuls检验。
图7.(R)-(+)-8-羟基-2-(二-n-丙胺)四氢化萘氢溴酸盐(8-OH-DPAT，0.5mg/kg腹腔注射)全身给药对小鼠中额前皮质(mPFC)中透析液5-HT水平的影响。各组小鼠为：i)载体，ii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iii)5-HT1AR-靶向的NLF-siRNA(5-HT1AR-NLF-siRNA)和iv)5-HT1AR敲除小鼠(5-HT1AR-KO)。以30μg/2.5μl/1天对小鼠注入载体或siRNA，脑室内注射，微透析实验在注入24-48小时后进行。注意到在5-HT1A自身受体下调和5-HT1AR-KO小鼠的mPFC中8-OH-DPAT对降低的5-HT水平的影响并不存在。数据表达为基线的百分比并显示为平均值±SEM(n＝5-9只小鼠/组)。**p＜0.01与载体和ns NLF-siRNA组显著不同，利用重复测量ANOVA，在被试内变量的因子和时间之间进行处理，最后多重比较Newman-Keuls检验。图8.舍曲林(5-羟色胺转运体-5-HTT的选择性抑制剂)对缀合的5-HT1AR-NLF-siRNA递送至5-HT神经元的影响。A)急性舍曲林注射(mg/kg腹腔注射)避免了5-HT1A自身受体通过缀合的5-HT1AR-NLF-siRNA的沉默，而急性8-OHDPAT给药(选择性5-HT1AR激动剂，0.5mg/kg腹腔注射)降低了中额前皮质中的5-HT水平。各组小鼠为：i)载体，ii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iii)5-HT1AR-靶向的NLF-siRNA(5-HT1AR-NLF-siRNA)和iv)5-HT1AR敲除(5-HT1AR-KO)。小鼠在注射siRNA进入D3V(30μg/2.5μl/1天，脑室内注射)的3小时之前接受选择性5-HTT抑制剂，舍曲林(20mg/kg腹腔注射)的急性注射。另外，一组小鼠接受载体腹腔注射和载体进入D3V。在脑室内注射载体或siRNA给药24小时之后进行微透析实验。数据表达为基线的百分比并显示为平均值±SEM(n＝5-8只小鼠/组)。***p＜0.001与对照和5-HT1AR-NLF-siRNA组有显著差异，利用单因素ANOVA，然后是多重比较Newman-Keuls检验。B)在预先用选择性5-HTT抑制剂，舍曲林(20mg/kg腹腔注射)处理的NLF-siRNA小鼠中，8-OH-DPAT给药(1mg/kg腹腔注射)对体温的影响。小鼠组类似于图A中。不像5-HT1AR-NLF-siRNA组，在舍曲林预处理的5-HT1AR-NLF-siRNA小鼠中8-OH-DPAT给药产生了体温降低响应。数值显示为体温改变的平均值±来自每组6-10只小鼠的SEM。***p＜0.001利用双因素ANOVA然后是多重比较Newman-Keuls检验。
图9.急性氟西汀(5-羟色胺转运体-5-HTT的选择性抑制剂，20mg/kg腹腔注射)给药对小鼠中额前皮质(mPFC)中透析液5-HT水平的影响。各组小鼠为：i)载体，ii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)，iii)5-HT1AR-靶向的NLF-siRNA(5-HT1AR-NLF-siRNA)和iv)5-HT1AR敲除(5-HT1AR-KO)。以30μg/2.5μl/1天对小鼠注入载体或siRNA，脑室内注射，微透析实验在注入24-48小时之后进行。注意到氯西汀对5-HT1A自身受体下调小鼠的mPFC中的5-HT水平有增强效果，类似于在5-HT1AR-KO小鼠中的那些。数据表达为基线的百分比并显示为平均值±SEM(n＝4-6只小鼠/组)。**p＜0.01与载体和nsNLF-siRNA组有显著差异，利用重复测量ANOVA，在被试内变量的因子和时间之间进行处理，随后多重比较Newman-Keuls检验。
图10.在5-HT1A自身受体下调小鼠中焦虑类似行为没有改变，但是在压力/抑郁相关测试中有改变的响应。各组小鼠为：i)载体，ii)5-HT1AR-靶向的NLF-siRNA(5-HT1AR-NLF-siRNA)和iii)5-HT1AR敲除(5-HT1AR-KO)。小鼠用载体或siRNA以30μg/2.5μl/1天，注入进D3V，脑室内注射。A)焦虑类似行为用高架十字迷宫在载体或siRNA给药24小时之后评价。与5-HT1AR敲除小鼠(5-HT1AR-KO)不同，5-HT1A自身受体下调小鼠(5-HT1AR-NLF-siRNA)显示在进入的次数和在高架十字迷宫的开臂花费的时间没有差别。B)悬尾实验被选择为范例以评价在急性压力/抑郁情况下的响应。该测试在载体或siRNA给药48小时之后进行评估。相比于载体组，在压力情况下，5-HT1A自身受体下调和5-HT1AR-KO小鼠展示了增加的灵活性。数值是平均值±SEM(n＝12-18只小鼠/组)。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001与载体有显著差异，利用单因素ANOVA然后是Newman-Keuls post hoc检验。
图11.鼻内给药缀合的5-HT1AR-NLF-siRNA导致的选择性5-HT1A自身受体沉默。小鼠接受单一的鼻内给药：i)载体，ii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)和iii)5-HT1AR-NLF-siRNA(每个鼻孔中15μg/5μl)。A)背缝神经核(DRN)的5-HT1AR表达通过原位杂交来评估。柱状图显示了在DRN中5-HT1AR-NLF-siRNA诱导的5-HT1AR mRNA水平的降低。膜上测量的5-HT1ARmRNA阳性颗粒的光密度定量显示为平均光密度(OD)百分比数值±SEM(n＝4只小鼠每组和在DRN的3AP水平的2次观察)。B-D)5-HT1AR-NLF-siRNA诱导突触前5-HT1AR的特异性下调，但不是突触后位点的。背缝神经核(B)，额叶前皮质(C)和海马区(D)的5-HT1AR蛋白水平通过放射自显影结合用3[H]-8-OH-DPAT来评价。图柱代表5-HT1AR fmol/mg组织蛋白的平均值±SEM(n＝4只小鼠每组并且在DRN的3AP水平的2次观察和在额叶前皮质和海马区的左右位点的2次观察)。*p＜0.05，**p＜0.01与载体和ns NLF-siRNA有显著差异，利用单因素ANOVA然后是Newman-Keuls post hoc检验。
图12.8-OH-DPAT(选择性5-HT1AR激动剂)对5-HT1A自身受体下调小鼠中生理学和神经化学参数的影响并不存在。各组小鼠接受单一鼻内给药：i)载体，ii)无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)和iii)5-HT1AR-NLF-siRNA(每个鼻孔15μg/5μl)。A)与载体和ns NLF-siRNA处理的小鼠不同，1mg/kg腹腔注射剂量的8-OH-DPAT在5-HT1AR-NLF-siRNA小鼠中对体温不产生任何变化。数值显示为体温改变的平均值±SEM(n＝4-7只小鼠每组)。B)载体、nsNLF-siRNA和5-HT1AR-NLF-siRNA小鼠的mPFC中通过体内微透析测量细胞外5-HT水平，然后全身给药8-OH-DPAT(0.5mg/kg腹腔注射)。在载体和nsNLF-siRNA两者的mPFC中5-HT水平均降低。然而，5-HT1AR-NLF-siRNA小鼠显示不存在8-OH-DPAT对mPFC中5-HT水平的影响。数据表达为基线的百分比并显示为平均值±SEM(n＝4-9只小鼠/组)。**p＜0.01，***p＜0.001分别与载体和ns NLF-siRNA有显著差异，分别利用单或双因素ANOVA然后是多重比较Newman-Keuls检验。
图13.鼻内5-HT1AR-NLF-siRNA沉默5-HT1A-自身受体并引起抗抑郁类似响应。小鼠接受单一鼻内给药：i)载体，ii)5-HT1AR-NLF-siRNA(每个鼻孔15μg/5μl)和iii)5-HT1AR-NLF-siRNA(每个鼻孔50μg/5μl)。A)在高架十字迷宫中5-HT1AR-NLF-siRNA的任何剂量均不影响焦虑类似应答(n＝6)。数值是平均值±SEM。B)单一鼻内给药5-HT1AR-NLF-siRNA(30或100μg)引起悬尾实验中固定性的剂量依赖性降低(n＝10-15)。数值为平均值±SEM。单因素ANOVA显示有显著效果的组，F2,34＝8.70，p＜0.001。相对于载体*p＜0.05，***p＜0.001。C)单一鼻内给药5-HT1AR-NLF-siRNA(100μg)引起强迫游泳测试中固定性的降低(n＝13-16)。数值为平均值±SEM。单因素ANOVA显示有显著效果的组，相对载体*p＜0.05，**p＜0.01。
图14.鼻内给药缀合的5-HTT-NLF-siRNA引起的特异性5-HT转运体(5-HTT)沉默。A)背缝神经核(DR)的5-HTT表达通过原位杂交来评价。小鼠接受单一给药：i)载体，ii)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔中5μg/5μl(5-HTT-NLF-siRNA 10)和，iii)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔中15μg/5μl(5-HTT-NLF-siRNA 30)。a1-a333在三个不同的前后(AP)坐标上显示了与33P-标记的5-HTT-特异性寡核苷酸结合的小鼠中缝核的冠状断面，以mm计：离前囱(吻尾从左至右)-4.24/-4.36，-4.36/-4.60和-4.72/-4.84。比例尺，500μm。B)柱状图显示了5-HTT-NLF-siRNA诱导的背缝神经核中5-HTT mRNA水平的降低。膜上测量的5-HTT mRNA阳性颗粒的光密度定量显示为平均光密度(OD)百分比数值±SEM(n＝4只小鼠每组，在背缝神经核的3AP水平的2-4次观察)。*p＜0.05，**p＜0.01与载体有显著差异，利用单因素ANOVA随后是Newman-Keuls post hoc检验。
图15.5-HTT-NLF-siRNA诱导的5-羟色胺转运体特异性下调，通过原位杂交和放射自显影结合来评价。小鼠接受单一给药：i)载体，ii)无义-NLF-siRNA，每个鼻孔15μg/5μl，iii)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔5μg/5μl(5-HTT-NLF-siRN A 10)和，iv)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔15μg/5μl(5-HTT-NLF-siRNA 30)。A)柱状图显示了5-HTT-NLF-siRNA诱导的在背侧(DR)和中部(MnR)中缝核的5-HTT mRNA水平的降低。膜上测量的5-HTT mRNA阳性颗粒光密度定量显示为平均光密度(OD)百分比数值±SEM(n＝7-10只小鼠每组)。*p＜0.05，***p＜0.001与相同区域的载体和无义-NLF-siRNA有显著差异，利用单因素ANOVA随后Newman-Keuls post hoc检验。B-C)特异性5-HTT结合的光密度分析表示为％结合载体注入小鼠的对应区域，为了说明每个区域中NLF-siRNA-诱导的5-HTT下调的程度。图柱表示平均值±6-9只小鼠/组的SEM。*p＜0.05，**p＜0.01与相同区域的载体和无义-NLF-siRNA有显著差异，利用单因素ANOVA随后Newman-Keuls post hoc检验。
图16.A)急性氟西汀(5-HT转运体的选择性抑制剂，20mg/kg腹腔注射)给药对小鼠背侧纹状体的透析液5-HT水平的影响。小鼠接受单一给药：i)载体，ii)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔5μg/5μl(5-HTT-NLF-siRNA 10)和，iii)5-HTT-NLF-siRNA，每个鼻孔15μg/5μl(5-HTT-NLF-siRNA30)。微透析实验在应用24-48小时之后进行。氟西汀在载体组产生了背侧纹状体中5-HT水平的增加，而在5-HTT-NLF-siRNA组则没有。B)选择性5-HT转运体抑制剂，西酞普兰(Cit)对载体和5-HTT-NLF-sirRNA小鼠的背侧纹状体中的5-HT水平的局部影响。西酞普兰的局部给药以浓度依赖性方式增加了载体组的背侧纹状体中的5-HT水平。然而，西酞普兰仅在50μM产生5-HTT-NLF-siRNA组的纹状体中5-HT水平的轻微增加。数据表达为基线的百分比并显示为平均值±SEM(n＝7-8只小鼠/组)。**p＜0.01与载体有显著差异，利用重复测量ANOVA，在被试内变量的因子和时间之间进行处理，随后多重比较Newman-Keuls检验。
图17.NLF-NS-siRNA-Cy3对黑质致密部的多巴胺能神经元的选择性靶向。A和C显示了红色标记的NLF-NS-siRNA-Cy3，分别在小鼠中脑腹侧ICV给药siRNA 1和3小时之后。B和D显示了与酪氨酸羟基化酶(TH)染色合并的相同标记。NLF-NS-siRNA-Cy3ICV给药1小时之后(A和B)，红色标记(Cy3)可以在TH-阳性黑质神经元内检测到(蓝色)，但是不能在黑质网状部的氨基丁酸能神经元中检测到(*)。红色标记遵循点状模式(插入)。注射3小时之后，不能检测到任何红色细胞内标记(C和D)。
图18.NLF-NS-siRNA-Cy3对蓝斑核的去甲肾上腺素能神经元的选择性靶向。A和C分别显示在ICV给药siRNA 1和3小时之后NLF-NS-siRNA-Cy3的红色标记。B和D显示与酪氨酸羟基化酶(TH)染色合并的相同标记。NLF-NS-siRNA-Cy3ICV给药1小时之后(A和B)，红色标记(Cy3)主要在TH-阳性去甲肾上腺素能神经元内可以被检测到(蓝色)。红色标记遵循点状模式(插入)。注射3小时之后，任何红色细胞内标记均检测不到了(C和D)。
图19.舍曲林-缀合的2-O’-甲基(TOM)-修饰的无义寡核苷酸(C-ns-TOM)在背脊5-羟色胺神经元中的选择性积聚。小鼠接受单一的脑室内注入Cy3-标记的C-ns-TOM(30μg)至背侧第三脑室并在注入24小时之后处死(n＝2只小鼠)。YOYO1-免疫反应细胞核的激光共聚焦图像(绿色)显示了局部免疫的Cy3标记的C-ns-TOM(红色)。比例尺是40μm。
发明详述
本发明的作者已经观察到，出人意料地，通过将所述核酸共价偶联至这样的分子，能够将核酸特异性靶向表达神经递质转运体的感兴趣的细胞，所述分子能够特异性结合至所述神经递质转运体并且，更具体地，至所述转运体的抑制剂。
A.本发明的缀合物
在第一个方面，本发明涉及缀合物，其包含：
i)至少一种特异性结合至一种或多种神经递质转运体的选择性试剂，
ii)至少一种能够特异性结合至靶标分子的寡核苷酸，所述靶标分子在相同的细胞中作为神经递质转运体被表达。
如本文所用的术语“缀合物”，指由两个或多个单独的化合物共价结合形成的任何化合物。在本发明中，缀合物指包含共价偶联的核酸和选择性试剂的分子，所述偶联直接或通过接头化合物。
术语“共价偶联”或“共价结合”意思是核酸和选择性试剂或者彼此直接共价连接，或者通过插入部分彼此间接通过共价连接，所述插入部分例如接头，或桥连，或隔离部分。
A.1.选择性试剂
如本文所用的表达“与一种或多种神经递质转运体特异性结合的选择性试剂”，指与神经递质转运体结合的任何物质。这种结合特异性使与所述选择性试剂连接的分子递送至含有所述神经递质转运体的细胞、组织或器官。通过这种方式，当将其给于动物或者在体外与不同类型的细胞种群接触时，含有所述选择性试剂的缀合物将特异性定向到所述细胞，
如本文所用，第一分子特异性结合到第二分子是指第一分子结合到所述第二分子的能力在某种程度上显著不同于非特异性相互作用。根据本发明的选择性试剂可以显示对于靶标(神经递质转运体)的Kd为至少约10-4M，可选地至少约10-5M，可选地至少约10-6M，可选地至少约10-7M，可选地至少约10-8M，可选地至少约10-9M，可选地至少约10-10M，可选地至少约10- 11M，可选地至少约10-12M或更强。
如本文所用的术语“神经递质转运体”，是指一类属于膜转运蛋白的蛋白，其跨越神经元的细胞膜，并且其主要功能是运载神经递质穿过这些膜并引导其进一步转运至细胞内特定的位置。本发明的选择性试剂可以靶向作用的神经递质转运体包括，但不限于，神经元和神经胶质细胞的质膜中存在的摄取载体，其将神经递质从细胞外空间泵入细胞内。该过程依赖于跨过质膜的Na+梯度，具体是Na+共转运。已经鉴定了两个家族的蛋白。一个家族包括用于GABA，单胺例如去甲肾上腺素，多巴胺，5-羟色胺，和氨基酸例如甘氨酸和脯氨酸的转运体。通常的结构性组分包括12个推定的跨膜α-螺旋结构域，细胞质的N-和C-末端，和一个大的糖基化细胞外环将跨膜结构域分为三或四份。该家族的同源蛋白将能量从Na+和Cl-离子与神经递质的共转运递送至细胞(Na+/Cl-神经递质转运体)。第二个家族包括用于兴奋性氨基酸例如谷氨酸的转运体。通常的结构性成分包括推定的6-10个跨膜结构域，细胞质的N-和C-末端，和糖基化的细胞外环。所述兴奋性氨基酸转运体不依赖于Cl-，而是可能需要细胞内K+离子(Na+/K+-神经递质转运体)(Liu，Y.et al.(1999)Trends Cell Biol.9：356-363)。
可以与本发明的选择性试剂靶向结合的神经递质转运体也包括在细胞内囊膜中存在的神经递质转运体，典型地在突触囊泡中，其主要功能是在突触传递过程中在囊泡内容物胞吐作用之前，将来自细胞质的神经递质浓缩进入囊泡中。囊泡转运利用跨过囊泡膜的H+-ATP酶产生的电化学梯度。两个家族的蛋白涉及神经递质转运进入囊泡。一个家族主要利用质子交换以驱动转运进入分泌囊泡并包括单胺和乙酰胆碱的转运体。例如，单胺转运体将两种腔内质子交换为细胞质递质的每种分子。第二个家族包括GABA转运体，其依赖于突触囊泡内的正电荷。这两类囊泡转运体显示出相互之间没有序列相似性并具有与质膜载体截然不同的结构Schloss，P.et al.(1994)Curr.Opin.Cell Biol.6：595-599；Liu，Y.et al.(1999)Trends Cell Biol.9：356-363)。
能够与本发明的选择性试剂靶向结合的神经递质转运体的特定类型包括谷氨酸/天冬氨酸转运体，包括，兴奋性氨基酸转运体1(EAAT1)，兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)，兴奋性氨基酸转运体3(EAAT3)，兴奋性氨基酸转运体4(EAAT4)，兴奋性氨基酸转运体5(EAAT5)，囊泡谷氨酸转运体1(VGLUT1)，囊泡谷氨酸转运体2(VGLUT2)和囊泡谷氨酸转运体3(VGLUT3)；GABA转运体，包括，GABA转运体类型1(GAT1)，GABA转运体类型2(GAT2)，GABA转运体类型3(GAT3)，甜菜碱转运体(BGT1)和囊泡GABA转运体(VGAT)；甘氨酸转运体，包括，甘氨酸转运体类型1(GlyT1)，甘氨酸转运体类型2(GlyT2)；单胺转运体，包括，多巴胺转运体(DAT)，去甲肾上腺素转运体(NET)，5-羟色胺转运体(SERT)，囊泡单胺转运体1(VMAT1)，囊泡单胺转运体2(VMAT2)；腺苷转运体，包括，平衡型核苷转运体1(ENT1)，平衡型核苷转运体2(ENT2)，平衡型核苷转运体3(ENT3)和平衡型核苷转运体4(ENT4)以及囊泡乙酰胆碱转运体(VAChT)。
在一个优选的实施方式中，选择性试剂不是肽。
在一个优选的实施方式中，选择性试剂选自5-羟色胺再摄取抑制剂(SRI)，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，去甲肾上腺素能和特异性5-羟色胺能的抗抑郁剂(NASSA)，去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，多巴胺再摄取抑制剂(DRI)，内源性大麻素再摄取抑制剂(eCBRI)，腺苷再摄取抑制剂(AdoRI)，兴奋性氨基酸再摄取抑制剂(EAARI)，谷氨酸再摄取抑制剂(GluRI)，GABA再摄取抑制剂(GRI)，甘氨酸再摄取抑制剂(GlyRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)。
术语“5-羟色胺再摄取抑制剂”或“SRI”，指能够阻碍5-羟色胺摄取的分子，包括选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)(其特异性阻碍5-羟色胺摄取而基本上不影响其他神经递质)和也包括非选择性5-羟色胺再摄取抑制剂例如5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI)。
术语“5-羟色胺选择性再摄取抑制剂”或“SSRI”，指5-羟色胺再摄取的选择性抑制剂，其基本上不影响其它神经递质摄取或转运体系。这些化合物主要在突触前5-羟色胺能的细胞起作用，导致神经递质5-羟色胺的细胞内水平的提高，从而提高5-羟色胺的水平，使其能够结合突触后受体并反转脑内该单胺能神经递质系统的活性不足。SSRI的示例性非限制性实例包括舍曲林(CAS 79617-96-2)，舍曲林-结构类似物，氟西汀(CAS 54910-89-3)，氟伏沙明(CAS 54739-18-3)，帕罗西汀(CAS 61869-08-7)，吲达品(CAS63758-79-2)，齐美定(CAS 56775-88-3)，西酞普兰(CAS 59729-33-8)和依他普仑(CAS 219861-08-2)。确定给定化合物是否担当SSRI的测定方法是，例如，降低体外摄取5-羟色胺和拮抗对-氯苯异丙胺的5-羟色胺-消耗行为的能力，而不影响大鼠心脏摄取静脉内[3H]去甲肾上腺素，如在Koe et al.(J.Pharmacol.Exp.Ther.，1983，226：686-700)基本上描述的。
在一个优选的实施方式，所述的SSRI是舍曲林或其结构类似物并具有结构(I)
Figure BPA00001657140800241
其中，独立地，R1、R2、R3、R4、R5和R6是氢或任意取代的C1-C6烷基；X和Y各自选自氢、氟、氯、溴、三氟甲基、C1-C3烷氧基和氰基；以及W选自氢、氟、氯、溴、三氟甲基、硝基和C1-C3烷氧基。在一些实施方式中，舍曲林类似物是以顺式-异构的构型。术语“顺式-异构的”是指环己烯环中的NR1R2和苯基部分的相对方位(即，它们都是位于环的同一侧)。因为1-碳和4-碳都是不对称取代的，每个顺式-化合物有2个以顺-(1R)和顺-(1S)对映体表示(参照I-碳)的旋光对映体形式。
某些有用的舍曲林类似物是以下化合物，以(1S)-对映体或者(1S)(1R)外消旋形式，以及它们的药学上可接受的盐：
-顺式-N-甲基-4-(3，4-二氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N-甲基-4-(4-溴苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N-甲基-4-(4-氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N-甲基-4-(3-三氟甲基苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N-甲基-4-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N，N-二甲基-4-(4-氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；
-顺式-N，N-二甲基-4-(3-三氟甲基苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺；和
-顺式-N-甲基-4-(4-氯苯基)-7-氯-1，2，3，4-四氢-1-萘胺。
还感兴趣的是顺式-N-甲基-4-(3，4-二氯苯基)-1，2，3，4-四氢-1-萘胺的(1R)-对映体。
舍曲林类似物还描述在美国专利号4,536,518中。其他相关的化合物包括(S，S)-N-去甲基舍曲林、外消旋-顺式-N-去甲基舍曲林、(1S，4S)-去甲基舍曲林、1-去(甲胺)-1-羰基-2-(R，S)-羟基舍曲林、(1R，4R)-去甲基舍曲林、舍曲林、磺酰胺、舍曲林(反向)甲磺酰胺、1R，4R舍曲林、对映体、N，N-二甲基舍曲林、硝基舍曲林、舍曲林苯胺、舍曲林碘化物、舍曲林磺酰胺NH2、舍曲林磺酰胺乙醇、舍曲林腈、舍曲林-CME、二甲基舍曲林反向磺酰胺、舍曲林反向磺酰胺(CH2接头)、舍曲林B-环邻位甲氧基、舍曲林A环甲基酯、舍曲林A-环乙醇、舍曲林N，N-二甲基磺酰胺、舍曲林A环羧酸、舍曲林B-环对位苯氧基、舍曲林B-环对位-三氟甲烷、N，N-二甲基舍曲林B-环和对位-三氟甲烷、和UK-416244。这些类似物的结构如下所示。
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术语“5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂”或“SNRI”指能够通过阻断5-羟色胺转运体而抑制5-羟色胺的再摄取和通过阻断去甲肾上腺素转运体而抑制去甲肾上腺素的再摄取的化合物家族。该家族包括化合物例如文拉法辛(CAS 93413-69-5)，去甲文拉法辛(CAS 93413-62-8)，度洛西汀(CAS116539-59-4)，米那普仑(CAS 92623-85-3)，西布曲明(106650-56-0)，曲马多(CAS 27203-92-5)和比西发定(CAS 71195-57-8)。确定给定化合物是否作为SNRI的测定方法是，例如，脑突触体摄取5-羟色胺和去甲肾上腺素降低的能力，如基本上在Bolden-Watson C，Richelson E.(Life Sci.1993；52(12)：1023-9)中描述。SNRI的一个特定类型是三环类抗抑郁药，它是具有含三个环的通常分子结构的SNRI。三环类抗抑郁药的代表是线形三环类，例如，丙咪嗪，地昔帕明，阿米替林，去甲替林，普罗替林，多塞平，氧丙咪嗪，米安色林，度硫平，阿莫沙平，二苯西平，美利曲辛，马普替林，氟哌噻吨，阿扎吩，噻奈普汀和显示类似活性的相关化合物。有角的三环类抑郁药包括茚屈林，氯达酮，诺米芬辛，和相关化合物。其它结构不同的抗抑郁药的变体，例如，伊普吲哚，布普品，尼亚拉胺，米那普仑，苯乙肼和反苯环丙胺已经显示出具有相似活性。它们与三环类抗抑郁药的功能相等，并且因此包括在本发明的范围内。从而，术语三环类抗抑郁药对本发明人想要的，包括上文所述的抗抑郁药的广泛种类和具有常规特征的相关化合物，它们都拥有抗抑郁活性并包括，而不限于，化合物例如阿米替林，氧阿米替林，卡马西平，布替林，氯米帕明，地美替林，地昔帕明，二苯西平，二甲他林，度硫平/二苯噻庚英，多虑平，丙咪嗪，氧米帕明，伊普吲哚，洛非帕明，美利曲辛，美他帕明，硝沙西平，去甲替林，诺昔替林，普瑞巴林，丙吡西平，普罗替林，奎纽帕明和曲米帕明。
术语“去甲肾上腺素再摄取抑制剂”、“NRI”、“NERI”、“肾上腺素能的再摄取抑制剂”或“ARI”指这样一个家族的化合物，其能够通过阻断去甲肾上腺素转运体(NET)的活动而阻断去甲肾上腺素和肾上腺素的再摄取。该家族的化合物包括选择性NRI，其独占地阻断NET，而不影响其它单胺转运体，以及非选择性NRI例如SNRI，其阻断去甲肾上腺素转运体和5-羟色胺转运体(见上文)，去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)，其阻断去甲肾上腺素和多巴胺转运体(见下文)，三环类抗抑郁药和四环类抗抑郁药(见上文)。适用于本发明的合适的选择性NRI包括，但不限于，阿托莫西汀/托莫西汀(Strattera或CAS 83015-26-3)，马吲哚(Mazanor，Sanorex或CAS 22232-71-9)，瑞波西汀(Edronax，Vestra或CAS 98819-76-2)和维洛沙秦(Vivalan或CAS 46817-91-8)。
术语“多巴胺再摄取抑制剂”或“DRI”通过阻断多巴胺转运体(DAT)的活动而成为神经递质多巴胺的再摄取抑制剂。这从而导致细胞内多巴胺的浓度增加并从而增加多巴胺能神经传递。适合的DRI包括，但不限于，医用药物例如阿米庚酸，苯甲托品/苯扎托品，安非他酮，右哌甲酯，艾司氯胺酮，乙苯托品/Ethybe，乙苄托品，芬坎法明，芬咖明，氯胺酮，利非他明，美地沙明，双苯斯酮胺，哌甲酯，奈福泮，诺米芬辛，哌苯甲醇，普罗林坦，吡咯戊酮，替来他明和曲吡那敏；研究中的化学药品例如altropane(培南)，安福萘酸，苯环己哌啶，布索芬新，布罗曼坦，DBL-583，二氯丙烷＝，二氯芬辛，苯基环己基二乙基胺(Dieticyclidine)，二氟平(dfluoropine)，加环利定，GBR-12,935，茚达曲林，碘氟潘，碘苯托烷，马尼法辛，雷达法辛，他美曲林，替索芬辛，托帕利酯和伐诺司林。合适的DRI可以用本领域技术人员已知的分析方法来鉴定，例如测定推定的DRI通过从大鼠纹状体制备的突触体制剂在抑制高亲和力摄取多巴胺的能力，使用以下文献公开的方法：Kula et al.，(LifeSciences 34：2567-2575，1984)。
术语“内源性大麻素再摄取抑制剂”或“eCBRI“，如本文所用，指通过阻断内源性大麻素转运体的活动而作为内源性大麻素的再摄取抑制剂的任何化合物。具有该活性的化合物可以通过描述于以下文献的方法来鉴定：Beltramo，M.et al.(Science，1997，277：1094-1097)，基于推定的内源性大麻素再摄取抑制剂通过大鼠神经元和星形细胞阻断大麻素的摄取的能力，并包括，但不限于，AM404，N-花生四烯香草胺(arvanil)和奥伐尼。
术语“腺苷再摄取抑制剂”或“AdoRI”指通过阻断一或多种平衡型核苷转运体(ENTs)的行为而作为嘌呤核苷和神经递质腺苷的再摄取抑制剂的化合物。这从而导致的细胞内腺苷浓度的增加并因此增加腺苷能神经传递。具有AdoRI活性的化合物可以利用以下方法来鉴定，即基于推定AdoRI在抑制通过红细胞的腺苷摄取的体外分析和基于推定AdoRI抑制腺苷的血管扩张效果以及预防腺苷介导的并行管生长的促进的体外分析，所有这些均可以基本上根据US6984642中的描述来进行。合适的AdoRI包括，但不限于，阿卡地新，醋酸亮丙瑞林，巴比妥类，苯二氮卓类，钙通道阻滞剂，卡马西平，卡立普多，西洛他唑，环苯扎林，地拉卓，双嘧达莫，雌二醇，乙醇(酒精)，氟马西尼，克冠二胺，羟嗪，吲哚美辛，肌苷，KF24345，甲丙氨酯，硝基苯甲基硫代鸟苷，硝基苯甲基硫代肌苷，罂粟碱，己酮可可碱，酚噻嗪，苯妥英，黄体酮，丙戊茶碱，丙泊酚，嘌呤霉素，R75231，RE102BS，索氟嗪(Soluflazine)，丰加霉素，曲卡唑酯，三环类抗抑郁药。
术语“兴奋性氨基酸再摄取抑制剂”或“EAARI”，指通过阻断兴奋性氨基酸转运体或EEATs而抑制兴奋性氨基酸再摄取的化合物。已经知道多种化合物结合EAAT并抑制转运体的功能。EAAT抑制剂分成两个主要的类别，它们不同在于其作用模式：非可转运阻断剂和竞争性底物。合适的EAARI包括，但不限于，DL-苏-β-苯甲氧基天冬氨酸，钾盐镁矾，二羟基红藻氨酸盐，2S4R4MG，threo-β-羟基天冬氨酸，L-反-吡咯烷-2，4-二羧酸(t-2，4-PDC)。合适的EEARI可以通过例如以下文献描述的分析方法来鉴定：Shimamotot et al.(Molecular Pharmacology，1998，53：195-201)，基于假定EEARI抑制表达人兴奋性氨基酸转运体-1(EAAT1)或人兴奋性氨基酸转运体-2(EEAT2)的Cos-1细胞对放射性标记的谷氨酸摄取的能力。
术语“谷氨酸再摄取抑制剂”或“GluRI”，指通过阻断一或多种谷氨酸转运体的行为而作为谷氨酸再摄取抑制剂的化合物。合适的谷氨酸再摄取抑制剂包括本领域已知的任何这样的抑制剂，包括，例如，threo-3羟基-DL-天冬氨酸(THA)，(2S)-反-吡咯烷-2，4-二羧酸(PDC)，氨基己酸，和(2S，3S)-3-{3-[4-(三氟甲基)苯甲酰胺]苯甲氧基}天冬氨酸。具有GluRI活性的化合物可以利用例如描述在以下文献的分析来鉴定：Shimamotot et al.(MolecularPharmacology，1998，53：195-201)，基于假定GluRI抑制表达人兴奋性氨基酸转运体-1(EAAT1)或人兴奋性氨基酸转运体-2(EEAT2)的Cos-1细胞对放射性标记的谷氨酸的摄取的能力。
术语“GABA再摄取抑制剂”或“GRI”，指通过阻断γ-氨基丁酸转运体(GAT)的行为而作为神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的再摄取抑制剂的化合物。它从而导致细胞内GABA的浓度增加并从而增加了GABA能的神经传递。合适的GABA再摄取抑制剂包括，但不限于，加贯叶金丝桃素(发现于贯叶连翘(St.John′s Wort))，CI-966，德伦环烷(EGIS-3886)，四氢烟酸(C10149)，贯叶金丝桃素(发现于贯叶连翘(St.John′s Wort))，六氢烟酸，NNC 05-2090，NNC-711，SKF-89976A，SNAP-5114，司替戊醇和噻加宾(Gabitril)，其描述于Borden LA et al.(Eur J Pharmacol.1994，269：219-224)。鉴别给定化合物是否是GABA再摄取抑制剂的方法是本领域已知的，例如在US6906177；US6225115；US4383999和AIi，F.E.，et al.(J.Med.Chem.1985，28，653-660)中的描述。这些方法通常包含使细胞接触放射性标记的GABA并检测在候选化合物存在和不存在情况下GABA的摄取。
