BRPI0714380A2 - composiÇÕes anticocaÍna e tratamento - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES ANTICOCAÍNA E TRATAMENTO. Modalidade da invenção aqui reveladas geralmente relacionam-se a terapêuticos anticocaína. Especificamente, algumas modalidades da invenção relacionam-se a esterases de cocaína (COcE) mutante altamente eficientes, termoestáveis, e de longa duração que podem proteger contra os efeitos tóxicos e de reforço da cocaína em indivíduos. São aqui fornecidos polipetídeos de COcE mutante que apresentam atividade de esterase termoestável. São também fornecidos métodos de tratamanto de condições induzidas por cocaína em um indivíduo em necessidade por meio da administração de CocE mutante bem como métodos para rastreamento de alto rendimento de polipetídeos de esterase candidatos.

Description

COMPOSIÇÕES ANTICOCAÍNA E TRATAMENTO Referência cruzada a pedidos relacionados

Esse pedido reivindica prioridade de pedido provisório U.S. no. 60/819.569, depositado em 10 de julho de 2006, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência.

Declaração relacionada à pesquisa ou desenvolvimento com patrocínio federal

Essa invenção foi feita em parte com o apoio do Governo dos Estados Unidos sob "NIDA Grant No. DA021416" . O Governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção. Incorporação por referência de material submetido em um compact disc

A Listagem de Seqüência, que é uma parte da atual invenção, inclui forma de leitura em computador e uma listagem de seqüência escrita que compreende seqüências de nucleotídeos e/ou aminoácidos da presente invenção. a informação de listagem de seqüência registrada em forma de leitura em computador é idêntica à listagem de seqüência escrita. O assunto da Listagem de Seqüência é aqui incorporado em sua totalidade por referência. Campo da invenção

A invenção aqui revelada relaciona-se de modo geral a terapêutica anticocaina. Fundamento

A dependência de cocaína é um problema social e médico

intratável que é resistente à cura através de farmacoterapia. Cocaína age bloqueando a captação de monoaminas, dopamina, norepinefrina, e serotina assim prolongando e intensificando os efeitos desses 3 0 neurotransmissores no sistema nervoso central (Benowitz NL (1993) Pharraacol Toxicol 72, 3-12) . A toxicidade de cocaína é marcada por convulsões e disfunção cardíaca (por exemplo, infarto do miocárdio, arritmias cardíacas, pressão arterial elevada, AVC, ou aneurisma dissecante, e demanda aumentada de oxigênio pelo miocárdio), devido a efeitos sobre os sistemas neurotransmissores e bloqueio do canal de sódio miocárdico (Bauman JL e DiDomenico RJ (2002) J Cardiovasc Pharmacol Ther 7, 195-202; Wilson LD and Shelat C (2003) J Toxicol Clin Toxicol 41, 777-788; Knuepfer MM (2003) Pharmacol Ther 97, 181-222). Devido à capacidde da cocaína de cruzar facilmente a barreira hematencefálica e seus efeitos disseminados sobre os sistemas nervosos central e periférico, overdose pode resultar em morte súbita (veja, Bauman JL e DiDomenico RJ (2002) J Cardiovasc Pharmacol Ther 7, 195-202, para revisão).

Embora o mecanismo de ação da cocaína seja bem compreendido, essa informação ainda não resultou no desenvolvimento de um antagonista eficaz de cocaína que possa ser usado em situações de dependência de overdose. Os efeitos rápidos e pleiotrópicos da cocaína apresentam um problema complexo para o tratamento de toxicidade aguda por cocaína (Carroll FI, Howell LL and Kuhar M.J (1999) J Med Chem 42, 2721-2736) . Os dois tipos de terapias que são disponíveis para o tratamento de dependência de opióide, antagonismo (por exemplo, naltrexona) e substituição (por exemplo, metadona) , não têm paralelos no caso de cocaína, embora tenham sido consideradas tentativas no último (por exemplo, J. Grabowski e cols. (2004) Addictive Behaviors 29, 143 9-14 64) . Uma abordagem é evitar ou reduzir que a cocaína atinja locais de ação por administração de esterases endógenas, anticorpos específicos para cocaína, ou um anticorpo a catalítico.

Cocaína de ocorrência natural é hidrolisada no éster de benzoila por butirilcolinesterase sérica (BChE) um éster metiIico de ecgonina não tóxico e ácido benzóico. No fígado, carboxilesterase hCE-2 hidrolisa o éster metílico para gerar benzoilecgonina e metanol (veja, por exemplo, Figura 1) . A meia-vida de eliminação da cocaína no sangue varia de 0,5 a 1,5 hr (T. Inaba (1989) Canadian Journal of Physiology & Pharmacology 67, 1154-1157). Tem havido algumas tentativas de usar BChE de ocorrência natural ou BChE geneticamente construída para aumentar a quebra de cocaína (veja, por exemplo, Carmona e cols. (2000) Drug Metabolism & Disposition 28, 367-371; Xie e cols. (1999) Molecular Pharmacology 55, 83-91; Sun e cols. (2002a) Molecular Pharmacology; Sun e cols. (2002b) Pharmacology & Experimental Terapêuticos 302, 710-716; Duysen e cols. (2002) Journal of Pharmacology & Experimental Terapêuticos 302, 751-758; Gao Y and Brimijoin S (2004) Journal of Pharmacology & Experimental Terapêuticos 310, 1046-1052; Gao e cols. (2005) Molecular Pharmacology 67, 204-211) . Outros pesquisadores utilizaram um anticorpo monoclonal, Mab 15A10, como um anticorpo catalítico para cocaína (veja, por exemplo, Landry e cols., 1993; Mets e cols., 1998 ; Baird e cols., 2000; Larsen e cols., 2004), enquanto outros exploram o uso de vacinas de cocaína (veja, por exemplo, Kosten e cols. (2002) Vaccine 20, 1196-1204).

Tabela 1: Cinética de várias enzimas de hidrólise de cocaína contra (-) cocaína.

Enzima Kcat Km (μΜ) Eficiência Referência (min-1) (kcat/Km) BChE 4,1 4,5 9,1 x IO8 Sun e cols., 2002a Ala328W/Y332A 154 18 8,5 χ IO8 Sun e cols., 2002a Mabl5A10 2,2 220 1 χ IO4 Larsen e cols., 2004 AME 359 620 20 3,1 x IO7 Gao e cols., 2005 CocE 468 0, 64 7,2 χ IO8 Turner e cols., 2002

Uma bactéria, Rhodococcus sp. MB 1, nativa do solo que

circunda a planta de coca, desenvolveu a capacidade de utilizar cocaína como sua única fonte de carbono e nitrogênio. A bactéria expressa uma esterase da cocaína (CocE) que age de modo similar a BChE para hidrolisar o éster de benzoila da cocaína, gerando éster metílico de ecgonina e ácido benzóico (veja, por exemplo, Figura 1) (Bresler e cols. (2000) Appl Environ Microbiol 66, 904-908; Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307; Larsen e cols. (2002) Nature Struct Biol 9, 17-21). 0 gene para CocE foi isolado e clonado (Bresler e cols. (2000) Appl Environ Microbiol 66, 904-908) , e a estrutura de cristal de CocE foi determinada (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307; Larsen e cols. (2002) Nature Struct Biol 9, 17-21). A estrutura de CocE (veja, por exemplo, Figura 2) revela uma clássica dobra de serina esterase em adição a dois outros domínios que se combinam para formar um bolso de ligação de cocaína. A alteração de qualquer um desses três aminoácidos (Asp, His, ou Ser) na tríade catalítica no sítio ativo (para revisão, vejaDodson G and Wlodawer A (1998) Trends Biochem Sci 23, 347-352) inativa a atividade da esterase contra a cocaína. Além disso, mutação de resíduos que fazem contato com a porção benzoato da cocaína (por exemplo, Tyr44) também rompe a hidrólise da cocaína, presumivelmente através do dano à estabilização de oxiânion no estado de transição (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 1229712307; Larsen e cols. (2002) Nature Structural Biology 9, 17-21). A enzima purificada (MW ~65kDa) catalisa a cocaína de modo muito eficaz com cinética de Michaelis- Menten kcal = 7,2 s"1 e Km = 640 nM (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307; Larsen e cols. (2002) Nature Structural Biology 9, 17-21), quase três ordens de magnitude maior que as esterases endógenas e, mais provavelmente, podem agira rapidamente o suficiente para desintoxicar humanos que sofreram overdose de cocaína (Landry e cols. (1993) Science 259, 1899-1901; Mets e cols. (1998) National Academy of Sciences of the United States of America 95, 10176-10181). Adicionalmente, a esterase também metaboliza cocaetileno, um potente metabólito de cocaína e álcool, de forma quase tão eficiente como ela metaboliza a cocaína (kcal = 9,4 s"1 e Km = 1.600 nM) (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307; Larsen e cols. (2002) Nature Structural Biology 9, 17-21). Portanto, seria desejável fornecer uma CocE estável

para terapêutica anticocaína. Sumário da invenção

Conseqüentemente, os presentes inventores tiveram êxito na descoberta de mutantes de esterase de cocaína altamente eficientes, termoestáveis, e de longa duração que podem proteger contra os efeitos tóxicos da cocaína em indivíduos.

Um aspecto da invenção fornece polipeptídeos de esterase de cocaína mutante isolada (CocE) da seqüência de aminoácidos de CocE de tipo selvagem (por exemplo, Id. de Seq. N° : 1) mas com pelo menos um resíduo de aminoácido substituído. Os polipeptídeos de CocE mutante têm atividade de esterase com termoestabilidade aumentada a 370C quando comparados à CocE de tipo selvagem.

Várias modalidades incluem polipeptídeos de CocE

mutante com pelo menos duas, três, quatro, cinco ou mais substituições da seqüência de aminoácidos de CocE de tipo selvagem. Exemplos de polipeptídeos de CocE mutante dentro do escopo da invenção incluem aqueles com uma seqüência de

aminoácidos de Id. de Seq. N0 : 3 (L163V); Id. de Seq . N0 7 (V225I); Id . de Seq. N0 8 (I218L); Id . de Seq. N0 : 9 (A310D); Id de Seq. N° : 10 (A149S); Id de Seq. N0 : 11 (S159A); Id de Seq. N0 : 12 (S265A); Id de Seq. N0 : 13 (S56G); Id. de Seq. N0 : 14 (W220A); Id. de Seq. N0 : 16 (S140A); Id de Seq. N0 : 17 (F189L); Id de Seq. N0 : 18 (A193D); Id de Seq. N0 : 19 (T254R); Id de Seq. N0 : 20 (N42V); Id. de Seq. N° : 21 (V262L); Id. de Seq. N0 : 22 (L508G); Id de Seq. N0 : 23 (Y152H); Id de Seq. N0 : 24 (V160A); Id de Seq. N0 : 25 (T172R); Id de Seq. N° : 26 (Y532F); Id de Seq. N0 : 27 (T74S); Id. de Seq. N0 : 28 (W285T); Id de Seq. N0 : 29 (L146P); Id de Seq. N0 : 30 (D533S); Id de Seq. N0 : 31 (A194R); Id de Seq. N0 : 32 (G173Q); Id de Seq. N0 : 33 (C477T); Id de Seq. N0 : 34 (K531A); Id de Seq. N° : 35 (R41I); Id. de Seq. N0 : 36 (L119A); Id de Seq. N0 : 37 (K4 6A); Id. de Seq. N0 : 38 (F84Υ) , , T172R-G173Q (Id. de Seq. Ν°: 39); L169K (Id. de Seq. N°: 40); F189A (Id. de Seq. N°: 41), N197K (Id. de Seq. N°: 42), R182K (Id. de Seq. N°: 43), F189K (SEQ ID NO: 44), V190K (Id. de Seq. N°: 45), Q191K (Id. de Seq. N°: 46), and A194K (Id. de Seq. N°: 47), ou um fragmento funcional desses. Polipeptídeos de exemplo adicionais de CocE mutante incluem, F189A/T172R, T172R/A193D,

T172R/Gl73Q-1175-G-GAl86 , T172R/G173Q-T176-G-G-D185, e outros. Devido às convenções de nomeação e seqüências de polipeptídeos aqui reveladas, uma pessoa habilitada na técnica pode determinar as seqüências de polipeptídeos para os polipeptídeos de CocE mutante acima nomeados.

Um outro aspecto da invenção fornece composições farmacêuticas que incluem entre outros componentes um polipeptídeo de CocE mutante dentro do escopo da invenção e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Um outro aspecto da invenção fornece ácidos nucleicos isolados que codificam o polipeptídeo de CocE mutante aqui descrito. Em várias modalidades, os ácidos nucleicos incluem aqueles com seqüências que hibridizam ao ácido nucleico que codifica CocE de tipo selvagem (por exemplo, Id. de Seq. N°: 2), ou o complemento a ela, sob condições altamente controladas. Tal ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo de CoeE mutante que tem atividade de esterase com termoestabilidade aumentada a 37°C quando comparado a CocE de tipo selvagem. Várias modalidades da seqüência de ácidos nucleicos isolados têm pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência com a seqüência de ácidos nucleicos de CocE de tipo selvagem (por exemplo, Id. de Seq. N°: 2). Por exemplo, a seqüência de ácidos nucleicos •isolados tcrr. pelo menos cerca de 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% de identidade de seqüência de CocE de tipo selvagem (por exemplo, Id. de Seq. N0: 2).

Em várias modalidades, polipeptídeos de CocE mutante

(ou polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos dentro do escopo da invenção) têm temperaturas de fusão aumentadas quando comparados a CocE de tipo selvagem. Em várias modalidades, polipeptídeos de CocE mutante (ou polipeptídeos codificados por ácidos nucleicos dentro do escopo da invenção) aumentam a termoestabilidade de polipeptídeo de CocE mutante sobre CocE de tipo selvagem em pelo menos cerca de 2,0 kcal/mol. Por exemplo, a termoestabilidade aumentada pode ser pelo menos cerca de 2,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,2 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,4 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,5 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,6 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,7 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,8 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,9 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,0 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,2 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,4 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,5 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,6 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,7 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,8 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,9 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,0 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,2 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,4 kcal/mol, or pelo menos cerca de 4,5 kcal/mol. Em várias modalidades, os polipeptídeos de CocE mutante (ou polipepcídeos codificados por ácidos nucleicos dentro do escopo da invenção) têm imunogenicidade reduzida quando comparados a CocE de tipo selvagem.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis têm menos atividade de esterase que CocE de tipo selvagem. Por exemplo, mutantes de CocE termoestáveis podem ter cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, or cerca de 99% da atividade de esterase de CocE de tipo selvagem. Em outras modalidades, os polipeptídeos de CocE mutante têm aproximadamente a mesma eficiência catalítica ou maior de Polipeptídeos de CocE de tipo selvagem. Por exemplo, mutantes de CocE termoestáveis podem ter cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, ou mais da atividade de esterase de CocE de tipo selvagem.

Em várias modalidades, os polipeptídeos de CocE 2 0 mutante são peguilados. Em várias modalidades, o polipeptídeo de CocE mutante é encapsulado em uma hemácea. Por exemplo, um polipeptídeo de CocE mutante(s) peguilado (ou uma composição farmacêutica que inclui um polipeptídeo de CocE mutante peguilado) pode ser encapsulado em uma 2 5 hemácea.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de CocE mutante são estabilizados por um substrato, produto, e/ou inibidor.

Um outro aspecto da invenção fornece métodos de tratamento de condição induzida por cocaína. Em tais métodos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de CocE mutante(s) (ou uma composição farmacêutica que inclui um polipeptídeo de CocE mutante(s)) dentro do escopo da invenção é administrada a um indivíduo que dela necessita. Em várias modalidades, a condição induzida por cocaína inclui overdose de cocaína, toxicidade de cocaína, vício de cocaína, dependência de cocaína, e/ou alguma combinação desses.

Ainda um outro aspecto da invenção fornece um método de rastreamento de alto rendimento para identificação de polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis. Em tal método de rastreamento, uma célula é estavelmente transformada com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de CocE mutante candidato. 0 polipeptídeo de CocE mutante é expresso na célula. 0 polipeptídeo de CocE mutante expresso é isolado ou revelado. A atividade de esterase do polipeptídeo de CocE mutante isolado é medida em um ou mais temperaturas para determinar a termoestabilidade dos polipeptídeos de CocE mutante isolados. Tais temperaturas podem ser de cerca de 30°C a cerca de 50°C. Polipeptídeo de CocE mutante com atividade de esterase nas temperaturas predeterminadas são selecionados.

Em algumas modalidades do método de rastreamento, a medição da atividade de esterase dos polipeptídeos mutantes isolados pode ser realizada por contato do polipeptídeo de CocE mutante isolado com (i) cocaína e um indicador de pH ou (ii) um tio-derivado de cocaína e um indicador de tiol. Qualquer mudança no indicador de pH ou no indicador de tiol é então detectada. Tal mudança é correlacionada com a 3 0 formação de ácido benzóico a partir da hidrólise de cocaína ou derivado de cocaína pelo polipeptídeo de CocE mutante.

Algumas modalidades do método de rastreamento também incluem a condução de vários ciclos do procedimento de rastreamento em temperaturas aumentadas para medir a atividade de esterase. Por exemplo, o primeiro ciclo pode empregar uma temperatura para medição da atividade de esterase de cerca de 30°C enquanto um ciclo subseqüente pode empregar uma temperatura para medição da atividade de esterase de cerca de 45°C. Em algumas modalidades do método de rastreamento, a

expressão de polipeptídeo de CocE mutante ocorre em uma temperatura em que CocE de tipo selvagem substancialmente retém a atividade catalítica. Em outras modalidades do método de rastreamento, a expressão de polipeptídeo de CocE mutante ocorre em uma temperatura em que o polipeptídeo de CocE de tipo selvagem substancialmente se divide em corpos de inclusão. Por exemplo, a temperatura de expressão pode ser pelo menos cerca de 35°C, pelo menos cerca de 36°C, pelo menos cerca de 37°C, pelo menos cerca de 38°C, pelo menos cerca de 39°C, ou pelo menos cerca de 40°C.

Outros assuntos e características serão em parte aparentes e em parte apontadas a seguir. Breve descrição dos desenhos

Aqueles habilitados na técnica compreenderão que os desenhos, descritos abaixo, são para pbjetivos ilustrativos apenas. Os desenhos não devem limitar o escopo dos presentes ensinamentos de modo algum.

Figura 1 é um diagrama que ilustra o metabolismo de cocaína por várias reações enzimáticas. 3 0 Figura 2 é um diagrama em fita que ilustra a estrutura de CocE. Domínio 1 (DOMl) , domínio 2 (D0M2), e domínio 3 (DOM 3) são indicados, junto com o sítio ativo localizado na interseção dos três domínios. Uma molécula de ácido benzóico é mostrda no sítio ativo.

A Figura 3 é um gráfico em linha que mostra o perfil

de eluição para CocE por FPLC (Q-Sepharose) , em que a absorvência de UV e concentração de cloreto de sódio é mostrada sobre o tempo. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 1.

A Figura 4 é um gráfico em linha e de dispersão que

mostra a degradação in vitro da cocaína na presença de CocE em plasma humano. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 2.

A Figura 5 é um gráfico de cinética de enzima de

Michaelis-Menten para CocE de tipo selvagem, a CocE mutante T172R (Id. de Seq. N°: 26), e a a CocE mutante S159A (Id. de Seq. N°: 11) para reações realizadas a 30°C e 37°C. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 4.

A Figura 6 é um conjunto de fotografias da coloração

2 0 de proteína total após separação por PAGE de CocE de tipo selvagem e mutante T172R com o uso de condições de desnaturação (SDS+(3Me) ou não desnaturação (Nativa) após incubação a 3 7 0C por vários pontos de tempo. Para mais informação veja o Exemplo 4.

2 5 A Figura 7 é um gráfico em linha que mostra as

temperaturas de fusão determinadas por dicroísmo circular de CocE de tipo selvagem e T172R. 0 espectro completo um é mostrado em A, o espectro próximo do UV é mostrado em B, e a temperatura de fusão estimada para cada mutante é

3 0 mostrada em C. Para mais informação veja o Exemplo 4. A Figura 8 contém (A) um desenho da hidrólise do derivado benzoiltioéster da cocaína (tio-1) e a des- carbometoxi cocaína (tio-2) seguido por reação dos tióis liberados (R-SH) com reagente de Ellman; e (B) um gráfico em linha que mostra a reação colorimétrica de células de controle BL21 e células BL21 que contêm CocE incubado com o derivado de benzoiltioéster (tio-1) e reagentwe de Ellman. Para mais informação veja o Exemplo 15.

A Figura 9 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra o efeito de 1,0 mg CocE (círculos fechados) ou PBS (veículo, círculos abertos) em letalidade induzida por cocaína quando administrada um minuto após doses crescentes de cocaína (n = 6-7) . Os dados apresentados são expressos como percentual e seu erro padrão. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 5.

A Figura 10 é um gráfico em barras que mostra o efeito de doses crescentes de CocE (CE) ou BChE humana (BChE) , ou PBS, sobre a letalidade induzida por cocaína quando administrada um minuto antes de 180 mg/kg cocaína (n = 6- 2 0 7) . Os dados apresentados são expressos como percentual e sua média de erro padrão. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 5.

A Figura 11 é um gráfico em barras que mostra o efeito de mutantes de CocE S117A e Y44F, ou CocE tratada com PMSF em convulsões e letalidade induzidas por cocaína quando administrados 1 minuto antes de 180 mg/kg cocaína (n = 5- 6). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 5.

A Figura 12 é um gráfico em barras que mostra o efeito de 1,0 mg CocE ou PBS administrados um minuto após 560 mg/kg WIN-35065-2, a LDlOO determinada do composto (n = 6- 8). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 5.

A Figura 13 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra inativação dependente de tempo de CocE (12 5 ng/ml) in vitro. A deterioração exponencial ti/2 foi calculada como 13.2. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 6.

A Figura 14 é um gráfico em barras que mostra efeitos protetores dependentes de tempo de 1 mg CocE quando administrada em vários momentos antes e depois de 100 mg/kg cocaína (n = 6-8) . Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 6.

A Figura 15 é um gráfico em barras que mostra as concentrações de cocaína em plasma humano tratado com 0, 8 μΜ de esterase de cocaína ou veículo de esterase em zero e um minuto após a administração da esterase. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 6.

A Figura 16 é uma série de gráficos em linha e de dispersão que mostra o efeito de 0,32 mg de CocE (círculos fechados), 0,32 mg de CocE mutante T172R (triângulos fechados), ou PBS (veículo, círculos abertos) sobre a letalidade induzida por cocaína quando administrada um minuto após doses crescentes de cocaína (painel esquerdo) e

2 5 minutos até a morte após administração de cocaína (painel

direito). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 7.

Figura 17 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra o efeito de 0,32 mg/kg de CocE (círculos fechados)

3 0 ou CocE mutante T172R (triângulos fechados) sobre a letalidade induzida por cocaína quando administrada em 1, 10, 30, and 60 minutos antes da administração de 320 mg/kg cocaína (n=6). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 7.

Figura 18 é uma série de gráficos em linha e de

dispersão que mostra o efeito de 1 mg de hBChE (triângulo fechado), 0,32 mg CocE (círculo fechado), ou 1 mg de CocE (quadrado fechado) sobre a letalidade induzida por cocaína. Figura 18A mostra a letalidade como uma função da concentração de cocaína. Figura 18B mostra os minutos até a morte após a administração de cocaína como uma função da concentração de cocaína. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 8.

A Figura 19 é um traço do espectro de massa MALDI-TOF de CocE peguilada. A diferença de massa entre os picos corresponde a -5.500 Da; equivalente ao peso molecular de uma única cadeia de PEG. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 11.

A Figura 2 0 é uma imagem de SEM de hemáceas fixadas 2 0 por gluteraldeído. A Figura 2 OA é RBC normal sem tratamento. A Figura 2OB é hemácea de ruptura osmótica/re- selagem carregada com L-ASNase. A Figura 20C é RBC carregado com LMWPASNase. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 12.

2 5 A Figura 21 é um gráfico de dispersão que mostra a

atividade percentual de Asperaginase no sangue como uma função do tempo (dias) para RBC/LMP-ASNase ou hemácea fantasma /ASNase. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 12.

