JP2024503711A - 修飾ｍｉＲ－１３５、そのコンジュゲートおよびその使用 - Google Patents

修飾ｍｉＲ－１３５、そのコンジュゲートおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2024503711A
JP2024503711A JP2023543102A JP2023543102A JP2024503711A JP 2024503711 A JP2024503711 A JP 2024503711A JP 2023543102 A JP2023543102 A JP 2023543102A JP 2023543102 A JP2023543102 A JP 2023543102A JP 2024503711 A JP2024503711 A JP 2024503711A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mir
nucleic acid
seq
acid sequence
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023543102A
Other languages
English (en)
Inventor
アロン チェン
シャロン マナシロフ
アンドレス パブロ モンテフェルトロ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Micure Therapeutics Ltd
Original Assignee
Micure Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Micure Therapeutics Ltd filed Critical Micure Therapeutics Ltd
Publication of JP2024503711A publication Critical patent/JP2024503711A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/548—Phosphates or phosphonates, e.g. bone-seeking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin

Abstract

配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を含む合成ｍｉＲ－１３５分子および配列番号４０に示す相補鎖を含む組成物が開示される。合成ｍｉＲ－１３５分子および細胞標的化部分を含む組成物を含むコンジュゲートも開示される。

Description

関連週願
本願は、２０２１年１月１８日付出願の米国仮特許出願第６３／１３８，５５５号および２０２１年１０月２７日付出願の米国仮特許出願第６３／２７２，３２９号の優先権を主張するものであり、本参照をもってその内容の全てを援用するものとする。
配列表に関する陳述
本願と同時に提出した、２０２２年１月１７日付作製の８９９３８ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称する２１，０２３バイトのＡＳＣＩＩファイルを、本参照をもって援用する。
本発明は、そのいくつかの実施形態において、治療用ｍｉＲ－１３５分子に関し、より具体的にはその使用に関するが、これに限定されるものではない。
大うつ病および不安障害といった気分障害は、人工の訳１０％に影響している、世界的に最も一般的で、増加している健康問題の一部を表している。数十年にわたる研究にもかかわらず、うつ病の発症、感染性、および利用可能な治療のメカニズムについては、部分的にしか理解されていない。現在、患者の約三分の一しか利用可能な治療に対して応答しないため、病理のより良い理解に対する大きな需要が存在する。
うつ病の病因に関する現在のドグマは、環境因子と遺伝的素因との複雑な相互作用であり、エピジェネティックなプロセスの機械論的役割を示唆している。
セロトニン（５ＨＴ）は、脳内で縫線核（ＲＮ）によって製造されるモノアミン神経伝達物質であり、種々の認知、感情および生理学的な機能を調節するために脳内全体に広がるものである。セロトニン活性の調節不全と、うつ病との関連は詳細に確立されている［Michelsen KA. et al., Brain Res Rev (2007) 55(2):329-42］。５ＨＴのレベルのみならず、その産生、分泌、再取り込みおよび不活化を担う遺伝的回路（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｉｒｃｕｉｔｒｙ）は、うつ病においてその調節が不全である。加えて、最近提供された抗うつ薬は、５ＨＴ系関連タンパク質の機能を標的とし、その結果、シナプス中の５ＨＴレベルが増加する［Krishnan V and Nestler EJ, Nature (2008) 455: 894-902］。現存の療法は、症状の軽減が見られるまでに長期の投与が必要である。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、遺伝子発現を転写後に抑制する内因性の小（約２２ヌクレオチド）非コードＲＮＡ分子のサブセットである。ＭｉＲは、一次ｍｉＲ分子として転写され、細胞核においてステムループ構造を有する前駆体ｍｉＲにプロセッシングされ、細胞質に輸送されて、活性成熟ｍｉＲに更にプロセッシングされる。成熟ｍｉＲは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に取り込まれ、特定のｍＲＮＡ分子の３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）に結合することで主として機能する。結合は、ｍｉＲの５’末端の６～８ヌクレオチド配列であるシード配列を介して起こり、相補的シードの塩基対は標的ｍＲＮＡ ３’ＵＴＲ上の配列と合致する。ｍｉＲの結合は、直接的なｍＲＮＡの脱安定化または翻訳抑制につながり、最終的には標的遺伝子のタンパク質レベルの減少をもたらす。
ＭｉＲは神経系に豊富に存在し、初期の研究は、発生、がんおよび神経変性異常における神経細胞、並びに整形外科等の正常なプロセスに集中していた［Kosik KS. Nat Rev Neurosci (2006) 7:911-20］。いくつかのｍｉＲスクリーニング研究が、種々のげっ歯類成体またはヒト脳構造におけるｍｉＲレベルが種々の範囲の行動的および薬理学的操作の影響を受けると報告している［O'Connor R. M. et al., Mol Psychiatry (2012) 17: 359-376］。加えて、ヒトモデルおよびマウスモデルの両方において、ｍｉＲが統合失調症、自閉症等の精神障害、並びにうつ病および不安において役割を担うことが示唆されている［Miller BH and Wahlestedt C, Brain Res (2010) 1338: 89-99およびIssler O and Chen A, Nat Rev Neurosci. (2015) 16: 201-212］。いくつかの研究が、近年、５ＨＴ関連遺伝子の調節におけるｍｉＲの関与を示し［Millan MJ. Curr Opin Pharmacol (2011) 11(1):11-22］、ｍｉＲの５ＨＴ系の調節において明らかになってきた役割およびそのうつ病関連障害との関連可能性を明らかにした。
国際公開第２０１３／０１８０６０号は、セロトニン放出ホルモン、アドレナリン放出ホルモン、ノルアドレナリン放出ホルモン、グルタミン酸放出ホルモン、およびコルチコトロピン放出ホルモンに関連する健康状態の治療および診断用のマイクロＲＮＡ（例：ｍｉＲ－１３５）およびそれを含む組成物を開示する。
国際公開第２０１５／１１８５３７号は、ｍｉＲ－１３５、その前駆体、あるいはｍｉＲ－１３５またはその前駆体をコードする核酸分子の治療有効量を対象に投与する、双極性障害の治療方法を開示する。
米国特許出願公開第２０１７／００３７４０４号は、合成核酸分子を用いてｍｉＲＮＡの活性または機能を細胞に導入するための方法および組成物を開示する。合成核酸分子は修飾されてもよい。
国際公開第２０１１／１３１６９３号は、（ｉ）標的核酸配列に対して相補的な核酸であって、その発現が標的核酸（例：ｍｉＲＮＡ）の発現を防止または減少させるもの、および（ｉｉ）高親和性をもって神経伝達物質輸送体（例：セロトニン再取り込み阻害薬）と結合可能な選択剤を含むコンジュゲートを開示する。国際公開第２０１１／１３１６９３号は、これらコンジュゲートの、目的細胞への核酸の送達、疾患の治療、および診断目的での使用を検討している。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖を含む合成ｍｉＲ－１３５分子を含む組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を含む合成ｍｉＲ－１３５分子、および配列番号１３または４７のいずれか一に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子の核酸構築物を含む組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、
（ｉ）本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子を含む組成物と、
（ｉｉ）細胞標的化部分と
を含むコンジュゲートが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本発明のいくつかの実施形態の組成物または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）関連病態を治療するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、ＣＮＳ関連病態を治療することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象のうつ病関連障害を治療するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、うつ病関連障害を治療することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象のがん性疾患を治療するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、がん性疾患を治療することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象の骨再生または筋肉細胞分化を促進するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、骨再生または筋肉細胞分化を促進することを含む方法が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象のＣＮＳ関連病態の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象のうつ病関連障害の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象のがん性疾患の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートが提供される。
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、治療を必要とする対象の骨関連疾患または病態あるいは筋肉関連疾患または病態の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物、または本発明のいくつかの実施形態のコンジュゲートが提供される。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５分子は５０個以下の核酸を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖は、二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子内に存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖は、ヘアピンループ構造を形成する。
本発明のいくつかの実施形態によると、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列と配列番号４０に示す相補鎖は、配列番号３７および配列番号４０のそれぞれの全長にわたって相補性１００％である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖の核酸配列は、糖修飾、核酸塩基修飾およびヌクレオチド間結合修飾からなる群より選ばれる１以上の修飾を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ロック核酸（ＬＮＡ）および２’－フルオロアラビノオリゴヌクレオチド（ＦＡＮＡ）からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂ内の糖修飾は、核酸配列の３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドに存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂ内の糖修飾は、核酸配列の５’末端の少なくとも１つのヌクレオチドに存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、相補鎖内の糖修飾は、核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドの修飾を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、相補鎖内の糖修飾は、核酸配列の５’末端の最初の２つのヌクレオチドの修飾を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、糖修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、および／または２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾である。
本発明のいくつかの実施形態によると、糖修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）および５’リボースのメチル化（２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ）である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ヌクレオチド間結合の修飾は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、ホスホジエステル、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂ中のヌクレオチド間結合の修飾は、核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドに存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、ヌクレオチド間結合の修飾は、リン酸塩を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、ヌクレオチド間結合の修飾は、ホスホロチオエートを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、ホスホロチオエート修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂまたは相補鎖の核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間に存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、ホスホロチオエート修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂまたは相補鎖の核酸配列の５’末端最後の２つのヌクレオチドの間に存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、修飾を含むｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は、配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、修飾を含む相補鎖の核酸配列は、配列番号１３または４７のいずれか一に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１０に示すものであり、相補鎖は配列番号１３に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号４１に示すものであり、相補鎖は配列番号１３に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号４２に示すものであり、相補鎖は配列番号１３に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１０に示すものであり、相補鎖は配列番号４７に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１６に示すものであり、相補鎖は配列番号１３に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号４１に示すものであり、相補鎖は配列番号４７に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号４２に示すものであり、相補鎖は配列番号４７に示すものである。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、相補鎖は配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、それぞれが二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子に存在する。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、相補鎖は配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、これらはヘアピン構造を形成する。
本発明のいくつかの実施形態によると、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列は配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、相補鎖は配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、相補性は１００％である。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は相補鎖の核酸配列の５’末端にコンジュゲートしている。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分はｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列の５’末端にコンジュゲートしている。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は相補鎖の核酸配列の３’末端にコンジュゲートしている。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分はｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列の３’末端にコンジュゲートしている。
本発明のいくつかの実施形態によると、合成ｍｉＲ－１３５分子と細胞標的化部分とは連結基によって連結されている。
本発明のいくつかの実施形態によると、連結基は、ホスホジエステル、ホスホラミダイト、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジウム、スルファミン酸、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびこれらの混合物からなる群より選ばれる化合物を含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、連結基はＣ１０リンカーを含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は、脳細胞上に発現または提示された分子に特異的に結合する。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は、神経伝達物質輸送体に特異的に結合する。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は、セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）、ドーパミン再取り込み阻害薬（ＤＲＩ）、内在性カンナビノイド再取り込み阻害薬（ｅＣＢＲＩ）、アデノシン再取り込み阻害薬（ＡｄｏＲＩ）、興奮性アミノ酸再取り込み阻害薬（ＥＡＡＲＩ）、グルタミン酸再取り込み阻害薬（ＧｌｕＲＩ）、ＧＡＢＡ再取り込み阻害薬（ＧＲＩ）、グリシン再取り込み阻害薬（ＧｌｙＲＩ）およびノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ＮＤＲＩ）からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）は、セルトラリン、セルトラリン－構造類似体、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、インダルピン、ジメリジン、シタロプラム、ダポキセチン、エスシタロプラム、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分がセルトラリンのとき、コンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000001
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分がセルトラリンのとき、コンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000002
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分がセルトラリンのとき、コンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000003
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分がセルトラリンのとき、コンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000004
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は、腫瘍関連抗原と特異的に結合する。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞標的化部分は、骨細胞、筋肉細胞または胃腸細胞上に発現または提示された分子と特異的に結合する。
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートは、細胞膜透過部分または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送用の部分の少なくとも１種をさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートは、細胞膜透過部分またはＢＢＢを通過する輸送用の部分と、合成ｍｉＲ－１３５分子との間にリンカーをさらに含む。
本発明のいくつかの実施形態によると、細胞膜透過部分またはＢＢＢを通過する輸送用部分は、ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖および／または細胞標的化部分に結合されている。
本発明のいくつかの実施形態によると、投与は、鼻腔内、脳室内、髄腔内、経口、局所注射、静脈内投与からなる群より選ばれる投与形態によって実施される。
本発明のいくつかの実施形態によると、組成物は、鼻腔内、脳室内、髄腔内、経口、局所注射、または静脈内投与用である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＣＮＳ関連病態は精神障害である。
本発明のいくつかの実施形態によると、ＣＮＳ関連病態は、うつ病、不安、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、双極性疾患、ストレス、疲労、認知機能障害、パニック発作、強迫行動、中毒、社会恐怖症、睡眠障害、摂食障害、記憶障害、認知障害、成長障害および生殖障害からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、うつ病関連障害は、大うつ病、強迫性障害（ＯＣＤ）、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、不安障害、双極性障害、摂食障害および慢性疼痛からなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、がん性疾患は、卵巣がん、結腸直腸がんおよび前立腺がんからなる群より選ばれる。
本発明のいくつかの実施形態によると、対象は、骨粗鬆症、骨折または骨欠損、一次または二次副甲状腺機能亢進、骨関節炎、歯周疾患または欠陥、骨溶解疾患、形成術後後遺症、成形外科インプラント後後遺症、および歯科インプラント後後遺症からなる群より選ばれる骨関連疾患または病態を有する。
本発明のいくつかの実施形態によると、対象は、筋変性疾患、神経筋疾患、脊髄性筋萎縮症、炎症性筋疾患、および代謝性筋疾患からなる群より選ばれる筋肉関連疾患または病態を有する。
本発明のいくつかの実施形態によると、対象はヒト対象である。
別段定義されない限り、本願において使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本願において記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用できるが、例示的方法および／または材料を以下に記載する。定義等が矛盾する場合には、本特許明細書を優先する。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、必ずしも制限を意図するものではない。
本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照して、単に例として本願において記載する。以下、図面の詳細に具体的に参照するが、ここに示す特徴は例示であり、本発明の実施形態の例示的考察を目的とするものであることを強調する。これに関して、図面を伴う説明は、本発明の実施形態をいかに実施し得るかを当業者に明らかにする。
図１は、ｍｉＲ－１３５単鎖オリゴヌクレオチドの合成を示す。合成は、ＣＰＧ（制御細孔ガラス（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ））支持体上の固相合成のための典型的な実験手順を用いて実施した。典型的なオリゴヌクレオチド合成は、最も５’側のヌクレオチドが結合されるまで繰り返される、４種の工程（脱保護、カップリング、キャッピングおよび酸化）で構成された一連のサイクルによって（後述する「一般材料と実験手順」の項に詳細に記載したように）進行した。 図２は、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５の合成を図示する。セルトラリンおよびリンカーの５’末端への付加は以下の様に実施された。１．カルボキシＣ１０リンカー付加： 誘導化セルトラリン（Ｃ６－ＮＨ２に結合したセルトラリン）のオリゴヌクレオチドの５’末端への結合を容易にするために最終サイクル（ＤＭＴ－ＯＦＦ）の後に、カルボキシＣ１０リンカーアミダイトブロック（そのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル型）を、最終カップリング工程で配列に結合した。２．セルトラリン付加： 誘導化セルトラリンを、アミド結合を介して５’－カルボキシＣ１０修飾オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした。この凝縮は有機条件（ジイソプロピルエチルアミンおよびジメチルホルムアミド（ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ）、室温で２４時間、後述した実施例で詳細に説明）下で実施した。 図３のＡ～Ｂは、デュプレックス１１がＳｌｃ６ａ４の３’ＵＴＲ（図３のＡ）およびＨＴＲ１ａの３’ＵＴＲ（図３のＢ）を有意に標的化することを示す、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を表す。 図４のＡ～Ｅは、ｍｉＲ－１３５模倣体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるセロトニン性機能に対する効果を表す。注目すべき点は、全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ体重（ＢＷ）、ｉ．ｐ．）は、むき出しの（即ち、未コンジュゲート）ｍｉＲ－１３５処置（１００μｇ）マウスにおいて、処置後２４時間（図４のＡ）、４８時間（図４のＢ）、７２時間（図４のＣ）および９６時間（図４のＤ）に低体温症を発症させなかった点にある。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝５～１０）に対して有意な効果（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示した。群間で基礎体温の違いは見られなかった（図４のＥ）。 同上 図５のＡ～Ｄは、直接背側縫線核（ＤＲＮ）投与に続く、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体デュプレックス１１（ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１、配列番号１０および１３に示す）のセロトニン性機能に対する効果を図示する。注目すべき点は、全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）は、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５処置（１００μｇ）マウスにおいて、処置後２４時間（図５のＡ）、４８時間（図５のＢ）、９６時間（図５のＣ）および７日（図５のＤ）に低体温症を発症させなかった点にある。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝１０）に対して有意な効果（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示した。 図６のＡ～Ｈは、低用量（３０μｇ）のセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５（ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１）の急性処置は、５ＨＴ１ａおよびＳＥＲＴのサイレンシングを生じ、抗うつ剤様応答をもたらすことを図示する。注目すべき点は、全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）が、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５処置（３０μｇ）マウスにおいて、処置から１日目（図６のＡ）、２日目（図６のＢ）、４日目（図６のＣ）および７日目（図６のＤ）に低体温症を発生しなかった点である。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝１０）に対して有意な効果（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示した。群間で基礎体温の違いは見られなかった（ｎ＝１０～４０）（図６のＥ）。テールサスペンション試験の際にｍｉＣｕｒｅ－１３５－１処置マウスの内側前頭前野（ｍＰＦＣ）において、細胞外セロトニンの増加が明らかとなった。有意な効果（＊Ｐ＜０．０５）と対照との対比（図６のＦ）。単回脳内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１投与（３０μｇ）は、テールサスペンション試験（ｎ＝８－９）において、不動性の減少をもたらした（図６のＧ）。［３Ｈ］－シタロプラム結合のオートラジオグラフィーは、対照（ｎ＝５～７）と比べて処置マウスにおける背側縫線のＳＥＲＴ密度の減少を示した、＊ｐ＜０．０５（図６のＨ）。 同上 同上 図７のＡ～Ｃは、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１（１６６μｇ）の急性鼻腔内投与が５ＨＴ１ａのサイレンシングを生じ、抗うつ剤様応答をもたらすことを図示する。注目すべき点は、全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）が、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５処置（１６６μｇ）マウスにおける鼻腔内送達に続いて、５日目に低体温症を発生しなかった点である。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝５）に対して有意な効果（＊Ｐ＜０．０５）を示した（図７のＡ）。単回鼻腔内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１投与（１６６μｇ）は、処置から４日後のテールサスペンション試験で不動性の減少を示した（ｎ＝８～９）。＊Ｐ＜０．０５と対照との対比（図７のＢ）。単回鼻腔内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１投与（１６６μｇ）を受けたマウスは、暗／明移動試験（ｎ＝１１～１２）において、対照よりも長期間にわたり明コンパートメントを探索した。＊Ｐ＜０．０５と対照との対比（図７のＣ）。 図８は、実施した追加のｍｉＲ－１３５修飾を示す。修飾は次の通りである。大文字（例：Ａ，Ｕ，Ｃ，Ｇ）：ＲＮＡ；小文字（例：ａ，ｕ，ｃ，ｇ）：２’－Ｏ－Ｍｅ修飾；Ｕｍ：（２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ）ウラシル修飾；Ａｍ：（２’－Ｏ－ＭＯＥ）アデニン修飾；小文字の‘ｓ’：ホスホロチオエートで、表示無しは正常ホスホジエステル結合を意味する；Ｐ：リン酸塩；下線：２’－フルオロ、即ち、２’－Ｆ。 図９Ａ～図９Ｂは、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－９、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１がＳｌｃ６ａ４ ３’ＵＴＲ（図９Ｂ）およびＨＴＲ１ａ ３’ＵＴＲ（図９Ａ）を有意に標的化することを示すルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を表す。バーの上の数字は、（５回の実験中に）見いだされた統計的有意差数である。 同上 図１０Ａ～図１０Ｅは、３種の異なるｍｉＲ－１３５コンジュゲートデュプレックスによるｉｎ ｖｉｔｒｏの処置に続くヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫応答を表す。注目すべき点は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０がＴＮＦアルファサイトカインの高い分泌量を特に３００ｎＭの濃度で誘導し、一方、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１は緩やかにこのサイトカインを活性化し、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２ほとんど分泌を誘導しなかった（図１０Ａ）点である。同じ分泌パターンがＩＦＮ－アルファ－２ａサイトカインについても示され（図１０Ｂ）、ここでｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０高レベルの分泌を誘導し、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１は中レベルの分泌を誘導し、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２は分泌を誘導しなかった。試験したデュプレックスのいずれもがＩＬ－１０（図１０Ｃ）、ＩＬ－１ベータ（図１０Ｄ）またはＩＬ－６（図１０Ｅ）の分泌を誘導しなかった。図１０Ａ、図１０Ｃ～図１０Ｅにおいて、ｄｉｒ．インキュベーションは直接インキュベーションを意味する。 同上 同上 同上 同上 図１１Ａ～図１１Ｆは、３種のｍｉＲ－１３５コンジュゲートデュプレックスの追加セットによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの処置に続くヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫応答を表す。注目すべき点は、ｍｉＲ－１３５－１１およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９がＩＦＮ－アルファ－２ａの高分泌を誘導し、一方、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３はその分泌をほとんど誘導しなかった点である（図１１Ａ）。低レベルのＴＮＦ－アルファ分泌がｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９によって誘導され、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３によって分泌は誘導されなかった（図１１Ｂ）。３００ｎＭ濃度のｍｉＣｕｒｅ－１３５－９はＩＦＮ－ガンマの低レベルの分泌をしめし、一方、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９はその分泌を示さなかった（図１１Ｃ）。３種の試験したデュプレックスのいずれもがサイトカインＩＬ－１０（図１１Ｄ）、ＩＬ－１ｂ（図１１Ｅ）、またはＩＬ－６（図１１Ｆ）の顕著な産生をもたらさなかった。 同上 同上 同上 同上 同上 図１２のＡ～Ｇは、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９）のセロトニン性機能に対する効果およびそれらの抗うつ剤様効果を表す。全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２処置（３０μｇ）マウスにおいて、処置から２日目（図１２のＡ）、４日目（図１２のＢ）および７日目（図１２のＣ）に低体温症を発生しなかった。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝４～５）に対して有意な効果（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示した。全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－９－処置（３０μｇ）マウスにおいて、処置から２日目（図１２のＤ）に低体温症を発生させなかった。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝４）に対して有意な効果（Ｐ＜０．０５）を示した。群間に基礎体温の違いはなかった（図１２のＥ）（ｎ＝４～１９）。