术语“甘氨酸再摄取抑制剂”或“GlyRI”指通过阻断甘氨酸转运体(GlyT)的行为而作为神经递质甘氨酸的再摄取抑制剂的化合物，包括以下化合物：阻断甘氨酸转运体(1型)GlyTI，涉及从突触缝隙移除甘氨酸；和GlyT2，是甘氨酸再摄取和再装进入突触囊泡所需要的(Gomeza et al.，2003；CurrOpin Drug Discov Devel 6(5)：675-82)。用于本发明的合适的甘氨酸再摄取抑制剂包括GlyT1特异性抑制剂例如N-甲基-N-[[(1R，2S)-1，2，3，4-四氢-6-甲氧基-1-苯基-2-萘基]甲基甘氨酸(MTHMPNM甘氨酸的游离碱)，4-[3-氟-4-丙氧苯基]-螺[2H-1-苯并吡喃-2，4′-哌啶]-1′-乙酸(FPPSBPAA的游离碱)其被描述于WO0007978和WO0136423中，ALX 5407，肌氨酸，5，5-二芳基-2-氨基-4-戊酸或描述于WO0208216的化合物，以及GlyT2-特异性抑制剂，例如描述于WO05044810A的化合物，其内容以其整体并入本文作为参考。检测GlyT1-特异性或GlyT2-特异性再摄取抑制剂的方法是本领域已知的，包括例如，描述于WO05018676A或WO05044810的方法，其中表达相关受体(GlyT1或GlyT2)的细胞在受测的再摄取抑制活性化合物存在下接触放射性标记的甘氨酸，在一段给定时间后在细胞内发现的甘氨酸的量进行确定的。
术语“去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂”或“NDRI”，如本文所用，指通过分别阻断去甲肾上腺素转运体(NET)和多巴胺转运体(DAT)的行为而作为神经递质去甲肾上腺素和多巴胺的再摄取抑制剂的化合物。这从而导致增加了去甲肾上腺素和多巴胺两者的细胞外浓度，并因此增加肾上腺素能和多巴胺能的神经传递。用于本发明缀合物的合适的NDRI包括，但不限于，氨奈普汀(Survector，Maneon，Directin)，丁氨苯丙酮(Wellbutrin，Zyban)，右哌甲酯(Focalin)，芬坎法明(Glucoenergan，Reactivan)，芬咖明(Altimina，Sicoclor)，利非他明(Santenol)，哌甲酯(Ritalin，Concerta)，诺米芬辛(Merital)，哌苯甲醇(Meretran)，普罗林坦(Promotil，Katovit)，吡咯戊酮(Centroton，Thymergix)，奈福泮(Acupan)，加贯叶金丝桃素(发现于贯叶连翘(St.John′s Wort))，贯叶金丝桃素(发现于贯叶连翘(St.John′s Wort))，可卡因，2-二苯甲基哌啶(Desoxypipradrol)(2-DPMP)，二苯基脯氨醇(Diphenylprolinol)(D2PM)，亚甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)，西洛巴明，马尼法辛(GW-320,659)，雷达法辛(GW-353,162)，他美曲林(CP-24,441)。
在一个优选的实施方式中，本发明的缀合物包含选择性试剂，其实选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)。在一个更优选的实施方式中，SSRI是舍曲林或如上文定义的其结构类似物。
A.2.本发明缀合物的核酸
根据本发明的缀合物的第二个组分是能够特异性结合至靶标分子的核酸，所述靶标分子在与神经递质转运体相同的细胞内表达。典型地，本发明的核酸能够抑制靶标分子的功能。因此，如果靶标分子是mRNA，则核酸(典型地是siRNA，shRNA或反义核酸)通过抑制mRNA的翻译而导致该mRNA编码的蛋白水平降低而起作用。如果靶标分子是蛋白，则核酸(典型地是适配体)通过抑制蛋白的活性而起作用。
术语“核酸”，如本文所用，指具有两个或多个脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物分子的聚合物，以及结构上类似于自身核酸，但是在一个或多个核酸骨架(例如，自身核酸的磷酸)、核酸糖基(例如，自身DNA的脱氧核糖和自身RNA的核糖)和核酸碱基(例如，自身核酸中的腺苷，胞嘧啶，鸟嘌呤或胸腺嘧啶)上不同于自身核酸(例如，通过化学修饰)的分子。
寡核苷酸可以是双链或单链寡核苷酸，包括，但不限于，小干扰RNA(siRNA)，小发夹RNA(shRNA)，微小RNA(miRNA)，反义寡核苷酸或核酶。如果使用双链核酸，其包含与靶标核酸互补的第一正义链和与正义链互补的第二反义链，其允许通过第一和第二链之间的碱基配对而形成双链DNA。
术语“反义链”指双链核酸的一条链，其包括基本上与靶标序列互补的区域。当互补区域不完全与靶标序列互补时，错配在反义链的5’端的2-7个核苷酸之外是可以允许的。
术语“正义链”，如本文所用，指dsRNA的一条链，其包括与反义链的区域基本上互补的区域。
术语小干扰RNA(“siRNA”)指诱导RNA干扰通路的小的抑制性双股RNA。这些分子可以在长度上变化(通常18-30个碱基对)并包含反义链中与其靶标mRNA不同程度的互补。一些，但不是全部的siRNA具有正义链和/或反义链的5’或3’端的未配对外伸碱基。术语“siRNA”包括两个分离的链的双股链(duplexes)。如本文所用，siRNA分子不限于RNA分子，而是进一步包含具有一个或多个化学修饰核苷酸的核酸，例如吗啉代物。
如本文所用的术语“shRNA”或“短发夹RNA”指这样的dsRNA，其两条链通过一条链的3’端和另一条链的5’端之间的连续核苷酸链连接起来以形成双股结构。
术语“微小RNA”或“miRNA”指短的单链RNA分子，典型地约21-23个核苷酸长度，并能够调控基因表达。miRNA可以是人工的(即，重组体)或天然的。天然的miRNA由从DNA转录的基因编码，并从初级转录产物(“初级-miRNA”)加工为短的臂-环结构(“前体-miRNA”)，并最终成为成熟miRNA。成熟miRNA分子部分互补于一个或多个mRNA分子，并通过与RNA干扰类似的过程或通过抑制mRNA翻译而下调基因表达。
“反义序列”，如本文所用，包括反义或正义寡核苷酸，其包含能够结合靶标mRNA(正义)或DNA(反义)序列的单链核酸序列(RNA或者DNA)。基于编码给定蛋白的cDNA序列而获得反义或正义寡核苷酸的能力描述于，例如，斯坦因和科恩，癌症研究，第48卷：2659页，1988年(Steinand Cohen，Cancer Res.48：2659，(1988))和范得科罗尔等人，生物技术，第6卷：958页，1988年(van der Krol et al.，BioTechniques 6：958，(1988))。
如本文所用，术语“核酶”或“RNA酶”或“催化性RNA”指催化化学反应的RNA分子。很多天然核酶催化其自身磷酸二酯键之一的水解，或者其他RNA中键的水解，但也已经发现其催化核糖体的氨基转移酶活性，DNA连接酶的连接酶活性，和传统的蛋白酶实现的多种其它化学反应。
“适配体”如本文所用指结合靶标分子上多于一个位点的核酸配体，其中的结合不是“互补”，即，不是由于核酸配体和靶标核酸序列之间的碱基对形成。适配体可以设计为结合任何预想的靶标，包括多肽。适配体提供了生物技术和治疗应用的用途，因为其提供了与常规使用的生物分子抗体相竞争的分子识别特性。除了其选择性识别之外，适配体也提供了优于抗体的优点，因为其能够完全在试管中加工，易于通过化学合成来生产，拥有期望的耐储存特性，并且在治疗性应用中引起很少或没有免疫原性。适配体可以通过重复循环的体外区分、筛选和放大来合成，该方法在本领域被称为“SELEX”(指数富集配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)(沙玛等人，化学研究评述.2008年，41：130-8页(Shamah etal，Acc.Chem.Res.2008，41 pp.130-8))。可选地，其可以通过例如逐步固相法合成。
本发明的核酸可以在核碱基、在糖基和/或核苷酸间连接上包含一或多个修饰。
核酸的一个或多个骨架残基的修饰可以包含一个或多个以下修饰：2′糖基修饰例如2′-O-甲基(2′-OMe)，2′-O-甲氧乙基(2′-MOE)，2′-O-甲氧乙氧基，2′-氟(2′-F)，2′-烯丙基(2′-AIIyI)，2′-O-[2-(甲氨基)-2-氧乙基]，2′-O-(N-氨基甲酸甲酯)；4′糖基修饰包括4′-硫代，4′-CH2-O-2′-桥连，4-(CH2)2-O-2′-桥连；锁核酸(LNA)；肽核酸(PNA)；插核酸(INA)；扭曲插核酸(TINA)；己糖醇核酸(HNA)；阿拉伯糖核酸(ANA)；环己烷核酸(CNA)；环己烯核酸(CeNA)；苏核酸(TNA)；吗啉环寡核苷酸；间隙体(Gap-mer)；混合体(Mix-mer)；掺入精氨酸富含肽；添加5’-磷酸的人工RNA；RNA适配体(阙-格沃斯NS，基因治疗，2007年2月；第14卷第4期：283-91页)(Que-Gewirth NS，Gene Ther.2007Feb；14(4)：283-91.)；特定RNA适配体的对象中解毒剂调节的RNA适配体(参考欧诺S，寡核苷酸.2007年秋季；第17卷第3期：265-74页.)(ref.Oney S，Oligonucleotides.2007 Fall；17(3)：265-74.)或其任何组合。
核酸的一个或多个核苷间连接的修饰可以包含一个或多个以下修饰：硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，磷酸二酰胺酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，硫代氨基磷酸酯(phosphoroanilothioate)和氨基磷酸酯(phosphoranilidate)，或其任意组合。
锁核酸(LNA)，通常指难以接近的RNA，是一种修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分用连接2’和4’碳的额外的桥修饰(O2′，C4′-亚甲基桥)。该桥“锁”住了3’-内部结构构象中的核糖，通常存在于DNA或RNA的A-型中。需要的话，LNA核苷酸可以在核酸中与DNA或RNA碱基混合。这样的寡聚物是商业上可获得的。锁核糖构象增强了碱基堆叠和骨架预组织。这显著增加了LNA-修饰的核酸的热稳定性(解链温度)和杂交亲和力，此外还具有改进的错配识别能力。这些特性使其对基于反义的技术非常有用。进一步，LNA抗-miR寡核苷酸已经在灵长类中进行了测试，并获得了激励性结果和低毒性。
肽核酸(PNA)是人工合成的类似于DNA或RNA的聚合物，并用于生物研究和医药治疗。PNA已知不是天然存在的。DNA和RNA分别具有脱氧核糖和核糖糖基骨架，然而PNA的骨架由重复的N-(2-氨乙基)-甘氨酸单位通过肽键连接而组成。多种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接至骨架。PNA类似肽来描述，具有N-端在起始(左)位置和C-端在右。由于PNA的骨架不包含带电荷的磷酸基团，PNA/DNA链之间的结合比DNA/DNA链之间更为强烈，因为没有静电排斥。在碱基配对识别方面，混合碱基PNA分子是真实的DNA分子模仿者。PNA/PNA结合比PNA/DNA结合更强烈。
插核酸(INA)是修饰的核酸类似物，包含脱氧核糖核苷酸共价连接至疏水插入。INA具有对互补DNA的高亲和力，对每种修饰具有多达11度的稳定性。INA比正常DNA具有全配目标相比错配目标更高的特异性。INA具有对DNA较高亲和力的用途使其可以利用更短的探针并从而进一步增强特异性。进一步，INA是DNA选择性寡核苷酸类似物，具有区分DNA和RNA的独特能力。尽管INA具有对互补DNA的高亲和力，其对互补INA的互补序列具有较低亲和力。扭曲插核酸表示为TINA。
己糖醇核酸(HNA)是由天然核碱基和磷酸化1，5-失水己糖醇骨架构建的寡核苷酸。HNA和RNA之间的分子联系比HNA和DNA之间和天然核酸(dsDNA，dsRNA，DNA/RNA)之间更为稳定。其它人工修饰的寡核苷酸包含ANA(阿拉伯糖核酸)，CAN(环己烷核酸)，CeNA(环己烯核酸)和TNA(苏核酸)。
吗啉环是合成分子，它是天然核酸结构的重新设计产物。结构上，吗啉环和DNA或RNA之间的区别是吗啉具有标准核碱基，那些碱基结合至六元吗啉环，而不是脱氧核糖/核糖环，和非离子磷酸二酰胺内亚基连接替换离子性磷酸二酯键连接。吗啉环有时候指PMO(磷酸二酰胺吗啉代寡核苷酸)。六元吗啉环具有化学式O-(CH2-CH2)2-NH。
间隙体(Gapmer)或“间隙寡聚化合物”是RNA-DNA-RNA嵌合寡核苷酸探针，其中DNA窗口或“间隙”插入其它正常的或修饰的RNA寡核苷酸，后者成为“翼”(wing)。该种修饰增加了寡核苷酸的体内稳定性和探针与靶标的作用的亲和力，从而可以有效使用更短的探针。优选地，翼是2’-O-甲基(OMe)或2’-O-甲氧乙基(MOE)修饰的核糖核苷酸，其保护内部部分免受核酸酶降解。进一步，形成间隙或翼的核苷酸可以通过磷酸二酯键或通过硫代磷酸酯键连接起来，从而使其耐受RNA酶降解。另外，形成翼的核苷酸也可以通过合并3’甲基磷酸酯连接结合的碱基而修饰。
本发明的缀合物的核酸能够特异性结合在神经递质转运体相同的细胞中表达的靶分子。核酸与靶分子的结合可以通过沃森-克中克(Watspn-Crick)作用而发生，其中靶标分子是含有与核酸序列序列互补的序列的核酸。可选地，当靶标分子是多肽时，本发明的缀合物的核酸也能与所述分子作用，在这种情况下核酸作为适配体。
当形成本发明的缀合物的一部分的核酸与靶标mRNA的核酸序列互补时，对本领域技术人员而言不同的标准可以用于选择最合适的核酸。作为示例，当形成缀合物一部分的核酸是siRNA时，其可以通过扫描靶标的mRNA序列的AA二核苷酸并记录AA下游紧随的19个核苷酸。其它方法也可以用于选择核酸靶标。在一个实施例中，siRNA靶标序列的选择完全由经验来确定(参见，例如，苏G等人，美国科学院院刊，第99卷：5515-20页，2002年)(Sui G et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：5515-20(2002))，只要靶标序列起始于GG并且用BLAST搜索分析不与其它基因具有显著的序列同源性。在另一个实施例中，一种更详细的方法用于选择siRNA靶标序列。该过程利用了这样的观察，其中内源性mRNA的任何可接近位点可以通过人工寡脱氧核糖核苷酸/RNA酶H方法来被靶向以降解(参见，例如，李NS等人，自然生物学技术，第20卷：500-05页，2002年)(Lee NS et al.，NatureBiotechnol.20：500-05(2002))。
可选地，发夹siRNA表达框构建为包含靶标的正义链，随后是一个较短间隔，靶标的反义链，和5-6个T作为转录终止子。siRNA表达构建体内的正义链和反义链的顺序可以改变，而不影响发夹siRNA的基因沉默活性。在某些实施例中，顺序的反转可能导致基因沉默活性的部分降低。
用作siRNA表达框的主干的核苷酸序列的长度可以在例如从19-29的范围内变化。环的大小可以从3-23个核苷酸的范围内变化。其它长度和/或环大小也可以使用。
在另外一个实施方式中，可以使用发夹siRNA构建体的5’延伸，条件是发夹siRNA在基因沉默中发挥功能。在一个具体的实施例中，5’延伸包括约6个核苷酸残基。
在另外一个实施方式中，RNAi的靶标序列是21单体序列片段。靶标序列的5’末端具有二核苷酸“NA”，其中“N”可以是任何碱基而“A”代表腺嘌呤。剩余19单体序列具有GC含量在35％和55％之间。另外，剩余19单体序列不包括任何四个连续的A或T(即，AAAA或TTTT)，三个连续的G或C(即，GGG或CCC)，或一行中七个“GC”。
其它标准也可以用于选择RNAi靶标序列。例如，剩余19单体序列的GC含量可以限制在45％和55％之间。而且，任何具有三个连续的相同碱基(即，GGG，CCC，TTT，或AAA)或具有5个或更多碱基的回文序列的19单体序列都被排除。进一步，剩余19单体序列可以选择为具有与其它基因的低序列同源性。在一个具体的实施例中，潜在的靶标序列通过BLASTN针对NCBI的人类UniGene(单一基因)簇序列数据库来搜索。人类UniGene数据库含有非冗余集的基因导向簇。每个UniGene簇包括代表一个独特的基因的序列。可以选择在BLASTN搜索下不产生对其它人类基因的碰撞的19单体序列。在该搜索下，e值可以设置为严紧值(例如“1”)。
siRNA序列，以及根据本发明衍生的任何其它RNAi序列对沉默靶标基因的表达的有效性，可以用本领域已知的多种方法来评价。
术语“沉默”和“抑制表达”，“下调表达”，“压制表达”等等，当其指向靶基因时，本文中指靶基因的表达的至少部分抑制，表现为靶标mRNA的量的减少，其可以从靶基因被转录的第一细胞或细胞组中被分离出来，并且被处理使得靶标基因的表达被抑制，相比于第二细胞或细胞组，其基本上与第一细胞或细胞组相同，但是其不被处理(对照细胞)。抑制程度通常用下列术语表达：
(对照细胞mRNA)-(处理细胞mRNA)*100％
(对照细胞mRNA)
可选地，抑制程度可以根据与靶标基因表达功能性联系的参数的降低来获得，例如，靶标基因编码的蛋白的量或展示某种表现型的细胞的数目。原则上，靶标基因组沉默可以在构成性或基因工程表达靶标的任何细胞中确定，通过任何合适的分析。然而，当需要参考以确定给定核酸是否以一定程度抑制靶标基因的表达并从而包含在本发明中时，下文实施例中提供的和本领域已知的分析将作为这样的参考。例如，在某些例子中，靶标基因的表达被双链寡核苷酸的给药抑制至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，或50％。在一些实施方式中，靶标基因被双链寡核苷酸给药抑制至少60％，70％，或80％。在一些实施方式中，靶标基因被双链寡核苷酸给药抑制至少85％，90％，或95％。
例如，根据本发明的核酸序列可以被导入表达靶标基因的细胞。细胞内靶标基因的mRNA水平可以通过使用RT-PCR(反转录PCR)，RNA印迹或任何其它标准方法来测定。可选地，靶标mRNA编码的多肽的水平可以用蛋白质印迹，ELISA(酶联免疫吸附测定)或任何其它免疫学或非免疫学方法来测量。导入siRNA序列之后靶标基因编码的mRNA或蛋白质的表达水平的实质性改变预示着siRNA序列在抑制靶标基因的表达的有效性。在一个具体的实施例中，导入siRNA序列之前和之后其它基因的表达水平也被监控。可以选择对靶标基因表达具有抑制效果而不显著影响其它基因的表达的siRNA。在另一个具体的实施例中，多个siRNA或其它RNAi序列可以被导入相同的靶标细胞中。这些siRNA或RNAi序列特异性抑制靶标基因表达而不影响其它基因的表达。在另外一个具体的实施例中，可以使用抑制靶标基因和其它基因的表达的siRNA或其它RNAi序列。
本领域技术人员将认识到并入本发明的缀合物的核酸分子的特异性选择将依赖于缀合物中选择性试剂的类型。从而，核酸对表达神经递质转运体的细胞中被表达的靶标分子是特异性的，其中的神经递质转运体与选择性试剂特异性结合。
在一个优选的实施方式中，核酸对5-羟色胺受体类型1A(5-HT1A)是特异性的。在核酸是反义，siRNA，shRNA或核酶的情况下，核酸通过与靶标分子碱基配对而起作用，在这种情况下靶标分子是编码5-羟色胺受体类型1A(5-HT1A)的mRNA。如果核酸是适配体，靶标分子是5-羟色胺受体类型1A(5-HT1A)多肽。
术语“类型1A 5-羟色胺受体”或“5-HT1AR”，如本文所用，指主要在突触前5-羟色胺能神经元中发现的一类5-羟色胺受体。这些受体被细胞外5-羟色胺激活，导致细胞放电活性的降低，并从而降低在主要前脑区域的5-羟色胺释放。该负反馈限制了突触5-羟色胺的增加，其可以由抗抑郁药急性诱导。随着时间的过去，体树突的自身受体变得不敏感，允许SSRI的完全效果在前脑表达。该时间段已经被发现对应于抗抑郁药活性的发作的潜伏期[佩雷斯，V.，等人，柳叶刀，1997年，第349卷：1594-1597页][Perez，V.，et al.，The Lancet，1997，349：1594-1597]。从而，在5-羟色胺类型1A受体是失活的细胞内，作为阻断5-羟色胺转运体的结果的细胞外5-羟色胺的增加将不会导致细胞放电活性的降低，从而防止与5-羟色胺再摄取抑制剂处理相关的负反馈。
可以被本发明的缀合物的核酸靶向的类型1A 5-羟色胺受体可以是任何类型1A 5-羟色胺受体，包括，但不限于，人类5-HT1AR，其序列在SwissProt数据库中在登录号P08908下给出，小鼠5-HT1AR，其序列在SwissProt数据库中在登录号Q64264下给出，大鼠5-HT1AR，其序列在SwissProt数据库中在登录号P19327下给出，狗5-HT1AR，其序列在SwissProt数据库中在登录号Q6XXX9下给出。
本领域技术人员将认识到对编码5-HT1AR的mRNA是特异性的本发明的核酸可以用上文提及的任何方法来选择，并测试其诱导对应mRNA的水平的实质性降低的能力。本发明的作者已经鉴别出5-HT1AR mRNA的序列的区域，其可以被本发明的核酸优先靶向。这些区域对应于在不同物种之间高度保守的区域或对应于主要转录产物的非编码区域，以避免编码区域中翻译复合物的潜在干扰。
因此，在一个优选的实施方式中，核酸序列互补于对应于小鼠5-HT1ARmRNA(在NCBI数据库的登录号NM_008308的序列)的核苷酸621-1640或核苷酸1880-2400的区域，或其它物种的5-HT1AR cDNA的对应区域。所述对应区域可以通过成对比对所述cDNA和小鼠5-HT1AR cDNA或通过多重比对不同的5-HT1AR cDNA并鉴别所述其它cDNA中与小鼠5-HT1AR cDNA中的选择区域重叠的区域来确定。
成对比对两个给定核酸序列的方法是本领域技术人员公知的，可以通过BLASTN[BLAST手册，阿特休尔，S.，等人，美国国立生物技术信息中心国立医学图书馆国立卫生研究院，贝塞斯达，马中兰州20894(BLASTManual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894)，阿特休尔，S.，等人，分子生物学杂志，第215卷：403-410页，1990年(Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))]的标准算法来实现，使用默认参数。多个核酸序列的比对方法可以使用CLUSTALW(汤普逊JD等人，核酸研究，1994年，第22卷：4673-4680页(Thompson JD et al，Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680))的标准算法来实现，使用默认参数。一旦不同物种中5-HT1AR cDNA的区域被鉴别，就可以鉴别可以并入本发明的缀合物的核酸的合适核酸序列。在一个优选的实施方式中，本发明的缀合物包含这样的核酸序列，其包含靶向5-HT1AR mRNA中选自SEQ IDNO：1(小鼠5-HT1AR mRNA的核苷酸1841-1910)，SEQ ID NO：2(小鼠5-HT1AR mRNA的核苷酸591-700)，SEQ ID NOSEQ ID NO：3(小鼠5-HT1ARmRNA的核苷酸831-940)，SEQ ID NO：4(小鼠5-HT1AR mRNA的核苷酸2120-4441)的区域的核酸序列。
在一个更优选的实施方式中，本发明的缀合物的核酸包含选自SEQ IDNO 5，SEQ ID NO7，SEQ ID NO：9，和SEQ ID NO：11的序列(参见表2)如果提供的核酸是双链核酸(例如，siRNA)，寡核苷酸配对由SEQ IDNO6，SEQ ID NO8，SEQ ID NO：10，和SEQ ID NO：12提供的对应反义序列(参见表2)。在另一个实施方式中，本发明的核酸针对编码5-羟色胺转运体的mRNA(其中核酸通过与靶标碱基配对而起作用)或如此类的5-羟色胺转运体(其中核酸作为适配体通过直接结合和抑制多肽活性而起作用)。术语“5-羟色胺转运体”或“SERT”，如本文所用，指这样的多肽，其是一种膜整合蛋白，并转运神经递质5-羟色胺从突触间隙至突触前神经元。人类、大鼠、小鼠和牛SERT的序列在SwissProt数据库中被提供，登录号分别是P31645，P31652，Q60857和Q9XT49。与靶向5-HT1AR cDNA的核酸类似，SERT cDNA中的任何区域可以被靶向，只要其导致对应的mRNA或所述mRNA编码的蛋白的水平的实质性抑制。因此，合适的SERT-特异性核酸可以根据上文描述来鉴别，通过所述细胞已经接触受测核酸之后测量在表达SERT的细胞中SERT mRNA或SERT蛋白的水平。
通过实施例的方式，可以使用描述于分子精神病学，2005年8月；第10卷第8期：782-9，714页(Mol.Psychiatry.2005 Aug；10(8)：782-9，714)和受体.信号传递.研究杂志2006年；第26卷：527-47页(J.Recept.Signal Transduct.Res.2006；26：527-47)的SERT-特异性siRNA。在一个更加优选的实施方式中，SERT-特异性siRNA含有序列
5′CUCCUGGAACACUGGCAACdTdT 3′(SEQ ID NO：13)
在另外一个实施方式中，SERT-特异性siRNA包含表X所述的序列。
Figure BPA00001657140800481
除了突触前5-HT1A，也可以通过调节5-HT1A行为下游的一些离子通道而调节5-HT1A行为，例如TREK-1或GIRK。这些通道通过产生大量钾离子流入而使膜超极化从而调节神经元活性。这些膜电位的改变，抑制了神经元放电。已经提议TREK-1或GirK激动剂将提高神经元活性。这将最终扰乱高水平5-羟色胺存在下的突触前5-HT1A抑制效果。
在另一个实施方式中，本发明的核酸针对编码5-HT1A行为下游起作用的离子通道的mRNA(其中核酸通过与靶标碱基配对而起作用)或针对5-HT1A行为下游起作用的离子通道(其中核酸作为适配体通过直接结合或抑制多肽活性而起作用)。那些通道通过产生大量钾离子流入而使膜超极化从而调节神经元活性。膜电位的改变将抑制神经元放电。这将最终扰乱高水平5-羟色胺存在下的突触前5-HT1A抑制效果。在一个优选实施方式中5-HT1A下游起作用的离子通道是TREK-1或GIRK。
术语“TREK-1”，如本文所用，指也称为KCNK2，TREK，TPKC1，K2p2.1，TREK1，hTREK-1c，hTREK-1e，MGC126742，MGC126744和KCNK2的多肽，它是双孔域型背景钾离子通道，由两个同二聚体形成，其建立一个使钾离子从细胞排出的通道以控制静止膜电位。然而，该通道可以通过某些麻醉剂、膜拉伸、细胞内酸中毒和热而被打开。在人类中，存在三种由TREK基因的选择性剪接而导致的亚型，在NCBI数据库在下列登录号下提供：NP_001017424.1，NP_001017425.2和NP_055032.1。狗(家犬)，黑猩猩(黑猩猩)，牛(黄牛)，大鼠(褐家鼠)和小鼠(小家鼠)的TREK-1异种同型基因在NCBI蛋白质数据库中分别在下列登录号下提供：XP_849278，XP_001171677，NP_777111，NP_742038和NP_034737。与靶向5-HT1AR cDNA的核酸类似，TREK-1 cDNA中的任何区域均可以被靶向，只要其导致对应mRNA或所述mRNA编码的蛋白的水平被大幅抑制。从而，合适的TREK-1-特异性核酸可以根据上文所述来鉴别，通过所述细胞与受测核酸接触后测量表达TREK-1的细胞内TREK-1 mRNA或TREK-1蛋白的水平。
可以用于本发明的缀合物的TREK-1特异性siRNA包括，但不限于，由圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)提供的sc-37180 siRNA，和在US2009317811中描述的反义分子。
术语G蛋白偶联的内向整流钾离子通道，GIRK或Kir3.x，如本文所用，指内向整流钾离子通道家族的任何成员，其通过起始于配体激活的G蛋白偶联受体(GPCR)的信号传导级联被激活(开放)。GPCR依次从非活化异三聚体G蛋白复合物(Gαβγ)释放活化的G蛋白βγ亚基(Gβγ)。最终Gβγ二聚蛋白与GIRK通道作用以使其开放从而其变得对钾离子可渗透，导致细胞的超极化。G蛋白偶联的内向整流钾离子通道是一种G蛋白门控的离子通道，由于GIRK通道被G蛋白亚基直接活化。
合适的GIRK包括，但不限于，J亚家族的所有成员，包括成员3(也称为GIRK1或Kir3.1)例如人类GIRK1，对应于NCBI基因数据库的登录号U39196下鉴别的核酸，或其称为GIRKd的脑变体，成员6(也称为GIRK2或Kir3.2)例如人类GIRK2，对应于NCBI基因数据库的登录号U24660下鉴别的核酸，成员9(也称为GIRK3或Kir3.3)例如人类GIRK3，对应于NCBI基因数据库的登录号U52152下鉴别的核酸，成员5(也称为GIRK4或Kir3.4)例如人类GIRK4，对应于NCBI基因数据库的登录号U39195下鉴别的核酸，成员2(也称为IRK1或Kir2.1)例如人类IRK1，对应于NCBI基因数据库的登录号U24055下鉴别的核酸，和成员4(也称为IRK3或Kir2.3)例如人类IRK3，对应于NCBI基因数据库的登录号U07364下鉴别的核酸。
能够靶向GIRK的合适的核酸包括，例如，WO2005054848中描述的核酶、反义分子。
靶向5-HT1AR mRNA或5-HT1AR蛋白，SERT mRNA或蛋白，TREK-1mRNA或蛋白或者GIRK mRNA或蛋白的那些核酸优选偶联至能够结合神经递质转运体的选择性试剂，所述神经递质转运体存在于5-HT1AR，SERT，TREK-1或GIRK被表达的细胞中，即，多巴胺能神经元。从而，本发明的缀合物包含5-HT1AR-特异性核酸，SERT-特异性核酸，TREK-1特异性核酸或GIRK-特异性核酸，其偶联至能够结合5-羟色胺转运体的选择性试剂，其可以是非选择性5-羟色胺转运体(例如SRI或SNRI)或者，更优选，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)。
在另一个实施方式中，形成本发明的缀合物的一部分的核酸针对突触核蛋白。
术语“突触核蛋白”，如本文所用，指突触核蛋白成员家族的多肽，其包含高度保守的α-螺旋脂结合基序，与可交换阿朴脂蛋白的A2类脂结合结构域相似，并且能够形成称为路易体的细胞内聚集体，其出现在某些神经疾病中，例如帕金森病，阿尔茨海默病和路易体病。术语“突触核蛋白”指α-突触核蛋白，β-突触核蛋白或γ-突触核蛋白。在一个优选的实施方式中，形成本发明的缀合物的部分的核酸是对α-突触核蛋白特异的。
人类、大鼠、小鼠和牛α-突触核蛋白的序列分别由SwissProt数据库的下列登录号提供：P37840，P37377，O55042和Q3T0G8。与靶向5-HT1ARcDNA的核酸类似，α-突触核蛋白特异性核酸可以用前文描述的任何方法来鉴别或选择，并测试其诱导对应mRNA或所述mRNA编码的蛋白的水平的大幅抑制的能力。从而，合适的α-突触核蛋白特异性核酸可以如上文所述来鉴别，通过所述细胞与受测核酸接触之后测量α-突触核蛋白mRNA或α-突触核蛋白在表达α-突触核蛋白的细胞内的水平。
在一个优选的实施方式中，α-突触核蛋白特异性核酸针对人类α-突触核蛋白-cDNA的区域。在另一个实施方式中，本发明的核酸针对编码5-HT1A行为下游起作用的离子通道的mRNA(其中核酸通过与靶标碱基配对而起作用)或针对5-HT1A行为下游起作用的离子通道(其中核酸作为适配体通过直接结合或抑制多肽活性而起作用)。那些通道通过产生大量钾离子流入而使膜超极化从而调节神经元活性。膜电位的这种改变将抑制神经元放电。这将最终扰乱高水平5-羟色胺存在下的突触前5-HT1A抑制效果。在一个优选实施方式中5-HT1A下游起作用的离子通道是TREK-1。
α-突触核蛋白-mRNA内的合适靶标区域包括，但不限于，WO07135426中描述的那些(例如核酸)，并且具体是siRNA，包含选自在WO2006039253中描述的siRNA的组的序列，例如
5′-GGAAAGACAAAAGAGGUGdTdT-3′SEQ ID NO：16
5′-GGAAAGACAAAAGAGGUGdTdT-3′SEQ ID NO：17
5′-GGAGGAAUUUUAGAAGAGGdTdT-3′SEQ ID NO：18
5’-UGUUGGAGGAGCAGUGGUGdTdT-3′SEQ ID NO：19
5’-GGACCAGUUGGGCAAGAAUdTdT-3’SEQ ID NO：20
或者发夹寡核苷酸，具有序列
5’-GATCCCCGGACCAGTTGGGCAAGAATTTCAAGAGAATTCTTGCCAACTGGTCCTTTTTGGAAA-3’和
5’-CTAGTTTCCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATTCTCTTGAAATTCTTGCCCAACTGGTCCGGG-3’
分别对应于SEQ ID NO：21和22。
其它突触核蛋白特异性siRNA序列是描述于US2008139799中的那些(实施例XVII中描述的序列，其内容由此通过引用被包含在内)和WO2009079399中描述的siRNA序列，选自下面的组：
5′-GGUGUGGCAACAGUGGCUGAG-3′SEQ ID NO：23
5′-AACAGUGGCUGAGAAGACCAA-3′SEQ ID NO：24