3 0 Figura 22 é um gráfico em linha que mostra a sobrevivência de camundongos DBA/2 que portam células de Iinfoma L5178Y. A enzima ou solução salina foram administradas no dia 5, em cujo tempo os sintomas estavam presentes. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 12.

A Figura 23 é um gráfico em linha e de dispersão que demonstra os efeitos protetores de CocE e seus mutantes contra a toxicidade induzida por cocaína. A Figura mostra a percentagem de camundongos que exibe letalidade induzida por cocaína como uma função da concentração de cocaína injetada em camundongos administrados com CocE de tipo selvagem (0,3 mg), T172R (0,3 mg), T172R-G173Q (0,3 mg), ou L169K (1 mg) . CocE ou mutantes (mg) foi administrado por via intravenosa 1 minuto antes da administração de cocaína (mg/kg, i.p.). Diferentes símbolos representam curvas dose- resposta de letalidade induzida por cocaína na ausência ou presença de CocE ou mutantes. Cada ponto de dado representa a percentagem de camundongos (n=8 para cada condição de dosagem) que exibem letalidade induzida por cocaína. A Figura 24 é uma série de gráficos em linha e de

dispersão que demonstram a duração de tempo dos efeitos protetores de CocE contra a toxicidade de cocaína. CocE ou mutantes (0,1, 0,3, e 1 mg, i.v.) foram administrados em diferentes pontos de tempo antes da administração de cocaína i.p. 180 mg/kg. Figura 24A mostra a percentagem de camundongos que exibem letalidade induzida por cocaína como uma função do tempo de administração de CocE de tipo selvagem (0,1 mg), T172R (0,1 mg), L169K (0,1 mg), ou T172R-G173Q (0,1 mg) antes da administração de cocaína i.p. 3 0 18 0 mg/kg. Figura 24B mostra a percentagem de camundongos que exibem letalidade induzida por cocaína como uma função do tempo de administração de CocE de tipo selvagem (0,3 mg), T172R (0,3 mg), L169K (0,3 mg), ou T172R-G173Q (0,1 mg) antes da administração de cocaína i.p. 18 0 mg/kg. Figura 24C mostra a percentagem de camundongos que exibem letalidade induzida por cocaína como uma função do tempo de administração de CocE de tipo selvagem (1 mg) , T172R (1 mg), L169K (1 mg), ou T172R-G173Q (1 mg) antes da administração de cocaína i.p. 18 0 mg/kg. Cada ponto de dado representa a percentagem de camundongos (n=8 para cada condição de dosagem) que exibem letalidade induzida por cocaína.

A Figura 25 é um gráfico em linha e de dispersão que demonstra a duração estimada de proteção para 50% letalidade: a Figura mostra a duração estimada (horas) de proteção (50% letalidade) de mutantes de CocE em camundongos como uma função da dosagem (mg, i.v.) de T172R- G173Q, L169K, T172R, e CocE de tipo selvagem. 0 tempo necessário para atingir 50% letalidade foi determinado a partir da Figura 24.

A Figura 26 é uma série de gráficos em linha e de dispersão que demonstram efeitos protetores de CocE, T172R- G173Q, e suas formas peguiladas contra toxicidade induzida por cocaína. Cada enzima (0,3 mg) foi administrada por via intravenosa 1 min antes da administração de cocaína (mg/kg, i.p.). Diferentes símbolos representam curvas dose-resposta de letalidade induzida por cocaína na ausência ou presença da enzima. Cada ponto de dado representa a percentagem de camundongos (n=8 para cada condição de dosagem) que exibem letalidade induzida por cocaína. A Figura 26A mostra a percentagem de ocorrência de letalidade como uma função da dosagem de cocaína (mg/kg, i.p.) para Veículo/PBS, CocE de tipo selvagem (0,3 mg), e PEG-CocE de tipo selvagem (0,3 mg) . A Figura 26B mostra a percentagem de ocorrência de letalidade como uma função da dosagem de cocaína (mg/kg, i.p.) para Veículo/PBS, T172R-G173Q (0,3 mg), e PEG-T172R- G173Q (0,3 mg).

A Figura 27 é uma série de gráficos em linha e de dispersão que mostra a estabilidade térmica de esterase de

cocaína e de mutantes: (A) CocE de tipo selvagem, (B) T172R, (C) T272R/G173Q e L169K. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 17.

A Figura 28 È UM série de cromatogramas que mostra enzimas pré-incubadas a 37°C por 0 minuto ou 60 minutos e

resolvidas por cromatografia de exclusão por tamanho (A) CocE de tipo selvagem, (B) T172R, (C) T172R/G173Q. Os padrões de peso molecular, BSA (66Kda) e AD (150Kda) são incluído em A. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 18.

2 0 Figura 29 é uma série de espectros de CD smoothed de

CocE de tipo selvagem e de quatro mutantes que mostra fusão dependente de temperatura observada entre 2 00 e 25 0 nm. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 19 .

A Figura 30 é uma série de espectros para CocE de tipo

selvagem e quatro mutantes desconvolutos para 3 curvas por meio do algoritmo CCA que sugere que a fusão de CocE é pelo menos um processo de duas etapas que se move da curva original (curva 1) para uma etapa de desdobra intermediária

3 0 (curva 2) a uma proteína totalmente desnaturada (curva 3) . Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 19 .

Figura 31 é uma série de gráficos em linha e de dispersão que mostra a contribuição percentual de cada uma das temperaturas na descrição das 3 curvas CCA desconvolutas mostradas na Figura 30. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 19.

A Figura 32 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra as temperaturas de fusão e formação para (1) as fusões de espectro inicial, (2) a formação e fusão do estado intermediário, e (3) o acúmulo da proteína totalmente fundida. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 19.

A Figura 33 é um retrato de um gel que mostra que a Cocaína (faixa de mM) evitou a formação induzida a 370C de agregados de CocE de alto peso molecular (0,lmg/ml de concentrações de enzima). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 20.

A Figura 34 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra que a Cocaína (quantidades em uM) estabilizou a perda de atividade induzida a 37°C. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 20.

Figura 35 é um retrato de um gel que mostra que Ácido benzóico (faixa de mM) evitou a formação induzida a 37°C de 2 5 agregados de CocE de alto peso molecular (0,lmg/ml de concentrações de enzima). Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 20.

A Figura 3 6 é um gráfico em linha e de dispersão que mostra que a Cocaína (quantidades em uM) estabilizou a perda de atividade induzida a 37°C. Para informação adicional de metodologia, veja o Exemplo 20. Descrição detalhada da invenção

São reveladas modalidades da invenção em que são fornecidas composições e métodos para uma abordagem de degradação catalítica para terapêutica anticocaína. A tecnologia aqui descrita é baseada em parte na descoberta de mutantes de esterase de cocaína altamente eficientes, termoestáveis, e de longa duração que podem proteger contra os efeitos tóxicos e de reforço da cocaína em indivíduos. Tais mutantes fornecem opções de tratamento para condições induzidas por cocaína como overdose de cocaína e dependência de cocaína. Polipeptídeos de CocE mutante

A despeito da potência de CocE de tipo selvagem (veja, por exemplo, Id. de Seq. N°: 1, N0 de acesso AF173165) na metabolização de cocaína (veja, por exemplo, Exemplo 2; Exemplo 4; Exemplo 5), a aplicação de CocE de tipo selvagem como um agente terapêutico no tratamento de overdose de cocaína pode ser limitada por causa sua baixa estabilidade térmica na temperatura fisiológica (se por exemplo, Exemplo 4; Exemplo 6). A Termo-instabilidade contribui para a meia- vida plasmática curta de CocE de tipo selvagem. Uma deterioração significativa (>50%) da atividade de CocE foi observada após incubação da enzima em plasma a 3 7°C, ou após sua administração intravenosa em um camundongo. 0 tx/2 de CocE a 370C é de aproximadamente 15 minutos enquanto a 4 0C o 11/2 é maior que 6 meses. Estudos preliminares em ratos demonstraram um duração relativamente curta do efeito anticocaína de um pouco mais que 3 0 minutos para CocE. 3 0 Um aspecto da invenção fornece, portanto, polipeptídeos de CocE mutante purificados que exibem estabilidade térmica e meia-vida plasmática aumentadas quando comparados a CocE de tipo selvagem. Os polipeptídeos de CocE mutante da invenção têm valor clínico significativo por causa de sua capacidade de hidrolisar de modo eficaz a cocaína, embora também exiba termoestabilidade e/ou meia- vida plasmática aumentada.

A invenção fornece polipeptídeos de CocE mutante em que pelo menos um resíduo de aminoácido da CocE de tipo selvagem é substituído, em que a CocE mutante tem termoestabilidade aumentada embora retenha eficiência catalítica relativamente alta. Em algumas modalidades, polipeptídeos de CocE mutante mantêm substancialmente a atividade de esterase funcional de polipeptídeo de CocE de tipo selvagem (ou seja, hidrólise de cocaína). Polipeptídeos de CocE mutante têm uma seqüência de peptídeos que difere de um polipeptídeo de CocE nativo em um ou mais aminoácidos. A seqüência de peptídeos de tais mutantes pode apresentar uma substituição, deleção, ou adição de um ou mais aminoácidos de um polipeptídeo de CocE nativo. Inserções de aminoácido são preferivelmente de cerca dei, 2, 3, e4a5 aminoácidos contíguos, e deleções são preferivelmente de cerca dei, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, e 9 a 10 aminoácidos contíguos. Em várias modalidades, o polipeptídeo de CocE mutante pode conter pelo menos uma, duas, três, quatro, ou mais substituições de aminoácido, deleções, ou adições, em que o polipeptídeo de CocE mutante resultante tem termoestabilidade aumentada.

0 termo aminoácido, como aqui usado, deve incluir 3 0 aminoácidos de ocorrência natural bem como aminoácidos de ocorrência não natural, incluindo análogos e derivados de aminoácidos. 0 último inclui moléculas que contêm uma porção de aminoácido. Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que referência nessa a um aminoácido inclui, por exemplo, L-aminoácidos proteogênicos de ocorrência natural; D-aminoácidos; aminoácidos quimicamente

modificados como análogos e derivados de aminoácido; aminoácidos não proteogênicos de ocorrência natural, e compostos quimicamente sintetizados que têm propriedades conhecidas na técnica como sendo características de aminoácidos. Para todos as seqüências de aminoácidos aqui reveladas, entende-se que nucleotídeos e aminoácidos equivalentes podem ser substituídos nas seqüências sem afetar a função das seqüências. Tal substituição está dentro da capacidade de uma pessoa de habilidade comum na técnica.

A invenção também fornece polipeptídeos de CocE mutante purificados com as seguintes substituições: L163V (Id. de Seq. N°: 3); V121D (Id. de Seq. N°: 4); S167A (Id. de Seq. N° : 5); Q123E (Id. de Seq. N° : 6); V225I (Id. de Seq. N°: 7); I218L (Id. de Seq. N°: 8); A310D (Id. de Seq. N°: 9); A149S (Id. de Seq. N°: 10); S159A (Id. de Seq. N°: 11); S265A (Id. de Seq. N°: 12); S56G (Id. de Seq. N°: 13); W220A (Id. de Seq. N°: 14); T122A (Id. de Seq. N°: 15); S140A (Id. de Seq. N°: 16); F189L (Id. de Seq. N°: 17); A193D (Id. de Seq. N°: 18); T254R (Id. de Seq. N°: 19); N42V (Id. de Seq. N°: 20); V262L (SEQ ID. NO: 21); L508G (Id. de Seq. N°: 22); Y152H (Id. de Seq. N°: 23); V160A (Id. de Seq. N°: 24); T172R (Id. de Seq. N°: 25); Y532F (Id. de Seq. N°: 26); T74S (Id. de Seq. N°: 27); W285T(Id. de Seq. N°: 28); L146P (Id. de Seq. N°: 29); D533S (Id. de Seq. N° : 30); A194R (Id. de Seq. N°: 31); G173Q (Id. de Seq. N°: 32); C477T (Id. de Seq. N°: 33); K531A (Id. de Seq. N°: 34); R41I (Id. de Seq. N° : 35); L119A (Id. de Seq.

N°: 36); K46A (Id. de Seq. N°: 37); F84Y(Id. de Seq. N°: 38), T172R-G173Q (Id. de Seq. N°: 39 ); L169K (Id. de Seq. N°: 40); F189A (Id. de Seq. N°: 41), N197K (Id. de Seq. N° : 42), R182K (Id. de Seq. N°: 43), F189K (Id. de Seq. N° : 44), V190K (Id. de Seq. N°: 45), Q191K (Id. de Seq. N°: 46), and A194K (Id. de Seq. N° : 47). Por exemplo, o polipeptídeo de CocE mutante T172R (Id. de Seq. N°: 25) tem termoestabilidade aumentada, Vmax e Km aumentadas a 37°C, temperatura de fusão aumentada (Tm) , meia-vida plasmática aumentada, maior redução na letalidade devido à toxicidade de cocaína, e efeitos anticocaína de maior duração, quando comparados a CocE de tipo selvagem (veja, por exemplo, Exemplo 4, Exemplo 7) .

0 aumento resultante na termoestabilidade do polipeptídeo de CocE mutante é pelo menos cerca de 2 kcal/mol. A termoestabilidade de um dado polipeptídeo pode ser avaliada por vários métodos conhecidos na prática, incluindo, por exemplo, dicroísmo circular (CD) espectroscopia ou calorimetria de rastreamento diferencial. Por exemplo, o aumento resultante na termoestabilidade pode ser pelo menos de cerca de 2,1, pelo menos cerca de 2,2, pelo menos cerca de 2,3, pelo menos cerca de 2,4, pelo menos cerca de 2,5, pelo menos cerca de 2,6, pelo menos cerca de 2,7, pelo menos cerca de 2,8, pelo menos cerca de 2,9, pelo menos cerca de 3,0, pelo menos cerca de 3,1, pelo 3 0 menos cerca de 3,2, pelo menos cerca de 3,3, pelo menos cerca de 3,4, pelo menos cerca de 3,5, pelo menos cerca de 3,6, pelo menos cerca de 3,7, pelo menos cerca de 3,8, pelo menos cerca de 3,9, pelo menos cerca de 4,0, pelo menos cerca de 4,1, pelo menos cerca de 4,2, pelo menos cerca de 4,3, pelo menos cerca de 4,4, ou pelo menos cerca de 4,5 kcal/mol. Aumentos ainda maiores na termoestabilidade são contemplados. Acredita-se que diminuindo a energia em cerca de 2,1 a cerca de 4,5 kcal/mol pode-se estender o tempo de meia-vida da proteína em cerca de 30 a cerca de 1.000 vezes mais em temperatura ambiente.

Geralmente, os polipeptídeos de CocE mutante têm atividade de esterase com termoestabilidade aumentada quando comparados a CocE de tipo selvagem. Em algumas modalidades, is polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis podem ter menos atividade de esterase que CocE de tipo selvagem. Por exemplo, mutantes de CocE termoestáveis podem ter cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99% da atividade de esterase de CocE de tipo selvagem. Em outras modalidades, os polipeptídeos de CocE mutante têm aproximadamente a mesma, eficiência catalítica ou maior de polipeptídeos de CocE de tipo selvagem. Por exemplo, mutantes de CocE termoestáveis podem ter cerca de 100%, cerca de 110%, cerca de 120%, cerca de 130%, cerca de 140%, cerca de 150%, ou mais da atividade de esterase de CocE de tipo selvagem.

Variantes dos polipeptídeos de CocE mutante como fragmentos, análogos, e derivados também fazem parte da 3 0 invenção. fragmentos de polipeptídeo de CocE que correspondem a um ou mais motivos e/ou domínios particulares ou a tamanhos arbitrários, por exemplo, pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.150 e 1.200 aminoácidos de comprimento estão dentro do escopo da invenção aqui revelada. Porções peptidil isoladas de polipeptídeos de CocE podem ser obtidas por rastreamento de peptídeos recombinantemente produzidos a partir do fragmento correspondente do ácido nucleico que codifica tais peptídeos. Em adição, os fragmentos podem ser quimicamente sintetizados com o uso de técnicas conhecidas na prática como química convencional de f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield. Por exemplo, um polipeptídeo de CocE como aqui descrito pode ser arbitrariamente dividido em fragmentos de comprimento desejado sem sobreposição dos fragmentos, ou preferivelmente divididos em ed fragmentos sobrepostos de um comprimento desejado. 2 0 Um outro aspecto da invenção aqui revelada refere-se a

formas recombinantes do polipeptídeo de CocE. Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico isolado da invenção incluem aqueles polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos de CocE acima descritos. Em outras 2 5 modalidades, os polipeptídeos recombinantes da invenção aqui revelados são codificados por um ácido nucleico que tem pelo menos 85% de identidade de seqüência (por exemplo, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99%) com a seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°: 2, em que o polipeptídeo de CocE recombinante expresso retém substancialmente a mesma eficiência catalítica ou maior de polipeptídeo de CocE de tipo selvagem e tem termoestabilidade aumentada quando comparado a CocE de tipo selvagem.

Ácidos nucleicos que hibridizam sob condições de alto

rigor a ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°: 2 ou os complementos de Id. de Seq. N0 : 2 também podem ser usados na invenção. Por exemplo, tais ácidos nucleicos que hibridizam a Id. de Seq. N°: 2 ou o complemento de Id. de Seq. N°: 2 sob condições de baixo rigor, condições de rigor moderado, ou condições altamente controladas e também codificam um polipeptídeo de CocE mutante que têm atividade de esterase com termoestabilidade aumentada quando comparados a CocE de tipo selvagem, estão dentro da invenção. Ácidos nucleicos preferidos são aqueles que têm uma seqüência de nucleotídeos que é o complemento de toda ou de uma porção de Id. de Seq. N°: 2. Outras variantes do gene de CocE nativo dentro da invenção são polinucleotídeos que partilham pelo menos 65% (por exemplo, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99%) de identidade de seqüência a Id. de Seq. N° : 2 ou ao complemento de Id. de Seq. N°: 2. Ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas ou partilham pelo menos 65% de identidade de seqüência com Id. de Seq. N°: 2 ou o complemento de Id. de Seq. N°: 2 podem ser obtidos por técnicas conhecidas na prática como por mutações no gene de CocE nativa, ou por isolação de um organismo que expressa tal ácido nucleico (por exemplo, uma variante alélica). Moléculas de ácido nucleico que codificam proteínas de fusão de CocE mutante também estão dentro da invenção. Tais ácidos nucleicos podem ser feitos por preparação de uma construção (por exemplo, um vetor de expressão) que expressa proteínas de fusão de CocE mutante quando introduzidos em um hospedeiro adequado. Por exemplo, tal construção pode ser feita por ligação de um primeiro polinucleotídeo que codifica proteína de CocE mutante fundida em estrutura com um segundo polinucleotídeo que codifica uma outra proteína de modo que a expressão da construção em um sistema de expressão adequado gera uma proteína de fusão.

As moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser modificadas em uma porção de base, porção de açúcar, ou na estrutura de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, hibridização e outros. Moléculas de ácido nucleico utilizadas nas modalidades da invenção aqui reveladas podem estar na forma de RNA ou na forma de DNA (por exemplo, cDNA, DNA genômico, e DNA sintético) . O DNA pode ser de filamento duplo ou de filamento único e se de filamento único pode ser o filamento de codificação (senso) ou o filamento de não codificação (anti-senso). A seqüência codificadora que codifica um polipeptídeo de CocE mutante pode ser idêntica à seqüência de nucleotídeos 2 5 reivindicada, ou ela pode também ser uma seqüência codificadora diferente que, como um resultado da redundância ou degeneração do código genético, codifica o mesmo polipeptídeo como os polinucleotídeos de Id de Seq. N0 s: 3-37. Desenho de CocE mutante

As mutações de teermoestabilização de CocE podem ser desenhadas para aumentar a estabilidade termodinâmica de um polipeptídeo através da diminuição de AG (desdobrado—> dobrado) ou taxa diminuída de desdobra através do aumento da energia livre de ativação do processo de desdobra. O AG (desdobrado—> dobrado) é a diferença de energia livre entre o estado desdobrado e dobrado. Para um polipeptídeo termodinamicamente estável, AG (desdobrado—> dobrado) deve ser um valor negativo. Geralmente, quanto menor o valor de AG (desdobrado—» dobrado), mais estável o estado dobrado. A energia livre de ativação do processo de desdobra é a diferença de energia livre entre o estado desdobrado e o estado de transição de desdobra (Steipe, 1999). Polipeptídeos de CocE mutante com termoestabilidade

aumentada podem ser desenahdos e gerados por vários métodos conhecidos na técnica que incluem, por exemplo, desenho racional, evolução direcionada (por exemplo, mutagênese aleatória, mutagênese do organismo hospedeiro de CocE), ou uma combinação desses. A evolução direta pode ser realizada através de mutação e recombinação seguida por rastreamento pelo traço desejado ou por aplicação de uma pressão seletiva para obter o traço de interesse (veja, por exemplo, Lehmann and Wyss, 2001) . Mutagênese podem ser realizada no gene específico de interesse ou através de mutagênese e seleção de um organismo hospedeiro de modo que a propriedade construída seja conferida à proteína de interesse. Preferivelmente, as termoestabilidades de CocE mutante são construídas através de uma abordagem de três 3 0 pontas de (i) desenho racional através de mutagênese direcionada a sítio guiada por computação (veja, por exemplo, Exemplo 3; Exemplo 4), (ii) mutagênese aleatória do gene de CocE e rastreamento de alto rendimento (veja, por exemplo, Exemplo 4; Exemplo 15); e (iii) mutagênese do organismo hospedeiro de CocE seguida por seleção genética (veja, por exemplo, Exemplo 14).

Vários conceitos de desenho racional são conhecidos por aqueles habilitados na técnica para realizar a diminuição de AG (desdobrado—> dobrado) e/ou aumento da energia livre de ativação do processo de desdobra (veja, por exemplo, Lehmann, 2001). Por exemplo, uma pessoa pode: diminuir a entropia do estado desdobrado por introdução de pontes adicionais de dissulfeto pi por mutações X—>Pro; aumento da tendência de α-hélice por substituições Gly-»Ala ou por estabilização de macrodipolos de α-hélice; melhorar interações eletrostáticas entre resíduos de superfície carregados por introdução de pontes de sal adicionais ou mesmo redes de ponte de sal, ou por mutações de termoestabilização com base nos cálculos de potenciais eletrostáticos.

A modelagem molecular, com base em simulações de dinâmica molecular adequada (MD), pode guiar racionalmente a mutagênese direcionada a sítio de modo a desenhar polipeptídeos de CocE mutante que possuam termoestabilidade aumentada. A simulação clássica de MD permite o estudo de evolução de tempo de um grande sistema tomando várias pequenas etapas de tempo sucessivas sob forças atômicas determinadas por um conjunto de funções de interação parametrizadas (campo de força), incluindo interações em 3 0 ponte (ligações, ângulos, e ângulos diedros), interações de van der Waals não ligadas, e cargas com base em interações eletrostáticas ou atômicas net. Devido à forma simples do campo de força, a simulação de MD pode ser realizada por um tempo de simulação suficientemente longo para gerar propriedades medianas em conjunto significativas, mesmo para um sistema muito grande que envolve outras centenas de milhares de átomos. Portanto, para CocE e cada mutante proposto, a simulação de MD pode levar a uma estrutura 3D razoável, dinamicamente mediana do polipeptídeo simulado em

água.

Uma abordagem usada de forma bem sucedida nessa concentra-se no desenho racional de mutações de termoestabilização que diminuem o valor de AG (desdobrado—> dobrado) do polipeptídeo (veja, por exemplo, Exemplo 3) .

Tal abordagem requer apenas o cálculo de AG (desdobrado—> dobrado) , sem realização de uma computação que demanda tempo na estrutura e energética do estado de transição da desdobra. Portanto, para aumentar a termoestabilidade de um polipeptídeo antes da peguilação, uma pessoa pode usar um

2 0 método implementado em um programa de desenho racional (por

exemplo, RosettaDesign) que usa uma função de energia para avaliação da adequação de uma seqüência particular para uma dada dobra e um algoritmo de pesquisa de Monte Cario para amostragem de espaço de seqüência. Tal abordagem é

conhecida para produzir termoestabilidade aumentada de outras enzimas sem redução na eficiência catalítica (veja, por exemplo, Korkegian, 2 0 05). Por exemplo, a dobra usada na computação pode corresponder àquela da estrutura disponível em cristal de raios X de CocE.