局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（シタロプラム、１０μＭ）の逆透析（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｄｉａｌｙｓｉｓ）による注入は、セルトラリンコンジュゲート対照（１００μｇ）処置マウスのＰＦＣにおいて、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（１００μｇ）処置マウス（図１２のＦ）と比べて、細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加をもたらした。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝６）に対して有意な効果（＊Ｐ＜０．０５）を示した。単回脳内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３投与（１００μｇ）はテールサスペンション試験において不動性の減少をもたらした（ｎ＝６）、＊ｐ＜０．０５（図１２のＧ）。 同上 同上 図１３のＡ～Ｆは、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体の鼻腔内および脳室内（ＩＣＶ）投与が、ｉｎ ｖｉｖｏのセロトニン性機能に対する効果を維持することを示す。注目すべき点は、全身８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ／ｋｇ ＢＷ、ｉ．ｐ．）は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（５０μｇ）（図１３のＡ）、（１００μｇ）（図１３のＢ）および（２００μｇ）（図１３のＣ）で処置したマウスにおいて処置後４８時間で低体温症をもたらさなかった点である。同様の効果が７日間にわたるｍｉＣｕｒｅ－１３５－２（３３μｇ／日）の鼻腔内投与の２４時間後（図１３のＤ）および７日間にわたるｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２００μｇ／日）のＩＣＶ投与から９６時間後（図１３のＥ）にも図示された。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝６）に対して有意な効果（＊Ｐ＜０．０５）を示した。７日間にわたるｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２００μｇ／日）の鼻腔内投与によって処置したマウスは、セルトラリンコンジュゲート対照（２００μｇ／日）処置マウスと比べて、逆透析による局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（シタロプラム）の注入に続くＰＦＣ中の細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）のより少ない増加を示した（図１３のＦ）。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝６）に対して有意な効果（＊Ｐ＜０．０５）を示した。 同上 図１４のＡ～Ｇは、急性鼻腔内投与したｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２５００μｇ）がセロトニン性機能に影響し、抗うつ剤様応答を生じることを図示する。免疫ブロット画像および定量化は、対照と比べて処置マウスにおいて、背側縫線のＳＥＲＴ（図１４のＡ～Ｂ）およびＨＴＲ１ＡＲ（図１４のＣ～Ｄ）のタンパク質レベルが低下することを示す（ｎ＝６～７）、＊ｐ＜０．０５。８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与（１ｍｇ ｋｇ－１、ｉ．ｐ．）（ｎ＝５～６）後に対照のｍＰＦＣでは細胞外セロトニンが減少したが、処置マウスでは減少しなかった。群の有意な効果（Ｐ＜０．０５と対照との対比（図１４のＥ）。逆透析による局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（シタロプラム１０μＭ）の注入は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２５００μｇ）処置マウス（図１４のＦ）と比べて、セルトラリンコンジュゲート対照（２５００μｇ）処置マウスのＰＦＣにおいて細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加をもたらした。２元配置分散分析は対照群（ｎ＝６）に対してＰ値＝０．０５を示した。単回鼻腔内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３投与（２５００μｇ）後の（後述する「一般材料と実験手順」の項に詳細に記載したような）テールサスペンション試験における不動性の減少をもたらした（ｎ＝８～１４）、＊ｐ＜０．０５（図１４のＧ）。 同上 図１５は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２５００μｇ）の急性鼻腔内投与は、うつ病様行動を誘導したマウスにおいて抗うつ剤様応答を生じること図示する。マウスは、うつ病様行動を誘導する２８日間のプロトコル（下記の一般材料と実験手順の項を参照）を経た後、対照またはｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の単回鼻腔内投与を受けた。結果は、処置から３日後に単回鼻腔内ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３投与（２５００μｇ）テールサスペンション試験において不動性の減少がもたらされることを表す（ｎ＝８～１０）、＊Ｐ＜０．０５と対照との対比。 図１６のＡ～Ｄは、鼻腔内投与に続くｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の背側縫線核における局所化を図示する。鼻腔内投与（１０００μｇ）に続くトリプトファンヒドロキシラーゼ２陽性（ＴＰＨ２陽性）神経細胞におけるａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（緑）の選択的蓄積。共焦点像は、背側縫線核（ＤＲ）５－ＨＴ神経細胞（ＴＰＨ２陽性、赤）におけるａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（黄）の共局在化を示す。細胞核をＤＡＰＩ（４，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、青）で染色した。各行は異なるマウス（ｎ＝３，図１６のＡ）を表し、図１６のＡの‘ｅｘｍ１’に示した枠の高倍率顕微鏡写真は、背側縫線核（ＤＲ）５－ＨＴ神経細胞におけるａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の共局在化を示すために提供した（図１６のＢ～Ｃ）。スケールバー：左＝１００μｍ、右＝２５μｍ。対照的に、ａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３は投与部位（嗅球）近傍の脳領域または脳室（海馬および線条体）の細胞には不存在であった（図１６のＤ）。 同上 同上 図１７のＡ～Ｄは、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（１００μｇ）の急性投与後の縫線核における細胞生存率の免疫組織学的計測を図示する。コンジュゲート対照、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３または細胞生存率に対して何の影響もないと過去に報告されている陽性対照を背側縫線核に急速に送達した。中脳縫線核を通る隣接する厚み３０μｍの切片を神経細胞性ＮｅｕＮマーカー（図１７のＡ）、マイクログリア性Ｉｂａ１マーカー（図１７のＢ）、またはセロトニン性ＴＰＨマーカー（図１７のＣ）で染色した。異なる処置下でＮｅｕＮ、Ｉｂａ１およびＴＰＨで染色された中脳縫線核を表す代表画像を図１７のＤに示した。注目すべき点は、全実験群間でいずれのマーカーについても違いが発見されなかった点である。代表図を図１７のＣに示し、スケールバーは１００μｍである。 同上 同上
本発明は、そのいくつかの実施形態において、治療用ｍｉＲ－１３５分子に関し、より具体的にはその使用に関するが、これに限定されるものではない。
本発明の原理と作用は、図面とそれに付随する説明を参照することによってよく理解することができる。
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が、以下の記載に示すかまたは実施例で例示する詳細に限定されるものではないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、また、様々な手段で実施または実行することが可能である。また、本明細書で使用される語句や用語は、説明のためのものであり、限定的なものと見なされるべきではないことを理解されたい。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、転写後に遺伝子発現を調節する小ＲＮＡ分子のサブセットであり、脳を含む種々の組織に豊富に存在する。
本発明を実施するに当たり、本発明者らは療法用の新規な合成ｍｉＲ－１３５分子を合成した。さらに本発明者らは、目的細胞に対して特異的に結合可能な他の分子にｍｉＲ－１３５分子をカップリングすることで、ｍｉＲ－１３５分子を全ての目的細胞に対して標的することが可能であることを明らかにした。
具体的には、本発明者らは安定性および細胞浸透性を改善する目的のいくつかの修飾を有する内因性ｍｉＲ－１３５に基づき、２本鎖、即ち、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含むｍｉＲ－１３５模倣体分子を設計し、合成した（下記表１および表、６並びに図８を参照）。次に、ｍｉＲ－１３５模倣体分子（表１ではデュプレックス１～１７、表６ではデュプレックス１～１６と命名）を公知のｍｉＲ－１３５標的（例：Ｈｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４）に対してｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした。合成した模倣体ｍｉＲ－１３５分子の１つ（表１ではデュプレックス１１、表６ではデュプレックス１と命名、配列番号１０および１３に示す）は、ヒト細胞系ＨＥＫ２９３Ｔにおいて、ｍｉＲ－１３５標的（例：Ｈｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４）に対して合成および試験した他の分子よりも有意な結合を示した（図３のＡ～Ｂおよび後述する実施例１を参照）。ｍｉＲ－１３５模倣体分子（即ち、表１のデュプレックス１１および表６のデュプレックス１）は、ｍｉＲ－１３５ｂの（配列番号３７に示す）ガイド配列および本来の配列とは異なる（配列番号４０に示す）相補的配列を含んでいた。さらにこの合成ｍｉＲ－１３５分子（即ち、表１のデュプレックス１１および表６のデュプレックス１）は、動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏのセロトニン性機能を有することが示された（図４のＡ～Ｅおよび後述する実施例２参照）。
本発明者らは、脳への非侵襲性送達のためにセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５分子を更に設計し、合成した。セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体デュプレックス１１（本願でｍｉＣｕｒｅ－１３５－１と命名）のｉｎ ｖｉｖｏ研究は、背側縫線核（ＤＲＮ）への単回投与が７日目までにナイーブマウスにおいて選択的ＨＴＲ１ａアゴニスト８－ＯＨ－ＤＰＡＴによって誘導される低体温症を排除するのに十分であることを明らかにした（図５のＡ～Ｄと図６のＡ～Ｅ、後述する実施例３～４を参照）。セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５分子のＤＲＮへの投与は、処置マウスにおける抗うつ効果のみならず、より良い対応機構（ｃｏｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を誘導することがさらに示された（図６のＦ～Ｇおよび後述する実施例４）。セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５分子のＤＲＮへの投与は、ＳＥＲＴ遺伝子をサイレンシングすることも示された（図６のＨおよび後述する実施例４）。加えて、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５の非侵襲性鼻腔内投与は、処置マウスにおいて、より低い低体温応答で示されるように５ＨＴ１ａをサイレンシングし（図７のＡおよび後述する実施例５）、そして抗うつ／抗不安様応答をもたらした（図７のＢ～Ｃおよび後述する実施例５）。
さらなる実験によって、本発明者らは種々の化学修飾を含む追加のセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体、即ち、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－９、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１（後述する表６を参照）は強力であり、５ＨＴＲ１ＡレベルおよびＳＬＣ６ａ４レベルの両方を有意に変更するものであることを明らかにした（３’ＵＴＲルシフェラーゼ構築物を使用、図９Ａ～図９Ｂおよび後述する実施例６を参照）。結合ｍｉＲ－１３５模倣体の免疫活性化に対する効果を試験した。結果（図１０Ａ～図１０Ｅと図１１Ａ～図１１Ｆ、および後述する実施例７を参照）から明らかなように、異なる結合ｍｉＲ－１３５模倣体は種々の免疫応答を誘導し、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－３はＰＢＭＣから最も低いサイトカイン分泌を誘導した。加えて、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体であるｍｉＣｕｒｅ－１３５－２、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９の背側縫線核（ＤＲＮ）への急性投与は、セロトニン性機能に影響し、抗うつ剤様応答を引き起こした（図１２のＡ～Ｇおよび後述する実施例８を参照）。さらに、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体の鼻腔内および脳室内への投与は、背側縫線核におけるセロトニン性自己受容体（５ＨＴ１ａ）およびセロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）の減少に成功した（図１３のＡ～Ｆおよび後述する実施例９を参照）。
さらなる実験によって、本発明者らはｍｉＲ－１３５模倣体であるｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の急性鼻腔内投与がＳＥＲＴおよび５－ＨＴ１Ａ自己受容体（ＨＴＲ１ＡＲ）のタンパク質レベルを低下させ、抗うつ効果を示すことを明らかにした（後述する実施例１０および１１）。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の鼻腔内投与は、背側縫線核、特に中脳５－ＨＴ神経細胞への蓄積をもたらした（後述する実施例１２）。加えて、ｍｉＲ－１３５模倣体であるｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の鼻腔内投与は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与において安全であることが見いだされた（後述する実施例１３）。
従って、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子のみならず、そのコンジュゲート型も、精神障害を含むＣＮＳ関連病態の治療等の療法に用いても良い。
よって、本発明の一態様において、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖を含む合成ｍｉＲ－１３５分子を含む組成物を提供する。
本発明の一態様において、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖を含む合成ｍｉＲ－１３５分子が提供される。
本願においては、「合成」とは非天然型分子を意味する。
一実施形態においては、非天然型ｍｉＲ－１３５は、天然型成熟ｍｉＲ－１３５ｂの配列を含み、且つ合成主鎖および／または側鎖を含む。典型的には、合成ｍｉＲ－１３５分子は、細胞内または生理学的条件下において天然型ｍｉＲＮＡ（例：ｍｉＲ－１３５ｂ）として機能する。
本願で使用する「ｍｉＲ－１３５ｂ」という用語は、転写後遺伝子調節に関与するマイクロＲＮＡ分子を意味し、ｍｉＲ－１３５ｂの５’（即ち、ｍｉＲ－１３５ｂ、ｍｉＲ－１３５ｂ－５ｐとも称する）または３’（即ち、ｍｉＲ－１３５ｂ＊、ｍｉＲ－１３５ｂ－３ｐとも称する）を含む。例示的な成熟ｍｉＲ－１３５ｂとしては、アクセッション番号ＭＩＭＡＴ００００７５８（配列番号３７）に示すｍｉＲ－１３５ｂが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的な成熟ｍｉＲ－１３５ｂ＊としては、アクセッション番号ＭＩＭＡＴ０００４６９８（配列番号３８）に示すｍｉＲ－１３５ｂ＊が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
マイクロＲＮＡは、典型的には、ｐｒｅ－ｍｉＲ（ｐｒｅ－マイクロＲＮＡ前駆体）からプロセッシングされる。Ｐｒｅ－ｍｉＲはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写される前駆体ｍｉＲＮＡ分子のセットであって、例えば、培養細胞にトランスフェクトとされた際に、機能的ｍｉＲＮＡに効率よくプロセッシングされるものである。Ｐｒｅ－ｍｉＲは、「（ｍｉＲＮＡ）機能獲得」実験においてその発現を下方制御することで、その標的の機能を指定するために使用することができる。Ｐｒｅ－ｍｉＲのデザインはｍｉＲＮＡレジストリーに列挙された全ての公知ｍｉＲＮＡに対して存在し、いかなる研究のためにも容易に設計することができる。マイクロＲＮＡは、さらに詳細に後述するように、そのまままたは核酸構築物に連結して、細胞に投与してもよい。
本教示のマイクロＲＮＡ（例：ｍｉＲ－１３５）は、いかなるマイクロＲＮＡの直接または間接的な標的（例：ｍｉＲ－１３５標的）に対しても結合する、付着する、調節する、処理する、介入する、増加させる、安定化させるおよび／または脱安定化させるものである。このような標的としては、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子およびポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、例えば、セロトニントランスポーター（即ち、ＳＥＲＴまたはＳｌｃ６ａ４）、セロトニン阻害性受容体１ａ（Ｈｔｒ１ａ）、トリプトファンヒドロキシラーゼ２（Ｔｐｈ２）およびモノアミンヒドロキシラーゼ（ＭａｏＡ）等のセロトニン関連遺伝子、アドレナリンまたはノルアドレナリン受容体（Ａｄｒ１等のアドレナリン性受容体）、アデニル酸シクラーゼ１型（ＡＤＣＹ１）、Ｃｒｈ１Ｒ等のＣＲＨ受容体、あるいは以下のような他の分子：ＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）、トランスリン関連タンパク質Ｘ（Ｔｓｎａｘ）および細胞接着分子Ｌ１（Ｌ１ｃａｍ）、あるいは後述する表７に列挙した精神障害と関連する他の標的が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
追加の直接または間接的な標的としては、アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（Ａｄｃｙａｐ１またはＰＡＣＡＰ）；アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１受容体１（Ａｄｃｙａｐ１ｒ１）；アドレナリン性受容体，アルファ２ａ（Ａｄｒａ２ａ）；アンキリン３（ＡＮＫ３）；活性調節細胞骨格関連タンパク質（Ａｒｃ）；Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質６（Ａｒｈｇａｐ６）；活性化転写因子３（Ａｔｆ３）；ベータ部位ＡＰＰ開裂酵素１（Ｂａｃｅ１）；カルシウムチャネル，電位依存性，Ｌ型，アルファ１Ｄサブユニット（Ｃａｃｎａ１ｄ）；細胞接着分子３（Ｃａｄｍ３）；コンプレキシン１（Ｃｐｌｘ１）；コンプレキシン２（Ｃｐｌｘ２）；ＣＵＢおよびスシ多重ドメイン１（Ｃｓｍｄ１）；カゼインキナーゼ１，ガンマ１（Ｃｓｎｋ１ｇ１）；ダブルコルチン（Ｄｃｘ）；ＤＩＲＡＳファミリー，ＧＴＰ－結合ＲＡＳ様２（Ｄｉｒａｓ２）；ディスクラージホモログ２（Drosophila）（Ｄｌｇ２）；ＥＴＳ癌遺伝子ファミリーのメンバーであるＥＬＫ１（Ｅｌｋ１）；ｆｙｎ－関連キナーゼ（Ｆｒｋ）；フコシルトランスフェラーゼ９（アルファ（１，３）フコシルトランスフェラーゼ）（Ｆｕｔ９）；ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ－Ａ）受容体，サブユニットベータ２（Ｇａｂｒｂ２）；ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）；成長ホルモン分泌促進薬受容体（Ｇｈｓｒ）；Ｇタンパク質共役型受容体３（Ｇｐｒ３）；グルタミン酸受容体、イオンチャンネル型ＡＭＰＡ３（アルファ３）（ＧＲＩＡ３）；グルタミン酸受容体，イオンチャンネル型，カイニン酸３（Ｇｒｉｋ３）；Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ５（Ｇｒｋ５）；グリコーゲンシンターゼキナーゼ－３ベータ（ＧＳＫ３Ｂ）；過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カリウムチャネル１（Ｈｃｎ１）、過分極活性化環状ヌクレオチド依存性Ｋ＋２（Ｈｃｎ２），５－ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ａ（Ｈｔｒ１ａ）；イノシトールモノホスファターゼ（ＩＭＰＡ１）、カリリン、ＲｈｏＧＥＦキナーゼ（Ｋａｌｒｎ）；中／小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル、サブファミリーＮ，メンバー３（ＫＣＮＮ３）；カリオフェリンアルファ３（インポルチンアルファ４）（Ｋｐｎａ３）；ミエリン転写因子１様（Ｍｙｔ１ｌ）；核受容体共活性化因子２（Ｎｃｏａ２）；Ｎ－Ｍｙｃ下流調節遺伝子４（Ｎｄｒｇ４）；一酸化窒素シンターゼ１（神経細胞性）アダプタータンパク質（ＮＯＳ１ＡＰ）；核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー２（Ｎｒ３ｃ２）；ネトリンＧ１（Ｎｔｎｇ１）；核カゼインキナーゼおよびシクリン依存性キナーゼ基質１（Ｎｕｃｋｓ１）；ホスホジエステラーゼ１Ａ、カルモジュリン依存性（Ｐｄｅ１ａ）；ホスホジエステラーゼ４Ａ、ｃＡＭＰ特異的（Ｐｄｅ４ａ）；ホスホジエステラーゼ８Ｂ（Ｐｄｅ８ｂ）；ホスホリパーゼＣ、ベータ１（Ｐｌｃｂ１）；プロラクチン受容体（Ｐｒｌｒ）；ＲＡＢ１Ｂ、メンバーＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１ｂ）；Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ－２ａ（Ｒａｐ２ａ）；レチノイド関連オーファン受容体ベータ（Ｒｏｒｂ）；サーチュイン１（サイレント交配型情報調節２、ホモログ１）（Ｓｉｒｔ１）；溶質キャリアファミリー１２，（塩化カリウムトランスポーター）メンバー６（Ｓｌｃ１２ａ６）；溶質キャリアファミリー５（塩素トランスポーター）、メンバー７（Ｓｌｃ５ａ７）；溶質キャリアファミリー６（神経伝達物質輸送体、セロトニン）、メンバー４（Ｓｌｃ６ａ４）；トランス作動性転写因子１（Ｓｐ１）；シナプス小胞糖タンパク質２ｂ（Ｓｖ２ｂ）；シナプス核エンベロープ１（ネスプリン－１をコードする）（Ｓｙｎｅ１）；シナプトタグミンＩ（Ｓｙｔ１）；シナプトタグミンＩＩ（Ｓｙｔ２）；シナプトタグミンＩＩＩ（Ｓｙｔ３）；トランスフォーミング成長因子、ベータ受容体ＩＩ（Ｔｇｆｂｒ２）；甲状腺ホルモン受容体、ベータ（Ｔｈｒｂ）；一過性受容体電位依存性カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー６（Ｔｒｐｃ６）；小胞体関連膜タンパク質２（Ｖａｍｐ２）；ウイングレス関連ＭＭＴＶ組み込み部位３（Ｗｎｔ３）；およびジンクフィンガー、ＢＥＤドメイン含有４（Ｚｂｅｄ４）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
Figure 2024503711000005
Figure 2024503711000006
「核酸」とは、本願においては、通常、核酸塩基を含むＲＮＡまたはその誘導体、模倣物または類似体の分子（一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマー）を意味する。核酸塩基には、例えば、ＲＮＡから見いだされる天然型プリンまたはピリミジン塩基（例：アデニン「Ａ」、グアニジン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」またはシトシン「Ｃ」）が含まれる。「核酸」という用語には、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」が含まれ、それぞれが「核酸」という用語の亜属である。「核酸」という用語はさらに合成ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド分子に由来する、天然型塩基、糖および共有ヌクレオシド間結合から構成される核酸（例：骨格）のみならず、対応する天然型部分と同様に機能する非天然型部分を有する合成ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドも含む。このような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、より詳細に後述するように、所望の特性、例えば、向上した細胞取り込み、核酸標的に対する親和性の増加、ヌクレアーゼの存在下における安定性の増加故に本来の形態よりも好まれることもある。
「模倣体」または「類似体」という用語は、天然型分子に似た構造を有するか有していないが、類似した機能を有する分子を意味する。
本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂおよび相補鎖を含む二本鎖核酸分子である。このような二本鎖核酸分子は天然型ｍｉＲＮＡ前駆体と類似した構造を有し、細胞タンパク質複合体に結合し、活性成熟ｍｉＲＮＡへとプロセッシングされ得る。
特定の実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂ（「ガイド鎖」または「活性鎖」とも称する）は、内因性成熟ｍｉＲ－１３５ｂに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または同一性を有する配列を含む。特定の実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂは、内因性成熟ｍｉＲ－１３５ｂと比較可能な（例：同一の）配列を含む。
２つの核酸またはポリペプチド配列に対して本願で使用する「配列同一性」または「同一性」には、アライメントした際に２つの配列で同じ残基に参照する。タンパク質に参照して配列同一性のパーセンテージが使用されるとき、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存性アミノ酸置換によって異なり、このとき、アミノ酸残基は類似した化学的性質（例：電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基によって置換され、そのため、分子の機能的性質は変更されない。配列が保存性置換によって異なる場合、置換の保存的性質について修正するためにパーセント配列同一性は上向きに調整され得る。このような保存性置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると考えられる。このような調整を行うための手段は当業者に広く知られている。典型的には、保存性置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコア付けすることを含み、それによってパーセンテージ配列同一性を増やす。よって、例えば、同一アミノ酸のスコアが１で、非保存性置換のスコアが０のとき、保存性置換には０と１との間のスコアが与えられる。保存性置換のスコアを、例えば、Henikoff S and Henikoff JG.［Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89(22): 10915-9］のアルゴリズムに従って計算する。
同一性 （例：パーセント相同性） は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）等の任意の相同性比較ソフトウエアを、デフォルトのパラメーターを使用して用い、決定することができる。
本発明のいくつかの実施形態によると、同一性は包括的な同一性、即ち、本発明の核酸配列全長に対し、その部分に対するものではない同一性である。
本発明のいくつかの実施形態によると、「相同性」または「相同である」という用語は、２以上の核酸配列の同一性、または２以上のアミノ酸配列の同一性、またはアミノ酸配列と１以上の核酸配列の同一性を意味する。
本発明のいくつかの実施形態によると、相同性は包括的な相同性、即ち、本発明の核酸配列全長に対し、その部分に対するものではない相同性である。
２またはそれ以上の配列間の相同性または同一性の程度は、種々の公知の配列比較ツールを用いて決定することができる。以下は本発明のいくつかの実施形態と共に使用可能なこのようなツールの非限定的な説明である。
ポリヌクレオチド配列から開始し、他のポリヌクレオチド配列と比較する場合は、ＥＭＢＯＳＳ－６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（emboss(dot)sourceforge(dot)net/apps/cvs/emboss/apps/needle(dot)htmlより入手可）を使用することができる。
いくつかの実施形態によると、相同性の程度の決定は、（タンパク質－タンパク質比較またはヌクレオチド－ヌクレオチド比較のための）Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムの使用をさらに必要とする。
本発明のいくつかの実施形態によると、目的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する包括的相同性（例：全長配列に対して８０％の包括的相同性）を求める前に、目的ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの局所的相同性に基づき事前に選択した配列（例：配列長の６０％に対して６０％の同一性）に対して包括的相同性を求める。例えば、相同配列は、ＢｌａｓｔｐおよびｔＢｌａｓｔｎアルゴリズムをフィルターとしたＢＬＡＳＴソフトウエアを第１ステージに用い、ニードル（ＥＭＢＯＳＳパッケージ）またはＦｒａｍｅ＋アルゴリズムを第２ステージのアライメントに用いて選択する。局所同一性（Ｂｌａｓｔアライメント）は、包括的アライメントステージのフィルターとしてのみ使用されるため、配列長の６０％に対する６０％同一性という寛大なカットオフ値で定義される。この特定の実施形態（局所同一性を使用する場合）は、（パラメーター“－ＦＦ”を設定することで）Ｂｌａｓｔパッケージのデフォルトのフィルタリングは使用しない。第２ステージでは、コア遺伝子のポリペプチド配列に対する少なくとも８０％の包括的同一性に基づきホモログを定義する。
特定の実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂは配列番号３７に示す配列を有する。
特定の実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂは配列番号１、５、７、８、１０、１４、１６、４１、４２、４３、４４、４５または４６に示す配列を有する。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子の相補鎖（本願において「パッセンジャー鎖」とも称する）は、成熟ｍｉＲ－１３５ｂ配列に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有する配列を含む。
特定の実施形態においては、相補鎖は、ガイド鎖に対して１００％相補的、即ち、完全にマッチする配列を含む。
特定の実施形態においては、相補鎖は配列番号４０に示す配列を含む。
特定の実施形態においては、相補鎖は配列番号２、３、４、６、９、１１、１２、１３、１５または４７に示す配列を含む。
特定の実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列（例：配列番号３７に示すもの）および相補鎖の核酸配列（例：配列番号４０に示すもの）は、全長核酸配列にわたって（例：配列番号３７および配列番号４０全長にわたり）１００％相補的である。
特定の実施形態においては、本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子のガイド鎖とパッセンジャー鎖との間にオーバーハングはない。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４０に示す相補鎖を含む。
本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子の長さは、任意で１００ヌクレオチド以下、または任意で９０ヌクレオチド以下、または任意で８０ヌクレオチド以下、または任意で７０ヌクレオチド以下、または任意で６０ヌクレオチド以下、または任意で５５ヌクレオチド以下、または任意で５０ヌクレオチド以下である。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子４６～５０残基を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４６～５５残基を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４６～６０残基を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４６～７０残基を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４６～８０残基を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、長さとして少なくとも約４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０核酸残基を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、長さとして４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９または７０核酸以下を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は５２核酸以下を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は５０核酸以下を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４８核酸以下を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は５２核酸を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は５０核酸を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４８核酸を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は４６核酸を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子はリンカー領域を含まない。この場合、ｍｉＲ－１３５ｂ領域および相補的領域（即ち、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のそれぞれ）は独立し、デュプレックスとしてアニーリングされている。
一実施形態においては、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖は、二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子に存在する。
一実施形態においては、配列番号１、５、７、８、１０、１４、１６、４１、４２、４３、４４、４５または４６のいずれか１つに示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号２、３、４、６、９、１１、１２、１３、１５または４７のいずれか１つに示す相補鎖は、二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子に存在する。
一実施形態においては、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖はヘアピンループ構造を形成する。
一実施形態においては、配列番号１、５、７、８、１０、１４、１６、４１、４２、４３、４４、４５または４６のいずれか１つに示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号２、３、４、６、９、１１、１２、１３、１５または４７のいずれか１つに示す相補鎖はヘアピンループ構造を形成する。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列（例：ガイド鎖）と相補配列の核酸配列（例：パッセンジャー鎖）との間にリンカー領域を含む。このようなリンカー領域はヘアピンループを形成してもよい。よって本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子は、分子内のｍｉＲ－１３５ｂ領域と相補的領域との間の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成することができる。
一実施形態においては、リンカー領域は２～３０残基を含む。
一実施形態においては、リンカー領域は、長さとして少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０残基を含む。
一実施形態においては、リンカー領域は長さとして２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０残基以下である。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子はｍｉＲ－１３５ｂ（例：ガイド鎖）および／または相補的配列（例：パッセンジャー鎖）の５’末端または３’末端のいずれかに隣接する配列を含んでもよい。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂ（例：ガイド鎖）および／または相補的配列（例：パッセンジャー鎖）の一方または両方の側に隣接する少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドがある。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５ｂ（例：ガイド鎖）および／または相補的配列（例：パッセンジャー鎖）は隣接する配列を含まない。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子（例：ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖）の核酸配列は１以上の修飾を含む。