5′-AUUGCAGCAGCCACUGGCUUU-3′SEQ ID NO：25
5′-AAGUGACAAAUGUUGGAGGAG-3′SEQ ID NO：26
5′-GAAGAAGGAGCCCCACAGGAA-3′SEQ ID NO：27
5′-CGGGUGUGACAGCAGUAGCdTdT-3′SEQ ID NO：28
5′-UCCUGACAAUGAGGCUUAUdTdT-3′SEQ ID NO：29
5′-U*CCUGACAAUGAGGCUUAUdT*dT-3′SEQ ID NO：30
5′-CUACGAACCUGAAGCCUAAdTdT-3′SEQ ID NO：31
5′-C*UACGAACCUGAAGCCUAAdT*dT-3′SEQ ID NO：32
5′-C*UACGAACCUGAAGCCUAAdT*dT-3′SEQ ID NO：33
5′-CUAUUGUAGAGUGGUCUAUdTdT-3′SEQ ID NO：34
5′-C*UAUGAGCCUGAAGC*UAAT*T-3′SEQ ID NO：35
5′-C*UAUGAGCCUGAAGCCUAAT*T-3’SEQ ID NO：36
其中*代表硫代磷酸酯键，下划线的核苷酸代表2’-O-Me修饰。
它们优选偶联至能够结合表达突触核蛋白的细胞中存在的神经递质转运体的选择性试剂。从而，本发明的缀合物包含突触核蛋白特异性核酸，其偶联至能够介导内化进入单胺能神经元的选择性试剂。从而，靶向突触核蛋白mRNA或蛋白的核酸偶联至能够促进所述核酸内化进入5-羟色胺能，去甲肾上腺素能和/或多巴胺能神经元的试剂。因此，在一个优选的实施方式中，突触核蛋白特异性核酸偶联至对5-羟色胺能，去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元的选择性试剂，其选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)，去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)(SNDRI或三倍-阻断剂)的组。
在另一个实施方式中，形成本发明的缀合物的部分的核酸针对一氧化氮合成酶(NOS)。
如本文所用，“一氧化氮合成酶”或“NOS”意思是体内催化一氧化氮合成的天然存在的酶。一氧化氮(NO)由L-精氨酸的胍基基团通过称为一氧化氮合成酶(NOS)的酶家族而合成。该术语应用于在生命系统中发现的一氧化氮合成酶(NOS)的所有亚型并包括，但不限于，NOS的构成性形式，内皮一氧化氮合成酶(eNOS)，神经元一氧化氮合成酶(nNOS)和可诱导一氧化氮合成酶(iNOS)。
人类、大鼠、小鼠、狗和牛的iNOS的序列分别提供于SwissProt数据库的登录号P35228，Q06518，P29477，O62699和Q27995下。人类、大鼠、小鼠和牛的eNOS的序列分别提供于SwissProt数据库的登录号P29474，Q62600，P70313和P29473下。人类、大鼠、小鼠和牛的nNOS的序列分别提供于SwissProt数据库的登录号P29475，P29476，Q9Z0J4和P29473下。
NOS cDNA中的任何区域均可被靶向，只要其导致对应mRNA或所述mRNA编码的蛋白的水平被大幅抑制。从而，合适的NOS-特异性核酸可以如前文所述来鉴别，通过在所述细胞接触受测核酸之后测量表达NOS的细胞内NOS mRNA或蛋白的水平，或者通过确定处理的细胞内的NOS活性。NOS活性可以通过本领域已知的任何方法来测量，以确定iNOS，eNOS和nNOS活性，视情况而定。例如，NOS活性可以通过放射性测量方法测量[3H]-精氨酸向[3H]-L-瓜氨酸的转化而确定，或者在一氧化氮形成中利用格中斯(Griess)分析。
合适的NOS-特异性沉默试剂包括，但不限于，WO08100591中描述的nNOS-特异性siRNA，通过下列多核苷酸对来获得：
-CAAAGAGATCGACACCATC(SEQ ID NO：58)(正义)，
GATGGTGTCGATCTCTTTGTT(SEQ ID NO：59)(反义)；
-CACGCATGTCTGGAAAGGC(SEQ ID NO：60)(正义)和
GCCTTTCCAGACATGCGTGTT(SEQ ID NO：61)(反义)；
-GGTCTATCCAATGTCCACA(SEQ ID NO：62)(正义)和
TGTGGACATTGGATAGACCTT(SEQ ID NO：63)(反义)
-具有如下序列的iNOS-特异性siRNA：5′-
CCACCAGTATGCAATGAAT-3′(SEQ ID NO：64)
-可以从英杰公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加州)(Carlsbad，CA)获得的eNOS-特异性siRNA，具有寡聚物鉴别号HSS 107326，HSS 107327和HSS 107328
-芳等人(Fang et al.)(RNA，2010年，第16卷：1429-1435页)的表2中描述的iNOS-特异性siRNA
-具有如下序列的iNOS-特异性siRNA：5′-
ACAACAGGAACCUACCAGCTT-3′(SEQ ID NO：65)(正义)和5′-
GCUGGUAGGUUCCUGUUGUTT-3′(SEQ ID NO：66)(反义).
适合用于本发明的示例性和非限制性NOS特异性反义物包括：
-具有如下序列的iNOS-特异性反义寡核苷酸：5’-ACAGCTCAGTCCCTTCACCAA-3’(SEQ ID NO：67)，描述于格拉索等人(Grasso et al.)(实验生物学与医学，2003年，第228卷：491-8页)。(Exp.Biol.Med.，2003，228：491-8)
-具有如下序列的iNOS-特异性反义寡核苷酸：5′-TTTGCCTTATACTGTTCC-3′(SEQ ID NO：68)描述于黑姆中希等人(Hemmrich et al.)(美国生理学会杂志，细胞生理学，2003年，第285卷：C489-C498)(Am.J.Physiol.Cell Physiol.，2003，285：C489-C498)。
-WO0152902中表1和表2描述的iNOS-特异性反义寡核苷酸。
-芳等人(Fang et al.)(RNA，2010年，第16卷：1429-1435页)的表1中描述的iNOS-特异性反义分子。
NOS特异性沉默试剂优选偶联至能够结合表达NOS的细胞中存在的神经递质转运体的选择性试剂。从而，本发明的缀合物包含NOS特异性核酸，其偶联至能够介导内化进入单胺能神经元的选择性试剂。从而，靶向突触核蛋白mRNA或蛋白的核酸偶联至能够促进所述核酸内化进入5-羟色胺能，去甲肾上腺素能和/或多巴胺能神经元的试剂。因此，在一个优选的实施方式中，突触核蛋白特异性核酸偶联至对5-羟色胺能，去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元的选择性试剂，其选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)，去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)(SNDRI或三倍-阻断剂)的组。
在另一个实施方式中，形成本发明的缀合物的部分的核酸针对去甲肾上腺素转运体。
术语“去甲肾上腺素转运体”，“NAT”，“降肾上腺素转运体”或“NET”在本文中用于不分区别地指单胺转运体，其将神经递质去甲肾上腺素(降肾上腺素)和多巴胺从突触转运回到囊泡中以储存直到之后使用。NET是617个氨基酸长，包含12个跨膜结构域，由SLC6A2基因编码。
人类，狗(Canis familiaris)，黑猩猩，(Pan troglodytes)，牛(Bostaurus)，大鼠(Rattus norvegicus)和小鼠(Mus musculus)的去甲肾上腺素转运体的序列分别在NCBI数据库的登录号P23975，XM_544398.2，XM_001167680.1，NM_174608.2，NM_031343.1和NM_009209.2下提供。NET cDNA中的任何区域均可以被靶向，只要其导致对应mRNA或所述mRNA编码的蛋白质的水平的大幅抑制。从而，合适的NET-特异性核酸可以如前文所述来鉴别，通过在所述细胞接触受测核酸之后测量表达NET的细胞内NET mRNA或蛋白的水平。
合适的NET-特异性核酸包括，但不限于，任何SLC6A2-特异性RNAi例如可以从英杰公司(Invitrogen)获得的登录号HSS109852，HSS109853和HSS185858下的RNAi。
在另一个实施方式中，形成本发明的缀合物的部分的核酸针对多巴胺-β-羟基化酶。
术语“多巴胺-β-羟基化酶”，如本文所用，指能够将多巴胺转化为去甲肾上腺素的多肽。
人类，大鼠，小鼠和牛的多巴胺-β-羟基化酶的序列分别在NCBI蛋白质数据库的登录号NP_000778，NP_037290，NP_620392和NP_851338下提供。与根据本发明的靶向其它核酸的核酸类似，多巴胺-β-羟基化酶cDNA中的任何区域均可以被靶向，只要其导致对应mRNA或所述mRNA编码的蛋白质的水平的大幅抑制。从而，合适的多巴胺-β-羟基化酶-特异性核酸可以如前文所述来鉴别，通过在所述细胞接触受测核酸之后测量表达多巴胺-β-羟基化酶的细胞内多巴胺-β-羟基化酶mRNA或蛋白的水平。
合适的多巴胺-β-羟基化酶-特异性核酸包括，但不限于，WO2008019159中描述的具有如下序列的核酸：
5’-GACCACGUACUGGUGCUACAUTA-3’(SEQ ID NO：37)
以及商业上可获得的多巴胺-β-羟基化酶-特异性核酸，例如可以从圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)(产品目录#sc-35180)、从英杰公司(Invitrogen)(产品目录#HSS175953，HSS175954和HSS175955)、从亚诺法公司(Abnova)(产品目录#H00001621-R01)、美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)(siRNA ids s3946，s3947和s3945)获得的多巴胺-β-羟基化酶特异性siRNA。
那些靶向多巴胺-β-羟基化酶mRNA或蛋白的核酸优选偶联至能够结合这样的细胞中存在的神经递质转运体，其中所述细胞中表达多巴胺-β-羟基化酶并且其中所述细胞中需要多巴胺-β-羟基化酶的降低以补偿导致特定病例状况的神经递质的缺乏。从而，本发明的缀合物包含多巴胺-β-羟基化酶特异性核酸，其偶联至能结合去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)的选择性试剂。
在另一个实施方式中，组成本发明的缀合物的部分的核酸特异性针对BAX。术语“BAX”或“BCL2相关X蛋白”如本文所用，指促凋亡BCL-2家族成员，其活化涉及亚细胞转移和二聚化。在活细胞中，BCL-2相关X蛋白的主要部分是单聚体并在细胞液中发现或与膜松弛连接。在死亡刺激下，细胞液单聚BCL2-相关X蛋白转移至线粒体，在这中它变成可交联的膜整合蛋白。BCL-2相关X蛋白形成独特的离子通导性膜孔的能力可能部分地是导致细胞死亡的线粒体功能障碍的原因(科斯梅雅等人，冷泉港定量生物学，1999年，第64卷，343-350页；科斯梅雅等人，细胞死亡与变异，2000年，第7卷，1166-1173页)(Korsmeyer et al.，Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.，1999，64，343-350；Korsmeyer et al.，Cell Death Differ.，2000，7，1166-1173)。术语“BAX”指其任何剪切变体，包括BAX-α(GenBank登录号L22473)，BAX-β(GenBank登录号NM004324))，BAX-γ(欧尔特沃伊等人，细胞，1993年，第74卷，609-619页)(Oltvai et al.，Cell，1993，74，609-619)，BAX-δ(GenBank登录号AI382305)(阿普特等人，基因组学，1995年，第26卷，592-594)页(Apte et al.，Genomics，1995，26，592-594)，BAX-ω(GenBank登录号AF008196)(周等人，生物化学杂志，1998年，第273卷，11930-11936页)(Zhou et al.，J.Biol.Chem.，1998，273，11930-11936)和BAX-ε(GenBank登录号AF007826)(适等人，生物化学与生物物理研究通讯，1999年，第254卷，779-785页)(Shiet al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1999，254，779-785)。编码BAX-α、BAX-β和BAX-γ的核苷酸序列在美国专利号5,691,179和5,955,595中公开并要求权利。编码BAX-ω的核苷酸序列在美国专利号6,140,484和对应的PCT公开WO 97/01635中公开并要求权利。美国专利号6,140,484中也公开了针对人类BAX-ω的外显子5/内含子5连接处的22聚体反义寡核苷酸。
用于根据本发明的缀合物的合适的BAX-特异性核酸包括：
-序列5′-UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg-3′(SEQ ID NO：38)(在CN101255422中描述)，
-靶向人类BAX的83-102和103-122位碱基(在曼弗雷迪尼等人，反义核酸药物开发，1998年，第8卷，341-350页中描述(Manfredini etal.，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，1998，8，341-350))和嗜中性白细胞(狄博特等人，美国科学院院刊，1999年，第96卷，13330-13335页(Dibbert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1999，96，13330-13335))的反义寡核苷酸.
-US20040077583(表1和3)中公开的任意序列，其内容通过引用并入本文。
靶向BAX mRNA或蛋白的核酸优选偶联至能够结合表达BAX的细胞中存在的神经递质转运体的选择性试剂。从而，本发明的缀合物包含BAX特异性核酸，其偶联至能够介导内化进入5-羟色胺能、去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元的选择性试剂。因此，在一个优选的实施方式中，选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物的核酸靶向微管相关蛋白taumRNA或蛋白。术语“tau”指tau蛋白家族的任何蛋白，包括但不限于，任何来源包括人类(P10636)，狗(XM_844939)，黑猩猩(NM_001009068.1)，小鼠(Z12133)，斑马鱼(BI981282.1)和线虫(NM_001027407.2)的天然tau蛋白单体，前体tau蛋白，tau肽，tau中间体，代谢产物和tau衍生物，其能够忍受导致成对螺旋纤维细丝和直纤维细丝自组装混乱的超磷酸化，涉及阿尔茨海默病和其它tau病理学的发病机理。
合适的tau-特异性核酸包括，但不限于：
-WO2005118858中描述的具有如下序列的siRNA：
5′-AATCACACCCAACGTGCAGAA-3′(SEQ ID NO：39)
和
5′-AACTGGCAGTTCTGGAGCAAA-3’(SEQ ID NO：40)
-US2004241854中描述的具有如下序列的siRNA：
Figure BPA00001657140800601
-卡塞雷斯等人，神经生物学杂志，1991年，第11卷：1515-1523页(Caceres et al.J.Neuroscience，1991，11：1515-1523)中描述的具有如下序列的tau-特异性反义核酸：
GGTTCAGCCATGCTGCTTCAAAGCC    SEQ ID NO：53
和
TGATAATCGACAGGAGGCGAGGACA    SEQ ID NO：54
靶向tau mRNA或蛋白的核酸优选偶联至能够结合表达Tau的细胞中存在的神经递质转运体的选择性试剂。从而，本发明的缀合物包含Tau-特异性核酸，其偶联至能够介导内化进入单胺能神经元尤其是5-羟色胺能、去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元的选择性试剂。因此，在一个优选的实施方式中，选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物的核酸靶向亨廷顿mRNA或蛋白质。术语“亨廷顿蛋白”指UniPortKB数据库登录号P42858的未知功能的350kDa的蛋白，以及存放在登录号L12392下的核酸序列编码的蛋白，和在狗(NCBI登录号XP_536221.2)，黑猩猩(NCBI登录号XP_517080.2)，牛(NCBI登录号XP_871851.2)，大鼠(NCBI登录号XP_573634.1)或小鼠(NCBI登录号NP_034544.11)中发现的其直系同源物，以及CAG重复的延伸导致的其变体(野生型蛋白中的CAG6-37至突变蛋白中的CAG35-121重复)。CAG延伸导致产生了在亨廷顿蛋白中含有多谷氨酸束的延伸的突变蛋白。
合适的亨廷顿-特异性核酸包括，但不限于，US2008039418A的表4和表5中以及US7320965的表1，2，7，8，9和10中描述的反义寡核苷酸，US2005042646A中描述的具有如下序列的siRNA：
5’-AAGAGGAGGAGGCCGACGCCC-3’(SEQ ID NO：55)
靶向亨廷顿mRNA或蛋白的核酸优选偶联至能够结合表达亨廷顿蛋白的细胞中存在的神经递质转运体的选择性试剂。从而，本发明的缀合物包含亨廷顿-特异性核酸，其偶联至能够介导内化进入单胺能神经元尤其是5-羟色胺能、去甲肾上腺素能和多巴胺能神经元的选择性试剂。因此，在一个优选的实施方式中，选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)或去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)或5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(SNDRI或三倍-阻断剂)的组。
根据本发明的选择性试剂和核酸的合适的组合总结在表1中。
Figure BPA00001657140800621
A.3.本发明的缀合物的接头区域
核酸和选择性试剂可以是直接偶联。但是，优选地是两部分都通过连接基团连接。
本文所用的术语“连接基团”和“接头”及其合乎语法的同等表达是指连接化合物的2个部分的有机部分。选择性试剂能够被连接至核酸内的任意正义或者反义核苷酸，但是它可以优选地通过3′端核苷酸和/或5′端核苷酸偶联。内部缀合物可能直接地或通过接头间接地连接至核苷酸的在核糖基团的2′位上，或者至其他的合适位置。
在核酸是双链核酸的情况下，缀合物可以连接至正义3′端核苷酸，正义5′端核苷酸，反义3′端核苷酸，和/或反义5′端核苷酸。
尽管不希望受定义或约定的限制，在这个申请中，接头的长度是通过计算原子数进行描述的，所述原子数是代表连接缀合部分至接头的原子和与寡核苷酸相关的末端磷酸部分的氧原子之间的最短距离的原子数，其中接头通过氧原子连接至寡核苷酸。在接头包含一个或多个环结构的情况下，优选计数代表最短路径的环绕环的原子。
用于本发明的适合的接头基团包括，但不限于，修饰的或者未修饰的核苷酸类、核苷类、聚合体、糖、碳水化合物、聚烯烃例如聚乙二醇类和聚丙二醇类、多元醇、聚丙烯类、乙烯和丙烯二醇类的混合物、聚烷基胺类、聚胺类例如多溶素和精脒、聚酯类例如聚(丙烯酸乙酯)、聚磷酸二酯类、脂肪族化合物、和烯烃。此外，基于Ω-氨基-1，3-二醇、Ω-氨基-1，2-二醇、羟脯氨醇、Ω-氨基-烷醇、二乙醇胺、Ω-羟基-1，3-二醇、Ω-羟基-1，2-二醇、Ω-硫代-1，3-二醇、Ω-硫代-1，2-二醇、Ω-羧基-1，3-二醇、Ω-羧基-1，2-二醇、共-羟基-烷醇(co-hydroxy-alkanols)、Ω-硫代-烷醇、Ω-羧基-烷醇、功能化寡乙二醇(functionalized oligoethylene glycols)、烯丙胺、丙烯酸、烯丙醇、炔丙胺、丙炔醇及更多的化学结构的接头/接头(linkers/linker)可以应用于本文以产生适当长度的接头。
接头还可能使寡核苷酸缀合物具有其他期望的性质改善水溶性、缀合部分和寡核苷酸之间的最佳间距、弹性(或缺乏其的)、特异性定向、分枝，以及其他。
优选地，所述连接基团具有以下结构
其中
M、n和p选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，
其中m+n+p的总和选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的整数，以及
其中k是0或1。
在一个优选的实施方式中，p是5，n是2，k是1和m是6，得到如下结构的接头：
Figure BPA00001657140800651
在另一个优选的实施方式中，p是5，n和k是0以及m是6，得到如下结构的接头：
Figure BPA00001657140800652
在一个具体的实施方式中，接头包含多于一个选择性试剂的偶联。在一个优选的实施方式中，接头是二价或三价的接头，即2或3个分子的选择性试剂能够分别地偶联。
在多于一个分子的选择性试剂通过接头偶联到核酸上的情况下，所述分子能能够表示相同的或不同的选择性试剂。
在一个具体的实施方式中，二价或三价的接头具有如下结构式：
Figure BPA00001657140800653
Figure BPA00001657140800661
其中
m、m’、m”、n、n’、n”、p、p’、p”、r、r’、r”、s、s’、s”、t和u独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13；
k、k’、k”和v独立地选自0和1；以及
X1、X2和X3独立地选自CH2、O、S、NH、CO、C(O)O和C(O)NH。
根据上述基团的价位，分支接头可以是对称的或不对称的。
在一个具体的实施方式中，接头是如上所示的二价接头，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1以及m和m’是6。在一个具体的实施方式中，接头是二价接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0以及m和m’是6。
在一个具体的实施方式中，接头是如上所示的二价接头，其中r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X1和X2代表C(O)NH。在另一个实施方式中，接头是二价接头，其中r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X1和X2代表CH2。
在一个具体的实施方式中，接头是二价接头，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1，m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X1和X2代表C(O)NH。
在另一个实施方式中，接头是二价接头，其中p和p’是5，n和n’是2，k和k’是1，m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X1和X2代表CH2。
在另一个实施方式中，接头是二价接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0以及m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X1和X2代表C(O)NH。
在另一个实施方式中，接头是二价接头，其中p和p’是5，n、n’、k和k’是0以及m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X1和X2代表CH2。
在一个具体的实施方式中，接头是如上所示的三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1以及m、m’和m”是6。在一个具体的实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0以及m，m’和m”是6。
在一个具体的实施方式中，接头是如上所示的三价接头，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X1、X2和X3代表O。在另一个实施方式中，接头是三价接头，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X1、X2和X3代表O。
在一个具体的实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X1、X2和X3代表O。
在另一个实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，k、k’和k”是1，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X1、X2和X3代表O。
在另一个实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X1、X2和X3代表O。
在另一个实施方式中，接头是三价接头，其中p、p’和p”是5，n、n’、n”、k、k’和k”是0，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X1、X2和X3代表O。
A.4.本发明缀合物的靶向部分(moiety)
本发明缀合物的另一个修饰涉及化学地连接至核酸或至保护基团一个或多个部分或缀合物，其增强核酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这样的部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分(Letsinger et al，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，199，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan et al，Biorg.Med.Chem.Let.，1994 4 1053-1060)，硫醚，例如，beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan et al，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)，巯基胆固醇(Oberhauser et al，Nucl.Acids Res.，1992，20，533-538)，脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al，EMBO J，1991，10，1111-1118；Kabanov et al，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk et a/.，Biochimie，1993，75，49-54)，磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-胺1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-氢膦酸酯(Manoharan et al，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea et al，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.，Nucleosides and Nucleotides，1995，14，969-973)，或者金刚烷乙酸(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)，棕榈基部分(Mishra et ai，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)，或者十八胺或己基氨基-羰基羟胆固醇部分(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937)。
可选地，能够增强细胞分布的部分可能是低分子量化合物或者多肽，其能够通过使用存在于所述生物学屏障的特异性转运体应用受体介导的细胞摄粒作用特异性地穿过生物学屏障进行转移。一系列广泛的摄取的受体和载体，具有甚至更大数目的受体-特异性配体，是本领域已知的。用于根据本发明所用的介导胞吞作用和/或胞转作用的受体的优选配体包括，例如配体用于或者其特异性地结合至硫胺素转运体、叶酸盐受体、维生素B12受体、去唾液酸糖蛋白受体、α(2，3)-唾液酸糖蛋白受体(含有，例如，由美洲驼单区抗体(sdAbs)组成的FC5和FC44纳米抗体(nanobodies)作为受体-特异性配体)、转铁蛋白-1和-2受体、清除剂受体(类型A或B，I、II或III型，或者CD36或CD163)、低密度脂蛋白(LDL)受体、LDL-相关蛋白1受体(LRP1，B型)、LRP2受体(也称为巨蛋白或者糖蛋白330)、白喉毒素受体(DTR，其是肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)的膜结合前体)、胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、瘦素受体、P物质受体、谷胱甘肽受体、谷氨酸受体和甘露糖6-磷酸盐受体。
符合本发明使用的，与这些受体结合的优选配体包括，例如配体选自：脂蛋白酯酶(LPL)、α2-巨球蛋白(α2M)、受体相关蛋白(RAP)、乳铁蛋白、去氨普酶、组织和尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(tPA/uPA)、纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂(PAI-I)、tPA/uPA：PAI-1复合物、黑素转铁蛋白(或P97)、凝血酶敏感蛋白1和2、肝脂酶、因子VIIa/组织因子途径抑制剂(TFPI)、VIIIA因子、IXa因子、Abetal-40、β-淀粉样蛋白前体(APP)、C1抑制剂、补体C3、载脂蛋白E(apoE)、假单胞菌外毒素A、CRM66、HIV-I Tat蛋白、鼻病毒、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、MMP-13(胶原酶-3)、鞘脂激活蛋白(SAP)、妊娠区带蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、α-抗胰蛋白酶、热休克蛋白96(HSP-96)、血小板衍生生长因子(PDGF)、载脂蛋白J(apoJ、或簇连蛋白)、ABETA至apoJ和apoE、抑肽酶、血管肽素(angio-pepl)、极低密度脂蛋白(VLDL)、转铁蛋白、胰岛素、瘦素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、凝集素、肽拟态物和/或人源化单克隆抗体或特异性作用于所述受体的肽(例如，结合至人转铁蛋白受体的序列HAIYPRH和THRPPMWSPVWP，或抗人转铁蛋白受体(TfR)的单克隆抗体A24)、血红蛋白、白喉毒素多肽链的无毒部分、白喉毒素B链的全部或一部分(包括DTB-His(如Spilsberg et al.，2005，Toxicon.，46(8)：900-6所描述的))、白喉毒素CRM197的无毒突变体的全部或一部分、载脂蛋白B、载脂蛋白E(例如，结合至吐温-80包衣纳米粒子之后)、维生素D结合蛋白、维生素A/视黄醇-结合蛋白、维生素B12/钴胺素血浆载体蛋白、谷胱甘肽和运钴胺蛋白-B12。
A.5.保护基团
形成本发明缀合物的一部分的核酸在它们经过有机体的不同液体和组分的转运期间，它们必须被保护以免受降解因子降解，所述的降解因子例如核酸酶(内/外切核酸酶)。为了这个目标，寡核苷酸设计成抵抗酶消化，以及改善寡核苷酸的体内稳定性和生物利用度的。优选地，核酸是通过在由阻止核酸酶介导的降解的基团的存在下进行的化学修饰。