3 0 0 programa de desenho racional permite a previsão de um conjunto de seqüências de aminoácidos modificadas que têm potencialmente energias menores (por exemplo, os valores de AG (desdobrado-» dobrado)) e, portanto, maior termoestabilidade. Assim, uma pessoa pode usar o desenho computacional aqui descrito para prever mutações no núcleo do polipeptideo de CocE que possam levar a termoestabilização do polipeptideo sem perda da eficiência catalítica. Essa abordagem minimiza o tempo de teste experimental e aumenta muito o sucesso dos resultados experimentais. As mutações de termoestabilização previstas podem ser testadas individualmente por mutagênese direcionada a sitio e então em combinação, em um processo iterativo (veja, por exemplo, Exemplo 15).

Evolução direcionada também pode ser usada para gerar mutantes de CocE termoestáveis. Evolução direcionada engloba uma série de técnicas experimentais que produzem diversidade acelerada e adaptação através de mutação e recombinação seguida por rastreamento pelo traço desejado ou por aplicação de uma pressão seletiva para obter o traço de interesse (Lehmann & Wyss (2001) Current Opinion in Biotechnology 12, 371-375). Portanto, evolução direcionada envolve tanto um processo para gerar diversidade quanto um rastreamento eficiente ou método de seleção para a detecção ou enriquecimento do traço desejado. Evolução direcionada

2 5 foi previamente aplicada de forma bem-sucedida à produção

de proteínas termoestáveis, e a geração de diversidade foi atingida através, por exemplo, de PCR propensa a erro, mutagênese de saturação, embaralhamento de DNA, mutagênese química, e combinações desses. PCR propensa a erro

3 0 amplifica o gene de interesse com polimerases não proofreading e condições de estresse desenhadas para gerar aleatoriamente mutações únicas de par de base. Depois de cada ciclo os melhores mutantes são selecionados e usados como seqüências parentes no próximo ciclo de mutagênese. Essa técnica tem sido usada para gerar inúmeras variantes de proteína termoestável, incluindo propil endopeptidase (Uchiyama ma., e cols. 2000), betaglicuronidase (Flores, H. and A. D. Ellington (2002) Journal of Molecular Biology 315, 325-337) e xilanases de família 10 (Andrews e cols. (2004) J Biol Chem 279, 54369-79) . Mutagênese por saturação também amplifica o gene de interesse mas incorpora bases universais durante a amplificação para gerar um número muito maior de mutações. Essa técnica tem sido usada para gerar termoestabilidade em uma enzima psicrofílica (Miyazaki e cols. (2000) Journal of Molecular Biology 297, 1015-1026) . Embaralhamento de DNA envolve um ou mais ciclos de recombinação entre um conjunto de seqüências homólogas para obter melhores variantes de uma dada enzima. Essa técnica também pode ser usada in tandem com PCR propensa a erro, em que os melhores mutantes obtidos por PCR propensa a erro são combinados por embaralhamento de DNA para gerar um novo subconjunto de mutantes. Embaralhamento de DNA tem sido implementado para gerar variantes termoestáveis de beta-glicuronidase (Flores, H. and A.D. Elllington (2002) Journal of Molecular Biology 315, 325- 337). Mutagênese química envolve o tratamento de DNA de plasmídeo com agentes químicos que introduzem mutações em ponto na seqüência como hidroxilamina, nitrosaminas ou dimetil sulfato. 0 tratamento de plasmídeo com hidroxilamina tem sido usado para gerar mutantes termoestáveis de beta- glicosidase A de Bacillus polymyxa (Lopeζ-Camacho e cols. (1996) Biochemistry Journal 314, 833- 838) e luciferase de vagalume (White e cols. (1996) Biochemistry Journal 319 (Pt 2), 343-350).

Mutagênese do organismo hospedeiro de CocE também pode

ser usada para gerar mutantes de CocE termoestáveis. Um método simples e rápido para a produção de variantes de CocE termoestáveis podem ser atingidas por utilização da capacidade da enzima de conferir metabolismo de cocaína como a única fonte de carbono e seu organismo hospedeiro. O gene de CocE foi originalmente seqüenciado a partir de Rhodococcus MBl por subclonagem de fragmentos do gene em Rhodocoeeus erythropolis CW25, uma bactéria incapaz de metabolizar cocaína mas capaz de crescer nos subprodutos de esterase de cocaína, éster metílico de ecgonina e benzoato (Bresler e cols. (2000) Applied & Environmental Microbiology 66, 904-908). Um outro organismo que mostrou previamente metabolizar subprodutos da cocaína é Pseudomonas fluoreseens (MBER), que foi capaz de crescer em 2 0 uma relação simbiótica com uma outra bactéria capaz de metabolizar cocaína por meio da esterase Comamonas aeidovorans (MBLF).

Embora de difícil transformação com plasmídeos em altas eficiências, essas cepas bacterianas podem ser transformadas de forma relativamente fácil com o gene de CocE nativo clonado em vetores adequados e então mutagênese bacteriana tradicional podem ser realizada (veja, por exemplo, Exemplo 14) . Pelo fato de essa bactéria crescer normalmente apenas a 25-30°C em produtos da hidrólise de cocaína, a seleção por mutantes capazes de metabolizar a cocaína de modo eficaz a 370C pode selecionar mutante de CocE altamente ativos que são estáveis a 370C.

A exposição das bactérias a radiação ou agentes químicos para a produção de mutantes que portam novos fenótipos é bem conhecida na técnica (veja, por exemplo, Maron, D.M. and Ames, BN (1983) Mutation Research 113, 173- 215) . Mutagênese por irradiação por envolver radiação de ionização e não ionização; no entanto, radiação de não ionização é a amplamente usada, e radiação de UV a 260 nm é mais eficaz como um agente letal. A mutagênese é causada pela indução de dímeros de pirimidina, aumento da probabilidade de incorporação de descombinações durante a replicação. As células são expostas a radiação UV em uma dose predeterminada para matar 90-95% da população de células, e mutantes são então buscados entre os

sobreviventes. A mutagênese química inclui o uso de análogos de base como 5-bromouracil e 2-aminopurina que aumenta o erro de cópia durante a replicação, ou o uso de agentes que reagem diretamente com DNA como hidroxilamina

2 0 ou nitrosoguanidina que induz mutações em uma freqüência

maior que os análogos de base.

Geração de polipeptídeos de CocE mutante

Modalidades da invenção também pertencem aos métodos de produção dos polipeptídeos de CocE mutante. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de ácido nucleico que direciona expressão de uma seqüência de nucleotídeos que codifica os polipeptídeos de CocE mutante pode ser cultivada sob condições adequadas para permitir que ocorra a expressão do peptídeo. As células podem ser

3 0 coletadas, lisadas, e a proteína isolada. Um polipeptídeo de CocE mutante pode ser isolado de células hospedeiras com o uso de técnicas conhecidas na prática para purificação de proteínas que incluem cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração de gel, ultrafiltração, eletroforese, e purificação por imunoafinidade com anticorpos específicos para tal proteína (veja, por exemplo, Exemplo 1).

Por exemplo, depois de um polipeptídeo de CocE mutante ter sido expresso em uma célula, ele pode ser isolado com o uso de qualquer cromatograf ia por imunoaf inidade. Mais especificamente, um anticorpo anti-CocE pode ser imobilizado em uma matriz de cromatografia em coluna, e a matriz pode ser usada para cromatografia por imunoafinidade para purificar o polipeptídeo de CocE mutante de lisados de células por métodos padrão (veja, por exemplo, Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0879697717;). Depois de cromatografia por imunoafinidade, o polipeptídeo de CocE mutante pode ser também purificado por outras técnicas padrão, por exemplo, cromatograf ia líquida de alta performance. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de CocE mutante é expresso como uma proteína de fusão que contém um rótulo de afinidade (por exemplo, Hisx6) que facilita saua purificação (veja,

2 5 por exemplo, Exemplo 1) .

Peguilação de polipeptídeos de CocE mutante

A CocE mutante pode ser peguilada de modo a aumentar a duração de ação e estabilidade ao calor, e diminuir a imunogenicidade. A peguilação também pode melhorar a

3 0 termoestabilidade da CocE mutante da invenção e aumentar a meia-vida sérica por diminuição do clearance renal, proteólise, absorção de macrófago, e resposta imunológica.

A peguilação é o processo de anexação de unidades repetição de etileno glicol (ou seja, polietileno glicol, ou PEG) a um polipeptídeo para reduzir a imunogenicidade do polipeptídeo e sua taxa de clearance renal (veja, geralmente (Veronese, FM and Harris, JM (2002b) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 457-606, Veronese, FM and Harris, JM (2002c) Advanced Drug Delivery Reviews 55, 1259-1345, reviewing PEGylation technology). Cada unidade de etileno glicol pode se ligar a duas ou três moléculas d água, que aumenta de modo eficaz o tamanho do peptídeo, e pode proteger o peptídeo de respostas imunes, degradação enzimática, e/ou rápido clearance renal. 0 polietileno glicol também pode estabilizar contra mudanças na temperatura e pH. 0 resultado é que o polipeptídeo terapêutico pode ser mantido por mais tempo no sangue, e induz uma menor resposta imune (Harris, JM and Chess, RB (2003) Nature Reviews. Drug Discovery 2, 214-221). PEG possui um conjunto único de propriedades, incluindo ausência de toxicidade, antigenicidade, e imunogenicidade, uma diminuição dependente de massa do clearance renal, e uma alta flexibilidade e solubilidade em água. Ele transmite essas características às proteínas às quais ele é ligado (Veronese, FM and Harris, JM (2002b) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 457-606).

Um polímero de PEG pode ser primeiramente ativado com um grupo funcional que encoraja ligação covalente a um aminoácido da proteína, o grupo hidroxil terminal do PEG pode ser modificado por um carbonato ativo, éster ativo, aldeído ou derivado de tresilato. O PEG pode ser anexado a lisinas ou a resíduos de cisteína introduzidos da CocE mutante. Unidades de repetição de óxido de etileno podem ser construídas em várias configurações que têm diferentes comprimentos, com ou sem ramificação, e com vários pesos moleculares. Meios de incorporação podem incluir mutagênese direcionada a sítio ou uso de derivados de maleimida de transglutaminase.

PEG é aprovado pelo FDA para uso como um veículo ou base em fármacos, incluindo formulações injetáveis, tópicas, retais e nasais (Harris and Chess, 2003). E drogas peguiladas foram aprovadas pata uso clínico (veja, por exemplo, PEG-interferon alfa-2a (Hamidi, M and Tajerzadeh, H (2003) Drug Delivery 10, 9-20; PEG-interferon alfa-2b (Reddy e cols. (2 002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 571-586) .

Devido à mobilidade dinâmica espacial não paralela de PEG, a modificação da superfície de uma CocE mutante pelo polímero de PEG pode defender a enzima revestida de ações pelas enzimas proteolíticas e reconhecimento pelo sistema imune; assim reduzindo a imunogenicidade e prolongando a meia-vida circulante da CocE mutante peguilada. 0 sucesso das estratégias de peguilação inclui lipossomos modificados por PEG, ou seja, lipossomos de reserva, assim denominados devido a sua capacidade de desviar da detecção imune e clearance renal para gerar um tempo de circulação significativamente estendido (Lasic, DD (1997) Journal of Controlled Release 48, 203-222), bem como asparaginase peguilada cuja meia-vida in vivo foi drasticamente melhorada de 26 horas observadas para asparaginase livre para 15 dias (Avramis e cols. (2002) Blood 99, 1986-1994) . Além disso, é reconhecido na técnica que a peguilação pode melhorar significativamente a estabilidade térmica de uma enzima (Kazan, D. and Erarslan, A. (1997) Applied Biochemistry & Biotechnology 62, 1-13; Efremova e cols. (1998) Biochemistry (Moscow) 63, 441-447) e reduzir a ativação do sistema de complemento (Chang e cols. (2005) Bioconjugate Chemistry 16, 147-155). Portanto, a tecnologia de peguilação é vem adequada para melhorar os efeitos farmacológicos e farmacêuticos da CocE mutante da invenção (veja, por exemplo, Exemplo 11). Peguilação de CocE mutante também pode ser usada junto com a encapsulação de RBC. Encapsulação de CocE mutante em RBC

A CocE mutante pode ser encapsulada em hemáceas (RBC) de modo a aumentar a duração da ação e estabilidade ao calor, e diminuir a imunogenicidade. A cocaína cruza rapidamente a barreira hematencefálica, também transita rapidamente a membrana plasmática das hemáceas, e essa absorção foi demonstrada em um estudo de administração intravenosa de cocaína em homens (Javaid e cols. (1978) Journal of Chromatography 15, 105-113). Além disso, as concentrações de cocaína em hemáceas excede as concentrações no plasma (Javaid e cols. (1978) Journal of Chromatography 15, 105-113) . Como tal, a encapsulacao em hemáceas pode ser utilizada para proteger formas termoestáveis de CocE do clearance.

Eritrócitos têm sido explorados extensivamente por suas aplicações potenciais como veículos de drogas (Wang e cols. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 547-570). 3 0 Sendo as células mais abundantes do corpo humano, as hemáceas oferecem vantagens únicas para funcionar como um veículo de drogas. Primeiramente, os eritrócitos são completamente biocompatíveis e biodegradáveis,

particularmente quando as células autólogas são usadas para carga de droga. Em adição, o formato de disco bicôncavo dos eritrócitos fornece a maior superfície para a proporção de volume (1,9 χ IO4 cm/g) (Guyton, AG & Hall, JE (1996) Textbook of Medicai Physiology, 425-433) usável para encapsulação de drogas. A encapsulação em hemáceas também evita a inativação da droga carregada por fatores endógenos bem como protege os organismos dos efeitos tóxicos da droga encapsulada (Wang e cols. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 547-570). Além disso, a encapsulação em hemáceas evita as respostas imunes indesejáveis (ou seja, antigenicidade e imunogenicidade) que possam ser ativadas por corpos estranhos (Wang e cols. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 547-570). E, os eritrócitos possuem meia-vida de circulação mais longa em comparação a outros veículos sintéticos. Por exemplo, a expectativa de vida normal de um eritrócito na circulação sistêmica é relatada como sendo cerca de 120 dias (Guyton, AG & Hall, JE (1996) Textbook of Medicai Physiology, 425-433) .

A encapsulação de CocE mutante em eritrócitos pode ser de acordo com várias técnicas conhecidas na prática, incluindo eletroporação, endocitose induzida por drogas (por exemplo, primaquina) , e osmose (veja, por exemplo, Green, R. and Widder, KJ (1987) Methods In Enzymology, Vol . 149) . Esses métodos podem incluir inchação e rompimento da membrana celular, liberando o conteúdo interior incluindo 3 0 primariamente hemoglobina e também citoesqueleto, aprisionando a droga, e então re-selagem da membrane para gerar a hemácea de forma em taça esférica, de cor rosa ou branca (geralmente denominada "hemaácea-fantasma").

Alternativamente, peptídeos que penetram a membrana podem ser empregados para encapsular CocE mutante em eritrócitos (veja, por exemplo, Exemplo 12) . Os peptídeos que penetram a membrana, ou peptídeos de domínio de transdução de proteína (PTD) são uma família de pequenos peptídeos (normalmente consiste em 10-15 resíduos de aminoácidos) incluindo TAT, LMWP, e outros peptídeos catiônicos ricos em arginina (veja, Dietz, GPH and Bahr, M (2004) Molecular Cell Neurosciences 27, 85-131) . É conhecido na técnica que, por ligação covalente de PTD a quase qualquer tipo de espécies moleculares incluindo proteínas (peso molecular >150 kDa; mais de 60 diferentes proteínas já foram testadas (Dietz, GPH and Bahr, M (2004) Molecular Cell Neurosciences 27, 85-131) e nano-veículos (por exemplo lipossomos) , PTD pode transportar as espécies anexadas através da membrana celular de todos os tipos de órgãos incluindo o cérebro (Schwarze e cols. (1999) Science 285, 1569-1572). PTD não é tóxico nem imunogênico (Schwarze e cols. (1999) Science 285, 1569-1572), e a internalização celular mediada por PTD não induz a perturbação ou alteração da membrana celular dos eritrócitos (Suzuki e cols. (2002) Journal of Biological Chemistry 25, 2437- 244 3) . PTD tem sido usado de modo bem-sucedido em hemáceas de carga de proteína, e resulta em eritrócitos com atributos físicos e químicos inalterados (veja, por exemplo, Li e cols. (2003) American Pharmaceutical Review 6, 22-26) . Portanto, a conjugação do peptídeo PTD a CocE mutante pode facilitar a encapsulação em hemáceas. A encapsulação em hemáceas também pode ser realizada pelo uso de CocE mutante peguilada. Estabilização de CocE mutante Um outro aspecto da invenção é direcionado à

estabilização de polipeptídeos de CocE mutante com o uso de substratos, produtos, e/ou inibidores de cocaína. Substratos e produtos úteis nas modalidades aqui reveladas incluem, por exemplo, mas não são limitados a, cocaína; derivados de cocaína, como, por exemplo, (-)-cocaína, ( + )- cocaína, tropococaína, e outros; derivados de tio-cocaína, como, por exemplo, Tiol-I, Tiol-2, e outros; derivados de amida-cocaína; derivados de provitamina-cocaína, como PABA cocaína, Niacina cocaína, e outros; ácido benzóico; 4- nitrofenil acetato (4NPA); 4-nitrofenol (4NP); e outros. Inibidores de exemplo incluem, sem limitação, análogos de substrato, como, fosfo-fluorcocaína, O-Fosfo-cocaína, O- metilfosfococaína, S-Metilfosfococaína, e outros; análogos de produto, como, Ecgonina e derivados de Ecgonina, como, 2 0 análogo de éster metiIico de ácido ecogonina borônico; ácido fenilborônico; derivados de ácido benzóico, como, ácido 4-terc-Butil benzóico, ácido 1-Naftóico, éster metílico de ácido 2,3,4 -trimetil- benzóico, e outros. Agentes químicos adicionais incluem, por exemplo, sem limitação, SDS, glicerol, PEG, e outros.

Preferivelmente, os substratos, produtos, e/ou inibidores estabilizam a desnaturação térmica dos polipeptídeos aqui revelados. Em algumas modalidades, os substratos, produtos e/ou inibidores também evitam a agregação termicamente induzida em eletroforese de gel. Geralmente, o uso de um substrato, produto, e/ou inibidor resulta em pelo menos cerca de a 10% de aumento na estabilidade e/ou inibição, respectivamente. Por exemplo o aumento pode ser de cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 120%, 150%, 200%, 300%, ou mesmo 500% ou maior. Portanto, substratos, produtos, e/ou inibidores são bem adequados para estabilizar os polipeptídeos de CocE mutante aqui revelados (veja, por exemplo, Exemplo 20). Em uma modalidade, pequenas moléculas são usadas para

termoestabilizar os polipeptídeos de CocE mutante aqui revelados. Em uma modalidade preferida, tais moléculas não ocupam o sitio ativo do polipeptídeo.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos aqui revelados podem ser co-infundidos com uma molécula de estabilização. Em outras modalidades, as moléculas de estabilização podem ser usadas para estabilizar o polipeptídeo durante a manufatura. Ainda em outras modalidades, as moléculas de estabilização podem ser usadas para estabilizar os polipeptídeos de CocE mutante até estarem prontos para uso. Métodos de tratamento

Um outro aspecto da invenção é direcionado à abordagem de degradação catalítica para terapêuticos anticocaína. São fornecidos tratamentos, profiláticos e terapêuticos, de condições induzidas por cocaína através da administração de polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis, ativos em esterase a um indivíduo que necessita. As variantes de esterase de cocaína da invenção têm um valor clínico 3 0 significativo por causa de sua termoestabilidade aumentada e maior meia-vida plasmática que a CocE conhecida de ocorrência natural. É esse aumento na termoestabilidade e meia-vida plasmática que permite uma resposta muito mais rápida aos sintomas que ameaçam a vida da toxicidade por cocaína que coloca as variantes de CocE da invenção separadas de outras opções de tratamento.

Uma determinação da necessidade por tratamento será tipicamente avaliada por uma história e exame físico consistentes com a condição induzida por cocaína. Condições induzidas por cocaína incluem, sem limitação, overdose de cocaína, toxicidade por cocaína, e dependência à cocaína e/ou vício. Por exemplo, o diagnóstico de toxicidade por cocaína pode incluir convulsões, convulsões tipo grande mal, ataque cardíaco, infarto do miocárdio, arritmias cardíacas, pressão arterial aumentada, AVC, psicose induzida por drogas, aneurisma dissecante, e demanda miocárdica aumentada de oxigênio. Como um outro exemplo, no caso de dependência à cocaína e/ou vício, os sintomas de retirada incluem sensações subjetivas de disforia leve a

2 0 severa, depressão, ansiedade, ou irritabilidade. Indivíduos

com uma necessidade identificada de terapia incluem aqueles com uma condição induzida por cocaína diagnostica, uma indicação de uma condição induzida por cocaína, e indivíduos que foram tratados, estão sendo tratados, ou serão tratados para uma condição induzida por cocaína. O indivíduo é preferivelmente um animal, incluindo, sem limitação, mamíferos, répteis, e aves, mais preferivelmente cavalos, vacas, cães, gatos, carneiros, porcos, e galinhas, e mais preferivelmente humanos.

3 0 Uma quantidade eficaz dos polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos é geralmente aquele que pode reduzir a toxicidade por cocaína ou a severidade de uma condição induzida por cocaína. A redução na severidade inclui, por exemplo, uma interrupção ou uma diminuição nos sintomas, indicadores fisiológicos, marcadores bioquímicos, ou indicadores metabólicos. Quando usada nos métodos de a invenção, a quantidade terapeuticamente eficaz de polipeptídeo de CocE mutante aqui descrito pode ser empregada em forma pura ou, quando tais formas existirem, em forma de sal farmaceuticamente aceitável e com ou sem um excipiente farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, os polipeptídeos de CocE mutante da invenção podem ser administrados em uma proporção risco/benefício razoável aplicável a qualquer tratamento médico, em uma quantidade suficiente para reduzir substancialmente a concentração de cocaína no sangue e/ou tecidos do indivíduo.

A toxicidade e eficácia terapêutica dos polipeptídeos de CocE mutante podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células e/ou animais experimentais para a determinação da LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50, (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) . A proporção de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico que pode ser expresso como a proporção LD50/ED50, em que grandes índices terapêuticos são preferidos.

A quantidade de polipeptídeo de CocE mutado que pode ser combinada com um veículo farmaceuticamente aceitável para produzir uma forma de dosagem única irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de 3 0 administração. Deve ser percebido por aqueles habilitados na técnica que o conteúdo unitário de agente contido em uma dose individual de cada forma de dosagem não precisa em si constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz, uma vez que a quantidade terapeuticamente eficaz necessária pode ser atingida pela administração de inúmeras doses individuais. A administração do agente pode ocorrer como um evento único ou pela duração do tempo de tratamento. Por exemplo, um agente pode ser administrado diariamente, semanalmente, a cada duas semanas, ou mensalmente. Para algumas condições, o tratamento pode ser estendido de várias semanas a vários meses ou mesmo um ano ou mais.

0 nível de dose específica terapeuticamente eficaz para qualquer indivíduo em particular será depende de uma variedade de fatores incluindo a condição induzida por cocaína sendo tratada e da severidade da condição induzida por cocaína; atividade do polipeptídeo de CocE mutante empregado; a composição específica empregada; da idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; do tempo de administração; da via de administração; da meia-

2 0 vida plasmática do polipeptídeo de CocE mutante; da taxa de

excreção do polipeptídeo de CocE mutante empregado; da duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou coincidência com o polipeptídeo de CocE mutante empregado; e fatores semelhantes bem conhecidos em medicina (veja, por exemplo, Koda-Kimble e cols. (2004) Applied Therapeutics: The Clinicai Uso de Drugs, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781748453; Winter (2003) Basic Clinicai Pharmacokinetics, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781741475; Shame! (2004) Applied Biopharmaceutics &

3 0 Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton & Lange, ISBN 0071375503) . Será entendido por um profissional que o uso diário total do polipeptídeo de CocE mutante para uso nas modalidades da invenção aqui reveladas será decidido pelo profissionalm médico dentro do escopo de julgamento médico seguro.