一実施形態においては、（例：ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖の）ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、内因性成熟ｍｉＲ－１３５ｂ配列またはその相補鎖（本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列とも称する）と比べて単一の修飾を有する。
他の実施形態によると、ｍｉＲ－１３５分子（例：ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖）の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれ以上の修飾を有する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、１～２の修飾を有する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、３～４の修飾を有する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、５～１０の修飾を有する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、１０～１５の修飾を有する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子の核酸配列は、本来のｍｉＲ－１３５ｂ配列と比べて、１６～２６の修飾を有する。
よって本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、所望の特徴を付与する修飾を含むように合成することができる。例えば、修飾は、安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーションの熱力学、特定の組織または細胞型の標的化、あるいは（例：エンドサイトーシス依存性または非依存性の機構による）細胞浸透性を向上し得る。修飾は、さらに配列特異性を増加し、その結果、部位外の標的化を減少させ得る。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、分子がその生物活性（例：ｍｉＲ－１３５サイレンシング活性）の少なくとも約９０％、９５％、９９％または１００％を保持する限り、核酸の挿入、欠損、置換または点変異から選ばれる修飾を含む。
一実施形態において、合成ｍｉＲ－１３５分子には、少なくとも１つの塩基（例：核酸塩基）の修飾または置換が含まれる。本願で使用する「未修飾」または「天然」塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、とウラシル（Ｕ）が含まれる。「修飾」塩基には、他の合成および天然塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ハイポキサンチン；２－アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体；２－チオウラシル、２－チオチミン、および２－チオシトシン；５－ハロウラシルおよびシトシン；５－プロピニルウラシルおよびシトシン；６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５－ウラシル（シュードウラシル）；４－チオウラシル；８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル、および他の８－置換アデニンおよびグアニン；５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、および他の５－置換ウラシルおよびシトシン；７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン；８－アザグアニンおよび８－アザアデニン；７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン；並びに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されるものではない。追加の修飾塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；Kroschwitz, J. I., ed. (1990),"The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering," pages 858-859, John Wiley & Sons; Englisch et al. (1991), "Angewandte Chemie," International Edition, 30, 613；およびSanghvi, Y. S., "Antisense Research and Applications," Chapter 15, pages 289-302, S. T. Crooke and B. Lebleu, eds., CRC Press, 1993に開示されたものが含まれる。このような修飾塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、およびＮ－２，Ｎ－６，およびＯ－６－置換プリンが含まれ、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、および５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸デュプレックスの安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており（Sanghvi, Y. S. et al. (1993), "Antisense Research and Applications," pages 276-278, CRC Press, Boca Raton）、現在は好ましい塩基置換であり、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせたときに特に好ましい。追加の塩基修飾は、Deleavey and Damha, Chemistry and Biology (2012) 19: 937-954に記載され、その内容をここに援用する。
一実施形態においては、修飾は化学修飾である。
一実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、標的核酸に対して相補性を有していない内部（即ち、非末端）領域のヌクレオチドに化学修飾を有し得る。例えば、修飾ヌクレオチドは、バルジを形成するｍｉＲＮＡの領域内に組み込まれ得る。修飾は、例えば、リンカーを介してｍｉＲＮＡに結合したリガンドを含み得る。修飾は、例えば、ポリヌクレオチドの薬理動態または安定性の改善、あるいはポリヌクレオチドの標的核酸に対するハイブリダイゼーション特性（例：ハイブリダイゼーション熱力学）の改善をもたらし得る。
いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドのバルジ領域に組み込まれたまたは繋がれた修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占めるような配向である。例えば、修飾には、核酸鎖上の修飾塩基または糖、あるいはインターカレーターとして機能するリガンドが含まれ得る。これらはバルジ内に位置することが好ましい。インターカレーターは芳香族、例えば、多環状芳香族またはヘテロ環状芳香族化合物であり得る。多環状インターカレーターは、スタッキング能を有し得るものであり、２、３、または４つの縮合環を有するシステムを含み得る。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドのバルジ領域に組み込まれたまたは繋がれた修飾またはリガンドの配向は、バルジ領域内の空間を占めるような配向である。この配向は、改善されたハイブリダイゼーション特性またはポリヌクレオチドのその他な所望の特徴を容易にする。
一実施形態において、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ポリヌクレオチドが改善されたハイブリダイゼーション特性または改善された配列特異性を示すようにし得るアミノグリコシドリガンドを含み得る。例示的なアミノグリコシドとしては、グリコシル化ポリリシン；ガラクトシル化ポリリシン；ネオマイシンＢ；トブラマイシン；カナマイシンＡ；およびネオ－Ｎ－アクリジン、ネオ－Ｓ－アクリジン、ネオ－Ｃ－アクリジン、Ｔｏｂｒａ－Ｎ－アクリジン、およびＫａｎａＡ－Ｎ－アクリジン等のアミノグリコシド類のアクリジンコンジュゲートが挙げられる。アクリジン類似体の使用は、配列特異性増加し得る。例えば、ネオマイシンＢはＤＮＡよりもＲＮＡに対して高親和性を有するが、配列特異性が低い。いくつかの実施形態においては、アミノグリコシドリガンドのグアニジン類似体（即ち、グアニジノグリコシド）はポリヌクレオチド剤に繋がれている。アミノ酸のグアニジノグリコシドアミン基はグアニジン基の代わりである。グアニジン類似体の結合は、ポリヌクレオチドの細胞透過性を増加させる。
増加したヌクレアーゼ耐性および／または標的に対する結合親和性を得るためには、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は２’－Ｏ－メチル、２’－フッ素、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－アミノ、および／またはホスホロチオエート結合を含み得る。ロック核酸（ＬＮＡ）（例えば、２’－Ｏ原子と４’－Ｃ原子を繋ぐメチレンブリッジによってリボース環が「ロックされた」核酸類似体）、エチレン核酸（ＥＮＡ）（例：２’－４’－エチレンブリッジ化核酸）、および２－アミノ－Ａ、２－チオ（例：２－チオ－Ｕ）、Ｇ－クランプ修飾といったある種の核酸塩基修飾の含有も、標的に対する結合親和性を増加し得る。オリゴヌクレオチド骨格内のピラノース糖の含有もエンドヌクレアーゼによる開裂を減少し得る。
ｍｉＲ－１３５分子は、３’カチオン性基を含むことによって、または末端のヌクレオシドを３’－３’結合と入れ替えることによってさらに修飾され得る。代替としては、３’末端をアミノアルキル基（例：３’のＣ５－アミノアルキルｄＴ）で遮断し得る。他の３’コンジュゲートも３’－５’エクソヌクレアーゼ開裂を阻害し得る。論理に縛られるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェン等の３’コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの３’末端へのエクソヌクレアーゼの結合を構造的に遮断することでエクソヌクレアーゼ開裂を阻害することがある。小さなアルキル鎖、アリール基、あるいはヘテロ環コンジュゲートまたは修飾糖（Ｄ－リボース、デオキシリボース、グルコース等）であっても、３’－５’－エクソヌクレアーゼを遮断し得る。
一実施形態においては、５’－末端はアミノアルキル基（例：５’－Ｏ－アルキルアミノ置換基）で遮断され得る。他の５’コンジュゲートの５’－３’エクソヌクレアーゼ開裂を阻害し得る。論理に縛られるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェン等の５’コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの５’末端へのエクソヌクレアーゼの結合を構造的に遮断することでエクソヌクレアーゼ開裂を阻害することがある。小さなアルキル鎖、アリール基、あるいはヘテロ環コンジュゲートまたは修飾糖（Ｄ－リボース、デオキシリボース、グルコース等）であっても、３’－５’－エクソヌクレアーゼを遮断し得る。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、標的化を改善する修飾を含む。オリゴヌクレオチド試薬を特定の細胞へ標的化する修飾の例としては、ガラクトース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース等の炭水化物糖類、葉酸等のビタミン類、ＲＧＤおよびＲＧＤ模倣体等の他のリガンド、ナプロキセン、イブプロフェンまたは他の公知のタンパク質－結合分子を含む小分子（さらに詳細に後述する）が挙げられる。
一実施形態において、修飾は、簡単に後述するように、糖修飾、核酸塩基修飾、およびヌクレオチド間結合の修飾からなる群より選ばれる。
本発明の本態様において有用な合成ｍｉＲ－１３５分子の具体例としては、修飾骨格（例：糖－リン酸塩骨格）または非天然ヌクレオシド間結合を含むものが挙げられる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとしては、骨格にリン原子を保持するものが挙げられ、これらは米国特許第４，４６９，８６３号明細書、同第４，４７６，３０１号明細書、同第５，０２３，２４３号明細書、同第５，１７７，１９６号明細書、同第５，１８８，８９７号明細書、同第５，２６４，４２３号明細書、同第５，２７６，０１９号明細書、同第５，２７８，３０２号明細書、同第５，２８６，７１７号明細書、同第５，３２１，１３１号明細書、同第５，３９９，６７６号明細書、同第５，４０５，９３９号明細書、同第５，４５３，４９６号明細書、同第５，４５５，２３３号明細書、同第５，４６６，６７７号明細書、同第５，４７６，９２５号明細書、同第５，５１９，１２６号明細書、同第５，５３６，８２１号明細書、同第５，５４１，３０６号明細書、同第５，５５０，１１１号明細書、同第５，５６３，２５３号明細書、同第５，５７１，７９９号明細書、同第５，５８７，３６１号明細書、同第５，６２５，０５０号明細書、および同第８，０１７，７６３号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１００２２２４１３号明細書に開示され、全てを本願に援用する。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子（例：ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖）の核酸配列はリン修飾ヌクレオチド間結合をヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に含む。
例示的なヌクレオチド間結合の修飾としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネートを含む）、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート（３’－アミノホスホロアミデート）、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート（正常な３’－５’結合、これらの２’－５’連結類似体、および隣接するヌクレオシド単位のペアが３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に連結され、逆の極性を有するもの等）、ホウ素ホスホネート、ホスホジエステル、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記修飾の種々の塩、混合塩、および遊離酸も使用することができる。追加のヌクレオチド間結合の修飾は本願に援用するDeleavey and Damha, Chemistry and Biology (2012) 19: 937-954に記載されている。
特定の実施形態においては、ヌクレオチド間結合の修飾はホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂまたはその相補鎖の核酸配列に少なくとも１つのホスホロチオエート結合修飾を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のホスホロチオエート結合修飾をｍｉＲ－１３５ｂまたはその相補鎖の核酸配列に含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のヌクレオチド間結合（例：ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチド）にホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂまたはその相補鎖の核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂまたはその相補鎖の核酸配列の５’末端の最後の２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂまたはその相補鎖の核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間および５’末端の最後の２つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および相補鎖の核酸配列の両方にホスホロチオエートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のヌクレオチド間結合（例：ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチド）にボラノホスフェートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のヌクレオチド間結合（例：ｍｉＲ－１３５核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチド）にメチルホスホネートを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のヌクレオチド間結合（例：ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチド）にホスホジエステルを含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ヌクレオチド配列の５’末端または３’末端のヌクレオチド間結合（例：ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチド）にリン酸塩を含む。
代替として、リン原子をその中に含まない合成ｍｉＲ－１３５分子骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から一部が形成されたもの）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および米国特許第５，０３４，５０６号明細書、同第５，１６６，３１５号明細書、同第５，１８５，４４４号明細書、同第５，２１４，１３４号明細書、同第５，２１６，１４１号明細書、同第５，２３５，０３３号明細書、同第５，２６４，５６２号明細書、同第５，２６４，５６４号明細書、同第５，４０５，９３８号明細書、同第５，４３４，２５７号明細書、同第５，４６６，６７７号明細書、同第５，４７０，９６７号明細書、同第５，４８９，６７７号明細書、同第５，５４１，３０７号明細書、同第５，５６１，２２５号明細書、同第５，５９６，０８６号明細書、同第５，６０２，２４０号明細書、同第５，６１０，２８９号明細書、同第５，６０２，２４０号明細書、同第５，６０８，０４６号明細書、同第５，６１０，２８９号明細書、同第５，６１８，７０４号明細書、同第５，６２３，０７０号明細書、同第５，６６３，３１２号明細書、同第５，６３３，３６０号明細書、同第５，６７７，４３７号および同第５，６７７，４３９号の明細書に開示された、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を混合して含む他の骨格が挙げられる。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は少なくとも１つの糖修飾（例：リボースの修飾）を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の糖修飾（例：リボースの修飾）を含む。
一実施形態においては、ｍｉＲ－１３５分子（例：ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または相補鎖）の少なくとも１つの核酸は、リボースの２位に対応する修飾を含む。
一実施形態において、糖修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドにある。
一実施形態においては、糖修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにある。
一実施形態において、糖修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端および５’末端の最後のヌクレオチドにある。
特定の実施形態においては、糖修飾はｍｉＲ－１３５ｂ鎖の核酸配列の５’末端の最初の１～２個のヌクレオチド、および／またはｍｉＲ－１３５ｂ鎖の核酸配列の３’末端の最後の１～３個のヌクレオチドにある。
特定の実施形態においては、糖修飾は相補鎖の核酸配列の５’末端の最初の２個のヌクレオチド、および／または相補鎖の核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドにある。
一実施形態において、糖修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および相補鎖の核酸配列の両方にある。
例示的な糖修飾としては、２’修飾ヌクレオチド（例：２’－デオキシ、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－フルオロアラビノオリゴヌクレオチド（２’－Ｆ－ＡＮＡ）、２’－Ｏ－－Ｎ－メチルアセタミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、２’－ＮＨ２）またはロック核酸（ＬＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加の糖修飾は、本参照によって本願に援用するDeleavey and Damha, Chemistry and Biology (2012) 19: 937-954に記載されている。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子の全てのヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾を有する。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端にある。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端にある。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端の最後の２つのヌクレオチド、および／またはｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドにある。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は少なくとも１つの２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端にある。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端にある。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチド、および／またはｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにある。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の（例：ｍｉＲ－１３５ｂ鎖の核酸配列の３’末端の）アデニン（Ａ）ヌクレオチドに設けられている。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾は、５’リボースのメチル化（２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅと称する）をさらに含む。
特定の実施形態においては、２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ修飾は、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の（例：ｍｉＲ－１３５ｂ鎖の核酸配列の５’末端の）ウラシル（Ｕ）ヌクレオチドに設けられている。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、少なくとも１つの２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態においては、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端にある。
特定の実施形態においては、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３５ｂ鎖またはその相補鎖の核酸配列の５’末端または３’末端の末端ヌクレオチドではない。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、修飾ヌクレオチド間結合および糖修飾を含む。よって、本発明において使用し得る合成ｍｉＲ－１３５分子は、糖およびヌクレオシド間結合の両方が修飾されたもの、即ち、骨格中のヌクレオチド単位が新規な基によって置換されたものでもよい。塩基単位は、適切なポリヌクレオチド標的との相補性のために維持される。このようなオリゴヌクレオチド模倣体の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。ＰＮＡオリゴヌクレオチドとは、糖－骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されたオリゴヌクレオチドを意味する。塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の製造方法を教示する米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、同第５，７１４，３３１号明細書および第５，７１９，２６２号の明細書が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、それぞれ本参照をもって本願に援用する。本発明で使用してもよい他の骨格修飾は米国特許第６，３０３，３７４号明細書に開示されている。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子リン修飾ヌクレオチド間結合および少なくとも１つの糖修飾（例：２’修飾ヌクレオチド）を含む。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、リン修飾ヌクレオチド間結合、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合、および少なくとも１つの糖修飾（例：２’修飾ヌクレオチド）を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにリン酸塩を含み、且つｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにリン酸塩を含み、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後の２つのヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、且つｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにリン酸塩を含み、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ修飾を含み、且つｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドにリン酸塩を含み、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ修飾を含み、且つｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドに２’－Ｏ－ＭＯＥ修飾を含む。
特定の実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、相補鎖の核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、且つ相補鎖の核酸配列の５’末端の最後の２つヌクレオチドに２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。
一実施形態においては、任意の上述した合成ｍｉＲ－１３５分子は、少なくとも１つの２’－Ｆ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
一実施形態においては、任意の上述した合成ｍｉＲ－１３５分子は、少なくとも１つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチド間結合をさらに含む。
例示的な合成ｍｉＲ－１３５ｂ配列としては、配列番号１、５、７、８、１０、１４、１６、４１、４２、４３、４４、４５および４６が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
例示的な修飾相補的配列としては、配列番号２、３、４、６、９、１１、１２、１３、１５および４７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１０に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４１に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４２に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４０に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１０に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４１に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４２に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４３に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４４に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４５に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号１３に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１０に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４１に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４２に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４３に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４４に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４５に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号４６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
特定の実施形態においては、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、配列番号１６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列、および配列番号４７に示す相補鎖の核酸配列を有する。
本発明の一態様によると、配列番号１０に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４１に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４２に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４３に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４４に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４５に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号１６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号１３に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号１０に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４１に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４２に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４３に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４４に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４５に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号４６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の一態様によると、配列番号１６に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４７に示す相補鎖を含む組成物が提供される。
本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、当業界で公知の（後に詳述する）化学合成および／または酵素連結反応によって構築することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、天然型ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性の増加、またはポリヌクレオチドと標的核酸との間で形成されたデュプレックスの物理的安定性の増加のために設計された種々の修飾ヌクレオチド（例：ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて、化学合成することができる（後に詳述する）。
本発明の教示に基づき設計された合成ｍｉＲ－１３５分子は、酵素合成および固相合成の両方を含む、公知の任意のオリゴヌクレオチド合成方法に従い作製することができる。種々の異なる機構によるオリゴヌクレオチド合成が、例えば、米国特許第４，６５９，７７４号明細書、同第４，８１６，５７１号明細書、同第５，１４１，８１３号明細書、同第５，２６４，５６６号明細書、同第４，９５９，４６３号明細書、同第５，４２８，１４８号明細書、同第５，５５４，７４４号明細書、同第５，５７４，１４６号明細書、同第５，６０２，２４４号明細書に開示され、それぞれ本参照をもって本願に援用する。
一実施形態においては、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法および固相化学によって、化学合成を達成することができる。これらの方法は下記で詳述する。
ジエステル法： ジエステル法は、利用可能な状態まで開発された最初の方法である。基本工程は、ホスホジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチドを形成するために、２つの適切に保護されたデオキシヌクレオチドを連結することである。
トリエステル法： ジエステル法とトリエステル法との主な違いは、後者は反応物質および産物のリン酸塩の原子に余分な保護基がある点である。リン酸塩の保護基は、通常、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中間体を有機溶媒に対して溶解性とするクロロフェニル基である。よって、精製はクロロホルム溶液中で行われる。この方法のその他の改善点としては、（ｉ）三量体およびより大きなオリゴマーのブロックカップリング、（ｉｉ）中間体および最終製品の両方の精製における高性能液体クロマトグラフィーの積極的使用、および（ｉｉｉ）固相合成が挙げられる。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法： これは多くの有用なオリゴヌクレオチドの合成に使用することのできるＤＮＡ合成の酵素的方法である。制御条件下において、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主として単一のヌクレオチドを短いオリゴヌクレオチドに付加する。クロマトグラフィー精製は所望の単一付加物の入手を可能にする。方法の開始には少なくとも三量体が必要であり、このプライマーは他の方法で得られなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は機能し、その手順はほとんどの生化学者に馴染みのものであるという利点がある。
固相法： ポリペプチドの固相合成のための技術に着目し、初期ヌクレオチドを固相支持材料に結合させ、ヌクレオチドの１つずつの付加を進めることが可能である。全ての混合工程および洗浄工程が単純化され、手順は自動化に対応可能である。これらの合成は今では日常的に自動核酸合成装置で実施されている。固相合成を実行するための基材および試薬は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより市販されている。
ホスホラミダイト化学は、オリゴヌクレオチド合成のための今では最も広範囲に使用されるカップリング化学である。当業者には広く知られるように、オリゴヌクレオチドのホスホラミダイト合成は、活性化中間体を形成するための、活性化試薬によるヌクレオシドホスホラミダイトモノマー前駆体の活性化と、オリゴヌクレオチド産物を形成するための、続く活性化中間体の（通常は適切な固体支持体に一端が止められた）成長途中のオリゴヌクレオチド鎖への連続的付加を含む。
組換え法： 細胞内で核酸を産生するための組換え法は当業者には広く知られており、合成ｍｉＲ－１３５分子が化学修飾を含まない場合に使用することができる。この方法には、標的細胞または（所望のＲＮＡ分子を大量に製造するための）単なる宿主細胞でもよい細胞への核酸の送達のためのベクター、プラスミド、コスミド、および他のベヒクルの使用が含まれる。代替として、このようなベヒクルは、ＲＮＡ分子を作製するための試薬が存在する限り、無細胞系で使用することも可能である。このような方法としては、Sambrook, 2003、Sambrook, 2001およびSambrook, 1989に記載のものが挙げられ、本参照をもって本願に援用するものとする。
このような合成のための任意の方法を使用することが可能であり、オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”、Ausubel, R. M. et al., eds. (1994, 1989), “Current Protocols in Molecular Biology”, Volumes I-III, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland、Perbal, B. (1988), “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York、およびGait, M. J., ed. (1984), “Oligonucleotide Synthesis”に記載の確立された方法論によって、固相化学、例えば、シアノエチルホスホラミダイトと続く脱保護、脱塩、および（例えば、自動トリチル－オン（ｔｒｉｔｙｌ－ｏｎ）法またはＨＰＬＣによる）精製を用いて達成することができ、
