CN106413757B - p97-多核苷酸结合物 - Google Patents

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Abstract

提供p97(黑色素转铁蛋白)与例如小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸之间的结合物，以及相关组合物和其使用方法，例如促进例如siRNA分子的多核苷酸跨越血脑屏障(BBB)传递和/或提高其在CNS和/或周边组织中的渗透，并且由此治疗和/或诊断多种疾病，包括具有中枢神经系统(CNS)组分的那些疾病。

Description

p97-多核苷酸结合物
相关申请案的交叉引用
本申请案根据35 U.S.C.§119(e)要求2014年4月8日申请的美国申请案第 62/144,598号；2014年8月6日申请的美国申请案第62/033,903号；以及2014年5月1 日申请的美国申请案第61/987,228号的权利，所述申请案各自以全文引用的方式并入。
序列表
以文本格式代替纸张拷贝提供与本申请案相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为BIOA_010_03WO_ST25.txt。所述文本文件约42KB，创建于2015年5月1日，并且以电子方式经EFS-Web提交。
技术领域
本发明涉及p97(黑色素转铁蛋白)与例如小干扰RNA(siRNA)分子之间的多核苷酸的结合物，以及相关组合物和其使用方法，例如促进siRNA试剂跨越血脑屏障 (BBB)传递和/或提高其在CNS和/或周围组织中的渗透，并且由此治疗和/或诊断多种疾病，包括具有中枢神经系统(CNS)组分的那些疾病。
背景技术
RNA干扰(RNAi)为RNA分子抑制基因表达的生物过程，通常通过导致具体mRNA 分子的破坏进行。疗法中可采用RNA干扰。但由于干扰素反应而难以向哺乳动物细胞中引入长dsRNA股，因此短干扰RNA(siRNA)的使用更成功。
然而，siRNA分子的治疗性用途在向例如中枢神经系统(CNS)组织的所要组织中存在挑战。一个问题是血脑屏障(BBB)阻断许多试剂从血液向脑部自由转移。因此，存在严重神经方面问题的疾病预期不会对常规投予途径(例如IV或皮下投予)起反应。对于这类和其它疾病，改良siRNA分子跨越BBB传递的方法将非常合意。
发明内容
本发明的实施例包括p97(黑色素转铁蛋白)与例如小干扰RNA(siRNA)分子的多核苷酸之间的结合物，以及相关组合物和其使用方法。因此，某些实施例包括p97结合物，其包含p97多肽，所述多肽共价连接至长度为约15-40个核苷酸的第一多核苷酸，中间有任选的连接子(L)，和长度为约15-40个核苷酸的第二多核苷酸，其与第一多核苷酸大体上互补和杂交，其中所述第一或第二多核苷酸为与目标mRNA序列大体上互补的反义股。
在一些实施例中，第一和第二多核苷酸在反义股的3'端、反义股的5'端或这两处形成1-3个核苷酸悬垂物。在某些实施例中，第一多核苷酸为反义股且第二多核苷酸为有义股。在某些实施例中，第二多核苷酸为反义股且第一多核苷酸为有义股。
在某些实施例中，第一和第二多核苷酸长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。在一些实施例中，反义股与选自表2的基因的目标mRNA序列大体上或完全互补。
在某些实施例中，基因为人类NOX基因。在一些实施例中，人类NOX基因为NOX1、NOX2或NOX4中的一个或多个。在具体实施例中，人类NOX基因为NOX4且其中第一和第二多核苷酸选自5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3'(SEQ ID NO:31)和 5'-GAC CUG ACU UUGUGA ACA UTT-3'(SEQ ID NO:32)。
在某些实施例中，p97多肽包含(a)SEQ ID NO:1-30或表1或表B中阐述的氨基酸序列；(b)与(a)的序列至少90％相同的氨基酸序列；(c)通过添加、取代、插入或缺失约1-50个氨基酸与(a)的序列不同的氨基酸序列。在一些实施例中，p97多肽为约10-50个氨基酸长。在某些实施例中，p97多肽为约12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸长。
在具体实施例中，p97多肽包含DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)或 DSSHAFTLDELRYC(SEQ ID NO:29)或DSSHAFTLDELRC(SEQ ID NO:30)、由它们组成或基本上由它们组成。在某些实施例中，p97多肽在C端、N端或这两处具有半胱氨酸残基。在一些实施例中，结合物中间包含连接子(L)。
还包括药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和本文所述的p97结合物，其中所述药物组合物无菌且无热原。
还包括用于治疗有需要的个体的疾病的方法，其包含向个体投予本文所述的p97结合物或药物组合物。在某些实施例中，目标基因为人类NOX基因，任选地NOX1、NOX2 或NOX4，且其中个体患有中枢神经系统(CNS)的NOX相关疾病或病况。在一些实施例中，CNS的NOX相关疾病或病况为神经退化性疾病、精神疾病、缺血、中风、CNS 损伤或神经痛。
在某些实施例中，p97结合物或药物组合物通过静脉内(IV)输注或皮下注射投予。
附图说明
图1A-1L示出了具有p97(黑色素转铁蛋白)多肽的示范性结合物的通式结构，所述多肽共价连接siRNA分子或shRNA分子的至少一股和任选地连接子(L)。
图2示出了示范性p97-siRNA结合物(参看实例1)的结构。
图3示出了所分析的脑部区段的四个视场的位置(参看实例1)。
图4A-4D示出了静脉内投予测试试剂后小鼠脑部组织的免疫荧光成像。仅对照测试试剂PBS(4A)和未结合的siRNA(4B)显示脑部组织中无AF680(红色)染色。相比之下，p97-siRNA结合物(4C-4D)显示脑部组织中显著AF680(红色)染色，证明与p97多肽的结合可提高siRNA分子向例如脑实质的CNS组织的传递。
图5A-5B示出了siRNA分子的糖(5A)和核碱基(5B)化学性质的示范性改良。
图6示出了p97多肽与siRNA分子的多核苷酸股结合形成p97-siRNA结合物的反应流程。
图7示出了脑部组织中的siRNA和p97-siRNA结合物相对于PBS对照的体积分数。
图8示出了所测试的七只不同小鼠的RT-PCR结果(如所指示，一个PBS对照和三个各siRNA测试分子)。相对于GAPDH对照显示NOX4mRNA的含量。
图9A-9C示出了使用ΔΔCT方法分析的RT-PCR数据：＝(CT(目标，未经处理)-CT(参考，未经处理))-(CT(目标，处理)-CT(参考，处理))。图9A示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中的NOX4mRNA相对于对照(PBS和未结合的siRNA)显著下调。图9B示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中内源性NOX4表达相对于未结合的siRNA的降低百分比。图9C示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中的NOX4表达相对于未结合的siRNA的降低倍数(约1.8倍)。
图10示出了用p97-siRNA结合物(MTfp-siRNA)预处理且罹患大脑中动脉闭塞(MCAO)诱发的局部缺血性中风的小鼠相对于PBS和仅siRNA组具有显著较小的梗塞面积。
图11示出了在中风诱发后0.5小时用MTfp-siRNA结合物预处理相对于用PBS或仅siRNA预处理改良动物的神经功能缺损。
图12A-12B示出了预处理和中风诱发后NOX4mRNA含量的RT-PCR分析结果。图 12A示出了MTfp-siRNA预处理相对于PBS或仅siRNA导致脑部的中风诱发部分中较低Nox4诱发(ΔCt＝Ct(nox4,PBS-假处理组)-Ct(B-肌动蛋白,PBS-假处理组))。图12B 同样示出了MTfp-siRNA预处理相对于PBS或仅siRNA降低中风诱发的脑部中的NOX4 mRNA表达(ΔΔCT＝(CT(Nox4,PBS-假处理组)-CT(B-肌动蛋白,PBS-假处理组))-(CT(Nox4,MTfp-siRNA-中风)-CT(B-肌动蛋白,MTfp-siRNA-中风))。
具体实施方式
除非明确指示为相反，否则本发明的实践将采用所属领域技术内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，下文中出于说明的目的对其中许多进行了描述。在文献中全面解释了此类技术。参看例如Sambrook等人,《分子克隆：实验指南(Molecular Cloning: ALaboratory Manual)》(第3版,2000)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第I卷和第II卷(D.Glover编)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》 (N.Gait编,1984)；《寡核苷酸合成：方法和应用(OligonucleotideSynthesis:Methods and Applications)》(P.Herdewijn编,2004)；《核酸杂交(NucleicAcid Hybridization)》(B. Hames和S.Higgins编,1985)；《核酸杂交：现代应用(NucleicAcid Hybridization: Modern Applications)》(Buzdin和Lukyanov编,2009)；《转录与翻译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》 (R.Freshney编,1986)；Freshney,R.I.(2005)《动物细胞培养，基础技术手册(Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique)》,第5版.Hoboken NJ,约翰·威利父子公司 (John Wiley&Sons)；B.Perbal,《分子克隆实践指南(APractical Guide to Molecular Cloning)》(第3版2010)；Farrell,R.,《RNA方法：分离和表征的实验室指导(RNA Methodologies:A Laboratory Guide for Isolation andCharacterization)》(第3版2005)。《聚(乙二醇)，化学和生物学应用(Poly(ethyleneglycol),Chemistry and Biological Applications)》,ACS,华盛顿(Washington),1997；Veronese,F.和J.M.Harris编,肽和蛋白质PEG化(Peptide and protein PEGylation),《先进药物输送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》,54(4)453-609(2002)；Zalipsky,S.等人,《聚乙二醇化学方法：生物技术和生物医学应用(Polyethylene GlycolChemistry:Biotechnical and Biomedical Applications)》中的“使用官能化聚(乙二醇)修饰多肽(Use of functionalized Poly(Ethylene Glycols)for modification ofpolypeptides)”。
本文中引用的全部公开案、专利和专利申请案都以全文引用的方式并入本文中。
定义
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中也可以使用与本文中描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。为了本发明的目的，下文定义以下术语。
本文中使用冠词“一(a/an)”是指所述冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法宾语。举例来说，“一要素”意味着一个要素或超过一个要素。
“约”意指量、含量、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相对于参考量、含量、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化多达30、 25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。
如本文所用，术语“氨基酸”打算意指天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括蛋白质生物合成期间使用的20种(L)-氨基酸，以及其他氨基酸，例如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链赖氨酸、异锁链赖氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正白氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸、乙硫氨酸等，其为所属领域的技术人员已知。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的改性形式。此类改良可包括例如取代或置换氨基酸上的化学基团和部分或通过氨基酸的衍生作用进行。氨基酸模拟物包括例如呈现功能上类似特性 (例如参考氨基酸的电荷和电荷间距特征)的有机结构。举例来说，模拟精氨酸(Arg 或R)的有机结构将具有以类似分子间距定位且具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的 e-氨基相同的移动程度的正电荷部分。模拟物还包括限制结构从而维持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间距和电荷相互作用。所属领域的技术人员已知或可测定哪些结构构成功能上等效氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
在本说明书通篇中，除非上下文另外要求，否则措辞“包含 (comprise/comprises/comprising)”应理解成暗示包括所陈述的步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其它步骤或要素或步骤或要素的群组。“由……组成”打算包括并且限于短语“由……组成”之后的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为需要或必需的，并且不能存在其它要素。“基本上由……组成”打算包括短语后所列的任何要素，并且限于不干扰或影响本发明中规定的所列要素的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列要素为需要或必需的，但其它要素是任选的并且可视其是否显著影响所列要素的活性或作用而定存在或不存在。
术语“结合物”打算指由于将试剂或其它分子(例如生物活性分子)共价或非共价连接或键连到p97多肽形成的实体。
如本文所用，术语“功能”和“功能性”等是指生物学、酶促或治疗性功能。
“同源性”是指相同或构成保守取代的氨基酸的数目百分比。同源性可使用序列比较程序测定，例如GAP(Deveraux等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》.12,387-395, 1984)，其以引用的方式并入本文中。以此方式，与本文列举的那些序列具有类似或大体上不同长度的序列可以通过向比对中插入间隙来比较，此类间隙例如通过GAP使用的比较算法测定。
“分离”意指使材料大体上或基本上不含其原生状态时通常伴随的组分。举例来说，如本文所用，“经分离的肽”或“经分离的多肽”等包括体外分离和/或纯化肽或多肽分子与其天然细胞环境，以及失去与细胞的其它组分的关联性；即与体内物质不显著关联。
术语“调节”和“更改”包括通常相对于对照组统计学上显著或生理学上显著的量或程度的“增加”、“提高”或“刺激”以及“降低”或“减少”。“增加”、“促进”或“提高”的量通常为“统计学上显著”的量，且可包括无组合物(例如不存在本发明的结合物)或对照组合物、样品或测试个体产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30倍或更多倍(例如500、1000倍)(包括全部整数和与1之间或大于1的小数点，例如1.5、 1.6、1.7、1.8等)的增加。“减少”或“降低”的量通常为“统计学上显著”的量，并且可包括无组合物或对照组合物产生的量中1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、 11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、 45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包括中间的全部整数)降低。作为一个非限制性实例，对照可比较p97-siRNA结合物相对于单独siRNA分子的活性(例如跨越血脑屏障传输/传递的量或速率)、分布到中枢神经系统组织的速率和/或水平，和/或针对血浆、中枢神经系统组织或任何其它全身或周围非中枢神经系统组织的Cmax、或减弱目标基因(例如在CNS组织中)表达的能力。本文描述了其它比较和“统计学上显著”的量的实例。
如本文所用的涉及基因或mRNA的短语“减毒表达”意指投予或表达一定量的siRNA以通过mRNA裂解或通过直接抑制转译减少目标mRNA转译成蛋白质。如本文所用的术语“抑制”、“沉默”和“减毒”是指目标mRNA或相应蛋白质的表达相比于目标mRNA 或相应蛋白质在无本发明的干扰RNA存在的情况下可测量的减少。目标mRNA或相应蛋白质的表达的减少可相对于投予或表达非靶向对照siRNA和/或未结合的siRNA之后存在的水平比较来评估。在某些实施例中，p97-siRNA结合物在CNS组织(例如体内周围投予时)中具有相对于相应未结合的siRNA的目标基因表达“增加的”削弱。
除非另外规定，否则术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式，以及其类似物。核苷酸包括包含嘌呤(例如腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤)和其衍生物和类似物，以及嘧啶(例如胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶)和其衍生物和类似物的物质。在一些实施例中，全部核苷酸选自经修饰或未经修饰的A、C、G或U的群组。
术语核苷酸还打算包括经修饰碱基和通用碱基。举例来说，通用碱基包括(但不限于)3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或水粉蕈素。术语“核苷酸”还打算包括用氨基取代核糖基 3'氧产生的N3'到P5'氨基磷酸酯。
另外，术语核苷酸亦包括具有可检测标记(例如放射性或荧光部分)或连接到核苷酸的质量标记的那些物质。
在某些实施例中，组合物中任何指定试剂(例如p97结合物)的“纯度”可以具体定义。举例来说，特定组合物可包含例如(但不限于)通过高压液相色谱(HPLC)测量的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯(包括中间的所有小数)的试剂，高压液相色谱是通常在生物化学和分析化学中用于分离、鉴别和定量化合物的众所周知的柱色谱形式。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物和其变异体和合成类似物。因此，这些术语应用于一个或多个氨基酸残基为合成非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物)以及天然存在的氨基酸聚合物。本文所述的多肽不限于具体长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质包括于多肽的定义内，并且除非另外明确说明，此类术语在本文中可互换使用。本文所述的多肽还可以包含表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及所属领域中已知的其它修饰 (天然存在的和非天然存在的)。多肽可以是整个蛋白质，或其子序列、片段、变异体或衍生物。
“生理学上可裂解”或“可水解”或“可降解”连接子或键是在生理条件下与水反应(即水解)的键。键在水中水解的趋势将不仅取决于连接两个中心原子的键的通用类型，而且取决于连接到这些中心原子的取代基。适当水解不稳定或弱键包括(但不限于)：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫酯、硫醇酯、碳酸根，和腙、肽和寡核苷酸。
“可释放连接子”包括(但不限于)生理学上可裂解连接子和酶可降解连接子。因此，“可释放连接子”为在生理条件下可发生自发水解或通过一些其它机制(例如酶催化、酸催化、碱催化等)裂解的连接子。举例来说，“可释放连接子”可涉及具有碱提取质子(例如可电离氢原子Hα)作为驱动力的消除反应。出于本文的目的，“可释放连接子”与“可降解连接子”同义。“酶可降解键”包括例如通过一种或多种酶(例如肽酶或蛋白酶)发生降解的氨基酸序列的键。在具体实施例中，可释放或以其它方式可降解的连接子在pH 7.4，25℃(例如生理pH，人体温度(例如体内))的半衰期为约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24 小时、约36小时、约48小时、约72小时或约96小时或更低。
术语“参考序列”一般是指倍另一序列比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的全部多肽和多核苷酸序列作为参考序列包括在内，包括通过名称描述的那些和序列表中描述的那些。
如本文所用，术语“序列一致性”或例如包含“50％一致性的序列”是指比较窗口上逐核苷酸计或逐氨基酸计的序列相同程度。因此，“序列一致性百分比”可以通过以下方式计算：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，测定两个序列中相同核酸碱基(例如A、 T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、 Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数获得匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并且将结果乘以100获得序列一致性百分比。包括与本文所述的参考序列中的任一个具有至少约50％、55％、 60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核苷酸和多肽(参看例如序列表)，通常其中多肽变异体保持参考多肽的至少一种生物活性。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”和“大体一致性”。“参考序列”的长度为至少12，但通常15到18并且通常至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含(1)两个多核苷酸之间类似的序列(即完全多核苷酸序列的仅一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间相异的序列，两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴别和比较局部区域的序列相似性来进行。“比较窗口”是指至少6个，通常约50到约100个，更通常约100到约 150个连续位置的概念性区段，其中在将两个序列最佳比对后，将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列比较。对于最佳比对的两个序列，比较窗口可包含相较于参考序列(其不包含添加或缺失)约20％或更少添加或缺失(即间隙)。用于比对比较窗口的序列最佳比对可以通过计算机化执行算法(美国威斯康星州的威斯康星州遗传学软件包 7.0版本，遗传学计算机组，575科学驱动麦迪逊(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)中的GAP、 BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过多种选择方法中的任一个产生的检查和最佳比对 (即在比较窗口上导致最高同源性百分比)来进行。还可以参考例如Altschul等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》25:3389,1997披露的BLAST程序家族。序列分析的具体论述可见于Ausubel等人,“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),”约翰·威利父子公司(John Wiley&SonsInc),1994-1998,第15章的19.3 单元。