Os polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos também podem ser usados em combinação com outras modalidades terapêuticas. Portanto, em adição às terapias aqui descritas, pode-se fornecer outras terapias ao indivíduo conhecidas como sendo eficazes para condições induzidas por cocaína particulares.

Os polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos podem ser formulados por qualquer maneira convencional com o uso de um ou mais veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis (veja, por exemplo, Gennaro (2005) Remington the Science and Practice of Pharmacy 21st ed. Lippincott Williams & Wilkins, ISBN 0781746736). Tais formulações terão uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo de CocE mutante, preferivelmente em forma

2 0 purificada, JUNTO COM Uma quantidade adequada de veículo de

modo a fornecer a forma para administração adequada ao indivíduo. A formulação deve ser conveniente ao modo de administração. Polipeptídeos de CocE mutante de uso com a atual invenção podem ser formulados por métodos conhecidos para administração a um indivíduo que usa várias vias que incluem, sem limitação, parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, oftálmica, bucal, e retal. 0 polipeptídeo de CocE mutante também pode ser

3 0 administrado em combinação com um ou mais agentes adicionais aqui revelados e/ou junto com outros agentes biologicamente ativos ou biologicamente inertes. Tais agentes biologicamente ativos ou inertes podem estar em comunicação de fluido ou mecânica com o agente ou anexado ao agente(s) por força iônica, covalente, Van der Weals, hidrofóbica, hidrofilica ou outras forças físicas.

Polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos podem ser administrados por via parenteral, incluindo injeções intravenosa, intramuscular, subcutânea, e intraperitoneal. Excipientes, comumente usados na liberação parenteral de pequenas moléculas de medicamento, incluindo

intensificadores de solubilidade, agentes osmóticos, tampões, e conservantes, também podem ser incluídos em formulações de biomolécula. A inclusão de agentes anti- agregação e anti-adsorção, como tensoativos e albumina, quando da formulação e liberação de biomoléculas pode adicionar estabilidade aumentada r diminuir o risco de interação da biomolécula ativa com uma interface, que pode levar à desdobra, agregação, e/ou precipitação. O polipeptídeo de CocE mutante pode ser liofilizado para melhor estabilidade durante a estocagem, e re-processado antes da administração parenteral.

Preferivelmente, o polipeptídeo de CocE mutante é peguilado, assim fornecendo estabilidade aumentada e imunogenicidade diminuída (veja acima).

A liberação pulmonar de macromoléculas, como polipeptídeos de CocE mutante, fornece uma administração relativamente fácil, não invasiva ao sistema circulatório para distribuição sistêmica (veja, por exemplo, Cryan (2004) AAPS J. 7(1) artigo 4, E20-41, que fornece uma revisão de tecnologia de liberação pulmonar). As vantagens da liberação pulmonar incluem não invasividade, grande área de superfície para absorção (-75 m2) , epitélio alveolar fino (-0,1 a 0,5 μπι) que permite rápida absorção, ausência de metabolismo de primeira passagem, atividade proteolítica diminuída, rápido surgimento de ação, e alta biodisponibilidade. Vários dispositivos de liberação por inalação, como inaladores de dose medida, nebulizadores, e inaladores de pó seco, que podem ser usados para liberar as biomoléculas aqui descritas são conhecidos na técnica (por exemplo, AErx (Aradigm, CA) ; Respimat (Boehringer, Germany); AeroDose (Aerogen Inc., CA)). Dispositivos de inalação de pó seco são particularmente preferidos para liberação pulmonar de agentes com base em proteína (por exemplo, Spinhaler (Fisons Pharmaceuticals, NY); Rotohaler (GSK, NC) ; Diskhaler (GSK, NC) ; Spiros (Dura Pharmaceuticals, CA); Nektar (Nektar Pharmaceuticals, CA) ) .

Preparações de liberação controlada (ou de liberação sustentada) podem ser formuladas para estender a atividade do polipeptídeo de CocE mutante e reduzir a freqüência de dosagem. Preparações de liberação controlada também podem ser usadas para efetuar o momento do surgimento da ação ou outras características, como níveis sangüíneos do agente, e conseqüentemente afetar a ocorrência de efeitos colaterais.

2 5 Preparações de liberação controlada podem ser desenhadas

para liberar inicialmente uma quantidade of polipeptídeo de CocE mutante que produz o efeito terapêutico desejado, e gradualmente e continuamente libera outras quantidades para manter o nível de efeito terapêutico por um período de

3 0 tempo estendido. Para manter um nível quase constante de polipeptídeo de CocE mutante no corpo, o agente pode ser liberado a partir da forma de dosagem em uma taxa que substituirá a quantidade de agente sendo metabolizada e/ou excretada do corpo. A liberação controlada de um agente pode ser estimulada por vários indutores, por exemplo, mudança no pH, mudança na temperatura, enzimas, água, ou outras condições fisiológicas ou moléculas.

Sistemas de liberação controlada podem incluir, por exemplo, uma bomba de infusão que pode ser usada para administrar o agente em uma maneira similar àquela usada para liberar insulina ou quimioterapia a órgãos específicos ou tumores. Os agentes da invenção podem ser administrados por outros meios de liberação controlada ou dispositivos de liberação que são bem conhecidos por aqueles de jabilidade comum na técnica, incluindo, por exemplo, hidropropilmetil celulose, outras matrizes poliméricas, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, depósitos, revestimentos de multicamadas, micropartículas, lipossomos, microesferas, ou outros, ou uma combinação de qualquer um dos acima para fornecer o perfil de liberação desejado em proporções variáveis. Outros métodos de liberação controlada de agentes serão bem conhecidos do profissional habilitado e estão dentro do escopo da invenção.

Polipeptídeos de CocE mutante podem ser encapsulados e

2 5 administrados em uma variedade de sistemas de liberação de

veículo. Sistemas com base em veículo para liberação de agente biomolecular podem: fornecer liberação intracelular; adaptar taxas de liberação de biomolécula/agente; aumentar a proporção de biomolécula que atinge seu local de ação;

3 0 melhorar o transporte da droga a seu local de ação; permitir o depósito localizado com outros agentes ou excipientes; melhorar a estabilidade do agente in vivo; prolongar o tempo de residência do agente em seu local de ação por redução do clearance; diminuir a liberação não específica do agente a tecidos não visados; diminuir a irritação causada pelo agente; diminuir a toxicidade devido a doses iniciais altas do agente; alterar a imunogenicidade do agente; diminuir a freqüência da dosagem, melhorar o sabor do produto; e/ou melhorar a vida-útil do produto. Exemplos de sistemas de liberação de veículo para

polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos incluem microesferas (veja, por exemplo, Varde & Pack (2004) Expert Opin. Biol. 4(1) 35-51), hidrogéis (veja, de modo geral, Sakiyama e cols. (2001) FASEB J. 15, 1300-1302), implantes poliméricos (veja, de modo geral, Teng et al (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99, 3024-3029), veículos poliméricos smart (veja, de modo geral, Stayton e cols. (2005) Orthod Craniofacial Res 8, 219-225; Wu e cols. (2005) Nature Biotech (2005) 23(9), 1137-1146), e lipossomos (veja, por exemplo, Galovic e cols. (2002) Eur. J. Pharm. Sei. 15, 441-448; Wagner e cols. (2002) J. Liposome Res. 12, 259-270). Preferivelmente, o polipeptídeo de CocE mutante é encapsulado em hemáceas (veja acima; Exemplo 12) .

2 5 Métodos de rastreamento

Um outro aspecto da invenção é direcionado a métodos de rastreamento para a geração, identificação, e purificação de polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis. Geralmente, polipeptídeos de CocE mutante podem ser

3 0 inicialmente desenhados de acordo com as abordagens acima descritas. Tais polipeptídeos desenhados podem ser então rastreados para características preferidas, como retenção de eficiência hidrolítica, termoestabilidade aumentada, meia-vida plasmática aumentada, e/ou antigenicidade reduzida. Também, polipeptídeos de CocE mutante aleatórios podem ser rastreados para as características desejadas.

Métodos de detecção para rastrear mutantes termoestáveis englobam uma ampla variedade de técnicas. A seguir está um resumo de exemplo de um protocolo genérico. Ácido nucleico que codifica os polipeptídeos de CocE mutante (gerados, por exemplo, através de desenho racional, mutagênese aleatória, ou mutagênese de hospedeiro) é transformado em um hospedeiro de expressão adequado (por exemplo, células de E. coli como E. coli BL21 Gold (Stratagene)), e a expressão do polipeptídeo mutante é induzida de acordo com protocolos padrão (por exemplo, por IPTG). A expressão é realizada em temperaturas para produzir expressão ótima da proteína (por exemplo, 16 0C para CocE, veja, por exemplo, Exemplo 1) por um período de tempo predeterminado (por exemplo, de 30 minutos a 24 horas ou mais). Alternativamente, a expressão é realizada em uma temperatura elevada (por exemplo, a temperatura elevada pode ser pelo menos cerca de 35 °C, pelo menos cerca de 36°C, pelo menos cerca de 37°C, pelo menos cerca de 38°C, pelo menos cerca de 39°C, pelo menos cerca de 40°C, ou ainda maior). Preferivelmente, a temperatura elevada em que polipeptídeo de CocE mutado é expresso é 37°C. Por volta dessa temperatura, o polipeptídeo de CocE de tipo selvagem divide-se quase exclusivamente em corpos de inclusão. Células que contêm os polipeptídeos mutantes expressos são rastreadas para a presença de variantes termoestáveis de CocE.

Rastreamento para a presença de variantes termoestáveis de CocE geralmente envolve a medição direta em células cultivadas, em lisados de células, ou após rompimento celular e isolação do polipeptídeo de CocE mutante. O rompimento celular pode incluir choque osmótico, Iise química, sonificação, e/ou homogeneização, e a isolação do polipeptídeo mutante pode ser obtida através de numerosos métodos que incluem absorção direta a uma matriz ou absorção por afinidade através do uso de anticorpos anticocaína ou sistemas de captura específicos de proteína de fusão. Matriz adequada para absorção inclui papel de nitrocelulose, filtros, placas de microtítulo não tratadas ou tratadas por afinidade, resinas de agarose ou sefarose, e/ou pontas revestidas por afinidade.

A atividade de esterase das células cultivadas ou polipeptídeo mutante isolado pode ser subseqüentemente medida em uma ou mais temperaturas para determinar a termoestabilidade dos mutantes. A temperatura em que o ensaio de atividade é realizado determina o grau de detecção de termoestabilidade. Portanto, embora os mutantes finais tenham preferivelmente a temperatura de fusão de 45°C ou maior (como determinado, por exemplo, por dicroísmo circular), freqüentemente, o rastreamento inicial a 45°C não encontrará enzimas ativas. Ao contrário, vários ciclos de mutagênese e rastreamento em temperaturas subseqüentemente crescentes podem ser realizados para atingir mutantes termoestáveis. Assim, o rastreamento inicial pode ser realizado a 30°C, e depois de ciclos de mutagênese adicionais, rastreamento pode ser realizado com temperaturas crescentes (por exemplo, 34°C, 37°C, 40°C, 42,5°C, 45°C etc.), até que um mutante de termoestabilidade adequada seja atingido. Os aumentos da temperatura são determinados empiricamente durante o procedimento, e são afetados pelo número de acertos em temperaturas particulares e a Tm determinada dos mutantes gerados.

Embora sob nenhuma obrigação de assim o fazer, e não desejando estar atado por teoria, aqui se segue o que acredita-se ser uma explicação mecanicista da fusão de várias modalidades de polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos. Os dados de espectro CD ilustram que a fusão CD de esterase de cocaína e mutantes é irreversível, uma vez que o resfriamento a 0 grau não restaura o espectro original (veja, por exemplo, Exemplo 19). Embora parâmetros termodinâmicos não possam ser verificados, o espectro de CD pode ser usado para determinar comparativamente se os mutantes são mais ou menos estáveis, se eles têm diferentes estruturas secundárias ou propriedades de agregação. Acredita-se que os polipeptídeos de CocE aqui descritos se fundam por meio de uma etapa intermediária, ou seja, os polipeptídeos passam por um processo de fusão de 2 etapas.

A detecção da atividade de esterase pode ser realizada com o uso de uma variedade de métodos, em que substratos são ligados a um sistema de detecção específico. Substratos adequados para uso na determinação da atividade de esterase podem incluir cocaína, cocaína tritiada (3H) , derivados de substrato de cocaína como um derivado de tio cocaína (veja, por exemplo, Figura 6) , e/ou substratos que têm atividade 3 0 de esterase geral como 4-nitrofenil acetato. 0 sistema de detecção pode ser diretamente ligado ao substrato, por exemplo: a clivagem cocaína não modificada pode ser detectada por monitoração de mudanças na absorvência da cocaína a 240 nm (veja, por exemplo, Exemplo 4), ou por monitoramento de mudanças do pH que resultem do acúmulo do produto ácido de ácido benzóico (veja, por exemplo, Exemplo 15) , ou através do uso de aptâmeros de cocaína (veja, por exemplo, Stojanovic, M. N., de Prada, P. & Landry, D. W. (2001) J Am Chem Soc 123, 4928-4931; Stojanovic, Μ. N. &

Landry, D. W. (2002) J Am Chem Soc 124, 9678-9679) por monitoramento de mudanças na fluorescência após degradação de cocaína (veja o exemplo 15) ; clivagem de cocaína tritiada (3H) pode ser detectada por acidificação e detecção de produto de ácido benzóico tritiado através de

separação por cromatograf ia (veja os exemplos 1 e 15) ; clivagem de derivados de cocaína como tio-cocaína pode ser monitorada pela detecção de grupos sulfidril reativos, através da adição de reagente de Ellman e determinação de mudanças de absorvência a 412 nm (veja, por exemplo,

2 0 Exemplo 15), ou pela adição e visualização de sulfidril em

precipitação que reage com metais pesados; clivagem de 4- nitrofenil acetato pode ser detectada por monitoramento de mudanças na absorvência a 420 nm (veja, por exemplo, Halgasova, N. e cols. (1994) Biochem J 298 Pt 3, 751-755 ;

0'Conner, C.J. & Manuel, R. D. (1993) J Dairy Sei. 76, 3674- 3682) .

Polipeptídeos de CocE mutante identificados através dos procedimentos acima, ou um ensaio similar de alto rendimento, podem ser também avaliados com o uso de

3 0 procedimentos in vitro aqui descritos (por exemplo, valores de Kcat e Km, estabilidade a 37°C, temperatura de fusão (Tm) , níveis de endotoxina, capacidade de degradar cocaína em plasma). Polipeptídeos de CocE mutante com atividade de esterase termoestável e/ou imunogenicidade reduzida, podem ser também avaliados com o uso de procedimentos in vivo aqui descritos (por exemplo, potência, duração de ação, efeitos com dosagem repetida, e/ou avaliação imunológica). Preferivelmente, a diminuição na magnitude dos polipeptídeos de CocE mutante de toxicidade por cocaína é examinada primeiramente (veja, por exemplo, Exemplos 5, 7, e 8) , e aqueles mutantes que reduzem a toxicidade em pelo menos cerca de 5-10 vezes podem ser também avaliados para duração da ação (veja, por exemplo, Exemplo 6). Polipeptídeos de CocE mutante candidatos podem ser também estabilizados, por exemplo, por peguilação e/ou encapsulação em hemáceas e re-avaliados nos procedimentos acima descritos.

Tendo descrito a invenção em detalhes, estará aparente que modificações, variações, e modalidades equivalentes são possíveis sem fugir do escopo da invenção definida das reivindicações em apêndice. Além disso, deve-se perceber que todos os exemplos na presente revelação são fornecidos como exemplos não limitantes. EXEMPLOS

Os exemplos não limitantes a seguir são fornecidos

para também ilustrar várias modalidades da invenção aqui reveladas. Deve ser percebido por aqueles habilitados na técnica que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam abordagens que os inventores acreditam 3 0 funcionar bem na prática da invenção, e assim podem ser consideradas como exemplos de modos para sua prática. No entanto, aqueles habilitados na técnica devem, em vista da presente revelação, perceber que várias mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado parecido ou similar sem fugir do espírito e escopo da invenção. Exemplo 1: Expressão de CocE

Um método para expressão e purificação de CocE foi estabelecido, em que CocE é expressa em E. Coli como uma proteína de fusão com um terminal carboxil Hisx6-tag. O gene de esterase de cocaína foi subclonado no vetor de expressão de E. coli pET-22b( + ) e altos níveis de enzima esterase de cocaína contendo um rótulo de histidina C- terminal foram induzidos após a adição de IPTG a 23°C. A proteína recombinante acumulou a aproximadamente 10-15% da proteína total. CocE foi enriquecida em uma coluna de cobalto-quelato (Talon™ Clontech) ou uma coluna de agarose níquel-quelato (Pierce) em virtude do rótulo Hisx6. A proteína eluída era aproximadamente 95% pura por SDS-PAGE e 2 0 coloração de azul Coomassie, e foi subseqüentemente resolvida por cromatografia de troca iônica em coluna FPLC (Q-Sepharose) usando um gradiente de NaCl. A proteína eluiu como um único pico e era aproximadamente 99% pura, como indexado por SDS-PAGE e coloração de azul Coomassie (veja,

2 5 por exemplo, Figura 3) .

A atividade da enzima foi determinada através de dois ensaios: um ensaio de atividade de radioligante em que cocaína tritiada foi hidrolisada e então após acidificação, o produto de ácido benzóico foi tritiado a partir de

3 0 cloridrato de cocaína tritiada por cromatografia; e um ensaio espectrofotométrico sob condições similares como descrito por Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297- 12307. O espectro único de absorção de cocaína (coeficiente de extinção 6,7 L/mmol/cm, a 240 nm) permite a observação de cocaína remanescente após a clivagem enzimática. As taxas lineares iniciais de deterioração da cocaína, que representam velocidde, foram determinadas em um leitor de placa SpectraMax 190 (Molecular Devices) usando SOFTmax Pro software (vl.13). A reação foi iniciada pela adição de 150 μΐ, de uma solução 2x enzima aos 150 μΐΐι de uma solução 2x cocaína. As concentrações finais de CocE variaram de 10 0 ng/mL a 2 0 ng/mL. As concentrações finais de cocaína eram como se segue: 250, 126, 62,5, 31,25, 15,63, 7,81, 3,91, and 1,95 μΜ. Para a cinética de todas as enzimas, o tampão foi solução salina tamponada por fosfato, pH 7,4. As taxas iniciais foram ajustadas à equação de Michaelis-Menten, com kcat e Km como parâmetros ajustáveis (GraphPad; PRISM, v4) .

Como determinado como o uso do ensaio espectrofotométrico de cocaína, o polipeptídeo de CocE de tipo selvagem purificado hidrolisa cocaína com uma Kcat de aprox. 500 min"1 e uma Km de aprox. 2 μΜ, eu é consistente com valores relatados previamente (veja, por exemplo, Turner e cols. 2000).

Tais procedimentos de expressão podem ser utilizados para os polipeptídeos de CocE mutante aqui descritos. Exemplo 2: Atividade plasmática ex vivo de CocE

A determinação ex vivo dos níveis de cocaína após esterase de cocaína foi examinada em plasma humano (banco de sangue do hospital da Universidade de Michigan). Cocaína foi obtida do "The National Institute of Drug Abuse" (Bethesda, MD, USA) . Cocaína foi dissolvida em água estéril. Alíquotas (3 ml) de plasma humano foram mantidas a 37°C em um banho de água por 10 minutos antes do início e pela duração do experimento. Após equilibrar o plasma em banho de água, a cocaína foi adicionada a uma concentração final de 300 μΜ e rotacionada por 30 segundos. As amostras de plasma foram removidas e colocadas em um tubo de microcentrífuga contendo o padrão interno e uma solução de fluoreto de sódio saturada para evitar metabolismo adicional da cocaína. Imediatamente após tomar a primeira amostra do plasma (cocaína isoladamente), 0,05 mg/ml de CocE ou veículo de CocE foi adicionado e rotacionado. As amostras de plasma foram coletadas a 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15, 30, 45, 60, e 12 0 minutos após a adição de CocE. Níveis de cocaína foram medidos com o uso de espectrometria de massa tandem de cromatografia líquida de alta performance.

Cromatografia líquida foi realizada com a utilização de um sistema Surveyor HPLC (ThermoElectron Corp., Franklin, MA) com uma bomba quaternária e autosampler configurado com uma alça de injeção de 10 μΐ. A separação foi realizada com o uso de uma coluna Phenomex C18 3 μιη 30 χ 4,6 mm com coluna guardiã correspondente (Waters Corp., Milford, MA) em uma taxa de fluxo de 600 μΐ,/ιιιίη. Solvente A consistiu em uma solução de ácido fórmico a 0,1%, e solvente B era ácido fórmico a 0,1% em acetonitrila (alto grau de pureza; Burdick and Jackson, Muskegon, MI) . Um gradiente balístico de 3 minuto foi usado com cocaína e a co-eluição interna padrão a 2,3 min.

Para a detecção e quantificação por espectrometria de massa, um espectrômetro de massa de quatro pólos triplo Finnigan TSQ Quantum Ultra AM equipado com uma fonte de ionização de eletrospray IonMax (ThermoElectron Corp., Franklin, MA) foi usado em ion positivo, modo de monitoramento de reação selecionada. Nitrogênio serviu como o gás nebulizante e argônio como o gás de colisão. As taxas de fluxo de gás, voltagens de spray, e energias de colisão foram otimizadas. Curvas de calibragem foram determinadas para cocaína com 5 0 nM cocaína deuterada (cocaína D3) como o padrão interno em amostras de plasma não tratadas. Amostras desconhecidas foram também receberam cocaína D3. todas as amostras foram avaliadas em triplicata. As curvas padrão e desconhecidas foram analisadas por programa Quan Browser em programa Xcalibur versão 1.4 (ThermoElectron Corp., Franklin, MA). As curvas calibragem foram construídas com o uso de regressão linear da proporção da área de pico da cocaína/área de padrão interno como uma função da concentração padrão com um fator de peso de l/x. Os valores adequados de curva padrão foram aceitos em um valor que é maior que 0,99, e os valores de RSD para amostras em réplica estão entre 0-10%.

Os resultados demonstram que CocE é capaz de degradar cocaína muito rapidamente quando as duas são misturadas brevemente em plasma humano (veja, por exemplo, Figura 4) . 0 primeiro ponto de tempo indica a concentração de cocaína antes da adição de esterase de cocaína ou veículo de esterase. Antes do tratamento com esterase, os níveis de cocaína foram similares, mas em 1 minuto de administração de esterase de cocaína, os níveis de cocaína foram diminuídos em pelo menos 100 vezes a aproximadamente 2 μΜ 3 0 quando comparados com a amostra de plasma tratada com veículo. Os níveis de cocaína continuaram a diminuir nas amostras de plasma tratada com esterase, caindo abaixo de 1 microM por volta do 2o minuto.

A eficiência terapêutica da enzima foi demonstrada pela dose crescente de cocaína necessária para produzir efeitos tóxicos após uma única injeção intravenosa de CocE. A enzima de tipo selvagem demonstrou rápida cinética para a degradação de cocaína ex vivo em soro de rato e humano. Dois rautantes inativos de CocE falharam em proteger os ratos dos efeitos tóxicos da cocaína, confirmando que os efeitos protetores são devidos à atividade hidrolítica. Além disso, CocE não mudou a letalidade de WIN-35065-2, um análogo da cocaína que é desprovido da porção de éster de benzoila direcionado por CocE. A caracterização in vivo e ex vivo de CocE sustenta o papel da enzima como um antídoto adequado para toxicidade em humanos. Exemplo 3: CocE mutante termoestável prevista

Desenho racional de CocE mutante aqui descrita foi baseado em simulações de dinâmica molecular (MD). Um modelo

2 0 computacional de CocE foi construído com o uso da estrutura

de CocE de tipo selvagem em cristal publicada (veja, por exemplo, Figura 2) . Tais modelos podem ser usados para identificar certas modificações de aminoácido que aumentam a temperatura de fusão teórica da proteína sem romper a estrutura no sítio ativo. Simulação clássica de MD permite o estudo de evolução de tempo de sistema grande tomando várias pequenas etapas de tempo sucessivas sob forças atômicas determinadas por um conjunto de funções de interação parametrizadas (campo de força), incluindo

3 0 interações ligadas (ligações, ângulos, e ângulos diedros) , interações de van der Waals não ligadas, e cargas com base em interações eletrostáticas ou atômicas net. Devido à forma simples do campo de força, a simulação de MD pode ser realizada por um tempo de simulação suficientemente longo para gerar propriedades medianas em conjunto significativas, mesmo para um sistema muito grande que envolve outras centenas de milhares de átomos. Portanto, para CocE e cada mutante proposto, a simulação de MD pode levar a uma estrutura 3D razoável, dinamicamente mediana do polipeptideo simulado em água.