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子は、安定性、分布、細胞による取り込み、血液脳関門（ＢＢＢ）の通貨、または合成ｍｉＲ－１３５分子の目的細胞への標的化の向上を目的に選択したリガンド（部分とも称する）に結合される。よって、合成ｍｉＲ－１３５分子は、下記で詳述するように、非ヌクレオチド部分を含むように修飾してもよい。
本発明の一態様において、コンジュゲートｍｉＲ－１３５分子が提供される。
本願において「コンジュゲート」という用語は、２以上の別個化合物の共有結合によってもたらされる任意の化合物を意味する。本発明においては、コンジュゲートとは、合成ｍｉＲ－１３５分子と、そこに共有結合された細胞標的化部分とを含む分子を意味する。
本願で使用する「細胞標的化部分」という表現は、目的の標的細胞によって発現または提示された、好ましくは特異的に発現または提示された（例：ある細胞型では発現／提示されないが、別の細胞であはより高レベルで発現／提示された）分子に結合する任意の物質を意味する。特定の実施形態においては、分子は受容体である。この結合特異性は、分子を発現または提示する細胞、組織または器官への（細胞標的化部分に結合した）合成ｍｉＲ－１３５分子の送達を可能にする。こうすることで、細胞標的化部分を保持するコンジュゲートは、対象（例：ヒト）に投与されたとき、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで異なる型の細胞の集団と接触させたときに、細胞に対して特異的に指向される。
本発明による細胞標的化部分が標的（目的の標的細胞、例えば、受容体、の発現または提示する分子）に対して示すＫｄは、少なくとも約１０－４Ｍ、代替として少なくとも約１０－５Ｍ、代替として少なくとも約１０－６Ｍ、代替として少なくとも約１０－７Ｍ、代替として少なくとも約１０－８Ｍ、代替として少なくとも約１０－９Ｍ、代替として少なくとも約１０－１０Ｍ、代替として少なくとも約１０－１１Ｍ、代替として、少なくとも約１０－１２Ｍまたはそれ以上であり得る。
「受容体」という用語は、「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する細胞関連タンパク質を意味する。
一実施形態においては、目的の標的細胞に発現または提示された分子（例：受容体）は、細胞特異的に（例：中枢神経系細胞、骨細胞、筋肉細胞、がん細胞、胃腸細胞等に）発現されている。
本発明の細胞標的化部分によって標的化してもよい受容体としては、５－ヒドロキシトリプタミン受容体（例：５－ＨＴ１Ａ、５－ＨＴ１Ｂ、５－ＨＴ２Ａ、５－ＨＴ３、５－ＨＴ１Ｄ、５－ＨＴ６）、アデノシン受容体（例：Ａ１、Ａ２、Ａ２Ａ）、アドレノセプター受容体（例：アルファ１Ａ－アドレノセプター、アルファ１Ｂ－アドレノセプター、アルファ１Ｄ－アドレノセプター）、アンジオテンシン受容体（例：ＡＴ２）、ボンベシン受容体（例：ＢＢ１、ＢＢ２、ＢＢ３）、ブラジキニン受容体（例：Ｂ１、Ｂ２）、カルシトニン受容体（例：ＡＭ１、ＡＭＹ１、ＣＧＲＰ、ＣＴ－Ｒ、ＡＭ２、ＡＭＹ３）、ケモカイン受容体（例：ＣＸＣＲ４）、コレシストキニン受容体（例：ＣＣＫ２）、コルチコトロピン放出因子受容体（例：ＣＲＦ１、ＣＲＦ２）、ドーパミン受容体（例：Ｄ１、Ｄ２）、エンドセリン受容体（例：Ｅｔα、Ｅｔβ）、エフリン受容体（例：ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３）、ホルミルペプチド受容体（例：ＦＰＲ１、ＦＰＲ２、ＦＰＲ３）、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体（例：ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＦＺＤ１０）、ガラニン受容体（例：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３）、成長ホルモン分泌促進薬受容体（ゲレリン）（例：ＧＨＳ－Ｒ１ａ）、キスペプチン受容体、メラノコルチン受容体（例：ＭＣ１、ＭＣ２、ＭＣ３、ＭＣ４）、メラトニン受容体（例：ＭＴ１、ＭＴ２）、神経ペプチドＦＦ／神経ペプチドＡＦ受容体（例：ＮＰＦＦ１、ＮＰＦＦ２）、神経ペプチドＳ受容体（例：ＮＰＳ）、神経ペプチドＷ／神経ペプチドＢ受容体（例：ＮＰＢＷ２）、神経ペプチドＹ受容体（例：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５）、ニューロテンシン受容体（例：ＮＴＳ１、ＮＴＳ２）、オピオイド受容体（例：デルタ、カッパ、ミュー）、オレキシン受容体（例：ＯＸ１、ＯＸ２）、ペプチドＰ５１８受容体（例：ＱＲＦＰ）、プロスタノイド受容体、ＳＬＣ６神経伝達物質輸送体ファミリー（例：ＤＡＴ、ＮＥＴ、ＳＥＲＴ、ＧｌｙＴ１）、ソマトスタチン受容体（例：ｓｓｔ１、ｓｓｔ２、ｓｓｔ３、ｓｓｔ４、ｓｓｔ５）、タキキニン受容体（例：ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３）、トール様受容体（例：ＴＬＲ７）、バソプレッシンおよびオキシトシン受容体（例：ＯＴ、Ｖ１Ａ、Ｖ１Ｂ、Ｖ２）、ＶＥＧＦ受容体（例：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３）およびＧ－タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、目的の標的細胞に発現または提示された分子（例：受容体）は、視床下部、脳幹、皮質、小脳、線条体、中脳、海馬、グリアおよび／または脊髄が挙げられるが、これらに限定されるものではない中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞に発現／提示されている。
一実施形態においては、分子（例：受容体）は、脳細胞によって発現されているまたは脳細胞に提示されている。
一実施形態においては、分子（例：受容体）は、神経細胞によって発現されているまたは脳細胞に提示されている。
一実施形態においては、分子（例：受容体）は、グリア細胞（神経膠）に発現または提示されている。
一実施形態においては、目的の標的細胞に発現または提示された分子（例：受容体）は神経伝達物質輸送体である。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートの第２成分は、神経伝達物質輸送体に特異的に結合する細胞標的化部分である。
本願で使用するように、本願で使用する「神経伝達物質輸送体」という用語は、神経細胞の細胞膜を介して存在し、主たる機能は膜を介して神経伝達物質を運搬し、さらに特定の細胞内の位置まで運搬する膜輸送タンパク質のクラスに属するタンパク質を意味する。
本発明のいくつかの実施形態の細胞標的化部分によって標的化してもよい神経伝達物質輸送体としては、細胞外空間から細胞へと神経伝達物質を送り込む、神経細胞およびグリア細胞の細胞膜に存在する取り込み運搬体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。工程は、細胞膜を介したＮａ＋勾配、特にＮａ＋の共運搬に依存する。２つのタンパク質ファミリーが同定されている。第１のファミリーは、ＧＡＢＡ、モノアミン（ノルアドレナリン等）、ドーパミン、セロトニン、およびアミノ酸（グリシンおよびプロリン等）のトランスポーターを含む。一般的な構造成分には、１２の推定膜貫通α－ヘリックスドメイン、細胞質Ｎ－およびＣ末端、並びに膜貫通ドメイン３と４を分離する大きなグリコシル化細胞外ループが含まれる。この相同タンパク質ファミリーは、神経伝達物質とＮａ＋イオンおよびＣｌ－イオンとの細胞への共輸送によってエネルギーを誘導する（Ｎａ／Ｃｌ神経伝達物質輸送体）。第２のファミリーは、グルタミン酸等の興奮性アミノ酸のトランスポーターを含む。一般的な構造成分は、６～１０の膜貫通ドメイン、細胞質のＮ末端およびＣ－端、および細胞外ループのグリコシル化を含む。興奮性アミノ酸トランスポーターはＣｌに依存せず、細胞内Ｋ＋イオンを必要とする場合がある（Ｎａ＋／Ｋ＋神経伝達物質輸送体）（Liu, Y. et al. (1999) Trends Cell Biol. 9: 356-363）。
本発明の細胞標的化部分が標的としてもよい神経伝達物質輸送体としては、細胞外空間から細胞へと神経伝達物質を送り込む、神経細胞およびグリア細胞の細胞膜に存在する取り込み輸送体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。工程は、細胞膜を介したＮａ＋勾配、特にＮａ＋の共運搬に依存する。２つのタンパク質ファミリーが同定されている。第１のファミリーは、ＧＡＢＡ、モノアミン（ノルアドレナリン等）、ドーパミン、セロトニン、およびアミノ酸（グリシンおよびプロリン等）のトランスポーターを含む。一般的な構造成分には、１２の推定膜貫通α－ヘリックスドメイン、細胞質Ｎ末端およびＣ末端、並びに膜貫通ドメイン３と４を分離する大きなグリコシル化細胞外ループが含まれる。この相同タンパク質ファミリーは、神経伝達物質とＮａ＋イオンおよびＣｌ－イオンとの細胞への共輸送によってエネルギーを誘導する（Ｎａ／Ｃｌ神経伝達物質輸送体）。第２のファミリーは、グルタミン酸等の興奮性アミノ酸のトランスポーターを含む。一般的な構造成分は、６～１０の膜貫通ドメイン、細胞質Ｎ－およびＣ末端、および細胞外ループグリコシル化を含む。興奮性アミノ酸トランスポーターはＣｌに依存せず、細胞内Ｋ＋イオンを必要とする場合がある（Ｎａ＋／Ｋ＋神経伝達物質輸送体）（Liu, Y. et al. (1999) Trends Cell Biol. 9: 356-363）。
本発明の細胞標的化部分が標的化してもよい神経伝達物質輸送体としては、その主たる機能がシナプスによる伝達の際の小胞内包物のエクソサイトーシスの前に細胞質から小胞体に神経伝達物質を濃縮することである、細胞内小胞膜、典型的にはシナプス小胞、に存在する神経伝達物質輸送体も挙げることができる。小胞輸送は、Ｈ＋－ＡＴＰａｓｅによって作製される小胞膜を介した電気化学的勾配を使用する。神経伝達物質の小胞体への輸送には２つのファミリーのタンパク質が関与する。第１のファミリーは、分泌性小胞体への輸送を駆動するために主としてプロトン交換を使用し、モノアミンおよびアセチルコリンのトランスポーターが挙げられる。例えば、モノアミントランスポーターは、細胞質内伝達物質の各分子に対して２つの内腔内プロトンを交換する。第２のファミリーとしてはＧＡＢＡトランスポーターが挙げられ、これはシナプス小胞内の陽性電荷に依存する。小胞トランスポーターの２つのクラスは互いに対して配列類似性を示さず、細胞膜キャリアとは異なる構造を有する（Schloss, P. et al. (1994) Curr. Opin. Cell Biol. 6: 595-599、Liu, Y. et al. (1999) Trends Cell Biol. 9: 356-363）。
一実施形態においては、本発明の細胞標的化部分によって標的化され得る神経伝達物質輸送体の種類としては、例えば、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、セロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）およびノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）が挙げられる。
ドーパミントランスポーター（ＤＡＴまたはＳＬＣ６Ａ３とも称する）は、神経伝達物質ドーパミンをシナプス間隙から輸送し、周囲の細胞内に置くことで、神経伝達物質のシグナルを停止させる膜内在性タンパク質である分子を意味する。
セロトニントランスポーター（ＳＥＲＴまたはＳＬＣ６Ａ４とも称する）は、神経伝達物質セロトニンをシナプス空隙から前シナプス神経細胞に輸送する膜内在性タンパク質であるポリペプチドを意味する。
ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴまたはＳＬＣ６Ａ２とも称する）は、シナプスにより放出されたノルエピネフリンを前シナプス神経細胞に戻るように輸送する膜貫通タンパク質である分子を意味する。
本発明の細胞標的化部分によって標的化され得る神経伝達物質輸送体の具体的な種類としては、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）、興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）、興奮性アミノ酸トランスポーター３（ＥＡＡＴ３）、興奮性アミノ酸トランスポーター４（ＥＡＡＴ４）、興奮性アミノ酸トランスポーター５（ＥＡＡＴ５）、小胞グルタミン酸トランスポーター１（ＶＧＬＵＴ１）、小胞グルタミン酸トランスポーター２（ＶＧＬＵＴ２）および小胞グルタミン酸トランスポーター３（ＶＧＬＵＴ３）等のグルタミン酸／アスパラギン酸トランスポーター；ＧＡＢＡトランスポーター１型（ＧＡＴ１）、ＧＡＢＡトランスポーター２型（ＧＡＴ２）、ＧＡＢＡトランスポーター３型（ＧＡＴ３）、Ｂｅｔａｉｎｅトランスポーター（ＢＧＴｌ）および小胞ＧＡＢＡトランスポーター（ＶＧＡＴ）等のＧＡＢＡトランスポーター；グリシントランスポーター１型（ＧｌｙＴｌ）、グリシントランスポーター２型（ＧｌｙＴ２）等のグリシントランスポーター；ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）、セロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）、小胞モノアミントランスポーター１（ＶＭＡＴ１）、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）等のモノアミントランスポーター；平衡型ヌクレオシドトランスポーター１（ＥＮＴ１）、平衡型ヌクレオシドトランスポーター２（ＥＮＴ２）、平衡型ヌクレオシドトランスポーター３（ＥＮＴ３）および平衡型ヌクレオシドトランスポーター４（ＥＮＴ４）および小胞アセチルコリントランスポーター（ＶＡＣｈＴ）等のアデノシントランスポーターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する細胞標的化部分を含む。
本願においては、「腫瘍関連抗原」という成句は、特定の過剰増殖疾患（がん等）に共通し、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質を意味する。
本発明で言及される腫瘍抗原の種類としては、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が挙げられる。「ＴＳＡ」は、腫瘍細胞に特有のタンパク質またはポリペプチド抗原を意味し、体内の他の細胞では生じない。「ＴＡＡ」は、腫瘍細胞によって発現されるタンパク質またはポリペプチド抗原を意味する。例えば、ＴＡＡは、腫瘍細胞の１種以上の表面タンパク質またはポリペプチド、核タンパク質または糖タンパク質、またはその断片とすることができる。
一実施形態においては、腫瘍関連抗原は、固形腫瘍（例：結腸癌腫、乳癌腫、前立腺癌腫、腎細胞癌腫（ＲＣＣ）、肺癌腫、肉腫または黒色腫）に関連する。
一実施形態においては、腫瘍関連抗原は血液悪性腫瘍に関連する。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例としては、以下が挙げられる。ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－１）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２等の分化抗原、およびＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５等の腫瘍特異的多系列抗原；ＣＥＡ等の過剰発現胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ等の過剰発現癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２A～ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ等の染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原；およびエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７等のウイルス抗原。他の大型のタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトプロテイン、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３／ＣＡ ２７．２９１／ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３／ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭA～５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴA～９０／Ｍａｃ－２結合タンパク質／シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰおよびＴＰＳが挙げられる。腫瘍抗原の更なる例としては、Ａ３３、ＢＡＧＥ、Ｂｃｌ－２、β－カテニン、ＣＡ１２５、ＣＡ１９－９、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ１２３、ＣＥＡｃ－Ｍｅｔ、ＣＳ－１、サイクリンＢ１、ＤＡＧＥ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦＲ、エフリンＢ２、エストロゲン受容体、ＦＡＰ、フェリチン、葉酸結合タンパク質、ＧＡＧＥ、Ｇ２５０、ＧＤ－２、ＧＭ２、ｇｐ７５、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ １７）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｋｉ－６７、ＬＲＰ、メソテリン、ｐ５３、およびＰＲＡＭＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。更なる腫瘍抗原については、van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun (2013)、www(dot)cancerimmunity(dot)org/peptide/（本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）に記載されている。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、骨細胞に発現または提示された分子（例：受容体）特異的に結合する細胞標的化部分を含む。
一実施形態においては、細胞標的化部分は 骨格系を標的化する。
一実施形態においては、細胞標的化部分は、特定の骨細胞型（例：骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、骨細胞前駆体、破骨細胞前駆体、または骨ライニング細胞）を対象とする。
本発明の細胞標的化部分によって標的化することのできる例示的な骨細胞標的としては、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、オステオカルシン、骨シアロタンパク質、Ｉ型コラーゲン、骨アルカリホスファターゼ、象牙基質タンパク質１およびスクレロスチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、筋肉細胞に発現または提示された分子（例：受容体）に特異的に結合する細胞標的化部分を含む。
本発明の細胞標的化部分が標的化し得る例示的な筋肉細胞分子としては、Ｍ－カドヘリン／カドヘリン－１５、カベオリン－１、ＡＢＣＧ２、およびマイオジェニンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、胃腸細胞が発現または提示する分子（例：受容体）に特異的に結合する細胞標的化部分を含む。
本発明の細胞標的化部分が標的化し得る例示的な胃腸細胞分子としては、セロトニントランスポーターまたはセロトニン受容体１－７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の細胞標的化部分の選択は、治療する疾患（例：精神障害、がん、骨疾患等）の特定の種類に依存する。
一実施形態においては、細胞標的化部分は小分子である。
一実施形態においては、細胞標的化部分は小薬物である。例えば、５－ＨＴ神経細胞およびシナプス後の神経細胞を標的化するために使用可能な例示的な小薬物としては、５－ＨＴ１ａ受容体［１１Ｃ］ＤＡＳＢ、［１１Ｃ］ＷＡＹ１００６３５または［１８Ｆ］ＭＰＰＦのリガンドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、細胞標的化部分は合成成分である。
一実施形態においては、細胞標的化部分は、抗原、受容体または他のタンパク質、あるいは標的細胞の非タンパク質性膜化合物に結合可能なナノ粒子である。
一実施形態においては、細胞標的化部分は、親和性結合部分、即ち、非特異的分子（例：抗原）よりも高い親和性をもって特定の分子（例：抗原）に対して結合する天然型または人工生成した分子または組成物である。
親和性は公知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Scarano S, Mascini M, Turner AP, Minunni M. Surface plasmon resonance imaging for affinity-based biosensors. Biosens Bioelectron. 2010, 25: 957-66に記載）で定量可能であり、例えば、結合活性の影響を最小とするために補足または固定したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の形式とし、例えば、解離定数Ｋｄは、低いＫｄが高い親和性を反映するためこれを使用し、計算することができる点に着目すべきである。親和性結合部分は、典型的には、（即ち、結合が特異的（即ち、バックグラウンドの結合無し）である限り）少なくとも約２～約２００Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有する。特定の実施形態においては、親和性結合部分はアプタマーまたはレクチンである。
特定の実施形態においては、親和性結合部分は抗体または抗体断片である。
本発明で使用される「抗体」という用語は、インタクトな分子およびその機能的断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、抗原に結合することができる抗体断片から形成される多特異性抗体等を包含する。これらの機能的抗体断片は次のように定義される。（１）Ｆａｂ：抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖と１個の重鎖の一部を作製することによって得ることができる。（２）Ｆａｂ’：全抗体をペプシンで処理した後に還元し、インタクトな軽鎖と重鎖の一部を作製することによって得ることができる抗体分子の断片。抗体分子１個当たり２個のＦａｂ’断片が得られる。（３）（Ｆａｂ’）２：全抗体を酵素ペプシンで処理した後に還元を行わずに得ることができる抗体の断片。Ｆ（ａｂ’）２は、２個のジスルフィド結合によって結合された２個のＦａｂ’断片の二量体である。（４）Ｆｖ：２個の鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作断片として定義される。（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）：遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む遺伝子操作分子。（６）ＣＤＲペプチドは、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。（７）単一ドメイン抗体（ナノボディとも称される）：特定の抗原に選択的に結合する、遺伝子操作された単一の単量体可変抗体ドメイン。ナノボディは分子量が１２～１５ｋＤａに過ぎず、通常の抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりも遥かに小さい。
一実施形態においては、細胞標的化部分は神経伝達物質輸送体に結合する。
一実施形態においては、神経伝達物質輸送体に特異的に結合する細胞標的化部分は、セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）、ドーパミン再取り込み阻害薬（ＤＲＩ）、内在性カンナビノイド再取り込み阻害薬（ｅＣＢＲＩ）、アデノシン再取り込み阻害薬（ＡｄｏＲＩ）、興奮性アミノ酸再取り込み阻害薬（ＥＡＡＲＩ）、グルタミン酸再取り込み阻害薬（ＧｌｕＲＩ）、ＧＡＢＡ再取り込み阻害薬（ＧＲＩ）、グリシン再取り込み阻害薬（ＧｌｙＲＩ）、ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ＮＤＲＩ）、トリプル再取り込み阻害薬、ノルアドレナリン・ドーパミンダブル再取り込み阻害薬、セロトニンシングル再取り込み阻害薬、ノルアドレナリンシングル再取り込み阻害薬およびドーパミンシングル再取り込み阻害薬からなる群より選ばれる。
「セロトニン再取り込み阻害薬」または「ＳＲＩ」という用語は、セロトニンの取り込みを遮断することのできる分子を意味し、（他の神経伝達物質に影響することなくセロトニン取り込みを特異的に遮断する）選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）のみならず、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）およびセロトニン－ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ＳＮＤＲＩ）等の非選択的セロトニン再取り込み阻害薬の両方を含む。
「セロトニン選択的再取り込み阻害薬」または「ＳＳＲＩ」という用語は、他の神経伝達物質再取り込みまたはトランスポーター系に実質的な影響を与えることのない、セロトニン再取り込みの選択的阻害薬を意味する。このような化合物は主として前シナプスセロトニン性細胞で働き、神経伝達物質セロトニン細胞外レベルの増加をもたらし、その結果、シナプス前の受容体に結合可能なセロトニンレベルを増加させ、脳内のこのモノアミン性神経伝達物質系の活性不足を逆転させる。ＳＳＲＩの非限定的な例示としては、セルトラリン（ＣＡＳ ７９６１７－９６－２）、セルトラリン構造類似体、フルオキセチン（ＣＡＳ ５４９１０－８９－３）、フルボキサミン（ＣＡＳ ５４７３９－１８－３）、パロキセチン（ＣＡＳ ６１８６９－０８－７）、インダルピン（ＣＡＳ ６３７５８－７９－２）、ジメルジン（ＣＡＳ ５６７７５－８８－３）、シタロプラム（ＣＡＳ ５９７２９－３３－８）およびエスシタロプラム（ＣＡＳ ２１９８６１－０８－２）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある化合物がＳＳＲＩとして働くか否かは当業界で公知の任意の方法で決定することが可能であり、このような方法としては、Koe et al.（J. Pharmacol. Exp. Ther., 1983, 226:686-700）に記載の、ラット心臓による静脈内［３Ｈ］ノルエピネフリンの取り込みに影響することなく、セロトニンのｅｘ ｖｉｖｏの取り込みを抑制し、ｐ－クロロアンフェタミンのセロトニン除去活性を拮抗する能力の検定が挙げられる。
特定の実施形態においては、ＳＳＲＩは、下記構造（式Ｉ）を有する、セルトラリンまたはその構造類似体である。
Figure 2024503711000007
 式中、Ｒｌ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は各々独立に水素または任意に置換されたＣ１－Ｃ６アルキルであり；ＸおよびＹはそれぞれ水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、Ｃ１－Ｃ３アルコキシ、およびシアノからなる群より選ばれ；そしてＷは水素、フルオロ、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、ニトロおよびＣ１－Ｃ３アルコキシからなる群より選ばれる。いくつかの実施形態においては、セルトラリン類似体はシス異性体形状である。「シス異性体」という用語は、シクロヘキセン環上のＮＲ１Ｒ２およびフェニル部分の相対的な配置（即ち、両方が環の同じ側に配置されていること）を意味する。１位および４位の炭素の両方が非対称的に置換されているため、それぞれのシス化合物は、（Ｉ－炭素に参照して）シス－（ｌＲ）エナンチオマーおよびシス－（ｌＳ）エナンチオマーと表される２つの光学活性エナンチオマー型を有する。
いくつかの有用なセルトラリン類似体は以下の化合物およびその薬学的に許容可能な塩であり、これらは（ＩＳ）－エナンチオマー型または（１Ｓ）（１Ｒ）ラセミ型のいずれかである。
・シス－Ｎ－メチル－４－（３，４－ジクロロフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ－メチル－４－（４－ブロモフェニル）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ－メチル－４－（４－クロロフェニル）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ－メチル－４－（３－トリフルオロメチル－フェニル）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ－メチル－４－（３－トリフルオロメチル－４－クロロフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－１－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（４－クロロフェニル）－１，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；
・シス－Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（３－トリフルオロメチル－フェニル）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン；および
・シス－Ｎメチル－４－（４－クロロフェニル）－７－クロロ－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミン。
更に注目すべきは、シス－Ｎ－メチル－４－（３，４－ジクロロフェニル）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－ｌ－ナフタレンアミンの（ｌＲ）－エナンチオマーである。
セルトラリン類似体は米国特許第４、５３６、５１８号明細書（参照によって本願に援用する）にも記載されている。他の関連化合物としては、（Ｓ、Ｓ）－Ｎ－デスメチルセルトラリン、ｒａｃ－シス－Ｎ－デスメチルセルトラリン、（１Ｓ、４Ｓ）－デスメチルセルトラリン、ｌ－デス（メチルアミン）－ｌ－オキソ－２－（Ｒ、Ｓ）－ヒドロキシセルトラリン、（ｌＲ、４Ｒ）－デスメチルセルトラリン、セルトラリン、スルホンアミド、セルトラリン（リバース）メタンスルホンアミド、１Ｒ、４Ｒセルトラリン、エナンチオマー、Ν、Ν－ジメチルセルトラリン、ニトロセルトラリン、セルトラリンアニリン、ヨウ化セルトラリン、セルトラリンスルホンアミドＮＨ２、セルトラリンスルホンアミドエタノール、セルトラリンニトリル、セルトラリン－ＣＭＥ、ジメチルセルトラリンリバーススルホンアミド、セルトラリンリバーススルホンアミド（ＣＨ２リンカー）、セルトラリンＢ環オルトメトキシ、セルトラリンＡ環メチルエステル、セルトラリンＡ環エタノール、セルトラリンＮ、Ｎジメチルスルホンアミド、セルトラリンＡ環カルボン酸、セルトラリンＢ環パラフェノキシ、セルトラリンＢ環パラ－トリフルオロメタン、Ν、Ν－ジメチルセルトラリンＢ環およびパラ－トリフルオロメタン、およびＵＫ－４１６２４４が挙げられる。これら類似体の構造を下記に示す。
Figure 2024503711000008
Figure 2024503711000009
Figure 2024503711000010
Figure 2024503711000011
Figure 2024503711000012
Figure 2024503711000013
「セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬」または「ＳＮＲＩ」という用語は、セロトニントランスポーターの遮断によってセロトニンの再取り込みを阻害し、ノルエピネフリントランスポーターの遮断によってノルエピネフリンの再取り込みを阻害する化合物のファミリーを意味する。このファミリーとして、ベンラファキシン（ＣＡＳ ９３４１３－６９－５）、デスベンラファキシン（ＣＡＳ ９３４１３－６２－８）、デュロキセチン（ＣＡＳ １１６５３９－５９－４）、ミルナシプラン（ＣＡＳ ９２６２３－８５－３）、シブトラミン（１０６６５０－５６－０）、トラマドール（ＣＡＳ ２７２０３－９２－５）およびビシファジン（ＣＡＳ ７１１９５－５７－８）等の化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある化合物がＳＮＲＩとして働くか否かは当業界で公知の任意の方法で決定することが可能であり、このような方法としては、Bolden-Watson C, Richelson E.（Life Sci. 1993;52(12): 1023-9）に実質的に記載の、脳シナプトソームによるセロトニンおよびノルエピネフリンの取り込み抑制能力を検量する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
一実施形態においては、ＳＮＲＩは、三つの環を含む基本分子構造を有するＳＮＲＩである三環系抗うつ薬である。三環系抗うつ薬の中でも卓越したものはｌｉｎｅａｒ型三環系薬、例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、ドキセピン、ケチプラミン、ミアンセリン、ドチエピン、アモキサピン、ジベンゼピン、メリトレースン、マプロチリン、フルペンチキソール、アザフェン、チアネプチンおよび類似活性を示す関連化合物である。Ａｎｇｕｌａｒ型三環系薬としては、インドリリン、クロダゾン、ノミフェンシン、および関連化合物が挙げられる。種々の他の構造的に異なる抗うつ薬、例えば、イプリンドール、ウエルブツリン、ニアラミド、ミルナシプラン、フェネルジンおよびトラニルシプロミンは、同様の活性をもたらすことが示されている。これらは三環系抗うつ薬と機能的に同等であり、よって本発明の範囲に含まれるものとする。従って、三環系抗うつ薬という用語は、上述した広範囲にわたる抗うつ薬と共に、いずれもが抗うつ活性を有するという共通の性質を示す関連化合物を包含することを本発明者らは意図する。関連化合物としては、アミトリプチリン、アミトリプチリンオキシド、カルバマゼピン、ブチリプチリン、クロミプラミン、デメキシプチリン、ジベンゼピン、ジメタクリン、ドスレピン／ドチエピン、ドキセピン、イミプラミン、イミプラミンオキシド、イプリンドール、ロフェプラミン、メリトラセン、メタプラミン、ニトロキサゼピン、ノルトリプチリン、ノキシプチリン、プレガバリン、プロプゼピン、プロトリプチリン、キヌプラミンおよびトリミプラミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「ノルアドレナリン再取り込み阻害薬」、「ＮＲＩ」、「ＮＥＲＩ」、「アドレナリン性再取り込み阻害薬」または「ＡＲＩ」という用語は、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）の作用を遮断してノルアドレナリンおよびアドレナリンの再取り込みを遮断する化合物のファミリーを意味する。この化合物ファミリーには、他のモノアミントランスポーターに影響することなくＮＥＴのみを遮断する選択的ＮＲＩのみならず、ノルエピネフリントランスポーターおよびセロトニントランスポーターを遮断するＳＮＲＩ（上記参照）、ノルエピネフリンおよびドーパミントランスポーターを遮断するノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ＮＤＲＩ）（下記参照）、三環抗うつ薬および四環抗うつ薬（上記参照）等の非選択的ＮＲＩも含まれる。本発明に適切な選択的ＮＲＩとしては、アトモキセチン／トモキセチン（Ｓｔｒａｔｔｅｒａ（登録商標）またはＣＡＳ ８３０１５－２６－３）、マジンドール（Ｍａｚａｎｏｒ（登録商標）、Ｓａｎｏｒｅｘ（登録商標）またはＣＡＳ ２２２３２－７１－９）、レボキセチン（Ｅｄｒｏｎａｘ（登録商標），Ｖｅｓｔｒａ（登録商標）またはＣＡＳ ９８８１９－７６－２）およびビロキサジン（Ｖｉｖａｌａｎ（登録商標）またはＣＡＳ ４６８１７－９１－８）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「ドーパミン再取り込み阻害薬」または「ＤＲＩ」という用語は、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）の作用を遮断して神経伝達物質ドーパミンの再取り込み阻害薬として作用するものを意味する。これは次にドーパミンの細胞外濃度の増加をもたらし、それ故に、ドーパミン性神経伝達を増加させる。適切なＤＲＩとしては、アミネプチン、ベンザトロピン／ベンゾトロピン、ブプロピオン、デキサメチルフェニデート、エスケタミン、エチベンザトロピン／Ｅｔｈｙｂｅ、ポナリド、フェンカムファミン、フェンカミン、ケタミン、レフェタミン、メヂフォキサミン、メソカルブ、メチルフェニデート、ネホパム、ノミフェンシン、ピプラドロール、プロリンタン、ピロバレロン、ティレタミンおよびトリペレンナミン等の医薬品、並びにアルトロパン、アンホネル酸、ベノシクリジン、ブラソフェンシン、ブロマンタン、ＤＢＬ－５８３、ジクロプロパン、ジクロフェンシン、ジエチシクリジン、ジフルオロピン、ガシクリジン、ＧＢＲ－１２，９３５、インダトラリン、イオフルパン、イオメトパン、マニファキシン、ラダファキシン、タメトラリン、テソフェンシン、トロパリルおよびバノキセリン等の研究用化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。適切なＤＲＩは、当業者に公知の方法、例えば、ラット線条体のシナプトソーム調製物によるドーパミンの高親和性取り込みに対する推定ＤＲＩの阻害能をKula et al（Life Sciences 34: 2567-2575, 1984）として出版されている方法に従い決定することで、同定することができる。
本願で使用する「内在性カンナビノイド再取り込み阻害薬」または「ｅＣＢＲＩ」という用語は、エンドカンナビドノイドトランスポーターの作用を遮断することで、エンドカンナビドノイドに対して再取り込み阻害薬として機能する任意の化合物を意味する。この活性を有する化合物は、推定内在性カンナビノイド再取り込み阻害薬がラットの神経細胞およびアストロサイトによるアナンダミドの取り込みを遮断する能力に基づき、Beltramo, M. et al.（Science, 1997, 277: 1094-1097）に記載の方法を用いて同定することができ、当該化合物としては、ＡＭ４０４、アルバニルおよびオルバニルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「アデノシン再取り込み阻害薬」または「ＡｄｏＲＩ」という用語は、１以上の平衡型ヌクレオシドトランスポーター（ＥＮＴ）の活性を遮断することで、プリンヌクレオシドおよび神経伝達物質アデノシンに対する再取り込み阻害薬として作用する化合物を意味する。作用の結果、アデノシンの細胞外濃度が上昇し、それ故にアデノシン性神経伝達が増加する。ＡｄｏＲＩ活性を有する化合物は、赤血球のアデノシン取り込みを推定ＡｄｏＲＩが阻害する能力に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイのみならず、アデノシンの血管拡張効果を推定ＡｄｏＲＩが阻害する能力に基づくｉｎ ｖｉｖｏアッセイや、側副血管の成長のアデノシン媒介促進を推定ＡｄｏＲＩが防止する能力に基づくｉｎ ｖｉｖｏアッセイで同定することができ、これらは、本参照をもって本願に援用する米国特許第６，９８４，６４２号明細書の記載と実質的に同様に行うことができる。適切なＡｄｏＲＩとしては、アカデシン、酢酸、バルビツール、ベンゾジアゼピン、カルシウムチャネル遮断薬、カルバマゼピン、カリソプロドール、シロスタジル、ジクロベンザプリン、ジラゼプ、ジピリダモール、エストラジオール、エタノール（アルコール）、フルマゼニル、ヘキソベンジン、ヒドロキシザイン、インドメタシン、イノシン、ＫＦ２４３４５、メプロバメート、ニトロベンジルチオグアノシン、ニトロベンジルチオイノシン、パパベリン、ペントキシフィリン、フェノチアジン、フェニトイン、プロジェステロン、プロペントフィリン、プロポフォール、ピューロマイシン、Ｒ７５２３１、ＲＥ １０２ ＢＳ、ソルフラジン、トヨカマイシン、トラカゾレート、三環系抗うつ薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