“统计学上显著”意指结果不太可能偶然发生。统计显著性可以通过所属领域中已知的任何方法来测定。显著性的常用测量值包括p值，其是如果零假设为真那么所观测事件将发生的频率或机率。如果所获得的p值小于显著性水平，那么驳回零假设。在简单情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。
术语“溶解度”是指蛋白质或结合物溶解于液体溶剂中并且形成均质溶液的特性。溶解度通常表示为浓度，按每单位体积溶剂的溶质质量计(g溶质/kg溶剂、g/dL(100mL)、mg/ml等)、摩尔浓度、重量摩尔浓度、摩尔分数或其它类似浓度描述。每一溶剂量可溶解的溶质的最大平衡量为指定条件(包括温度、压力、pH和溶剂性质)下，所述溶质在所述溶剂中的溶解度。在某些实施例中，在生理pH或其它pH下，例如在pH 5.0、 pH 6.0、pH 7.0或pH7.4下测量溶解度。在某些实施例中，在水或生理学缓冲剂(例如 PBS或NaCl(具有或不具有NaP))中测量溶解度。在具体实施例中，在相对较低pH (例如pH 6.0)和相对较高盐(例如500mM NaCl和10mM NaP)下测量溶解度。在某些实施例中，在例如血液或血清的生物流体(溶剂)中测量溶解度。在某些实施例中，温度可以大致是室温(例如约20、21、22、23、24、25℃)或大致是体温(约37℃)。在某些实施例中，在室温下或约37℃下，p97结合物的溶解度为至少约0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、25或30mg/mL。
如本文所用，“个体”包括呈现可以使用本发明的p97结合物治疗或诊断的症状或处于呈现所述症状风险中的任何动物。适合个体(患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、农畜和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，并且优选地人类患者。
“大体上”或“基本上”意指一些指定量的几乎全部或所有，例如95％、96％、97％、98％、99％或更高。
“大体上不含”是指几乎完全或完全不存在指定量，例如一些指定量的小于约10％、 5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少。举例来说，特定组合物可以“大体上不含”细胞蛋白质、膜、核酸、内毒素或其它污染物。
术语“目标”以多种不同形式在本文通篇中使用且由其使用情境定义。“目标mRNA”是指指定siRNA针对的信使RNA。“目标序列”和“目标位点”是指siRNA的有义股显示不同程度一致性并且反义股呈现不同程度互补性的mRNA内的序列。短语“siRNA目标”可以是指siRNA针对的基因、mRNA或蛋白质。类似地，“目标沉默”可以是指基因或相应mRNA或蛋白质的状态。
如本文所用，“治疗(Treatment/treating)”包括对疾病或病况的症状或病变的任何理想作用，并且可包括所治疗疾病或病况的一个或多个可测量标记中的甚至最小改变或改进。“治疗(Treatment/treating)”并非必须指示完全根除或治愈疾病或病况或其相关症状。接收这一治疗的个体为有需要的任何个体。所属领域的技术人员将显而易知临床改良的示范性标记。
术语“野生型”是指基因或基因产物具有从天然存在的来源分离的所述基因或基因产物的特征。野生型基因或基因产物(例如多肽)为种群中最通常观测到的那些并且因此任意设计基因的“正常”或“野生型”形式。
p97-多核苷酸结合物
本发明的实施例大体上涉及包含p97(黑色素转铁蛋白；MTf)多肽的结合物，所述多肽共价或可操作地连接到至少一个多核苷酸，例如双股小干扰RNA(siRNA)分子的至少一个股；以及相关组合物和其使用方法。本文描述了示范性p97多肽序列(例如表1)和siRNA目标基因(例如表2)。在某些实施例中，p97结合物在p97多肽和核酸分子之间包含一个或多个连接子(L)，本文提供了其实例。本文还包括和描述了前述任一个的变异体和片段。
在某些实施例中，p97结合物包含图1A-1H或2A中所示的示范性非限制性构形中的至少一个，或由其组成或基本上由其组成。举例来说，在某些实施例中，siRNA分子的多核苷酸股结合到p97多肽的N端。在一些实施例中，siRNA分子的多核苷酸股结合到p97多肽的C端。在具体实施例中，siRNA分子的多核苷酸股结合到p97多肽的内部氨基酸，例如含S氨基酸，例如甲硫氨酸或半胱氨酸。在这些和相关实施例的一些中， siRNA分子的多核苷酸股经连接子结合到p97多肽。
在某些实施例中，p97多肽结合到siRNA分子的多核苷酸股的3'端。在某些实施例中，p97多肽结合到siRNA分子的多核苷酸股的5'端。在具体实施例中，p97多肽结合到siRNA分子的多核苷酸股的内部核碱基。在这些和相关实施例的一些中，p97多肽经连接子结合到siRNA分子的多核苷酸。
在一些实施例中，如本文所述，p97多肽结合到siRNA分子的有义多核苷酸股。在某些实施例中，如本文所述，p97多肽结合到siRNA分子的反义多核苷酸股。
某些结合物可采用超过一种p97多肽。举例来说，在一些实施例中，第一p97多肽结合到有义股且第二p97多肽(相同或不同)结合到反义股。在一些实施例中，1、2、 3、4或5种p97多肽结合到siRNA分子的多核苷酸股。
一些结合物可采用超过一种siRNA分子。举例来说，在某些实施例中，p97多肽结合到siRNA分子的1、2、3、4或5个多核苷酸股。一些方面，p97多肽结合到siRNA 分子的1、2、3、4或5个有义股。在某些方面，p97多肽结合到siRNA分子的1、2、3、4或5个反义股。在特定方面，p97多肽结合到有义股和反义的混合物，例如siRNA分子的1、2、3、4或5个有义股和1、2、3、4或5个反义股。
还包括前述任一个的组合。
可以根据所属领域的多种技术制备p97多肽和siRNA分子的多核苷酸股之间的结合物。举例来说，某些实施例可利用含有硫醇的siRNA(参看Muratovska和Eccles,《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett.)》558:63-68,2004)或其它方法(参看Jeong 等人,《生物结合物化学(Bioconjugate Chem.)》20:5-14,2009)。在一些实施例中，siRNA 股的5'端、内部核碱基或3'端可以使用一个或多个具有存在于多肽和多核苷酸中的官能团的预活化小分子(例如胺、硫醇、羧酸酯、羟基、醛和酮、活性氢、光化学和环加成反应)并且通过经多种不同结合化学物质(包括稳定、可裂解或不稳定键)彼此交联从而共价连接到肽的N端、内部残基或C端。在一些方面，聚合物结合物可以例如通过借助于基因编码的对乙酰基苯丙氨酸(pAcF)将氨氧基衍生的阳离子嵌段共聚物结合到 p97多肽(参看Lu等人,《美国化学会志(J Am Chem Soc.)》135:13885-91,2013)，接着将siRNA分子的多核苷酸股结合到共聚物来制备。用于将例如多核苷酸的复杂分子连接到p97多肽的方法的另一实例为SATA/磺基-SMCC交联反应(Pierce(Rockford, IL))。图6中说明一种示范性方法。
结合物可以使用本文所述的p97、L或siRNA分子(包括其官能性或活性变异体和片段)建构。
在某些实施例中，如根据所所属领域中的常规技术所测量，结合物具有至少约90％的纯度。在某些实施例中，例如诊断组合物或特定治疗性组合物，结合物具有至少约95％的纯度。在具体实施例中，例如治疗性或药物组合物，结合物具有至少约97％或98％或99％的纯度。在其它实施例中，例如当用作参考或研究试剂时，结合物可以是较小纯度，并且可具有至少约50％、60％、70％或80％的纯度。纯度(例如按蛋白质计的纯度)可以整体测量或相对于所选定组分(例如其它蛋白质)测量。
在某些实施例中，如上文所述，本文所述的结合物和/或组合物为约大体上不含内毒素，包括例如约95％不含内毒素，优选地约99％不含内毒素，并且更优选地约99.99％不含内毒素。如本文所述，可以根据所属领域中的常规技术检测内毒素的存在。
p97多肽.在某些实施例中，结合物中所用的p97多肽序列包含下表1中提供的人类p97参考序列，基本上由其组成或由其组成。还包括其变异体和片段。
Figure GDA0002116732210000121
Figure GDA0002116732210000131
Figure GDA0002116732210000141
在一些实施例中，p97多肽序列包含沿其长度与表1中的人类p97序列或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性或同源性的序列。
在具体实施例中，p97多肽序列包含表1中的人类p97序列的片段。在某些实施例中，p97多肽片段长度为约、至少约或高达约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、 91、92、93、94、95、96、97、98、100、105、110、115、120、125、130、135、140、 145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、210、220、230、 240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、 390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、 540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、 690、700、700、710、720、730个或更多个氨基酸，包括中间的全部整数和范围，并且其可包括p97参考序列的全部或一部分序列，包括如SEQ ID NO:1所定义的参考p97片段的任何相邻N端和/或C端序列。
在某些实施例中，p97多肽片段的长度为约5-700、5-600、5-500、5-400、5-300、 5-200、5-100、5-50、5-40、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-700、10-600、10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-25、10-20、10-15、20-700、 20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、20-25、30-700、 30-600、30-500、30-400、30-300、30-200、30-100、30-50、30-40、40-700、40-600、 40-500、40-400、40-300、40-200、40-100、40-50、50-700、50-600、50-500、50-400、 50-300、50-200、50-100、60-700、60-600、60-500、60-400、60-300、60-200、60-100、 60-70、70-700、70-600、70-500、70-400、70-300、70-200、70-100、70-80、80-700、 80-600、80-500、80-400、80-300、80-200、80-100、80-90、90-700、90-600、90-500、 90-400、90-300、90-200、90-100、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-250、 100-200、100-150、200-700、200-600、200-500、200-400、200-300或200-250个氨基酸，并且包含p97参考序列的全部或一部分序列，包括如SEQ ID NO:1所定义的参考 p97片段的任何相邻N端和/或C端序列。
某些实施例包含一个或多个p97多肽，例如2、3、4或5个多肽，如式[X]n所示，其中X为本文所述的p97多肽并且n为整数1-5。在具体实施例中，X为DSSHAFTLDELR (SEQ ID NO:14)。
在一些实施例中，p97多肽具有一个或多个末端(例如N端、C端)半胱氨酸和/ 或酪氨酸，其可以添加分别用于结合和碘化。在一些方面，半胱氨酸残基提供游离巯基以允许p97多肽直接或经例如PEG类连接子的连接子结合到siRNA分子的多核苷酸股。
在某些实施例中，所关注的p97多肽序列包括p97氨基酸序列、p97的子序列和/ 或变异体，其有效传输所关注的试剂跨越血脑屏障并且进入中枢神经系统(CNS)。在具体实施例中，变异体或片段包含人类p97的N-凸起部(SEQ ID NO:1的残基20-361)。在特定方面，变异体或片段包含完整和官能性Fe3+结合位点。
在一些实施例中，p97多肽序列为p97多肽的可溶形式(参看Yang等人,《蛋白质表达和纯化(Prot Exp Purif.)》34:28-48,2004)或其片段或变体。在一些方面，可溶性 p97多肽单独或与缺失信号肽的全部或一部分(SEQ ID NO:1的残基1-19)组合的缺失疏水性结构域(SEQ ID NO:1的残基710-738)的全部或一部分。在特定方面，可溶性 p97多肽包含SEQID NO:2(SEQ ID NO:1的残基20-711)，包括其变异体和片段，或由其组成。
在某些实施例中，例如采用脂质体的那些，p97多肽序列为p97多肽的脂溶性形式。举例来说，这些和相关实施例中的某些包括p97多肽，所述多肽包含疏水性结构域的全部或一部分，任选地具有或不具有信号肽。
在特定其它实施例中，p97片段或变异体能够特异性结合到p97受体、LRP1受体和/或LRP1B受体。
在一些实施例中，p97多肽为例如从细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或真核细胞(例如哺乳动物或人类细胞)产生的重组多肽。在一些实施例中，重组p97多肽在大体上或完全无血清培养基中产生。在一些实施例中，p97多肽为合成多肽。
下文更详细地描述参考p97多肽和其它参考多肽的变异体和片段。
siRNA分子和其它多核苷酸.如上文所述，本发明的实施例包括共价或以其它方式连接到至少一个多核苷酸的p97多肽。在具体实施例中，多核苷酸为siRNA分子的至少一个股。术语“siRNA分子”或“siRNA”是指诱发RNA干扰(RNAi)路径的小抑制RNA 双螺旋体。如本文所用，这些分子的长度可变化(一般15-30个碱基对加任选地悬垂物) 并且反义股中含有与其目标mRNA的不同互补程度。一些(而非全部)siRNA在有义股和/或反义股的5'或3'端上具有不成对悬垂碱基。
术语“siRNA”包括具有两个独立股的双螺旋体，并且除非另外规定，否则还包括可形式包含双螺旋体区域的发夹结构的单链，例如短发夹RNA(“shRNA”)。因此，在一些实施例中，多核苷酸为shRNA分子，并且p97多肽共价或以其它方式连接到包含双螺旋体区域的单股多核苷酸(参看例如图1I-1L)。在具体实施例中，单股发夹shRNA 分子包含约、至少约或不超过约19-29个碱基对(即约19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28或29bp)的主干，约、至少约或不超过约4、5、6、7或8个核苷酸的环，和任选地在3′端处的二核苷酸悬垂物，由其组成，或基本上由其组成。
还包括作为多核苷酸的CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)RNA寡核苷酸和TALEN(转录活化因子样效应子核酸酶)RNA寡核苷酸，包括形成CRISPR RNA引导的监视络合物，例如Cas9-crRNA络合物等的部分的RNA(参看例如WO 2013/142578；以及美国申请案第2010/0076057号；第2011/018977号；第2013/0011828号；以及第 20130330778号，其以引用的方式并入本文中)。
术语“有义股”是指包含与目标核酸序列(例如信使RNA或DNA序列)完全或部分相同的序列。术语“反义股”是指包含与目标核酸序列(例如信使RNA或DNA序列)完全或部分互补的序列的多核苷酸。
有义股和/或反义股的长度的实例包括约15-40个碱基，约19-36个碱基，约19-30个碱基，约19-25个碱基和约19-23个碱基。在具体实施例中，siRNA-结合物的第一和/ 或第二单股多核苷酸长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基或核苷酸，包括中间的全部范围。这些股长度包括可能悬垂物区域。因此，在具体实施例中，siRNA分子的第一和第二多核苷酸在反义股的3'端、反义股的5'端或这两处形成1、2或3个核苷酸悬垂物。
当提供siRNA的序列时，按照惯例，除非另外指示，否则其为有义股，并且互补反义股隐含。在双螺旋体siRNA(由两个独立股形成)中，一个股可以是有义股，且另一股可以是反义股。如果存在悬垂物，那么短语“有义区域”可以指除悬垂物区域之外的有义股的核苷酸序列部分。类似地，短语“反义区域”可以指除悬垂物区域之外的反义股的核苷酸序列部分。如果siRNA为shRNA，那么不存在两个独立股，并且“有义区域”为双螺旋体区域具有与目标序列完全或部分相同的序列的部分，并且“反义区域”为与目标序列和有义区域完全或部分互补的核苷酸序列。
通常，siRNA、shRNA或miRNA分子构成或形成双螺旋体区域。术语“双螺旋体区域”是指通过沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)或允许互补或大体上互补的多核苷酸股之间形成稳定双螺旋体的任何其它方式彼此形成碱基对的两个互补或大体上互补多核苷酸的区域。双螺旋体区域的尺寸的实例包括(但不限于)约17-30个碱基对、17-25个碱基对、17-23个碱基对、18-30个碱基对、18-25个碱基对、18-23个碱基对、19-30个碱基对、19-25个碱基对和19-23个碱基对。双螺旋体区域可以由碱基对的长度以及所述范围上的互补程度限定。
因此，当双螺旋体区域由两个独立核苷酸股形成时，反义股和有义股的各股可在5' 端或3'端含有为双螺旋体的部分的核苷酸和不为双螺旋体的部分的核苷酸。siRNA可以设计成在反义股上，与目标互补的全部核苷酸为双螺旋体区域的部分，并且因此在有义股上具有互补核苷酸。然而，siRNA还可以设计成尽管有义股上不具有互补核苷酸，但反义股在其3'端和/或其5'端也含有在具有目标的互补核苷酸的反义股内的连续核苷酸链段的部分的核苷酸。
举例来说，有义股可含有19个核苷酸并且反义股可含有21个核苷酸。反义股的全部核苷酸(但两个最3'核苷酸除外)可以与有义股上的19个核苷酸互补，而反义股的 21个核苷酸的全部链段可以与目标的21个核苷酸的链段互补。或者，反义股的两个最 3'核苷酸可以选择以便与目标的一部分互补，或随机选择或促进处理使得一个或两个可能与或不与目标的如下两个核苷酸互补，所述两个核苷酸与反义股的其它19个核苷酸与所互补的核苷酸相邻。在一些实施例中，双螺旋体区域内可能例如不存在错配、存在一个错配、两个错配、三个错配、四个错配或五个错配。
术语“错配”包括有义股的核苷酸与反义股的核苷酸之间不进行沃森-克里克碱基配对的情境。错配的实例包括(但不限于)A与G正对面、C与A正对面、U与C正对面、U与G正对面、A与A正对面、G与G正对面、C与C正对面以及U与U正对面。
通常，siRNA分子的第一和第二多核苷酸股彼此完全或基本上互补。术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常通过反向平行的多核苷酸股中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸股可以用沃森-克里克方式(例如A与T、A与U、 C与G)或以允许形成双螺旋体的任何其它方式碱基配对。所属领域的技术人员了解，当使用RNA而非DNA时，尿嘧啶而非胸腺嘧啶是认为与腺苷互补的碱基。然而，除非另外规定，否则当在本发明的情形下标示U时，暗示取代T的能力。完美互补或100％互补是指一个多核苷酸股的各核苷酸单元可以与第二多核苷酸股的核苷酸单元氢键结的情境。欠完美互补是指两个股的一些而非全部核苷酸单元可以彼此氢键结的情境。举例来说，对于两个20-mer，如果各股上仅两个碱基对可以彼此氢键结，那么多核苷酸股呈现10％互补。在同一实例中，如果各股上的18个碱基对可彼此氢键结，那么多核苷酸股呈现90％互补。在一些实施例中，在双螺旋体区域内，存在至少75％互补、至少80％互补、至少90％互补、至少95％互补或100％互补。
在某些实施例中，siRNA分子的反义股完全或大体上与目标基因中的目标mRNA序列互补。在一些实施例中，目标mRNA序列为包括内含子和外显子的预-信使RNA(经预处理的或预-mRNA)序列，或通常仅包括外显子序列的经加工mRNA序列。在一些实施例中，反义股与目标基因中的目标mRNA序列至少75％互补、至少80％互补、至少90％互补、至少95％互补或100％互补。在具体实施例中，反义股完全或大体上与选自下表2的目标基因的目标mRNA序列互补。同样，在一些实施例中，siRNA分子的有义股完全或大体上与目标基因中的目标mRNA序列一致。在一些实施例中，有义股与目标基因中的目标mRNA序列具有至少75％一致性、至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性。在具体实施例中，反义股完全或基本上与选自下表2 的目标基因的目标mRNA序列一致。
Figure GDA0002116732210000181
Figure GDA0002116732210000191
考虑到目标基因，例如表2中的目标基因，所属领域的技术人员可根据所属领域的多种技术选择或设计siRNA分子的特定多核苷酸序列。作为一个实例，所属领域的技术人员可扫描AA二核苷酸序列并且选择各AA和3'相邻19个核苷酸作为潜在siRNA目标位点。这一选择siRNA目标位点的策略是基于Elbashir等人的观测(《欧洲分子生物学杂志(EMBO J)》20:6877-6888,2001)，其中具有3'悬垂UU二核苷酸的siRNA分子是高效的。接着可选择具体目标序列，例如通过鉴别具有30-50％GC含量的siRNA，和/或通过比较潜在目标位点与适当基因组数据库(人类、小鼠、大鼠等)并且从考虑消除与其它编码序列具有超过16-17个连续碱基对同源性的任何目标序列。还可使用多种软件工具在任何指定基因中产生特定siRNA目标位点。还参看Birmingham等人,《自然实验手册(Nat Protoc.)》2:2068-78,2007；以及美国专利第7,056,704号；第7,078,196 号；第8,101,348号；第8,394,628号；第8,420,391号；第8,445,237号；以及第8,552,171 号，其全部内容以引用的方式并入。