Com base na estrutura em cristal de raios X (PDB código 1JU3) da esterase de cocaína bacteriana (CocE) (Larson e cols. (2002) Nature 9, 17), um modelo em 3D completo de ligação de CocE com (-)-cocaína adequado para modelagem computacional de sua estabilidade termodinâmica foi construído. Para aumentar a termoestabilidade de CocE, um método computacional foi implementado em programa RosettaDesign (Kuhlman and Baker (2000) PNAS 97, 10383) capaz de prever mutações de termoestabilização em uma dada dobra enquanto minimiza qualquer torça na estrutura que pode romper estruturalmente a estrutura do sítio ativo ou extinguir sua flexibilidade. 0 método implementado no programa RosettaDesign usa um função de energia para avaliação da adequação de uma seqüência em particular para 2 5 uma dada dobra e um algoritmo de pesquisa Monte Cario apara amostragem do espaço da seqüência. Um método similar foi usado de forma bem sucedida por outros pesquisadores para aumentar a termoestabilidade de uma enzima sem redução na eficiência catalítica (Korkegian e cols. (2005) Science 308, 857). As cargas atômicas parciais para os átomos de resíduo não padrão foram calculadas pelo uso do protocolo padrão RESP implementado mo módulo de Antecâmara do pacote de programa Amber7 (ou 8) (Case, 2002). A modelagem computacional que usa o programa RosettaDesign permitiu a previsão de um conjunto de mutações de CocE calculadas como tendo uma menor energia e, portanto, termoestabilidade aumentada (veja, por exemplo, Tabela 2). Para esse exemplo, a computação considerou apenas as mutações possíveis nos resíduos de aminoácidos que têm uma distância entre 6-25 À da molécula de substrato de cocaína.

Polipeptídeos de CocE de mutação única identificados calculados para estabilizar CocE em cerca de 2,1 a cerca de 4,5 kcal/mol incluíam: L163V (Id. de Seq. N°: 3); V121D (Id. de Seq. N°: 4); S167A (Id. de Seq. N°: 5); Q123E (Id. de Seq. N°: 6); V225I (Id. de Seq. N° : 7); I218L (Id. de Seq. N°: 8); A310D (Id. de Seq. N°: 9); A149S (Id. de Seq. N°: 10); S159A (Id. de Seq. N°: 11); S265A (Id. de Seq. N°:

12) ; S56G (Id. de Seq. Nc : 13) ; W2 2 0A (Id de Seq . N0 : 14) ; T122A (Id de Seq. N0 : 15) ; S140A (Id. de Seq. N0 : 16) ; F189L (Id de Seq. N0 : 17) ; A193D (Id. de Seq. N0 : 18) ; T254R (Id . de Seq. N0 : 19) ; N42V (Id. de Seq. N0 : 20) ; V262L (Id de Seq. N° : 21) ; L508G (Id. de Seq. N0 : 22) ; Y152H (Id de Seq. N0 : 23) ; Vl 6 OA (id. de Seq. N0 : 24) ; T172R (Id de Seq. N° : 25) ; Y532F (Id. de Seq. N0 : 26) ; T74S (Id. de Seq. N0 : 27) ; W285T(Id . de Seq. N° : 28) ; L146P

(Id. de Seq. N°: 29); D533S (Id. de Seq. N° : 30); A194R (Id. de Seq. N°: 31); G173Q (Id. de Seq. N° : 32); C477T (Id. de Seq. N°: 33); K531A (Id. de Seq. N° : 34); R41I (Id. de Seq. N° : 35); L119A (Id. de Seq. N°: 36); K46A (Id. de Seq. N°: 37); e F84Y(Id. de Seq. N°: 38). Tabela 2: Sumário de modelagem computacional co o uso do

programa RosettaDesign com abordagem de consenso

Rl R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 RlO Mutação de consenso Mudança de energia (kcal/mol) 163 163 163 163 163 163 163 163 163 163 L163V -4 , 5 121 121 121 121 121 121 121 121 121 121 V121D -3,9 167 167 167 167 167 167 167 167 167 167 S167A -3,9 123 123 123 123 123 123 123 123 123 123 Q123E -3 , 8 225 310 310 225 225 225 225 310 225 218 V22 5I -3,6 218 225 218 218 218 218 218 225 218 225 I218L -3 , 5 310 218 225 310 310 310 310 218 310 152 A310D -3 , 4 149 149 152 149 149 149 149 149 149 310 A149S -3 , 3 159 159 140 159 159 159 159 159 159 149 S159A -3,3 189 265 149 265 265 265 265 265 189 265 S265A -3 , 3 265 140 265 56 56 56 56 220 265 159 S56G -3 , 2 56 220 159 220 220 220 220 122 56 220 W22 0A -3 , 2 220 122 220 122 122 122 122 140 220 56 T122A -3,1 122 189 122 140 140 140 140 189 122 122 S140A -3,1 140 193 189 189 189 189 189 193 140 140 F189L -3 , 1 254 42 193 193 193 193 193 42 254 189 A193D -3,1 262 262 42 254 254 254 254 254 42 193 T254R -3 , 1 508 508 262 42 42 42 42 262 262 262 N42V -3,0 152 152 508 262 262 262 262 508 508 508 V262L -3 , 0 160 160 198 508 508 508 508 152 152 198 L508G -2, 9 74 198 160 152 152 152 152 160 160 254 Y152H -2, 9 172 74 74 160 160 160 160 198 198 74 V160A -2 , 8 193 172 172 198 198 74 198 74 172 160 T172R -2,8 532 532 532 532 74 172 74 172 74 172 Y532F -2,7 146 146 56 74 172 532 172 532 193 532 T74S -2,7 285 285 285 172 532 146 532 146 532 285 W285T -2,6 533 290 146 285 146 285 146 285 285 290 L146P -2,6 173 254 533 146 285 533 285 533 146 146 194 533 173 533 533 173 533 173 533 533 D533S -2,5 477 56 194 173 194 194 173 194 173 173 A194R -2,4 531 173 200 194 200 290 194 200 194 194 G173Q -2,4 42 194 477 200 290 477 200 290 200 200 C477T -2,4 119 200 531 290 477 531 477 477 290 477 Κ531Α -2,4 200 477 305 477 531 200 531 531 477 531 41 531 41 41 41 41 41 41 531 42 R41I -2,2 46 41 119 119 119 119 119 119 41 119 Lll 9 A -2 , 2 84 119 46 46 173 46 46 46 119 41 Κ4 6Α -2,1 305 46 84 84 46 84 84 56 46 46 F84Y -2,1 478 57 158 478 84 478 305 84 84 57 57 84 307 57 478 57 478 307 478 84 87 478 478 142 57 87 57 478 57 158 142 87 57 263 87 142 87 57 142 478 263 142 142 307 142 263 142 142 263 142 307 263 263 78 263 307 263 263 307 263 78 307 78 257 307 78 307 78 78 78 257 78 257 531 48 257 78 257 257 257 290 257 290 49 78 49 257 49 49 49 291 201 49 201 257 305 201 201 201 201 49 49 201 305 45 291 290 412 305 307 176 291 291 412 49 176 291 291 412 291 45 305 412 291 201 45 49 176 291 176 54 176 176 176 305 54 176 45 45 305 406 45 254 45 291 406 45 413 176 45 50 54 45 413 176 50 54 54 413 54 406 54 54 54 406 305 54 406 50 413 50 406 50 406 406 50 406 406 50 50 50 50

Exemplo 4: parâmetros cinéticos de CocE mutante T172R e S159A

CocE de tipo selvagem e os polipeptídeos de CocE mutante T172R e S159A foram testados para eficiência catalitica.

Mutagênese direcionada a sitio (QuickChange™, Invitrogen) de CocE foi realizada para gerar o polipeptídeo de CocE mutante S159A (Id. de Seq. N°: 11). Técnicas de clonagem e expressão usadas para produzir S15 9A foram as mesmas que no Exemplo 1, exceto quando indicado em contrário. 0 gene de CocE foi amplificado através de Reação em cadeia de Polimerase (PCR) na presença de iniciadores que contêm a mutação específica necessária (Integrated DNA Technologies, Inc.). A mutação específica foi subclonada de volta no plasmídeo de expressão e a seqüência de nucleotídeos desses plasmídeos determinada para verificar a presença da mutação.

Mutante T172R foi gerado por sobreposição de PCR com o uso dos iniciadores 5' e 3' contendo a mutação T17 2R específica, bem como um sítio de enzima de restrição adicional Sac II para facilitar a detecção do gene mutado. Pares de iniciadores CocE 20-5'F-Nde I (5' GATATA CA TA TGG TGGACGGGAATTAC 3') e T172R3'R (51

CAGACCTCGACGTGATGAGCCCGCGGCCTATGAGAGCTGACCAGC 3 ' ) bem como CocE-1800-3 1R (5' GTGGTG CTCGAGTCGCTTGAT AATCG 3') e T172R- ' F ( 5 ' GCTGGTCAGCTCTCATAGGCCGCGGGCTCATCACGTCGAGGTCTG 3 ' ) foram amplificados por PCR com o uso da enzima de alta fidelidade Pfu (Stratagene) com uma temperatura de anelamento de 55°C. Os produtos resultantes de PCR foram combinados e re-amplif içados, gerando um gene de CocE de comprimento total que codifica a mutação T172R. 0 gene foi digerido com Nde I e Xho I; subclonado no vetor de expressão, e seqüenciado em sua totalidade para verificar a presença da mutação e a ausência de mutações de erro adicionais de cópia de PCR.

Plasmídeos que contêm as mutações foram transformados em células de E. coli BL21 e enzima induzida por IPTG foi purificada em Ni-Agarose. As proteínas expressas foram então testadas para atividade enzimática e para termoestabilidade a 37°C. A atividade da enzima foi medida com o uso do ensaio espectrofotométrico como descrito no Exemplo 1. A termoestabilidade foi também testada por meio do ensaio espectrofotométrico por pré-incubação de tipo 2 0 selvagem e mutante a 370C por várias vezes. Adicionalmente, a natureza da termo-instabilidade de T172R de tipo selvagem e mutante foi analisada por eletroforese de gel de poliacrilamida gel sob condições de desnaturação e não desnaturação. Resumidamente, enzima mutante e de tipo selvagem 0,1 mg/ml foram incubadas a 37°C por vários pontos de tempo, resfriadas a 4 °C, misturadas com corante SDSLIoading contendo 8-mercaptoetanol e passadas em gel de SDS-PAGE 10% (condições de desnaturação) ou passadas em géis de poliacrilamida nativa 10% (condições de não desnaturação) a 40C. Os géis foram fixados com 10% metanol, 7% ácido acético por 30 minutos, e então corados com corante em gel de proteína Sypro-Ruby (Molecular Probes, Invitrogen) por 3 horas. A coloração da proteína foi visualizada sob luz UV com o uso de Alphalmager™ 34 00 (Alpha Innotech). Finalmente, a temperatura de fusão exata de T172R de tipo selvagem e mutante foi determinada por dicroísmo circular com o uso de um espectropolarímetro JASCO-810 dirigido por um programa de análise JASCO V500/FP-750 para Windows. Os espetros de CD foram medidos em miligraus e normalizados contra tampão PBS.

Os resultados do ensaio espectrofotométrico mostraram que T172R tinha uma Vmax e Km aumentadas em temperatura ambiente e uma Vmax e Km muito aumentadas a 370C quando comparadas a CocE de tipo selvagem (veja, por exemplo, Tabela 3; Figura 5). De fato, a Vmax e Km de T172R a 37°C foi comparável à Vmax e Km de CocE de tipo selvagem em temperatura ambiente. A CocE mutante S159A mostrou uma Vmax e Km levemente aumentadas a 3 7 °C, mas uma Vmax e Km diminuídas em temperatura ambiente, quando comparadas a 2 0 CocE de tipo selvagem. Eletroforese sob condições de desnaturação (Figura 6a) indicou yma banda única de proteína para T172R e de tipo selvagem de aproximadamente 6.5 000 Da, sem levar em consideração a temperatura da incubação, indicando que a degradação proteolítica não does

2 5 descreve adequadamente o mecanismo para a

termoinstabilidade. Os géis não desnaturados (Figura 6b) mostraram uma banda única de proteína para a enzima de tipo selvagem antes da a 370C, no entanto após incubação a 370C espécies de maior peso molecular são observadas à medida

3 0 que a banda original desaparece. Esses agregados de proteína supostos também podem ser observados para o mutante T172R, no entanto o tempo para agregação sob incubação a 370C é maior, e nesse procedimento o mutante T172R foi aproximado para ter uma meia-vida 8 vezes maior a 370C que o tipo selvagem. A análise da temperatura de fusão da proteína por dicroismo circular (Figura 7) indicou que as mudanças sensíveis à temperatura na estrutura terciária da proteína ocorreram na faixa próxima de UV do espectro (entre 260 nm e 320 nm) . O ajuste da curva de mudanças sensíveis à temperatura nessa região do espectro indicou que a CocE de tipo selvagem tem uma temperatura de fusão de 36,15°C, com desnaturação detectável iniciando em aproximadamente 30°C. 0 mutante T172R foi determinado para ter uma temperatura de fusão de 41,43 °C, com desnaturação detectável iniciando em aproximadamente 28°C. Portanto a mudança de aminoácido único de Tirosina para Arginina no Aminoácido 172, com um aumento estimado de 2,8 kCa/mol na termoestabilidade, foi determinada como tendo uma temperatura de fusão aumentada em 5 graus comparada à CocE 2 0 de tipo selvagem.

Tabela 3: parâmetros cinéticos para T172R, S159A, e CocE de tipo selvagem.

S159A S159A (40 min @ 3 7 ° C ) T172R T172R (40 min @ 3 7 ° C ) CocE de tipo selv. CocE de tipo selv.(40 min@ 3 7 ° C ) Vmax 8 7 6,6 130, 7 1466 1267 1264 94 , 06 Km 43,65 15, 69 88,20 7 8,80 71, 81 12,30

Exemplo 5: prevenção por CocE de tipo selvagem in vivo de letalidade por cocaína em ratos Para determinar a atividade esterática de CocE in vivo, um modelo de toxicidade aguda por cocaína em roedor foi implementado. Quando tratado com altas doses de cocaína, os ratos primeiramente exibiram convulsões seguidas por cessação da respiração e movimento. A menor dose tóxica de cocaína, quando administrada por via intraperitoneal, produzirá fatalidade em 15 minutos de tratamento.

A proteção contra letalidade induzida por cocaína por CocE de tipo selvagem foi determinada e comparada aos efeitos protetores de BchE humana. A atividade esterática de CocE foi estabelecida por avaliação da atividade de duas enzimas mutantes, cada uma desprovida de três aminoácidos no sítio ativo. Adicionalmente, a atividade de uma enzima de tipo selvagem modificada por uma modificação covalente de Serl7 no sítio ativo, por fenilmetil sulfonato fluoreto (PMSF) foi determinada. A degradação estérica de cocaína foi mostrada como sendo o mecanismo de efeitos protetores da CocE por verificação de se a enzima protegeu contra toxicidade induzida por WIN 35065-2 (Madras e cols. (198 9) J Pharmacol Exp Ther 251, 13 -141) , um análogo de cocaína que é desprovido da ponte de éster no sítio proposto de hidrólise enzimática.

Machos de ratos Sprague-Dawley (3 00 gramas) (Harlan 2 5 Sprague Dawley, Indianapolis, IN) foram abrigados em grupos de três por gaiola. Após implante cirúrgico de um cateter na jugular, todos os ratos foram abrigados individualmente até o término do experimento. Os ratos foram mantidos em um ciclo de 12 -h de luz/escuridão, com as luzes ligadas às 7:30 a.m. e alimento e água eram disponíveis ad Iibi tum. Depois dos ratos serem anestesiados com cloridrato de quetamina (100 mg/kg, i.p.) e xilazina (10 mg/kg, i.p.), os cateteres intravenosos (tubo Micro-renetano, 15 cm, MRE- 04 0, Braintree Scientific Inc., Braintree, MA) foram implantados na veia jugular direita. Aproximadamente 3 cm do cateter foram inseridos na veia; o tubo restante foi passado por via subcutânea ao dorso, em que ele saía de uma incisão entre os ombros. O tubo exposto foi coberto com um pedaço de 1 cm de aço inoxidável (0,28 de diâmetro, Small Parts Inc., Miami, FL). Os cateteres foram aspergidos diariamente com 0,5 ml de solução salina heparinizada (50 U/ml) para manter a patência do cateter. Após a cirurgia, os ratos foram deixados por uma semana em recuperação. Cada rato foi usado para um único experimento, e todos os grupos experimentais consistiram em 6-8 ratos.

Para determinar a menor dose eficaz de CocE que bloqueou as convulsões induzidas por cocaína e morte, 0,1,

0.32, ou 1,0 mg de CocE ou veículo (solução salina tamponada por fosfato, PBS) foi administrada por via

intravenosa um minuto após 180 mg/kg de cocaína (i.p.) . Para determinar os limites catalíticos de CocE, doses crescentes de cocaína foram administradas (100, 560, 1000 mg/kg, i.p.) um minuto antes de 1,0 mg de CocE (i.v.). CocE mutantes e bloqueadas por PMSF foram administradas (1 mg, i.v.) um minuto antes de 180 mg/kg de cocaína (i.p.). CocE (1,0 mg, i.v.) foi também administrada um minuto após a menor dose de WIN-35065-2 (560 mg/kg, i.p.). CocE (1,0 mg,

1.v.) foi dada antes e depois da cocaína (100 mg/kg, i.p.) para determinar a meia-vida in vivo da esterase. Todas as

3 0 injeções intravenosas foram seguidas por um fluxo de solução salina heparinizada (0,5 ml). Após o tratamento, os ratos foram observados para convulsão e morte. O número de episódios de convulsão, duração de cada episodio, e tipo de convulsão foram registrados. A morte foi definida como a cessação de movimento observado e respiração. 0 percentual de animais em cada grupo experimental que exibe convulsões e letalidade foram calculados. A média de erro padrão percentual foi então calculada para cad aponto de dado.

Os resultados mostraram que, no modelo de roedor de toxicidade aguda, a dose dependente de cocaína induziu convulsões e morte em ratos; a morte foi observada em menos que 15 minutos após a administração em 100% dos animais que receberam 100 mg/kg cocaína (veja, por exemplo, Figura 9) . CocE (1,0 mg) infundida após a administração de cocaína produziu uma mudança de dez vezes na curva de efeito de dose sobre a toxicidade da cocaína (veja, por exemplo, Figura 9), de modo que 1.000 mg/kg de cocaína foram necessários para superar as propriedades protetoras, catalíticas de CocE. Esse regime de tratamento é muiti similar a situações de toxicidade humana, quando o antídoto para overdose é dado apenas após a cocaína ter sido ingerida, inalada, ou injetada.

CocE de tipo selvagem mostrou eficiência catalítica superior sobre BchE humana. Dada um minuto antes de 180 mg/kg de cocaína, 1 mg de CocE ofereceu 100% de proteção contra a letalidade induzida por cocaína (veja, por exemplo, Figura 10), enquanto uma dose equivalente molar de vezes de BChE humana (13 mg) não ofereceu proteção, similar a uma dose dez vezes menor de CocE (0,1 mg) (veja, 3 0 por exemplo, Figura 10) . Ambas mutações de CocE (Serll7Ala ou Tyr44Phe) são desprovidas de atividade in vivo e, portanto, não tiveram efeitos protetores (Figura 11 b) . Além disso, enzima tratada com PMSF também eliminou o efeito protetor de CocE contra cocaína (Figura 11 b) . Adicionalmente, o efeito letal do análogo não hidrolisável de cocaína g, WIN 35065- 2, não foi superado pelo tratamento com CocE (Figura 12) . Com base em estudos de proteção in vivo realizados com preparações cataliticamente inativadas da enzima (mutantes tratados com PMSF e inativos de CocE) , é claro que os efeitos protetores da enzima são devidos a sua capacidade de hidrolisar cocaína. Juntos, esses dados estão de acordo com as avaliações in vitro da atividade esterática de CocE e confirmam o mecanismo de proteção da enzima contra a letalidade induzida por cocaína in vivo.

Exemplo 6: efeitos dependentes de tempo da CocE de tipo selvagem

Os efeitos da administração de CocE de tipo selvagem antes da dosagem de cocaína foi examinado. 0 modelo de toxicidade de rato foi como descrito no Exemplo 5. CocE de tipo selvagem foi adminstrada 10 0, 30, 10, 3, e 1 minuto antes e 1 e 6 minutos após a administração de cocaína. Extrações de composto de amostras de plasma humano foram realizadas em 100% acetronitrila (3x volume), incubadas por aproximadamente 15 minutos, centrifugadas a 13.000 rpm por 4,5 min, e o sobrenadante resultante foi coletado. Os extratos foram concentrados em um Savant Speed Vac (ThermoElectron Corp., Franklin, MA) para remover a acetonitrila. As amostras extraídas foram reconstituídas em água e também diluídas 10-1000 vezes. Amostras de plasma humano receberam 3 00 μΜ cocaína e foram mantidas a 37°C. Uma alíquota de plasma foi retirada antes da adição de esterase de cocaína ou veículo de esterase, e uma outra alíquota foi coletada 1 minuto após a administração da esterase. Alíquotas de plasma foram misturadas imediatamente com o padrão interno (cocaína-D3) e uma solução saturada de fluoreto de sódio para prevenir metabolismo adicional de cocaína. As extrações de tecido foram realizadas e os níveis de cocaína e padrão interno foram quantificadas por HPLC com espectrometria de massa tandem.

Para inativação dependente de tempo de CocE in vitro, enzima CocE purificada (a 250 ng/ml) foi incubada em tampão de ensaio na ausência de cocaína a 37°C por vários tempos. Após incubação a 37°C as amostras foram colocadas em gelo. Para avaliar o efeito da temperatura sobre a atividade de CocE, amostras foram incubadas com (-) cocaína em várias concentrações como indicado em uma concentração final da enzima de 125 ng/ml. A taxa de deterioração da (-)-cocaína a A24 0 foi medida em um leitor de multiplaca. Os dados foram ajustados a uma deterioração exponencial única com o uso de Kaleidagraph™ (Synergy software) gerando um tj.n de 13 , 2 .

Constatou-se que CocE de tipo selvagem tem efeitos protetores dependentes de tempo; 100% dos ratos foram salvos quando tratados com CocE (1 mg) 1 minuto antes da cocaína, enquanto apenas 66% e 3 2% dos ratos sobreviveram quando tratados com CocE 30 e 1 minuto antes da cocaína, respectivamente (veja, por exemplo, Figura 14) . Os efeitos protetores da CocE foram eliminados quando os ratos foram tratados 100 minutos antes da cocaína. Esse efeito dependentes de tempo é mais provavelmente devido à desativação térmica da enzima in vivo. Em plasma de rato, CocE tem uma meia-vida marcadamente curta (cerca de 10 minutos, Figura 13), mais provavelmente devido à sensibilidade a mudanças no pH e temperatura. Adicionalmente, dados preliminares in vitro com a enzima purificada sugerem que CocE sofre uma inativação dependente de temperatura com um ti/2 de aproximadamente 15 minutos a 3 7 ° C.

Com esses dados, pode-se afirmar que uma dose de 1 mg de CocE administrada 3 0 minutos antes da cocaína, deteriorará aproximadamente 3 meias-vidas, deixando 0,25 mg da enzima de tipo selvagem na circulação geral quando a cocaína for administrada.