为了本发明的目的，“帽结构”或者“保护基团”应当理解为是指化学修饰，其已合并至寡核苷酸的任一末端。5′-帽的非限制性例子包括反转碱性部分(inverted abasic residue)(部分)、4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓糖)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环的核苷酸；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯连接；苏-呋喃戊糖核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核苷酸；无环3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反转核苷酸部分；3′-3′-反转碱性部分(inverted abasic moiety)；3′-2′-反转核苷酸部分；3′-2′-反转碱性部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3′-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3′-磷酸盐；3′-磷硫酰；二硫代磷酸酯；或者桥连或非桥连的甲基膦酸酯部分。细节详细描述在WO97/26270中，此处引入作为参考。3′-帽结构包括，例如，4′，5′-亚甲基核苷酸；1-(β-D-呋喃赤藓糖)核苷酸；4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5′-氨基-烷基磷酸酯；1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1，2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-呋喃戊糖核苷酸；无环3′，4′-开环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸、5′-5′-反转核苷酸部分；5′-5′-反转碱性部分；5′-氨基磷酸酯；5′-磷硫酰；1，4-丁二醇磷酸酯；5′-氨基；桥连和/或非桥连5′-氨基磷酸酯、磷硫酰和/或二硫代磷酸酯、桥连或非桥连甲基膦酸酯和5′-巯基部分。仍然参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925；其内容此处并入作为参考。
在一个优选的实施方式中，连接本发明缀合物的核酸序列的帽结构具有以下通式结构：
M-L1d-[(A-L2)a-(B-L3)b]c-
其中：
M是H、脂质部分或如上定义的靶向基团；
A和B代表单体单元，独立地选自单糖和(C2-C20)烷撑二醇；
L1、L2和L3是连接化合物，独立地选自磷酸二酯、磷硫酰、氨基甲酸酯、甲基膦酸酯、胍鎓、氨基磺酸酯、磺酰胺、甲缩醛(formacetal)、硫代甲缩醛(thioformacetal)、砜、酰胺及其混合物；
a和b是0-50的整数；
c是0-30的整数；
d是至少为1的整数。
本文所用的脂质部分是指有机化合物的基团，其具有亲脂的或两亲性特性，包括，但不限于，脂肪、脂肪油、挥发油、蜡、甾类、甾醇、磷脂类、糖脂、硫脂、氨基脂、荧光色脂质(脂色素)、和脂肪酸。术语“脂质”包含天然存在的和合成生产的脂质。脂质部分通常增加寡核苷酸的亲脂性并促进寡核苷酸构建体体内的细胞内摄取。可以使用的适合的脂质包括脂肪酸；脂肪；油；蜡；胆固醇；甾醇；脂溶性维生素，例如维生素A、D、E和K；单酸甘油酯；二葡基甘油二酯，和磷脂。优选的脂肪酸是选自月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、硬脂酸(C18)、山嵛酸(C22)、以及石胆酸和油胺的混合物(石胆酸-油胺，C43)。脂质可能由本领域技术人员根据考虑靶组织、靶细胞、给药途径、预期寡核苷酸行进的通路等情况进行选择。
本文所用的以及本领域公知的术语“单糖”是指糖的简单形式，由单个糖单元组成，其不可能进一步分解成更小的糖结构单元或部分。用于本本发明的缀合基团的糖部分优选选自呋喃糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、改性单糖、唾液酸和赤藓糖及其混合物。单糖可以是它的线性或环状形式(半缩醛环异构体)。呋喃糖是包含5元呋喃环的任何简单糖类，例如D-核糖或者果糖残基(D-(-)-果糖呋喃糖)。单糖的结合能够获得多糖结构。果糖寡聚体(FOS)和半乳糖低聚糖(GOS)是特别有利的结合，以及二糖蔗糖或乳糖；或者多糖菊糖、糊精、淀粉或者糖原。
本文所用的术语“烷撑二醇”、“聚(烷撑二醇)”和“烷撑氧化物”包含聚醚聚合物家族，其共有通式-O-[(CH2)m-O-]n-，其中m代表每个烷撑二醇单元中存在的亚甲基基团的数目，和n代表重复单元的数目，并因此代表聚合物的大小或长度。术语包括，不限于，乙二醇、丙二醇，二烷撑二醇(例如，二乙二醇)、三烷撑二醇(例如，三乙二醇)，和二醇例如前述二醇相应的单-或二-烷基醚，其中烷基醚是具有1-6个碳原子的低级烷基醚(例如，甲基、乙基、丙基醚和类似物)。
在另一个实施方式中，式(I)的基团具有(C2-C20)烷撑二醇单体单元，其可以是2-20个碳原子的线性的或支链的分子，或者，根据a和b的价位，有若干(C2-C20)烷撑二醇单体单元的聚烷撑二醇聚合物。优选地，烷撑二醇基团选自C16-C20烷撑二醇。更优选地，烷撑二醇基团是C18烷撑二醇。
适合本发明缀合物的保护基团包括，不限于：
M-L1d-[(A-L2)a-(B-L3)b]c-
-PEG+糖，对应于上式，其中M是H，d是0，A是PEG，B是糖，a和b每个都是1，以及L1和L2是磷酸二酯键；
-PEG+(糖)2，对应于上式，其中A是PEG，B是糖，a是1，b是2，M是H，d是0，以及L1和L2是磷酸二酯键；
-(PEG)2+糖，对应于上式，其中A是PEG，B是糖，a是2，b是1，M是H，d是0，以及L1和L2是磷酸二酯键；
-(PEG)3+糖，对应于上式，其中A是PEG，B是糖，a是3，b是1，M是H，d是0，以及L1和L2是磷酸二酯键；
-(PEG)5+糖，对应于上式，其中A是PEG，B是糖，a是5，b是1，M是H，d是0，以及L1和L2是磷酸二酯键。
所用的术语“PEG”和“糖”基本上如上所述，并且包括呋喃糖作为糖以及PEG选自C3、C9和C18间隔区。
B.本发明缀合物的结构
本发明缀合物的不同单元可能以不同方式来排列。从而，选择性试剂可以偶联至核酸的5’端和/或3’端。此外，核酸和选择性试剂可能直接地连接或者可能通过接头连接。类似地，接头可能偶联至核酸的5’端和/或3’端。从而，其中本发明的核酸包含单个核酸链，可能的排列是：
-包含连接至5’端的选择性试剂的核酸，
-包含连接至3’端的选择性试剂的核酸，
-包含连接至5’端的选择性试剂和连接至3’端的保护基团的核酸，和
-包含连接至5’端保护基团和连接至3’端的选择性试剂的核酸。
-修饰的核酸，其包含第一和第二选择性试剂，所述第一和第二选择性试剂是相同或不同的，两个选择性试剂都与连接到核酸的5’端的双功能接头的两端相连接，
-修饰的核酸，其包含第一和第二选择性试剂，所述第一和第二选择性试剂是相同或不同的，两个选择性试剂都与连接到核酸的3’端的双功能接头的两端相连接，
-修饰的核酸，其包含4个选择性试剂，所述选择性试剂是相同或不同的，其中两个选择性试剂连接到与核酸的5’端相连接的第一双功能接头的两端，以及其中两个选择性试剂连接到与核酸的3’端相连接的第二双功能接头的两端。
再者，本发明的缀合物可能包括多于一个核酸链，该核酸调节靶分子的表达。例如，本发明的构建体可以包括至多5个不同核酸，这些核酸通过磷酸二酯连接在一起，定位到给定靶分子的不同区域。
此外，在核酸是双链核酸的情况下，选择性试剂可以偶联至正义和/或反义链，并且可能直接偶联或者通过接头基团连接。
形成本发明缀合物的一部分的核酸在经过有机体的不同液体和组分的转运期间，它们必须被保护以免受降解因子的降解，所述的降解因子例如核酸酶(内/外切核酸酶)。为了这个目标，寡核苷酸设计成抵抗酶消化，以及改善寡核苷酸的体内稳定性和生物利用度的。细胞外切核酸酶使用游离5’端作为靶标。因此，在单链核酸的情况下，当与核酸的5’端偶联时，选择性试剂可能充当稳定部分。但是，在缀合物包含双链核酸或者选择性试剂连接至3’端的单链核酸的情况下，缀合物可能进一步包含稳定部分，或者帽结构，其通常是通过外切核酸酶的活性阻止核酸降解的基团。在双链核酸的情况下，存在的可能排列如下：
[1]选择性试剂附着于一条链的5’端，这种情况下在相反链的5’端附加帽结构是有用的。另外，帽结构也可以存在于3’端中一个或两个。
[2]选择性试剂附着于一条链的3’端，这种情况下在正义和反义链的5’端附加帽结构是有用的。另外，帽结构可以存在于游离的3’端。
[3]在包含多于一个相同或不同的选择性试剂的缀合物的情况下，选择性试剂偶联至正义和反义链的5’端。可以选择地，帽结构可能存在于3’端中的一个或两个。
在一个优选的实施方式中，核酸是双链RNA，其中选择性试剂连接至反义链的5’端，并保护基团连接至正义链的5’端。还有一个更优选的实施方式中，保护基团具有结构
M-L1d-[(A-L2)a-(B-L3)b]c-
其中，M是H，d是0，A是C18间隔区的聚乙烯乙二醇，B是呋喃糖，a是2，b和c是1以及L2和L3是磷酸二酯键。
在一个优选的实施方式中，本发明的缀合物包含
(i)至少一个选择性试剂，其特异性地结合至一个或多个神经递质转运体，其中选择性试剂选自包含5-羟色胺再摄取抑制剂(SRI)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)的试剂组，和
(ii)核酸，其能够特异性地结合至靶分子，其中靶分子选自包含5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)、编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA、5-羟色胺转运蛋白和编码5-羟色胺转运体的mRNA。
在一个更优选的实施方式中，能够特异性地结合至编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA的核酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3和SEQ ID NO：4的序列组的一个序列。
还有一个更优选的实施方式中，本发明的缀合物具有结构(I)
Figure BPA00001657140800771
其中
R1、R2、R3、R4和R5独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W是选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
m、n和p选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，其中m+n+p的和是选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的整数以及
其中寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列组中的序列。
在另一个实施方式中，本发明的缀合物具有结构：
Figure BPA00001657140800781
其中寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列组中的序列。
还有更优选的实施方式中，本发明的缀合物具有结构(XIV)
其中，
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
m和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，其中m+p的和是选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的整数，和
其中寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列组的序列。
在具体的实施方式中，缀合物具有结构
Figure BPA00001657140800791
其中寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列组中的序列。
还在另一个优选的实施方式中，本发明的缀合物包含双链核酸，其中正义链的5’端与保护基团偶联，以及反义链的5’端与选择性试剂偶联。其中，保护基团具有结构：
M-L1d-[(A-L2)a-(B-L3)b]c-
其中M是H，d是0，A是C18间隔区的聚乙烯二醇，B是呋喃糖，a是2，b和c是1以及L2和L3是磷酸二酯键，并且其中保护基团是舍曲林，本发明的化合物具有结构：
C18-磷酸二酯-C18-磷酸二酯-呋喃糖-磷酸二酯-aRNA链
sRNA链-肽连接-舍曲林
还有一个更优选的实施方式中，本发明的化合物具有结构：
Figure BPA00001657140800801
还有更优选的实施方式中，本发明的化合物具有结构：
Figure BPA00001657140800811
在另一个实施方式中，缀合物具有如下结构：
Figure BPA00001657140800812
其中，
R1表示氢、低级烷基或苄基
R2表示氢、甲基、氟族的氯
R2’表示氢、甲基、甲氧基、羟基或卤素原子
R3和R4表示氢、低级烷基
R5表示5-或6-位上的氢、氯或甲氧基和
p是2-6。
还有一个更优选的实施方式中，缀合物具有如下结构
还有一个更优选的实施方式中，形成如上定义的缀合物一部分的寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其中所述靶分子选自：
-多巴胺-β-羟化酶，
-编码多巴胺-β-羟化酶的mRNA，
-BAX，
-编码BAX的mRNA，
-Tau，
-编码Tau的mRNA，
-亨廷顿蛋白和
-编码亨廷顿蛋白的mRNA。
从本发明的意义上说，通式的保护基团可以通过以连接化合物(指在式(I)基团中的“L”)的方式连接至寡核苷酸的5’-OH或者3’-OH基团，从而获得缀合物-寡核苷酸。寡核苷酸和式(I)基团的化学性质可以有若干实施方式。
例如，有可能单个寡核苷酸分子中连接式(I)中可变数目的基团上，典型地从2到4，在通过5’-OH和/或3’-OH形成连接的这个条件下，取决于寡核苷酸是双链还是单链。也有可能的是式(I)中的若干基团的链连接至寡核苷酸，所述式(I)的基团通过连接化合物而相互连接，例如，亚磷酰胺，其是在分子和/或寡核苷酸之间产生磷酸二酯键的分子衍生得到。还有，寡核苷酸构建体可以包含连接至寡核苷酸的一端的式(I)的若干基团的链以及连接至该寡核苷酸另一端的式(I)的其他基团。
还有，本发明的核苷酸构建体可以包含多于一个的靶向试剂，被分布于寡核苷酸的两条链的5’-OH和3’-OH末端中的所有可能组合或者结合至式(I)的基团上。此外，如果有多于一个的靶向试剂，这些可以串联地连接至式(I)的基团和/或该寡核苷酸。
如果寡核苷酸构建体包含多于一个的靶向试剂，不同的组合是可能的。例如，保护基团可以连接至寡核苷酸的一条链的5’-OH或3’-OH末端基团。另一种可能组合包括连接至一条寡核苷酸链的5’-OH基团的药物化合物和一系列适配体，所述适配体是连接到与另一条寡核苷酸链结合的式(I)基团的末端单元适配体。
C.本发明的药物组合物
发明人已经发现本发明的缀合物具有调节核酸表达的能力，其是通过定向到缀合物的核酸序列进行的。例如，在缀合物包含特异性作用于突触前5-HT1AR的核酸的情况下，当将构建体给药于受试者时，它可以有效地诱导受试者的中脑脊核(即，脑中5-羟色胺能神经元体所在的区域)中的5-HT1AR的特异性降低。
因此，本领域技术人员将理解的是，本发明的缀合物对于疾病的治疗是恰当的，其可能是从基因表达水平的降低中获益的，所述基因的存在于本发明缀合物中的核酸所定向的。因此，另一个方面，本发明涉及根据本发明在医药中使用的缀合物。另外，本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的缀合物和药学上可接受的赋形剂。
适量的本发明寡核苷酸构建体可以与药学上可接受的赋形剂和/或载体按配方制造以获得药物组合物。包含本发明缀合物的组合物可以以多种途径给予受试者。示例性的途径包括纹状体内、脑室内、鞘膜内、薄膜组织内(例如，在纹状体中)、鼻内和眼部给予。组合物还可以全身给予，例如，通过静脉内、皮下或肌内注射，其对于将缀合物给予至外周神经元是特别有用的。另外，本发明的缀合物还有可能鼻内给药，其使通过非侵入性的给药方式而全身给药。还有，脑室内给药可能也是恰当的。优选的给药途径是直接到达脑部，例如，进入脑的脑室或下丘脑，或者进入脑的侧面或背侧区域。
本发明的药物组合物可能包含多个不同的缀合物，其中不同的缀合物包含靶向于相同靶分子的不同区域的核酸。因而，药物组合物可能包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个和更多个不同缀合物，每个不同的缀合物包含不同的核酸。
本领域技术人员熟悉公知且可买到的资料如《雷氏药物大全》(Remington′s Pharmaceutical Science)(第17版，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985)和古德曼和吉尔曼治疗药理学基础(Goodman and Gilman′s ThePharmaceutical Basis of Therapeutic)(第8版.，Pergamon Press，Elmsford，N.Y.，1990)中所讨论的原理和程序，其在此处将二者引入作为参考。
在本发明优选的实施方式中，根据标准程序将缀合物配制成适于人类和其他哺乳动物给药的药物组合物。典型地，静脉内或脑室内给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液的溶液。
必要时，组合物还可以包括增溶剂和用于改善注射部位的任何疼痛的局部麻醉剂。通常地，组分在单位剂量形式中是单独地或者混合地提供，例如，标示了活性成分的量的熔封容器例如安瓶或药囊中的冻干粉或无水浓缩剂(water free concentrate)。当组合物通过注入给药时，它可以通过包含无菌药用级别水或盐水的输液瓶来配药。当组合物通过注射给药时，可以使用含有灭菌注射用水或盐水的安瓶以便组分可以在使用前混合。
除了静脉内给药的情况，组合物可以包含较少量的润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、混悬液、乳剂、凝胶、聚合物、或者缓释制剂。组合物可以与本领域已知的传统的粘合剂和载体一起按配方制成。制剂可以包括标准载体例如药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等，惰性载体在药物制剂生产中具有良好的确定的功能。各种给药系统是已知的，并可以用于本发明的治疗的给药中，包括脂质体包封、微粒、微粒体以及诸如此类的。
还有另一个优选的实施方式，包括本发明缀合物的治疗用制剂可以以中性或盐的形式来配制。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，例如来源于盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸以及诸如此类的，以及与游离羧基形成的那些，例如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因或类似的。
对于穿过血脑屏障给予组合物的实施方式，组合物包括，例如，脂质体，如例如在美国专利号6,372,250(Pardridge)中所描述的，和药学上可接受的载体。此处所述的脂质体可以将生物活性剂穿过血脑屏障传递，随后在脑中表达。脂质体和纳米粒是纳米载体(nanocontainer)的典型形式，其通常用于药物的包封。脂质体优选地具有小于200纳米的直径。具有50-150纳米的直径的脂质体是优选的。特别优选的是具有大约80纳米外径的脂质体或其他纳米载体。合适类型的脂质体是用中性磷脂例如1-棕榈酰基-2-油酰基-锡-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、二磷脂酰磷酸胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)或者胆固醇，连同小量(1％)的阳离子类脂例如双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)一起制成的，用以稳定脂质体内的DNA。
脂质体可以用纳米粒或者任何其他直径小于200nm的分子纳米载体替代，当制剂还在血液中或者从血液运输至靶细胞的细胞内隔室时，其可以包封DNA并且保护核酸免受核酸酶分解。还有，代替使用缀合试剂例如PEG链，而使用一种或多种其他聚合的物质例如鞘磷脂，其可以连接至脂质体或纳米载体的表面，并且达到双重目的：为“可运输的肽”的缀合提供支架以及用于延迟制剂从血液中消除和优化血浆药代动力学性质。进一步地，本发明注重DNA给药至细胞或器官的任何部分，其具有特异性靶受体。脂质体可以用作将DNA给予至器官，例如肝、肺和脾。
其他适合本发明缀合物的递送的载体包括树枝状高分子。术语“树枝状高分子”是指具有一个核心以及具有自核心发射的多重外壳的分枝结构的大分子。树枝状载体的形状和大小是可以变化。在一些情况中，树枝状载体的形状可以是大致球体的或者球形的。而且，树枝状载体可以具有大约15埃(A)至大约250A的范围内的直径，以及相应范围的分子量，例如，从大约500道尔顿至大约2百万道尔顿。树枝状高分子可以从各种商业渠道(例如，Dendritech、Midland、Michigan)获得或者通过本领域技术人员知道的方法合成得到。树枝状分子可以粗略地分为低分子量类和高分子量类。第一类包括树枝状高分子和树突(dendron)，而第二类包含树突聚合物、超支化聚合物和刷状聚合物(也称为瓶刷形分枝(bottle-brushes))。树枝状高分子和树突是重复分枝的、单分散的和通常高度对称的化合物。在定义树枝状高分子和树突上没有明显的差别。树突通常包括单纯化学上可寻址的基团，其被称为焦点。由于摩尔质量分布的缺乏，高摩尔质量树枝状高分子和树突是大分子而非聚合物。树枝状高分子的性质是由分子表面的功能性基团决定。功能性分子的树枝状包封使活性位点隔离，一个结构，其在生物材料中模拟活性位点的结构，因为树枝状支架隔开内部和外部功能。例如，当树枝状高分子的末端基团是亲水基团，像羧基，树枝状高分子可以是水溶性的。
树枝状高分子通常通过以下性质来表征：(i)起始核(I)，其可能有一个或多个活性位点并且是点状的或者有重要意义的尺寸以影响树枝状高分子的最终拓扑学；(ii)一层或多层连接在起始核上的分枝的重复单元；(iii)功能性末端基团，例如阴离子基团或阳离子基团，连接至树枝状高分子的表面，所述连接是任意地通过连接基团连接。
本文期望的树枝状高分子可能包含赖氨酸或者赖氨酸类似物构建单元。术语“赖氨酸类似物”是指一个分子，其具有单一顶点羧基基团用于连接至上一层的构建单元，和2个或3个伯胺基团，其可以进一步与构建单元、阻断基团、接头或者芳基酸基团连接。本文期望的“赖氨酸类似物”的例子在PCT/AU2007/000352中描述，例如甘氨酰基-赖氨酸(glycyl-lys)。在一些具体的例子中，树枝状高分子仅包含赖氨酸或者一种类型的赖氨酸类似物作为构建单元。
本文期望的其他树枝状高分子包括那些包含聚乙二胺(PAMAM)、聚(乙醚羟胺)(PEHAM)或者聚丙烯基亚胺构建单元的。在它的具体例子中，树枝状高分子仅具有聚乙二胺(PAMAM)、聚(乙醚羟胺)(PEHAM)或者聚丙烯基亚胺作为构建体。
核部分可能仅包括1个连接点用于连接构建单元或者可能包含2、3或更多点，其可能会或可能不会进一步地用于构建单元的连接。典型地，连接点是游离氨基基团。核部分可能包括、包含或者衍生自构建单元或者可能是与构建单元不同的分子。典型的核部分是在本文说明以及在PCT/AU2007/000352中所描述的。
脂质体和树枝状高分子可能与任何适合的药用载体结合用于静脉内给药。组合物的静脉内给药是优选的途径，由于这具有最少的侵入性。其他给药途径是可能的，如果希望的话。合适的药学上可接受的载体包括盐水、Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、或者任何其他的水溶液。恰当的剂量可以通过本领域技术人员已知的程序来确定。
D.本发明缀合物的治疗用途
可以理解地是本发明缀合物可以治疗的临床症状将取决于形成缀合物的一部分的核酸的特异性。因此，本发明的缀合物可以用于任何的疾病的治疗，所述疾病是可以通过抑制细胞中表达神经递质转运体的感兴趣的基因而改善的。本领域技术人员将理解的是，缀合物对于下述疾病的治疗是有用的，所述疾病是以细胞中蛋白的异常表达(例如，路易体中α-突触核蛋白的蓄积)为表征，或者对靶蛋白表达的水平异常但其可以通过减少所述靶蛋白的表达来改善的疾病。
D.1.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向作用在位于5-羟色 胺能神经元上的5-HT 1A 受体、5-羟色胺转运体或者离子通道
如上所述，当将SSRI给予所需受试者时，有一个负反馈机制发生，其结果使位于5-羟色胺能神经元(突触前5-HT1AR)的5-HT1A受体的激活。SSRI的作用导致高的5-羟色胺水平，所述高的5-羟色胺水平是由位于5-羟色胺能神经元上的5-羟色胺再摄取转运体(SERT)介导的5-羟色胺再摄取的阻断而诱导的。这个事实将不仅激活突触后5-羟色胺受体，而且还激活突触前5-HT1AR，其充当了细胞反馈传感器。这些5-HT1AR的激活引起5-羟色胺水平的降低，因为细胞放电和脉冲依赖性的5-羟色胺释放的抑制，从而限制了SSRI的给药效果。
这个效果显示在例如本发明的实施例2和3中，其中它显示了包含舍曲林和5-HT1AR-特异性siRNA的缀合物的输注能够阻止由选择性5-HT1AR激动剂诱导的降温反应。这个效果使本发明缀合物在所有那些临床症状中的应用，其中所期望的是抑制基因的表达，所述基因与形成缀合物的一部分的核酸互补。
在抗抑郁治疗领域中这是一个重要的发现，因为本发明的寡核苷酸可以是有用的，以抵消上述的商品化的SSRI的副作用，即，起效缓慢和疗效有限。另外，通过应用本发明的高选择性寡核苷酸构建体，只需要给予低剂量的治疗用寡核苷酸就可以达到期望的效果。因此，本发明的构建体对治疗疾病是有用的，所述的疾病与突触区域的异常浓度的5-羟色胺相关的疾病，特别是与5-羟色胺传递不足相关的那些疾病(即突触中5-羟色胺浓度水平减少)，例如抑郁相关的病症。
相应地，如果核酸的靶向是针对突触前5-羟色胺能神经元的组分，缀合物将适用于治疗疾病，其中需要突触前5-羟色胺能神经元的活性降低。因此，在另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)或者去甲肾上腺素能和特异性5-羟色胺能抗抑郁剂(NASSA)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，所述靶分子选自5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)mRNA、5-羟色胺转运体mRNA、TREK-1mRNA、5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)多肽、5-羟色胺转运体多肽和TREK-1多肽
用于治疗或预防抑郁相关病症。
可选地，本发明涉及一种治疗或预防抑郁相关病症的方法，其包含向需要的受试者给药本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)或者去甲肾上腺素能和特异性5-羟色胺能抗抑郁剂(NASSA)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，所述靶分子选自5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)mRNA、5-羟色胺转运体mRNA、TREK-1mRNA、5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)多肽、5-羟色胺转运体多肽和TREK-1多肽。
此处所用的表达“抑郁相关病症”是指以突触中5-羟色胺的异常地低水平为特征的那些症状，和其在美国精神病学协会(American PsychiatricAssociation)，Washington DC出版的精神病的诊断和统计手册——第四版(Diagnostic  and  Statistical Manual of Mental Disorders--Fourth Edition)(DSM-IV)中所定义的，以及包括，不限于，严重抑郁症、长期抑郁症、治疗耐受性抑郁、精神抑郁症、以悲伤、绝望、挫折、“沮丧”、忧郁的感觉为特征的抑郁情绪的精神状态、低自我肯定感、内疚和自责、退出人际交往，以及躯体症状例如进食和睡眠紊乱。优选地，抑郁相关病症选自：严重抑郁、强迫性精神障碍(OCD)、综合性精神发育障碍(PDDs)、创伤后精神紧张性障碍(PTSD)、焦虑症、双相性精神障碍、进食障碍和慢性痛。
另外，本发明缀合物包含对5-羟色胺能神经元特异性的选择性试剂和下调5-HT1A受体的寡核苷酸的，释放在额前皮质中5-羟色胺增加大约基线值的150-200％，与由单独地抗抑郁剂产生的50％增加相比较(见图8)。如前所述，传统的抗抑郁剂是设计成改进5-羟色胺的传递的，但由于突触前5-HT1A受体的激活而只有有限的效果。因此，用本发明的寡核苷酸构建体，克服了所述抗抑郁剂的主要限制(起效缓慢和疗效有限)。因此，在短期内可以达到对抗抑郁剂治疗的积极响应，而且相对于只用商品化抗抑郁剂(即SSRI)治疗，可以提高适应治疗的患者的数目。因此，另一个方面，本发明涉及一种治疗抑郁相关病症的方法，其包含给药本发明的缀合物和抗抑郁剂。
本发明的寡核苷酸构建体可以与通用抗抑郁剂(SSRIs、NARIs、MAOI、TCA等)同时给药。寡核苷酸序列的给药阻断5-HT1A自身受体的表达，使这些抗抑郁剂的效果提高，其是通过对再摄取阻断产生的细胞外5-HT增加的衰减进行抑制实现的
D.2.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向于突触核蛋白
另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其是编码α-突触核蛋白或α-突触核蛋白多肽的mRNA
用于治疗或预防与路易体沉积有关的疾病。
术语“与路易体沉积有关的疾病”是指以α-突触核蛋白代谢的紊乱为特征的症状，其引起异常神经元α-突触核蛋白包涵体的形成。更具体的路易体病包括帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)、帕金森性痴呆(PDD)和多系统萎缩症。
优选地，本发明缀合物可能与商品化抗抑郁剂例如SSRI一起给药，用于治疗抑郁和/或抑郁相关病症。
D.3.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向于去甲肾上腺素转 运体
正如背景部分所解释的，中脑皮质的DA输送的增加可能对精神分裂症的治疗是有用的。由于NA转运体(NAT)对NA和DA显示类似的亲和力，NAT抑制剂优先地增加在内侧PFC(mPFC)中DA的细胞外浓度，与尾状核和伏隔核(NAc)相比。因此，来自蓝斑(LC)神经元的NA轴突可能促成调节PFC中DA的细胞外浓度，通过吸收或者共同-释放。
另一个方面，本发明涉及本发明的缀合物，其中
(i)选择性试剂选自多巴胺再摄取抑制剂、去甲肾上腺素再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，所述靶分子是编码去甲肾上腺素转运体或者去甲肾上腺素多肽的mRNA
用于治疗或预防由去甲肾上腺素再摄取的抑制介导的或对去甲肾上腺素再摄取的抑制敏感的疾病。
这样的医学症状包括，通过示例的方式，疼痛障碍例如神经性疼痛和慢性疼痛，抑郁症例如严重抑郁症，情感障碍例如焦虑症，注意力缺陷多动障碍，认知障碍例如痴呆，和应激性尿失禁。
D.4.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向于多巴胺-β-羟化酶
正如背景部分所解释的，中脑皮质的DA输送的增加可能对精神分裂症的治疗是由有用的。这种增加可能通过去甲肾上腺素转运体抑制剂的应用而实现，或者，可选地，通过抑制多巴胺-β-羟化酶而实现。这个酶是负责将多巴胺转化成去甲肾上腺素，并因此，当下调时，将导致NA神经元中的多巴胺水平的提高。这将依次产生在包含NA的去甲肾上腺素能囊泡中和较高水平的DA。这增加NA投射区的DA水平而改善脑的认知和记忆相关的功能。
因此，另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自去甲肾上腺素转运体抑制剂(SDNRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其是编码多巴胺-β-羟化酶或多巴胺-β-羟化酶多肽的mRNA
用于治疗或预防与去甲肾上腺素能投射的多巴胺不足的相关疾病。
此处所用的表达“与去甲肾上腺素能投射的多巴胺不足的相关疾病”是指与痴呆、抑郁和神经变性疾病相关的记忆和认知过程。
D.5.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向于BAX在另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自5-羟色胺-多巴胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SDNRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其是编码BAX或BAX多肽的mRNA
用于治疗或预防与神经元的细胞凋亡和细胞死亡相关的疾病。