在具体实施例中，目标基因为NOX(NADPH氧化酶)基因，例如NOX1(NADPH 氧化酶1)、NOX2(NADPH氧化酶2；细胞色素b-245重链)和/或NOX4(NADPH氧化酶4)。NOX酶为产生跨膜蛋白的过氧化物。NOX酶在许多细胞类型和组织中表达。然而，增加的迹象表面过度活化NOX酶可能造成CNS相关和其它疾病。因此，特定结合物包含siRNA分子，其中反义股完全或大体上与NOX1序列(参看例如登录号： AJ438989.1；登录号：NM_007052.4；登录号：NM_013955.2；登录号：NM_001271815.1)、 NOX2序列(参看例如登录号：NM_000397.3)和/或NOX4目标序列(参看例如登录号： NM_001143837.1；登录号：NM_001143836.1；登录号：NM_016931.3；登录号： AY288918.1)互补。在具体实施例中，siRNA分子包含5'-A UGU UCA CAAAGU CAG GUC TT-3'(SEQ ID NO:31)和/或5'-GAC CUG ACU UUG UGA ACA UTT-3'(SEQ IDNO:32)或由其组成(参看实例1)。
在具体实施例中，目标为微RNA(miRNA)。miRNA目标的非限制性实例包括 miRNA-132，其抑制预防卵巢和乳癌原位小鼠模型中的血管生成，以及miRNA-21，其抑制导致恶性pre-B-淋巴性肿瘤消退。在一些实施例中，反义股与目标miRNA序列至少75％互补、至少80％互补、至少90％互补、至少95％互补或100％互补。在具体实施例中，反义股完全或大体上与目标miRNA序列互补。同样，在一些实施例中，siRNA 分子的有义股完全或大体上与目标miRNA序列一致。在一些实施例中，有义股具有与目标miRNA序列至少75％一致性、至少80％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性。
在某些实施例中，siRNA分子或siRNA的多核苷酸股中的一个或两个是合成寡核苷酸。
某些实施例采用经修饰的siRNA分子。实例包括在碱基、糖和/或磷酸盐的化学结构中并入具有修饰的核苷酸类似物(参看例如图5)，包括(但不限于)5-位嘧啶修饰、 8-位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰以及5-溴-尿嘧啶的取代；以及2'-位糖修饰，包括(但不限于)糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH置换为例如H、OR、R、卤基、SH、 SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团，其中R为烷基部分。核苷酸类似物还打算包括具有以下的核苷酸：例如肌苷、Q核苷、黄嘌呤的碱基、例如2'-甲基核糖的糖、例如甲基磷酸酯的非天然磷酸二酯键、硫代磷酸酯和肽。
还包括2'-氟、2'-氨基和/或2'-硫基修饰。具体实例包括2'-氟-胞苷、2'-氟-尿苷、2'- 氟-腺苷、2'-氟-鸟苷、2'-氨基-胞苷,2'-氨基-尿苷、2'-氨基-腺苷、2'-氨基-鸟苷、2,6-二氨基嘌呤、4-硫基-尿苷；和/或5-氨基-烯丙基-尿苷。额外示范性修饰包括5-溴-尿苷、5- 碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-氨基嘌呤、2'-氨基-丁酰基-芘-尿苷、5-氟-胞苷以及5-氟-尿苷。本发明的经修饰siRNA内可使用2'-脱氧-核苷酸，但优选包括于siRNA双螺旋体的有义股内。额外经修饰残基在所属领域中已描述且市场有售，包括脱氧-无碱基、肌苷、N3-甲基-尿苷、N6,N6-二甲基-腺苷、假尿苷、嘌呤核苷和利巴韦林(ribavirin)。
经修饰的碱基是指已经通过置换或添加一个或多个原子或基团进行修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤、肌苷和Q核苷。可包含关于碱基部分进行修饰的核苷酸的修饰类型的一些实例包括(但不限于)独立地或组合的烷基化、卤化、硫醇化、氨化、酰胺化或乙酰化碱基。更多特定实例包括例如5- 丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N,-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位置具有修饰的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤基胞苷、5-卤基尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、 7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺苷)、6-氮尿苷、6-氮胞苷、6-氮胸苷、5-甲基-2-硫尿苷、其它硫碱基(例如2-硫尿苷和4-硫尿苷和2-硫胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、Q核苷、古嘌苷、萘基和经取代的萘基、任何O-和N-烷基化的嘌呤和嘧啶，例如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和经改性苯基(例如氨基苯酚或2,4,6- 三甲氧基苯)、用作G-固定核苷酸的经修饰胞嘧啶、8-经取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-经取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸以及烷基羰基烷基化核苷酸。经修饰的核苷酸还包括关于糖部分经修饰的那些核苷酸，以及具有糖的核苷酸或其不为核糖基的类似物。举例来说，糖部分可以是或基于甘露糖、树胶醛醣、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4'-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。
修饰包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脱氮、卤基、羟基、硫醇基或其组合取代。核苷酸可以经具有更高稳定性的类似物取代，例如用脱氧核糖核苷酸置换核糖核苷酸，或具有糖修饰，例如2'氨基、2'O-甲基、2'甲氧基乙基或2'-O,4'-C亚甲基桥置换2'-OH 基团。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物的实例包括黄嘌呤、次黄嘌呤、氮杂嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、7-脱氮-腺苷以及O-和N-修饰的核苷酸。
核苷酸或核苷酸类似物之间的键的修饰也优选，例如磷酸二酯键取代硫代磷酸酯键。核苷酸的磷酸基可以通过用氮或硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基的一个或多个氧来修饰。修饰例如适用于提高功能、改良稳定性或渗透率，或直接定位或靶向。
连接子.如上所述，特定结合物可采用一个或多个连接基团。本文所用的术语“键”、“连接子”、“连接部分”或“L”是指可用于分离p97多肽与试剂(例如siRNA分子的一个股)，或分离第一试剂与另一试剂或标签(荧光标记)(例如其中两种或更多种试剂连接形成p97结合物)的连接子。连接子可以是生理学上稳定的并且可包括可释放连接子(例如不稳定连接子)或酶可降解连接子(例如蛋白水解可裂解连接子)。在某些方面，连接子可以是肽连接子。在一些方面，连接子可以是非肽连接子或非蛋白质连接子。在一些方面，连接子可以是粒子，例如纳米粒子。
连接子可以电中性的或可携带正电荷或负电荷。可逆或不稳定连接子含有可逆或不稳定键。连接子可任选地包括间隔子来增加两个接合的原子之间的距离。间隔子可进一步增加连接子的柔韧性和/或长度。间隔子可包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、芳香基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。
不稳定键为除了能够在断裂或裂解同一分子中的其它共价键的条件下选择性断裂或裂解的到氢原子的共价键以外的共价键。更具体来说，不稳定键为在适当条件下比同一分子中的其它非不稳定共价键更不稳定(热力学)或更快速破裂(动力学)的共价键。分子内不稳定键的裂解可导致形成两个分子。对于所属领域的技术人员，一般根据键裂解的半衰期(t1/2)(一半键裂解所需的时间)论述键的裂解或不稳定性。因此，不稳定键涵盖可比键结分子的其它键更快速选择性裂解的键。
适当条件可通过不稳定键的类型决定并且在有机化学中众所周知。不稳定键可能对 pH、氧化性或还原性条件或试剂、温度、盐浓度、酶(例如酯酶，包括核酸酶和蛋白酶) 的存在，或所添加试剂的存在敏感。举例来说，增加或降低的pH为针对pH不稳定键的适当条件，
在一些实施例中，连接子为经建构以含有烷基、芳香基和/或氨基酸主链，并且含有酰胺、醚、酯、腙、二硫键或其任何组合的有机部分。含有氨基酸、醚和酰胺结合组分的键在生理pH(在血清中通常为7.4)的条件下稳定。如上所述，还包括含有酯或腙并且在血清pH下稳定的键，但其在暴露于溶酶体pH时水解释放siRNA分子。还包括二硫键，至少部分因为其对还原性裂解敏感。另外，氨基酸连接子可以设计成对所要目标器官中或例如溶酶体中的特定酶裂解敏感。示范性连接子描述于Blattler等人(19S5)《生物化学(Biochem.)》24:1517-1524；King等人(1986)《生物化学》25:5774-5779； Srinivasachar和Nevill(1989)《生物化学》28:2501-2509以及别处(也参看图2)中。
在一些实施例中，连接子的长度为约1到约30个原子，或长度为约1、2、3、4、5、 6、7、8、9、0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子，包括中间的全部范围。在某些实施例中，连接子长度为约1到30个原子，碳链原子可以经独立地选自由O、N或S组成的群组的杂原子取代。在一些实施例中，1到4个或5到15个C原子经独立地选自O、N、S的杂原子取代。
在某些实施例中，连接子包含选自以下的结构或由其组成：-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、 C(O)-NH、NH-C(O)-NH、O-C(O)-NH、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、 -CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、 -O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、 -O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、 -CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、 -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、 -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、 -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、 -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-NH-C(O)-CH2-、 -CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、 -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2、-C(O)-NH-CH2-、 -C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-NH-CH2-、 -NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、 -CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、 -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、 -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-，二价环烷基、-N(R6)-，R6为H或选自由以下组成的群组的有机基团：烷基、经取代的烷基、烯基、经取代的烯基、炔基、经取代的炔基、芳香基和经取代的芳香基。
在一些实施例中，连接子包含可释放连接子。在一些实施例中，可释放连接子选自由以下组成的群组：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫酯、硫醇酯、碳酸盐和腙。在某些实施例中，连接子含有当传递到溶酶体环境时发生水解的部分(例如在溶酶体pH下或当与溶酶体酶接触时容易发生水解)。
在一些实施例中，连接子包含稳定连接子。在一些实施例中，稳定键选自由以下组成的群组：丁二酰亚胺、丙酸、羧基甲醇化物键、醚、氨基甲酸酯、酰胺、胺、碳酰二胺、酰亚胺、脂肪族C-C键和硫醚。
在一些实施例中，连接子包含例如聚乙二醇或聚丙二醇的聚合物或由其组成。如本文所用，术语“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”可互换并且打算涵盖任何水溶性聚(氧化乙烯)衍生物。PEG为在许多水溶液和有机溶剂中具有良好溶解度的众所周知的聚合物，其呈现低毒性、缺乏免疫原性并且澄清、无色、无臭和稳定。如本文所述，可使用其它水溶性聚合物获得类似产品，包括(但不限于)；聚乙烯醇、其它聚(氧化烯)(例如聚(丙二醇)等)、聚(乙氧基化多元醇)(例如聚(乙氧基化丙三醇)等)、羧甲基纤维素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧杂环戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/顺丁烯二酸酐和聚氨基酸。所属领域的技术人员将能够基于所要剂量、循环时间、蛋白分解抗性和其它考虑因素选择所要聚合物。
通常，根据本文所述的结合物使用的PEG包含以下结构“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)为约1到4000，约20到1400，或约20-800。在具体实施例中，视是否已置换末端氧而定，PEG还包括“-O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)n-O-”。术语“PEG”包括具有多个末端或“封端”基团的结构。术语“PEG”还包括一种聚合物，这种聚合物含有大部分(也就是说大于50％)的-OCH2CH2-重复子单元。关于特定形式，PEG可采取多种不同分子量，以及例如“分支链”、“直链”、“分叉”、“多官能”PEG分子的结构或几何结构。
使此类聚合物与活性部分结合的代表性聚合试剂和方法描述于Harris,J.M.和Zalipsky,S.编,聚(乙二醇)(Poly(ethylene glycol)),《化学和生物学应用(Chemistryand Biological Applications)》,ACS,华盛顿(Washington),1997；Veronese,F.和J.M.Harris 编,肽和蛋白质聚乙二醇化(Peptide and Protein PEGylation),《先进药物输送评论》, 54(4)；453-609(2002)；Zalipsky,S.等人,《聚乙二醇化学方法：生物技术和生物医学应用(Polyethylene Glycol Chemistry:Biotechnical and BiomedicalApplications)》中的“使用官能化聚(乙二醇)修饰多肽(Use of Functionalized PolyEthylene Glycols)for Modification of Polypeptides)”,J.M.Harris编,普伦纽斯出版社(Plenus Press),纽约(New York) (1992)；Zalipsky(1995)《先进药物评论(AdvancedDrug Reviews)》16:157-182；以及Roberts等人,《先进药物输送评论》,54,459-476(2002)中。
多种PEG衍生物都市场有售并且适用于制备本发明的PEG结合物。举例来说，NOFCorp.'s
Figure GDA0002116732210000241
系列提供许多PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和经活化的PEG 衍生物(例如丁二酰亚胺酯、甲氧基-PEG胺、顺丁烯二酰亚胺和羧酸)，用于通过多种方法偶合到多肽和多核苷酸，并且Nektar治疗性先进聚乙二醇化技术还提供不同PEG 偶合技术来提高疗法的安全性和功效。用于形成p97-siRNA结合物的额外PEG包括获自Polypure(挪威(Norway))、QuantaBioDesign LTD(俄亥俄州(Ohio))JenKem Technology、NanocsCorporation和新日生物技术公司(Sunbio,Inc)(韩国 )的那些。适用于形成结合物的其它PEG试剂和结合方法描述于例如Pasut等人,《治疗术专利专家评论(ExpertOpin.Ther.Patents.)》14(6)859-893,2004。
直链或分支链PEG聚合物和其衍生物或结合物的制备描述于例如美国专利第 4,904,584号；第5,428,128号；第5,621,039号；第5,622,986号；第5,643,575号；第 5,728,560号；第5,730,990号；第5,738,846号；第5,811,076号；第5,824,701号；第 5,840,900号；第5,880,131号；第5,900,402号；第5,902,588号；第5,919,455号；第 5,951,974号；第5,965,119号；第5,965,566号；第5,969,040号；第5,981,709号；第 6,011,042号；第6,042,822号；第6,113,906号；第6,127,355号；第6,132,713号；第 6,177,087号；第6,180,095号；第6,448,369号；第6,495,659号；第6.602,498号；第 6,858,736号；第6,828,401号；第7,026,440号；第7,608,678号；第7,655,747号；第 7,786,221号；第7,872,072号；以及第7,910,661号中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，连接基团为亲水性的，例如以提高结合物在体液中的溶解度。在一些实施例中，p97多肽和siRNA分子通过包含氨基酸或肽、脂质或糖残基的连接子接合。在一些实施例中，p97多肽和siRNA分子接合在以合成方式或通过转译后修饰引入的基团处。
变异体序列.某些实施例包括通过名称或参考序列识别码描述的本文所述的参考多肽和多核苷酸序列的变异体，包括p97序列、IDS序列、连接子序列、信号肽序列、纯化标记和蛋白酶位点(参看例如序列表)。这些多肽的野生型或最盛行序列为所属领域中已知的，并且可用作本文所述的变异体和片段的比较。
在本文使用术语“变异体”序列时是指与本文所披露的参考序列相差一个或多个取代、缺失(例如截短)、添加和/或插入的多肽或多核苷酸序列。特定变异体因此包括本文所述的参考序列的片段。变异体多肽为生物活性的，也就是说其继续具有参考多肽的酶促或结合活性。此类变异体可由例如遗传学多态现象和/或人类操作产生。
在许多情况下，生物活性变异体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”为氨基酸经另一个具有类似特性的氨基酸取代，使得肽化学方法领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质大体上不变。如上文所述，可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中进行修饰并且仍获得编码具有理想特征的变异体或衍生物多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列形成本发明多肽的等效或甚至改良的变异体或部分时，所属领域的技术人员通常将改变编码根据下文表A的DNA序列的一个或多个密码子。
Figure GDA0002116732210000251
Figure GDA0002116732210000261
举例来说，特定氨基酸可取代蛋白质结构中的其它氨基酸而不明显损失与例如抗体的抗原结合区域或底物分子上的结合位点的结构相互结合能力。因为蛋白质的相互作用能力和性质界定蛋白质的生物功能活性，所以可以在蛋白质序列以及当然其潜在DNA 编码序列中进行特定氨基酸序列取代，且仍获得具有类似特性的蛋白质。因此预期所披露组合物的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中进行多种改变而不明显损失其效用。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。所属领域中一般理解亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle,1982，以引用的方式併入本文中)。公认氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的二级结构，这又限定蛋白质与其它分子(例如酶、衬底、受体、DNA、抗体、抗原等)相互作用。各氨基酸已基于其疏水性和电荷特征指定亲水指数(Kyte和Doolittle,1982)。这些值为：异白氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；白氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。所属领域中已知特定氨基酸可以经具有类似亲水指数或评分的其它氨基酸取代并且仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效蛋白质。进行这类改变时，亲水指数在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些尤其优选，并且在±0.5之内的那些甚至更优选。
所属领域中还应理解可以基于亲水性有效进行类似的氨基酸取代。美国专利 4,554,101(以全文引用的方式明确并入本文中)表述由相邻氨基酸的亲水性决定的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学特性相关。如美国专利4,554,101中详细描述，氨基酸残基已经指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0 ±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸 (-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；白氨酸(-1.8)；异白氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应理解，氨基酸可以是经具有类似亲水性值的另一个氨基酸取代并且仍获得生物等效蛋白质，并且尤其免疫等效蛋白质。在这类改变时，亲水性值在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些尤其优选，并且在±0.5之内的那些甚至更尤其优选。
如上文所概述，氨基酸取代一般因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑前述一个或多个特征的示范性取代为所属领域的技术人员众所周知并且包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、白氨酸和异白氨酸。