Estudos prévios sugeriram que as concentrações sangüíneas letais de cocaína no rato variam entre 50-12 8 μΜ (Mets B and Virag L (1995) Anesth Analg 81, 1033-1038; Mets e cols. (1999) Life Sci 65, 13171328), e níveis plasmaticos 2 0 d épico de cocaína ocorrem cerca de 13 minutos apos uma injeção intraperitoneal (Sun e cols. (2002) J Pharmacol Exp Ther 302, 710-716). Com base na cinética relatada de administração intraperitoneal de cocaína (Sun e cols. (2002) J Pharmacol Exp Ther 302, 710-716), estima-se que 100 e 320 mg/kg de cocaína geraram concentração sangüínea de pico de cocaína de 35 μΜ e 113 μΜ, respectivamente. As concentrações letais da cocaína são de uma magnitude similar em humanos (20-200 μΜ) (Finkle BS and McCloskey KL· (1978) J Forensic Sci 23, 173-189; Wetli and Wright (1979) J Am Med Assoc 241, 2519-2522). Uma vez que 1 mg de CocE de tipo selvagem salvou ratos tratados com essas doses de cocaína (Figura 9) , pode ser justificável prever que a enzima pode proteger contra toxicidade por cocaína em humanos. Além disso, níveis de cocaína medidos com o uso de espectrometria de massa andem de cromatografia líquida de alta performance em plasma humano com 3 00 μΜ cocaína, uma concentração que excede os níveis tóxicos relatados da cocaína, e então tratados com CocE (um equivalente molar de nossa dose in vivo de 1,0 mg), reduziu a concentração de cocaína a aproximadamente 2 μΜ em menos que um minuto (Figura 10).

Proteção contra uma dose LD50 de cocaína em ratos requer um tratamento de 10 mg/kg de BChE (Lynch e cols. (1997) Toxicol Appl Pharmacol 145, 363-371), assumindo que a enzima seja distribuída de modo similar em humanos, uma pessoa de 70 kg deve requerer uma dose de 700 mg de BChE exógena para proteger contra uma overdose. Além disso, não há evidência de que BChE possa agir para reverter a toxicidade por cocaína quando administrada após a cocaína, uma característica necessária de um antídoto para toxicidade por cocaína.

É assim demonstrado que uma dose de 1 mg CocE de tipo selvagem em um rato de 3 00 gramas é suficiente para proteger contra uma dose de cocaína que exceda a LD10 0 (Figura 9) . Adicionalmente, a enzima dada antes, e mais importante, até 6 minutos após a dose LDlOO de cocaína, forneceu proteção da toxicidade (Figura 14) . CocE metabolizou as concentrações de cocaína no soro em 150 vezes em menos que um minuto (Figura 15). 3 0 Apresentados esses dados, prevê-se que 250 mg de CocE administrados a uma pessoa de 7 0 kg após ingestão tóxica de cocaína deve salvar o indivíduo da morte certa. O acima demonstra que CocE de tipo selvagem é uma molécula anticocaína eficiente mas que o tempo de atividade curto da enzima sob condições fisiológicas limita seu valor terapêutico. Tais resultados apontam para a importância da extensão da termoestabilidade de CocE de tipo selvagem. Exemplo 7: prevenção in vivo de CocE mutante T172R da letalidade por cocaína em ratos A atividade hidrolítica de CocE de tipo selvagem e

CocE mutante T172R foi caracterizada e confirmada in vivo por avaliação de sua capacidade de prevenir letalidade induzida por cocaína em ratos.

0 tratamento de animais foi como descrito no Exemplo 5. Doses crescentes de cocaína foram administradas (i.p.) a ratos, e um minuto após, CocE de tipo selvagem (0,32 mg), CocE mutante T172R (0,32 mg), ou veículo foram administrados por via intravenosa. Todas as injeções intravenosas foram seguidas por uma dose de heparina (0,5

2 0 ml) . Após o tratamento, os ratos foram observados para

morte. O tempo até a morte foi registrado pela dosagem de lg/kg de cocaína. CocE de tipo selvagem e T172R (0,32 mg) foi administrada em vários momentos precedendo (1, 10, 30, e 60 minutos) a administração de 320 mg/kp i.p. de cocaína, com os ratos então monitorados para morte.

Os resultados demonstram a capacidade de CocE intravenosa e, especialmente, CocE mutante de reverter ou prevenir os efeitos letais produzidos por cocaína. CocE de tipo selvagem administrada um minuto após a administração

3 0 de cocaína evitou a letalidade e dosagens de cocaína que mataram os ratos de controle e 100% de letalidade não ocorreu até as dosagens de cocaína de lg/kg (veja, por exemplo, Figura 16) . Os ratos tratados com CocE mutante T172R foram capazes de tolerar doses ainda maiores, com lg/kg de cocaína resultando em apenas cerca de 7 0% de letalidade. E os efeitos profiláticos de CocE mutante T172R foi de maior duração que a CocE de tipo selvagem (veja, por exemplo, Figura 17).

Exemplo 8: dose de CocE repetida in vivo em camundongos

Estudos adicionais foram feitos sobre o efeito de CocE

sobre a toxicidade no camundongo, particularmente com relação a doses repetidas.

0 modelo de toxicidade em animal foi similar àquele descrito previamente, exceto como descrito. Machos de

camundongos NH Swiss foram usados. Para injeção intravenosa na cauda, os camundongos são colocados em uma câmara pequena restrita que expõe sua cauda. Uma lâmpada de calor com um bulbo de 250w de infravermelho é colocada cerca de cm da cauda, e deixada por alguns minutos. A cauda é

2 0 então limpa com lenço de álcool e uma agulha de precisão de 3OG 1/2 (Fisher Scientific) , é inserida em uma das veias laterais para infusão. Para verificar se a agulha está na veia uma pequena quantidade de droga é infundida, se na localização correta a solução deve infundir facilmente sem

2 5 qualquer indicação de um localização subcutânea incorreta,

o que aparece branco no local da injeção. Para cateterização intravenosa, machos de camundongos NIH Swiss são anestesiados com quetamina 100 mg/kg e xilazina 10 mg/kg co-administradas i.p. quando os camundongos não são

3 0 mais responsivos à pressão na pata, o pescoço é raspado e preparado por alternação de Betadina e lenços de álcool. Sob condições limpas, uma incisão no pescoço transversa direita é feita e a veia jugular externa é isolada. Um cateter é inserido na veia com a ajuda de um microscópio de dissecção ao nível do átrio direito, e é preso à veia com suturas de nylon, 4-0 e adesivo de tecido, 3M Vetbond (3M Animal Care Products, St. Paul, MN) . Os cateteres são um comprimento curto de tubos Tygon com um diâmetro interno de 0,025 cm e um diâmetro externo de 0,076 cm. (Small Parts, Inc., Miami Lakes, FL). Uma incisão pequena é feita no meio do dorso do animal, e um trocar inserido por via subcutânea para sair no local de incisão ventral. 0 cateter é então puxado através do trocar e trazido para fora do dorso do animal onde ele é mantido no lugar com material de sutura de nylon e o adesivo de tecido. Um pequeno pedaço de fio de aço com um diâmetro de 0,028 cm (Small Parts, Inc., Miami Lakes, FL) é inserido no final do cateter. A incisão ventral é fechadas com um material de sutura 4-0 de Vicryl e o camundongo colocado sob uma lâmpada de calor para

2 0 recuperação. Aproximadamente uma hora depois, o camundongo

é devolvido a sua gaiola.

Camundongos que sobreviveram a uma primeira administração da combinação de 0,32 mg CocE e 320 mg/kg de cocaína receberam essa combinação novamente, 14 dias após a administração inicial. Todos os camundongos sobreviveram a essa segunda administração. Todos os camundongos também sobreviveram a uma terceira administração 21 dias após a primeira combinação de dose. A eficácia da administração repetida sugere que uma forte resposta imune não está sendo

3 0 montada a CocE nessa preparação, talvez por causa de seu rápido clearance.

Os resultados mostraram que um deslocamento dramático para a direita na potência da cocaína na produção de morte foi gerada por 0,32 e 1,0 mg/kg cocaína (veja, por exemplo, Figura 18). A latência até a morte foi marcadamente estendida por CocE: após 18 0 mg/kg i.p. de cocaína, os camundongos tipicamente morreram em cerca de 3 minutos. Depois de uma dose de 1,0 gm/kg de cocaína mais 1,0 mg de CocE, a morte ocorreu em 2 8 minutos em média. Os dados também foram examinados para a capacidade de hBChE de bloquear a toxicidade de cocaína. Em uma dose de 1 mg, hBChE produziu um leve aumento na dose de cocaína necessária para matar os camundongos (veja, por exemplo, Figura 18) . Essa enzima é marcadamente menos eficaz que CocE. Embora doses maiores de cocaína tenham sido necessárias para matar os camundongos após administração de hBChE, o tempo até a morte não foi modificado por essa enzima.

Exemplo 9: meia-vida in vivo e testes de biodistribuição

A meia-vida in vivo e biodistribuição dos

polipeptídeos de CocE mutante são examinados em camundongos BALB/c. Resumidamente, 125I é rotulado aos resíduos de tirosina de CocE mutante pelo uso do método de iodinação bem estabelecido cloramina-T (Hunter, WM and Greenwood, FC (1962) Nature 194, 495-496). Os camundongos BALB/c são injetados por meio das veias da cauda com 0,1 mL de CocE mutante rotulado com 0,5 μΟί 125I ou os conjugados CocE mutante-PEG. Cada grupo experimental consiste em 24 camundongos. Três camundongos são sacrificados por 3 0 deslocamento cervical nos intervalos de tempo de 15-, 30-, 90-minutos, 3-, 12-, 24-, 48-, e 72-horas após a injeção da droga. Amostras de sangue bem como amostras de tecido de fígado, pulmão, coração, rim, e baço são coletadas, pesadas e medidas para radioatividade usando um contador gama. As amostras de sangue são também centrifugadas, e os sobrenadantes serão coletados e contados para estimativa de radíolabels associados ao plasma. A proporção do pico para aquela do padrão interno é usada como o parâmetro do ensaio. Parâmetros PK são calculada pelo uso do programa de

computador de quadrados mínimos não linear KINFT (Kaltenbach, ML and Vistelle, R (1994) Anticancer Research 14, 2375-2377) por ajuste dos dados de radioatividade do plasma a uma equação biexponencial (Gibaldi, M. and Perrier, D. (1982) Pharmacokinetics):

15

A(t) - A*e"V + Aie-V

Em que A(t) = %ID/mL plasma e ID = dose injetda. k2 será usado para calcular o tempo de eliminação de primeira ordem tx/2. A área sob a curva (AUC) a curva concentração

2 0 plasmática-tempo, o volume de estado estável de

distribuição (Vss), clearance plasmático total (CI), e the o tempo de residência médio (MRT) são calculados de Ai, A2, ki, k2, e o peso corporal (kg) do camundongo como descrito por Gibaldi e Perrier, 1982). 0 produto da área de

permeabilidade- superfície do órgão (PS) é calculado como:

PS - (Vd.Ve]CP(e0mln)/AUC({veOfriiri)

Em que CP(60min) é a concentração plasmática terminal (dpm/μυ a 60 minutos após injeção, Vd é o volume de

3 0 distribuição de tecido determinado a partir da proporção de desintegrações por minuto por grama de tecido para CP (60min) λ e V0 é o volume plasmático do órgão. A liberação pelo órgão das amostras é determinada como:

%ID/g = PS XAUCitwomlfl,

5

Em que %ID/g é a dose percentual injetada tomada por grama de órgão. Exemplo 10: imunologia

CocE pode ser usada em adjuvante incompleto de Freund

(IFA) para imunizar camundongos (veja Tabela 4) . Um ELISA direto específico para anticorpos de CocE foi estabelecido por um protocolo padrão. CocE foi usada (1 ug/ml) para cobrir uma placa de microtítulo de 96 cavidades com o uso de solução salina tamponada por borato (1,5 M NaCl, 0,5 M

H3BO3, 1,0 M NaOH) para ressuspender a esterase de cocaína (50 uL/cavidade). As placas cobertas foram deixadas de um dia para o outro a 4°C. 0 tampão de cobertura foi removido e manhã seguinte e as placas bloqueadas com 2% soro de cabra normal em PBS por 1 hora a 370C e lavadas três vezes.

2 0 Soro dos vários grupos de camundongos foi serialmente diluído em 50 μ]^ de PBS nas cavidades em uma faixa de IO2 a IO1 e passado em duplicata. As placas foram cobertas e incubadas por 3 0 minutos a 37°C. Subseqüentemente, as placas foram lavadas 3 vezes e 5 0 μL/cavidade de anticorpo

2 5 rotulado com peroxidase de IgG anti-camundongo de cabra

diluído a 1:400. As placas foram então lavadas 3 vezes e 0 μ]1ι de solução de substrato de peroxidase (OPD dissolvida em tampão de citratelfosfato) foram adicionados a cada cavidade. Depois de uma incubação de 5-10 minutos

3 0 (baseada no desenvolvimento de cor nos controles positivos) a reação foi interrompida com o uso de 3M H2SO4 (50 μL/cavidade) . As placas foram lidas a 490 nm e os títulos determinados pela maior diluição que mostrou aumentos sobre a absorvência de base. Controles positivos foram derivados por imunização de camundongos Balb/c com 100 μ9 em 10 0 μΐ; de Esterase de cocaína emulsifiçada em adjuvante incompleto de Freund (IPA) por injeção intraperitoneal (IP). No grupo positivo 1 o soro foi isolado de camundongos imunizados de 2 semanas. No grupo positivo 2 os camundongos imunizados receberam reforço com o uso de 100 μg em 100 μΐι por injeção IP 2 semanas após a imunização primária e o soro coletado após mais uma semana (3 semanas após primária).

Altos títulos foram derivados dos dois grupos de controle positivo imunizados com CocE, IO5 e IO6, respectivamente. Os títulos de anticorpo de animais que receberam CocE i.v. durante as administrações de cocaína demonstraram títulos detectáveis mas relativamente baixos comparados aos animais de controle positivo imunizados por CocE mais IFA. Soro coletado de animais imunizados uma vez 2 0 com CocE/IFA demonstraram maior título de IO5, enquanto soro de animais que receberam uma dose de reforço adicional tiveram um título maior de IO6 (3 camundongos/grupo). 0 soro coletado desses animais servirá como controles positivos para todos os experimentos subseqüentes de titulação.

Tabela 4: títulos de CocE de camundongos imunizados

Grupo Protocolo Título(IoglO diluição +1- SE Positivo 1 (n=3) 2 semanas Imunizado (IFA/IP) 5 Positivo 2 (n=3) 3 semanas Imunizado / reforço (IFA/IP) 6 Administrado e tratado (3x) CocE dada com cocaína 3,33 ± 0,333 Administrado e tratado (4x) CocE dada com cocaína 3,5 ± 0,5

Exemplo 11: peguilação de CocE

A conjugação de um a dois polímeros de PEG por molécula de enzima é geralmente suficiente para gerar os efeitos protetores desejados (Avramis e cols. (2002) Blood 99, 1986-1994) . Pelo fato de que cada molécula de CocE de tipo selvagem ser relatada como contendo 8 resíduos de lisina, com nenhum no sítio ativo ms apenas 2 sendo próximos ao sítio ativo (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307) , é improvável que o direcionamento de lisina para peguilação inative a enzima. A CocE mutante é misturada com vários polímeros de monometoxi-PEG (m-PEG) (peso molecular variando de 3-12 KDa) ; todos contêm um grupo hidroxisucciniil éster funcional de N-extremidade ativada (mPEG-NHS; de Shear Water Inc., Birmingham, AL). PEG com um peso molecular de 5,5 KDa será a primeir tentativa, porque os resultados dos inventores e aqueles de outros investigadores (veja, por exemplo, Veronese, FM and Harris, JM (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 453- 456; Avramis e cols. (2002) Blood 99, 1986-1994) demonstraram que esse peso molecular gera a proteção benéfica. Diferentes proporções molares de [NH2] : [mPEG] (a primeira é calculada com base nos moles totais de resíduos de lisina de CocE mutante) variando de 1:2 a 1:10 são testados para obter condições ótimas. A conjugação prossegue por cerca de 40 minutos a 40C com leve agitação. Os produtos da reação são então purificados por ultrafiltração (MWCO 10.000) at 4°C. As atividades dos produtos de CocE mutantes peguilados são determinadas por medição das taxas iniciais de hidrólise de cocaína com o uso do procedimento previamente estabelecido (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307). Em adição, espectrofotometria de massa MALDi-TOF é realizada nesses produtos para analisar o grau de peguilação e seu peso molecular. Os produtos peguilados são estocados a -40°C e descongelados imediatamente antes de seus usos.

A caracterização padrão, incluindo determinação do pH, temperatura, força iônica ótimos, bem como parâmetros cinéticos (por exemplo Km, Vm) , dos conjugados de CocE mutante-PEG são conduzidas em PBS. Além disso, a estabilidade térmica dos produtos peguilados e sua estabilidade contra degradação proteolítica são examinadas na presença de plasma ou sangue humano. Testes funcionais in vivo dos produtos de CocE mutante-PEG são conduzidos como acima descrito. A meia-vida in vivo e biodistribuição dos conjugados de CocE mutante-PEG, quando comparados a CocE livre são conduzidas como acima descrito (veja o Exemplo 9).

Análise estatística é realizada nos resultados obtidos dos experimentos de peguilação. ANOVA de duas vias de bloqueio aleatório com pós-teste de Dennett é realizada em conjuntos de dados com duas variáveis com o uso de GraphPad (San Diego, CA) Prism para Windows e Software GraphPad. Teste t pareado é realizado para experimentos com duas condições. A conjugação de CocE mutante a PEG ramificado de alto peso molecular (por exemplo, até 60 KDa) pode ser também realizado (veja, por exemplo, Reddy e cols. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 571-586).

Adicionalmente, peguilação específica a sítio pode ser

uma alternativa viável para reduzir heterogeneidde funcional e estrutural. A remoção de resíduos de cisteína próximos ao sítio ativo ou incorporação dos resíduos de cisteína na superfície da proteína pode servir como melhor substrato de peguilação (através de ligação de maleimida). De modo similar, a ligação a amina de PEG a CocE pode ser empregada através, por exemplo, da substituição conservadora de resíduos de arginina por qualquer um dos de CocE mutante (nove lisinas no total em CocE de tipo selvagem, sete das quais são lisinas de superfície).

Achados preliminares mostraram que CocE de tipo selvagem (WT) foi ligada de forma bem-sucedida com polímeros de monometoxi-PEG (m-PEG) (peso molecular: 5,5 KDa) contendo um grupo funcional an succinimidil ativado em

2 0 uma extremidade, com o uso dos procedimentos acima

descritos. Um alto rendimento da atividade inicial de CocE (>70%) foi recuperado depois da reação de peguilação. Espectros de massa MALDI-TOF revelaram quatro picos primários para os produtos PEG-CocE, indicando a presença de uma mistura heterogênea dos conjugados que contêm diferentes números das cadeias de PEG (variando de 1 a 4, respectivamente) (veja, por exemplo, Figura 19). Foi sugerido na literatura que a conjugação de apenas 1-2 cadeias de PEG por molécula de proteína seria capaz de

3 0 gerar efeitos protetores induzidos por PEG (Veronese, FM and Harris, JM (2002b) Advanced Drug Delivery Reviews 54, 457-606; Avramis e cols. (2002) Blood 99, 1986-1994). Nesse aspecto, o método de peguilação aqui empregado aparentemente satisfaz tal requisito.

Exemplo 12: encapsulação em hemáceas

A encapsulação em hemáceas de CocE pode ser realizada por meio de um peptídeo PTD ligado. LMWP é seleciondo como o peptídeo PTD para transportar CocE mutante ns hemáceas, por causa de sua potência nas proteínas de translocação por toda a membrane celular (Park e cols. (2005) FASEB Journal, in press) e de sua ausência de toxicidade (Chang e cols. (2001) AAPS Journal 3, Artigo #17, #18 e #19) . Para assegurar que a CocE mutante encapsulada seja permanentemente incorporadas na hemácea, a ligação entre CocE e LMWP pode degradar automaticamente e rapidamente uma vez que os conjugados de CocE mutante-LMWP entran na hemácea. Um ligante como uma ligação de dissulfeto (S-S) que será degradada rapidamente dentro da hemácea devido à presença de atividade citosólica elevada de glutationa e redutase (Trouet e cols. (1982) Proceeding of the National Academy of Science 79, 626-629), assegura que a CocE permanecerá na hemácea.

Para produzir conjugados de CocE mutante-LMWP ligados com ligações S-S, o grupo amina na N-extremidade de LMWP (esse é o único grupo -NH2 em LMWP) é primeiramente ativado com SPDP, e a LMWP ativada então é misturada com CocE mutante na presença de ditiotretol (DTT) para permitir a formação da ligação S-S com um dos resíduos de cisteina livres (quatro em de tipo selvagem) em CocE mutante (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307); de acordo com um procedimento modificado previamente desenvolvido (Liang e cols. (2000) AAPS Pharmaceutical Science 2, Artigo 7) . CocE é estável quando sendo estocada em DTT (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12297-12307), sugerindo que o uso desses grupos de cisteína livre para conjugação não deve prejudicar a atividade catalítica dessa enzima (mutação já realizada de cada cisteína em CocE de tipo selvagem para uma serina resultou em diminuição da atividade). Os produtos finais LWMP-CocE são então purificados via uma coluna de heparina, e são estocados por Iiofilização.

A encapsulação é realizada por incubação de hemáceas com CocE mutante-LMWP por 30-60 minutos. Pelo fato de a entrada na célula mediada por PTD ser independente de temperatura (Schwarze e cols. (1999) Science 285, 1569- 1572) , a encapsulação é conduzida a 40C para preservar a funcionalidade de hemáceas. 0 processo e extensão do aprisionamento de CocE mutante em hemáceas é monitorado por microscopia confocal e ana'lise de citometria de fluxo com o uso de CocE mutante rotulada por FITC. A morfologia de

2 0 CocE mutante aprisionada em hemáceas é também examinada por

SEM.

A caracterização básica, incluindo avaliação da funcionalidade de hemáceas (por exemplo atividade de transferência de oxigênio) e de CocE mutante (por exemplo atividade de hidrólise de cocaína, propriedades cinéticas como Km, Vm etc.), escapamento de CocE mutante de hemáceas (ou seja, por incubação de hemáceas carregadas com CocE mutante em tampão então medição da atividade da enzima no sobrenadante), e estabilidade d CocE mutante aprisionada

3 0 contra degradação proteolítica, é conduzida em tampão ou em plasma. S resultados obtidos para a CocE mutante encapsulada em hemáceas são comparados com aqueles obtidos para a enzima livre. Testes funcionais in vivo da CocE mutante-encapsulada em hemáceas são conduzidos como acima descrito.

Hemáceas humanas (da Cruz Vermelha Americana, Detroit, MI) são usadas para estudos in vitro. Para estudos animais in vivo incluindo os testes funcionais e estudos de farmacocinética, no entanto, hemáceas autólogas da mesma espécie animal são usadas para evitar incompatibilidade celular e possíveis efeitos tóxicos.

A meia-vida de circulação it1/2) de CocE mutante- aprisionada em hemáceas é determinada por injeção de CocE mutante rotulada com 125I (ou seja, antes de sua carga nas hemáceas) em camundongos, de acordo com os mesmos procedimentos acima descritos. Cada conjunto de experimentos consiste em 24 camundongos. Os camundongos (3) são sacrificados em intervalos de tempo de 3-, 6-, 12-, 24- horas e 3-, 6-, 10-, e 15 dias. Amostras de sangue e amostras de tecido são coletadas, pesadas e medidas para radioatividade. Os parâmetros de PK incluindo a ti/2 de eliminação, em como distribuição de tecido são calculadas pelo uso do programa KINFT como acima descrito. os resultados de farmacocinética obtidos para a CocE mutante encapsulada em hemáceas são comparados com aqueles obtidos para CocE mutante livre.

Análise estatística é realizada nos resultados obtidos dos experimentos de encapsulação em hemáceas. ANOVA de duas vias de bloqueio aleatório com pós-teste de Dennett é realizada em conjuntos de dados com duas variáveis com o uso de GraphPad (San Diego, CA) Prism para Windows e Software GraphPad. Teste t pareado é realizado para experimentos com duas condições.