此处所用的术语“与神经元的细胞凋亡和细胞死亡相关的疾病”是指许多人神经性障碍的“终点”，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病、中风/创伤、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化。海马的和皮质的神经元的细胞凋亡是阿尔茨海默病的症状的原因；使用神经递质多巴胺的中脑神经元的死亡是发生帕金森病的基础；亨廷顿病涉及纹状体中控制身体行动的神经元的死亡；以及下位运动神经元的死亡表现出肌萎缩侧索硬化。另外，脑缺血和创伤诱导小型脑区域的坏死，然后其通过细胞凋亡扩散神经元细胞消亡至更大的脑区域，由于坏死细胞释放的神经毒性物质。凋亡的神经元细胞的消亡还在老化的脑中观察到，作为一个生理过程。
D.6.包含核酸的缀合物，所述核酸是靶向于tau的
在另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自5-羟色胺-多巴胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SDNRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其是编码tau或Tau多肽的mRNA
用于治疗或预防tau相关疾病。
此处所用的术语“tau相关疾病”是指与Tau中异常相关的疾病以及“Tau病变”的疾病。Tau相关疾病包括，但不限于，包括额颞痴呆的亚型和17号染色体相关的帕金森综合征(FTDP-17)的额颞痴呆(frontotemporal dementia)、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、匹克氏病、嗜银颗粒病，以及帕金森病、唐氏综合征、脑炎后帕金森病、营养不良性肌强直、尼曼-皮克C型病、拳击手痴呆、Blint病、朊病毒病、肌萎缩侧索硬化、关岛型帕金森综合征、多发性硬化、青光眼、糖尿病视网膜病变，和外伤性脑损伤；以及亨廷顿病、路易体痴呆、恰克-马利-杜斯氏病、遗传性痉挛性截瘫、和多系统萎缩。此处定义的“Tau病变”意指与脑中的纤维化形式的Tau蛋白(缠结tangles)相关的神经变性疾病。这些疾病包括AD；但是，其他Tau病变包括，但不限于，包括额颞痴呆的亚型和17号染色体相关的帕金森症(FTDP-17)的额颞痴呆、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、匹克氏病和嗜银颗粒病。
D.7.包含核酸的缀合物，所述核酸靶向于亨廷顿
另一个方面，本发明涉及本发明缀合物，其中
(i)选择性试剂选自5-羟色胺-多巴胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SDNRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)以及
(ii)寡核苷酸能够特异性地结合至靶分子，其是编码亨廷顿或亨廷顿多肽的mRNA
用于治疗或预防亨廷顿相关疾病。
此处所用的术语“亨廷顿相关疾病”是指由突变型亨廷顿蛋白的异常构造或聚集或表达引起的疾病，并且包括，但不限于，亨廷顿病及其变种。
本发明的治疗量，其在特定病症或症状的治疗中将是有效的，将取决于障碍或症状的性质，并且可以通过标准临床技术进行确定，在治疗的给药方案中很好地建立。制剂中将采用的精确剂量还将取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应该根据医师的判断和患者的需要来决定。颅内给药的合适的剂量范围通常是每微升大约103至1015感染单位的病毒载体，以1至3000微升的单个注射体积中给药。每微升中载体的感染单位的添加量通常将包括10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、1014感染单位的病毒载体，以大约10、50、100、200、500、1000或2000微升给予。有效剂量可能从基于体外或体内试验系统的剂量-响应曲线中推知。
为了本发明缀合物的脑室内给药，具有接入口的多条导管可以植入到特定患者体内用于完整的治疗。在优选的实施方式中，每大脑或小脑半球有一个口和导管系统，并且也许有多个。一旦由神经外科医生完成植入，患者的神经科专家医生可以进行疗程治疗，所述的疗程治疗是在超过数周至数月的时间内重复弹丸注射缀合物，同时在这段时间内进行疗效的监测。装置可以保持植入若干月或年用于完整疗程的治疗。治疗效果证实后，接入口可能会选择地移除，并且可以密封并抛弃导管，或者同样移除。装置材料应当不干扰磁共振成像，并且，当然，小干扰RNA制剂必需与接入口和导管材料和任何表面包衣相容。
E.本发明缀合物的合成
本发明的缀合物的典型合成是使用有机合成中的标准程序来合成的。技术人员将理解的是，确切的合成步骤将取决于要被合成的缀合物的确切结构。例如，如果缀合物包含通过5’端缀合至选择性试剂的单个核酸链，那么合成通常按以下说明的进行，通过将氨基活化寡核苷酸和反应活化选择性试剂接触连接进行。
缀合物包含双链核酸时，那么正义和反义链单独合成并使用标准分子生物学程序体外退火。在典型的缀合物中，第一核酸链载有选择性试剂，和第二核酸链载有保护基团。还在一个更优选的实施方式中，选择性试剂偶联至第一核酸链的5’端和/或保护基团连接至第二核酸链的5’端，虽然选择性试剂的连接或保护基团的连接还可以在核酸链的3’端进行。
缀合物的合成可以按照以下进行：
[1]缀合物具有如下结构
选择性试剂-[寡核苷酸]-3’
典型地用以下步骤合成：
(i)活化选择性试剂。优选地，选择性试剂中的活化基团是琥珀酰亚胺基团或氨基；
(ii)在5’端活化寡核苷酸。优选地，寡核苷酸中的活化基团是氨基(其中选择性试剂已通过琥珀酰亚胺基团活化)或羧基(其中选择性试剂已通过氨基活化)以及
(iii)在适合两个活化基团之间反应的条件下，将活化的选择性试剂与活化的寡核苷酸接触连接。
[2]具有如下结构的缀合物
保护基团-[正义链]-3’
3’-[反义链]-选择性试剂
典型地使用以下步骤合成：
(i)活化选择性试剂。优选地，选择性试剂中的活化基团是琥珀酰亚胺基团或氨基，
(ii)在正义链的5’端活化正义链。优选地，寡核苷酸中的活化基团是氨基(其中选择性试剂已通过琥珀酰亚胺基团活化)或羧基(其中选择性试剂已通过氨基活化)，
(iii)在适合两个活化基团之间反应的条件下，将活化的选择性试剂与活化的正义链接触连接，
(iv)将保护基团添加至固定化的反义链。这个步骤优选地使用活性基团被乙酰化或苄化作用(呋喃基团)、2-氰乙基化(磷酸二酯连接)和FMOC(环外氨基)封闭的寡核苷酸来进行。
(v)将正义链和反义链退火。
E.1.包含核酸和连接至5’端的SSRI的缀合物的合成
本发明的缀合物可以用本领域技术人员已知的技术来制备得到。缀合物的合成可能涉及功能性基团的选择性保护和去保护。合适的保护基团是本领域技术人员公知的。例如，由Wuts，P.G.M.和Greene T.W.在《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)(第四版.Wiley-Interscience)，和Kocienski P.J.在《保护基团》(Protecting Groups)(第三版Georg Thieme Verlag)中提供的有机化学中的保护基团的综述。
在本发明的上下文中，以下术语的意思在下面详细说明：
-术语“C1-C6烷基”是指由碳和氢原子组成的线性或分支的烃基，其不包括不饱和基团，具有1至6，优选1至3(C1-C3烷基)个碳原子，以及其是通过单键结合在分子的其他部分上。烷基的例子包括但不限于烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基和己基。优选地，烷基是指甲基。
-术语“卤素”是指溴、氯、碘或氟。
-术语“卤烷基”是指如上所定义的烷基，其中至少一个氢原子被卤素原子所取代。卤烷基的例子包括但不限于CF3、CCl3、CHF2、CF2CF3。优选地，卤烷基是指CF3。
-术语“C6-C10芳基”是指具有6-10个碳原子的芳香基团，包含1或2个芳香核，借由碳-碳键或稠合来结合，包括例如苯基、萘基和二苯基。优选地，“芳基”是指苯基。
-术语“杂环基”是指稳定的3-至10-元环基，优选地5-或者6-元环，其由碳原子和1-5个选自氮、氧和硫的杂原子组成，并且其可以部分或完全饱和的或者芳香的(“杂芳基”)。为了本发明的目的，杂环可以使单环基、双环基或者三环基方式，其可以包括稠合环的方式。在一个具体的实施方式中，杂环基团是琥珀酰亚胺。
如上所描述的式(I)所表示的本发明的化合物可能包括立体异构体，其取决于手性中心的存在。单个异构体、对映体或非对应异构体及其混合物均落入本发明的保护范围。
除非另有说明，本发明所用的化合物意欲包括在一个或多个同位素富集原子存在下而仅仅不同的化合物。例如，除了用氘或氚替代氢，或者用13C-或者14C-富集碳或者15N-富集氮替代碳之外的具有本发明结构的化合物是在本发明的范围内。
i.用氨基衍生的核酸和活化的舍曲林衍生物合成
在第一个实施方式中，本发明的缀合物可以通过将氨基衍生的核酸偶联至舍曲林或其类似物的活化衍生物形式而获得，其中选择性试剂的活化衍生物是式(II)化合物：
Figure BPA00001657140801001
其中
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
R6是羰基活化基；
W选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
n和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。
术语“羰基活化基”是指羰基的取代基，其使羰基易发生亲核加成反应。在一个具体的实施方式中，它与羰基一起形成酸酐、酰卤或酯基。在一个优选的实施方式中，羰基活化基是选自卤素、-OC(O)R、-OR’、-SR”；其中R、R’和R”是独立地选自C1-C6烷基、卤烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
在一个具体的实施方式中，R6是琥珀酰亚胺基。因此，在另一个实施方式中，本发明的缀合物可以通过将氨基衍生的核酸偶联至舍曲林或其类似物的活化衍生物形式，其中选择性试剂的活化衍生物是式(III)化合物：
Figure BPA00001657140801011
其中
R1，R2，R3，R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
n和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。
根据具体的实施方式，式(III)的活化化合物是化合物(1)：
Figure BPA00001657140801021
根据一个实施方式，式(I)化合物可以通过以下顺序制备得到，包括：
a)式(IV)化合物
Figure BPA00001657140801022
与式(V)酰化剂反应：
Figure BPA00001657140801023
其中p如上所定义的，Z是卤素或OH以及PG是氨基保护基团以得到式(VI)化合物
Figure BPA00001657140801031
通常用于氨基的保护基团包括氨基甲酸酯类，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、9H-芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙基或者硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺类，例如甲酰胺类、乙酰胺类、三氟乙酰胺类、磺酰胺类、三氟甲基磺酰基酰胺类或者叔丁基磺酰基酰胺类；和芳基或者芳烷基胺类，例如p-甲氧基苯基、苄基、p-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或者单甲氧基三苯甲基胺类。在一个具体的实施方式中，式(V)酰化剂是9H-芴甲氧羰基-6-氨基己酸。
式(IV)化合物可以例如按照US6455736中所述的方法依次制备得到。具体地，当式(IV)化合物式舍曲林时，它可以从其相应的盐酸盐(可商业上购得的)用合适的碱处理得到，包括有机或无机碱例如碱或碱土金属的碳酸盐或氢氧化物、铵盐或者胺类例如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、哌啶、吗啉以及诸如此类。
b)式(IV)化合物中的氨基保护基团脱保护以生成式(VII)化合物：
Figure BPA00001657140801041
合适的脱保护条件是技术人员已知的，例如《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)(Wuts，P.G.M.andGreene T.W.，第四版.Wiley-Interscience)和《保护基团》(ProtectingGroups( )Kocienski P.J.，第三版.Georg Thieme Verlag)。在一个具体的实施方式中，保护基团是在存在胺的情况下除去的，例如哌啶、吗啉、二环己胺、二异丙基乙胺或二甲氨基吡啶，优选地是在哌啶存在下。
c)式(VII)化合物与式(VIII)或(IX)酰化剂反应：
Figure BPA00001657140801042
其中n如上所定义，以及Z是卤素或者OH，生成式(X)化合物：
Figure BPA00001657140801051
在一个具体的实施方式中，式(VII)酰化剂是琥珀酐，
d)用羰基活化基处理式(X)化合物。
术语“羰基活化基”是指一个化合物，其将羧酸基团的羰基转化为更易于亲核加成反应的化合物，例如酐类、羧酸卤化物、碳化二亚胺、卤化剂、二硫化物等等。在一个具体的实施方式中，羰基活化基是选自卤化剂、R(O)COC(O)R、RC(O)卤素、R’OH、R”SH、R”SSR”；其中R、R’和R”是独立地选自C1-C6烷基、卤烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
在一个具体的实施方式中，羰基活化基是N-羟基-琥珀酰亚胺。在这个情况下，反应优选地在存在另外的羰基活化基下进行。
因此，在一个具体的实施方式中，步骤d)包含用在存在另外的羰基活化基的情况下用N羟琥珀酰亚胺处理式(X)化合物。
适合这个方法的羰基活化基包括碳二亚胺类，例如二环己基碳二亚胺(DCC)和二异丙基碳二亚胺(DIC)以及三唑醇类(triazolols)，例如1-羟基-苯并三唑(HOBt)和1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)。在一个具体的实施方式中，式(VI)化合物在二异丙基碳二亚胺存在的情况下与N-羟基琥珀酰亚胺反应以提供式(II)的活化衍生物。
根据另一个方面，本发明指向式(VI)所示的中间体，
Figure BPA00001657140801061
其中R1-R5、X、Y、W、p和PG如上所定义。在一个优选的实施方式中，R1是甲基，R2-R5是氢，X和Y是氯，W是氢，p是5和PG是9H-芴甲氧羰基。更优选地，式(VI)化合物是化合物(2)
根据另一个方面，本发明指向式(VII)所示的中间体，
Figure BPA00001657140801063
其中R1-R5、X、Y、W和p如上所定义。在一个优选的实施方式中，R1是甲基，R2-R5是氢，X和Y是氯化物，W是氢，p是5。更优选地，式(V)化合物是化合物(3)
根据另一个方面，本发明指向式(X)所示的中间体
Figure BPA00001657140801072
其中R1-R5、X、Y、W、p和n如上所定义。在一个优选的实施方式中，R1是甲基，R2-R5是氢，X和Y是氯化物，W是氢，p是5和n是2。更优选地，式(VIII)化合物是化合物(4)
根据另一个方面，本发明指向式(II)所示的中间体，
其中R1-R6、X、Y、W、p和n如上所定义。
根据另一个方面，本发明指向式(III)所示的中间体
Figure BPA00001657140801082
其中R1-R5、X、Y、W、p和n如上所定义。在一个优选的实施方式中，R1是甲基，R2-R5是氢，X和Y是氯化物，W是氢，p是5和n是2。更优选地，式(II)化合物是化合物(1)
Figure BPA00001657140801083
将会连接至选择性试剂的siRNA链是在固体载体上通过逐步固相合成而形成的，所述形成的方法是根据M.J.Gait.IRL编辑1985年印刷的“寡核苷酸的合成，实用的方法(Oligonucleotide synthesis，a practical approach).”中所公开的方法。
为了缀合选择性配体，寡核苷酸需要被氨基衍生化。这可以在5’或3’端进行。在一个优选的实施方式中，选择性配体连接至5’端。
根据一个实施方式，式(I)的缀合物的制备可以通过将上面描述的式(II)或(III)化合物与式(XII)的氨基修饰的寡核苷酸进行反应得到：
Figure BPA00001657140801091
使用氨基接头修饰剂活化寡核苷酸的一般程序典型地是通过以下方案：
Figure BPA00001657140801092
式(XII)化合物可以通过将寡核苷酸的5’-OH基团与式(XIII)的氨基修饰剂反应而制备得到：
Figure BPA00001657140801101
其中m是如上所定义的，以及PG是胺保护基团。通常用于胺的保护基团包括氨基甲酸酯类，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、9H-芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙基或硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺类，例如甲酰胺、乙酰胺、三氟乙酰胺、磺酰胺、三氟甲基磺酰基酰胺或叔丁基磺酰基酰胺；以及芳基或芳烷基胺类，例如对甲氧基苯基、苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基胺。在具体的实施方式中，式(XIII)的氨基接头是6-(三氟乙酰胺基)己基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5′-TFA-C6-氨基修饰剂-CEP)或6-(4-单甲氧基三苯基甲基氨基)己基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5′-MMT-C6-氨基修饰剂-CEP)。
将寡核苷酸5’-OH基团的偶联至氨基接头之后，胺保护基团在已知的条件下去除。例如，TFA-保护的氨基衍生物可以用氨处理而脱保护；而MMT-保护的氨基衍生物可以用醋酸、氯乙酸、二氯乙酸或三氟乙酸处理而脱保护。
氨基修饰的寡核苷酸的一般合成方法：
(i)在无水乙腈中制备接头/修饰剂分子溶液(大多数商业可购得的氨基衍生物(amidite)使用的是0.1M溶液)并且将它放入合成仪的额外的槽中(Y)
(ii)在所需寡核苷酸序列合成开始时，在5’端加入Y碱基。这将使来自Y槽的接头/修饰剂分子偶联至寡核苷酸序列的末端。
(iii)使用恰当的偶联循环开始合成。相同的偶联循环将被用来实现接头/修饰剂分子偶联。
(iv)在寡核苷酸合成结束时，洗涤载体并最终用气体干燥载体
(v)从柱中取下固体载体，并将它转移进螺口小瓶中，并且完成2步脱保护。
氨基修饰的寡核苷酸应当被脱保护，用于选择性试剂进一步地缀合。为了下面这个目的，寡核苷酸上的所有剩余保护基团如下去除。将500μl的包含20％v/v甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v饱和氨溶液的混合液(包含30-32％w/v NH3)加入到含寡核苷酸(称重200nmole的量)的埃彭道夫管中。将管密封并加热45分钟至温度为65℃。这个过程除去核苷酸的磷原子上的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苄化和磷酸二酯连接的2-氰乙基化)，以及环外氨基的保护基团(Bz、Ac、IBu)。然后，混合物冷却并过滤，而且将上清液干燥。残留片状沉淀物用1M三乙胺-HF在65℃下反应3小时以分开核苷酸的2’的保护基团(2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)。最后，所得溶液在葡聚糖凝胶柱中脱盐，留下氨基修饰-5’-寡核苷酸。
在3’OH端结合氨基修饰剂接头的情况下；应当使用相应的聚合物载体(CPG球)并且合成方案相应的根据以下简图进行：
Figure BPA00001657140801121
(可以使用氢氧化铵或贝克曼试剂来进行水解)(甲胺∶氢氧化铵)
在两种情况下，脱保护步骤将是相同的，并且在这种情况下缀合方法也是相同的，但是具有不同程度的效率。在大多数情况下，用5’-氨基衍生化达到更好的结果。
在优选的实施方式中，寡核苷酸可以包含选自SEQ ID NO：5至12的序列。
然后，氨基活化的寡核苷酸与上面定义的式(II)或(III)选择性试剂的活化衍生物反应。获得具有如下结构的缀合物：
Figure BPA00001657140801122
其中R1-R5、X、Y、W、p和n是如上所定义的，以及m是2-10。
在一个优选的实施方式中，缀合物有如下结构：
Figure BPA00001657140801131
在具体的实施方式中，寡核苷酸是先与二价或三价磷酰胺反应。这样，就可以获得带2个或3个偶联位置的化合物，以便2个或3个选择性试剂分子能够偶联至寡核苷酸。所述2个或3个选择性试剂可以是相似的或不同的。
在具体的实施方式中，2个或3个相同的选择性试剂分子被偶联至寡核苷酸。在另一个实施方式中，2个或3个不同的选择性试剂被偶联至寡核苷酸。
在实施方式中，寡核苷酸与二价或三价亚磷酰胺反应生成式(XX)或(XXI)化合物：
其中
PG、PG”和PG”’是独立地选自H和羟基保护基团；
r、r’、r”、s、s’、s”、t和u是独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13；
v是独立地选自0和1；以及
X 1 、X 2 和X 3 是独立地选自CH2、O、S、NH、CO、C(O)O和C(O)NH。
羟基保护基团，以及合适的保护和脱保护条件，是技术人员已知的，例如在《有机化学中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)(Wuts，P.G.M.and Greene T.W.，第四版.Wiley-Interscience)和《保护基团》(Protecting Groups)(Kocienski P.J.，第三版.Georg Thieme Verlag)中。
在具体实施方式中，羟基保护基团选自醚类、甲硅烷基醚类、酯类、磺酸酯类、次磺酸酯类、亚磺酸酯类、碳酸酯类和氨基甲酸酯类。在优选的的实施方式中，羟基保护基团是选自乙酰基、苯甲酰基、苄基、甲氧基乙氧甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基甲基醚(MOM)、甲氧基三苯甲基(MMT)、p-甲氧基苄基醚(PMB)、甲硫基甲基醚、特戊酰(Piv)、四氢化吡喃基(THP)、三苯甲基(Tr)、9H-芴甲氧羰(Fmoc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚。优选地，PG、PG’和PG”是独立地选自H、DMT和Fmoc。
在具体的实施方式中，式(XX)或(XXI)化合物中的羟基保护基团是不同的，这样它们可以选择性地脱保护和偶联，如果期望的话，可以用不同的分子进行。
一个具体的实施方式是指向式(XX)化合物，其中r和r’是4，s和s’是1，t和v是0，X1和X2表示C(O)NH以及PG1和PG2是独立地选自H、DMT和Fmoc。另一个实施方式涉及式(XX)化合物，其中r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0，X1和X2表示CH2以及PG1和PG2是独立地选自H和DMT。
一个实施方式是指向式(XXI)化合物，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0，X1、X2和X3表示O以及PG1、PG2和PG3是独立地选自H和DMT。另一个实施方式涉及式(XXI)化合物，其中r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1，X1、X2和X3表示O以及PG1、PG2和PG3是独立地选自H和DMT。
然后，式(XX)和(XXI)化合物被脱保护，如果需要的话，并且与式(XIII)氨基修饰剂进行反应：
Figure BPA00001657140801151
其中m和PG是如上所定义的而分别获得式(XXII)或(XXIII)化合物：
Figure BPA00001657140801161
其中
m、m’、m”、r、r’、r”、s、s’、s”、t、u、v、X1、X2和X3是如先前所定义的。
式(XXII)和(XXIII)化合物可以进一步地与式(II)化合物进行反应，更优选的与式(III)化合物进行反应，分别生成缀合物(XXIV)和(XXV)：
其中
m、m’、m”、n、n’、n”、p、p’、p”、r、r’、r”、s、s’、s”、t、u、v、X1、X2、X3、R1-R5、W、X、Y和Z是如先前所描述的。
具体的实施方式指向如上所定义的式(XXIV)化合物。
另一个实施方式是指向式(XXIV)化合物，其中，选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，n和n’是2，m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。另一个实施方式涉及式(XXIV)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，n和n’是2，m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X和X’表示CH2。
具体的实施方式是指向上面定义的式(XXV)化合物。
一个具体的实施方式是指向式(XXV)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X、X’和X”代表O。另一个实施方式涉及式(XXV)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，n、n’和n”是2，m，m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X，X’和X”代表O。
ii.使用羧基衍生的核酸和氨基衍生的舍曲林进行合成
在另一个实施方式中，本发明缀合物是通过氨基衍生的选择性试剂和羧基衍生的寡核苷酸的缀合作用而获得的。
在一个具体的实施方式中，选择性试剂的活化衍生物是式(VII)化合物：
Figure BPA00001657140801191
其中
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W是选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
P是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。
根据具体的实施方式，如上所述的式(II)活化化合物是化合物(3)：
Figure BPA00001657140801192
如上面描述的式(VII)化合物可以通过以下顺序的步骤来制备，包括：
(i)式(IV)化合物
Figure BPA00001657140801201
与式(V)酰化剂反应：
Figure BPA00001657140801202
其中p是如上所定义的，Z是卤素或OH以及PG是胺保护基团以生成式(VI)化合物
Figure BPA00001657140801203
通常用于胺的保护基团包括氨基甲酸酯类，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、9H-芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙基或硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺类，例如甲酰胺类、乙酰胺类、三氟乙酰胺类、磺酰胺类、三氟甲基磺酰基酰胺类或叔丁基磺酰基酰胺；以及芳基或者芳烷基胺类，例如p-甲氧基苯基、苄基、p-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基的胺。在一个具体的实施方式中，式(VII)酰化剂是9H-芴甲氧羰基-6-氨基己酸。
式(III)化合物例如如上所述的依次制备得到。
(ii)式(VI)化合物中的氨基保护基团脱保护，生成式(VII)化合物：
Figure BPA00001657140801211
合适的脱保护条件是技术人员已知的，例如《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)(Wuts，P.G.M.andGreene T.W.，第四版..Wiley-Interscience)和《保护基团》(ProtectingGroups)(Kocienski P.J.，第三版Georg Thieme Verlag)。在具体的实施方式中，保护基团是在存在胺的情况下除去的，例如哌啶、吗啉、二环己基胺、二异丙基乙胺或二甲氨基吡啶，优选地存在哌啶。
在一个优选的实施方式中，氨基修饰的选择性试剂对应于式(3)化合物。
Figure BPA00001657140801212
将要连接至选择性试剂的siRNA链是在固体载体上通过逐步固相合成而形成的，所述形成的方法是根据M.J.Gait.IRL编辑1985年印刷的“《寡核苷酸合成，实用方法》(Oligonucleotide synthesis，a practical approach).”中所公开的方法。
为了缀合选择性配体，寡核苷酸需要被羧基衍生化。这可以在5’或3’端进行。在优选的实施方式中，选择性配体连接至5’端。
根据一个实施方式，式(XIV)缀合物可以通过将上面描述的式(VII)化合物和式(XV)的羧基修饰的寡核苷酸反应制备得到：
Figure BPA00001657140801221
使用羧基接头修饰剂活化寡核苷酸的一般程序是典型地通过以下方案进行：
Figure BPA00001657140801222
羧基修饰的寡核苷酸的合成的一般方法：
(i)在无水乙腈中制备修饰剂分子溶液并且将它放入合成仪的额外的槽中(Y)
(ii)在所需寡核苷酸序列合成开始时，在5’端加入Y碱基。这将使来自Y槽的接头/修饰剂分子偶联至寡核苷酸序列的末端。
(iii)使用恰当的偶联循环开始合成。相同的偶联循环将被用以实现接头/修饰剂分子偶联。
(iv)在寡核苷酸合成结束时，洗涤载体并最终用气体干燥载体
(v)从柱中取下固体载体，并将它转移进螺口小瓶中，并且完成2步脱保护。
羧基修饰的寡核苷酸应当被脱保护，以用于与选择性试剂进一步地缀合。为了下面这个目的，寡核苷酸上的所有剩余保护基团如下去除。将500μl的包含20％v/v甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v饱和氨溶液的混合液(包含30-32％w/v NH3)加入到含寡核苷酸(称重200nmole的量)的埃彭道夫管管中。将管密封并加热45分钟至温度为65℃。这个过程除去核苷酸的磷原子上的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苯甲酰化和磷酸二酯连接的2-氰乙基化)，以及环外氨基的保护基团(Bz、Ac、IBu)。然后，混合物冷却并过滤，而且将上清液干燥。残留片状沉淀物用1M三乙胺-HF在65℃下反应3小时以分开核苷酸的2’的保护基团(2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)。最后，所得溶液在葡聚糖凝胶柱中脱盐，留下羧基修饰的-5’-寡核苷酸。
在优选的实施方式中，寡核苷酸可以包含选自SEQ ID NO：5至12的序列。
然后，羧基活化的寡核苷酸与上面定义的式(VII)选择性试剂的活化衍生物反应，获得的化合物通式如下：
Figure BPA00001657140801241
在具体的实施方式中，缀合物具有结构
Figure BPA00001657140801242
在另一个具体的实施方式中，缀合物具有结构
Figure BPA00001657140801243
在实施方式中，寡核苷酸首先与二价或三价亚磷酰胺反应，生成前面定义的式(XX)或(XXI)化合物。然后，式(XX)和(XXI)化合物被脱保护，如果需要的话，并与羧基修饰剂反应，分别得到式(XXVI)或(XXVII)化合物：
Figure BPA00001657140801251
其中
m、m’、m”、r、r’、r”、s、s’、s”、t、u、v、X 1 、X 2 和X 3 是如前所定义的。
式(XXVI)和(XXVII)化合物可以进一步地与式(VII)化合物反应，分别生成缀合物(XXVIII)和(XXIX)：
Figure BPA00001657140801261
其中
m、m’、m”、p、p’、p”、r、r’、r”、s、s’、s”、t、u、v、X1、X2、X3、R1-R5、W、X、Y和Z是如前所描述的。
具体实施方式是指向上面定义的式(XXVIII)的化合物。
具体实施方式是指向式(XXVIII)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。另一个涉及式(XXVIII)化合物的实施方式，其中选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X和X’表示CH2.