可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性中的相似性进行进一步氨基酸取代。举例来说，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有类似亲水性值的具有不带电极性头端的氨基酸包括白氨酸、异白氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以代表保守改变的其它氨基酸基团包括：(1)ala、pro、gly、 glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、 phe；(4)lys、arg、his；以及(5)phe、tyr、trp、his。
变异体还可以或替代地含有非保守改变。在一个优选实施例中，与原生或参考序列的不同之处在于取代、缺失或添加少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸或甚至1个氨基酸的变异体多肽。变异体还可以(或替代地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构、酶促活性和/或亲水性影响最小的氨基酸来修饰。
在某些实施例中，DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)p97多肽的变异体可以基于来自其它生物体的p97序列的序列，如下表B中所示。相对于人类序列的变异体氨基酸带下划线。
Figure GDA0002116732210000281
Figure GDA0002116732210000291
Figure GDA0002116732210000301
因此，在某些实施例中，p97肽包含表B中的序列，由表B中的序列组成或基本上由表B中的序列组成。在特定方面，p97肽在DSSHAFTLDELR(SEQ ID NO:14)肽的 C端处保留短α-螺旋(LDEL)。
在某些实施例中，多肽序列的长度为约、至少约或高达约5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、 170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、 320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、 470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、 620、630、640、650、660、670、680、690、700、700、710、720、730、740、750、 760、770、780、790、800、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、 900、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包括中间的全部整数)连续氨基酸并且可包含全部或一部分参考序列(参看例如序列表)。
在某些实施例中，多肽序列由组成约或不超过约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、 60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、 340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、 490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、 640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、 790、800.800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、900、910、920、 930、940、950、960、970、980、990、1000或更多个(包括中间的全部整数)连续氨基酸组成，并且可包含全部或一部分参考序列(参看例如序列表)。
在一些实施例中，多肽序列为约10-1000、10-900、10-800、10-700、10-600、10-500、 10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、10-40、10-30、10-20、20-1000、20-900、20-800、 20-700、20-600、20-500、20-400、20-300、20-200、20-100、20-50、20-40、20-30、50-1000、 50-900、50-800、50-700、50-600、50-500、50-400、50-300、50-200、50-100、100-1000、 100-900、100-800、100-700、100-600、100-500、100-400、100-300、100-200、200-1000、 200-900、200-800、200-700、200-600、200-500、200-400或200-300个(包括中间的全部整数)连续氨基酸，并且包含全部或一部分参考序列。在某些实施例中，任何参考多肽的C端或N端区域可以截短约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、 190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750或800个或更多个氨基酸，或约10-50、20-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、 350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800 个或更多个氨基酸(包括中间的全部整数(例如101、102、103、104、105))、只要截短的多肽保留参考多肽的结合特性和/或活性。通常，生物活性片段具有不低于其来源生物活性参考多肽的约1％、约5％、约10％、约25％或约50％活性。
一般来说，变异体将展现与参考多肽序列至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、 70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似性或序列一致性或序列同源性。另外，涵盖通过添加(例如C端添加、N端添加、它们两个)、缺失、截短、插入或取代(例如保守取代)约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸(包括中间的全部整数和范围)与原生序列或亲本序列不同但仍保留亲本多肽序列或参考多肽序列的特性或活性的序列。
在一些实施例中，变异体多肽与参考序列相差至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在其它实施例中，变异体多肽与参考序列相差至少1％但少于20％、15％、10％或5％残基。(如果这一比较需要比对，那么应该针对最大相似性来比对序列。缺失或插入引起的“退出循环”序列或错配视为不同。)
如下进行序列之间的序列相似性或序列一致性(所述术语在本文中可互换使用)的计算。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的一致性百分比，将所述序列针对最优比较目的比对(例如，可将间隙引入第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中以便最优比对且出于比较目的可以忽略非同源序列)。在某些实施例中，出于比较目的所比对的参考序列长度是参考序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少50％、60％，并且甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。接着对相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在所述位置处相同。
两个序列之间的一致性百分比与所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳比对两个序列需要引入的间隙的数目和每一间隙的长度。
序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法实现。在一个优选实施例中，使用已并入GCG软件包中的GAP程序中的尼德曼和文施(Needleman andWunsch)(《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:444-453,1970)算法，使用Blossum 62 矩阵或PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的间隙权数和1、2、3、4、5 或6的长度权数测定两个氨基酸序列之间的一致性百分比。在另一优选实施例中，两个核苷酸序列之间的一致性百分比使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP 矩阵和40、50、60、70或80的间隙权数以及1、2、3、4、5或6的长度权数计算。尤其优选的参数集(并且除非另外规定，否则应使用的参数集)是Blossum 62计分矩阵，其中间隙罚分为12，间隙扩大罚分为4，并且移码空隙罚分为5。
两个氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用已并入到ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法(Cabios.4:11-17,1989)，使用PAM120加权残基表，12的间隙长度罚分和4的间隙罚分测定。
本文所述的核酸和蛋白质序列可用作“查询序列”来执行公用数据库的检索，例如来鉴别其它家族成员或相关序列。此类检索可以使用Altschul等人,(1990,《分子生物学杂志》,215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，总分＝100，字长＝12，由此获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，总分＝50，字长＝3，由此获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的带间隙比对，可以如Altschul等人(《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402,1997)中所述利用带间隙BLAST。当利用BLAST和带间隙BLAST程序时，可使用各别程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一个如上文所述的实施例中，可以使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对仅由一对序列片段组成，一个序列片段来自所比较序列的每一个。史密斯-沃特曼或塞勒斯算法的改良将发现评分不能通过伸展或微调提高的全部区段对，称为高评分区段对(HSP)。BLAST比对的结果包括指示BLAST评分可能预期来自单独机会的可能性的统计措施。
初始评分S从与各比对序列有关的间隙和取代数目计算，其中越高的相似性评分指示越显著的比对。取代评分由查询表(参看PAM、BLOSUM)给出。
间隙评分通常作为间隙开启罚分G和间隙扩大罚分L的总和计算。对于长度n的间隙，间隙代价将为G+Ln。间隙代价G和L的选择是经验值，但习惯选择高G值(10-15)，例如11，以及低L值(1-2)，例如1。
比特评分S'来自初始比对评分S，其中已考虑所用评分系统的统计特性。比特评分关于评分系统标准化，因此其可用于比较来自不同检索的比对评分。术语“比特评分”和“相似性评分”可互换使用。比特评分给出比对良好程度的指示；评分越高，比对越好。
E值或预期值描述数据库中偶然出现具有类似评分的序列的可能性，这是预期在数据库检索中偶然出现的评分等于S或比S更好的不同比对的数目的预测。E值越小，比对越显著。举例来说，E值为e-117的比对意思是具有类似评分的序列非常不可能仅偶然出现。另外，比对随机氨基酸对的预期评分需要为负，而长比对将倾向于不管比对的区段是否相关都具有高评分。另外，BLAST算法使用适当取代基质、核苷酸或氨基酸并且针对带间隙比对使用间隙形成和扩大罚分。举例来说，多肽序列的BLAST比对和比较通常使用BLOSUM62矩阵进行，间隙存在罚分为11并且间隙扩大罚分为1。
在一个实施例中，序列相似性评分从使用BLOSUM62矩阵、间隙存在罚分11和间隙扩大罚分1的BLAST分析报道。
在特定实施例中，本文提供的序列一致性/相似性评分是指使用GAP版本10 (GCG、Accelrys、San Diego、Calif.)，使用以下参数获得的值：使用GAP权数50和长度权数3，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵的核苷酸序列的一致性％和相似性％；使用 GAP权数8和长度权数2，以及BLOSUM62评分矩阵的氨基酸序列一致性％和相似性％ (Henikoff和Henikoff,《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》.89:10915-10919,1992)。 GAP使用尼德曼和文施算法(分子生物学杂志《J Mol Biol.》48:443-453,1970)发现使匹配数目最大并且使间隙数最少的两个全序列的比对。
在一个特定实施例中，变异体多肽包含可以与参考多肽序列(参看例如序列表)最优地比对以产生至少约50、60、70、80、90、100、100、110、120、130、140、150、 160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、 310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、 460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、 610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、 910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000或更大(包括中间的全部整数和范围)的BLAST比特评分或序列相似性评分的氨基酸序列，其中BLAST比对使用 BLOSUM62矩阵，间隙存在罚分11和间隙扩大罚分1。
如上文所述，参考多肽可以使用不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短、添加和插入。用于此类操控的方法在所属领域中一般已知。举例来说，参考多肽的氨基酸序列变异体可以通过DNA中的突变制备。突变诱发和核苷酸序列改变的方法在所属领域中众所周知。参看例如Kunkel(《美国国家科学院院刊》.82:488-492,1985)；Kunkel 等人,(《酶学方法(Methods in Enzymol)》.154:367-382,1987)；美国专利第4,873,192 号；Watson,J.D.等人,(“《基因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,”第四版,Benjamin/Cummings,加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,Calif.),1987)以及其中引用的参考文献。关于不影响所关注蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导存在于 Dayhoff等人,(1978)蛋白序列和结构图集(Atlas of Protein Sequence and Structure)(《国家生物医学研究基础(Natl.Biomed.Res.Found.)》,华盛顿(Washington,D.C.))的模型中。
通过此类修饰筛选组合文库的基因产物以及筛选具有所选特性的基因产物的cDNA 文库的方法为所属领域中已知的。此类方法可调适用于快速筛选通过参考多肽的组合突变诱发产生的基因文库。作为一个实例，提高文库中功能性突变体频率的技术递归整体突变诱发(REM)可与筛选分析法组合用于鉴别多肽变异体(Arkin和Yourvan,《美国国家科学院院刊》89:7811-7815,1992；Delgrave等人,《蛋白质工程改造(ProteinEngineering.)》6:327-331,1993)。
可检测实体.在一些实施例中，p97结合物可操作地连接到“可检测实体”。示范性可检测实体包括(但不限于)碘类标记、放射性同位素、荧光团/荧光染料和纳米粒子。
示范性碘类标记包括泛影酸(
Figure GDA0002116732210000351
通用电气医疗集团(GE Healthcare))和其阴离子形式泛影酸根。泛影酸为用于高级X射线技术(例如CT扫描)中的中波频率造影剂。还包括下文所述的碘放射性同位素。
可用作可检测实体的示范性放射性同位素包括32P、33P、35S、3H、18F、11C、13N、15O、111In、169Yb、99mTC、55Fe以及碘同位素，例如123I、124I、125I以及131I。这些放射性同位素具有不同半衰期、衰变类型以及可调适以匹配具体方案的需要的能级。这些放射性同位素中的某些可以通过结合到p97结合物选择性靶向或更好的靶向CNS组织，例如改良此类组织的医学成像。
可用作直接可检测实体的荧光团或荧光染料的实例包括荧光素、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、德克萨斯红(Texas Red)、Oregon
Figure GDA0002116732210000352
以及许多其它实体(例如Haugland,《荧光探针手册(Handbook of Fluorescent Probes)》-第9版,2002,Molec.Probes,Inc.,Eugene OR；Haugland,《荧光探针和标记技术指导手册(TheHandbook:A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)》-第10版,2005,加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))。还包括发光或其它可检测染料。染料发射的光可以是可见光或不可见光，例如紫外光或红外光。在示范性实施例中，染料可以是荧光共振能量转移(FRET)染料；二苯并哌喃染料，例如荧光素和若丹明；在α或β位置中具有氨基的染料(例如萘胺染料、1-二甲基氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯以及2-对-甲苯胺基-6-萘磺酸酯)；具有3-苯基-7-异氰酸酯基香豆素的染料；吖啶，例如9-异硫代氰酸酯基吖啶以及吖啶橙；芘、苯并噁二唑以及芪；具有3-(e-羧基戊基)-3'-乙基-5,5'-二甲基氧杂甲花青苷碘(CYA)的染料；6-羧基荧光素 (FAM)；5&6-羧基罗丹明-110(R110)；6-羧基罗丹明-6G(R6G)；N,N,N’,N’-四甲基-6- 羧基罗丹明(TAMRA)；6-羧基-X-若丹明(ROX)；6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE)；ALEXA FLUORTM；Cy2；德克萨斯红和若丹明红；6-羧基-2',4,7,7'-四氯荧光素(TET)；6-羧基-2',4,4',5',7,7'-六氯荧光素(HEX)；5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素(ZOE)； NAN；NED；Cy3；Cy3.5；Cy5；Cy5.5：Cy7；以及Cy7.5；IR800CW、ICG、Alexa Fluor 350；Alexa Fluor488；Alexa Fluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 594； AlexaFluor 647；Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 750。特定实施例包括与化学治疗剂(例如太平洋紫杉醇、阿德力霉素(adriamycin))结合，所述化学治疗剂经例如荧光团(例如Oregon
Figure GDA0002116732210000361
Alexa Fluor 488)的可检测实体标记。
纳米粒子的尺寸通常在约1-1000nm范围内并且包括不同化学结构，例如金和银粒子和量子点。当用倾斜入射白光照射时，约40-120nm范围内的银或金纳米粒子将散射具有高强度的单色光。散射光的波长取决于粒子尺寸。极为接近的四到五个不同粒子将各自散射单色光，所述单色光叠加时将获得特定独特颜色。例如银或金粒子的衍生的纳米粒子可以连接到大量分子，包括蛋白质、抗体、小分子、受体配位体和核酸。纳米粒子的特定实例包括金属纳米粒子和金属纳米壳层，例如金粒子、银粒子、铜粒子、铂粒子、镉粒子、复合粒子、金中空球、金涂布的二氧化硅纳米壳层，以及二氧化硅涂布的金壳层。还包括二氧化硅、乳胶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、PVDF纳米粒子和任何这些材料的彩色粒子。
量子点为可以被大范围波长的光激发的直径约1-5纳米的荧光晶体。当被具有适当波长的光激发时，这些晶体发光，例如单色光，波长取决于其化学组成和尺寸。例如CdSe、ZnSe、InP或InAs的量子点具有独特光学特性；这些和类似量子点获自许多商业来源(例如NN-Labs,Fayetteville,AR；Ocean Nanotech,Fayetteville,AR；NanocoTechnologies,Manchester,UK；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
使用方法和药物组合物
本发明的某些实施例涉及使用本文所述的p97结合物的方法。此类方法的实例包括治疗方法和诊断方法，包括例如使用p97结合物进行特定器官/组织(例如神经系统的器官/组织)的医学成像。一些实施例包括诊断和/或治疗中枢神经系统(CNS)的病症或病况，或具有CNS组分的病症或病况的方法。具体方面包括治疗溶酶体贮积病症(LSD)，包括具有CNS组分的那些的方法。
因此，某些实施例包括治疗有需要的个体的方法，包含投予本文所述的p97结合物。还包括将IDS酶传递到个体的神经系统(例如中枢神经系统组织)的方法，包含投予包含本文所述的p97结合物的组合物。在这些和相关实施例的某些中，所述方法相对于例如通过包含未结合siRNA分子的组合物传递提高所述药剂到中枢神经系统组织的传递速率。
在某些实施例中，个体患有表2中的疾病或病况。在具体实施例中，siRNA分子靶向NOX基因，例如NOX1、NOX2和/或NOX4，且个体患有以下疾病或病况，例如与细胞死亡有关的疾病、慢性肾病、糖尿病或糖尿病并发症，糖尿病性肾病(参看例如Jha 等人,《美国肾脏病学会杂志(J Am Soc Nephrol.)》2014)、神经心血管疾病，例如心肌梗塞诱发的心脏功能不全，或CNS病症(参看例如Nayernia等人,《抗氧化剂和氧化还原信号传导(Antioxidants&Redox Signaling)》,doi:10.1089/ars.2013.5703,2014； Sorce和Krause,《抗氧化剂和氧化还原信号传导》.11:2481-2504,2009。具体实例包括神经退行性疾病，例如其中微神经胶质细胞中的NOX酶活化产生细胞损伤的病理学循环，导致微神经胶质细胞活化提高，这导致进一步细胞损伤等。还包括帕金森氏病，例如其中多巴胺能神经元中的NOX(例如NOX1)表达可造成神经退化。