「興奮性アミノ酸再取り込み阻害薬」または「ＥＡＡＲＩ」という用語は、興奮性アミノ酸トランスポーターまたはＥＥＡＴを遮断することで、興奮性アミノ酸の再取り込みを阻害する化合物を意味する。ＥＡＡＴに結合し、トランスポーター機能を阻害する多くの化合物が知られている。ＥＡＡＴの阻害薬は、作用機序の異なる２つのクラス、非輸送性遮断薬および競合性基質、に分類される。適切なＥＡＡＲＩとしては、ＤＬ－スレオ－ベータ－ベンジロキシアスパラギン酸、カイナイト、ジヒドロカイニン酸、２Ｓ４Ｒ４ＭＧ、スレオ－Ｐ－ヒドロキシアスパラギン酸、Ｌ－トランスピロリジン－２，４－ジカルボン酸（ｔ－２，４－ＰＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。適切なＥＥＡＲＩは、例えば、ヒト興奮性アミノ酸トランスポーター－１（ＥＡＡＴ１）またはヒト興奮性アミノ酸トランスポーター－２（ＥＥＡＴ２）を発現するＣｏｓ－１細胞による放射線標識グルタミン酸の取り込みを推定ＥＥＡＲＩが阻害する能力に基づく、Shimamotot et al.（Molecular Pharmacology, 1998, 53: 195-201）に記載のアッセイを用いて同定することができる。
「グルタミン酸再取り込み阻害薬」または「ＧｌｕＲＩ」という用語は、１以上のグルタミン酸トランスポーターの作用を遮断することでグルタミン酸に対する再取り込み阻害薬として作用する化合物を意味する。グルタミン酸再取り込みに対する適切な阻害薬には、例示的に、スレオ－３ヒドロキシ－ＤＬ－アスパラギン酸（ＴＨＡ）、（２Ｓ）－トランスピロリジン－２，４－ジカルボン酸（ＰＤＣ）、アミノカプロン酸，および（２Ｓ，３Ｓ）－３－｛３－［４－（トリフルオロメチル）ベンゾイルアミノ］ベンジロキシ｝アスパラギン酸を含む既に公知の阻害薬のいずれか１種が含まれる。ＧｌｕＲＩ活性を有する化合物は、例えば、ヒト興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）またはヒト興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＥＡＴ２）を発現するＣｏｓ－１細胞による放射線標識グルタミン酸の取り込みを推定ＧｌｕＲＩが阻害する能力に基づく、Shimamotot et al.（Molecular Pharmacology, 1998, 53: 195-201）に記載のアッセイを用いて同定することができる。
「ＧＡＢＡ再取り込み阻害薬」または「ＧＲＩ」という用語は、ガンマ－アミノ酪酸トランスポーター（ＧＡＴ）の作用を遮断することで神経伝達物質ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対する再取り込み阻害薬として作用する化合物を意味する。作用の結果、ＧＡＢＡの細胞外濃度が増加し、それ故にＧＡＢＡ性神経伝達が増加する。ＧＡＢＡ再取り込みの適切な阻害薬としては、Borden LA（Eur J Pharmacol. 1994, 269: 219-224）に記載の（Hypericum perforatum（セントジョンズワート）より発見された）アドハイパーホリン、ＣＩ－９６６、デラミシクラン（ＥＧＩＳ－３８８６）、グバシン（Ｃ１０１４９）、（Hypericum perforatum（セントジョンズワート）より発見された）ハイパーホリン、ニペコチン酸、ＮＮＣ０５－２０９０、ＮＮＣ－７１ １、ＳＫＦ－８９９７６Ａ、ＳＮＡＰ－５１１４、スチリペントールおよびチアガビン（ガビチリル）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。与えられた化合物がＧＡＢＡ再取り込み阻害薬であるかを検出するための方法は公知であり、例えば、米国特許第６，９０６，１７７号明細書、同第６，２２５，１１５号明細書、および同第４，３８３，９９９号明細書、並びにAli, F. E., et al.（J. Med. Chem. 1985, 28, 653-660）に記載されている。これらの方法は、通常、細胞を放射線標識ＧＡＢＡと接触させ、候補化合物の存在下または不存在下でＧＡＢＡの取り込みを検出することを含む。
「グリシン再取り込み阻害薬」または「ＧｌｙＲＩ」という用語は、グリシントランスポーター（ＧｌｙＴｓ）の作用を遮断することで神経伝達物質グリシンに対する再取り込み阻害薬として作用する化合物を意味し、シナプス間隙からのグリシンの除去に関与するグリシントランスポーター（１型）、即ちＧｌｙＴＩ、のみならず、グリシンのシナプス小胞への再取り込みおよび再ロードに必要なＧｌｙＴ２（Gomeza et al, (2003) Curr Opin Drug Discov Devel 6(5): 675-82）を遮断する化合物が含まれる。本発明における使用に適切なグリシン再取り込み阻害薬としては、ＧｌｙＴｌ特異的阻害薬が挙げられ、非限定的な例としては、国際公開ＷＯ／０００７９７８号およびＷＯ／０１３６４２３号に記載のＮ－メチル－Ｎ－［［（ｌＲ，２Ｓ）－ｌ，２，３，４－テトラヒドロ－６－メトキシ－ｌ－フェニル－２－ナフタレニルメチルグリシン（ＭＴＨＭＰＮＭグリシンのフリー塩基）、４－［３－フルオロ－４－プロポキシフェニル］－スピロ［２Ｈ－ｌ－ベンゾピラン－２，４’－ピぺリジン］－ｌ’－酢酸（ＦＰＰＳＢＰＡＡのフリー塩基）、ＡＬＸ５４０７、サルコシン、５，５－ジアリール－２－アミノ－４－ペンテン酸エステルまたは国際公開ＷＯ／０２０８２１６に記載の化合物であり、さらにＧｌｙＴ２特異的阻害薬としては、国際公開ＷＯ／０５０４４８１０Ａに記載のものが挙げられ、その内容は本参照をもって本願に援用する。ＧｌｙＴｌ特異的またはＧｌｙＴ２特異的な再取り込み阻害薬を検出するための方法は当業界で公知であり、例えば、再取り込み阻害性活性を試験する化合物の存在下で、関連受容体（ＧｌｙＴｌまたはＧｌｙＴ２）を発現する細胞を放射線標識グリシンと接触させ、一定時間経過後に細胞内に見られるグリシンの量を決定する、国際公開ＷＯ／０５０１８６７６ＡまたはＷＯ／０５０４４８１０に記載の方法が挙げられる。
本願で使用する「ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬」または「ＮＤＲＩ」という用語は、ノルエピネフリントランスポーター（ＮＥＴ）およびドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）のそれぞれの作用を遮断することで、神経伝達物質ノルエピネフリンおよびドーパミンに対して再取り込み阻害薬として作用する化合物を意味する。この作用の結果、ノルエピネフリンおよびドーパミンの両方の細胞外濃度が増加し、その結果、アドレナリン性およびドーパミン性神経伝達が増加する。本発明のコンジュゲートにおける使用に適したＮＤＲＩとしては、アミンプチン（Ｓｕｒｖｅｃｔｏｒ（登録商標）、Ｍａｎｅｏｎ（登録商標）、Ｄｉｒｅｃｔｉｎ（登録商標））、ブプロピオン（Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（登録商標）、Ｚｙｂａｎ（登録商標））、デキサメチルフェニデート（Ｆｏｃａｌｉｎ（登録商標））、フェンカムファミン（Ｇｌｕｃｏｅｎｅｒｇａｎ（登録商標）、Ｒｅａｃｔｉｖａｎ（登録商標））、フェンカミン（Ａｌｔｉｍｉｎａ（登録商標）、Ｓｉｃｏｃｌｏｒ（登録商標））、レフェタミン（Ｓａｎｔｅｎｏｌ（登録商標））、メチルフェニデート（Ｒｉｔａｌｉｎ（登録商標）、Ｃｏｎｃｅｒｔａ（登録商標））、ノミフェンシン（Ｍｅｒｉｔａｌ（登録商標））、ピプラドロール（Ｍｅｒｅｔｒａｎ（登録商標））、プロリンタン（Ｐｒｏｍｏｔｉｌ（登録商標）、Ｋａｔｏｖｉｔ（登録商標））、パイロバレロン（Ｃｅｎｔｒｏｔｏｎ（登録商標）、Ｔｈｙｍｅｒｇｉｘ（登録商標））、ネホパム（Ａｃｕｐａｎ（登録商標））、（Hypericum perforatum（（セントジョンズワート）より発見された）アドハイパーホリン、（Hypericum perforatum（（セントジョンズワート）より発見された）ハイパーホリン、コカイン、デソキシピプラドロール（２－ＤＰＭＰ）、ジフェニルプロリノール（Ｄ２ＰＭ）、メチレンジオキシパイロバレロン（ＭＤＰＶ）、シロバミン、マニファキシン（ＧＷ－３２０，６５９）、ラダファキシン（ＧＷ－３５３，１６２）、タメトラリン（ＣＰ－２４，４４１）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）である神経伝達物質輸送体に特異的に結合する細胞標的化部分を含む。
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、セルトラリン、セルトラリン－構造類似体、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、インダルピン、ジメリジン、シタロプラム、ダポキセチン、エスシタロプラム、およびこれらの混合物からなる群より選ばれるＳＳＲＩを含む。
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは、上記で定義したＳＳＲＩ、即ちセルトラリン、またはその構造類似体を含む。
特定の実施形態においては、細胞標的化部分が骨細胞を標的化するとき、標的化部分はテトラサイクリンやビスホスホネート（ＢＰ）といった合成成分を含み得る。
合成ｍｉＲ－１３５分子と細胞標的化部分は直接結合してもよいし、リンカー、ブリッジまたはスペーサー部分等の介在部分を介して間接的に結合してもよい。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子と細胞標的化部分は直接結合されている。代替として、他の実施形態によると、両方の部分が結合基によって連結されてもよい。
「結合基」、「リンカー」、「連結基」という用語およびこれら文法的な同等物は、本願において、化合物の２つの部分を結合させる有機部分を意味する。細胞標的化部分は、ｍｉＲ－１３５分子内のセンス（例：ガイド）鎖またはアンチセンス（例：パッセンジャー）鎖の任意のヌクレオチドに結合させることができるが、３’末端ヌクレオチドおよび／または５’末端ヌクレオチドを介して結合されることが好ましい。内部コンジュゲートは、リボース基の２’位、または他の適切な位置のヌクレオチドに直接、またはリンカーを介して間接的に結合してもよい。
上述したように、本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、好ましくは２本鎖核酸分子であり、そのため、コンジュゲート部分（即ち、細胞標的化部分）は、ガイド配列の３’末端ヌクレオチド、ガイド配列の５’末端ヌクレオチド、パッセンジャー配列の３’末端ヌクレオチド、および／またはパッセンジャー配列の５’末端ヌクレオチドに結合することができる。
定義または従来技術によって制限されることを望まないが、本願においては、リンカーの長さは、コンジュゲート部分（即ち、細胞標的化部分）をリンカーに結合させる原子と、リンカーがｍｉＲ－１３５オリゴヌクレオチドに結合する際に介する、ｍｉＲ－１３５オリゴヌクレオチドと関連付けられた末端リン酸塩部分の酸素原子との間が最小になる距離を表すように原子数を計数することで求める。リンカーが１以上の環構造を含む場合、最も短いパスを示す環の周りの原子を数えることが好ましい。
本発明における使用に適切なリンカー基としては、修飾または未修飾のヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖、炭化水素、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール等のポリアルキレン、ポリアルコール、ポリプロピレン、エチレンおよびプロピレングリコールの混合物、ポリアルキルアミン、ポリリシンおよびスペルミジン等のポリアミン、ポリ（エチルアクリレート）等のポリエステル、ポリホスホジエステル、脂肪族およびアルキレンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。更に、オメガ－アミノ－１、３－ジオール、オメガ－アミノ－ｌ、２－ジオール、ヒドロキシプロリノール、オメガ－アミノアルカノール、ジエタノールアミン、オメガ－ヒドロキシ－ｌ、３－ジオール、オメガ－ヒドロキシ－ｌ、２－ジオール、オメガ－チオ－ｌ、３－ジオール、オメガ－チオ－１、２－ジオール、オメガ－カルボキシｌ、３－ジオール、オメガ－カルボキシ－１、２－ジオール、共－ヒドロキシ－アルカノール、オメガ－チオ－アルカノール、オメガ－カルボキシアルカノール、機能化オリゴエチレングリコール、アリルアミン、アクリル酸、アリルアルコール、プロパギニルアミン、プロパギニルアルコール等に基づくリンカー／リンカー化学は、適切な長さのリンカーを作製するために、この文脈に適応することができる。
リンカーは、他の望ましい特徴、例えば、改善された水溶性、コンジュゲート部分（即ち、細胞標的化部分）とｍｉＲ－１３５分子との最適分離距離、可とう性（またはその不存在）、特定の配向、分岐等を有することもできる。
一実施形態においては、結合基は下記の構造を有する。
Figure 2024503711000014
 式中、
ｍ、ｎおよびｐは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択され、
ｍ＋ｎ＋ｐの合計は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８から選ばれる整数であり、
ｋは０または１である。
一実施形態においては、ｐは５、ｎは２、ｋは１、そしてｍは６であり、下記構造を有するリンカーが得られる。
Figure 2024503711000015
一実施形態においては、ｐは５、ｎとｋは０、そしてｍは６であり、下記構造を有するリンカーが得られる。
Figure 2024503711000016
一実施形態においては、リンカーは、細胞標的化部分と１超のカップリングを含む。好ましい実施形態において、リンカーは二価または三価のリンカーである、即ち、それぞれ２分子または３分子の試薬をカップリング可能である。
１分子超の細胞標的化部分がリンカーを介してｍｉＲ－１３５核酸にカップリングされているとき、分子は同一または異なる細胞標的化部分を表すことができる。
一実施形態においては、二価または三価のリンカーは下記式で表される。
Figure 2024503711000017
 ｍ、ｍ’、ｍ”、ｎ、ｎ’、ｎ”、ｐ、ｐ’、ｐ”、ｒ、ｒ’、ｒ”、ｓ、ｓ’、ｓ”、ｔおよびｕはそれぞれ独立に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２および１３から選択され、
ｋ、ｋ’、ｋ”およびｖはそれぞれ独立に０および１から選択され、
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立にＣＨ２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＣＯ、Ｃ（Ｏ）ＯおよびＣ（Ｏ）ＮＨから選択される。
上記基の価に応じて、分岐状リンカーは対称または非対称でもよい。
特定の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎおよびｎ’が２、ｋおよびｋ’が１、そしてｍおよびｍ’が６である、上述した二価リンカーである。特定の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０、そしてｍおよびｍ’が６である、上述した二価リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、ｒおよびｒ’が４、ｓおよびｓ’が１、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す、上述した二価リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、ｒが２、ｒ’が０、ｓが１、ｓ’が０、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣＨ２を表す二価リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎおよびｎ’が２、ｋおよびｋ’が１、ｍおよびｍ’が６、ｒおよびｒ’が４、ｓおよびｓ’が１、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す二価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎおよびｎ’が２、ｋおよびｋ’が１、ｍおよびｍ’が６、ｒが２、ｒ’が０、ｓが１、ｓ’が０、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣＨ２を表す二価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０およびｍおよびｍ’が６、ｒおよびｒ’が４、ｓおよびｓ’が１、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣ（Ｏ）ＮＨを表す二価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐおよびｐ’が５、ｎ、ｎ’、ｋおよびｋ’が０およびｍおよびｍ’が６、ｒが２、ｒ’が０、ｓが１、ｓ’が０、ｔおよびｖが０、そしてＸ１およびＸ２がＣＨ２を表す二価リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’およびｎ”が２、ｋ、ｋ’およびｋ”が１、そしてｍ、ｍ’およびｍ”が６である、上述した三価リンカーである。特定の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’、ｎ”、ｋ、ｋ’およびｋ’’が０、そしてｍ、ｍ’およびｍ’’が６である三価リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｖが０、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。他の実施形態において、リンカーは、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｕが３、ｖが１、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。
特定の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’およびｎ”が２、ｋ、ｋ’およびｋ”が１、ｍ、ｍ’およびｍ”が６、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｖが０、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’およびｎ”が２、ｋ、ｋ’およびｋ”が１、ｍ、ｍ’およびｍ”が６、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｕが３、ｖが１、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’、ｎ”、ｋ、ｋ’およびｋ”が０、ｍ、ｍ’およびｍ”が６、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｖが０、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。
他の実施形態において、リンカーは、ｐ、ｐ’およびｐ”が５、ｎ、ｎ’、ｎ”、ｋ、ｋ’およびｋ”が０、ｍ、ｍ’およびｍ”が６、ｒ、ｒ’およびｒ”が３、ｓ、ｓ’およびｓ”が１、ｔが１、ｕが３、ｖが１、そしてＸ１、Ｘ２およびＸ３がＯを表す三価リンカーである。
一実施形態においては、連結化合物は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、カルバメート、メチルホスホネート、グアニジウム、スルファミン酸、スルファミド、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、スルホン、アミドおよびこれらの混合物から選ばれる。
一実施形態においては、連結化合物はＣ１０ Ｎ－ヒドロキシコハク酸エステルリンカー（即ち、Ｃ１０リンカー）である。
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000018
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000019
特定の実施形態においては本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000020
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000021
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000022
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記構造を有する。
Figure 2024503711000023
本発明のコンジュゲートは、当業者に公知の技術によって製造することができる。コンジュゲートの合成は、官能基の選択的保護および脱保護を含んでもよい。適切な保護基は当業者に知られている。例えば、有機化学における保護基の一般的な説明は、Protecting Groups in Organic Synthesis（4th Ed. Wiley-Interscience）におけるWuts, P.G.M. and Greene T.W.、およびProtecting Groups（3rd Ed. Georg Thieme Verlag）におけるKocienski P.J.によって提供されている。
本発明の目的において、「保護基」とは、ｍｉＲ－１３５オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に導入された化学修飾と理解されたい。５’－キャップの非限定的な例としては、反転脱塩基残基（部分）、４’，５’－メチレンヌクレオチド；１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ－ヌクレオチド；アルファ－ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ－ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’－ｓｅｃｏヌクレオチド；非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－反転ヌクレオチド部分；３’－３’－反転脱塩基部分；３’－２’－反転ヌクレオチド部分；３’－２’－反転脱塩基部分；１，４－ブタンジオールリン酸塩；３’－ホスホロアミデート；ヘキシルリン酸塩；アミノヘキシルリン酸塩；３’－リン酸塩；３’－ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。詳細は、本参照をもって本願に援用するＷＯ９７／２６２７０に記載されている。３’－キャップとしては、例えば、４’，５’－メチレンヌクレオチド；１－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド：４’－チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’－アミノ－アルキルリン酸塩；ｌ，３－ジアミノ－２－プロピルリン酸塩、３－アミノプロピルリン酸塩；６－アミノヘキシルリン酸塩；１，２－アミノドデシルリン酸塩；ヒドロキシプロピルリン酸塩；１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ－ヌクレオチド；アルファ－ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオ－ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’－ｓｅｃｏヌクレオチド；３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５－ｄｉヒドロキシペンチルヌクレオチド，５’－５’－反転ヌクレオチド部分；５’－５’－反転脱塩基部分；５’－ホスホロアミデート；５’－ホスホロチオエート；１，４－ブタンジオールリン酸塩；５’－アミノ；架橋および／または非架橋５’－ホスホロアミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋および／または非架橋メチルホスホネートおよび５’－メルカプト部分が挙げられる。Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925を参照、本参照をもって本願に援用する。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子または本発明のコンジュゲートは、ｍｉＲ－１３５核酸の活性、細胞分布または細胞取り込みを増加させるためにｍｉＲ－１３５の核酸または保護基に１以上の部分またはコンジュゲートを化学結合させることでさらに修飾されてもよい。
一実施形態においては、本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子またはコンジュゲートは、少なくとも１つの細胞膜透過部分をさらに含む。このような部分としては、脂質部分（即ち、天然型または合成によって製造された脂質）、例えば、コレステロール部分（Letsinger et al, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 199, 86, 6553-6556）、コリン酸（Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1994 4 1053-1060）、チオエーテル（例：ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Manoharan et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309、Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770））、チオコレステロール（Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪鎖（例：ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al, EMBO J, 1991, 10, 11 11-1118; Kabanov et al, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54））、リン脂質（例：ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈホスホネート（Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654、 Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783））、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides and Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニロキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に従って使用することのできる追加の脂質部分としては、脂肪酸、脂肪、油、ワックス、コレステロール、ステロール、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ等の脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、およびリン脂質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態においては、脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）、ドコサン酸（Ｃ２２）およびリトコリン酸とオレイルアミンのハイブリッド（リトコリンオレイルアミン、Ｃ４３）が挙げられる。
特定の実施形態においては、脂質部分はパルミトイルである。
特定の実施形態においては、脂質部分はコレステリルである。
一実施形態においては、脂質部分はＣ１８－Ｃ１８（即ち、Ｃ１８－ホスホジエステル－Ｃ１８）である。例えば、Ｃ１８はホスホラミダイトとして提供され、オリゴヌクレオチドの５’末端にカップリング反応で追加され、次に２つ目のＣ１８が先のＣ１８に同じカップリング反応で追加される。
一実施形態においては、細胞膜透過部分はペプチドまたはタンパク質である。
特定の実施形態においては、細胞膜透過部分はオキシトシンペプチドまたはそこから誘導した化合物（例：組換えまたは合成オキシトシン）である。
特定の実施形態においては、細胞膜透過部分は、ヒト血清アルブミンまたは他の血漿タンパク質またはその部分ペプチドである。
特定の実施形態においては、細胞膜透過部分はペプチドシャトルである。例示的なペプチドシャトルとしては、アンジオペップ－２、ＲＧＶ２９、およびＴＨＲが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、細胞膜透過部分は小薬剤である。例えば、５－ＨＴ神経細胞およびシナプス後の神経細胞の標的化に使用可能な例示的な小薬剤としては、５－ＨＴ１ａ受容体［１１Ｃ］ＤＡＳＢ、［１１Ｃ］ＷＡＹ１００６３５または［１８Ｆ］ＭＰＰＦのリガンドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
代替として、細胞分布を増加させることのできる部分は、生物学的バリア内に存在する特異的トランスポーターを用いた受容体媒介エンドサイトーシスの使用による生物学的バリアを超えた特異的な移動が可能な低分子量化合物またはポリペプチドでもよい。取り込み受容体および単体の広いアレイと、さらに広い数の受容体特異的リガンドが当業界では知られている。本発明に従って使用することができるエンドサイトーシスおよび／またはトランスサイトーシスを媒介する受容体に対する好ましいリガンドとしては、例えば、チアミントランスポーター、葉酸受容体、ビタミンＢ１２受容体、アシアロ糖タンパク質受容体、アルファ（２，３）－シアロ糖タンパク質受容体（例えば、受容体特異的リガンドとしてのラマ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ）からなるＦＣ５およびＦＣ４４ナノボディと共に使用）、トランスフェリン－１および－２受容体、スキャベンジャー受容体（クラスＡまたはＢ、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型、あるいはＣＤ３６またはＣＤ１６３）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ関連タンパク質１受容体（ＬＲＰ１、Ｂ型）ＬＲＰ２受容体（メガリンまたは糖タンパク質３３０としても知られる）、ジフテリアトキシン受容体（ヘパリン結合上皮成長因子様因子（ＨＢ－ＥＧＦ）の膜結合前駆体であるＤＴＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体、物質Ｐ受容体、グルタチオン受容体、グルタミン酸受容体およびマンノース６－リン酸塩受容体に対するまたは特異的に結合するリガンドが挙げられる。
本発明に従って使用するための、これら受容体に結合する例示的なリガンドとしては、例えば、下記からなる群より選ばれるリガンドが挙げられる：リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アルファ２－マクログロブリン（アルファ２Ｍ）、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ラクトフェリン、デスモテプラス、組織およウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクティベーター（ｔＰＡ／ｕＰＡ）、プラスミノーゲンアクティベーター阻害薬（ＰＡＩ－Ｉ）、ｔＰＡ／ｕＰＡ：ＰＡＩ－ｌ複合体、メラノトランスフェリン（またはＰ９７）、トロンボスポジン１および２、肝臓リパーゼ、因子Ｖｌｌａ／組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）、因子ＶＩＩＩａ、因子ＩＸａ、アベタル－４０、アミロイドベータ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、Ｃ１インヒビター、補体Ｃ３、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、シュードモナス外毒素Ａ、ＣＲＭ６６、ＨＩＶ－ＩＴａｔタンパク質、ライノウイルス、マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ－９）、ＭＭＰ－１３（コラーゲナーゼ－３）、スフィンゴ脂質アクチベータータンパク質（ＳＡＰ）、妊娠ゾーンタンパク質、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、アルファｌ－アンチトリプシン、熱ショックタンパク質９６（ＨＳＰ－９６）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪまたはクルステリン）、ａｐｏＪおよびａｐｏＥに結合したＡＢＥＴＡ、アプロチニン、ａｎｇｉｏ－ｐｅｐｌ、極低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、トランスフェリン、インスリン、レプチン、インスリン様成長因子、上皮成長因子、レクチン、ペプチド模倣体および／またはヒト化モノクローナル抗体または受容体特異的なペプチド、ヘモグロビン、ジフテリア毒素ポリペプチド鎖の非毒性部分、ジフテリア毒素Ｂ鎖の全部または一部（ＤＴＢ－Ｈｉｓを含む（Spilsberg et al., 2005, Toxicon., 46(8):900-6に記載））、ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７の非毒性変異体の全部または一部、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｅ（例：ナノ粒子上のポリソルブ－８０被覆に結合後）、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＡ／レチノール結合タンパク質、ビタミンＢ１２／コバラミン血漿輸送タンパク質、グルタチオン、およびトランスコバラミン－Ｂ１２。
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートはコンジュゲートの生物膜を横切る輸送を容易にする基さらに含む。一実施形態においては、基は両親媒性である。例示的な試薬としては、シグナル配列に基づくペプチドである４８～６０アミノ酸を含むＴａｔタンパク質断片であるペネトラチン、ＰＶＥＣ、トランスポータン、両親媒性モデルペプチド、Ａｒｇ９、最近細胞壁浸透ペプチド、ＬＬ－３７、セクロピンＰ１、α－デフェンシン、β－デフェンシン、バクテネクチン、ＰＲ－３９およびインドリシジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。試薬がペプチドの場合、ペプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたはシュード－ペプチド結合を含むように修飾する、およびＤ－アミノ酸の使用が可能である。らせん形試薬はアルファらせん形試薬が好ましく、親油性相および疎油性相を有することが好ましい。
一実施形態においては、本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子またはコンジュゲートは、少なくとも１つのＢＢＢを通過する輸送用部を分さらに含む。
一実施形態においては、ＢＢＢを通過する輸送用部分はペプチドまたはタンパク質である。
一実施形態においては、ＢＢＢを通過する輸送用部分は、向神経性のまたは神経毒由来のペプチドまたはそのバリアントである。
例示的なペプチドとしては、本参照をもって本願に援用するRazzak et al. Int. J. Mol. Sci. (2019), 20: 3108に開示された、例えば、ヒトインスリン受容体、抗トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）モノクローナル抗体、ラビウイルス糖タンパク質（例：キメラＲＶＧ断片ペプチド）に対する親和性を有するペプチド模倣体抗体に融合された、ＥＰＯ融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、ＢＢＢを通過する輸送用部分は、ＢＢＢシャトル（トロイの木馬抗体とも称する）である。例示的なＢＢＢシャトルとしては、アンジオペップ－２、Ｄアンジオペップ－２、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、ＴＨＲ、ＴＨＲｒｅ、ＲＶＧ２９、ＴＧＮ、ＤＣＤＸ、アパミン、ＴＧＮおよびＴＡＴ（４７－５７）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加のＢＢＢシャトルは、本参照をもって本願に援用するOller-Salvia et al., Chem. Soc. Rev. (The Royal Society of Chemistry) 2016に開示されている。
本発明の他の特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートはエンドソーム溶解性リガンドをさらに含んでもよい。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解および／またはエンドソームから細胞の細胞質への本発明の組成物またはその成分の輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、ｐＨ依存性膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体でもよい。ある種の実施形態においては、エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームのｐＨにおいて活性な立体構造を示す。例示的なエンドソーム溶解性リガンドとしては、例えば、ＧＡＬ４ペプチド（Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972）、ＥＡＬＡペプチド（Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586）、およびそれらの誘導体（Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68）、ＩＮＦ－７ペプチド、Ｉｎｆ ＨＡ－２ペプチド、ｄｉＩＮＦ－７ペプチド、ｄｉＩＮＦ３ペプチド、ＧＬＦペプチド、ＧＡＬＡ－ＩＮＦ３ペプチド、およびＩＮＦ－５ペプチドが挙げられる。
標的組織、標的細胞投与方式、オリゴヌクレオチドがたどると予想される経路等を考慮して、当業者は上記リガンドまたはその部分（例：細胞膜透過部分またはＢＢＢを通過する輸送用部分）のいずれかを選択することができる。