Para examinar se o previamente sugerido pode cumprir os dois últimos requisitos, estudos preliminares de encapsulação em hemáceas mediada por PTD foram conduzidos usando L-asparaginase como uma enzima modelo. LMWVP, um peptídeo de PTD previamente desenvolvido no laboratório de Dr. Yang (Chang e cols. (2001) AAPS Journal 3, Artigo #17, #1, e #19) com atividade provada, potente de penetração em membrana (Park e cols. (2005) FASEB Journal, em impressão), foi ligado a asparaginase com o uso de um procedimento similar àquele acima descrito. Os conjugados LMWP-ASNase foram então incubados com hemáceas (coletadas de camundongos DBA/2) por 2 horas a 4°C. Para comparação, hemáceas fantasmas contendo ASNase encapsuladas foram também preparadas de acordo com os procedimentos previamente estabelecidos (Updike e cols. (1976) Science 193, 681-683). Resultados preliminares demonstraram que a 2 0 eficiência de carga do método mediado por LMWP foi pelo menos comparável, se não melhor, à técnica convencional, de ruptura célula com base em osmose. Uma vantage m principal do método mediado por PTD, entretanto, é que ele apenas requer uma única etapa para processamento; diferente dos

2 5 outros métodos de entrada em célula que requerem todos

múltiplas etapas dos procedimentos de carga e lavagem.

A Figura 2 0 apresenta imagens de microscopia de rastreamento de elétrons (SEM) feitas a partir de amostras de hemáceas normais, hemáceas fantasmas carregadas com

3 0 ASNase, e hemáceas carregadas com LMWP-ASNase. Como observado, embora as hemáceas carregadas com ASNase do método de ruptura osmótica/re-selagem (ou seja hemácea fantasma) exibissem mudança significativa no formato e morfologia, as hemáceas carregadas com LMWP-ASNase mostraram formato e morfologia praticamente indistinguíveis (ou seja disco bicôncavo) daquele de hemáceas normais. Esses achados estão de acordo com aqueles relatados por vários outros investigadores de que a encapsulação celular mediada por PTD não causa qualquer perturbação significativa ou alteração da membrana celular (Dietz, GPH and Bahr, M (2004) Molecular Cell Neurosciences 27, 85-131; Schwarze e cols. (1999) Science 285, 1569-1572; Suzuki e cols. (2002) Journal of Biological Chemistry 25, 2437- 2443) .

Para também avaliar esses dois sistemas de

encapsulação em hemáceas, fora realizados estudos preliminares de clearance. A meia-vida da atividade de ASNase em plasma foi avaliada após injeção intravenosa de: (1) hemácea fantasma carregada com ASNase, and (2) hemácea carregada com LMWP-ASNase. Cada grupo de animais consistiu em 4 camundongos DBA-2, e cada camundongo recebeu 8 unidades de atividade de ASNase carregada. As amostras de sangue foram retiradas em diferentes intervalos de tempo da vaia da cauda, e a quantidade de atividade de ASNase no sangue total foi medida por Nesslerization direta de amônia produzida (Ho e cols. (1970) Journal of Biological Chemistry 245, 3708-15) . Os resultados demonstraram que havia quase um aumento de duas vezes na meia-vida de circulação para as hemáceas encapsuladas com LMWP-ASNase 3 0 (ti/2: 9,2 dias) comparada àquela (t1/2: 5,9 dias) para a hemácea fantasma (veja, por exemplo, Figura 21) . É atualmente desconhecida qual é diferença entre as meias- vidas das hemáceas encapsuladas e as hemáceas normais, não tratadas. Não obstante, esses resultados de aumento de 2 vezes de ti/2 sobre hemácea fantasma demonstram o mérito dessa abordagem, uma vez que foi relatado na literatura que mesmo por utilização do método de encapsulação em hemácea fantasma, a atividade in vivo de ASNase já foi prolongada de 2 6 horas para a ASNase livre para 2 9 dias para a ASNase encapsulada em hemácea fantasma (Kravtzoff e cols. (1996) European Journal of Clinicai Pharmacology 49, 465-470): já um aumento de 10 vezes. Portanto, um outro aumento de 2 vezes dessa t±/2 pelo método de encapsulação aqui descrito é particularmente eficaz. Para confirmar que a ASNase encapsulada em hemáceas

ainda retém suas funções biológicas originais, efeitos antitumor pela ASNase de hemácea fantasma e hemácea-ASNase foram examinados em camundongos que portam turmor. células de Iinfoma de camundongo L5178Y foram cultivadas, e a cada 2 0 camundongo DBA/2 7xl05 de células de câncer foram injetadas por via intraperitonial. Cinco dias depois do implantate do tumor, os camundongos com pesos corporais similares foram selecionados e divididos em três grupos: (1) grupo de controle recebeu solução salina apenas; (2) hemáceas fantasmas carregada com ASNase; e (3) hemáceas carregada com LMWP-ASNase. Cada grupo consistiu em 5 camundongos, e cada camundongo experimental recebeu 0,1 mL da hemácea encapsulada com droga (ou fantasma). Os resultados mostraram que os tempos de sobrevivência médios para os grupos de controle não tratado, tratado com ASNase-henacea fantasma, e tratado com hemácea LMWP-ASNase foram 10,0, 12,6, e 14,4 dias, respectivamente (veja, por exemplo, Figura 22) . Deve ser observado que embora o tempo de sobrevivência entre os três grupos tenha diferido em apenas cerca de 2 dias, os efeitos do tratamento pala ASNase encapsulada em hemáceas foi ainda bastante dramáticos; considerando o fato de que apenas 0,1 mL da suspensão de hemáceas, que foi equivalente a apenas 5% do volume total de sangue do camundongo, foi dada a cada camundongo para o tratamento antitumor. No geral, esses achados com o modelo de enzima ASNase demonstram que a enzima encapsulada em hemáceas era ainda terapeuticamente ativa. Deve-se notar que a cocaína é mais permeável através da membrana da hemácea que o substrato de asparaginase. Portanto, a utilização de CocE encapsulada em

hemáceas no tratamento de condições relacionadas à cocaína é uma abordagem eficaz porque a cocaína cruza facilmente a membrana da hemácea (e realmente se concentra na hemácea) (Javaid e cols. (1978) Journal of Cromatografia 15, 105- 113) , a encapsulação mediada por PTD não altera as propriedades físicas e/ou químicas das hemáceas, e a enzima encapsulada em hemáceas funciona como se fosse livre. EXEMPLO 13: REMOÇÃO DE END0T0XINA

A descontaminação por endotoxina de mutantes de CocE pode ser realizada de várias formas. Idealmente, a descontaminação de endotoxina diminui a concentração a níveis de menos de 10 EU/mg proteína. Métodos de descontaminação incluem condições alternativas de cromatografia em coluna de troca iônica, de exclusão de 3 0 tamanho polietilenoimina (PEI) e cromatografia em coluna hidrofóbica, ultrafiltração e extração de detergente. Um sistema de detecção de endotoxina (PYROGENT 5000, Cambrex) é usado para determinar o teor de endotoxina de preparações. O ensaio é baseado no fator anti-LPS de lisado de Liwulus amebocyte (LAL). A sensibilidade do ensaio é entre 0,01 e 100 EU/ml, dentro dos níveis de necessários. 0 ensaio espectrofotométrico é projetado em um formato de placa de microtitulação de 96 poços. O fracionamento da endotoxina e da CocE e/ou mutante de CocE pelos procedimentos seguintes pode ser testado tanto quanto ao nível de endotoxina quanto à atividade de esterase de cocaína. A atividade de esterase de cocaína é medida utilizando-se um ensaio espectrofotométrico que se beneficia da absorção intrínseca de cocaína a 24 0 nm. Mediante hidrólise, os espectros de absorção revelam uma redução dramática no pico a 24 0 nm (Turner e cols. (2002) Biochemistry 41, 12.297-12.307).

Cromatografia de troca aniônica: as condições atuais envolvem o uso de cromatografia líquida performance rápida (FPLC) em uma coluna Q-Sefarose em pH 8,0 para descontaminação de endotoxina. As condições de tamponamento (pH) podem ser otimizadas para maximizar tanto a adsorção de CocE e/ou de mutante de CocE quanto a separação de endotoxina. Fluted frações são testadas por medida da atividade de CocE ou atividade de mutante de CocE (ensaio espectroscõpico da hidrólise de cocaína, absorção a 240 nm) . Os níveis de endotoxina são avaliados usando PYROGENT 5000 (acima).

Cromatografia por exclusão de tamanho e ultrafiltração: a endotoxina pode existir como formas monoméricas (PM -1-2 χ IO4) ou em forma micelar (PM ~4 x IO5 a 1 χ IO6), dependendo das condições de tamponamento. A presença de detergentes como colato favorece a forma monomérica, enquanto cátions divalentes (por exemplo, Ca2+) favorece a forma micelar (Hirayama, C. e Sakata, M. (2002) Journal of Chromatography B Analytical Technology Biomedical Life Science 781, 419-432). Essa propriedade da endotoxina é usada para separar a forma micelar (ou seja, na presença de cátions divalentes como Mg2+; ou Ca2 + ) da CocE e/ou mutante de CocE por cromatografia de filtração de gel usando uma resina de coluna Sefadex 75 ou Sefadex 200 (Pharmacia). A endotoxina micelar não deve ser retida na coluna e deve passar através do espaço vazio, enquanto CocE e/ou mutante de CoeE deve eluir como uma proteína monodispersa que corresponde a uma proteína de 65 kDa. Similarmente, a capacidade de unidades de ultrafiltração para separar as formas micelares de endotoxina de CocE e/ou mutante de CocE será avaliada. Unidades de ultraf iltração são agora disponíveis com valores de corte de peso molecular de 3 χ IO5 a 1 χ IO6, dentro da faixa necessária para reter a endotoxina micelar, mas não a própria CocE.

Cromatografia em polietilenoimina: Mitzner e cols . (1993) e Morimoto e cols. (1985) utilizaram PEI imobilizado em glóbulos de celulose ou em fibra de celulose, 2 5 respectivamente, para remove endotoxina de preparações cie BSA. A cromatograf ia coluna PEI é uma permutadora de anions muito fraca que pode, na verdade, se beneficiar de algumas propriedades hidrofóbicas da endotoxina e, dessa forma, absorvê-la preferencialmente. Várias preparações cie glóbulos de PEI-sílica são disponíveis por Sigma., dependendo do tamanho do glóbulo. Embora glóbulos de sílica estejam mais classicamente associados às aplicações de HPLC, nos compactaremos as colunas para um funcionamento em uma pressão menor e selecionaremos tamanhos de trama de 200 μιη.

Extração com Triton X-114: a separação de fase com Triton X-114 tem sido usada com sucesso para separar endotoxina de albumina e catalase (Aida, Y. e Pabst, M.J. (1990) J. Iwmunological Methods 132, 191-195). Adia e Pabst relatam uma diminuição de 1.000 vezes na concentração de endotoxina após uma única etapa de extração Triton X-114. Amostras de CocE e de mutante de CocE são incubadas com volumes iguais de Triton 114 e, são incubadas primeiramente no gelo, e depois a 37°C por 15 minutos. A fase Triton X- 114 que contém a endotoxina é removida por centrifugação. Como observado anteriormente, foi demonstrado que CocE é consideravelmente termolábil, mas pode ser um pouco protegida pela presença do substrato, cocaína. Caso a incubação de CocE com Triton X-114 a 37°C resulte em uma inativação significativa de CocE, a enzima será estabilizada por inclusão de substrato em excesso durante a extração.

EXEMPLO 14: MUTAGÊNESE DO ORGANISMO HOSPEDEIRO DE CocE

Há várias cepas bacterianas que exibem crescimento

2 5 sensível à temperatura em subprodutos de esterase de

cocaína, incluindo várias cepas de Pseudomonas, e esses organismos podem ser adaptados para crescimento sensível ã temperatura em cocaína por adição do gene de CocE codificado dentro de vetores de plasmídeo adequados. Por

3 0 exemplo, o gene CocE foi originalmente seqüenciado a partir de Rhodococcus MBl por subclonagem de fragmentos gênicos em Rhodococcus erythropolis CW25, uma bactéria incapaz de metabolizar cocaína, mas capaz de crescer nos subprodutos de esterase de cocaína éster metílico e benzoato de ecgonina (Bresler e cols. (2000) Applied & Environmental Microbiology 66, 904-908) . 0 gene CocE foi subclonado em vetores shuttle pJAK-14 e pMMB67EH (veja, por exemplo, o Exemplo 1) . Esses plasmídeos são capazes de expressão em qualquer bactéria gram-negativa, incluindo Pseudomonas, e adicionalmente o plasmídeo pMMB67EH permite altos níveis de expressão e facilidade de transformação por conjugação bacteriana com o uso do plasmídeo auxiliar pRK2013. A transformação do plasmídeo em bactérias que exibem crescimento sensível à temperatura em subprodutos de esterase de cocaína (por exemplo, cepas de Pseudomonas), permite o crescimento sensível â temperatura em placas que contêm cocaína como a única fonte de carbono. A mutagênese tanto do Rhodococcus MBl original quanto das cepas de Pseudomonas que contêm CocE plasmídeo é realizada usando radiação com luz UV a 260 nm. A exposição é administrada de tal forma que 90-95% das células sejam mortas. As células restantes são recuperadas em meios nutrientes por 1 hora a 26°C, coletadas e enriquecidas na presença de cocaína, como descrito previamente (Britt, e cols. (1992) Journal of Baeteriology 174, 2.087-2.094). 0 enriquecimento é realizado a 37°C para a seleção de variantes termoestáveis da CocE. Finalmente, as células são plaqueadas em placas de ágar com meio mínimo contendo cocaína 10 mM, e incubadas a 370C. Colônias únicas se desenvolvem e são testadas quanto 3 0 à atividade de CocE a 37°C. A amplificação por PCR do gene CocE é realizada nos mutantes encontrados para produzir CocE ativa e solúvel a 37°C, e os produtos de amplificação são subclonados no plasmídeo pET-22B(+) para caracterização adicional. Como um prelúdio da mutagênese de CocE, pode ser necessário efetuar a mutagênese das cepas nativas de Pseudomonas a fim de pré-selecionar nenhuma sensibilidade à temperatura a 3 7 0C quando desenvolvidas em produtos da hidrólise de cocaína, e que depois demonstrem sensibilidade à temperatura em cocaína a 370C após clonagem em CocE.

EXEMPLO 15: MÉTODO DE RASTREAMENTO DE ALTO RENDIMENTO PARA IDENTIFICAÇÃO DE MUTANTES DE CocE TERMOESTÁVEIS

Vários métodos de rastreamento de alto rendimento para identificação de variantes de CocE termoestáveis foram implementados. Como a enzima de tipo selvagem é conhecida

por ter instabilidade térmica em temperaturas acima de 3 O ° C, após transformação em células de E. coli BL21, as colônias são subcultivadas e a expressão de proteína induzida a 16°C. As proteínas expressas são então testadas quanto à atividade de esterase em temperaturas 3O0C e

acima. Após várias rodadas de mutagênese e testes em temperaturas crescentes, são obtidos mutantes

termoestáveis. Cada mutante de CocE individual é então preparado, purificado e testado quanto à atividade e termoestabilidade a 37°C, como descrito acima (veja os

2 5 Exemplos 1 e 4).

Colônias bacterianas contendo polipeptídeos mutantes são rastreadas diretamente das placas de ágar por impressão em filtro de nitrocelulose de réplicas de placas, seguida por Iise das bactérias e fixação de proteína. A

3 0 determinação da enzimática atividade em várias temperaturas é obtida por monitoramento do acúmulo de ácido benzóico, o subproduto ácido de (-)cocaína. Uma impressão úmida de nitrocelulose é colocada sobre um papel de filtro seco previamente saturado com uma mistura de cocaína em pH 7,4, sem tampão, e um indicador de pH que apresenta uma transição de incolor a cor mediante acidificação, por exemplo, vermelho metil. A enzima ativa é identificada por mudança de cor, e as colônias são adequadamente coletadas. O método detecção baseado na acidificação por meio da formação de ácido benzóico é empregado para a detecção da expressão celular de anticorpos catalíticos que hidrolisam cocaína no grupo éster de benzoila, o mesmo local clivado por CocE. Alternativamente, a detecção por impressão de nitrocelulose é obtida por exposição a um derivado tiol de cocaína e subseqüente detecção de grupos sulfidrila por meio de sistema indicador por precipitação de metal pesado (por exemplo, baseado em mercúrio).

Colônias bacterianas que contêm polipeptídeos mutantes também são rastreadas por subcultivo em meio líquido e testes diretos quanto à atividade de esterase de cocaína usando um derivado tiol de cocaína e detecção com utilização do indicador colorimétrico de tiol, o reagente de Ellman (veja, por exemplo, a Figura 6) . 0 reagente de Ellman forma rapidamente uma ligação dissulfeto com grupos tiol livres e libera um íon tiolato colorido que absorve a 412 nm. Culturas incubadas de um dia para o outro a 160C na presença de IPTG para induzir expressão de proteína (20 μΐ) são misturadas com derivado de benzoiltioéster 1 mM de cocaína, e reagente de Ellman 500 μΜ em fosfato de sódio 3 0 100 mM pH 7,4, até um volume final de 200 μΐ. Os resultados (veja, por exemplo, a Figura 6) indicam que as células que contêm a enzima CocE de tipo selvagem são capazes de clivar o benzoiltioéster em níveis bem maiores do que as células isoladamente.

Finalmente, colônias bacterianas contendo

polipeptídeos mutantes são rastreadas por subcultivo em meio líquido, seguido por Iise e isolação de polipeptídeos mutantes usando um meio de afinidade. Por exemplo, as células lisadas são lavadas através de placas de filtro de níquel-agarose que permitem a coleta e subseqüente eluição de proteínas marcadas com 6xHIS (por exemplo, o kit "Ni-NTA Superflow 96-Bio-robot" (Qiagen). Alternativamente, as células são lisadas dentro de placas de microtitulação revestidas com níquel que permitem a ligação de proteínas de fusão 6xHIS e subseqüente remoção de contaminantes (por exemplo, placas imobilizadoras de quelato de níquel (Nunc) ou placas flash de quelato de níquel NEN (Perkin Elmer)) . Similarmente, as células lisadas são incubadas com microglóbulos revestidos com níquel (como glóbulos magnéticos de agarose Ni-NTA (Qiagen)), seguido por remoção subseqüente de proteínas contaminantes. A atividade isolada de proteína esterase é então testada com s utilização de qualquer um dos ensaios mencionados previamente (como o ensaio espectrofotométrico de atividade (Exemplos 1 e 4), o ensaio de atividade de cocaína tritiada (Exemplo 1) , o ensaio de atividade por indicação do pH de ácido benzóico, os sistemas de detecção do derivado tiol de cocaína, o uso de aptâmeros de cocaína (Stojanovic, M.N., de Prada, P. e Landry, D.W. (2001) J. Am. Chem. Soe. 123, 4.928-31; 3 0 Stojanovic, M.N. e Landry, D.W. (2002) J. Am. Chem. Soe. 124, 9.678-9) por monitoramento de mudanças na fluorescência mediante degradação de cocaína, ou pelo uso de um substrato genérico de esterase como, por exemplo, acetato de 4-nitrofenil e monitoramento das mudanças colorimétricas a 420 nm, como descrito previamente (Halgasova, N. e cols. (1994) Biochem. J. 298 Pt 3, 751-5; 01 Conner, C.J. e Manuel, R. D. (1993) J. Dairy Sei. 76: 3.674-3 . 682) .

EXEMPLO 16: ANÁLISE PRELIMINAR DO P0LIPEPTÍDE0 MUTANTE N197K

A análise preliminar do polipeptídeo mutante N197K (Id. de Seq. N°: 42) mostrou boa estabilidade após 1 hora a 37°C no dia 0. Os valores de Vmax e Km são mostrados na Tabela 5. Uma re-verificação no 3° dia mostrou estabilidade similar. Os valores de Vmax e Km são mostrados na Tabela 6. Valores de Km maiores no 3° dia foram em conseqüência do reuso de cocaína velha. A filtração em gel de amostras incubadas a 37°C mostrou a formação de agregados.

Tabela 5: Teste inicial de N197K (dia 0)

N197K (0) N197K (60) Equação 1 Valores Best-fit VMAX 2 . 928 2 . 187 KM 34 , 77 24, 24 Tabela 6: teste de repetição de N197K (dia 3) N197K (0) Nl9 7 K (60) Equação 1 Valores Best-fit VMAX 3 .357 3 . 085 KM

102 , 2

113 , 5

Exemplo 17: identificação de polipeptídeos mutantes de CocE termicamente estáveis

Polipeptídeos mutantes de CocE termicamente estáveis foram identificados por determinação de Xi/2 dos polipeptídeos mutantes de CocE. Resumidamente, as enzimas foram pré-incubadas a 37°C por tempos variáveis. As medidas da atividade foram determinadas em temperatura ambiente (25°C) . As enzimas mutantes com Xi/2 maior do que 12 minutos (o Χχ/2 da CocE do tipo selvagem) foram consideradas termicamente estáveis (veja, por exemplo, a Figura 27 e a Tabela 7). Como demonstrado pela combinação de polipeptídeo de mutante de CocE T172R/G173Q, em várias modalidades, a combinação de duas mutações únicas com estabilidade menor ou ausente pode resultar em um a combinação termicamente estável.

Tabela 7: Polipeptídeos mutantes de CocE termicamente estáveis

Mutante Estabilidade @ 37 0C (Ti/2) T122A Não Q123E Não S159A Não S140A Não S167A/W52L Não T172R -46 min V121D Não L163V Não F189A Não F189A/T172R ~4 0 min (Similar a T172R) C107S Não W2 2 0A Não F189L Não A193D Não TI72R/A193D -40 min (Similar a T172R) G173Q -25 min T254R Não N4 2V Não T172R/G173Q -326 min Gl7IQ/Tl72R/G17 3Q Não Gl 7IA Não G173A Não wt-T17 5-G-D185 Não wt-T176-G-G-Dl85 Não T172R/G173Q-T17 5-G-D185 Tl72R/G173Q-T175-G-G-A186 -75 min T17 2R/G173Q-T17 6-G-G-D185 -75 min S177Q Não D45R Não F4 7R Não L169K -274 min L174R Não A181K Não S179R Não F189K 25 min V190K Não A194K Não R182K Não

Exemplo 18: proteção de agregação de mutantes esterase de cocaína termoestáveis A Proteção de agregação de mutantes de CocE termoestáveis foi avaliada com o uso de cromatografia por exclusão de tamanho. Resumidamente, as enzimas foram pré- incubadas a 37°C por 0 minuto ou 60 minutos, e resolvidas por cromatografia por exclusão de tamanho. Os resultados para CocE de tipo selvagem, T172R e T172R/G173Q são mostrados na Figura 28.

EXEMPLO 19: ESPECTROS INFERIORES DO UV

Os dados dos espectros inferiores do UV foram obtidos usando um Aviv Spectropolarimeter Mode 400, com o auxilio de Norma Greenfield, UMDNJ, usando um suporte de 5 células e concentrações de proteína de 0,2 mg/ml. Os valores brutos dos dados obtidos foram purificados em PBS de controle, regulados, e desconvolutos usando o algoritmo CCA como descrito por A. Perczel, K. Park e G.D. Fasman, ["Analysis of the circular dichroism spectrum of proteins using the convex constraint algorithm: a practical guide". Analytical Blochemistry 203, 83-93 (1992)]. Esse algoritmo encontra o número mínimo de curvas necessário para a reconstrução de um conjunto de dados, e expressa a percentagem que cada curva contribui para o conjunto de dados como uma função da temperatura.

Abaixo está apresentada uma análise de desconvolução de CCA de UV inferior de CocE do tipo selvagem e 4 mutantes, obtidos em uma fusão de espectros de CD únicos usando um suporte de 5 células. 0 experimento foi realizado o longo do period de 8 horas, de 0-80°C.