还包括NOX相关精神疾病的治疗。举例来说，NOX2日益牵涉于精神病性疾病，具体来说氯胺酮诱发的精神病的动物模型中。此处，有迹象表明神经元(并且不专有的限于微神经胶质细胞)中可能存在疾病相关NOX2活性。具体实例包括急性应激障碍；未分型适应障碍；焦虑性适应障碍；抑郁心境的适应障碍；品行异常的适应障碍；伴随焦虑与忧郁情绪的适应障碍；情绪和品行混合的适应障碍；无惊恐发作史的广场恐怖症；神经性厌食症；反社会型人格障碍；身体状况引起的焦虑症；焦虑症，NOS；回避型人格障碍；两极型异常NOS；I型两极型异常，最近抑郁发作，完全缓解；I型两极型异常，最近抑郁发作，部分缓解；I型两极型异常，最近抑郁发作，轻微；I型两极型异常，最近抑郁发作，中等；I型两极型异常，最近抑郁发作，严重且具有精神病特征；I型两极型异常，最近抑郁发作，严重且不具有精神病特征；I型两极型异常，最近抑郁发作，未分型；I型两极型异常，最近躁狂发作，完全缓解；I型两极型异常，最近躁狂发作，部分缓解；I型两极型异常，最近躁狂发作，轻微；I型两极型异常，最近躁狂发作，中等；I型两极型异常，最近躁狂发作，严重且具有精神病特征；I型两极型异常，最近躁狂发作，严重且不具有精神病特征；I型两极型异常，最近躁狂发作，未分型；I型两极型异常，最近混合发作，完全缓解；I型两极型异常，最近混合发作，部分缓解；I型两极型异常，最近混合发作，轻微；I型两极型异常，最近混合发作，中等；I型两极型异常，最近混合发作，严重且具有精神病特征；I型两极型异常，最近混合发作，严重且不具有精神病特征；I型两极型异常，最近混合发作，未分型；I型两极型异常，最近未分型发作；I型两极型异常，最近轻度躁狂发作；I型两极型异常，单次躁狂发作，完全缓解；I型两极型异常，单次躁狂发作，部分缓解；I型两极型异常，单次躁狂发作，轻微；I型两极型异常，单次躁狂发作，中等；I型两极型异常，单次躁狂发作，严重且具有精神病特征；I型两极型异常，单次躁狂发作，严重且不具有精神病特征；I型两极型异常，单次躁狂发作，未分型；II型两极型异常；身体变形障碍；边缘性人格障碍；呼吸相关睡眠障碍；短时精神障碍；神经性暴食症；生理节律睡眠障碍；转换障碍；循环情感障碍；妄想症；依赖型人格障碍；人格解体障碍；抑郁症NOS；分离性失忆症；分离性障碍NOS；分离性神游；分离性身份识别障碍；性交困难；睡眠障碍NOS；与(另一病症)相关的睡眠障碍；心境恶劣障碍；进食障碍NOS；裸露癖；身体状况引起的女性性交困难；身体状况引起的女性机能减退的性欲障碍；女性性高潮障碍；女性性唤起障碍；恋物癖；摩擦癖；青少年或成人性别认定障碍；儿童性别认定障碍；性别认定障碍NOS；广泛性焦虑症；表演型人格障碍；机能减退的性欲障碍；臆想症；冲动控制障碍NOS；与(另一病症)相关的失眠症；间歇性暴发障碍；盗窃癖；重度抑郁症，复发，完全缓解；重度抑郁症，复发，部分缓解；重度抑郁症，复发，轻微；重度抑郁症，复发，中等；重度抑郁症，复发，严重且具有精神病特征；重度抑郁症，复发，严重且不具有精神病特征；重度抑郁症，复发，未分型；重度抑郁症，单次发作，完全缓解；重度抑郁症，单次发作，部分缓解；重度抑郁症，单次发作，轻微；重度抑郁症，单次发作，中等；重度抑郁症，单次发作，严重且具有精神病特征；重度抑郁症，单次发作，严重且不具有精神病特征；重度抑郁症，单次发作，未分型；身体状况引起的男性性交困难；男性勃起障碍；身体状况引起的男性勃起障碍；身体状况引起的男性机能减退的性欲障碍；男性高潮障碍；身体状况引起的情感障碍；自恋型人格障碍；嗜眠发作；梦魇症；强迫症；强迫型人格障碍；身体状况引起的其它女性性功能障碍；身体状况引起的其它男性性功能障碍；与心理因素和身体状况相关的疼痛障碍；与心理特征相关的疼痛障碍；广场恐怖症性惊恐障碍；不伴随广场恐怖症的惊恐障碍；偏执型人格障碍；性欲倒错，NOS；睡眠异常NOS；病理性赌博；恋童癖；人格障碍NOS；创伤后应激障碍；早泄；原发性嗜睡症；原发性失眠；身体状况引起的精神障碍，伴随妄想；身体状况引起的精神障碍，伴随幻想；精神障碍，NOS；纵火癖；分裂情感性障碍；精神分裂样人格障碍；精神分裂症，紧张型；精神分裂症，紊乱型；精神分裂症，偏执型；精神分裂症，后遗症型；精神分裂症，未分化型；类精神分裂症；分裂型人格障碍；性厌恶；性异常NOS；性功能障碍NOS；性受虐症；性虐待狂；共有型精神病；身体状况引起的睡眠障碍，嗜睡型；身体状况引起的睡眠障碍，失眠型；身体状况引起的睡眠障碍，混合型；身体状况引起的睡眠障碍，异常睡眠型；夜惊障碍症；梦游症；社交恐惧症；躯体化障碍；躯体形式障碍NOS；特殊恐惧症
还包括缺血或中风的治疗。有充分证据证明NOX缺乏小鼠受保护免于中风。神经元和微神经胶质细胞NOX都可以起作用。已证实支持NOX2和NOX4的实验证据(参看Radermacher等人,《抗氧化剂和氧化还原信号传导》.18:1418-27,2013；Suzuki等人, 《科学报道(Sci Rep.)》2:896,2012)。还包括CNS损伤的治疗。有迹象表明CNS损伤可导致长效微神经胶质细胞活化和NOX2表达。认为这一机制在CNS损伤后造成神经退化。靶向NOX4的分子还显示改善周围神经损伤(例如脊髓外伤性损伤)之后的神经痛(参看Im等人,《细胞死亡与疾病(Cell Death Dis)》.3:e426,2012)。
特定实施例包括神经退化性病症的治疗，例如神经发炎、特定类型的癌症、多发性硬化症(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、阿兹海默氏病、弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、脊髓性肌萎缩、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、路易体痴呆(Dementia with Lewy bodies)、脊髓性肌萎缩、视神经脊髓炎、重度抑郁症、精神分裂症、青光眼或周围神经病变(糖尿病性或AIDS神经病变)。
还包括中心和周围神经系统疾病的治疗。具体实例包括不存在透明隔、酸性脂肪酶病、酸性麦芽糖酶缺乏症、获得性癫痫失语、急性播散性脑脊髓炎、艾迪氏瞳(Adie'sPupil)、艾迪氏综合症(Adie's Syndrome)、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体发育不良、失认症、艾卡尔迪综合症(Aicardi Syndrome)、艾卡迪-葛帝尔障碍综合症 (Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、AIDS-神经系统并发症、亚历山大病(AlexanderDisease)、阿尔佩斯病(Alpers'Disease)、交替性偏瘫、阿兹海默氏病、肌萎缩性侧索硬化、无脑畸形、动脉瘤、安琪儿综合症(Angelman Syndrome)、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂综合症、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、阿诺德-基亚里畸形 (Arnold-ChiariMalformation)、动静脉畸形(Arteriovenous Malformation)、阿斯伯格综合症(AspergerSyndrome)、共济失调、共济失调毛细血管扩张、共济失调和小脑或脊髓小脑变性、心房颤动和中风、注意力不足过动症(ADHD)、孤独症、自主神经功能障碍、背痛、巴氏综合症(BarthSyndrome)、贝敦氏病(Batten Disease)、贝克尔肌强直 (Becker's Myotonia)、白塞氏病(Behcet's Disease)、贝尔氏麻痹(Bell's Palsy)、良性原发性眼睑痉挛、良性局限性肌萎缩、良性颅高压、伯恩哈特-罗斯综合症(Bernhardt-Roth Syndrome)、宾斯旺格病(Binswanger's Disease)、眼睑痉挛、布洛赫-苏兹贝格综合症 (Bloch-SulzbergerSyndrome)、臂丛神经产伤、臂丛神经损伤、布拉德伯里-埃格尔斯顿综合症(Bradbury-Eggleston Syndrome)、脑和脊髓肿瘤(Brain and Spinal Tumors)、脑动脉瘤、脑梗塞、脑缺血、脑损伤、脊髓半切综合症(Brown-Sequard Syndrome)、延髓肌肉萎缩、CADASIL、卡纳万病(Canavan Disease)、腕管综合症(Carpal Tunnel Syndrome)、灼痛(Causalgia)、海绵状瘤、海绵状血管瘤、海绵状静脉畸形、中央颈脊髓综合症、中央脊髓综合症、中枢性疼痛综合症、中央髓鞘溶解症(Central Pontine Myelinolysis)、头部病症、神经酰胺酶缺乏症、小脑变性、小脑发育不全、脑动脉瘤、脑动脉硬化、大脑萎缩、脑型脚气病、脑海绵状血管畸形、脑巨人症、脑缺氧、脑瘫、脑-眼-面-骨骼综合症(Cerebro-Oculo-Facio-SkeletalSyndrome)、恰克-马利-杜斯氏病 (Charcot-Marie-Tooth Disease)、小脑扁桃体下疝畸形、胆固醇酯沉积病、舞蹈病、舞蹈病棘红细胞增多症、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性立位耐力不良、慢性疼痛、II型科凯恩氏综合症(Cockayne Syndrome TypeII)、科勒二氏综合症(Coffin Lowry Syndrome)、COFS、空洞脑、昏迷、复杂区域疼痛综合症、先天性面部双瘫、先天性肌无力症、先天性肌病、先天性血管海绵状血管瘤、皮质基底节变性、颅动脉炎、颅缝早闭、库贾氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、累积性伤害紊乱、库欣氏综合症 (Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体体病、巨细胞病毒感染(Cytomegalovirus Infection)、眼足舞蹈综合症(Dancing Eyes-Dancing FeetSyndrome)、丹迪-沃克综合症(Dandy-Walker Syndrome)、道森病(Dawson Disease)、德莫舍综合症(De Morsier's Syndrome)、帕金森氏病的深部脑刺激、下臂丛麻痹(Dejerine-Klumpke Palsy)、痴呆、多发性梗塞痴呆、语义性痴呆、皮层下痴呆、路易体痴呆、齿状小脑性共济失调、齿状萎缩、皮肌炎、发展性运动障碍、德维克综合症(Devic's Syndrome)、糖尿病性神经病变、弥漫性硬化 (Diffuse Sclerosis)、德维特综合症(Dravet Syndrome)、自主神经障碍、书写障碍、阅读障碍、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑性协调障碍(Dyssynergia Cerebellaris Myoclonica)、进行性小脑共济失调、肌张力障碍、婴儿早期癫痫性脑病、空蝶鞍综合症、脑炎、流行性脑炎、脑膨出、脑病变、脑病变、具有颅内钙化及慢性脑脊液淋巴细胞增多的家族性婴儿病；克里脑炎(Cree encephalitis)；伪火炬综合症(Pseudo-Torch syndrome)；伪弓形体病综合症、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、癫痫偏瘫、上臂型和下臂丛麻痹、欧勃氏麻痹(Erb's Palsy)、特发性震颤、外髓鞘溶解、法布里病(FabryDisease)、法尔氏综合症(Fahr's Syndrome)、昏厥、家族性植物神经障碍、家族性血管瘤、家族性基底节钙化、家族性周期性麻痹、家族性痉挛性瘫痪、法伯氏病(Farber'sDisease)、高热惊厥、肌纤维发育不良、菲希尔综合症(Fisher Syndrome)、婴儿低肌张力综合症、足下垂、弗里德共济失调(Friedreich's Ataxia)、额颞痴呆、神经节苷脂沉积症、高雪氏病(Gaucher's Disease)、杰斯特曼综合症(Gerstmann's Syndrome)、杰茨曼-斯脱司勒- 史茵克综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、巨轴索神经病变、巨细胞动脉炎、巨细胞性包涵体病、球形细胞样脑白质病变、舌咽神经痛、糖原贮积病、格林-巴利综合症(Guillain-BarréSyndrome)、哈勒沃登-斯帕茨病(Hallervorden-SpatzDisease)、头部受伤、头痛、连续性半侧颅痛、面肌痉挛、交叉性偏瘫、遗传性神经病变、遗传性痉挛性下半身麻痹、遗传性共济失调性多发性神经炎样病、带状疱疹、耳带状疱疹、平山综合症(Hirayama Syndrome)、霍姆斯-阿迪综合症(Holmes-Adie syndrome)、前脑无裂畸形、HTLV-1相关脊髓病、休斯综合症(Hughes Syndrome)、亨廷顿氏病(Huntington'sDisease)、积水性无脑畸形、脑积水、正常颅压脑积水、脊髓积水、皮质醇增多症、嗜睡、张力亢进、张力减退、组织缺氧、免疫介导性脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿期肌张力低下、幼儿神经轴索性营养不良、婴儿植烷酸贮积症、婴儿雷弗素姆病 (Infantile RefsumDisease)、婴儿痉挛症、炎症性肌病、枕骨裂露脑畸形、肠道脂肪代谢障碍、颅内囊肿、颅内压增高、艾萨克斯综合症(Isaac's Syndrome)、茹贝尔综合症(Joubert Syndrome)、卡恩斯-塞尔综合症(Kearns-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏病(Kennedy's Disease)、金斯伯恩综合症(Kinsbourne syndrome)、克莱恩-莱文综合症(Kleine-Levin Syndrome)、克-费综合症(Klippel-Feil Syndrome)、克-特综合症(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克鲁尔-布西综合症(Klüver-Bucy Syndrome)、柯萨可夫遗忘综合症(Korsakoffs AmnesicSyndrome)、克拉伯病(Krabbe Disease)、库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-WelanderDisease)、苦鲁病(Kuru)、兰姆博特-伊顿二氏重症肌无力综合症(Lambert-EatonMyasthenic Syndrome)、兰达-克莱夫纳综合症(Landau-Kleffner Syndrome)、外侧股神经皮支卡压、延髓外侧综合症、学习障碍、利氏病(Leigh's Disease)、林-戈综合症(Lennox-Gastaut Syndrome)、莱-尼综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)、脑白质病变、莱文-克里奇利综合症(Levine-Critchley Syndrome)、路易体痴呆、脂贮积症、类脂蛋白沉积症、无脑回畸形、闭锁综合症、鲁盖瑞氏病(Lou Gehrig's Disease)、狼疮-神经系统后遗症、莱姆病-神经系统并发症(Lyme Disease- Neurological Complications)、马查多-约瑟夫病(Machado-Joseph Disease)、巨脑畸形、巨脑症、梅-罗综合症(Melkersson-RosenthalSyndrome)、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、缅克斯综合症(Menkes Disease)、感觉异常性股痛(Meralgia Paresthetica)、异染性脑白质障碍、小头畸形、偏头痛、米勒-费希尔综合症(Miller Fisher Syndrome)、轻度认知功能障碍、小中风、线粒体肌病、麦比乌斯综合症(Moebius Syndrome)、单肢肌萎缩、运动神经元病、烟雾病、粘多糖症、粘多糖贮积症、多灶性运动神经病变、多发梗塞性痴呆、发性硬化症、多系统萎缩症、伴随起立性低血压的多系统萎缩症、肌肉萎缩症、重症-先天性、重症肌无力、髓鞘破坏弥漫性硬化症、婴儿肌阵挛性脑病变、肌阵挛、肌肉病变、先天性肌肉病变、甲状腺毒素肌病、肌强直、先天性肌强直症、嗜眠发作、神经棘红细胞增多症、伴随脑铁积累的神经变性、经纤维瘤、神经安定药恶性综合症、AIDS的神经系统并发症、莱姆病的神经系统并发症、巨细胞病毒感染的神经影响、庞贝氏病(Pompe Disease)的神经系统表现、狼疮的神经系统后遗症、视神经脊髓炎、神经性肌强直、神经元蜡样脂褐质沉积症、神经元移行障碍、遗传性神经病变、神经系统结节病、神经毒性、海绵形痣、尼曼-皮克病(Niemann-Pick Disease)、正常颅压脑积水、枕神经痛、大田原综合症(Ohtahara Syndrome)、橄榄体桥脑小脑萎缩、斜视性眼阵挛-肌阵挛、起立性低血压、奥沙利文-麦克劳德综合症 (O'Sullivan-McLeod Syndrome)、过度使用综合症、慢性疼痛、泛酸激酶相关神经变性、副肿瘤综合症、感觉异常、帕金森氏病、发作性舞蹈手足徐动症、阵发性半侧颅痛、帕瑞-罗姆伯格氏综合症(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、舒凯尔Ⅰ型综合症(Pena Shokeir II Syndrome)、神经周围囊肿、周期性麻痹、周围神经病变、室周脑白质软化、持续性植物状态、广泛性发育障碍、植烷酸贮积病、匹克氏病(Pick's Disease)、神经受压、梨状肌损伤综合症(PiriformisSyndrome)、垂体肿瘤、多肌炎、庞贝氏病(Pompe Disease)、孔洞脑畸形、带状疱疹后遗神经痛、感染后脑脊髓炎、脊髓灰质炎后综合症、体位性低血压、体位性心动过速综合症、直立性心动过速综合症、原发性生发层萎缩(Primary Dentatum Atrophy)、原发性脊髓侧索硬化(Primary Lateral Sclerosis)、原发性进行性失语(Primary Progressive Aphasia)、朊病毒病(Prion Disease)、进行性面部偏侧萎缩 (Progressive Hemifacial Atrophy)、进行性运动性共济失调、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性灰质萎缩、进行性核上性麻痹、人面失认症、假性脑瘤、I型拉姆齐·亨特综合症(Ramsay Hunt Syndrome I)(曾用名)、II型拉姆齐·亨特综合症(曾用名)、拉斯马森脑炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神经营养不良综合症、雷弗素姆病 (Refsum Disease)、婴儿雷弗素姆病、重复运动障碍、重复性应激损伤、多动腿综合症、逆转录病毒相关性脊髓病、蕾特综合症(RettSyndrome)、雷氏综合症(Reye's Syndrome)、风湿性脑炎、莱利日综合症(Riley-DaySyndrome)、骶神经根囊肿、圣维特斯舞蹈病(Saint Vitus Dance)、唾液腺疾病、山德霍夫氏病(Sandhoff Disease)、谢耳德氏病(Schilder's Disease)、脑裂畸形、赛特贝格病(Seitelberger Disease)、癫痫发作、语义性痴呆、中隔-视神经发育不良、婴儿严重肌阵挛癫痫(SMEI)、摇晃婴儿综合症、带状疱疹、休-德雷格综合症(Shy-Drager Syndrome)、休格连综合症 (
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Syndrome)、睡眠呼吸暂停、昏睡病(Sleeping Sickness)、索托斯综合症 (Sotos Syndrome)、痉挛、脊柱裂、脊髓梗死、脊髓损伤、椎管内肿瘤、脊髓性肌萎缩、脊髓小脑萎缩症、脊髓小脑变性、斯蒂尔-理查德森-欧斯祖斯基综合症 (Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵人综合症、纹状体黑质变性、中风、斯特奇-韦伯综合症(Sturge-Weber Syndrome)、亚急性硬化性全脑炎、皮质下动脉硬化性脑病变、SUNCT头痛、吞咽障碍、西德纳姆舞蹈病(Sydenham Chorea)、昏厥、梅毒性脊髓硬化症、脊髓空洞积水症、脊髓空洞症、全身性红斑狼疮、脊髓痨、迟发性运动障碍、骶管囊肿、泰萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、颞动脉炎、脊髓栓系综合症、汤姆森肌强直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口综合症、甲亢性肌病、三叉神经痛、托德麻痹(Todd's Paralysis)、妥瑞症(TouretteSyndrome)、短暂性脑缺血发作、传染性海绵状脑病变、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性截瘫、特洛亚综合症、结节性硬化症、血管勃起肿瘤、中枢和周围神经系统的血管炎综合症、埃科诺莫病(Von Economo's Disease)、希佩尔·林道综合病(VonHippel-Lindau Disease，VHL)、冯·雷克林霍逊病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦伦贝格综合症、韦德尼希-霍夫曼病(Werdnig-Hoffman Disease)、韦尼克-柯萨可夫综合症(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、韦斯特氏综合症(West Syndrome)、颈部受伤、惠普尔病(Whipple's Disease)、威廉斯综合症(Williams Syndrome)、威尔森氏病(Wilson'sDisease)、沃尔曼病(Wolman's Disease)、X连锁脊髓延髓肌萎缩、齐薇格综合症(Zellweger Syndrome)、视神经炎、慢性疲劳综合症、纤维肌痛、精神疾病，例如情绪障碍、重度抑郁、双极综合症、精神错乱、精神分裂症、强迫综合症、毒品或药物滥用疾病，例如酒精中毒和药物滥用，以及脑病变，例如肝性脑病变。
因此，针对NOX基因(例如NOX1、NOX2、NOX4)且具有改良的CNS组织渗透的p97-siRNA结合物可提供治疗CNS的这些和其它NOX相关疾病或病况的治疗效用。
对于体内用途，例如对于治疗人类疾病、医学成像或测试，本文所述的p97结合物一般在投予之前并入到药物组合物中。药物组合物包含本文所述的p97结合物中的一个或多个以及生理学上可接受的载剂或赋形剂。
为了到药物组合物，有效量或所要量的一种或多种结合物与所属领域的技术人员已知适于具体投予模式的任何药物载剂或赋形剂混合。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可包括例如无菌稀释剂(例如水)、生理食盐水(例如磷酸盐缓冲生理食盐水；PBS)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗微生物剂(例如苯甲醇和对羟苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)以及螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内投予(例如通过IV输注)，那么适合载剂包括生理食盐水或磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)，以及含有增浓和增溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物)的溶液。
纯形式或适当药物组合物形式的本文所述的结合物的投予可以通过起类似效用的试剂的任何可接受投予模式进行。药物组合物可以通过组合含有结合物的组合物与适当生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂制备，并且可以调配成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、散剂、颗粒、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球体以及气雾剂。另外，组合物中可存在但并非必需存在其它药学活性成分(包括如本文别处描述的其它小分子)和/或适合赋形剂(例如盐)、缓冲剂和稳定剂。