具体的实施方式是指向式(XXVIII)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，m和m’是9，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。另一个涉及式(XXVIII)化合物的实施方式，其中选择性试剂是舍曲林，p和p’是5，m和m’是9，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X和X’表示CH2。
一个具体的实施方式是指向如上所定义的式(XXIX)化合物。
一个具体的实施方式是指向式(XXIX)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X、X’和X”代表O。另一个涉及式(XXIX)化合物实施方式，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X、X’和X”代表O。
一个具体的实施方式是指向式(XXIX)化合物，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，m、m’和m”是9，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X、X’和X”代表O。另一个涉及式(XXIX)化合物的实施方式，其中选择性试剂是舍曲林，p、p’和p”是5，m、m’和m”是9，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X、X’和X”代表O。
iii.使用羧基衍生的核酸和氨基衍生的诺米芬辛进行合成
诺米芬辛及其类似物包含氨基，其原则上可以用于偶联至羧基修饰的寡核苷酸。但是，氨基直接地偶联至芳环上，导致其反应性降低和立体位阻。因此，氨基修饰的诺米芬辛或者其变体被制成具有式(XVI)的化合物：
Figure BPA00001657140801281
其中R1表示氢、烷基C1-C6基或者苄基
R2表示氢、甲基、氯或者氟基团
R2’表示氢、甲基、甲氧基、羟基或者卤素原子
R3和R4表示氢、烷基C1-C6基团
R5表示在5-或6-位的氢、氯或者甲氧基以及
p是2-6
在一个具体的实施方式中，选择性试剂的活化衍生物是化合物(5)，其中R1、R2、R2’、R3和R5是H以及R4是甲基。
Figure BPA00001657140801291
根据一个实施方式，式(XVI)化合物可以通过以下顺序来制备，包括：
a)式(XVII)化合物
Figure BPA00001657140801292
与式(V)酰化剂反应：
其中p是如上所定义的，Z是卤素或者OH以及PG是氨基保护基团，生成式(XVIII)化合物
Figure BPA00001657140801301
通常用于氨基的保护基团包括氨基甲酸酯类，例如叔丁基、苄基、2，2，2-三氯乙基、2-三甲基硅烷基乙基、9H-芴甲氧羰基(Fmoc)、烯丙基或者硝基苯基氨基甲酸酯；酰胺类，例如甲酰胺类、乙酰胺类、三氟乙酰胺类、磺酰胺类、三氟甲磺酰胺类，叔丁基磺酰胺，和芳基烷基胺例如p-甲氧基苯基、苄基、p-甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、二甲氧基三苯甲基或者单甲氧基三苯甲基的胺。在一个具体的实施方式中，式(V)酰化剂是9H-芴甲氧羰基-6-氨基己酸。
相应地，式(XVII)化合物可以例如描述在US4185105中所述的方法制备得到。具体来说，当式(III)化合物是诺米芬辛时，它可以从它的相应的盐酸盐(可商业购得的)用适合的碱处理而得到，包括有机或无机碱例如碱金属的或碱土金属的碳酸盐或氢氧化物、铵或者胺例如三甲胺、三乙胺、二异丙基乙胺、吡啶、哌啶、吗啉以及诸如此类。
b)式(XVIII)化合物中的氨基保护基团脱保护，生成式(XIX)化合物：
Figure BPA00001657140801311
合适的脱保护条件是技术人员已知的，例如《有机合成中的保护基团》(Protecting Groups in Organic Synthesis)(Wuts，P.G.M.和GreeneT.W.，第四版..Wiley-Interscience)和《保护基团》(ProtectingGroups)(Kocienski P.J.，第三版.Georg Thieme Verlag)。在一个具体的实施方式中，保护基团是在存在胺的情况下除去的，例如哌啶、吗啉、二环己胺、二异丙基乙胺或二甲氨基吡啶，优选在哌啶存在下除去。
根据另一个方面，本发明是指向式(XVIII)所示的中间体，
Figure BPA00001657140801312
其中R1-R5、X、Y、W、p和PG是如上所定义的。在一个优选的实施方式中，R1是甲基、R2-R5是氢，X和Y是氯化物，W是氢，p是5以及PG是9H-芴甲氧羰基。更优选地，式(XVIII)化合物是化合物(8)
Figure BPA00001657140801321
将要连接至选择性试剂的核(nucleic)是在固体载体上通过逐步固相合成而形成的，所述形成的方法是根据M.J.Gait.IRL编辑1985年印刷的“寡核苷酸的合成，实用的方法(Oligonucleotide synthesis，a practical approach).”中所公开的方法。
为了缀合至选择性配体，寡核苷酸需要被羧基衍生化。这可以在5’或者3’端进行。在一个优选的实施方式中，选择性配体连接至5’端。
根据一个实施方式，式(XVI)缀合物可以通过上面描述的式(XIX)化合物和式(XV)的氨基修饰的寡核苷酸反应而制备得到：
其中m是2至6
使用羧基活化寡核苷酸是按照上面所说明的进行。
在一个优选的实施方式中，偶联至诺米芬辛或其衍生物的寡核苷酸是选自：
(i)核酸，其是与α-突触核蛋白互补的，优选地，核酸是包含选自任一序列SEQ ID NO：16-36中序列。
(ii)核酸，其是与BAX互补的，优选地是包含序列SEQ IDNO：38的核酸。
(iii)核酸，其是与Tau互补的
(iv)核酸，其是与NET互补的，以及
(v)核酸，其是与亨廷顿互补的，优选地，核酸是包含选自任一序列SEQ ID NO：39-55中序列。
然后，羧基活化的寡核苷酸与如上所定义的式(XVI)选择性试剂的活化衍生物反应，得到下述通式化合物：
在一个优选的实施方式中，缀合物具有结构
Figure BPA00001657140801332
在另一个优选的实施方式中，缀合物具有结构
Figure BPA00001657140801341
在一个具体的实施方式中，式(XVI)化合物与式(XXVI)或者(XXVII)化合物反应，分别生成缀合物(XXX)和(XXXI)：
Figure BPA00001657140801342
其中
m、m’、m”、p、p’、p”、r、r’、r”、s、s’、s”、t、u、v、X1、X2、X3和R1-R5是如前面所描述的。
一个具体的实施方式是指向如上所定义的式(XXX)化合物。
一个具体的实施方式是指向式(XXX)化合物，其中选择性试剂是诺米芬辛，p和p’是5，m和m’是6，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。另一个涉及式(XXVIII)化合物的实施方式，其中选择性试剂是诺米芬辛，p和p’是5，m和m’是6，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X和X’表示CH2。
一个具体的实施方式是指向式(XXX)化合物，其中选择性试剂是诺米芬辛，p和p’是5，m和m’是9，r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。另一个涉及式(XXVIII)化合物的实施方式，其中选择性试剂是诺米芬辛，p和p’是5，m和m’是9，r是2，r’是0，s是1，s’是0，t和v是0以及X和X’表示CH2。
一个具体的实施方式是指向如上所定义的式(XXXI)化合物。
一个具体的实施方式是指向式(XXXI)化合物，其中选择性试剂是诺米芬辛，p、p’和p”是5，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X、X’和X”代表O。另一个涉及式(XXXI)化合物的实施方式，其中选择性试剂是诺米芬辛，p、p’和p”是5，m、m’和m”是6，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X、X’和X”代表O。一个具体的实施方式是指向式(XXXI)化合物，其中选择性试剂是诺米芬辛，p、p’和p”是5，m、m’和m”是9，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，v是0以及X、X’和X”代表O。另一个实施方式涉及式(XXXI)化合物，其中选择性试剂是诺米芬辛，p、p’和p”是5，m、m’和m”是9，r、r’和r”是3，s、s’和s”是1，t是1，u是3，v是1以及X、X’和X”代表O。
iv.使用羧基衍生的核酸、双功能接头、氨基衍生的诺米 芬辛和氨基衍生的舍曲林合成双重衍生的寡核苷酸
式(XX)和(XXI)化合物中的羟基保护基团PG、PG’和PG”可以是类似的或不同的。
在一个具体的实施方式中，式(XX)化合物中的PG和PG’是不同的，这样它们可以独立地脱保护，并且如果需要的话，式(XX)化合物可以与2个不同的活化的选择性试剂偶联。
在一个具体的实施方式中，PG和PG’不同的式(XX)化合物是连续地与羧基修饰剂反应，以及然后与式(VII)化合物反应，而其他偶联位置是与羧基修饰剂反应，以及然后与式(XVI)化合物反应，生成式(XXXII)缀合物
Figure BPA00001657140801371
其中m、m’、p、p’、r、r’、s、s’、t、u、v、X1、X2and R1-R5、X、Y和Z是如前所述的。
在一个优选的实施方式中，PG和PG’不同的式(XX)化合物是连续地与羧基修饰剂反应，以及然后与式(10)化合物反应，而其他偶联位置是与羧基修饰剂反应，以及然后与式(11)化合物反应，生成式(XXXIIa)缀合物。
Figure BPA00001657140801381
其中r、r’、s、s’、t、u、v、X1和X2是如前所述的。
在一个具体的实施方式中，在式(XXXII)或(XXXIIa)化合物中r和r’是4，s和s’是1，t和v是0以及X和X’表示C(O)NH。
在本发明的一个具体的实施方式中，PG和PG’不同的式(XX)化合物是式(XXa)化合物
Figure BPA00001657140801382
在一个优选的实施方式中，式(XXXIIa)化合物具有如下结构式：
Figure BPA00001657140801391
在一个具体的实施方式中，本发明是指向式(XXXII)和化合物(XXXIIa)，其中m、m’、p、p’、r、r’、s、s’、t、u、v、X1、X2和R1-R5、X、Y和Z是如前所述的。
在一个优选的实施方式中，本发明涉及如上所定义的化合物(12)。
E.2.包含核酸和连接至5’端的保护基团的缀合物的合成.
合成从保护基团加入到第一条链开始。其中保护基团是由多个部分形成的，形成保护基团的部分的不同部分被加入到核酸中，所述加入方法使用的类似将核苷酸加入到预成核酸时所用的方法，即，为了增加游离羟基的反应性，将被加入的基团首先被活化。适合的活化试剂包括，但不限于，磷硫酰化合物、氨基甲酸酯化合物、甲基-膦酸酯化合物、胍鎓、氨基磺酸酯化合物、磺酰胺化合物、甲酰乙缩醛化合物、硫代甲酰乙缩醛化合物、砜化合物、氨基磷酸酯化合物。在一个优选的实施方式中，保护基团的基团是用亚磷酰胺化合物及其混合物活化的。
适合于活化游离OH基团的典型的磷酰胺是，例如，
下式的(2-氰乙基)N，N，N’，N’-四(二异丙基)磷二酰胺：
Figure BPA00001657140801401
和下式的(2-氰乙基)N-二异丙基，N’-烷基胺亚磷酰胺：
其中n是6-12
典型的反应包括以下步骤：
A)呋喃糖单元(恰当的化学计量对于本领域技术人员来说是知道的)在有利于仅在伯醇羟基位置反应的条件下与4，4’-二甲氧三苯甲基氯(DMTr-Cl)反应。然后，剩余的羟基与乙酰化或者苯甲酰化保护基团反应。典型地，活化的呋喃糖具有结构：
Figure BPA00001657140801403
B)感兴趣的siRNA的一条链(其可以是正义(s)链或者反义(a)链)是通过在固相载体上固相合成逐步形成的，其中生长链中的末端亚单位的5’-OH基团，其正常情况下是由二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的，将其放在酸性条件下，用以除去5′-OH DMT保护基团，而嘌呤和嘧啶碱基仍然受(芴-9-基)甲氧羰基(FMOC)保护。其他适合的保护基团是具有结合至氨基磷酸酯化合物、磷硫酰化合物和O-甲基(氧甲基)和O-乙基(氧乙基)基团的6-元吗啉环的化合物。
C)siRNA链的脱保护5’-OH基团与步骤A)的呋喃糖反应，从而获得初级-缀合的寡核苷酸。最后，在酸性条件下，呋喃糖的伯醇羟基的DMT保护基团离开5’-OH基团而除去。
D)具有6个乙二醇单体(12个碳原子和6个氧原子)的活性C18元接头(以下称为C18)烷撑二醇单体是在亚磷酸化条件下通过加入到末端OH的亚磷酰胺化合物而形成，例如上面描述的(2-氰乙基)N，N’-二异丙基亚磷酰胺。
亚磷酰胺化合物对存在于聚核苷酸或寡核苷酸骨架中的那些磷酸二酯连接的产生是尤其有用。用于制造活性聚乙二醇的其他适合的化合物是具有结合至氨基磷酸酯化合物、磷硫酰化合物和O-甲基(氧甲基)和O-乙基(氧乙基)基团的6-元吗啉环的化合物。
典型地，具有6个乙二醇的活性(C18)烷撑二醇单体具有结构
Figure BPA00001657140801411
E)呋喃糖-siRNA链的脱保护的5’-OH基团与步骤D)的活性(C18)烷撑二醇单体进行反应，从而获得具有下式的第二-缀合寡核苷酸：
DMT-(C18)烷撑二醇-磷酸二酯-呋喃糖-磷酸二酯-RNA链。
F)(C18)烷撑二醇的伯醇羟基的DMT保护基团是在酸性条件离开5’-OH基团而除去的。
G)(C18)烷撑二醇-磷酸二酯-呋喃糖-磷酸二酯-RNA链的脱保护的5’-OH基团是与像步骤D)那样与第二活性(C18)烷撑二醇单体反应，从而获得具有下式的第三-缀合寡核苷酸：
DMT-(C18)烷撑二醇-磷酸二酯-(C18)烷撑二醇-磷酸二酯-呋喃糖-磷酸二酯-RNA链。
H)(C18)烷撑二醇端的伯醇羟基的DMT保护基团是在酸性条件下离开5’-OH基团而除去，用于进一步处理。
当保护基团包括脂质部分时，用于获得本发明的寡核苷酸构建体的方法中包括在步骤H)和(I)之间的额外的步骤，其中脂质部分，优选地以脂肪酸的活性酯、胺、硫醇或者酸的形式，是结合至末端基团(呋喃糖或者C18烷撑二醇，视情况而定)。本领域技术人员可以选择恰当的条件、试剂等以进行所述步骤，根据脂质和所述基团的性质。优选的条件在于用亚磷酰胺化学的脂肪酸衍生化产生活化分子，其可以通过5’-OH或者3’OH游离末端通过磷酸二酯键缩合至寡核苷酸构建体。
E.3.通过退火缀合物合成siRNA，所述缀合物为包含第一 核酸和连接至5’端的保护基团保护的缀合物和包含核酸互补链的 缀合物和连接至5’的SSRI的缀合物
如上面E.1中描述的获得的缀合至SSRI的siRNA的互补链是与如E.2中所定义得到的修饰的siRNA链一起退火的。为了这个目的，RNA链中的所有剩余保护基团先进行去除如下。将500μl的包含20％v/v甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v饱和氨溶液的混合液30(包含30-32％w/v NH3)加入到含寡核苷酸(称重200nmole的量)的埃彭道夫管中。将管密封并加热45分钟至温度为65℃。这个过程除去核苷酸的磷原子上的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苄基化和磷酸二酯连接的2-氰乙基化)，以及环外氨基的保护基团(FMOC)。然后，将混合物冷却并过滤，而且将上清液干燥。残留片状沉淀物用1M三乙胺-HF在65℃下反应3小时以除去核苷酸的2’的保护基团(2’-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)。最后，所得溶液在葡聚糖凝胶柱中脱盐。
适用于形成这样的双链结构的核酸退火条件是由Joseph Sambrook等(《分子克隆，实验手册》冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，2001(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001))和Haymes，B.D.等(《核酸杂交实用方法》，IRL出版，华盛顿，1985，(Nucleic Acid Hybridization，A PracticalApproach，IRL Press，Washington，D.C.，1985))所描述的。
本发明的寡核苷酸构建体的效果举例如下。实施例2表明了本发明的siRNA寡核苷酸序列，与相应的裸露形式的siRNA相比，很大程度上阻断了靶标突触前5-HT1AR的表达，所述的本发明的siRNA寡核苷酸序列，是带有连接至siRNA的一条链的呋喃糖和一个双C18烷撑二醇以及通过连接臂连接至其他链的舍曲林。
F.诊断用缀合物及其应用
通过使用选择性试剂将治疗化合物特异性地递送至靶细胞的可能性还可以应用于可用作诊断目的的化合物的递送，所述选择性试剂是能够高亲和性地结合至神经递质转运体的。因此，在另一个实施方式中，本发明提供的缀合物，包含
(i)至少一个选择性试剂，其特异性地结合至一个或多个神经递质转运体，和
(ii)显像剂。
术语“选择性试剂”和“神经递质转运体”已在上面详细地描述，并且在本发明的诊断用缀合物中可以做同样地理解。
术语“显像剂”和“造影剂”在此处可以互换使用，并且是指生物相容的化合物，它的使用有助于图像不同部分的区分，其是通过增加图像的那些不同区域之间的“对比度”。因此，术语“造影剂”包含用于增强图像的质量的试剂，但是图像可能在没有这样的试剂下产生(这种情况，例如MRI)，也有试剂是产生图像的必须条件(这种情况，例如核成像)。适合的造影剂包括，不限于，用于放射性核素成像、计算机控制体层摄影、拉曼光谱、磁共振成像(MRI)和光学成像的造影剂。
用于放射性核素成像的造影剂包括通常用正电子发射体例如11C、13N、15O、18F、82Rb、62Cu和68Ga标记的放射性药物。SPECT放射性药物是通常用正电子发射体例如94mTc、201Tl和67Ga来标记。放射性核素显像模式(正电子发射断层扫描，(PET)；单光子发射计算体层扫描(SPECT))是诊断用的横断层面成像技术，其映射放射性核素-标记的放射性示踪剂的位置和浓度。PET和SPECT可以用于通过测量代谢活性来定位和表征放射性核素。PET和SPECT提供关于细胞水平的信息，例如细胞活的成活力。在PET中，患者口服或注射少量发射正电子的放射性物质，就可以监测其在身体中的移动，在一个通常的应用中，例如，给予患者连接正电子放射体的葡萄糖，以及在他们执行各种任务时监测他们的脑部。由于大脑在它工作的时候使用葡萄糖，PET成像显示了脑部的哪里活动是活跃的。在本发明的某些实施方式中，细胞被体外标记用于PET或SPECT的体内成像。与PET紧密相关的是单光子发射计算体层扫描，或者SPECT。这两者之间的主要不同是其代替了正电子发射物质，SPECT使用发射低能光子的放射性示踪剂。
用于CT成像的造影剂包括，例如，碘化的或者溴化的造影剂。这类试剂的例子包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘油和碘番酸盐。也有报道钆试剂用作CT造影剂(参见，例如，Henson et al.，2004)。例如，钆喷酸试剂已被用作造影剂(在Strunk和Schild中有讨论，2004)。在本发明的上下文中，计算体层扫描(CT)作为成像模式被仔细考虑。通过捕获来自不同角度的一系列X-射线，有时超过一千，以及然后将它们用计算机组合，CT使建立身体任何部位的三维图像成为可能。计算机按照程序以显示来自各个角度和各个深度的二维片层。在CT中，静脉注射不透X线造影剂例如此处描述的那些可以帮助软组织肿块的识别和描绘，当最初的CT扫描不是诊断的时候。
用于光学成像的造影剂包括，例如，荧光素、荧光素衍生物、吲哚菁绿、俄勒冈绿(Oregon green)、俄勒冈绿衍生的衍生物、若丹明绿(rhodamine green)、若丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红、德克萨斯红、特克萨斯红的衍生物、孔雀绿、纳米金磺基琥珀酰亚胺酯(nanogoldsulfosuccinimidyl ester)、级联蓝(Cascade blue)、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑衍生物、级联黄染料(Cascade yellow dye)、Dapoxyl染料和此处所公开的各种其他荧光化合物。
在一个优选的实施方式中，造影剂是能够由磁共振成像仪器所成像的化合物。能够由磁共振成像仪器所成像的造影剂与用在其他成像技术中的那些是不同。他们的目的是为了帮助具有相同信号特征的组织元件之间的识别，以及为了缩短松弛时间(其将在T1-加权的自旋回波MR影像中产生更强的信号以及在T2-加权影像中产生较少强度的信号)。MRI造影剂的例子包括钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物和铁颗粒。在一个具体的实施方式中，MRI造影剂是19F。CT和MRI都提供解剖学上的信息，用于帮助辨别组织的边界。与CT相比较，MRI的缺点包括较低的患者低耐受性，在起搏器上的禁忌和某些其他植入的金属装置，以及与多种原因相关的人工制品，其中不仅仅是运动。另一个方面，CT是快速的，良好的耐受性以及容易获得的，但是具有比MRI低的对比度分辨率以及需要碘化造影和电离辐射。CT和MRI都有的缺点是两种成像模式都不提供细胞水平上的功能信息。例如，两种模式都不提供关于细胞活力的信息。磁共振成像(MRI)是一种比CT新的成像模式，其使用高强度的磁铁和射频信号用以产生图像。生物组织中最丰富的分子种类是水。就是水质子核的量子力学“自旋”而最终使在成像实验中产生信号。在MRI中，用于成像的样品被放置在强静电磁场(1-12特斯拉)并且用射频(RF)的脉冲激发自转以在样品中产生净磁场。然后，各种磁场梯度和其他RF脉冲作用于自转，以将空间信息编码成为记录信号中。通过收集和分析这些信号，有可能计算出三维图像，其，如同CT影像，是正常地显示在二维片层上。
MRI造影剂包括金属的复合物，所述金属选自铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)。在优选的实施方式中，能够通过磁共振成像仪器成像的化合物是钆基化合物。
此处所用的术语“钆基化合物”将意指，就成像方面而论，可给药于受试者的任何含钆物质，其导致血管内的增强作用。在另一个实施方式中，含钆造影剂是选自钆、钆乙琥红霉素(gadolinium pentate)和钆双胺。
含钆造影剂的给药量是在每kg体重大约10mg的量变化。在另一个实施方式中，第二次磁共振成像在给药含钆造影剂大约45分钟后进行。本发明还提供上述方法，其进一步包含向受试者腹膜内给药盐水溶液(例如，林格式溶液)的步骤，其接着步骤(c)或步骤(d)的给药。
本发明还提供如上所定义的缀合物作为诊断用试剂的用途，以及用于在表面表达神经递质转运体的细胞的检测方法。
根据将被成像的细胞类型，缀合物将结合一种或多种选择性试剂。下表描述了根据将要被成像的细胞类型而可以使用的选择性试剂。
Figure BPA00001657140801481
本发明还提供多模式成像方法。本发明的某种实施方式是关于受试者或者受试者内的位置成像的方法，使用包括测量多重信号的多重成像模式。在某些实施方式中，多重信号的由细胞上或内的单个标记引起。如上文所述，本领域技术人员已知的任何成像模式可以应用于本成像方法的这些实施方式中。
成像模式在标记组合物例如标记细胞的给药期间或者给药之后的任何时间进行。例如，成像研究可以在本发明的标记细胞给药期间或者在其后的任何时间进行，即，以帮助将导向给药至特定部分。
额外的成像模式可以与第一成像模式同时进行，或者在第一成像模式后的任何时间进行。例如，额外的成像模式可以在第一成像模式完成后的大约1秒、大约1小时、大约1天或者更长的时间进行，或者在任何的这些给定时间之间的任何时间进行。在本发明的某种实施方式中，多重成像模式是同时进行的，这样使它们在标记细胞或试剂给药后的相同时间开始。本领域技术人员应当熟悉本发明关注的各种成像模式。
在本成像方法的一些实施方式中，第一成像模式和第二成像模式是由相同的成像仪器执行。在其他实施方式中，不同的成像模式由不同的成像仪器执行。本领域技术人员应当熟悉可用于此处所述的成像模式的成像仪器。
本发明提供使用一个或多个成像模式的成像细胞的方法。在一些实施方式中，细胞用多重成像试剂标记，以及在其他方面，细胞用单一标记试剂标记。在某种实施方式中，单一标记试剂是多模式可测试剂。
以下实施例和附图是以说明的方式提供，而并不是意图限制本发明。
实施例
实施例1
包含舍曲林和寡核苷酸的本发明缀合物的合成
活化的舍曲林(4)的合成
活化的舍曲林按如下所示方案进行制备。
A.1.化合物(1)的合成
盐酸舍曲林(市购的，34mg)、9H-芴甲氧羰基-6-氨基己酸a(Fmoc-ACA，49mg)、DMF(2ml)、N-甲基-吗啉(22l)和O-(苯并三氮唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU，68mg)的混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC(10％CH3OH/CHCl3)跟踪反应。蒸发混合物得到浓稠的油，其进一步用3×5ml的Pet-乙醚洗涤。将2ml水加入到油状混合物中，所得沉淀物再次用2×10ml的水洗涤。用20ml的二氯甲烷(DCM)将沉淀物溶解并用20ml NaCl溶液洗涤，然后用Na2SO4干燥。溶液蒸发至干燥，然后在机械泵中干燥得到固体(129mg粗品)。用硅胶柱色谱法纯化该粗品，用1％甲醇/DCM、2％甲醇/DCM、然后5％甲醇/DCM洗脱。合并馏分并蒸发至干燥。产品真空干燥6小时并产生90mg纯化合物(1)。
A.2.化合物(2)的合成
将化合物(1)(90mg)在3ml的含20％哌啶的DCM中溶解1小时。通过TLC(10％甲醇/CHCl3)跟踪反应。蒸发反应混合物至得到油，其用3×10ml Pet-乙醚洗涤。所得粗品化合物(54mg)足够纯可以用于下一步反应而不用进一步地纯化。
A.3.化合物(3)的合成
化合物(2)(54mg)、吡啶(3ml)、琥珀酐(16mg)和N，N-二甲氨基吡啶(DMAP，18mg)的混合物在室温下搅拌过夜。通过TLC(85∶10∶5＝DCM∶甲醇∶醋酸)跟踪反应。10ml水加入反应中。将反应混合物浓缩成胶状物，然后用10ml的DCM混悬。有机相用2×10ml NaHCO3溶液、10ml 5％的柠檬酸溶液和10ml盐水洗涤。得到的溶液用硫酸钠干燥并蒸发得到白色泡沫的化合物(3)(46mg)。
A.4.化合物(4)的合成
化合物(3)(46mg)、羟琥珀酰亚胺(13mg)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC，60l)和DCM(4ml)的混合物在室温下搅拌过夜，并用TLC(10％甲醇/CHCl3)跟踪反应。溶液蒸发至干燥以获得150mg的粗制固体。粗的展开剂为包含1％醋酸的7％甲醇/CHCl3体系。切下恰当的条带并放置在过滤漏斗中。用15％甲醇/CHCl3洗脱后，溶液蒸发至干燥以获得35mg的化合物(4)(HPLC纯度为98％)。
B.氨基修饰的寡核苷酸(5)和(6)的合成
合成是在自动合成仪中进行，分别使用市购的氨基接头6-(4-单甲氧基三苯基甲氨基)己基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5′-MMT-C6-氨基修饰剂-CEP)和6-(三氟乙酰胺基)己基-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(5′-TFA-C6-氨基修饰剂-CEP)。
接下去的步骤如下：
1.-氨基-接头-CEP在惰性气氛(氩或氮)中溶解在无水乙腈(1ml中100μM)。溶液放入一个干净的额外的槽中(Expedite 8900合成仪的位置5-9或者任何其他合成仪的备用孔)。用手操作数秒或者使用启动程序启动线路，以便输送管充满试剂。
2.-写入期望的序列；5’-端有备用碱基位置(5-9)，以便通过仪器在合成的最后一步加入修饰的试剂。
3.-验证序列，其有用于合成程序的DMT选项，因为寡核苷酸需要HPLC纯化。
4.-使用仪器中合适规模(0.2-1.0μM)的匹配程序来开始合成。
5.-在合成的结束时，将柱从仪器上分离并使用注射器用乙醇(3×1mL)来冲洗支架以除去残留的酸(来自脱三苯甲基步骤)和碘(来自氧化步骤)。
C.寡核苷酸从支架上脱保护并除去
进行下列步骤：
1.-将来自前述步骤的干燥支架转移到螺口小瓶(1.5-2mL)中。
2.-加入500μL(0.2μM的量)的浓缩的NH4OH(30％)溶液。
3.-盖紧帽子，并在55℃下悬挂孵育8h至过夜(为了得到富有G-序列应当给予更长的时间)。
4.-上清液冷却至0℃，并转移到另一个微量管。
5.-用相同量的d-水漂洗支架，并且洗脱物加入到氨上清液中。所得氨溶液包含全长的寡核苷酸，以及非核苷材料和短序列一起，所述的全长寡核苷酸是5’-端具有游离氨基己烷基(在加入N-TFA-氨基己烷基亚磷酰胺的情况)的寡核苷酸，或者具有受保护的氨基己烷基连接的寡核苷酸，
具有游离氨基己烷基接头的寡核苷酸的纯化可以通过阴离子交换HPLC、乙醇沉淀或聚丙烯凝胶电泳(PAGE)来实现。
D.活化舍曲林并入到游离伯胺上
用步骤A中获得的N-羟琥珀酰亚胺酯衍生物标记步骤B和C中获得的5’-端氨基接头的寡核苷酸的，在溶液相中根据下列步骤进行：
A.-标记并入
1.-来自前述步骤的部分或全部纯化的氨基连接的寡核苷酸(20-25ODU A260～700μg)溶解在250μL的1.0M NaHCO3/Na2CO3(pH 9.0)的混合物中。核对所得溶液的pH以确保它是碱性的。
2.-500μL来自阶段A的活性衍生物的溶液(5-6mg)加入到1.0MNaHCO3/Na2CO3缓冲液pH＝9.0的DMF∶水(5∶2∶3v/v)的混合物中。
3.-混合物涡旋，而且埃彭道夫管用铝箔包住以避免光的照射。
4.-室温下孵育20h后，混合物用1M TEAA溶液淬灭。