一実施形態においては、リガンドまたは部分（例：細胞膜透過部分またはＢＢＢを通過する輸送用部分）がペプチドまたはペプチド産物のとき、（例：プロテアーゼ活性に対する）安定性および／または（例：血液、消化液等の生物学的流体中の）溶解性をペプチドのアミノ酸配列に付与しながらも、その生物活性を維持し、半減期を延長するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾（例：ＰＥＧ化、脂質修飾等）に付すことができる。
本発明のコンジュゲートは、典型的には、有機合成の標準的な手順によって合成される。当業者は、合成の正確な工程が合成されなければならないコンジュゲートの正確な構造に依存することをわかっている。例えば、コンジュゲートがその５’末端を介して細胞標的化部分にコンジュゲートした単一核酸鎖を含む場合、合成は、通常、アミノ－活性化オリゴヌクレオチドと反応性活性化細胞標的化部分とを接触させることで実施する。
一実施形態においては、コンジュゲートが二本鎖ｍｉＲ－１３５核酸を含むとき、標準的な分子生物学的手法（上記で詳細に説明）を用いて、センス鎖（例：ガイド鎖）およびアンチセンス鎖（例：パッセンジャー鎖）を別個に合成し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアニーリングする。典型的なコンジュゲートにおいては、第１の核酸鎖が細胞標的化部分を有し、第２の核酸鎖を有する。
一実施形態においては、細胞標的化部分が第１の核酸鎖の５’末端にカップリングされるおよび／または保護基が第２の核酸鎖の５’末端に結合されるが、細胞標的化部分または保護基の結合は核酸鎖の３’末端で実施することもできる。
特定の実施形態において、細胞標的化部分がパッセンジャー鎖の５’末端にカップリングされるおよび／または保護基がガイド鎖の５’末端に結合される。
細胞標的化部分が合成ｍｉＲ－１３５分子のセンス鎖（例：ガイド鎖）またはアンチセンス鎖（例：パッセンジャー鎖）の５’末端または３’末端にカップリングされるとき、細胞膜透過部分および／またはＢＢＢを通過する輸送用部分は、二本鎖分子の残った末端（５’または３’）のいずれかにカップリングしてもよいことがわかる。
一実施形態においては、細胞膜透過部分および／またはＢＢＢを通過する輸送用部分は細胞標的化部分に結合されてもよい。
特定の実施形態においては、脂質性部分（例：コレステロール）は、細胞標的化部分（例：セルトラリン等のＳＳＲＩ）に結合されている。
一実施形態においては、合成ｍｉＲ－１３５分子が細胞標的化部分にコンジュゲートしていないとき、細胞膜透過部分および／またはＢＢＢを通過する輸送用部分は、合成ｍｉＲ－１３５分子のセンス鎖（例：ガイド鎖）またはアンチセンス鎖（例：パッセンジャー鎖）のいずれかの末端（５’または３’）にカップリングしてもよい。
一実施形態においては、本発明のいくつかの実施形態の合成ｍｉＲ－１３５分子またはコンジュゲートと、細胞膜透過部分および／またはＢＢＢを通過する輸送用部分とは直接カップリングされてもよい。代替として、他の実施形態によると、両方の部分が結合基によって連結されてもよい。
本発明における使用に適したリンカー基については、上述した通りである。
特定の実施形態においては、リンカーは、下記構造（但し、ＡＳＯはオリゴヌクレオチドである）を有するパルミトイル修飾リンカーである。
Figure 2024503711000024
特定の実施形態においては、リンカーは、パルミチン酸をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせるためのホスホジエステル単位（例：ホスホジエステル（ＰＯ）－トリヌクレオチドリンカーおよびヘキシルアミノスペーサー）である。
特定の実施形態においては、リンカーは、コレステロールリンカーである。例示的なリンカーとしては、トリエチルグリコール［ＴＥＧ］リンカーおよび２－アミノブチル－１－３－プロパンジオール［Ｃ７］リンカーが挙げられる。
特定の実施形態においては、本発明のコンジュゲートは下記工程によって合成される。
（ｉ）（例：神経伝達物質輸送体に特異的に結合する）細胞膜透過部分の活性化。特定の実施形態においては、試薬中の活性化基はサクシニミドまたはアミノ基である。
（ｉｉ）パッセンジャー鎖（またはガイド鎖）の５’末端の活性化。特定の実施形態においては、オリゴヌクレオチド内の活性化基は、（サクシニミド基によって試薬が活性化されたときは）アミノ基または（アミン基によって試薬が活性化されたときは）カルボキシル基である。
（ｉｉｉ）活性化細胞膜透過部分と活性化パッセンジャー鎖（または活性化ガイド鎖）との、２つの活性化基の反応に適した条件下での接触。
一実施形態においては、以下の工程をさらに実施してもよい。
（ｉｖ）ガイド鎖（またはパッセンジャー鎖）への保護基の付加。この工程は、反応性基がアセチル化またはベンジル化（フラノース基）、２－シアノエチル化（ホスホジエステル結合）およびＦＭＯＣ（環外アミノ基）によって遮断されたオリゴヌクレオチドを用いて実施してもよい。
一実施形態においては、以下の工程をさらに実施してもよい。
（ｖ）ガイド鎖およびパッセンジャー鎖のアニーリング。
一実施形態および上記説明においては、合成ｍｉＲ－１３５分子が化学修飾を含まないとき、発現構築物の一部として標的細胞（例：神経膠細胞、オリゴデンドロサイト、脈絡叢（ＣＰ）細胞、幹細胞または分化幹細胞などの脳細胞）に投与してもよい。この場合、核酸構築物内においては、標的細胞（例：神経膠細胞、オリゴデンドロサイト、ＣＰ細胞、幹細胞または分化幹細胞などの脳細胞）内で構成的にまたは誘導的にマイクロＲＮＡの発現を指揮することのできるシスエレメント（例：プロモーター）の制御下に合成ｍｉＲ－１３５分子は連結される。
本発明の発現構築物は、真核生物での複製および組み込みに最適化させる追加の配列（例：シャトルベクター）をさらに含んでもよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳開始配列（例：プロモーター、エンハンサー）と、転写および翻訳ターミネーター（例：ポリアデニル化シグナル）を含有する。本発明の発現構築物は、そこからの転写を上方制御するように機能し得るエンハンサーをプロモーター配列の隣または遠位にさらに含み得る。発現効率の増加のためにポリアデニル化配列を本発明の発現構築物に追加することもできる。
既に記載した実施形態に加えて、本発明の発現構築物は、クローニングされた核酸の発現レベルの増加、または組換えＤＮＡを保有する細胞の同定を容易にすることを目的とした他の特殊なエレメントを典型的には含有してもよい。
本発明の発現構築物は、真核細胞性レプリコンを含んでも、含まなくてもよい。
核酸構築物は、適切な遺伝子送達ベヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入等）および適切な発現システムを用いて、本発明の標的細胞（例：神経膠細胞等の脳細胞）に導入することができる。このような方法は通常、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)およびGilboa et at. ［Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986］に記載されており、例えば、安定的または一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび組換えウイルスベクターによる感染を含む。更に、ポジティブ－ネガティブ選択法については、米国特許第５，４６４，７６４号明細書および同第５，４８７，９９２号明細書を参照。
血液脳関門を迂回するために、本発明の構築物は、（室を介して）脳に、（鼻腔内投与によって）嗅球に、（例：硬膜カテーテルによって）脊髄に直接投与する、または後述するように脈絡叢で発現させる。追加の投与方式については詳細に後述する。
追加または代替として、脂質に基づくシステムを構築物またはコンジュゲートｍｉＲ－１３５分子の本発明の標的細胞（例：神経膠細胞などの脳細胞）への送達に使用してもよい。
リポソームは、脂質二重膜で構成され、内部に容積を有する、任意の合成（即ち、非天然型）構造を含む。リポソームとしては、エマルション、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が挙げられる。リポソームは当業界で公知の方法［Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308、Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145、Lasic D., Liposome Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (chapter 3)、Winterhalter M, Lasic D D, Chem Phys Lipids, 1993 September;64(1-3):35-43］で製造してもよい。マイクロＲＮＡ（例：合成ｍｉＲ－１３５分子）をリポソームに導入する際には、当業界で公知の任意の方法を使用することができる。例えば、マイクロＲＮＡポリヌクレオチド試薬（例：合成ｍｉＲ－１３５分子）をリポソームに内包させてもよい。代替として、リポソーム表面に吸着させることもできる。本発明のリポソームに医薬成分を導入するための他の方法は、Alfonso et al.［The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)］およびKulkarni et al.［J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46］に記載の方法である。
本発明の方法で使用するリポソームは、血液関門を通過してもよい。従って、一実施形態によると、本発明のリポソームは、血液関門を標的化する多糖（例：マンノース）をその膜部分に含まない。本発明に特に適切なリポソームを決定するためにスクリーニングアッセイを実施することができる、例えば、米国特許出願公開第２００４０２６６７３４号明細書および同第２００４０２６６７３４号明細書、並びにDanenberg et al., Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9、Circulation 2002, 106:599-605、Circulation 2003, 108:2798-804に記載のアッセイが挙げられる。
一実施形態においては、二重標的化リポソームが使用される。例示的な二重標的化リポソームおしては、アンジオペップ－２－オリゴアルギニン、Ｔ７－ＴＡＴ、ＴＨＲ－トランスポータン、Ｔｆ－ＴＡＴ、Ｔｆ－ペネトラチンまたはＴｆ－マストパランが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
追加または代替として、本発明の本態様で使用可能な非脂質ベースの小胞体としては、エクソソーム、例えば、ＥＶＯＸ等の修飾エクソソームが挙げられる。これらエクソソームはＢＢＢを通過し、治療用組成物を脳、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）に放出することができる。
本発明の本態様で使用可能な他の非脂質ベースの小胞体としては、ポリリシン、デンドリマー、およびガゴマー（Ｇａｇｏｍｅｒ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
使用する方法または構築物に関わらず、上記で詳細に説明した、合成ｍｉＲ－１３５分子をコードする核酸構築物を含むか、または合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型を含む、単離された細胞が提供される。
特定の実施形態においては、細胞は神経膠細胞（即ち、神経細胞またはグリア細胞、例えば、オリゴデンドロサイトまたはアストロサイト）である。
特定の実施形態においては、神経膠細胞はセロトニン性神経細胞等の神経細胞である。
特定の実施形態においては、細胞はがん性細胞である。
特定の実施形態においては、細胞は骨細胞である。
特定の実施形態においては、細胞は筋肉細胞である。
特定の実施形態においては、細胞は胃腸細胞である。
本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子は、細胞、即ち、本発明の標的細胞（例：神経膠細胞）にｉｎ ｖｉｖｏで（即ち、生物または対象の中に）またはｅｘ ｖｉｖｏで（例：培養組織に）提供する。細胞をｅｘ ｖｉｖｏで処理する場合、方法にはこのような細胞を個体に戻す工程が含まれることが好ましい（ｅｘ ｖｉｖｏ細胞療法）。
Ｅｘ ｖｉｖｏ療法のために、細胞（例えば、神経膠細胞（例：オリゴデンドロサイト）等の脳細胞、ＣＰ細胞、幹細胞および／または分化幹細胞）は本発明の組成物（例：合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型）で処理されることが好ましく、その後、それを必要とする対象に投与する。
本発明のｅｘ ｖｉｖｏ処理細胞の投与は適切な導入経路、例えば、静脈内、腹腔内、腎臓内、消化管内、皮下、経皮、筋肉内、皮内、髄腔内、硬膜外および直腸等で行うことができる（さらに詳細に後述する）。現在好まれる実施形態においては、本発明のｅｘ ｖｉｖｏ処理細胞を静脈内、腎臓内、消化管内および／または腹腔内投与で個体に導入することができる。
本発明の細胞（例：オリゴデンドロサイト等の神経膠細胞、ＣＰ細胞、幹細胞、分化幹細胞および／または心臓細胞）は、自家移植源あるいはヒトの死体またはドナー等の同種他家移植源から誘導することができる。非自家細胞は体に投与した際に免疫反応を誘導しやすいため、非自家細胞の拒絶傾向を減少させるいくつかのアプローチが開発されている。このようなアプローチとしては、移植前の、レシピエントの免疫系の抑制、または非自家細胞の免疫隔離性半浸透膜への封入のいずれかが挙げられる。
封入技術は、一般的に、小さな球状ベヒクルを含むマイクロ封入、および大きな、平たいシートおよび中空糸膜を含むマクロ封入に分類される（Uludag, H. et al. (2000). Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev 42, 29-64）。
マイクロカプセルの製造方法は当業界で公知であり、例えば、下記に開示されている：Lu, M. Z. et al. (2000). Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng 70, 479-483、Chang, T. M. and Prakash, S. (2001) Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol 17, 249-260、およびLu, M. Z., et al. (2000). A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul 17, 245-521。
例えば、マイクロカプセルを２－ヒドロキシエチルメチルアクリレート（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）、およびメチルメタクリレート（ＭＭＡ）のｔｅｒ－ポリマーシェルとの複合体とした修飾コラーゲンを用いて製造し、厚み２～５μｍのカプセルを得る。このようなマイクロカプセルは、陰電性の平滑表面を付与し、血漿タンパク質の吸収を査証源にするために、さらに追加の２～５μｍのｔｅｒ－ポリマーシェルに封入することができる（Chia, S. M. et al. (2002). Multi-layered microcapsules for cell encapsulation. Biomaterials 23, 849-856）。
他のマイクロカプセルは、海洋性多糖であるアルギン酸（Sambanis, A. (2003). Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Thechnol Ther 5, 665-668）またはその誘導体をベースとするものである。例えば、マイクロカプセルは、塩化カルシウムの存在下、ポリアニオンであるアルギン酸ナトリウムとセルロース硫酸ナトリウム、およびポリカチオンである塩酸ポリ（メチレン－ｃｏ－グアニジン）の高分子電解質錯体形成によって製造することができる。
より小さなカプセルを使用することで、細胞封入は改善されることを理解されたい。よって、例えば、カプセルのサイズを１ｍｍから４００μｍに縮小することで、封入細胞の品質管理、拡散特性、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ活性は改善された（Canaple, L. et al. (2002). Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed 13, 783-96）。さらに、最小７ｎｍの詳細に制御された孔径、テーラーメイドの表面化学、および詳細な微小構造（ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を有するナノポーラスバイオカプセルが細胞の微小環境の免疫隔離に成功したことも見出されている（Williams, D. (1999). Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol 10, 6-9、およびDesai, T. A. (2002). Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther 2, 633-646を参照）。
Ｅｘ ｖｉｖｏの療法と併用することのできる免疫抑制剤の例としては、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ－ペニシリン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、エタネルセプト、ＴＮＦα阻害薬、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＳＡＩＤの例としては、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナム酸、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ－２阻害薬、およびトラマドールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
Ｉｎ ｖｉｖｏ療法のために、組成物（例：合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型）をそのままで対象に投与するか、または医薬組成物の一部として投与する。
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、本明細書に記載の１種以上の有効成分と生理学的に適切な担体や賦形剤等の他の化学成分とから成る調製物を意味する。医薬組成物の目的は化合物の生物への投与を容易にすることである。
本明細書において「有効成分」という用語は、生物学的効果をもたらす分子（例：合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型）を意味する。
以下、互換的に使用される「生理学的に許容される担体」と「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に対して重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を意味する。このような語句にはアジュバントが含まれている。
本明細書において「賦形剤」という用語は、医薬組成物に添加して有効成分の投与を更に容易にする不活性物質を意味する。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖および各種デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
薬物の処方と投与の技法については、“Remington’s Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新刊（本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する）に記載されている。
適切な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、特に経鼻、鼻腔内、眼内、腸管内または非経口送達を挙げることができ、例えば、筋肉内、皮下および髄内注射や、髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、または眼腔内注射を挙げることができる。
代わりに、医薬組成物を全身ではなく局所に、例えば、医薬組成物を直接患者の組織領域に注射（例：疾病組織への局所注射）で投与してもよい。
特定の実施形態においては、組成物は経口 投与用である。
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチとしては、神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）、ＢＢＢの内因性輸送経路の１個を利用するための剤の分子操作（例えば、上述したような、脳細胞表面分子に対して親和性を有する細胞標的化部分に結合させた合成ｍｉＲ－１３５分子の作製）、薬剤の脂溶性を高めるように設計された薬理学的戦略（例えば、脂質またはコレステロール担体への合成ｍｉＲ－１３５分子のコンジュゲート）、および高浸透圧破壊によるＢＢＢの完全性の一時的な破壊（頸動脈へのマンニトール溶液の注入またはアンジオテンシンペプチド等の生物活性剤の使用に起因）が挙げられる。
ＢＢＢの後ろへの薬物送達の方法としては、（例えば針による）脳内インプラントおよび対流強化薬剤送達法が挙げられる。ＢＢＢを迂回するためにマニトールを使用することができる。同様に粘膜（例：鼻）投与をＢＢＢの迂回に使用することができる。
特定の実施形態においては、組成物は鼻腔内投与用である。
鼻腔内投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）への治療薬の送達に使用してもよい。送達は、鼻腔の上後部に位置する嗅上皮を介して生じる。嗅上皮の神経細胞は、脳の嗅球に突き出すため、脳と外部環境との直接接続を可能にする。脳への薬物の移動は、遅い嗅神経細胞輸送またはより速い嗅神経細胞の周囲の神経周囲腔を通る脳内の脳髄液への移動のいずれかによって生じると考えられる。これは非侵襲性投与であり、ＢＢＢを通過することのできない大きな分子がＣＮＳに接近することを可能にすると考えられる。この投与経路は全身暴露を減少するため、望ましくない全身副反応も減少させる。鼻からＣＮＳへの送達は、典型的には数分で生じ、任意の受容体への結合または軸索輸送を必要としない。
特定の実施形態においては、組成物は髄腔内（ＩＣ）、脳室内（ＩＣＶ）、眼内または静脈内（ＩＶ）投与用であり、組成物は血液脳関門（ＢＢＢ）の通過を可能にする。
一実施形態においては、医薬組成物は脳脊髄液（ＣＳＦ）に届くように、髄腔内投与、即ち、脊柱管へ、またはくも膜下腔へ投与する。
一実施形態においては、医薬組成物眼内投与形態で投与する。
一実施形態においては、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）投与形態、即ち、脳室内の脳髄液に直接注射によって投与する。
一実施形態においては、医薬組成物は、静脈内（ＩＶ）投与形態によって投与する。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で良く知られたプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
従って、本発明に従って使用する医薬組成物は、薬学的に使用可能な調製物への有効成分の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む１種以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で処方することができる。適切な製剤は選択する投与経路によって決まる。
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液等の生理的に適合性のある緩衝液に処方することができる。経粘膜投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当技術分野では一般に知られている。
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物を当技術分野で良く知られた薬学的に許容される担体と組み合わせて容易に処方することができる。そのような担体によって、患者が経口摂取できるように医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として処方することができる。経口使用のための薬理学的調製物は固体賦形剤を使用して作製し、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、必要に応じて適切な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖等の充填剤、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロース等のセルロース調製物、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理学的に許容されるポリマーである。必要に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を添加することができる。
糖衣錠コアには適切なコーティングを設ける。この目的のために、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を必要に応じて含み得る濃縮糖溶液を使用することができる。染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加して識別に用いたり、活性化合物用量の様々な組み合わせを特徴付けたりすることができる。
経口使用可能な医薬組成物としては、ゼラチンで形成されたプッシュフィットカプセルや、ゼラチンとグリセロールやソルビトール等の可塑剤で形成されたソフトシールカプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルには、有効成分と混合させて、ラクトース等の充填剤、デンプン等のバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、および必要に応じて安定剤を配合することができる。ソフトカプセルにおいては、有効成分を適切な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール）に溶解または懸濁させることができる。更に安定剤を添加することができる。経口投与用の全ての製剤は、選択した投与経路に適した投与形態とすべきである。
口腔内投与の場合、組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチの形態をとることができる。
経鼻吸入による投与の場合、本発明に係る使用のための有効成分は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で簡便に送達する。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するバルブを設けることによって投与単位を決定することができる。ディスペンサーで使用する、例えば、ゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースやデンプン）との粉末混合物を含むように処方することができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用製剤は単位剤形、例えば、アンプルで供給するか、または必要に応じて防腐剤を添加した複数回投与容器で供給することができる。組成物は油性媒体または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液とすることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの調合剤を含むことができる。
非経口投与用の医薬組成物には水溶性の活性製剤の水溶液が含まれる。更に、有効成分の懸濁液は適切な油性または水ベースの注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒体としては、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリドまたはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、有効成分の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする適切な安定剤または薬剤を含むこともできる。
或いは、有効成分は、適切な媒体（例えば、無菌でパイロジェンフリーの水ベース溶液）で用事調製するための粉末形態とすることができる。
本発明の医薬組成物は、例えば、カカオバターや他のグリセリド等の従来の坐剤基剤を使用して坐剤または保持浣腸等の直腸組成物に処方することもできる。
本発明の状況での使用に適した医薬組成物としては、本来の目的を達成するために有効な量の有効成分を含む組成物が挙げられる。より具体的には、治療有効量とは、障害（例えば、ＣＮＳ関連病態（気分障害等の精神障害）の症状を予防、緩和または改善するか、または治療される対象の生存を延長するために有効な有効成分（例：合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型）の量を意味する。
本発明の一実施形態によると、合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型の投与には抗うつおよび抗ストレス効果がある。
治療有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の方法で使用されるいずれの調製物についても、治療有効量または用量は先ずインビトロおよび細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して所望の濃度または力価を得ることができる。このような情報を利用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
本明細書に記載の有効成分の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物においてインビトロでの標準的な製薬手順によって確認することができる。このようなインビトロおよび細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを用いて、ヒトで使用される範囲の投与量を処方することができる。投与量は使用する剤形および利用する投与経路に応じて変わり得る。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1 内のFingl, et al., 1975を参照）。
投与量と投与間隔は個別に調整して、生物学的効果を誘発または抑制するために十分な有効成分の血漿レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を得ることができる。ＭＥＣは調製毎に変わるが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを得るために必要な投与量は、個々の特性と投与経路によって決まる。検出アッセイにより血漿中濃度を確認することができる。
治療する病態の重症度と応答性に応じて投薬は単回または複数回の投与であり、治療過程は数日間～数週間続くか、或いは治癒が成されるかまたは病状が軽減されるまで続く。
当然のことながら、投与する組成物の量は、治療する対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医師の判断等に依存する。投与の量およびタイミングは、個別の病態の変化の詳細且つ連続的なモニタリングに応じたものとなる。
本発明の合成ｍｉＲ－１３５分子をヒトの治療に用いる前に試験するための動物モデルが存在することを理解されたい。例えば、うつ病、ストレス、不安等の学習性無力感モデル（ＬＨ）、慢性軽度ストレス（ＣＭＳ）モデル、社会的敗北ストレス（ＳＤＳ）モデルおよび母性剥奪モデルおよび睡眠剥奪モデルを使用してもよい。例えば、双極性疾患の動物モデルとしては、例えば、変異体Ｐｏｌｇ（Ｄ１８１Ａ）の神経細胞特異的発現を示すトランスジェニックマウス［参照を持って本願に援用する、Kato et al., Neuroscience and Biobehavioral Reviews (2007) 6 (31):832-842に教示］や、広く確立されたアンフェタミン誘導性過活性の躁病ラットモデル［例：米国特許第６，５５５，５８５号明細書に教示］およびケタミン誘導性過活性［例：Ghedim et al., Journal of Psychiatric Research (2012) 46: 1569-1575に教示］を使用してもよく、これは本参照を持って本願に援用する。
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含む１種以上の単位剤形を含むことのできる、ＦＤＡ承認キット等のパックまたはディスペンサーデバイスで提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属またはプラスチック箔を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには投与用説明書を添付することができる。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の容器に関連する通知（組成物の形態またはヒトや動物への投与に関する機関による承認を反映している通知）を収容することもできる。このような通知は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局で承認されたラベル表示、または承認された製品挿入物とすることができる。上で更に詳述したように、適合性医薬担体に処方された本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、示された病態の治療用と表記することもできる。
本発明の治療用組成物は、合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型に加えて、ＣＮＳ関連病態（例えば、精神障害、例えば、うつ病、ストレス、不安、睡眠不足等）の治療のための公知の医薬を含んでも良いことを理解されたい。このような医薬としては、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン性および特異的セロトニン性抗うつ薬（ＮａＳＳＡ）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬、選択的セロトニン再取り込みエンハンサー、ノルエピネフリン－ドーパミン脱阻害薬、三環系抗うつ薬（例：イミプラミン）、モノアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これら医薬は製品中の単一パッケージにまたは別個のパッケージに含めてもよい。
一実施形態においては、本発明の治療用組成物は、合成ｍｉＲ－１３５分子またはそのコンジュゲート型に加えて、医薬または医薬の組み合わせを含んでもよい。医薬としては、リチウム（例：炭酸リチウム、クエン酸リチウム、硫酸リチウム）、抗精神病薬（例：後述する定型抗精神病薬および非定型抗精神病薬）、気分安定薬（例：バルプロ酸（ＶＰＡ、バルプロ酸塩）、ミネラル類、抗痙攣剤、抗精神病薬）および抗うつ薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本教示にしたがって使用することのできる例示的な定型抗精神病薬としては、低強度医薬（Ｌｏｗ ｐｏｔｅｎｃｙ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）：クロプロマジン（Ｌａｒｇａｃｔｉｌ（登録商標）、Ｔｈｏｒａｚｉｎｅ（登録商標））、クロルプロチキセン（Ｔｒｕｘａｌ（登録商標））、チオリダジン（Ｍｅｌｌａｒｉｌ（登録商標））、メソリダジンおよびレボメプロマジン；中強度医薬（Ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｔｅｎｃｙ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）：ロキサピン（Ｌｏｘａｐａｃ（登録商標）、Ｌｏｘｉｔａｎｅ（登録商標））、モリンドン（Ｍｏｂａｎ（登録商標））、ペルフェナジン（Ｔｒｉｌａｆｏｎ（登録商標））およびチオチキセン（Ｎａｖａｎｅ（登録商標））；高強度医薬（Ｈｉｇｈ ｐｏｔｅｎｃｙ ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ）：ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ（登録商標）、Ｓｅｒｅｎａｃｅ（登録商標））、フルフェナジン（Ｐｒｏｌｉｘｉｎ（登録商標））、ドロペリドール、ズクロペンチキソール（Ｃｌｏｐｉｘｏｌ（登録商標））、フルペンチキソール（Ｄｅｐｉｘｏｌ（登録商標））、プロクロルペラジンおよびトリフルオペラジン（Ｓｔｅｌａｚｉｎｅ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。加えて、プロクロルペラジン（Ｃｏｍｐａｚｉｎｅ（登録商標）、ＢｕｃＣＡＳ ｔｅｍ（登録商標）、Ｓｔｅｍｅｔｉｌ（登録商標））およびピモジド（Ｏｒａｐ（登録商標））を使用してもよい。
本教示にしたがって使用することのできる例示的な非定型抗精神病薬（第二世代抗精神病薬とも称する）としては、アミスルプリド（Ｓｏｌｉａｎ（登録商標））、アリピプラゾール（Ａｂｉｌｉｆｙ（登録商標））、アセナピン（Ｓａｐｈｒｉｓ（登録商標））、ブロナンセリン（Ｌｏｎａｓｅｎ（登録商標））、ビトペルチン（ＲＧ１６７８）、ブレクスピプラゾール（ＯＰＣ－３４７１２）、カプリルアミン（Ｐｒａｚｉｎｉｌ（登録商標））、クロカプラミン（Ｃｌｏｆｅｋｔｏｎ（登録商標））、クロザピン（Ｃｌｏｚａｒｉｌ（登録商標））、カリプラジン（ＲＧＨ－１８８）、イロペリドン（Ｆａｎａｐｔ（登録商標））、ルラシドン（Ｌａｔｕｄａ（登録商標））、ＬＹ２１４００２３、メルペロン（Ｂｕｒｏｎｉｌ（登録商標））、モサプラミン（Ｃｒｅｍｉｎ（登録商標））、オランザピン（Ｚｙｐｒｅｘａ（登録商標））、パリペリドン（Ｉｎｖｅｇａ（登録商標））、ペロスピロン（Ｌｕｌｌａｎ（登録商標））、ピマバンセリン（ＡＣＰ－１０３（登録商標））、クエチアピン（Ｓｅｒｏｑｕｅｌ（登録商標））、レモキシプリド（Ｒｏｘｉａｍ（登録商標））、リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ（登録商標））、セルチンドール（Ｓｅｒｄｏｌｅｃｔ（登録商標））、スルピリド（Ｓｕｌｐｉｒｉｄ（登録商標））、バビカセリン（ＳＣＡ－１３６（登録商標））、ジプラシドン（Ｇｅｏｄｏｎ（登録商標））、ゾテピン（Ｎｉｐｏｌｅｐｔ（登録商標））およびジクロナピン（Ｌｕ ３１－１３０）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本教示にしたがって使用することのできる例示的な気分安定薬としては、ミネラル類（例：リチウム）；バルプロ酸（Ｄｅｐａｋｉｎｅ（登録商標））、ジバルプロエクスナトリウム（Ｄｅｐａｋｏｔｅ（登録商標））、およびバルプロ酸ナトリウム（Ｄｅｐａｃｏｎ（登録商標）、Ｅｐｉｌｉｍ（登録商標））、ラモトリギン（Ｌａｍｉｃｔａｌ（登録商標））、カルバマゼピン（Ｔｅｇｒｅｔｏｌ（登録商標））、オキシカルバゼピン（Ｔｒｉｌｅｐｔａｌ（登録商標））、トピラマート（Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標））、リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））およびガバペンチン（Ｎｅｕｒｏｎｔｉｎ（登録商標））を含む抗痙攣気分安定薬；（上述した）抗精神病薬；および食品添加物（例：オメガ－３脂肪酸）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本教示に従って使用することのできる例示的な抗うつ薬としては、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチンおよびセルトラリン等のＳＳＲＩ）；セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（デスベンラファキシン、デュロキセチン、ミルナシプランおよびベンラファキシン等のＳＮＲＩ）；ノルアドレナリン性および特異的セロトニン性抗うつ薬（ミアンセリンおよびミルタザシン等）；ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）再取り込み阻害薬（アロモキセチン、マジンドール、レボキセチン、およびビロキサジン等のＮＲＩ）；ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ブプロピオン等）；選択的セロトニン再取り込み促進剤（ティアネプチン等）；ノルエピネフリン－ドーパミン脱阻害薬（アゴメラチン等のＮＤＤＩ）；三環系抗うつ薬（三級アミン三環系抗うつ薬および二級アミン三環系抗うつ薬を含む）；およびモノアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、抗うつ薬は、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、三環系抗うつ薬およびノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）を含む。