可以通过多种不同途径(包括经口、肠胃外、经鼻、静脉内、皮内、皮下或局部) 实现投予。优选投予模式取决于打算治疗或预防的病况的性质。具体实施例包括通过IV 输注投予。
载剂可包括例如药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，其对暴露于所采用剂量和浓度的所述载剂的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载剂通常是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇酯20(TWEENTM)聚乙二醇 (PEG)，和泊洛沙姆(poloxamers)(PLURONICSTM)等。
在某些方面，p97多肽序列和siRNA分子各自独立地结合于或囊封于粒子内或为结合于或囊封于粒子内的预先存在结合物形式，所述粒子例如纳米粒子、珠粒、脂质调配物、脂质粒子或脂质体，例如免疫微脂囊。举例来说，在具体实施例中，p97多肽序列结合于粒子表面，且所关注的siRNA分子结合于粒子表面和/或囊封于粒子内。在这些和相关实施例的一些中，p97多肽和siRNA分子仅通过粒子本身(例如纳米粒子、脂质体)共价或可操作地彼此连接，并且不以任何其它方式彼此共价连接；也就是说，其独立地结合于同一粒子。在其它实施例中，p97多肽和siRNA分子首先如本文所述共价或非共价彼此结合(例如通过连接子分子)，接着结合或囊封于粒子(例如脂质体、纳米粒子)内。在具体实施例中，粒子为脂质体，且组合物包含一个或多个p97多肽、一个或多个所关注的siRNA分子以及脂质混合物以形成脂质体(例如磷脂、具有表面活性剂特性的混合脂质链)。在一些方面，p97多肽和siRNA分子独立地与脂质/脂质体混合物混合，使得形成无需共价结合即可操作地连接p97多肽和siRNA分子的脂质体结构。在其它方面，p97多肽和siRNA分子首先如本文所述共价或非共价彼此结合，接着与脂质混合形成脂质体。p97多肽、siRNA分子或p97结合物可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合(分别例如羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)包埋于所制备的微胶囊、胶体药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或巨乳液中。此类技术披露于《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》,第16版,Oslo,A.编,(1980)中。粒子或脂质体可进一步包含其它治疗剂或诊断剂，例如细胞毒性剂。
确切剂量和治疗持续时间随所治疗的疾病而变化并且可以使用已知测试方案或通过在所属领域中已知的模型系统中测试组合物凭经验测定并且从它推断。还可以进行对照临床试验。剂量还可以随着打算缓解的病况的严重程度变化。药物组合物一般调配和投予以发挥治疗适用作用，同时使不合意副作用降到最低。组合物可以是投予一次，或可以分成许多较小剂量每隔一定间隔投予。对于任何具体个体，特定剂量方案可以根据个别需要随时间调整。
投予这些和相关药物组合物的典型途径因此包括(但不限于)经口、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、经颊、经直肠、经阴道以及鼻内。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。根据本发明的某些实施例的药物组合物调配成允许其中所含有的活性成分在将组合物投予到患者时生物可用。将向个体或患者投予的组合物可以采取一种或多种剂量单元形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单元，并且气雾剂形式的本文所述结合物的容器可以保存多个剂量单元。制备这类剂型的实际方法对所属领域的技术人员已知或显而易知；例如，参看《雷明顿：医药科学和实践(Remington:TheScience and Practice of Pharmacy)》,第20版(费城药学和科学学院(PhiladelphiaCollege of Pharmacy and Science),2000)。打算投予的组合物通常将含有治疗有效量的本文所述的结合物，用于治疗所关注的疾病或病况。
药物组合物可以采取固体或液体形式。在一个实施例中，载剂是颗粒，使得组合物例如呈片剂或散剂形式。载剂可以是液体，同时组合物是例如口服精油、可注射液体或适用于例如吸入投予的气雾剂。当打算经口投予时，药物组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液以及凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式中。
作用用于经口投予的固体组合物，药物组合物可以调配成散剂、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口嚼锭、粉片等。这类固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食载剂。此外，可以存在以下中的一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、淀粉羟基乙酸钠(Primogel)、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或史提若特(Sterotex)；助滑剂，例如胶态二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或柑橘调味剂；以及着色剂。当药物组合物呈胶囊(例如明胶胶囊)形式时，除上述类型的物质以外，其可含有例如聚乙二醇或油的液体载剂。
药物组合物可以呈液体形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于经口投予或用于通过注射传递。当打算用于经口投予时，优选组合物除本发明化合物以外含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及香味增强剂中的一种或多种。在打算通过注射投予的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂以及等张剂中的一种或多种。
液体药物组合物不论是溶液、悬浮液或其它类似形式，都可以包括以下助剂中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液(优选地生理食盐水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等张氯化钠、不挥发性油(例如可以充当溶剂或悬浮介质的合成单或二甘油酯)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调整张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可以将肠胃外制剂封闭于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理食盐水是优选助剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
打算用于肠胃外或经口投予的液体药物组合物应含有一定量的结合物，从而将获得适合剂量。通常，这一量为至少0.01％组合物中的所关注试剂。当打算用于经口投予时，这一量可以在介于0.1与约70％组合物重量之间变化。特定经口药物组合物含有介于约4％和约75％之间的所关注试剂。在某些实施例中，制备根据本发明的药物组合物和制剂使得肠胃外剂量单元在稀释之前含有介于0.01到10重量％之间的所关注试剂。
药物组合物可以打算用于局部投予，在这一情况下，载剂可适合地包含溶液、乳液、软膏或凝胶基质。举例来说，基质可以包含以下中的一种或多种：石蜡脂、羊毛蜡、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(例如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于药物组合物中以用于局部投予。如果打算用于经皮投予，那么组合物可以包括经皮贴片或离子电渗疗(iontophoresis)装置。
药物组合物可以打算以例如栓剂形式用于直肠投予，栓剂将在直肠中熔融并且释放药物。用于直肠投予的组合物可以含有油性基质作为适合无刺激性赋形剂。这类基质包括(但不限于)羊毛脂、可可脂以及聚乙二醇。
药物组合物可包括多种材料，其修改固体或液体剂量单元的物理形式。举例来说，组合物可以包括围绕活性成分形成包覆壳层的材料。形成包覆壳层的材料通常呈惰性，并且可以选自例如糖、虫胶以及其它肠溶包覆剂。或者，活性成分可以封装于明胶胶囊中。固体或液体形式的药物组合物可包括结合于结合物或试剂的试剂并且由此帮助传递化合物。可以起这一作用的适合试剂包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。
药物组合物可以基本上由可以气雾剂形式投予的剂量单元组成。术语气溶胶用于表示在具有胶态性质的那些系统到由加压封装组成的系统范围内的多种系统。传递可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的适合泵系统进行。气雾剂可以单相、双相或三相系统传递，从而传递活性成分。气雾剂的传递包括必需容器、活化剂、阀门、子容器等，其在一起可以形成套组。普通技术人员在不进行过度实验的情况下可以确定优选气雾剂。
本文所述的组合物可以使用保护结合物不从身体快速消除的载剂(例如时间释放调配物或涂层)制备。此类载剂包括控制释放调配物，例如(但不限于)插入物和微囊封传递系统，以及可生物降解生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及普通技术人员已知的其它聚合物。
药物组合物可以通过药物技术中众所周知的方法制备。举例来说，打算通过注射投予的药物组合物可包含盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种，且包含形成溶液的无菌蒸馏水。可以添加表面活性剂来促进形成均质溶液或悬浮液。表面活性剂是与结合物非共价相互作用从而促进结合物在水性传递系统中溶解或均质悬浮的化合物。
组合物可以治疗有效量投予，所述量将视多种因素而变化，包括所采用特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投予模式和时间；分泌速率；药物组合；具体病症或病况的严重程度；以及进行治疗的个体。一般来说，治疗有效日剂量为(对于70kg哺乳动物)约0.001mg/kg (即约0.07mg)到约100mg/kg(即约7.0g)；优选治疗有效剂量为(对于70kg哺乳动物)约0.01mg/kg(即约0.7mg)到约50mg/kg(即约3.5g)；更优选治疗有效剂量为 (对于70kg哺乳动物)约1mg/kg(即约70mg)到约25mg/kg(即约1.75g)。
本文所述的组合物还可以在投予一种或多种如本文所述的其它治疗剂同时投予、在投予它们之前或之后投予。举例来说，在一个实施例中，结合物与消炎剂一起投予。消炎剂或药物包括(但不限于)类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢皮质酮(hydrocortisone acetate)、氢皮质酮(hydrocortisone)、氢皮质酮、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone))；非类固醇消炎药物(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲胺喋呤(methotrexate)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、来氟米特(leflunomide)、抗 TNF药剂、环磷酰胺和霉酚酸酯(mycophenolate)。
此类组合疗法可包括投予含有本发明化合物(即结合物)和一种或多种额外活性剂的单药物剂量调配物，以及投予包含呈自身独立药物剂量调配物的本发明结合物以及各活性剂的组合物。举例来说，本发明化合物和其它活性剂可以一起以单一经口剂量组合物形式(如片剂或胶囊)向患者投予，或每种试剂以单独经口剂量配制品形式投予。类似地，如本文所述的结合物和另一活性剂可在单个肠胃外剂量组合物(例如在生理食盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液)中一起投予患者或各试剂在独立肠胃外剂量调配物中投予。当使用独立剂量调配物时，包含结合物和一种或多种额外活性剂的组合物可以基本上在同一时间(即同时)投予或在交错时间分别(即依序和以任何顺序)投予；组合疗法理解为包括全部这些方案。
本文所述的各种实施例可以组合提供其它实施例。本说明书中提及和/或申请资料表中列出的全部美国专利、美国专利申请公开案、美国专利申请案、外来专利、外来专利申请案和非专利公开案都以全文引用的方式并入本文中。必要时可以修改实施例的各方面以使用不同专利、申请案以及公开案的观点来提供其它实施例。
实例
实例1
p97-siRNA结合物的制备和测试
为了测试p97提高siRNA分子跨越血脑屏障(BBB)传递的能力，p97多肽DSSHAFTLDERYC(SEQ ID NO:29)的C端经连接子部分结合到靶向NOX4基因的 siRNA分子的反义股(5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3')(SEQ ID NO:31)的 3'端。对于检测，siRNA分子的有义股(5'-GAC CUG ACU UUG UGA ACA UTT-3')(SEQ ID NO:32)经连接子结合到Alexa
Figure GDA0002116732210000481
680(AF680)。对于阳性对照，p97结合的反义股和AF680标记的有义股退火形成p97-siRNA结合物(参看图2A)。对于阴性对照，未结合反义股和AF680标记的有义股经退火(参看图2B)。
如下表E1中所示的研究设计中所概述，将测试分子注射到小鼠中。
Figure GDA0002116732210000482
在Balb/c小鼠中静脉内注射(经尾静脉)测试分子，且1小时后，如下处死动物：在安乐死之前，将小鼠注射(i.v.)西红柿凝集素-德克萨斯红(80mg)持续10分钟将脑部血管染色。通过心内输注10ml肝素化生理食盐水(1ml/min)清除血液。切除脑部且在干冰上冷冻，且在-80℃下储存。脑部安置于Tissue Tek中且在-20℃下用低温恒温器分段(25mm，3段/脑部)。将区段(n＝3/脑部)安置于Superfrost Plus显微镜载玻片上，在室温下在冷丙酮/MeOH(1:1)中固定10分钟，接着用PBS洗涤。使用具有 DAPI的Prolong Gold抗荧光衰减试剂(分子探针公司(Molecular probes)，P36931)将玻璃盖玻片安置于区段上。进行3D共焦显微(每个截面捕捉到4个随机场)。图3示出了脑部区段中四个视场的位置。
全部区段的信号都关于PBS对照组校准以观测那些区段中仅最小(而非全部空)AF680荧光信号(参看图4A)。对于siRNAAF680，任何小鼠的脑实质中都未检测到核周 AF680信号(参看图4B)且血管中未观测到AF680信号。对于p97-siRNAAF680，全部小鼠的脑实质中都检测到核周AF680信号(参看图4D)，并且血管中未观测到AF680 信号。图7显示脑部组织中siRNAAF680和p97-siRNAAF680结合物相对于PBS对照的计算体积分数。这些结果显示结合到p97多肽可显著提高siRNA分子到CNS组织(例如脑实质)中的传递。
为了测量NOX4的mRNA含量，向小鼠注射(如上文所述)低剂量的测试分子(10 mg/kg)，且在注射后一小时收集组织样品用于分析。全部RNA从冷冻脑部组织提取(参看
Figure GDA0002116732210000492
试剂和方法)并且使用下表E2中的引物对RNA样品进行实时PCR。
Figure GDA0002116732210000491
对于实时PCR，使用qScript cDMA SuperMix试剂(QuantaBio)使用无规六聚体和寡dT将1μg各RNA样品逆转录成cDNA。接着使用SYBR Green I技术在ABI 7500快速实时PCR系统(美国福斯特市应用生物系统公司(Applied Biosystems,Foster city, USA))上进行实时RT-PCR。各PCR操作的主混合物使用SYBR Green PCR核心试剂(美国福斯特市应用生物系统公司)制备，其含有：1×SYBR Green PCR缓冲剂、3mM MgCl2、1mM dNTP、0.625U Taq聚合酶以及0.25U Amperase UNG。添加10ng cDNA，且特异性有义和反义引物各使用300nM。用于实时PCR的扩增程序如下：50℃2分钟， 95℃10分钟，在95℃持续15秒进行40次循环，随后60℃持续1分钟。全部样品自相同RNA制剂重复三次扩增并且视为平均值。使用线性回归模型的斜率测定各基因和各应力的实时PCR效率。为此，各cDNA样品膨大，接着在50、25、10、5和2ng范围中用作PCR模板。对于各基因，通过测量膨大cDNA的连续稀释液的CT比特定临界值 (Walker，2002)来测定PCR效率。全部PCR反应展现介于84％与96％之间的效率。
数据显示于图8和9A-9C中。图8示出了所测试的七只不同小鼠的RT-PCR结果(一个PBS对照和三个各siRNA测试分子)。相对于GAPDH对照显示NOX4mRNA的含量。
图9A-9C显示使用ΔΔCT方法分析的数据：＝(CT(目标，未经处理)-CT(参考，未经处理))-(CT(目标，处理)-CT(参考，处理))。图9A示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中的NOX4mRNA相对于对照(PBS和未结合的siRNA)显著下调。图 9B示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中内源性NOX4表达相对于未结合的siRNA的降低百分比。图9C示出了用p97-siRNA结合物处理的小鼠的脑部组织中的NOX4表达相对于未结合的siRNA的降低倍数(约1.8倍)。
这些数据显示siRNA(针对NOX4基因)与p97肽的结合能够促进跨越BBB到脑实质中的较高传输。另外，通过RT-PCR定量对NOX4基因特异的mRNA证实使用 p97-siRNA结合物治疗后相对于未结合siRNA较高的NOX4下调。
实例2
p97-siRNA结合物在局部缺血诱发中风小鼠模型中的作用
测试来自实例1的NOX4基因靶向p97-siRNA结合物在大脑中动脉闭塞(MCAO) 小鼠模型中提供神经保护的能力(参看例如Chang等人,《视频实验期刊(J Vis Exp.)》 2761:2011；
Figure GDA0002116732210000501
等人,《细胞和分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)》 69:2327-2343,2012；以及Kleinschnitz等人,《公共科学图书馆·生物学(PLoS Biol.)》 8(9):e1000479,2010)。
C57/Bl6小鼠经静脉内(IV)注射用PBS或30mg/kg单独siRNA或p97-siRNA预处理3次(每次注射之间1小时间隔)。如下所述，在最后一次注射之后约1小时，动物发生MCAO诱发的中风。解剖和分离外部和内部颈动脉(分别ECA和ICA)并且接合颈总动脉(CCA)。将在牙科硅酮中涂布的11cm 8-0尼龙线朝向CCA的分叉插入到 ECA中小孔中。将线轻缓引入到ICA中并且馈入直到仅剩1mm从孔中突出。线通入到威利环(Circle of Willis)中并且堵塞大脑中动脉的开口，使得血液不能通过。线留在原位1小时，接着去除，并且去除CCA上的结扎线使受影响的脑部区域再灌注。再灌注24小时后处死小鼠，并且解剖和去除脑部用于样品分析。
梗塞体积分析.为了测量1小时MCA阻塞之后24小时的局部缺血破坏，从安乐死动物去除脑部，将大脑切成五个2mm厚冠状切片，将其使用2％溴化2,3,5-三苯基四氮盐(TTC)染色。接着将脑部切片切成两半来分离局部缺血半球和对侧半球。将局部缺血和对侧脑部切片转移到含有2％TTC溶液的独立小瓶并且在37℃下继续染色60分钟。在室温下染色10-15分钟之后，使用HP扫描仪获得脑部切片的影像。
当TTC染色完成时，通过比色染色法测量梗塞尺寸。简单来说，使用生理食盐水冲洗组织并且随后暴露于乙醇/二甲亚砜的混合物(1:1)来溶解甲
Figure GDA0002116732210000511
产物。在暗处培育24 小时后，红色溶剂提取物在三个玻璃试管中用新鲜乙醇/二甲亚砜(1:1)溶剂1:20倍稀释，接着转移到比色管中。
在485nm下，在分光光度计中测量吸光度，并且将各值取平均值。使用以下等式将脑部局部缺血侧中的脑部TTC染色的百分比损失与同一动物的脑部对侧比较：
损失％＝100×(1-局部缺血半球吸光度/对侧半球吸光度)
假手术组(无MCAO)的脑部中未观测到梗塞组织，并且PBS和siRNA处理的中风动物(MCAO)相对于假手术组都展现大梗塞区域。然而，如图10中所示，用p97-siRNA 结合物(MTfp-siRNA)处理的动物相对于仅PBS和siRNA组具有显著较小梗塞区域。因此，用靶向NOX4的p97-siRNA结合物预处理通过显著减少脑部的梗塞体积在这一 MCAO诱发中风的小鼠模型中提供神经保护。
神经评定.再灌注之后0和24小时，由对小鼠处理不知情的个体进行行为评定。
如下进行神经缺陷评分：
·正常；
·当通过尾部拾起时伴随或不伴随不恒定卷缩的温和转身行为，<50％尝试向对侧卷缩；
·温和恒定卷缩，>50％尝试向对侧卷缩；
·有力且立即恒定卷缩，小鼠保持卷缩位置持续超过1-2秒，小鼠鼻子几乎达到尾部；
·进展成快速移动的严重卷缩，失去行走或翻正反射；以及
·昏迷或垂死。
如图11中示出，在中风诱发后0.5小时用MTfp-siRNA结合物预处理相对于用PBS或仅siRNA预处理改良动物的神经功能缺损。
NOX4 mRNA表达.在预处理和通过MCAO诱发中风之后，进行实时PCR来分析NOX4的mRNA含量。图12A示出了MTfp-siRNA预处理相对于PBS或仅siRNA导致脑部的中风诱发部分中较低Nox4诱发。Ct(循环临界值；ΔCt＝Ct(nox4,PBS-假处理组)-Ct(B-肌动蛋白,PBS-假处理组)表示荧光信号越过临界值/超过背景水平所需的周期数，并且与样品中的目标核酸的量成反比(即Ct水平越低，样品中的目标核酸量越高)。
图12B示出了MTfp-siRNA预处理相对于PBS或仅siRNA导致中风诱发脑部中Nox4mRNA表达降低。这些结果使用ΔΔCT法(ΔΔCT＝(CT(Nox4,PBS-假处理组)-CT(B- 肌动蛋白,PBS-假处理组))-(CT(Nox4,MTfp-siRNA-中风)-CT(B-肌动蛋白, MTfp-siRNA-中风))分析。
总体来说，p97(MTfp)促进siRNA(靶向NOX4基因)跨越BBB进入脑部传输。另外，用MTfp-siRNA预处理显著减少经MCAO局部缺血诱发中风24小时后的梗塞体积。在诱发中风之前注射MTfp-siRNA的小鼠中，较小梗塞区域与较高神经评分相关。具体来说，在中风诱发之后0.5小时和24小时，用MTfp-siRNA预处理相对于用PBS或仅 siRNA预处理改良小鼠的神经功能缺陷。在中风诱发脑部(左脑)中，MTfp-siRNA预处理还相对于PBS或仅siRNA对照降低mRNA水平的Nox4表达。
因此，这些数据显示siRNA在与p97多肽(例如MTfp)结合之后可以治疗剂量传递到脑部。
序列表
<110> 拜欧斯科技公司
<120> P97多核苷酸结合物
<130> BIOA-010/03WO
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 738