B.-过量标记物的除去——使用Shephadex G-25柱
1.-将活化的衍生物样品移到柱子上。
2.-用水洗脱柱子，并且用1.0ml流出液收集埃彭道夫管。在空体积之后，期望的产品开始被洗脱下来，而大多数期望的产品在第3-9部分的流出液中被洗脱得到的。
3.-合并并浓缩包含大多数物质的流出液。
4.-通常获得12-15ODU A260(70％)，其没有过量的染料/标记分子。如果需要，产品可以进一步通过RP HPLC的电泳(20％PAGE)进行纯化。
实施例2
siRNA的合成，所述siRNA包含缀合舍曲林的正义寡核苷酸和包含式 C18-L3-C18-L2-呋喃糖-L1-[寡核苷酸]-3’的保护基团的反义寡核苷酸，其中 L1、L2和L3是磷酸二酯连接
使用下列步骤进行该反应：
(a)RNA寡核苷酸是通过在固体载体上的固相合成而逐步形成的，其中生长链中的末端亚单位的5′-OH基团，其正常情况下是由二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的，将其放在酸性条件下，用以除去5′-OHDMT保护基团，而嘌呤和嘧啶碱基仍然受(芴-9-基)甲氧羰基(FMOC)保护。
(b)呋喃糖单元，例如D-核糖或D-(-)-呋喃果糖与4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(DMTr-CI)仅在有利于伯醇羟基基团位置上反应的条件下反应。然后，剩余羟基基团与乙酰化或苄化保护基团反应。最后，在酸性条件下，伯醇羟基的DMT保护基团被除去。呋喃糖的所述脱保护羟基基团与步骤(a)获得siRNA链的脱保护5′-OH基团反应，从而获得伯-缀合寡核苷酸。
(c)有6个单体的聚乙二醇(PEG)且提供18个共价键单元的间隔区(C18间隔区)的活性聚乙二醇的形成是通过在亚磷酸化条件氨基磷酸酯化合物，例如式(II)的(2-氰乙基)N，N′-二异丙基亚磷酰胺下加入到末端OH基团进行的。
Figure BPA00001657140801551
(d)呋喃糖的脱保护5′-OH基团与步骤(c)的活性聚乙二醇反应，从而获得如下结构的siRNA链：
OH-C18-L2-呋喃糖-L1-[寡核苷酸]-3’
其中L1和L2是磷酸二酯键。
(e)有6个单体的聚乙二醇(PEG)且提供18个共价键单元的间隔区(C18间隔区)的第二活性聚乙二醇的形成是通过在亚磷酸化条件氨基磷酸酯化合物，例如式(II)的(2-氰乙基)N，N′-二异丙基亚磷酰胺下加入到末端OH基团而进行的。
Figure BPA00001657140801552
(f)C18的脱保护5′-OH基团与来自步骤(e)的第二活性C18聚乙二醇反应，从而获得如下结构的siRNA链：
C18-L3-C18-L2-呋喃糖-L1-[寡核苷酸]-3’
其中L1、L2和L3是磷酸二酯键。
(g)如实施例1所述的缀合舍曲林的siRNA的互补链用步骤f)的修饰的siRNA链退火。为了这个目的，RNA链中的所有的剩余保护基团如下地预先除去。500μl包含20％v/v的甲胺(水溶液40％w/v)和80％v/v的饱和氨溶液、30(包含30-32％v/v的NH3)的混合物加入到含siRNA(200nmole规模)的埃彭道夫管中。将管密封并加热45分钟至温度为65℃。该步骤除去核苷酸的磷原子上的保护基团(呋喃糖的乙酰化或苄化以及磷酸二酯连接的2-氰乙基化)，和环外氨基的保护基团(FMOC)。然后，将混合冷却并过滤，以及将上清液干燥。残留的片状沉淀物用1M三乙胺-HF在65摄氏度下反应3小时除去核苷酸的2′上的保护基团(2′-叔丁基二甲基甲硅烷基-TBDMS)。最后，所产生的溶液在葡聚糖凝胶柱(Sephadex柱)中脱盐。
实施例3
缀合至式(I)的基团和一个靶向试剂的5-HT 1A R-靶向siRNA(下文称为 NLF-siRNA)以及裸5-HT 1A R-靶向siRNA(下文中称为裸siRNA)的有效性 分析，通过体内局部注入小鼠的背缝神经核(DRN)
本实施例显示NLF-siRNA和裸siRNA对下调突触前5-HT1AR表现出相似的功效，根据它的蛋白水平下降和它的功能来测量，当局部应用于5-羟色胺能神经元所在的背缝神经核时。这表明了用于本发明的构建中的式(I)的基团和靶向试剂不干扰干扰寡核苷酸的功效。
一组具有实施例1和2的结构的化合物如上所述被合成且具有如下结构。
Figure BPA00001657140801571
siRNAs被设计成靶向来自小家鼠(小鼠，GenBank登录号：NM_008308)的5-羟色胺受体5-HT型1A(5-HT1AR)序列的下述区域：633-651、852-870、1889-1907和2167-2185。每个siRNA的反义链和正义链是化学合成的(SEQ ID NO：5-10，表1)，并且在等渗RNA退火缓冲液(100mM醋酸钾，30mM HEPES-KOH pH：7.4，2mM醋酸镁)中退火，通过结合每个链的50μM溶液。然后，该溶液在90℃下培养1分钟，离心15秒，且然后在37℃下培养1小时。HPLC纯化退火溶液，并冻干经选择的siRNA片段。siRNA的原液通过在无RNA酶的水中再次悬浮冻干产品而制备得到，且保存在-20℃下直到使用。在使用前，所有siRNA原液在aCSF(125mM NaCl、2.5mM KCl、1.26mM CaCl2、1.18mM MgCl2和5％葡萄糖)和合适的载体中稀释至最终浓度，以用于脑部应用(局部和脑室内注射应用)。
表2
所有这些siRNA序列包括与5-HT1A受体的mRNA互补的反义序列，因而能够捕获所述mRNA并阻断它的表达。所有试验都采用这些序列的等摩尔混合物。
作为对照，注入无义siRNA序列(ns siRNA)。当在Blast对齐算法中与小鼠的全转录组对比时，该ns siRNA不与任何小鼠基因互补。ns siRNA具有如下序列：
ns siRNA-s    AGUACUGCUUACGAUACGG    SEQ ID NO：56
ns siRNA-a    CCGUAUCGUAAGCAGUACU    SEQ ID NO：57
所有序列都具有核苷酸的末端DNA二聚体，包含至少一个未示出的胸腺嘧啶(T)，为了避免干扰调控正常程序的mRNA进入细胞的蛋白。这技术是本领域技术人员公知的。对于这些末端二聚体，寡核苷酸有21-23个碱基对，促成有效的RNAi机制。
表1的siRNA序列，缀合至式(I)基团和一个如上所述的靶向试剂(NLF-siRNA)、缀合至式(I)的基团和一个靶向试剂的无义siRNA(ns NLF-siRNA)和没有修饰的裸寡核苷酸(表1的裸siRNA或ns裸siRNA)被用于实验中。
为了siRNA的注入，使用如现有技术所述的标准立体定向方法植入微型插管系统。流入微型插管通过110μm OD和40μm ID的熔融二氧化硅毛细管25号管插入。微型插管的预设长度是基于被靶向的脑区的深度(即，对于背缝神经核是1mm)而决定的。
雄性C57BL/6J小鼠(21-29g，9-12周大，雄性)在背缝神经核(DRN)植入一个微型插管。立体定向坐标(以mm计)是离颅骨的前囟和顶部的AP：-4.5、L：-1.0、DV：-4.4，有20°的外侧角(根据Franklin和Paxinos(1997))。该微型插管对颅骨是安全的，具有牙科粘固粉和2mm长、0.95mm直径的螺钉。微注入实验是在清醒小鼠中外科手术后20-24小时进行。注射微型插管通过聚乙烯管与注射器连接，注射器由0.5μL/分钟的速率的精密泵来操作。
为了测试突触前5-HT1AR活性的功能测量，我们在将一批裸siRNA或NLF-siRNA注入到背缝神经核(DRN，0.3μg(0.02nmoles)/1μl/2天)24小时后评价由(R)-(+)-8-羟基-2-(二-n-丙胺基)四氢萘氢溴酸盐(8-OH-DPAT，一种选择性5-HT1AR激动剂)诱导的体温降低响应。对照组接受相同量的载体(aCSF：125mM NaCl、2.5mM KCl、1.26mM CaCl2、1.18mM MgCl2和5％葡萄糖)、ns裸si RNA和ns NLF-siRNA。实验前1小时，小鼠在22℃的稳定温度的实验室中的单独的笼中饲养。所有实验在上午10:00和下午14:00之间进行。通过在读取温度前5分钟将润滑的探针插入直肠来测量体温，而小鼠是自由行动的。用数字式温度计获取读数。基础值是在给予8-OH-DPAT之前5分钟和之后15、30、60和120分钟测得的。8-OH-DPAT溶解在盐溶液中，且以在5mg/kg体积中1mg/kg腹腔注射(i.p.)。8-OH-DPAT诱导低温的的所选剂量是基于以前的工作。体温是在5-HT1A-靶向siRNA最后应用至不同组的小鼠以及它们各自的对照的DRN 24小时后进行评价的。经直肠测量体温的额外实验是在5-HT1AR KO小鼠(无5-HT1AR小鼠)中进行以评估8-OH-DPAT-诱导的低温的缺少。
正如图1中可以看到的，siRNA局部注入引起的5-HT1AR的下调显示了缺少由8-OH-DPAT诱导的体温降低响应，类似于5-HT1AR KO小鼠。
这个分析之后，用断头术将小鼠处死，且脑部快速移除，在干冰上冷冻并储存在-20℃下。组织切片，14μm厚，用冷冻切片机切下，在涂有APTS(3-氨丙基三乙氧硅烷)的载玻片上融裱并-20℃下保存直到使用。
为了分析5-HT1AR蛋白的密度，我们使用[3H]8-OH-DPAT用于5-HT1A受体位点的放射自显影可视化。用于[3H]8-OH-DPAT的实验培养条件已在现有技术中有描述。简而言之，冷冻的组织切片解冻并干燥，室温下在170mMTris-HCl pH 7.6、4mM CaCl2和0.01％抗坏血酸中预培养30分钟，然后室温下在包括1nM[3H]-OH-DPAT(234.0Ci/mmol)和10-5M帕吉林的相同的缓冲液中培养60分钟。非特异性结合如下定义：在10-5M 5-HT存在下保留。培养和洗涤之后，组织切片浸泡在蒸馏的冰水中，并在冷气流下快速干燥。组织与塑胶的3H-标准品一起在4℃下暴露在氚易感膜上60天。
小鼠中脑中缝核中离前囟的3个不同前后轴(AP)坐标系(大约AP-4.84、-4.60和-4.24mm)中的组织DRN切片(富兰克林和帕克西诺斯，1997年)被用于受体位点的定量，并且它们是在相同的实验条件下同时处理的。放射自显影图的定量分析用AISR计算机化图像分析系统来进行。
正如图2中所看到的，在裸siRNA和NLF-siRNA组中5-HT1AR蛋白密度有大约是对照组(载体、ns裸siRNA和ns NLF-siRNA)40-50％的下降，。这个变化是与图1所述的体温降低响应的抑制相平行的。
这些实验显示了两条链上NLF-siRNA的化学修饰不降低siRNA下调靶基因的能力，当与裸siRNA比较时。此外，5-HT1A受体——特异性siRNA通过注入局部应用到DRN导致靶标mRNA的下调，无论siRNA是否是裸露的或是与靶向部分配对。这可以解释为是因为在应用过程中借由物理压力施加的给药方法导致siRNA直接转移至神经元小体，并因此，不需要穿过神经元细胞膜的转移。
在以下实施例中，将显示通过脑室内注射(i.c.v)或是鼻内应用裸5-HT1A受体——特异性siRNA都不能下调靶标mRNA，并且附着于siRNA的靶向分子的存在允许靶标mRNA的有效下调。
实施例4
对中脑中缝核的5-羟色胺能神经元的差别选择性以及本发明的NLF- siRNA构建体对裸siRNA的有效性分析，通过体内脑室内注射(i.c.v)注入 小鼠的背侧3 rd 脑室(D3V)
本实施例显示：NLF-siRNA构建体和裸siRNA显示对5-羟色胺能神经元的差别选择性以及下调5-HT1AR的有效性，当它们应用于背侧3rd脑室(D3V)以穿过脑脊髓液(CSF)进入全脑时。这是通过测量它的mRNA表达水平下降、蛋白水平减少、功能性变化和抗抑郁药理学增强作用来评价。
如实施例3中所述的一组分子(载体、ns裸siRNA、ns NLF-siRNA、裸siRNA和NLF-siRNA组)以30μg/2.5μl/1天(2.3纳摩尔)注入到以下立体定位坐标(mm计：AP：-2.0、L：0、DV：-2.1)下的背侧3rd脑室(D3V)，使用实施例2的类似小鼠品系和注射系统。为了测定5-HT1A R mRNA表达水平，我们同时使用4个寡脱氧核苷酸探针对5-HT1A R进行了原位杂交分析，与碱基82-122、123-171、885-933和1341-1389互补。使用末端脱氧核苷酸转移酶，将每个5-HT1A受体寡核苷酸用[33P]-dATP(＞2500Ci/mmol)在它的3′-端独立地标记(2pmol)，使用QIA快速核苷酸去除试剂盒(QIAquickNucleotide Removal Kit)通过离心法来纯化。对单个标记原位杂交的方案是基于前述方法。简而言之，如实施例2所述的冷冻组织切片首先复元至室温，4℃下在磷酸盐缓冲液(1×PBS：8mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、136mM NaCl、2.6mM KCl)的4％多聚甲醛中固定20分钟，室温下在3×PBS中洗涤5分钟，各自在1×PBS中洗涤2次每次5分钟，且21℃下在50mMTris-HCl pH 7.5、5mM EDTA中的最终浓度24U/ml的预消化链酶蛋白酶溶液中培养2分钟。通过1×PBS中2mg/ml甘氨酸中浸渍30s而使酶活性停止。组织最后在1×PBS中清洗，并通过梯度系列的乙醇脱水。关于杂交，放射性标记探针在溶液中稀释，所述溶液包含50％甲酰胺、4×SSC(1×SSC：150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、1×Denhardt’s溶液(0.02％蔗聚糖、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白)、10％硫酸葡聚糖、1％肌氨酰、20mM磷酸盐缓冲液pH 7.0、250μg/ml酵母tRNA和500μg/ml鲑鱼精DNA。放射性探针在杂交缓冲液中的最终浓度是在相同的范围(1.5nM)。组织切片由包含标记探针的杂交溶液覆盖，盖上Nescofilm盖玻片，并在42℃下在潮湿的盒子中培养过夜。然后，切片在60℃下在1×SSC中洗涤4次(每次15分钟)，且在室温下在1×SSC中洗涤1次30分钟，脱水并曝光至膜3-4周。膜光学密度用AISR计算机图像分析系统进行半定量化。
关于用于原位杂交的相同组的小鼠，我们使用[3H]8-OH-DPAT对如实施例2所述的5-HT1A受体位点的放射自显影来分析了5-HT1AR蛋白的密度。
5-HT1AR蛋白在5-羟色胺神经元(中脑中缝核)上突触前高度表达，并且在神经元突触后地定位至5-HT神经末梢，主要在皮质-边缘区域(即，海马区)。
正如在图3A和B中所看到的，只有NLF-siRNA分子在小鼠中脑中缝核的3个不同前后坐标系中诱导5-HT1AR mRNA水平的特异性下调，其中5-羟色胺能神经元的小体位于小鼠中脑中缝核。
正如在图3C中所看到的，在背缝神经核中膜上的5-HT1AR mRNA阳性颗粒测量的密度定量显示了NLF-siRNA组的表达水平有50％的下降，与其他测试组相比较。5-HT1AR mRNA表达的差别主要体现于DRN区域。
正如从图4中所看到的，只有NLF-siRNA分子在突触前(背缝神经核)而非突触后(海马区或额叶前皮质)的脑区域中诱导了5-HT1AR蛋白水平的下降(大约50％)，通过使用[3H]8-OH-DPAT在5-HT1A受体位点上的结合测试来测定。5-HT1AR mRNA和蛋白表达的差别主要体现在DRN区域。
这些结果表明了NLF-siRNA选择性定向寡核苷酸执行mRNA对位于背缝神经核的特异性5-羟色胺能神经元的干扰，因而增强所述RNA对靶向神经元受体的干扰的有效性。
为了检查5-HT1A受体的特异性下调是否可以影响相关的5-HT蛋白像5-羟色胺转运体(5-HTT或SERT)或5-HT1B受体的表达，测定了DRN中的5-羟色胺转运体蛋白的密度和5-HT1B受体的密度。
为了分析5-羟色胺转运体蛋白的密度，我们将[3H]西酞普兰用于5-HTT位点的放射自显影。简单地说，冷冻组织切片解冻并干燥，室温下在包含120mM NaCl和5mM KCl的50mM Tris-HCl缓冲液(25℃下pH 7.4)中预培养15mm。然后，室温下在包含1.5nM[3H]西酞普兰(70.0Ci/mmol)的相同缓冲液中培养60分钟。非特异性结合定义为：在1μM氟西汀存在下保留。培养和洗涤之后，组织切片浸泡在蒸馏冰水中，并在冷气流下快速地干燥。组织与塑胶的3H-标准品一起在4℃下在氚感光膜中曝光40天。
小鼠中脑中缝核3个不同前后轴(AP)坐标系中(离前囱大约AP-4.84/-4.96、-4.60/-4.36和-4.24mm；富兰克林和帕克西诺斯，1997年)的组织DRN切片()用于5-HTT位点的定量，并且它们在相同的实验条件下同时处理。用AISR计算机图像分析系统进行放射自显影图的定量分析。正如在图5A中所看到的，载体、裸siRNA和NLF-siRNA组没有显示出背缝神经核中5-HTT(5-羟色胺转运体，SERT)在蛋白水平上的任何减少或变化。
为了分析5-HT 1B 受体(5-HT1BR)蛋白的密度，我们将[125I]碘氰吲哚洛尔用于5-HT1BR位点的放射自显影。切片在室温下在包含150mM NaCl的170mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中预培养10分钟，然后在补充了100pM[125I]碘氰吲哚洛尔([125I]CYP，2000Ci/mmo)和100nM 8-OH-DPAT的相同缓冲液中培养2小时以阻断5-HT1AR位点，以及30-异丙肾上腺素以阻断β-肾上腺素位点。非特异性结合在相邻切片上测定，所述相邻切片是在相同的条件下但存在10μM 5-HT下培养。切片在相同的缓冲液中清洗两次，在4℃快速地浸泡于蒸馏水中，冷空气下干燥且在4℃下在感光膜(超膜-3H(Hyperfilm-3H))中曝光一天。膜光密度用AISR计算机图像分析系统来半定量化。正如在图5B中所看到的，载体、裸siRNA和NLF-siRNA组没有显示出背缝神经核中5-HT1B受体在蛋白水平上的任何减少或变化。
为了评价NLF-siRNA对5-HT1AR的功能特征的作用，我们分析了由8-OH-DPAT诱导的体温降低响应和中额前皮质(mPFC)中的5-HT释放。我们在将一批裸siRNA或NLF-siRNA(如实施例2所述的)注入到背侧3rd脑室(D3V，30μg/2.5μl/1天)24小时后评价由8-OH-DPAT诱导的体温降低响应。正如在图6中所看到的，只有由注入NLF-siRNA引起的5-HT1AR下调显示了缺少8-OH-DPAT诱导的体温降低响应，类似5-HT1AR KO小鼠。其他裸siRNA和对照(载体、ns裸siRNA和ns NLF-siRNA)组没有显示出对5-HT1AR的下调作用(如图4和5所示的)，并且它是与由8-OH-DPAT诱导的体温降低响应的典型曲线相平行的。
如上所述，位于5-羟色胺能神经元的5-HT1A R的活化，通过内源性激动剂5-HT(神经递质5-羟色胺)或选择性激动剂(即，8-OH-DPAT)抑制中脑中缝核和中额前皮质、海马区等的末端投射脑区域中的细胞放电和脉冲-依赖5-HT释放，导致较低的5-HT水平(8-OH-DPAT作用)。为了评价5-HT释放，使用现有技术中已有描述的脑内微透析程序。简单地说，探针的轴由15-mm长、25-口径(501μm OD、300μm ID)不锈钢管制成。进管和出管通过由110μm OD和40μm ID熔合硅石毛细管组成的25口径管。硅石管的上外露端是插入到7-mm长、27口径(410μm OD，220μm ID)的不锈钢管中。小鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg，腹腔注射)麻醉并放置在立体定位架上。每只小鼠在中额前皮质(mPFC)(以mm计，离前囟的AP+2.2、L-0.2、DV-3.4，根据Franklin和Paxinos的解剖图，1997年)植入一根装有铜仿膜的透析探针(2-mm长，5000Da分子量截留值)。
微透析实验是在手术后48-72小时在自由行动的小鼠中通过用连接高架液体旋转体的WPI模型sp220i注射泵以2.0μl/分钟的速率连续地向探针输送aCSF(125mM NaCl、2.5mM KCl、1.26mM CaCl2、1.18mM MgCl2)来进行的。每30分钟收集60μl透析样品于微量离心管中。
在最初的60-分钟稳定期后，4个基线样品在8-OH-DPAT全身给药(0.5mg/kg腹腔注射)之前收集，然后收集连续的透析样品。透析实验完成时，杀死小鼠，而且脑立即摘除并-70℃下冷冻。然后，在低温恒温器中切下脑的冠状面(50μm)，并且，根据标准方法用甲酚紫染色用于灌注部位的定位。只有从组织学上地正确探针放置的动物中获得的数据被用于随后的统计分析。
透析样品中5-HT的浓度用HPLC来测定，其中HPLC使用3-μm十八烷基二氧化硅(ODS)柱(7.5cm×0.46cm)，用氧化电位0.6V的惠普(Hewlett-Packard)1049检测器组来进行电流检测。流动相由0.15M NaH2PO4.H2O、1.8mM辛基硫酸钠、0.2mM EDTA(pH 2.8，用磷酸调整)和30％甲醇组成，且以0.7ml/分钟泵入。5-HT的保留时间是3.5-4分钟，且检出限是2fmol/样品。
正如在图7中所看到的，与ns NLF-siRNA组小鼠相比，在NLF-siRNA处理小鼠组中不存在8-OH-DPAT对额叶前部的5-羟色胺释放的影响。这个在5-羟色胺能神经元中5-HT1AR的下调的证据可以通过激动剂8-OH-DPAT对末梢脑区域中的5-HT量的影响的减少来功能性地评价。
实施例5
游离选择性配体(舍曲林)和根据本发明的NLF-siRNA构建体的竞争性 测定，通过测量在用配体急性预处理随后体内脑室内注射(i.c.v.)NLF- siRNA的小鼠中的5-羟色胺能神经元的功能指标
为了测定在NLF-siRNAs中缀合至siRNA的选择性配体是否是至背缝神经核细胞(主要地5-羟色胺能神经元)的递送中的关键组分，进行了一些竞争性测试。在D3V(30μg/2.5μl/1 day，脑室内注射)中注入siRNA前3小时，小鼠接受急性注射选择性游离配体，5-HTT抑制剂舍曲林(20mg/kg腹腔注射)。此外，一组小鼠接受载体腹腔注射和载体注入D3V中。
微透析实验在脑室内注射载体或siRNA给药24小时后进行。正如在图8A中看到的，急性舍曲林注射(20mg/kg腹腔注射)通过缀合至5-HT1AR-NLF-siRNA避免5-HT1A自体受体的沉默，以及急性8-OHDPAT给药(选择性5-HT1AR激动剂，0.5mg/kg腹腔注射)减少了中额前皮质中的5-HT水平，如同对照组。
在用选择性5-HTT抑制剂，舍曲林(20mg/kg腹腔注射)预处理的NLF-siRNA小鼠中，也在小鼠中评价了的8-OH-DPAT给药(1mg/kg i.p.)对体温的影响与图8A所用的那些类似。图8B显示了舍曲林有效地与5-HT1AR-NLF-siRNAs竞争，因而导致类似对照组的体温降低响应，表明了转染的缺乏以及5-HT1AR mRNA的下调。
这些结果证明了游离选择性配体(舍曲林)的急性给药阻断或竞争舍曲林缀合的siRNA(NLF-siRNA)，通过至靶神经元(即，5-HTT，5-羟色胺转运体)相同的进入点。首先，舍曲林具有高的特异性和亲和性(在纳摩尔范围内)，对5-HT转运体，以及如在NLF-siRNA中缀合至siRNA，新的缀合物保持对该5-HT转运体的亲和性。另一方面，5-HT转运体只在5-HT神经元中表达，并且通过转运体的高亲和性的结合和细胞型特异性表达决定了NLF-siRNA的选择性本质，其具有舍曲林或SSRI配体缀合。
实施例6
与对照组比较，在体内脑室内注射(i.c.v.)NLF-siRNA至背侧3 rd 脑室 (D3V)小鼠中，急性抗抑郁剂(即，氟西汀)应用后，额叶前皮质中的5- HT水平的增量的增强作用
在生理条件下，SSRI(即，氟西汀)引起中脑中缝核和前脑中的5-羟色胺的细胞外浓度的显著增加。由5-羟色胺转运体(SERT)的再摄取阻断引起的细胞外5-HT的增加激活了中脑中缝核中的5-HT1A自体受体，抑制细胞放电和末梢释放，一种减弱由再摄取阻断产生的细胞外5-HT增加的作用。因而，承担治疗作用的突触后5-羟色胺受体的活化低于预期的。据了解，用5-HT1A受体拮抗剂(即，i.e吲哚洛尔)的这些负反馈机制的阻断增加SSRI引起的5-HT，并因此可能适用于促进SSRI的临床效果。
正如在图9中所看到的，在无义NLF-siRNA(ns NLF-siRNA)小鼠组中全身性给药氟西汀后中额前皮质中的透析液5-羟色胺浓度比基线高大约50％，其中5-HT1A受体预期成为如之前所示的全功能的。在NLF-siRNA小鼠组，突触前的5-HT1A受体的下调使全身性给药氟西汀的作用达到中额前皮质中的基线末梢5-HT水平的150％。
这些结果清楚地证明了本发明的寡核苷酸序列(NLF-siRNA)，与舍曲林分子结合，通过下调相应地要翻译的mRNA转录物而阻断5-HT1A受体的表达。本发明的寡核苷酸序列(NLF-siRNA)比裸露形式(裸siRNA)中的相应地siRNA在主要指标上下调所述表达。因此，本发明的寡核苷酸比等量的相同序列的siRNA更加有效，其未进行修饰(裸siRNA)。
这些观察允许推论出：式(I)的基团不干扰受体表达的下调。此外，额外缀合分子的存在增强了通过RNAi机制执行的抑制作用的有效性。
实施例7
在响应体内脑室内注射(i.c.v.)NLF-siRNA和对照5-HT 1A R敲除(KO)小 鼠中，抗抑郁和抗焦虑行为研究
为了分析突触前5-HT1A受体的下调的潜在抗抑郁效果，在9至12周大的成年小鼠中进行行为分析。它们以下列顺序进行，且试验之间至少一天：高架十字迷宫和悬尾试验。高架十字迷宫是在暗室(50勒克斯)中使用架于离地面31cm的30cm长和5cm宽的臂的十字迷宫来进行的。动物被带到迷宫的中央区，面对开放臂，并允许自由勘察5分钟。用视频跟踪系统测量在开放和闭合臂上的花费时间和行动距离。仪器用70％乙醇擦拭并允许在小鼠之间干燥。所有试验在上午11:00和下午4:00之间进行。在测试日，动物被运送到微弱照明行为实验室并在测试前保持不受打扰至少1小时。在悬尾试验中，小鼠的尾部被悬挂，并且我们用带子绑起以确保它们处于水平。动物悬挂6分钟，并且使用自动视频跟踪软件包来评估这期间的静止。
正如在图10中所看到的，没有观察到焦虑样行为的变化，但是在5-HT1A自身受体下调小鼠中的应激/抑郁相关试验中有改变的反应。NLF-siRNA的潜在的抗抑郁能力定位于KO小鼠和野生型对照小鼠之间。这提示了5-HT1A受体可以成为抑郁治疗的新靶标。有40％左右的抑郁病人对传统的SSRI治疗没有反应，并且他们可以成为这个疾病的新治疗方案的优先候选人。
实施例8
在功能性5-羟色胺能的测量中，5-HT 1A R NLF-siRNA相对无义NLF- siRNA引起下调的差别有效性，通过在小鼠中体内鼻内(i.n)应用
为了验证鼻内应用作为一种潜在的治疗给药方式，分析了载体和NLF-siRNA以检查体温降低响应、背缝神经核中的mRNA水平和额叶前皮质中的5-HT透析液。
小鼠用戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，并且背朝下放置。用5-ul等分计的微量加样器吸头将PBS或NLF-siRNA缓慢并轻轻地滴入交替的鼻孔。
正如在图11中所看到的，NLF-siRNA或载体的鼻内应用导致mRNA 5-HT1A受体的减少，正如通过原位杂交所测得的，以及5-HT1A受体的减少，正如通过配体结合分析所测得的，其与脑室内注射应用后观察到的结果类似。具体地，突触前下调是30％(当与NLF-siRNA脑室内给药时的50％下调比较时)(参见图11)。此外，NLF-siRNA的鼻内应用导致给药8-OH-DPAT后的体温降低响应的下降(参见图12A)和急性应用8-OH-DPAT后的5-HT额叶前皮质透析液水平减少的下降(图12B)。
此外，5-HT1AR-NLF-siRNA的潜在的抗抑郁效果使用如实施例7所述的悬尾试验来评价。还有，焦虑样行为通过高架十字迷宫来评价。正如在图13中所看到的，实验显示了观察到焦虑样行为没有改变(图13A)，但是在应激/抑郁相关试验中的5-HT1A自身受体下调小鼠中诱出下降的静止时间(图13B)以及在强迫游泳测试中下降的静止时间(图13C)。
实施例9
以10或30μg/小鼠的剂量缀合至式(I)基团和一个靶向试剂的5-HTT-靶 向的siRNA(5-羟色胺转运siRNA)(下文称为5-HTT-NLF-siRNA)的有效 性分析，载体作为对照组，通过在小鼠体内鼻内给药
一组具有实施例1和2的结构的化合物如上所述的合成。siRNA被设计成靶向来自小家鼠(小鼠，GenBank登录号：NM_010484)的5-羟色胺转运体(5-HTT)序列的以下区域：1230-1250。siRNA的反义和正义链是化学合成的(SEQ ID NO1-2，表2)，且在等渗RNA退火缓冲液(100mM醋酸钾、30mMHEPES-KOH pH：7.4、2mM醋酸镁)中退火，通过结合每个链50μM溶液。然后，溶液在90℃下培养1分钟，离心15秒，并然后在37℃下培养1小时。退火溶液是HPLC纯化的，并且siRNA的所选部分冻干。siRNA的原液通过在无RNA酶的水中重悬冻干产品来制备得到，并保存在-20℃下直到使用。在使用前，所有siRNA原液在PBS缓冲液和合适的载体中稀释至最终浓度，以用于鼻内应用。
Figure BPA00001657140801721
siRNA序列包括与5-HT转运体(5-HTT)的mRNA互补的反义序列，因此能够捕获所述mRNA并阻断它的表达。
所有这些序列具有核苷酸的末端DNA二聚体，包含至少一个未示出的胸腺嘧啶(T)，为了避免干扰调控正常程序的mRNA进入细胞的蛋白。这技术是本领域技术人员公知的。对于这些末端二聚体，寡核苷酸有21-23个碱基对，促成有效的RNAi机制。
表2的siRNA序列，缀合至式(I)的基团和一个如上所述的靶向试剂(5-HTT-NLF-siRNA)被用于本实验中。
实施例10
下调的差别有效性，通过小鼠体内鼻内(i.n)应用2个剂量(10和 30μg/小鼠)的5-HTT-NLF-siRNA的功能性测定分析
雄性C57BL/6J小鼠(21-29g，9-至12-周大，雄性)用戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，并且背朝下放置。用5-ul等分计的微量加样器吸头将PBS或5-HTT-NLF-siRNA缓慢并轻轻地滴入交替的鼻孔中。5-HTT-NLF-siRNA的评价剂量是：每个鼻孔中5μg/5ul和15μg/5ul(NLF-siRNA的总剂量：每天10和30ug/小鼠)。
处理后24小时，小鼠断头处死，脑快速地摘除，在干冰中冷冻并保存在-20℃下。组织切片，14μm厚，用显微镜用切片机切下，在涂有APTS(3-氨丙基三乙氧硅烷)的载玻片上融裱并-20℃下保存直到使用。