A fusão dependente da temperatura foi observada entre os comprimentos de onda testados (200-250 nm), e os espectros regulados para cada mutante são mostrados na Figura 29. Desconvolução via o algoritmo CCA indicou que cada espectro foi mais bem descrito por um conjunto de três curvas, como mostrado na Figura 30. Isso sugere que a fusão de CocE é um processo de pelo menos duas etapas, movendo de uma curva original (curva 1) para uma etapa desbobrada intermediária (curva 2), e finalmente a proteína totalmente desnaturada (curva 3). A contribuição % que cada temperatura desempenhou na descrição dessas três curvas é mostrada na Figura 31. A análise de reposta foi usada para aproximar uma temperatura em que o espectro inicial se funde (1), a formação e fusão do estado intermediário (2), e o acúmulo da proteína totalmente fundida (3) . Esses numerosos foram coletados e tabulados na Figura 3 2 e mostrados na Tabela 8. Tabela 8: Pontos de fusão de cada etapa

Fusão #1 Formação #2 Fusão #2 Formação #3 —*- WT 37 , 04 34 , 57 50, 98 59 , 86 T172R 39,22 38, 11 54 , 56 56, 85 T172R-A193D 38,11 46,47 47,68 58 , 72 T172R-F189K 38,8 46, 81 48 , 42 57, 23 T172R-G173 0 40, 62 45,61 46, 17 56, 61

O mutante mais termoestável T172R-G173Q (como determinado em outros ensaios) mostrou a maior temperatura de fusão da curva original 1 (40°C vs 37°C para o tipo selvagem), e a menor temperatura tanto para o 2 0 desaparecimento do intermediário da curva 2 (46°C vs 50°C para o tipo selvagem) quanto para o aparecimento da curva totalmente fundida 3 (56°C vs 59°C para o tipo selvagem).

Em resumo, parece que todos os mutantes passaram por um processo de fusão em 2 etapas.

EXEMPLO 20: ESTABILIZAÇÃO USANDO PRODUTOS E INIBIDORES

A Esterase de cocaína (CocE) cliva a cocaína para produzir ácido benzóico e éster metílico de ecgonina.

Resumidamente, substratos e inibidores alternativos de cocaína, além de compostos capazes de estabilizar termicamente a enzima, foram investigados geralmente por substituição de análogos de amida e tiol na ligação reativa Ester, ou por remoção da ligação (para inibidores), por substituição de análogos de benzoila no lugar do grupo abandonador de ácido benzóico, e/ou remoção ou alteração do grupo metil-éster na porção ecgonina da molécula. Como discutido abaixo, foi determinado que alguns substratos, produtos e inibidores estabilizavam a desnaturação térmica de CocE do tipo selvagem, bem como evitavam a agregação induzida termicamente em eletroforese em gel.

A cocaína é o substrato natural da esterase de cocaína (CocE). A clivagem de cocaína foi monitorada por uma queda da absorbância a 24 0 nm. A cocaína (na faixa de mM) evitou

2 0 a formação induzida a 37 0C de agregados de CocE de alto

peso molecular (concentrações enzimáticas de 0,1 mg/ml) (veja, por exemplo, a Figura 33). Cocaína (em quantidades de μΜ) estabilizou a perda de atividade induzida a 370C (veja, por exemplo, Figura 34) , embora o mecanismo dessa estabilização seja complicado em função da inibição de substrato em concentrações maiores.

0 ácido benzóico é o produto natural de CocE e um inibidor fraco da clivagem de CocE de acetato de 4- nitrofenil (Ki 310 μΜ). 0 ácido benzóico evitou a formação

3 0 induzida a 370C de agregados de CocE de alto peso molecular (concentrações enzimáticas de 0,1 mg/ml) (veja, por exemplo, a Figura 35). O ácido benzóico (quantidades de μΜ) estabilizou a perda de atividade induzida a 37°C (veja, por exemplo, Figura 3 6) , embora o mecanismo dessa estabilização seja complicado em função da inibição de substrato em concentrações maiores.

CocE catalisa a clivagem de acetato de 4-nitrofenil (4NPA) em 4-nitrofenol (4NP) e acetato. A reação de clivagem foi monitorada por observação de formação de produto a 400 nm. Tanto 4NP quanto 4NPA (na faixa de raM) evitaram a formação induzida a 370C de agregados de CocE de alto peso molecular (concentrações enzimáticas de 0,1 mg/ml).

0 ácido fenilborônico é um inibidor potente de CocE (Ki 250 nM). 0 ácido fenilborônico estabilizou a agregação induzida a 370C de CocE com uma EC50 de 0,2 UM por análise de densitometria.

Usando o que foi apresentado acima, é desenvolvido um ensaio de rastreamento para rastrear pequenas moléculas que possam, da mesma forma, estabilizar a enzima, mas não ocupem necessariamente o sítio ativo. As moléculas identificadas como moléculas estabilizantes são usadas para estabilizar as proteínas aqui reveladas até estarem prontas para uso. LISTAGEM DE SEQUENCIAS

<110> Columbia University Zhan, Chang-Guo Landry, Donald

Sunahara, Roger MacDonald, Joanne Narasimhan, Diwa Woods, James Holden Ko, Mei_Chuan

Deng, Shi-Xian

<120> COMPOSIÇÕES ANTICOCAÍNA E TRATAMENTO <13 O > 88800730-0003

<14 O > PCTUS 0715762

<141> 03-08-2007

<150 > 60/819,569

<151> 10-07-2006

<160> 47 <170> PatentIn versão 3.3

<210 > 1

<211> 574

<212 > PRT

3 0 <213> Rhodococcus sp. MBl

<4 0 0 > 1

Met Val Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ala Ser Asn Val Met Val Pro Met 1 5 10 15

Arg Asp Gly Val Arg Leu Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp Ala Asp 25 30

40

Gly Pro Val Pro Val Leu Leu Val Arg Asn Pro Tyr Asp Lys Phe Asp 40 45

45

Val Phe Ala Trp Ser Thr Gln Ser Thr Asn Trp Leu Glu Phe Val Arg 50 55 60

0 Asp Gly Tyr Ala Val Val Ile Gln Asp Thr Arg Gly Leu Phe Ala Ser 65 70 75 80

Glu Gly Glu Phe Val Pro His Val Asp Asp Glu Ala Asp Ala Glu Asp 55 85 90 95

Thr Leu Ser Trp Ile Leu Glu Gln Ala Trp Cys Asp Gly Asn Val Gly 100 105 110

60 Met Phe Gly Val Ser Tyr Leu Gly Val Thr Gln Trp Gln Ala Ala Val 115 120 125

Ser Gly Val Gly Gly Leu Lys Ala Xle Ala Pro Ser Met Ala Ser Ala 130 135 140

Asp Leu Tyr Arg Ala Pro Trp Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Leu Ser Val 145 150 155 160

Glu Ala Leu Leu Gly Trp Ser Ala Leu Ile Gly Thr Gly Leu Ile Thr 165 170 175

15

Ser Arg Ser Asp Ala Arg Pro Glu Asp Ala Ala Asp Phe Val Gln Leu 180 185 190

20

Ala Ala Ile Leu Asn Asp Val Ala Gly Ala Ala Ser Val Thr Pro Leu 195 200 205

2 5 Ala Glu Gln Pro Leu Leu Gly Arg Leu Ile Pro Trp Val Ile Asp Gln 210 215 220

Val Val Asp His Pro Asp Asn Asp Glu Ser Trp Gln Ser Ile Ser Leu 225 230 235 240

Phe Glu Arg Leu Gly Gly Leu Ala Thr Pro Ala Leu Ile Thr Ala Gly 245 250 255

35

Trp Tyr Asp Gly Phe Val Gly Glu Ser Leu Arg Thr Phe Val Ala Val 260 265 270

40

Lys Asp Asn Ala Asp Ala Arg Leu Val Val Gly Pro Trp Ser His Ser 275 280 285

4 5 Asn Leu Thr Gly Arg Asn Ala Asp Arg Lys Phe Gly Ile Ala Ala Thr 290 295 300

Tyr Pro Ile Gln Glu Ala Thr Thr Met His Lys Ala Phe Phe Asp Arg 50 305 310 315 320

His Leu Arg Gly Glu Thr Asp Ala Leu Ala Gly Val Pro Lys Val Arg 325 330 335

55

Leu Phe Val Met Gly Ile Asp Glu Trp Arg Asp Glu Thr Asp Trp Pro 340 345 350

60

Leu Pro Asp Thr Ala Tyr Thr Pro Phe Tyr Leu Gly Gly Ser Gly Ala 355 360 365

Ala Asn Thr Ser Thr Gly Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser Ile Ser Gly 370 375 380

Thr Glu Ser Ala Asp Thr Tyr Leu Tyr Asp Pro Ala Asp Pro Val Pro 385 390 395 400

10

Ser Leu Gly Gly Thr Leu Leu Phe His Asn Gly Asp Asn Gly Pro Ala 405 410 415

15

Asp Gln Arg Pro Ile His Asp Arg Asp Asp Val Leu Cys Tyr Ser Thr 420 425 430

2 0 Glu Val Leu Thr Asp Pro Val Glu Val Thr Gly Thr Val Ser Ala Arg 435 440 445

Leu Phe Val Ser Ser Ser Ala Val Asp Thr Asp Phe Thr Ala Lys Leu 450 455 460

Val Asp Val Phe Pro Asp Gly Arg Ala Ile Ala Leu Cys Asp Gly Ile 465 470 475 480

30

Val Arg Met Arg Tyr Arg Glu Thr Leu Val Asn Pro Thr Leu Ile Glu 485 490 495

35

Ala Gly Glu Ile Tyr Glu Val Ala Ile Asp Met Leu Ala Thr Ser Asn 500 505 510

4 0 Val Phe Leu Pro Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Ser Ser Ser Asn 515 520 525

Phe Pro Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asn Thr Gly Gly Val Ile Ala Arg 45 530 535 540

Glu Gln Leu Glu Glu Met Cys Thr Ala Val Asn Arg Ile His Arg Gly 545 550 555 560

50

Pro Glu His Pro Ser His Ile Val Leu Pro Ile Ile Lys Arg 565 570

55

<210> 2 <211> 2692 <212 > DNA

<213 > Rhodococcus sp. MBl

60

<4 0 0 > 2 10

20

30

60 120 180 240 300 360 420

ggctgaaqqc qatcqcqccg tccatggcgt cqqcqqactt qtaccgcgcc ccgtggtacg 480

540

600 660 720

aatcatqqca qtccattaqc ttgtttgaac gactcggcgg gttggcaaca ccggccttga 780

840 900 960 1020

ccaaagtgcg gctgttcgta atgggcatcg atgagtggcg tgacgaaacg gactggccac 1080

1140 1200 1260 1320

45 aggtattgac cgacccggtg gaagtaaccg gcaccgtctc cgcccggctg ttcgtgtcgt 1380

1440 1500 1560 1620

55 accgcaattc gaataccggc ggagtaatcg cacgggaaca gctcgaagag atgtgcaccg 1680

1740 1800 1860

40

50

60

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574

PRT

Artificial

Polipeptídeo Mutante CocE

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45

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5

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<223> Polipeptídeo Mutante CocE

45

<4 0 0 > 28

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50

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55

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5

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25

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5

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20

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<223 > Polipeptídeo Mutante CocE

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25

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40

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<22 0 >

<223> Polipeptideo Mutante CocE 55 <4 0 0 > 34

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60

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55

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55

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5

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5

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25

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30

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5

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Glu Gln Leu Glu Glu Met Cys Thr Ala Val Asn Arg Ile His Arg Gly 545 550 555 560

6 0 Pro Glu His Pro Ser His Ile Val Leu Pro Ile Ile Lys Arg Leu Glu

565 570 575 His His His His His His 580

5

<210 > 47 <211> 582 <212 > PRT <213> Artificial <22 0 > <223 > Polipeptídeo <4 00 > 47

Met Val Asp Gly Asn Tyr Ser Val Ala Ser Asn Val Met Val Pro Met 10 15

20

Arg Asp Gly Val Arg Leu Ala Val Asp Leu Tyr Arg Pro Asp Ala Asp 25 30

2 5 Gly Pro Val Pro Val Leu Leu Val Arg Asn Pro Tyr Asp Lys Phe Asp 40 45

Val Phe Ala Trp Ser Thr Gln Ser Thr Asn Trp Leu Glu Phe Val Arg 50 55 60

Asp Gly Tyr Ala Val Val Ile Gln Asp Thr Arg Gly Leu Phe Ala Ser 65 70 75 80

35

Glu Gly Glu Phe Val Pro His Val Asp Asp Glu Ala Asp Ala Glu Asp 85 90 95

40

Thr Leu Ser Trp Ile Leu Glu Gln Ala Trp Cys Asp Gly Asn Val Gly 100 105 110

4 5 Met Phe Gly Val Ser Tyr Leu Gly Val Thr Gln Trp Gln Ala Ala Val 115 120 125

Ser Gly Val Gly Gly Leu Lys Ala Ile Ala Pro Ser Met Ala Ser Ala 50 130 135 140

Asp Leu Tyr Arg Ala Pro Trp Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Leu Ser Val 145 150 155 160

55

Glu Ala Leu Leu Gly Trp Ser Ala Leu Ile Gly Thr Gly Leu Ile Thr 165 170 175

60

Ser Arg Ser Asp Ala Arg Pro Glu Asp Ala Ala Asp Phe Val Gln Leu 180 185 190

Ala Lys Ile Leu Asn Asp Val Ala Gly Ala Ala Ser Val Thr Pro Leu 195 200 205

Ala Glu Gln Pro Leu Leu Gly Arg Leu Ile Pro Trp Val Ile Asp Gln 210 215 220

10

Val Val Asp His Pro Asp Asn Asp Glu Ser Trp Gln Ser Ile Ser Leu 225 230 235 240

15

Phe Glu Arg Leu Gly Gly Leu Ala Thr Pro Ala Leu Ile Thr Ala Gly 245 250 255

2 0 Trp Tyr Asp Gly Phe Val Gly Glu Ser Leu Arg Thr Phe Val Ala Val 260 265 270

Lys Asp Asn Ala Asp Ala Arg Leu Val Val Gly Pro Trp Ser His Ser 275 280 285

Asn Leu Thr Gly Arg Asn Ala Asp Arg Lys Phe Gly Ile Ala Ala Thr 290 295 300

30

Tyr Pro Ile Gln Glu Ala Thr Thr Met His Lys Ala Phe Phe Asp Arg 305 310 315 320

35

His Leu Arg Gly Glu Thr Asp Ala Leu Ala Gly Val Pro Lys Val Arg 325 330 335

4 0 Leu Phe Val Met Gly Ile Asp Glu Trp Arg Asp Glu Thr Asp Trp Pro 340 345 350

Leu Pro Asp Thr Ala Tyr Thr Pro Phe Tyr Leu Gly Gly Ser Gly Ala 45 355 360 365

Ala Asn Thr Ser Thr Gly Gly Gly Thr Leu Ser Thr Ser Ile Ser Gly 370 375 380

50

Thr Glu Ser Ala Asp Thr Tyr Leu Tyr Asp Pro Ala Asp Pro Val Pro 385 390 395 400

55

Ser Leu Gly Gly Thr Leu Leu Phe His Asn Gly Asp Asn Gly Pro Ala 405 410 415

6 0 Asp Gln Arg Pro Ile His Asp Arg Asp Asp Val Leu Cys Tyr Ser Thr 420 425 430 Glu Val Leu Thr Asp Pro Val Glu Val Thr Gly Thr Val Ser Ala Arg 435 440 445

5

Leu Phe Val Ser Ser Ser Ala Val Asp Thr Asp Phe Thr Ala Lys Leu 450 455 460

10

Val Asp Val Phe Pro Asp Gly Arg Ala Ile Ala Leu Cys Asp Gly Ile 465 470 475 480

Val Arg Met Arg Tyr Arg Glu Thr Leu Val Asn Pro Thr Leu Ile Glu

485 490 495

Ala Gly Glu Ile Tyr Glu Val Ala Ile Asp Met Leu Ala Thr Ser Asn 500 505 510

Val Phe Leu Pro Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Ser Ser Ser Asn 515 520 525

25

Phe Pro Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asn Thr Gly Gly Val Ile Ala Arg 530 535 540

30

Glu Gln Leu Glu Glu Met Cys Thr Ala Val Asn Arg Ile His Arg Gly 545 550 555 560

3 5 Pro Glu His Pro Ser His Ile Val Leu Pro Ile Ile Lys Arg Leu Glu

565 570 575

His His His His His His 40 580

Claims (27)

1. Polipeptídeo de esterase de cocaína mutante isolado (CocE) caracterizado por compreender uma seqüência de aminoácidos de Id. de Seq. N°: 1, em que pelo menos um resíduo de aminoácido é substituído de modo que o polipeptídeo de CocE mutante tem atividade de esterase com termoestabilidade aumentada a 370C quando comparado a CocE de tipo selvagem.

2. Polipeptídeo de CocE isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois resíduos de aminoácidos são substituídos.

3. Polipeptídeo de CocE isolado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos três resíduos de aminoácidos são substituídos.

4. Polipeptídeo de CocE isolado, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos quatro resíduos de aminoácidos são substituídos.

5. Polipeptídeo de CocE isolado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos cinco resíduos de aminoácidos são substituídos.

6. Polipeptídeo de esterase de cocaína mutante isolado caracterizado por compreender uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Id. de Seq. N°: 3 (L163V); Id. de Seq. N°: 7 (V225I); Id. de Seq. N0: 8 (1218 L) ; Id. de Seq. N°: 9 (A310D); Id. de Seq. N°: (A14 9S) ; Id. de Seq. N°: 11 (S159A); Id. de Seq. N° : 12 (S265A) ; Id. de Seq. N° : 13 (S56G) ; Id. de Seq. N° : 14 (W220A) ; Id. de Seq. N°: 16 (S140A) ; Id. de Seq. N°: 17 (F189L) ; Id. de Seq. N°: 18 (A193D) ; Id. de Seq. N°: 19 (T2 54R) ; Id. de Seq. N° : 20 (N42V) ; Id. de Seq. N°: 21 (V262L) ; Id. de Seq. N° : 22 (L508G); Id. de Seq N° 23 (Y152H) ; Id. de Seq. N0 : 24 (V160A); Id. de Seq N0 25 (T172R) ; Id. de Seq. N0 : 26 (Y532F); Id. de Seq N0 27 (T74S); Id. de Seq. N° : 28 (W285T) ; Id. de Seq. N° : 29 (L146P) ; Id. de Seq. N0 : 30 (D533S); Id. de Seq N0 31 (A194R) ; Id. de Seq. N0 : 32 (G173Q); Id. de Seq N0 33 (C477T) ; Id. de Seq. N0 : 34 (K531A); Id. de Seq N0 35 (R411) ; Id. de Seq. N0 : 36 (L119A); Id. de Seq. N0 37 (K46A); Id. de Seq. N0 : 38 (F84Y), Id. de Seq. N0 : 39 (T172R- G173Q) ; Id. de Seq N0 : 40 (L169K); Id. de Seq. N0 :41 (F189A) , Id. de Seq. N°: 42 (N197K) , Id. de Seq. N°: 43 (R182K) , Id. de Seq. N°: 44 (F189K) , Id. de Seq. N° : 45 (V190K) , Id. de Seq. N°: 46 (Q191K) , e Id. de Seq. N°: 47 (A194K), ou um fragmento funcional dessas.

7. Ácido nucleico isolado caracterizado por codificar o polipeptídeo de CocE mutante de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

8. Ácido nucleico isolado caracterizado por compreender uma seqüência de nucleotideos que hibridiza a Id. de Seq. N°: 2 ou o complemento de Id. de Seq. N°: 2 sob condições altamente controladas, em que o ácido nucleico isolado codifica um polipeptídeo de CocE mutante que tem atividade de esterase com termoestabilidade aumentada a 370C quando comparado a CocE de tipo selvagem.

9. Ácido nucleico isolado caracterizado por codificar um polipeptídeo de CocE mutante que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 85% de identidade de seqüência com a seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°: 2, em que o polipeptídeo de CocE mutante codificado tem atividade de esterase com termoestabilidade aumentada a 370C quando comparado a CocE de tipo selvagem.

10. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a identidade de seqüência é selecionada do grupo que consiste em pelo menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99%.

11. Polipeptídeo ou ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o aumento da termoestabilidade do polipeptídeo de CocE mutante sobre CocE de tipo selvagem é pelo menos de cerca de 2,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,2 kcal/mol, at leist cerca de 2,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,4 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,5 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,6 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,7 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,8 kcal/mol, pelo menos cerca de 2,9 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,0 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,2 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,4 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,5 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,6 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,7 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,8 kcal/mol, pelo menos cerca de 3,9 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,0 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,1 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,2 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,3 kcal/mol, pelo menos cerca de 4,4 kcal/mol, ou pelo menos cerca de 4,5 kcal/mol.

12. Polipeptídeo ou o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de CocE mutante tem imunogenicidade reduzida quando comparado a CocE de tipo selvagem.

13. Polipeptídeo ou o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de CocE mutante tem pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 100%, pelo menos cerca de 105%, pelo menos cerca de 110%, pelo menos cerca de 115%, pelo menos cerca de 120%, pelo menos cerca de 125%, pelo menos cerca de 130%, pelo menos cerca de 135%, ou pelo menos cerca de 140% da atividade de esterase de polipeptídeo de CocE de tipo selvagem.

14. Polipeptídeo ou o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de CocE mutante retém pelo menos substancialmente a mesma eficiência catalítica ou maior de polipeptídeo de CocE de tipo selvagem.

15. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o polipeptídeo de CocE mutante ou o polipeptídeo de CocE mutante codificado pelo ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

16. Polipeptídeo, polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de CocE mutante é peguilado.

17. Polipeptídeo, polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo de CocE mutante é encapsulado em uma hemácea.

18. Polipeptídeo, polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de CocE mutante é estabilizado por um substrato ou inibidor.

19. Polipeptídeo, polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico, ou a composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende uma pluralidade de substituições de resíduo de aminoácido selecionadas do grupo que consiste em: T122A; 123E; S159A; S140A; S167A/W52L; T172R; V121D; L163V; F189A; F189A/T172R; C107S; W22 0A; F18 9L; A193D; T172R/A193D; G173Q; T254R; N42V; T172R/G173Q; G171Q/T172R/G173Q; G171A; G173A; wt-1175-G- Dl8 5; wt-T17 6-G-G-D185; T172R/G173Q-1175-GD185; T172R/G173Q-117 5-G-G-A18 6; T172R/G173Q-T17 6-G-G-D185; S17 7 Q; D45R; F47R; L169K; L174R; A181K; S179R; F189K; Vl9OK; Al94K; e R182K.

20. Método de tratamento de uma condição induzida por cocaína caracterizado por compreender a administração a um indivíduo que necessita de uma quantidade eficaz do polipeptídeo de CocE mutante, o polipeptídeo de CocE mutante codificado pelo ácido nucleico, ou a composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1-19.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a condição induzida por cocaína é selecionada do grupo que consiste em overdose de cocaína, toxicidade por cocaína, dependência de cocaína, e vício de cocaína.

22. Método de rastreamento de alto rendimento para a identificação de polipeptídeos de CocE mutante termoestáveis caracterizado por compreender as etapas de: transformação estável de uma célula com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de CocE mutante; expressão do polipeptídeo de CocE mutante na célula; isolação do polipeptídeo de CocE expresso; medição da atividade de esterase do polipeptídeo de CocE mutante isolado em uma ou mais temperaturas predeterminadas de pelo menos cerca de 30°C até cerca de 50°C para determinar a termoestabilidade dos polipeptídeos de CocE mutante isolados; seleção de polipeptídeo de CocE mutante isolado com atividade de esterase na temperatura(s) predeterminada(s) .

23. Método de rastreamento de alto rendimento, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a medição da atividade de esterase dos polipeptídeos mutantes isolados compreende: o contato do polipeptídeo de CocE mutante isolado com (i) cocaína e um indicador de pH ou (ii) um tio-derivado de cocaína e um indicador de tiol; detecção de uma mudança no indicador de pH ou indicador de tiol; em que uma mudança no indicador de pH ou indicador de tiol está correlacionada com a formação de ácido benzóico a partir da hidrólise de cocaína ou derivado de cocaína pelo polipeptídeo de CocE mutante.

24. Método de rastreamento de alto rendimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 ou 23, caracterizado por também compreender a repetição de uma ou mais etapas do método de rastreamento pelo menos uma vez em uma temperatura aumentada para medição da atividade de esterase.

25. Método de rastreamento de alto rendimento, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que um primeiro ciclo de rastreamento tem uma primeira temperatura para medição da atividade de esterase de cerca de 3 O0C e um ciclo subseqüente de rastreamento tem uma temperatura para medição da atividade de esterase de cerca de 450C.

26. Método de rastreamento de alto rendimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a expressão de polipeptídeo de CocE mutante ocorre em uma temperatura em que CocE de tipo selvagem retém substancialmente a atividade catalítica.

27. Método de rastreamento de alto rendimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a expressão de polipeptídeo de CocE mutante ocorre em uma temperatura em que o polipeptídeo de CocE de tipo selvagem substancialmente se divide em corpos de inclusão.