特定の実施形態においては、抗うつ薬は選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）を含む。
本教示と、臨床心理学、気けいれん療法、非自発入院、光療法、心理療法、経頭蓋磁気刺激法および認知行動的療法が挙げられるが、これらに限定されない追加の非薬理治療手段とを組み合わせることもできることを理解されたい。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のＣＮＳ関連病態を治療するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートの治療有効量対象に投与することで、ＣＮＳ関連病態を治療することを含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のＣＮＳ関連病態の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態組成物またはコンジュゲートが提供される。
「治療する」という用語は、疾患、異常または病態の発生の阻害または停止させること、および／または疾患、異常または病態の減少、寛解または退行を生じること、あるいは疾患、異常または病態を有すると未だ診断されていないが、疾患、異常または病態のリスクを有する対象において、疾患、異常または病態の発生を防止する(即ち、予防する)ことを意味する。疾患、異常または病態の発症を評価すめるために種々の方法論およびアッセイが使用可能であり、同様に種々の方法論およびアッセイは疾患、異常または病態の減少、寛解または退行 の評価に使用してもよいことを、当業者は理解するであろう。
本明細書で使用する「対象」または「○○を必要とする対象」という用語は、病理に罹患しているまたは病理を発症するリスクのある、あらゆる年齢の雄または雌の哺乳動物、好ましくはヒトを意味する。
本願においては、「ＣＮＳ関連病態」または「中枢神経系関連病態」という成句には、精神障害（例えば、パニック症候群またはパニック発作、不安障害（例：全般不安障害）、全種類の恐怖性障害（例：社会恐怖症）、躁病、躁うつ病（例：双極性疾患）、軽躁病、全形態および／または種類のうつ病（例：単極性うつ病）、ストレス障害、ＰＴＳＤ、身体表現性障害、パーソナリティ障害、強迫行動、精神病、および統合失調症）、中毒または物質関連障害（例えば、薬物依存［例：アルコール、覚せい剤（例：クラック、コカイン、スピードおよびヒロポン）、オピオイドおよびニコチン］、ストレス、疲労、てんかん、頭痛、急性疼痛、慢性疼痛、神経障害、脳虚血、痴呆症（例：アルツハイマー型および多発脳梗塞性痴呆）、記憶喪失、認知不全（例：認知機能障害）、睡眠障害（例：不眠症、早朝覚醒、および／または過眠）、摂食障害（例：過食症、拒食症、身体増の崩壊、むちゃ食い障害）、自閉症スペクトラム障害、トゥレット障害、幼児障害、運動障害、多発性硬化症、成長障害、生殖障害、適応障害、譫妄が含まれる。追加の障害は、例えば、Diagnostic and Statistical Manual (DSM) of Mental Disorders, Fifth Edition（ＤＳＭ－５）に記載されている。典型的には、このような障害は、複雑な遺伝的、生化学的および／または環境的因子を有する。
特定の実施形態においては、ＣＮＳ関連病態は精神障害である。
特定の実施形態においては、精神障害は気分障害である。
気分障害の非限定的な例としては、うつ病（即ち、うつ病性障害）、双極性障害、物質－誘導性気分障害、アルコール誘導性気分障害、ベンゾジアゼピン誘導性気分障害、一般的な健康状態による気分障害、その他の気分障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、（上述した）ＤＳＭ－５を参照。
特定の実施形態においては、精神障害はうつ病性障害である。
うつ病性障害の非限定的な例としては、大うつ障害（ＭＤＤ）、非定型うつ病、メランコリー型うつ病、精神病性大うつ病または精神病性うつ病、緊張型うつ病、産後うつ病、季節性感情障害（ＳＡＤ）、急性うつ病、慢性うつ病（気分変調症）、二重うつ病、その他の特定不能のうつ病性障害、抑うつ性パーソナリティ障害（ＤＰＤ）、反復性短期うつ病（ＲＢＤ）、小うつ病性障害（小うつ病）、月経前症候群、月経前不快気分障害、慢性健康状態（例：、がん、慢性疼痛、化学療法、慢性ストレス）が原因のうつ病、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。うつ病の種々の亜型は、例えば、ＤＳＭ－５に記載されている。
特定の実施形態においては、精神障害は双極性障害である。
双極性障害の非限定的な例としては、躁病、急性躁病、重度躁病、軽躁病、うつ病、中等症うつ病、気分変調症、重度うつ病、躁病および／またはうつ病のエピソード、精神病／精神病性症状（例：幻覚、妄想）、混合双極状態、１型双極性障害（大うつ病の併発ありまたは無しの躁病）、２型双極性障害（大うつ病を併発した軽躁病）、急速交替型双極性障害、気分循環症および／または特定不能の双極性．障害（ＢＤ－ＮＯＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、（上述した）ＤＳＭ－５を参照。双極性障害は躁うつ病としても知られている。
特定の実施形態においては、精神障害は統合失調症である。
一実施形態においては、統合失調症は、個人による現実逃避を含む精神障害を意味する。その症状には、少なくとも一ヶ月の一部、二ヶ月またはそれを超える期間の以下の症状が含まれる：妄想、幻覚、崩壊した会話、ひどく混乱したまたは緊張した行動、または陰性症状（即ち、感情の平坦化、失語症、または意欲消失）。統合失調症には、例えば、統合失調感情障害等の障害が含まれる。統合失調症の診断は、例えば、ＤＳＭ－５に記載されている。統合失調症の種類としては、偏執型、破瓜型、緊張型、型分類困難、および残遺型が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、（上述した）ＤＳＭ－５を参照。
特定の実施形態においては、ＣＮＳ関連病態は自閉症スペクトラム障害である。
一実施形態においては、自閉症スペクトラム障害は、社会的相互関係の障害および反復および常同行動を伴うコミュニケーション症によって特徴づけられる、神経発達障害のスペクトラムを意味する。自閉症には、社会的相互関係の障害およびコミュニケーション症のスペクトラムが含まれるが、しかし、障害は、社会的相互関係およびコミュニケーションの障害の程度に応じて、「高機能性自閉症」または「低機能性自閉症」に大まかに分類することができる。「高機能性自閉症」と診断された個人は、低くはあるが、同定可能な社会的相互関係およびコミュニケーションの障害を有する（例：アスペルガー症候群）。自閉症スペクトラム障害に関する追加の情報は、例えば、ＤＳＭ－５、Sicile-Kira and Grandin, Autism Spectrum Disorders: The Complete Guide to Understanding Autism, Asperger's Syndrome, Pervasive Developmental Disorder, and Other ASDs, 2004, Perigee Trade；およびDuncan et al., Autism Spectrum Disorders [Two Volumes]: A Handbook for Parents and Professionals, 2007, Praegerに見ることができる。
特定の実施形態においては、ＣＮＳ関連病態は、神経免疫に基づく精神障害である。神経免疫に基づく精神障害の非限定的な例としては、うつ病（例：大うつ病性障害）および双極性障害等の気分障害、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、小児急性発症神経精神症候群（ＰＡＮＳ）および小児自己免疫神経精神障害（ＰＡＮＤＡＳ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のうつ病関連障害を治療するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートの治療有効量を前記対象に投与することで、うつ病関連障害を治療することを含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のうつ病関連障害の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートが提供される。
一実施形態においては、うつ病関連障害は、大うつ病、強迫性障害（ＯＣＤ）、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、心的外傷後ストレス症候群（ＰＴＳＤ）、不安障害、双極性障害、摂食障害および慢性疼痛からなる群より選ばれる。
一実施形態においては、ＣＮＳ関連病態（例：精神障害）またはうつ病関連障害の治療は、ＣＮＳ関連病態（例：精神障害）またはうつ病関連障害の治療用の追加の薬剤（または薬剤の任意の組み合わせ）を対象に投与することによってさらに実行されてもよい。
本教示に従って使用可能な精神障害またはうつ病関連障害の治療用の例示的な薬剤としては、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩｓ）、ノルアドレナリン性および特異的セロトニン性抗うつ薬（ＮａＳＳＡ）、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）、ノルエピネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬、選択的セロトニン再取り込みエンハンサー、ノルエピネフリン－ドーパミン脱阻害薬、三環系抗うつ薬（例：イミプラミン）、モノアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、精神障害またはうつ病関連障害の治療は、対象に精神障害またはうつ病関連障害治療用の追加の薬剤（または薬剤の任意の組み合わせ）を投与することでさらに実施してもよく、薬剤としては、リチウム（例：炭酸リチウム、クエン酸リチウム、硫酸リチウム）、抗精神病薬（例：上述した定型抗精神病薬および定型抗精神病薬）、気分安定薬（例：バルプロ酸（ＶＰＡ、バルプロ酸）、ミネラル類、抗痙攣剤、抗精神病薬）および抗うつ薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本教示に従って使用してもよい追加の薬剤については、上記で詳細に説明した。
一実施形態において効率的な治療（例：抗うつ／気分障害治療等の精神障害治療）は、治療前のｍｉＲ－１３５発現レベルと比べて、治療後に有意に高いｍｉＲ－１３５発現レベルが得られることをもって決定する。
治療に続く対象のｍｉＲ－１３５発現レベルは、治療前の対象と比べて、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％高くてもよい。
治療のモニタリングは、患者の健康状態を評価すること、そして追加のまたは代替として、対象を行動試験、ＭＲＩまたは他の当業者に広く知られる方法に付すことでさらに実施してもよい。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のがん性疾患を治療するための方法であって、発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、がん性疾患を治療することを含む方法が提供される。
本発明の別の態様においては、治療を必要とする対象のがん性疾患の治療用である、治療有効量の、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートが提供される。
がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。がん性疾患の具体例は、慢性骨髄性白血病、成熟傾向の、急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩球の増加を伴う急性非リンパ性白血病、急性単球性白血病、好酸球増多症を伴う急性骨髄単球性白血病等の骨髄性白血病；バーキット非ホジキンリンパ腫等の悪性リンパ腫；急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病等のリンパ球性白血病；固形腫瘍、良性髄膜種、唾液腺の混合腫瘍、大腸腺腫等の骨髄増殖性疾患；小細胞肺がん、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液型、骨膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液型軟骨肉腫、ユーイング腫瘍等の腺癌；その他としては精巣および卵巣胚芽異常症、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳房、皮膚、前立腺および卵巣であるが、これらに限定されるものではない。
特定の実施形態においては、がんは卵巣がん、結腸直腸がん、または前立腺がんを含む。
一実施形態においては、がん性疾患の治療は、がん性疾患.の治療用の追加の薬剤（または薬剤の任意の組み合わせ）を対象に投与することによってさらに実行されてもよい。
このような治療としては、放射線療法、化学療法、生物療法、例えば、免疫療法または骨髄移植が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明の組成物によって治療していない対象と比較して、または治療を受ける同じ対象の治療前の状態と比較して、腫瘍体積の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上の減少、あるいは腫瘍成長の停止をもって効果的な抗がん治療は決定される。
がん治療の効率を評価するために種々の方法およびアッセイ、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、Ｘ線、超音波、血液試験等が利用可能であることを当業者は理解するであろう。
本発明のいくつかの実施形態の組成物は、筋肉細胞分化および骨再生の促進にさらに使用してもよい。
よって、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートの治療有効量は、治療を必要とする対象の骨関連疾患または病態あるいは筋肉関連疾患または病態の治療に使用してもよい。
一実施形態においては、治療を必要とする対象の骨再生または筋肉細胞分化を促進するための方法であって、本発明のいくつかの実施形態の組成物またはコンジュゲートの治療有効量を対象に投与することで、骨再生または筋肉細胞分化を促進することを含む方法が提供される。
本教示に従って治療してもよい例示的な骨関連疾患または病態としては、骨損傷を含む怪我、閉鎖、開放および骨癒合不全の骨折等の骨折；成長不全；がんなどの骨溶解疾患；歯周病および欠陥、並びに他の歯科修復過程；老年性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、グルココルチコイド誘導性骨粗鬆症または廃用骨粗鬆症および関節炎、骨関節炎等の骨異常または骨形成の促進が有利に働く任意の病態が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物は、先天性、心的外傷性誘導または外科的な骨の切除（例えば、がん治療）、および整形外科における治療に有用である。
本教示に従って治療してもよい例示的な筋肉関連疾患または病態としては、筋変性疾患、神経筋疾患、脊髄性筋萎縮症、炎症性筋疾患、および代謝性筋疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的な筋疾患としては、筋ジストロフィー（例：デュシエンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーおよび筋強直性ジストロフィー）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、ランバート－イートン筋無力症候群、ボツリヌス症および脳血管障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
一実施形態においては、本発明の組成物によって治療していない対象と比較して、または治療を受ける同じ対象の治療前の状態と比較して、骨再生（例：骨細胞量）または筋肉細胞分化（例：筋肉細胞量）が少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％またはそれ以上の増加をもって、効果的な治療（例：骨再生および筋肉細胞分化）は決定される。
骨再生および筋肉細胞分化の促進を評価するために種々の方法およびアッセイ、例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、Ｘ線、超音波、血液試験等が利用可能であることを当業者は理解するであろう。
本出願から生じる特許の存続期間中に多数の関連ｍｉＲＮＡ修飾が開発されることが予想されるため、修飾という用語の範囲には、このような全ての新技術が演繹的に含まれることを意図する。
本明細書で使用される「約」という用語は±１０％を意味する。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその活用形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。
「から成る」という用語は、「含み、限定される」ことを意味する。
「から実質的に成る」という用語は、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。但しこれは、追加の成分、工程および／または部分が、請求項に記載の組成物、方法または構造の基本的且つ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
本明細書において、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数をも対象とする。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１種の化合物」には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物をも含み得る。
本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式にて示され得る。範囲形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、可能な下位の範囲の全部、およびその範囲内の個々の数値を特異的に開示していると考えるべきである。例えば、１～６といった範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲のみならず、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５および６も具体的に開示するものとする。これは、範囲の大きさに関わらず適用される。
本明細書において数値範囲を示す場合、それは常に示す範囲内の任意の引用数（分数または整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で代替可能に使用され、第１の指示数および第２の指示数と、それらの間の分数および整数の全部を含むことを意図する。
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医療の各分野の従事者に既知のもの、または既知の様式、手段、技術および手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
明確さのために別個の実施形態に関連して記載した本発明の所定の特徴はまた、１つの実施形態において、これら特徴を組み合わせて提供され得ることを理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連して記載した本発明の複数の特徴はまた、別々に、または任意の好適な部分的な組み合わせ、または適当な他の記載された実施形態に対しても提供され得る。様々な実施形態に関連して記載される所定の特徴は、その要素なしでは特定の実施形態が動作不能でない限り、その実施形態の必須要件であると捉えてはならない。
上述したように、本明細書に記載され、特許請求の範囲に請求される本発明の様々な実施形態および態様は、以下の実施例によって実験的に支持されるものである。
本出願に開示の配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）はいずれも、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマットまたはＲＮＡ配列フォーマットのみで表されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じてＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかに言及し得ることは理解されよう。例えば、配列番号１０はＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルをＵと表記している）が、ｍｉＲ－１３５ｂ核酸配列に対応するＲＮＡ配列、またはｍｉＲ－１３５ｂ分子核酸配列のＤＮＡ配列のいずれかに言及し得る。さらに、一部の配列はＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルをＵと表記している）が、記載される分子の実際の種類に応じて、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、または示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかに言及し得る。いずれにせよ、開示された配列を有するＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の両者が交換可能に想定される。
ここで、上記の記載と共に本発明を限定することなく説明する以下の実施例に参照する。
一般に、本明細書で使用される命名法や本発明で利用される実験手順には、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号明細書に記載の方法、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)であり、利用可能なイムノアッセイは特許および科学文献に広く記載されている、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８３９，１５３号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，８５０，５７８号明細書、同第３，８５３，９８７号明細書、同第３，８６７，５１７号明細書、同第３，８７９，２６２号明細書、同第３，９０１，６５４号明細書、同第３，９３５，０７４号明細書、同第３，９８４，５３３号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，０３４，０７４号明細書、同第４，０９８，８７６号明細書、同第４，８７９，２１９号明細書、同第５，０１１，７７１号明細書および同第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、"Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986)、"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)、並びに"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)。これら文献の全てを本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。他の一般的な参考文献はこの文書全体で提供される。そこに記載の手順は、当技術分野で良く知られていると考えられており、読者の便宜のために提供される。そこに含まれる全ての情報を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
一般材料と実験手順
動物および飼育条件
成体Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス、９～１１週齢を使用した。マウスは温度制御室（２２±１℃）内で、反転１２時間の明／暗サイクルで飼育した。餌と水は自由に摂取できるようにした。全ての実験プロトコルを雄マウスで実施し、ワイツマン科学研究所の動物実験委員会の承認を得た。
顕微解剖およびＲＮＡの調製
断頭の直後に脳を除去し、１ｍｍの金属製マトリクス（ｃａｔ＃ ５１３８０）（イリノイ州、ウッドデール、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）内に入れた。標準的な剃刀の刃（ＧＥＭ，６２－０１６５）で脳を１ｍｍまたは２ｍｍの切片にし、ドライアイス上で急速に冷凍した。マトリクスから取り除いた切片から、異なる直径の先端を丸めた注射針を用いて脳領域を抽出し、その後、－８０℃で保存した。ＲＮＡ抽出は、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標） ＲＮＡ ＸＳキット（ドイツ国、デューレン、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ（商標））を用いて実施した。ＲＮＡは、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ ｔｏ ｃＤＮＡキット（カリフォルニア州、フォスターシティ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次にｃＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）で解析した。
マイクロＲＮＡの精製および定量的リアルタイムＰＣＲ発現解析
マイクロＲＮＡを含むｍＲＮＡをｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造社の取扱説明書に従って単離し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写キットを用いて処理してｃＤＮＡを作製した。次に、ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造社のガイドラインに従ってＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）７５００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサンプルを解析した。各ｍｉＲの特異的プライマーを市販のユニバーサルプライマーと共に使用し、Ｕ６ ｓｎＲＮＡを内部対照として使用した。ｍＲＮＡの定量には、各転写産物についてソフトウエアであるＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて特異的プライマーを設計し、リアルタイムＰＣＲを用いて発現を試験した。
標的転写産物である３’ＵＴＲのｐｓｉＣＨＥＫ－２ルシフェラーゼ発現プラスミドへのクローニング
Ｓｌｃ６ａ４およびＨｔｒ１ａの３’ＵＴＲ配列をマウスゲノムＤＮＡからＰＣＲで増幅した。製造社のガイドラインに従って３’ＵＴＲのＰＣＲ断片をｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結し、ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２レポータープラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）内のルシフェラーゼの３’末端にある単一ＮｏｔＩ部位にさらにサブクローニングした。クローニングの向きは、診断用の切断およびシーケンシングで立証した。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８４－ウェルプレート内のポリ－Ｌ－リシン上で７０～８５％コンフルエントまで増殖し、ポリエチレンイミンを用いて、以下のプラスミドでトランスフェクトした：野性型または変異した３’ＵＴＲを含有するｐｓｉＣＨＥＣＫ－２プラスミドと特定のｍｉＲＮＡ用の過剰発現ベクター、あるいは空の過剰発現プラスミド。ｍｉＲｓ過剰発現プラスミドは、ｍｉＲ－Ｖｅｃライブラリーから取り入れた。トランスフェクションから２４時間後に細胞を融解し、ルシフェラーゼレポーター活性を既に報告されている方法［Kuperman Y. et al., Mol Endocrinol (2011) 25: 157-169］で解析した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ値は、同じベクターであるが３’ＵＴＲの影響のないものから転写した対照ホタルルシフェラーゼレベルに対して正規化し、その後の試験し、各条件について６回繰り返した試験の平均を得た。
Figure 2024503711000025
Figure 2024503711000026
Figure 2024503711000027
（任意でセルトラリンにコンジュゲートした）ｍｉＲ－１３５単鎖オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド配列は、標準的な２’－デオキシ、２’－Ｏ－Ｍｅまたは２’－ＭＯＥホスホラミダイトブロック、例えば以下のもの、を用いて組み立てた。
Figure 2024503711000028
ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）支持体上の固相合成の典型的な実験手順を使用しながら合成を実施した。簡単には、典型的なオリゴヌクレオチド合成は最も５’のヌクレオチドが結合されるまで繰り返される、（図１に示した）一連の４工程（脱保護、カップリング、キャッピングおよび酸化）からなるサイクルにより進行する。
（ａ）脱保護／脱トリチリル化
固相支持体に固定した塩基から酸に不安定な５’－ジメトキシトリチリル保護基を開裂させて（開始ヌクレオシド、またはその後の成長オリゴ鎖）、フリーの反応性ヒドロキシ官能基を得た。開裂試薬としては、ジクロロメタン中のジ－またはトリ－クロロ酢酸を用いた。
（ｂ）カップリング
フリーの５’－ＯＨ基はこれで添加したホスホラミダイトと反応可能である。その結果、両方のヌクレオシドは亜リン酸エステル架橋で連結された。ホスホラミダイトは、初めに弱酸（例：１Ｈ－テトラゾール）で活性化されなければならなかった。
（ｃ）キャッピング
残存したフリーのＯＨ基（約１％）が合成サイクル中で反応し、非特異的配列を生成するのを防止するために、キャッピング工程においてフリーの反応性基をアセチル化によって遮蔽し、合成の更なる工程における反応性パートナーから排除した。
（ｄ）酸化
カップリング工程で生成されたヌクレオチド間亜リン酸エステル基を、ヨウ素溶液を用いてリン酸塩へと酸化した。
工程（ａ）から新しい合成サイクルを繰り返した。これらの反応は所望のオリゴヌクレオチド配列が製造されるまで繰り返した。フリーの５’－ＯＨ基を保有する支持体結合オリゴヌクレオチドまたは保護５’－ＯＨ基（ＤＭＴ）を有する支持体結合オリゴヌクレオチドが得られるようにサイクルを停止することもできる。
ホスホロチオエート結合の導入：
全長ホスホジエステル骨格を有する正常オリゴの合成と、部分または全長ホスホロチオエート骨格を有するオリゴの合成との違いは、工程（ｄ）の酸化に用いる酸化剤の選択の違いに基づく。
リン酸塩に四番目の酸素を付加するためにヨウ素および水を用いて、ホスホジエステル結合を製造した。リン酸塩に硫黄を付加するためにＢｅａｕｃａｇｅ試薬を用いてホスホロチオエート結合を製造した。硫黄または酸素がリン酸塩に付加されると、結合は安定化し、続く化学サイクルの影響を受けなくなった。２種の酸化剤の間で行ったり来たりさせることで、キメラ骨格を構築してもよい。
セルトラリンがコンジュゲートされたｍｉＲ－１３５の合成
ホスホラミダイト化学を用いた自動合成機でガイドおよびパッセンジャーＲＮＡ鎖を合成した。ｒＡＢｚ、ｒＣＡｃ、ｒＧｉＢｕ、ｒＵおよび２’ＯＭｅＡＢｚ、２’ＯＭｅＣＡｃ、２’ＯＭｅＵホスホラミダイトモノマーを用いて配列を伸長させた。鎖伸長後にＲＮＡ鎖を固体支持体から開裂させ、水酸化アンモニウムとメチルアミンの混合物を用いて脱保護した。２’ＯＨ位はフッ素イオンを含む溶液を用いて脱保護した。次にＲＮＡ鎖をアニオン交換ＨＰＬＣで精製した。
セルトラリン修飾パッセンジャーＲＮＡ鎖をホスホラミダイト化学を用いた自動合成機で合成した。配列は、ｒＡＢｚ、ｒＣＡｃ、ｒＧｉＢｕ、ｒＵおよび２’ＯＭｅＡＢｚ、２’ＯＭｅＣＡｃ、２’ＯＭｅＵホスホラミダイトモノマーを用いて伸長させた。脱保護工程の前に、Ｃ１０Ｎ－ヒドロキシコハク酸エステルリンカーを未だ固体支持体に結合したパッセンジャーＲＮＡ配列の５’末端にグラフトした。セルトラリン－Ｃ６アシル－ＮＨ２リガンドとＣ１０ Ｎ－ヒドロキシコハク酸エステルリンカーとの縮合は、３％のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを含むジメチルホルムアミド中、室温で４８時間実施した（図２）。コンジュゲートの後には、セルトラリン修飾パッセンジャーＲＮＡ鎖を固体支持体から開裂させ、水酸化アンモニウムとメチルアミンの混合物を用いて脱保護した。２’ＯＨ位はフッ素イオンを含む溶液を用いて脱保護した。次にコンジュゲートのＲＮＡ鎖を逆相ＨＰＬＣで精製した。
ガイドおよびパッセンジャーＲＮＡ鎖は、最近傍法に基づき計算した消散係数を用いたＵＶ分光分析によって定量化した。デュプレックスは、同モル量のガイドおよびパッセンジャー鎖を組み合わせた。アニーリングは水中で実施した。デュプレックスはこれ以上精製しなかった。
オリゴヌクレオチドプライマー、ＲＮＡ鎖とセルトラリンとがコンジュゲートしたＲＮＡ鎖、およびＲＮＡデュプレックスは、本願明細書および本願の設計に基づき、Ａｘｏｌａｂｓ，ＧｍｂＨにより製造された。
構造：
むき出しの（ｎａｋｅｄ）ｍｉＲ－１３５デュプレックス１（下記表１のデュプレックス１１および表６のデュプレックス１）
Figure 2024503711000029
セルトラリンコンジュゲート（Ｓｅｒｔｒａｌｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ｍｉＲ－１３５デュプレックス１（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－１）
Figure 2024503711000030
 セルトラリン－アシルＣ６－ＮＨＣＯ－Ｃ９－５’ｍｉＲ－１３５配列３’－ＯＨ
むき出しの対照（下記表１のデュプレックス１６、および表６のデュプレックス８）
Figure 2024503711000031
セルトラリンコンジュゲート対照（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－８）
Figure 2024503711000032
むき出しのｍｉＲ－１３５デュプレックス２（下記表６）
ガイド鎖： ５’－Ｐ／ＵｍＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａ（配列番号４１）
パッセンジャー鎖： ５’－ｕｃＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＵａ（配列番号１３）
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５デュプレックス２（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－２）
Figure 2024503711000033
むき出しのｍｉＲ－１３５デュプレックス３（下記表６）
ガイド鎖： ５’－Ｐ／ＵｍＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａＡｍｓＡｍ（配列番号４２）
パッセンジャー鎖： ５’－ｕｃＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＵａ（配列番号１３）
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５デュプレックス３（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）
Figure 2024503711000034
むき出しのｍｉＲ－１３５デュプレックス９（下記表６）
ガイド鎖： ５’－Ｐ／ＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａ（配列番号１０）
パッセンジャー鎖： ５’－ｕｓｃｓＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＳ Ｕｓａ（配列番号４７）
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５デュプレックス９（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－９）
Figure 2024503711000035
むき出しのｍｉＲ－１３５デュプレックス１０（下記表６）
ガイド鎖： ５’－Ｐ／ＵｍＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａ（配列番号４１）
パッセンジャー鎖： ５’－ｕｓｃｓＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＳ Ｕｓａ（配列番号４７）
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５デュプレックス１０（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０）
Figure 2024503711000036
むき出しのｍｉＲ－１３５デュプレックス１１（下記表６）
ガイド鎖： ５’－Ｐ／ＵｍＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａＡｍｓＡｍ（配列番号４２）
パッセンジャー鎖： ５’－ｕｓｃｓＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＳ Ｕｓａ（配列番号４７）
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５デュプレックス１１（下記表６のｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１）