为了测定5-HTT mRNA表达水平，原位杂交分析使用对5-HTT特异的寡脱氧核苷酸探针来进行，与碱基820-863(小鼠，GenBank登录号：NM_010484)互补。5-HTT寡核苷酸各自使用末端脱氧核苷酸转移酶在它的3′-端用[33P]-dATP(＞2500Ci/mmol)进行标记，通过使用QIA快速核苷酸去除试剂盒离心纯化。对单个标记原位杂交的方案是基于前述方法。简单地说，冷冻组织切片，如实施例2中所描述的，首先复元至室温，4℃下在磷酸盐缓冲液(1×PBS：8mM Na2HPO4、1.4mM KH2PO4、136mM NaCl、2.6mM KCl)的4％多聚甲醛中固定20分钟，室温下在3×PBS中洗涤5分钟，各自在1×PBS中洗涤2次每次5分钟，且21℃下在50mM Tris-HCl pH7.5、5mM EDTA中的最终浓度24U/ml的预消化链酶蛋白酶溶液中培养2分钟。通过1×PBS中2mg/ml甘氨酸中浸渍30s而使酶活性停止。组织最后在1×PBS中清洗，并通过梯度系列的乙醇脱水。关于杂交，放射性标记探针在溶液中稀释，所述溶液包含50％甲酰胺、4×SSC(1×SSC：150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、1×Denhardt’s溶液(0.02％聚蔗糖、0.02％聚乙烯吡咯烷酮、0.02％牛血清白蛋白)、10％硫酸葡聚糖、1％肌氨酰、20mM磷酸盐缓冲液pH 7.0、250μg/ml酵母tRNA和500μg/ml鲑精DNA。放射性探针在杂交缓冲液中的最终浓度是在相同的范围(1.5nM)。组织切片由包含标记探针的杂交溶液覆盖，盖上Nescofilm盖玻片，并在42℃下在潮湿的盒子中培养过夜。然后，切片在60℃下在1×SSC中洗涤4次(每次15分钟)，且在室温下在1×SSC中1次30分钟，脱水并曝光至膜1-3天。膜光学密度用AISR计算机图像分析系统进行半定量化。
正如在图14A中所看到的，5-HTT-NLF-siRNA分子的两个剂量在三个不同前后轴坐标系中都诱导了背缝神经核的5-HTT mRNA的特异性下调。
正如在图14B中所看到的，在中脑中缝核中膜上的5-HT1AR mRNA阳性颗粒测量的密度计定量显示了NLF-siRNA组中表达水平有30％的下降，与载体组相比较。
这些结果表明NLF-siRNA选择性地定向寡核苷酸，其执行mRNA对位于中脑中缝核的特异性5-羟色胺能神经元的干扰。
5-羟色胺转运体蛋白的密度是如实施例4所述的来测定，使用[3H]西酞普兰用于5-HTT位点的放射自显影。NLF-siRNA鼻内给药24-48小时后，处死小鼠，并且它们的脑摘除并在以下AP坐标系中获得14μm厚的冠状面：以mm计，相对于前囟(Franklin和Paxinos，1997)：2.2(额叶前皮质-PFC)，1.1至0.6(尾状壳核-Cpu，侧面和中间的隔核-Sep，腹侧苍白球-VP)，-1.5至-1.8(海马区-HPC，下丘脑-Hip)和-4.24至-4.96(背缝神经核-DR和中间的中缝核-MnR)。简单地说，冷冻的组织切片解冻并干燥，室温下在包含120mM NaCl和5mM KCl的50mM Tris-HCl缓冲液(25℃下pH 7.4)中预培养15mm。然后，室温下在包含1.5nM[3H]西酞普兰(70.0Ci/mmol)的相同缓冲液中培养60分钟。非特异性结合定义为：在1μM氟西汀存在下保留。培养和洗涤之后，组织切片浸泡在蒸馏冰水中，并在冷气流下快速地干燥。组织与塑胶的3H-标准品一起在4℃下在氚易感膜中曝光40天。放射自显影图的定量分析用AIS计算机化图像分析系统来进行。通过使用来自共同曝光的放射性标准品的组织-校准的数据，放射自显影图的OD值被转化成组织切片中放射性结合至特异性脑区域的水平(nCi/mg组织蛋白)。
正如在图15中所看到的，通过放射自显影的结合分析测定，与载体或NLF-无义-siRNA的鼻内给药相比，5-HTT-NLF-siRNA的鼻内应用诱导了不同脑区域中的5-羟色胺转运体水平的减少。
实施例11
与对照组相比，通过体内鼻内应用(i.n.)10和30μg/小鼠剂量的5- HTT-NLF-siRNA，处理的小鼠中额叶前皮质中5-HT水平的增加
为了评价NLF-siRNA对5-HTT的功能特性的作用，评价了选择性5-HT转运体抑制剂对背侧纹状体中响应5-HTT NLF-siRNA的5-HT水平的神经化学作用。为了这个目的，雄性C57BL/6J小鼠(21-29g，9-至12-周大，雄性)用戊巴比妥40mg/kg i.p麻醉，并放置在立体定位架上。每只小鼠在背侧纹状体(mPFC)(以mm计，离前囟AP+0.5，L-1.7，DV-4.5，根据Franklin和Paxinos的解剖图，1997)中植入一个配置有铜仿膜的透析探针(1.5-mm长、5000Da分子量截留值)。
微透析实验是手术后24-72小时在自由行动的小鼠中通过用连接高架液体旋转体的WPI模型sp220i注射泵以2.0μl/分钟的速率连续地向探针输送aCSF(125mM NaCl、2.5mM KCl、1.26mM CaCl2、1.18mM MgCl2)来进行的。每30分钟收集60μl透析样品于微量离心管中。
在最初的60-分钟稳定期后，4-6个基线样品在西酞普兰(1-10-50μM)局部给药或氟西汀(20mg/kg i.p.)全身给药之前收集，然后收集连续的透析样品。透析实验完成时，处死小鼠，而且脑立即摘除并-70℃下冷冻。然后，在低温恒温器中切脑的冠状面(50μm)，并且，根据标准程序用甲酚紫染色用于灌注部位的定位。只有从组织学上地正确探针放置的动物中获得的数据被用于随后的统计分析。
透析样品中5-HT的浓度用HPLC来测定，其中HPLC使用3-μm十八烷基二氧化硅(ODS)柱(7.5cm×0.46cm)，用氧化电位设为0.6V的惠普(Hewlett-Packard)1049检测器来进行电流检测。流动相由0.15 MNaH2PO4.H2O、1.8mM辛基硫酸钠、0.2mM EDTA(pH 2.8，用磷酸调整)和30％甲醇组成，且以0.7ml/分钟压泵。5-HT的保留时间是3.5-4分钟，且检出限是2fmol/样品。
正如在图16中所看到的，与载体组相比，5-HTT-NLF-siRNA处理的小鼠组的背侧纹状体中在5-羟色胺水平上对选择性5-HTT抑制剂，包括氟西汀和西酞普兰是没有或有减少的5-HTT响应。这个证据，即5-羟色胺能神经元中5-HTT的下调，通过减小选择性转运体抑制剂对末端脑区域中5-HT的量的影响而能够被功能性评价。
这些结果证明了缀合至siRNA的舍曲林(NLF-siRNA)靶向5-羟色胺能神经元，通过选择性地与5-HTT相互作用，除核酸组分的序列(siRNA)之外。
实施例3-8显示了对5-HT1AR定向的NLF-siRNA能够特异性地在位于背缝神经核的5-HT神经元中下调靶基因。这个作用在脑室内注射后以及鼻内应用后都被观察到。
实施例10和11显示了对5-HTT特异性的NLF-siRNA还能够下调靶基因，在这个情况下，5-HTT mRNA。本发明的NLF-siRNA构建体的靶向能力在第三脑室(3DV)中脑室内注射应用后以及以0.3至1mg/Kg(给小鼠10至30μg siRNA分子)剂量鼻内应用中都被观察到。这是siRNA疗法通常接受的治疗范围，且具有升级到人类治疗的潜力。非侵袭性的鼻内应用还增加了siRNA分子发展为治疗剂的可行性。
实施例12
缀合至诺米芬辛的siRNA(NLF-NS-siRNA)的靶向确认，通过体内脑 室内注入至右脑室内
这个实施例显示了脑室内注入的NLF-NS-siRNA能够到达脑部位于黑质和蓝斑的特定神经元。这些细胞酪氨酸羟化酶染色是阳性的，就是说，它们是多巴胺能或去甲肾上腺素能神经元。
所用的序列是与任何人类、小鼠或大鼠基因没有同源性的无义(ns)siRNA：
NS siRNA-s    AGUACUGCUUACGAUACGG    SEQ ID NO：69
NS siRNA-a    CCGUAUCGUAAGCAGUACU    SEQ ID NO：70
该序列具有核苷酸的末端DNA二聚体，包含至少一个未示出的胸腺嘧啶(T)，为了避免干扰调控正常程序的mRNA进入细胞的蛋白。这技术是本领域技术人员公知的。对于这些末端二聚体，寡核苷酸有21个碱基对，促成有效的RNAi机制。反义(a)序列还具有Cy3分子以允许在共聚焦显微镜中它是可见的。
关于siRNA的注入，C57Bl/6Ncrl雄性小鼠用异氟烷深度麻醉，并放置在连接带数字显示读数的立体定位架(大卫科夫仪器(David KopfInstruments)，型号940)的小鼠配适器(美国斯杜汀公司(Stoelting)参考51625)。用21G×1.5英寸无菌针在颅骨上戳一个孔之后，注射器(10μl汉密尔顿)递送在蒸馏水中的2μl siRNA NLF-NS-siRNA-Cy3溶液(100μg总剂量)或载体进入右脑室内(离前囟AP+0.26、L-0.75DV-2.5)，通过注射泵(美国KD科学公司(KD Scientific)，KDS 310)以0.5μl/分钟的恒定流速的方式(每个时间点n＝2)。针留在所在位置3分钟以避免siRNA溶液向上流。
小鼠在两个不同的时间点用4％PFA灌注，给药siRNA后的1和3小时。切开脑，并且4℃下在4％PFA溶液中固定24h。然后，脑在4℃下在30％蔗糖溶液中放置48h。脑在-30至-40℃下冷冻在2-甲基丁烷中，并保存在-80℃下。脑在莱卡(Leica)低温恒温器CM3050S中切片(30mm)。自由漂浮切片洗涤并在4℃下保存于0.1M PBS和0.001％叠氮化钠中。
切片在PBS中洗涤，用2％山羊血清和0.1％三硝基甲苯(Triton)阻断，并在4℃下用抗-TH抗体(1∶800小鼠)培养过夜。洗涤后，切片用二抗Alexa Fluor 647抗-小鼠(英杰公司)(Invitrogen)在室温下培养1h。最终，切片用达科荧光封固剂(Dako Fluorescent Mounting Medium)包埋，并使用共聚焦光谱显微镜(FV1000奥林巴斯)(FV1000 Olympus)分析。图片用FV10-ASW 1.7 Viewer生成。
正如在图17和18中所看到的，脑室内注射1h后，黑质致密部和蓝斑中一些TH阳性细胞对Cy3也阳性的。不是所有TH阳性细胞都对Cy3阳性，但是它们中的大部分具有内部Cy3荧光性，表明了NLF-NS-siRNA-Cy3分子是合并到一些TH-阳性神经元中。
实施例13
通过脑室内给药缀合至舍曲林的Cy3-标记的无义2-O’-甲基-修饰的间隙 体对5-羟色胺能神经元的靶向确认
缀合物被合成，其包含各自含2-O’-甲基的3个核苷酸的RNA翼的间隙体和包含非特异性(无义)序列的10个核苷酸长的无义间隙区域。该间隙体是经由它的5’端缀合至舍曲林，并经由它的3’端缀合至Cy3。小鼠接受Cy3缀合物的单次脑室内注射(30μg)入背侧第三脑室，并在注射后24h处死(n＝2只小鼠)。然后，Cy3标记的定位通过激光共聚焦显微镜来测定。本实验显示了(图19)间隙体是特异性地定位至5-羟色胺能神经元的。
Figure IPA00001657140300031
Figure IPA00001657140300041
Figure IPA00001657140300051
Figure IPA00001657140300061
Figure IPA00001657140300071
Figure IPA00001657140300081
Figure IPA00001657140300091
Figure IPA00001657140300101
Figure IPA00001657140300111
Figure IPA00001657140300121
Figure IPA00001657140300131

Claims (56)

1.一种缀合物，包含：
i)至少一种选择性试剂，其特异性结合至一种或多种神经递质转运体和
ii)至少一个核酸，其能够特异性结合至靶分子，其中所述靶分子在与神经递质转运体相同细胞中被表达。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中能够特异性结合至靶分子的核酸序列选自如下序列组成的组：双链RNA干扰寡核苷酸、反义寡核苷酸、间隙体、PNA、LNA、核酶和适配体，其中所述靶分子在与神经递质转运体相同细胞中被表达。
3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中核酸至靶分子的结合产生了靶分子的活性抑制的结果。
4.如权利要求1-3任一项所述的缀合物，其中选择性试剂缀合至寡核苷酸的5’末端。
5.如权利要求1-4任一项所述的缀合物，其中选择性试剂和寡核苷酸是通过连接基团连接的。
6.如权利要求5所述的缀合物，进一步包含与第一寡核苷酸序列互补的第二寡核苷酸序列。
7.如权利要求8所述的缀合物，其中干扰RNA是siRNA。
8.如权利要求7所述的缀合物，进一步包含连接至第二寡核苷酸的5’末端的保护基团。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中连接至第二寡核苷酸的5’末端的保护基团具有结构
M-L1d-[(A-L2)a-(B-L3)b]c-
其中：
M是H或脂质部分；
A和B代表单体单元，独立地选自单糖和(C2-C20)烷撑二醇组成的组；
a和b是0-50的整数；
c是0-30的整数；
L1、L2和L3是连接化合物，独立地选自如下组成的组：磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基甲酸酯、甲基膦酸酯、胍鎓、氨基磺酸酯、磺酰胺、甲缩醛、硫代甲缩醛、砜、酰胺及它们的混合物；
d是0或1。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中单糖选自如下组成的组：呋喃糖、果糖、呋喃糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、改性单糖、唾液酸和赤藓糖。
11.根据权利要求9或者权利要求10所述的缀合物，其中(C2-C20)烷撑二醇选自乙二醇，丙二醇及它们的混合物组成的组。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中M是H，A是呋喃糖；B是C18乙二醇；a、b和c是1，d是0以及L2和L3是磷酸二酯键。
13.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中特异性结合至一种或多种神经递质转运体的选择性试剂选自如下组成的组：5-羟色胺再摄取抑制剂(SRI)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素能和特异性5-羟色胺能抗抑郁剂(NASSA)、去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)、多巴胺再摄取抑制剂(DRI)、内源性大麻素再摄取抑制剂(eCBRI)、腺苷再摄取抑制剂(AdoRI)、兴奋性氨基酸再摄取抑制剂(EAARI)、谷氨酸再摄取抑制剂(GluRI)、GABA再摄取抑制剂(GRI)、甘氨酸再摄取抑制剂(GlyRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)。
14.根据权利要求13所述的缀合物，其中选择性试剂选自如下组成的组：5-羟色胺再摄取抑制剂(SRI)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)选自如下组成的组：舍曲林、舍曲林结构类似物、氟西汀、氟伏沙明、帕罗西汀、吲达品、齐美定、西酞普兰、达泊西汀、依他普仑及它们的混合物，以及寡核苷酸序列互补至靶核苷酸，所述靶核苷酸在到在氨基酸类神经递质转运体相同的细胞中被表达。
16.根据权利要求15所述的缀合物，其具有选自结构(I)或(II)组成的组的结构
Figure FPA00001657140700041
其中
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W是选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
m、n和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，其中m+n+p之和是选自7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的整数。
17.根据权利要求16所述的缀合物，具有选自如下组成的组的结构
Figure FPA00001657140700051
18.根据权利要求14-17任一项所述的缀合物，其中所述靶分子是选自如下组成的组：5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)、编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA、5-羟色胺转运体蛋白和编码5-羟色胺转运体的mRNA。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中核酸能够特异性结合至编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA，并且包含选自如下组成的组的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
20.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中选择性试剂选自如下组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且靶分子是α-突触核蛋白或者编码α-突触核蛋白的mRNA。
21.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中选择性试剂是去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，并且其中靶分子是多巴胺-β-羟化酶或者编码mRNA多巴胺-β-羟化酶的mRNA。
22.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中选择性试剂是选自如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且靶分子是BAX或者编码BAX的mRNA。
23.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中选择性试剂是选自如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且靶分子是tau或者编码Tau的mRNA。
24.如权利要求1-12任一项所述的缀合物，其中选择性试剂是选自如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且靶分子是亨廷顿或者编码亨廷顿的mRNA。
25.根据权利要求20-24任一项所述的缀合物，其中缀合物具有结构
Figure FPA00001657140700071
26.如权利要求25所定义的缀合物，其中缀合物具有结构
Figure FPA00001657140700072
27.如权利要求1-26任一项所述的缀合物用作药物。
28.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗或者预防抑郁相关的病症，其中
(i)选择性试剂选自如下组：5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)、5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)，以及
寡核苷酸能够特异性地结合至选自如下组的靶分子：编码5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)的mRNA、编码5-羟色胺转运体的mRNA、5-羟色胺受体1A型(5-HT1A)和5-羟色胺转运体。
29.如权利要求28所述的缀合物，其中抑郁相关的病症是选自如下组成的组：重性抑郁、强迫性精神障碍(OCD)、广泛性发育障碍(PDDs)、创伤后应激障碍(PTSD)、焦虑症、双相性精神障碍、进食障碍和慢性痛。
30.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗或者预防与路易体沉积有关的疾病，其中
(i)选择性试剂是选自如下组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)，以及
(ii)寡核苷酸能够特异性结合至靶分子，其中靶分子是编码α-突触核蛋白的mRNA或者α-突触核蛋白多肽。
31.如权利要求30所述的缀合物，其中与路易体沉积有关的疾病选自帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩的组。
32.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗或预防与去甲肾上腺素能投射多巴胺不足相关的疾病，其中
(i)选择性试剂是去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，以及
(ii)靶分子是多巴胺-β-羟化酶或者编码多巴胺-β-羟化酶的mRNA。
33.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗或预防与去甲肾上腺素能投射多巴胺不足相关的疾病，其中
(i)选择性试剂是选自去甲肾上腺素再摄取抑制剂(NRI)，以及
(ii)寡核苷酸能够特异性结合至靶分子，其中靶分子是编码去甲肾上腺素转运体(NET)的mRNA或者去甲肾上腺素转运体(NET)多肽。
34.如权利要求33所述的缀合物，其中与去甲肾上腺素能投射多巴胺不足相关的疾病是与痴呆、抑郁和神经变性疾病相关的记忆或者认知过程。
35.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗与神经元细胞凋亡和细胞死亡相关的疾病，其中
(i)选择性试剂是选自如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且
(ii)靶分子是BAX或者编码BAX的mRNA。
36.根据权利要求35所述的缀合物，与神经元细胞凋亡和细胞死亡相关的疾病是选自如下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病、中风/创伤、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化。
37.如权利要求1-12任一项所述的缀合物用于治疗或预防tau相关疾病，其中
(i)选择性试剂是选自如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且
(ii)靶分子是tau或者编码Tau的mRNA。
38.缀合物，如权利要求37所述进行使用，其中tau相关疾病是选自与Tau异常相关的疾病和Tau病变的组。
39.如权利要求38所述的缀合物，其中Tau相关疾病是选自由如下疾病组成的组：额颞痴呆和17号染色体相关的帕金森综合征(FTDP-17)的亚型、进行性核上性麻痹、皮质基底变性、匹克氏病、嗜银颗粒病，以及帕金森病、唐氏综合征、脑炎后帕金森病、营养不良性肌强直、尼曼-皮克C型病、拳击手痴呆、Blint病、朊病毒病、肌萎缩侧索硬化、关岛型帕金森综合征、多发性硬化、青光眼、糖尿病视网膜病变，和外伤性脑损伤；以及亨廷顿病、路易体痴呆、恰克-马利-杜斯氏病、遗传性痉挛性截瘫、和多系统萎缩。
40.如权利要求1-12所述的缀合物用于治疗亨廷顿疾病，其中
(i)选择性试剂是选自由如下组成的组：多巴胺再摄取抑制剂(DRI)和去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRI)和5-羟色胺-去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂，并且
(ii)靶分子是亨廷顿或者编码亨廷顿的mRNA。
41.缀合物，如权利要求40所述进行使用，其中缀合物是脑室内给药或鼻内给药。
42.一种缀合物，包含
(i)至少一种选择性试剂，其特异性结合至一种或多种神经递质转运体，以及
(ii)显像剂。
43.如权利要求42所述的缀合物，其中显像剂是磁共振成像造影剂。
44.如权利要求42或者43所述的缀合物，其中磁共振成像造影剂是钆基化合物。
45.根据权利要求4244任一项所述的缀合物，其中选择性试剂是如权利要求13-26任一项所述的选择性试剂。
46.一种用于成像表达神经递质转运体的细胞的方法，其包含将所述细胞与权利要求42-45任一项所述的缀合物接触，其中形成缀合物的一部分的选择性试剂，特异性结合到所述细胞表达的神经递质转运体上。
47.如权利要求42-45任一项所述的缀合物用作诊断用试剂。
48.一种用于制备式(II)化合物的方法：
Figure FPA00001657140700111
其中
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
R6是羰基活化基团
W是选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
n和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13；
该方法包含以下步骤：
a)式(III)化合物
与式(VII)酰化剂进行反应：
Figure FPA00001657140700122
其中p是如上所定义的，Z是卤素或者OH，以及PG是氨基保护基团，生成式(IV)化合物：
Figure FPA00001657140700123
b)使式(IV)化合物上氨基保护基团脱保护，生成式(V)化合物：
Figure FPA00001657140700124
c)将式(V)化合物与式(VIII)或(IX)的酰化剂进行反应：
其中n是如上所定义的，以及Z是卤素或OH，生成式(VI)化合物：
Figure FPA00001657140700132
d)用羰基活化基处理式(VI)的化合物。
49.根据权利要求48所述的方法，进一步包含将式(II)化合物与以下式(X)的氨基修饰寡核苷酸进行反应，生成如权利要求25所定义的式(I)缀合物：
Figure FPA00001657140700133
其中R1-R5、X、Y、W、m、n和p是如权利要求48中所定义的。
50.根据权利要求49所述的方法，其中寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：5a12的序列。
51.化合物，选自如下构成的组：
(i)具有式(II)的化合物：
Figure FPA00001657140700141
其中R1-R6、X、Y、W、n和p是如权利要求48中所定义的；
(ii)具有式(IV)的化合物
其中R1-R5、X、Y、W、p和PG是如权利要求48中所定义的；
(iii)式(V)化合物
其中R1-R5、X、Y、W和p是如权利要求48中所定义的；
(iv)式(VI)化合物
Figure FPA00001657140700151
其中R1-R5、X、Y、W、p和n是如权利要求48中所定义的。
52.根据权利要求51所述的化合物，选自
(i)具有如下结构的化合物
(ii)具有如下结构的化合物
(iii)具有如下结构的化合物
Figure FPA00001657140700161
和
(iv)具有如下结构的化合物
53.一种用于合成具有如下结构缀合物的方法
Figure FPA00001657140700163
其中
R1、R2、R3、R4和R5是独立地选自氢和C1-C6烷基；
X和Y是独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、ORa和SRb，其中Ra和Rb是独立地选自C1-C3烷基和C6-C10芳基；
W是选自氢、卤素、CN、NO2、C1-C3烷基、C1-C3卤烷基、NRcRd、SO2NReRf、NRgSO2Rh、CO2Ri，其中Rc、Rd、Re、Rf、R8、Rh和Ri是独立地选自氢和C1-C3烷基；
n和p是选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13；
包括以下步骤：
a)下式化合物
与式(V)酰化剂反应
其中p是如上所定义的，Z是卤素或OH以及PG是氨基保护基团，生成式(VI)化合物
Figure FPA00001657140700173
b)使式(VI)化合物上的氨基保护基团脱保护，生成式(VII)化合物：
Figure FPA00001657140700181
和
c)将式(VII)化合物与式(XIV)的羧基修饰的寡核苷酸进行反应：
Figure FPA00001657140700182
54.一种用于制备式(XIV)化合物
其中
R1表示氢、低级烷基或苄基
R2表示氢、甲基、氟族的氯
R2’表示氢、甲基，甲氧基、羟基或卤素原子
R3和R4代表氢、低级烷基
R5表示5-或6-位上的氢、氯或甲氧基以及
P是2-6
该方法包括以下步骤：
a)将式(XVI)化合物
Figure FPA00001657140700191
与式(V)酰化剂进行反应：
Figure FPA00001657140700192
其中R1、R2、R2’、R3、R4，R5和p是如上所定义的，Z是卤素或者OH，以及PG是氨基保护基团，生成式((XVII)化合物
Figure FPA00001657140700201
b)使式(XVII)化合物上的氨基保护基团脱保护，生成式(XVIII)化合物：
Figure FPA00001657140700202
和
c)将如上所描述的式(XVIII)化合物与式(X)的氨基修饰的寡核苷酸进行反应：
Figure FPA00001657140700203
55.化合物，选自如下构成的组：
(i)具有式(XVII)结构的化合物
和
(ii)具有式(XVIII)结构的化合物
Figure FPA00001657140700212
56.根据权利要求55所述的化合物，选自如下组：
(i)具有如下结构的化合物
Figure FPA00001657140700221
和
(ii)具有如下结构的化合物
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