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg Gly Pro Ser Gly Ala Leu Trp Leu Leu Leu Ala Leu Arg Thr
1 5 10 15
Val Leu Gly Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu
20 25 30
Gln His Lys Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile
35 40 45
Gln Pro Ser Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val
50 55 60
Gln Leu Ile Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Ile Tyr Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly
85 90 95
Glu Val Tyr Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val
100 105 110
Val Arg Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys
115 120 125
Ser Cys His Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val
130 135 140
Gly Tyr Leu Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val
145 150 155 160
Leu Lys Ala Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala
165 170 175
Gly Glu Thr Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp
180 185 190
Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr
195 200 205
Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val
210 215 220
Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr
225 230 235 240
Leu Pro Ser Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu
245 250 255
Cys Arg Asp Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His
260 265 270
Leu Ala Arg Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp
275 280 285
Gly Gly Leu Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser
290 295 300
His Glu Gly Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln
305 310 315 320
Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala
325 330 335
Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met
340 345 350
Lys Gly Leu Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp
355 360 365
Cys Val Leu Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val
370 375 380
Ala Phe Arg Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala
385 390 395 400
Lys Ser Pro Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp
405 410 415
Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr
420 425 430
Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser
435 440 445
Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala
450 455 460
Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe
465 470 475 480
Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg
485 490 495
Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu
500 505 510
Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro
515 520 525
Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys
530 535 540
Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe
545 550 555 560
Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr
565 570 575
Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala
580 585 590
Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg
595 600 605
Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro
610 615 620
His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly
625 630 635 640
Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn
645 650 655
Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu
660 665 670
Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr
675 680 685
Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met
690 695 700
Ser Ser Gln Gln Cys Ser Gly Ala Ala Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro
705 710 715 720
Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ala Leu Ala Ala Arg Leu Leu Pro Pro
725 730 735
Ala Leu
<210> 2
<211> 692
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys
1 5 10 15
Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser
20 25 30
Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile
35 40 45
Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr
65 70 75 80
Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg
85 90 95
Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His
100 105 110
Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala
130 135 140
Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly
165 170 175
Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser
180 185 190
Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
195 200 205
Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser
210 215 220
Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp
225 230 235 240
Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg
245 250 255
Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu
260 265 270
Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly
275 280 285
Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu
290 295 300
Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu
325 330 335
Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg
355 360 365
Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro
370 375 380
Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr
385 390 395 400
Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val
405 410 415
Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr
420 425 430
Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu
435 440 445
Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro
450 455 460
Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile
465 470 475 480
Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn
485 490 495
Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu
500 505 510
Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly
515 520 525
Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu
530 535 540
Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe
545 550 555 560
Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg
565 570 575
Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val
580 585 590
Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val
595 600 605
Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp
610 615 620
Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys
625 630 635 640
Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp
645 650 655
Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr Tyr Arg Gly
660 665 670
Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met Ser Ser Gln
675 680 685
Gln Cys Ser Gly
690
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Arg Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gly Asp Ser Ser Gly Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg
1 5 10 15
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Tyr Tyr Asp Tyr Ser Gly Ala Phe Arg
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg
1 5
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu Ile Phe Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys
1 5 10 15
<210> 17
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser
1 5 10 15
Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr Tyr Glu Ala Trp Leu
20 25 30
Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met
35 40
<210> 18
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr Leu Ser Gly Glu
1 5 10 15
Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr Tyr Val Val Ala
35 40 45
Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
50 55 60
Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro Ala Gly Trp Asp
65 70 75 80
Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile Arg Pro Lys Asp
85 90 95
Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn Ala Ser Cys Val
100 105 110
Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu Cys Ala Leu Cys
115 120 125
Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly Asn Ser Gln Glu
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val Glu Asn Ala
145 150 155 160
Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe Asp Asn Thr Asn
165 170 175
Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr
180 185 190
Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala
195 200 205
Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met
210 215 220
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys
1 5 10 15
Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met
20 25 30
<210> 20
<211> 564
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys
1 5 10 15
Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser
20 25 30
Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile
35 40 45
Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr
65 70 75 80
Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg
85 90 95
Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His
100 105 110
Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala
130 135 140
Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly
165 170 175
Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser
180 185 190
Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
195 200 205
Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser
210 215 220
Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp
225 230 235 240
Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg
245 250 255
Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu
260 265 270
Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly
275 280 285
Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu
290 295 300
Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu
325 330 335
Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg
355 360 365
Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro
370 375 380
Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr
385 390 395 400
Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val
405 410 415
Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr
420 425 430
Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu
435 440 445
Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro
450 455 460
Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile
465 470 475 480
Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn
485 490 495
Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu
500 505 510
Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly
515 520 525
Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu
530 535 540
Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe
545 550 555 560
Asp Asn Thr Asn
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Leu Cys Pro Asn
20
<210> 22
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr
20 25 30
Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His
35 40 45
Asn Lys Asn
50
<210> 23
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu
1 5 10 15
Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr
20 25 30
Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met
35 40 45
Ser Ser Gln Gln Cys
50
<210> 24
<211> 586
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys
1 5 10 15
Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser
20 25 30
Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile
35 40 45
Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr
65 70 75 80
Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg
85 90 95
Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His
100 105 110
Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala
130 135 140
Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly
165 170 175
Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser
180 185 190
Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
195 200 205
Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser
210 215 220
Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp
225 230 235 240
Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg
245 250 255
Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu
260 265 270
Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly
275 280 285
Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu
290 295 300
Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu
325 330 335
Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg
355 360 365
Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro
370 375 380
Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr
385 390 395 400
Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val
405 410 415
Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr
420 425 430
Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu
435 440 445
Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro
450 455 460
Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile
465 470 475 480
Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn
485 490 495
Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu
500 505 510
Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly
515 520 525
Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu
530 535 540
Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe
545 550 555 560
Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg
565 570 575
Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn
580 585
<210> 25
<211> 637
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Gly Met Glu Val Arg Trp Cys Ala Thr Ser Asp Pro Glu Gln His Lys
1 5 10 15
Cys Gly Asn Met Ser Glu Ala Phe Arg Glu Ala Gly Ile Gln Pro Ser
20 25 30
Leu Leu Cys Val Arg Gly Thr Ser Ala Asp His Cys Val Gln Leu Ile
35 40 45
Ala Ala Gln Glu Ala Asp Ala Ile Thr Leu Asp Gly Gly Ala Ile Tyr
50 55 60
Glu Ala Gly Lys Glu His Gly Leu Lys Pro Val Val Gly Glu Val Tyr
65 70 75 80
Asp Gln Glu Val Gly Thr Ser Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Arg Arg
85 90 95
Ser Ser His Val Thr Ile Asp Thr Leu Lys Gly Val Lys Ser Cys His
100 105 110
Thr Gly Ile Asn Arg Thr Val Gly Trp Asn Val Pro Val Gly Tyr Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Arg Leu Ser Val Met Gly Cys Asp Val Leu Lys Ala
130 135 140
Val Ser Asp Tyr Phe Gly Gly Ser Cys Val Pro Gly Ala Gly Glu Thr
145 150 155 160
Ser Tyr Ser Glu Ser Leu Cys Arg Leu Cys Arg Gly Asp Ser Ser Gly
165 170 175
Glu Gly Val Cys Asp Lys Ser Pro Leu Glu Arg Tyr Tyr Asp Tyr Ser
180 185 190
Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
195 200 205
Lys His Ser Thr Val Leu Glu Asn Thr Asp Gly Lys Thr Leu Pro Ser
210 215 220
Trp Gly Gln Ala Leu Leu Ser Gln Asp Phe Glu Leu Leu Cys Arg Asp
225 230 235 240
Gly Ser Arg Ala Asp Val Thr Glu Trp Arg Gln Cys His Leu Ala Arg
245 250 255
Val Pro Ala His Ala Val Val Val Arg Ala Asp Thr Asp Gly Gly Leu
260 265 270
Ile Phe Arg Leu Leu Asn Glu Gly Gln Arg Leu Phe Ser His Glu Gly
275 280 285
Ser Ser Phe Gln Met Phe Ser Ser Glu Ala Tyr Gly Gln Lys Asp Leu
290 295 300
Leu Phe Lys Asp Ser Thr Ser Glu Leu Val Pro Ile Ala Thr Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly His Glu Tyr Leu His Ala Met Lys Gly Leu
325 330 335
Leu Cys Asp Pro Asn Arg Leu Pro Pro Tyr Leu Arg Trp Cys Val Leu
340 345 350
Ser Thr Pro Glu Ile Gln Lys Cys Gly Asp Met Ala Val Ala Phe Arg
355 360 365
Arg Gln Arg Leu Lys Pro Glu Ile Gln Cys Val Ser Ala Lys Ser Pro
370 375 380
Gln His Cys Met Glu Arg Ile Gln Ala Glu Gln Val Asp Ala Val Thr
385 390 395 400
Leu Ser Gly Glu Asp Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Thr Tyr Gly Leu Val
405 410 415
Pro Ala Ala Gly Glu His Tyr Ala Pro Glu Asp Ser Ser Asn Ser Tyr
420 425 430
Tyr Val Val Ala Val Val Arg Arg Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu
435 440 445
Asp Glu Leu Arg Gly Lys Arg Ser Cys His Ala Gly Phe Gly Ser Pro
450 455 460
Ala Gly Trp Asp Val Pro Val Gly Ala Leu Ile Gln Arg Gly Phe Ile
465 470 475 480
Arg Pro Lys Asp Cys Asp Val Leu Thr Ala Val Ser Glu Phe Phe Asn
485 490 495
Ala Ser Cys Val Pro Val Asn Asn Pro Lys Asn Tyr Pro Ser Ser Leu
500 505 510
Cys Ala Leu Cys Val Gly Asp Glu Gln Gly Arg Asn Lys Cys Val Gly
515 520 525
Asn Ser Gln Glu Arg Tyr Tyr Gly Tyr Arg Gly Ala Phe Arg Cys Leu
530 535 540
Val Glu Asn Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Arg His Thr Thr Val Phe
545 550 555 560
Asp Asn Thr Asn Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg
565 570 575
Ser Glu Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val
580 585 590
Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val
595 600 605
Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp
610 615 620
Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn
625 630 635
<210> 26
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro
35 40 45
Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp
50 55 60
Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn
65 70
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Gly His Asn Ser Glu Pro Trp Ala Ala Glu Leu Arg Ser Glu Asp Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Leu Cys Pro Asn Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala
20 25 30
Ala Cys Asn Leu Ala Gln Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro
35 40 45
Asp Thr Asn Ile Phe Thr Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp
50 55 60
Leu Phe Gly Asp Asp His Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser
65 70 75 80
Ser Asn Tyr His Gly Gln Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg
85 90 95
Ala Val Pro Val Gly Glu Lys Thr Thr Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu
100 105 110
Asp Tyr Val Ala Ala Leu Glu Gly Met Ser Ser Gln Gln Cys
115 120 125
<210> 28
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Gly Ala Arg Ala Glu Val Ser Gln Phe Ala Ala Cys Asn Leu Ala Gln
1 5 10 15
Ile Pro Pro His Ala Val Met Val Arg Pro Asp Thr Asn Ile Phe Thr
20 25 30
Val Tyr Gly Leu Leu Asp Lys Ala Gln Asp Leu Phe Gly Asp Asp His
35 40 45
Asn Lys Asn Gly Phe Lys Met Phe Asp Ser Ser Asn Tyr His Gly Gln
50 55 60
Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ala Thr Val Arg Ala Val Pro Val Gly Glu
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Arg Gly Trp Leu Gly Leu Asp Tyr Val Ala Ala Leu
85 90 95
Glu Gly Met Ser Ser Gln Gln Cys
100
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的p97蛋白质片段
<400> 29
Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Tyr Cys
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经修饰的p97蛋白质片段
<400> 30
Asp Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg Cys
1 5 10
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义NOX4多核苷酸（siRNA）
<400> 31
auguucacaa agucagguct t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反义NOX4多核苷酸（siRNA）
<400> 32
gaccugacuu ugugaacaut t 21
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 沙漠跳鼠
<400> 33
Asp Ser Ser Asp Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 小耳大婴猴
<400> 34
Asp Ser Ser His Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 十三线的地松鼠
<400> 35
Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 白犀牛
<400> 36
Asn Ser Ser His Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 南美羊驼
<400> 37
Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 美国鼠兔
<400> 38
Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Pro Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 中国树鼩
<400> 39
Asp Ser Thr His Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 40
Asp Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 虎鲸
<400> 41
Asn Ser Ser Asn Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 绒毛丝鼠
<400> 42
Asp Ser Ser Ser Ala Phe Thr Leu Asn Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> 九带犰狳
<400> 43
Asp Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Trp
1 5 10
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 太平洋海象
<400> 44
Asn Ser Ser Ser Ala Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 欧洲杯梗孢
<400> 45
Ala Thr Ser His Ala Ile Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 非洲象
<400> 46
Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Met Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 中国仓鼠
<400> 47
Asp Arg Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 48
Asp Ser Ala Tyr Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 12
<212> PRT
<213> 八齿鼠
<400> 49
Asp Ser Ser Ser Ala Phe Asn Leu Asn Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 50
<211> 12
<212> PRT
<213> 家犬
<400> 50
Asn Ser Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 51
<211> 12
<212> PRT
<213> 灰短尾负鼠
<400> 51
Asn Ser Ser Tyr Ser Phe Thr Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 52
<211> 12
<212> PRT
<213> 马
<400> 52
Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Thr Val Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 星鼻鼹
<400> 53
Asn Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Leu Asp Glu Leu Arg
1 5 10
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Ser Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys
1 5 10
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
aactttggca ttgtggaagg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
acacattggg ggtaggaaca 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
gcctttattg tgcggagaga 20
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cttgacttga tggaggcagt ag 22

Claims (7)

1.一种p97结合物，其中所述结合物包含(a)分离的p97多肽，其中所述p97多肽是由DSSHAFTLDELRYC(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列组成，其中所述p97多肽共价连接至第一多核苷酸，所述p97多肽和所述第一多核苷酸中间有任选的连接子(L)，和(b)第二多核苷酸，所述第二多核苷酸与所述第一多核苷酸杂交，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分别是5'-A UGU UCA CAA AGU CAG GUC TT-3'(SEQ ID NO:31)和5'-GAC CUG ACU UUG UGAACA UTT-3'(SEQ ID NO:32)。
2.根据权利要求1所述的p97结合物，其中所述第一多核苷酸为反义股且所述第二多核苷酸为有义股。
3.根据权利要求1所述的p97结合物，其中所述第二多核苷酸为反义股且所述第一多核苷酸为有义股。
4.根据权利要求1所述的p97结合物，其中间包含连接子(L)。
5.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和根据前述权利要求中任一项所述的p97结合物，其中所述药物组合物无菌且无热原。
6.权利要求1所述的p97结合物在制备用于治疗有需要的个体的疾病的药物中的用途，其中所述疾病为中风、缺血、CNS损伤或神经痛。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物通过静脉内输注或皮下注射投予。
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