Figure 2024503711000037
全デュプレックスにおいて、
大文字（例：Ｎ，Ａ，Ｕ，Ｃ，Ｇ）： ＲＮＡ
小文字（例：ａ，ｕ，ｃ，ｇ）： ２’－Ｏ－Ｍｅ修飾
Ｕｍ： ２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅウラシル修飾
Ａｍ： ２’－Ｏ－ＭＯＥアデニン修飾
小文字の‘ｓ’： ホスホロチオエート。修飾無しは正常ホスホジエステル結合を意味する。
Ｐ： リン酸塩
アンダースコア： ２’－フルオロ、即ち、２’－Ｆ
（Ｃ１０）： カルボキシ修飾Ｃ１０
（Glen Research: 10-1935）
鼻腔内投与
２％のイソフルランの吸入によりマウスに弱い麻酔をかけ、仰臥位にした。１日１回、各鼻腔に交互に一滴の５μｌのコンジュゲート対照またはコンジュゲートｍｉＲ－１３５を投与した。１６６μｇを含有する溶液合計１０μｌを送達した。
脳内注射
定位手術および化合物送達のために、コンピューターガイド付き定位装置および電動ナノ注入器を使用した（Ａｎｇｌｅ Ｔｗｏ（商標）定位装置、ｍｙＮｅｕｒｏｌａｂ）。マウスを通常麻酔下で定位器具に載せ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｐａｘｉｎｏｓの脳座標によって定義される座標にレンチウイルス製剤を送達した：ＤＲ：ＭＬ １ｍｍ；ＡＰ －４．５ｍｍ；ＤＶ －４．２ｍｍで傾き２０°。注射を０．２μｌ／１分の速度で行った。
側脳室内の慢性投与
脳注入キット３（ＡＬＺＥＴ）（カリフォルニア州、クパチーノ、ＤＵＲＥＣＴ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、右側脳室に定位的に穿孔した（十字縫合からの座標：後方，－０．７ｍｍ；側方，－１．５ｍｍ；前方，－２．０ｍｍ）。動物の背中の肩甲骨の真後ろに皮下的に移植したミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ ポンプモデル１００７Ｄ）に注入カニューレを繋いだ。浸透圧ポンプは移植前の約８時間にわたり充填し、デュプレックス／対照で満たした（０．５ｎｍｏｌ／日）。移植されると、ポンプは化合物または陰性対照を０．５μｌ／ｈの速度で７日間にわたり連続的に放出した。
脳内微小透析
細胞外５－ＨＴ濃度をｉｎ ｖｉｖｏ微小透析で測定した。まとめると、ペントバルビタールで麻酔したマウスのｍＰＦＣ（ＡＰ，２．２；ＭＬ，－０．２；ＤＶ，－３．４）に１つの同心円状の透析プローブ（ｃｕｐｒｏｐｈａｎ；１ｍｍ長）を移植した。手術から４８～７２時間後に実験を行った。１ｍＭのシタロプラム（ＳＳＲＩ）（コペンハーゲン、バルビュー、Ｌｕｎｄｂｅｃｋ Ａ／Ｓ）を人工脳髄液に添加した。人工脳髄液を６μｌ分－１（ＷＰＩモデル ｓｐ２２０ｉ）で送液し、６分間のサンプルを回収した。８個目の画分を回収しつつ、テールサスペンション試験を実施した。５－ＨＴ濃度の解析を、１．５ｆｍｏｌサンプルを検出限界とした高性能液体クロマトグラフィーのアンペロメトリー検出（Ｈｅｗｌｅｔｔ－Ｐａｃｋａｒｄ １０４９；０．６Ｖ）（米国、カリフォルニア州、パロアルト）で実施した。ベースライン５－ＨＴレベルは、４つの薬物投与前サンプルの平均として計算した。正しいプローブの留置はクレジルバイオレット染色で立証した。
行動評価
各試験の開始２時間前に試験室で飼育し、暗相で全行動評価を実施した。試験を実施する試験官は、マウス群について盲目とした。
暗明移動（Ｄａｒｋ－Ｌｉｇｈｔ Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＤＬＴ）試験： ＤＬＴ試験装置は、塩化ポリビニル製の箱を黒色の暗室（１４×２７×２６ｃｍ）と、そこに繋がった、１２００ルクスで照らした白色の明室（３０×２７×２６ｃｍ）とに分けたものからなる。５分間の試験時間中に、明室で過ごした時間、明るい場所で移動した距離、および明暗移動の回数をビデオトラッキングシステム（ＶｉｄｅｏＭｏｔ２）（ドイツ国、バートホンブルグ、ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で定量した。
テールサスペンション試験： しっぽの先から約１ｃｍのところに付けた接着テープでマウスをベンチの３０ｃｍ上につるした。ビデオカメラシステム（Ｓｍａｒｔ）（Ｐａｎｌａｂ）を用いてマウスをモニタリングして記録し、６分間にわたり、動かずに過ごした時間を記録した。
８－ＯＨ－ＤＰＡＴ誘導低体温症
Ｂ２ｃｍに挿入した潤滑化プローブおよびデジタル体温計（ＡＺ９８８２）（スペイン国、バルセロナ、Ｐａｎｌａｂ）を用いて体温を直腸から測定した。測定の２０分前にはマウスを一匹ずつきれいなケージに入れ、次に２つのベースライン温度を測定した。１０分後に動物はｋｇ当たり１ｍｇの８－ＯＨ－ＤＰＡＴの静脈注射を受け、合計１２０分まで、体温を１５分毎に測定した。データは、平均ベースライン測定値からの変化として表した。
種々のｍｉＲ－１３５模倣体（後記「結果」の項に記載）の効果を試験する実験においては、体温はマイクロチップで測定した。プログラム可能な皮下マイクロチップ応答機（ＩＰＴＴ－３００ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ａｃｃｕｒａｃｙ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）（デラウエア州、シーフォード、Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を製造社の説明書に従ってマウスの皮下に移植した。まとめると、この手順は、マイクロチップを含む大口径針型送達デバイスの迅速な挿入と、送達デバイスからマイクロチップを追い出すデバイス上のプランジャーの押し込みを含む。マイクロチップ応答機による温度測定は、携帯リーダー（カタログ番号ＷＲＳ６００７、モデルＩＰＴＴ－３００、Ｂｉｏ Ｍｅｄｉｃ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で得た。リーダーは、製造社の説明書通り、マウスの背中から５～６ｃｍの距離に持った。ビープ音（１～３秒後）が測定の完了を知らせ、表示された温度を記録した。続けて２回の測定を行うことで複製された温度を得た。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよび受容体オートラジオグラフィー用の組織調製物
マウスを過剰量のペントバルビタールで殺処分とし、迅速に脳を取り出し、ドライアイス上で凍結し、－２０℃で保存した。組織切片（１４ｍｍ厚）をミクロトーム－クリオスタット（ＨＭ５００ＯＭ）（ドイツ国、ウォールドルフ、Ｍｉｃｒｏｍ）で切り出し、３－アミノ－プロピルトリエトキシシラン被覆スライド（スペイン国、マドリッド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）上で解凍しながらマウントし、使用まで－２０℃で保存した。
受容体オートラジオグラフィー
５－ＨＴ１Ａおよび５－ＨＴ１Ｂ受容体並びにセロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）のオートラジオグラフィー結合アッセイをそれぞれ以下の放射性リガンドを用いて実施した：（ａ）［３Ｈ］－８－ＯＨ－ＤＰＡＴ（２３３Ｃｉｍｍｏｌ－１）、（ｂ）［１２５Ｉ］－シアノピンドール（２２００Ｃｉｍｍｏｌ－１）および（ｃ）［３Ｈ］－シタロプラム（７０Ｃｉｍｍｏｌ－１）（スペイン国、バルセロナ、Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅおよびスペイン国、マドリッド、Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）。８－ＯＨ－ＤＰＡＴ、イソプロテレノール、パルギリンおよび５－ＨＴはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製であり、フルオキセチンはＴｏｃｒｉｓ製である。実験条件は下記表５にまとめた。
Figure 2024503711000038
組織をＢｉｏｍａｘ（登録商標）ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）に、３Ｈ－マイクロスケール標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅ）と共に曝露した。群内の全実験および対照脳はそれぞれを２つずつ処理し、フィルムに対してまとめて曝露した。
コンピューター補助画像解析装置（カナダ国、オンタリオ州、セントキャサリンズ、ＡＩＳ，Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、フィルムをミクロデンシトメトリーで解析した。選択した脳領域内の５－ＨＴ１ＡＲ ｍＲＮＡおよび５－ＨＴ１Ｂ結合部位をそれぞれのオートラジオグラムから測定し、相対光学密度を得た。５－ＨＴ１ＡＲおよびＳＥＲＴ結合系は３Ｈ－マイクロスケール標準で校正し、相対光学密度データからｆｍｏｌ ｍｇ－１タンパク質等量を得た。疑似カラー画像を得るためにＡＩＳシステムも用いた。ニコンＤＸＭ１２００ ＦデジタルカメラおよびＡＣＴ－１ニコンソフトウエア（ドイツ国、ミュンスター、Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｍｂｈ）を備えたＷｉｌｄ ４２０顕微鏡（ドイツ国、ヘーアブルーク、Ｌｅｉｃａ）を使用して、白黒の写真をオートラジオグラムから撮影した。画像を、コントラストおよび輝度のそれぞれの値を同一としてＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（マウンテンビュー、Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理した。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）研究
研究はＡｘｏｌａｂｓ（www(dot)axolabs(dot)com）によって実施された。まとめると、ヒトＰＢＭＣを健常者のバフィーコート（ドイツ国、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ズール血液銀行より入手）から単離した。バフィーコートは容量約２８～３２ｍｌ、献血から約１９時間後に無菌状態の密閉輸血用バッグで送達されたものを使用した。ヒトＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）の単離はフィコール密度勾配遠心分離で実施した。
種々の模倣体（後述する「結果」に記載したもの）のトランスフェクションまたは直接インキュベーション（３種の濃度で２４時間）によりｈｕＰＭＢＣを処理した。トランスフェクションはリポフェクタミン２０００を用いて実施した。上清中のサイトカインの存在について、メゾスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プラットフォーム上で実行されたマルチプレックスアッセイ（Ｕ－Ｐｌｅｘ（登録商標））で解析した。全ての手順がＡｘｏｌａｂｓ（www(dot)axolabs(dot)com）によって実施された。
コルチコステロン－慢性拘束ストレスモデル
慢性拘束ストレスプロトコルのために、マウスを隔離し、実験開始の３日前から処理した。２８日間にわたり、１日１回、マウスをゆっくりと、プラスチックトレイに固定された、穴の開いた５０ｍＬのファルコンチューブに入れ、暗く静かな部屋に２時間放置した。対照マウスは隔離されず、それぞれ１日１分しか処理しなかった。
コルチコステロン（Ｃｏｒｔｉｃｏ）（スペイン国、マドリッド、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を市販のミネラルウォーターに溶解し、ＨＣｌでｐＨ７．０～７．４に調整した。慢性拘束ストレスプロトコルの２８日間の間、隔離されたマウスにＣｏｒｔｉｃｏ溶液を与えた：３０μｇ ｍｌ－１を１５日間、次に１５μｇ ｍｌ－１を３日間、および７．５μｇ ｍｌ－１を１０日間。Ｃｏｒｔｉｃｏ溶液は３日以内に使用し、光から保護するために不透明なボトルで保存した。対照マウスにはミネラルウォーターのみを与えた。
慢性社会敗北ストレス
９週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを既報［Krishnan V.et al., Cell (2007) 131:391-404］に記載の慢性社会敗北ストレス（ＣＳＤＳ）プロトコルに付した。まとめると、マウスを攻撃性ＩＣＲ（ＣＤ１）異形交配マウス（Ｈａｒｌａｎ）の飼育ケージに入れて、５分間、肉体的に接触するようにした。この間、ＩＣＲマウスは侵入マウスを攻撃し、侵入者は服従姿勢（ｓｕｂｏｒｄｉｎａｔｅ ｐｏｓｔｕｒｉｎｇ）を取った。多孔性透明Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）製の仕切りを、その後、動物たちの間に設け、感覚的接触が可能な状態でマウスを同じケージに２４時間放置した。この手順を、１０日間にわたり、毎日見慣れないＩＣＲマウスを使用して連続的に繰り返した。対照マウスは社会敗北マウスと同じ部屋で飼育したが、ＩＣＲマウスと接触する５分間は部屋から移動させた。対照マウスは毎日処理し、１ケージに２匹を、透明Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ（登録商標）の仕切りで隔てて飼育した。
免疫組織化学
マウスをペントバルビタールで麻酔し、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を経心的に灌流した。脳を抽出し、その後、４℃のＰＦＡ中で２４時間固定し、ショ糖溶液の１０～３０％密度勾配中に４℃で３日間放置した。冷凍保存後、３０μｍ厚の連続切片を切り出して、前頭前皮質（ＰＦＣ）、新線条体（ＣＰｕ）、海馬（ＨＰＣ）、および背側縫線核（ＤＲＮ）を得た。脳切片を洗浄し、２次抗体ホスト由来の正常血清を含む１×ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ ０．２％溶液でインキュベートした。１次抗体としてＮｅｕＮ（抗ＮｅｕＮ １：１０００；ｒｅｆ：ＭＡＢ３７７，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｉｂａ１（抗Ｉｂａ１ １：１０００；ｒｅｆ：０１９－１９７７４１，Ｗａｋｏ）、およびＴＰＨ（抗ＴＰＨ１ １：２５００；ｒｅｆ：ＡＢ１５４１，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した。まとめると、１次抗体を４℃で一晩インキュベートし、続いて対応する、ＮｅｕＮ用のビオチン化抗マウスＩｇＧ１（１：２００；ｒｅｆ：Ａ－１０５１９、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗Ｉｂａ１用のビオチン化抗ウサギＩｇＧ１（１：２００；ｒｅｆ：ＢＡ－１０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および抗ＴＰＨ１用のビオチン化抗ヒツジＩｇＧ１（１：２００；ｒｅｆ：ＢＡ－６０００，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのインキュベーションを実施した。比色反応は、ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）（ｒｅｆ：１８８６５．０２，Ｑｕｉｍｉｇｅｎ）溶液とのインキュベーションで実施した。切片をマウントし、Ｅｎｔｅｌｌａｎ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に包埋した。ソフトウエア（ｖ１．５１ｓ）（米国、メリーランド州、ベセスダ、ＮＩＨ）を用いて、十字縫合から－４．２４ｍｍから－４．８４ｍｍの種々の前後レベルに対応する切片からＤＲＮ内のＮｅｕＮ陽性細胞、Ｉｂａ１陽性細胞およびＴＰＨ陽性細胞の数を求めた。標識された細胞でその核が計数フレーム内に含まれるものを、３つの連続したＤＲＮ切片について、すべて計数した。
免疫蛍光
マウスをペントバルビタールで麻酔し、リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液を経心的に灌流した。脳を抽出し、その後、４℃のＰＦＡ中で２４時間固定し、ショ糖溶液の１０～３０％密度勾配中に４℃で３日間放置した。冷凍保存後、３０μｍ厚の連続切片を切り出して、嗅球（ＯＢ）、ＣＰｕ，ＨＰＣおよびＤＲＮを得た。脳切片を洗浄し、２次抗体ホスト由来の正常血清を含む１×ＰＢＳ／Ｔｒｉｔｏｎ ０．２％溶液でインキュベートした。１次抗体としてＡｌｅｘａ４８８（抗Ａｌｅｘａ４８８ １：１０００；ｒｅｆ．：Ａ１１０９４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＴＰＨ（抗ＴＰＨ １：１５４１；ｒｅｆ．：ａｂ１５４１，Ａｂｃａｍ）を使用した。まとめると、１次抗体を４℃で一晩インキュベートし、濯ぎ、２次抗体であるＡ５５５抗ヒツジ抗体（１：５００；ｒｅｆ．：Ａ－２１４３６，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｌｅｘａ４８８抗ウサギ抗体（１：５００；ｒｅｆ．：Ａ－２１２０６，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１２０分処理した。核をＨｏｅｃｈｓｔ（１：１０．０００，ｒｅｆ．：Ｈ３５７０，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。
Ａｌｅｘａ４８８－コンジュゲートｍｉＲ－１３５のＴＰＨ＋神経細胞における細胞内局在化を、スピニングディスクユニットＡｎｄｏｒ Ｄｒａｇｏｎｆｌｙ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に取り付けられた倒立ニコンＥｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２－Ｅ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて観察し、画像化した。全ての実験において、油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ Ｌａｍｂｄａ ｂｌｕｅ６０×、開口数（ＮＡ）１．４、油）を使用した。サンプルを４０５ｎｍ、４８８ｎｍおよび５６１ｎｍのレーザーダイオードで励起した。レーザー光は、レーザー光をガウスプロファイルから均一なフラットトップへと再成形するＡｎｄｏｒ Ｂｏｒｅａｌｉｓユニットを通るマルチモードファイバーへカップリングした。そこから４０μｍのピンホールディスクを通した。組織切片は高解像度サイエンティフィック相補型金属酸化膜半導体（ｓＣＭＯＳ）カメラ（Ｚｙｌａ ４．２，２．０ Ａｎｄｏｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）で画像化した。Ｆｕｓｉｏｎソフトウエア（Ａｎｄｏｒ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を取得に使用し、ＩｍａｇｅＪ／Ｆｉｊｉ（１．５１ｓ、オープンソースソフトウエア）を画像処理に用いた。
ウエスタンブロット
ＯＢ、ＰＦＣ、ＣＰｕ、ＨＰＣ、ＤＲＮおよび小脳（Ｃｂ）の組織サンプルを脳切片から切り出し、ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．５％のデオキシコレートナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）中でプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害薬と共にホモジェナイズした。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質を定量した。タンパク質融解物（１０～１５μｇ）を４～１５％のＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロース膜に電気的に移動させた。タンパク質ブロットをＳＥＲＴ（１：１０００、ｒｅｆ．：ａｂ１３０１３０、Ａｂｃａｍ）および５ＨＴ１ＡＲ（１：１０００、ｒｅｆ．：ａｂ８５１６５、Ａｂｃａｍ）に対する１次抗体、およびロード対照となる抗β－アクチン（１：５００００、ｒｅｆ．：Ａ３８５４、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でプローブ化し、続いてＳＥＲＴに対応するＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＩｇＧ（１：２００００、ｒｅｆ．：Ｐ０４４９、Ｄａｋｏ）および５ＨＴ１ＡＲに対応するＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（１：１００００；ｒｅｆ．：ＮＡ９３４、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ）とインキュベートした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）化学発光ＥＣＬ基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた化学発光によって検出し、およびＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて撮影した。画像をＩｍａｇｅＬａｂ（商標）ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ）で解析した。
統計解析
データは平均±標準誤差で表した。データは、必要に応じて、スチューデントのｔ検定、１元または２元配置分散分析で解析し、続いて事後検定（Ｎｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓ）を行った。有意性のレベルはＰ＜０．０５（両側検定）とした。
実施例１
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｍｉＲ－１３５模倣体オリゴの設計、合成および検証
トランスジェニックマウスモデルおよびマウス５ＨＴ神経細胞またはＤＲＮにおけるウイルス操作のそれぞれに見られる、内因性ｍｉＲ－１３５の過剰発現によって示される抗うつ薬効果を模倣するように、ｍｉＲ－１３５模倣体（オリゴ）を設計した。内因性ｍｉＲ－１３５に基づき、安定性および細胞浸透性の改善を目的として、オリゴ（ｍｉＲ－１３５模倣体）に僅かな修飾を加えた。改変オリゴヌクレオチドは、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ（www(dot)biospring(dot)de）というオリゴヌクレオチド製造業者によって、公知の化学に基づき合成され、安定性改善のために各オリゴをデュプレックスとして使用した。１７種の異なる模倣体（表１参照）を設計し、合成し、ルシフェラーゼアッセイを用いて検証対象であるＨｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４標的転写産物に対する効果をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした。ルシフェラーゼアッセイスクリーニングのためにヒト細胞系ＨＥＫ２９３Ｔと、トランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
デュプレックス１１が最も強力なｍｉＲ－１３５模倣体オリゴとして見いだされ、５ＨＴＲ１ＡレベルおよびＳＬＣ６ａ４レベルの両方に有意に影響を与えた（３’ＵＴＲルシフェラーゼ構築物を使用；図３のＡ～Ｂ）。ｍｉＲ－１３５のデュプレックス１１模倣体の設計は次の通りである。
ガイド鎖： ５Ｐｈ／ＵＡＵＧＧＣＵＵＵＵＣＡＵＵＣＣＵＡＵＧＵＧａ（配列番号１０）
パッセンジャー鎖： ｕｃＡＣＡＵＡＧＧＡＡＵＧＡＡＡＡＧＣＣＡＵａ（配列番号１３）
小文字（例：ａ，ｕ，ｃ，ｇ）： ２’－Ｏ－Ｍｅ修飾
Ｐｈ＝リン酸塩、５は、これが配列の５’末端であることを示す。
調製物によらず、標的転写産物（Ｈｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４）を常に減少させると特定された模倣体をｉｎ ｖｉｖｏ実験に更に使用した。
Figure 2024503711000039
Figure 2024503711000040
Figure 2024503711000041
実施例２
ｍｉＲ－１３５模倣体のｉｎ ｖｉｖｏにおけるセロトニン性機能に対する効果
ｍｉＲ－１３５模倣体のｉｎ ｖｉｖｏセロトニン系に対する効果を試験するために、ｍｉＲ－１３５模倣体（デュプレックス１１）を、定位手術を用いて野性型マウスの背側縫線核（ＤＲＮ）に直接送達した。むき出しの（即ち、未コンジュゲートの）模倣体を急性的に（１００μｇ）投与し、５－ＨＴ１Ａ自己受容体（ＨＴＲ１ａ）サイレンシングの生理学的事象を、選択的５－ＨＴ１ＡＲアゴニストである８－ＯＨ－ＤＰＡＴによって誘導される低体温症応答、即ち、マウスにおいて前シナプス５－ＨＴ１ＡＲのみによって仲介される効果、を用いて試験した。ｍｉＲ－１３５模倣体（デュプレックス１１）処置マウスは８－ＯＨ－ＤＰＡＴ誘導性低体温症を示さなかったが、どちらの対照群（人工脳髄液（ａＣＳＦ）で処置したマウスまたは対照ｍｉＲ（即ち、むき出しの対照）で処置したマウス）も予想された低体温応答を提示した（図４のＡ～Ｄ）。ベースライン温度の違いは群間で見られなかった（図４のＥ）。この効果の力学は、急性投与に続く４つの異なる時点（２４、４８、７２および９６時間）で示された（図４のＡ～Ｄ）。
実施例３
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体のセロトニン性機能に対するｉｎ ｖｉｖｏ効果
ｍｉＲ－１３５模倣体の効率に関するｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの検証に続き、セルトラリンコンジュゲートの鼻腔内投与を用いたオリゴヌクレオチドの脳への非侵襲性送達のために既報のアプローチ（Ferres-Coy et al., Mol. Psychiatr. (2016) 21(3): 328-38）を使用した。Ferres-Coy et al.（2016、上記）は、マウスにおいてセルトラリン結合小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の鼻腔内投与がＳＥＲＴ発現／機能のサイレンシングを行ったと既に報告している。透過性の嗅上皮を通過した後、セルトラリンコンジュゲートｓｉＲＮＡは吸収され、深部のＲａｂ－７－関連内膜小胞体によってセロトニン細胞体に輸送された。
修飾ｍｉＲ－１３５模倣体および対照オリゴを非機能性セルトラリン（スペイン国、バルセロナ、ＮＥＤＫＥＮ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ，Ｓ．Ｌ．より購入）にコンジュゲートし、ナイーブマウスの背側縫線核（ＤＲＮ）に急性的に投与した。１００μｇの用量のセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体デュプレックス１１（ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１と命名、配列番号１０および１３に示す）で処置されたマウスは、８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与に続いて低体温症応答を示さなかった。この効果は急性投与から７日まで持続した（図５のＡ～Ｄ）。
実施例４
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（３０μｇ）の急性脳内投与による、５ＨＴ１ａおよびＳＥＲＴのサイレンシングと抗うつ剤様応答の発生
ｍｉＲ－１３５によって直接制御されることが既に示されているセロトニン系の遺伝子発現の下方制御におけるセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５の効率についてさらに探求するために、より低用量のｍｉＣｕｒｅ－１３５－１（３０μｇ）を成体マウスのＤＲＮに急性的に投与した。初めに、高用量（１００μｇ）で実施したのと同様に、５－ＨＴ１Ａ自己受容体（ＨＴＲ１ａ）のサイレンシングに伴う生理学的事象を８－ＯＨ－ＤＰＡＴによって誘導される低体温症応答を用いて検討した。結果は、用量３０μｇのｍｉＣｕｒｅ－１３５－１の単回投与では治療から７日まではベースライン温度を変えることなく、選択的ＨＴＲ１ａアゴニストによる低体温症誘導を排除するのに十分であることを示した（図６のＡ～Ｅ）。
次に、リアルタイムのＣＳＦの回収を可能にする微小透析プローブをマウスの内側前頭前野（ｍＰＦＣ）に固定し、続いて液体クロマトグラフィーを用いて５－ＨＴレベルを測定した。マウスを１匹ずつケージに入れ、各６分の１５個の画分を回収した。８番目の画分はテールサスペンション試験（マウスのうつ病様行動を評価するための試験）中に回収した。結果は、対照群と比べてｍｉＣｕｒｅ－１３５－１で処置したマウスが不動性時間の有意な減少を示すこと（図６のＧ）を明らかにし、これはセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５の抗抑うつ剤様効果を示している。注目すべきは、行動的結果と一致するように、処置マウスのｍＰＦＣ ５－ＨＴレベルは有意に高く（図６のＦ）、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５処置マウスのより良い適応機構を示唆した。次に本発明者は、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５によるＳＥＲＴ遺伝子のサイレンシングが可能か否かを評価した。投与から１～４日後の組織学的試験は、注射後２４時間および９６時間に背側縫線のＳＥＲＴ結合密度が有意に減少している（対照の７５％；図６のＨ）ことを明らかにした。
実施例５
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（１６６μｇ）の急性鼻腔内投与による、５ＨＴ１ａのサイレンシングと抗うつ／抗不安様応答の発生
非侵襲性送達法の後にｍｉＣｕｒｅ－１３５－１が抗うつ薬として機能する能力を鼻腔内送達によって試験し、ここで麻酔されたマウスは、５μｌのｍｉＣｕｒｅ－１３５－１を各鼻腔から合計１６６μｇ投与された。８－ＯＨ－ＤＰＡＴ誘導低体温症を処置から５日間にわたり検査し、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１処置マウス群が、ＨＴＲ１ａサイレンシングの生理学的事象である科学的に低い低体温応答を示すことが明らかになった（図７のＡ）。さらには、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１処置マウスのテールサスペンション試験における対照と比べて減少した不動性時間によって、抗抑うつ剤様効果が示され（図７のＢ）、暗／明移動試験において処置マウスが対照と比べてより多くの時間を明るいコンパートメントで過ごしたことによって、抗不安効果が示された（図７のＣ）。
実施例６
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける１６の高度化学修飾ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴの設計、合成および検証
上述したように、内因性ｍｉＲ－１３５に基づき、追加のｍｉＲ－１３５模倣体（オリゴ）を設計したが（上記表１を参照）、これらは効力を低下させることなく、安定性を改善し、生来の免疫毒性を減少することを目的とした高度化学修飾を有していた。
１６種の異なる模倣体（図８および下記表６参照）を設計し、（上記「一般材料と実験手順」に記載のように）公知の化学を用いて合成し、安定性を改善するためにそれぞれのオリゴをデュプレックスとして使用した。１６の異なるｍｉＲ－１３５模倣体のルシフェラーゼアッセイを用いて検証対象であるＨｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４標的転写産物に対する効果をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングした。ルシフェラーゼアッセイスクリーニングのためにヒト細胞系ＨＥＫ２９３Ｔと、トランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－９、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１が最も強力なｍｉＲ－１３５模倣体オリゴであり、５ＨＴＲ１ＡレベルおよびＳＬＣ６ａ４レベルの両方に有意な影響を与えた（３’ＵＴＲルシフェラーゼ構築物を使用；図９Ａ～図９Ｂ）。
調製物によらず、標的転写産物（Ｈｔｒ１ａおよびＳｌｃ６ａ４）を常に減少させると特定された模倣体を追加の実験に更に使用した。
Figure 2024503711000042
実施例7
ｍｉＲ－１３５オリゴの高度化学修飾による、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＢＭＣによるサイトカイン分泌パターンの変化
生体が自己と認識しないオリゴヌクレオチドは、典型的には、炎症促進性サイトカインの放出を通じて免疫応答を誘導する。オリゴヌクレオチドの化学修飾は、能力を増加し、生来の免疫活性を減少させる潜在的能力を発揮させることを目的とする。新規修飾による免疫活性化誘導パターンを試験するために、健常者のボランティアの新鮮なバフィーコート（上記「一般材料と実験手順」に記載のように、輸血センターより入手）から出発して、フィコール密度勾配遠心分離でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＭＢＣを種々の模倣体で２４時間処理し、上清中のサイトカインの存在について、メゾスケールディスカバリー（ＭＳＤ）上で実行されたマルチプレックスアッセイで解析した。
このアッセイの結果は、２つの新規デュプレックスであるｍｉＣｕｒｅ－１３５－２およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－３は、試験したサイトカイン（それぞれ図１０Ａ～図１０Ｅおよび図１１Ａ～図１１Ｆ）の分泌を誘導しないことを明示し、ｍｉＲ－１３５－１はＴＮＦ－アルファ（図１０Ａ）およびＩＦＮ－アルファ－２ａ（図１０Ｂ）の中庸な活性化を示し、ｍｉＲ－１３５－９はＩＦＮ－アルファ－２ａの高分泌（図１１Ａ）およびＴＮＦ－アルファの低分泌（図１１Ｂ）を誘導し、ｍｉＲ－１３５－１１はＩＦＮ－アルファ－２ａの高分泌（図１１Ａ）およびＴＮＦ－アルファ（図１１Ｂ）とＩＦＮ－ガンマ（図１１Ｃ）の低分泌を誘導した。ＭｉＣｕｒｅ－１３５－１０の結果はＴＮＦ－アルファおよびＩＦＮ－アルファ－２ａ（それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂ）の非常に高い分泌を明らかにした。最も低レベルの分泌を誘導すると同定されたデュプレックス（即ち、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）を更にｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－９、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－１０およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－１１による比較的高いサイトカイン分泌誘導は、これらに共通の、５’末端と３’末端の１つにある正常なホスホジエステルを置換する２つのホスホロチオエート結合からなるパッセンジャー鎖に関連する可能性があり、これについても試験した。
実施例８
急性ＤＲＮ投与したセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体による、セロトニン性機能への影響および抗うつ剤様応答の発生
ｍｉＲ－１３５模倣体のｉｎ ｖｉｖｏセロトニン系に対する効果を更に試験するために、非機能性セルトラリンにコンジュゲートした３種のｍｉＲ－１３５模倣体、即ち、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２（配列番号４１および１３に示す）、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（配列番号４２および１３に示す）およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９（配列番号１０および４７に示す）を、定位手術を用いて背側縫線核（ＤＲＮ）に直接送達した。
ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９を急性的に（３０μｇ）投与し、５－ＨＴ１Ａ自己受容体（ＨＴＲ１ａ）サイレンシングの生理学的結果について、選択的５－ＨＴ１ＡＲアゴニストである８－ＯＨ－ＤＰＡＴによって誘導される低体温症応答、即ち、マウスにおいて前シナプス５－ＨＴ１ＡＲのみによって仲介される効果、を用いて試験した。図１２のＡ～Ｄに図示されるように、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５処置マウス（ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２およびｍｉＣｕｒｅ－１３５－９の両方の模倣体）は低体温症を示さなかったが、いずれの対照群、即ち、人工脳髄液（ａＣＳＦ）で処置したマウスまたは対照ｍｉＲで処置したマウスも、予想された低体温応答を提示した。ベースライン温度の違いは群間で見られなかった（図１２のＥ）。この効果の力学は、急性投与に続く３つの異なる時点で示された。
次に、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３およびセルトラリンコンジュゲート対照をマウスＤＲＮに急性的に（１００μｇ）投与し、セロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）サイレンシングの機能的事象を検討した。そのために、リアルタイムのＣＳＦの回収を可能にする微小透析プローブをマウスの内側前頭前野（ｍＰＦＣ）に固定し、続いて液体クロマトグラフィーを用いて５－ＨＴレベルを測定した。マウスを１匹ずつケージに入れ、各２０分の１２個の画分を回収した。７番目の画分から局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（１０μＭのシタロプラム）を逆透析によって浸潤させたところ、細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加がもたらされた。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置マウスにおける５－ＨＴレベルの増加は対照群のレベルと比べて有意に低く（図１２のＦ）、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３が利用可能なセロトニントランスポーターの減少をもたらすことを示唆した。同じ実験群、即ち、ＤＲＮに１００μｇのｍｉＣｕｒｅ－１３５－３またはコンジュゲート対照を１回注射したマウスを、テールサスペンション試験で試験した。結果は、対照群と比べてｍｉＣｕｒｅ－１３５－３で処置したマウスは不動性時間の有意な減少を示すこと（図１２のＧ）を明らかにし、これはセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（例：ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）の抗抑うつ剤様効果を示している。
実施例９
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体の鼻腔内および脳室内投与による、５ＨＴ１ａおよびＳＥＲＴのサイレンシング
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体が、臨床的に認められた薬物投与法で抗うつ薬として機能する潜在的能力を、非侵襲性の投与方法（即ち、鼻腔内）を用いて示した。マウスを急性的にｍｉＣｕｒｅ－１３５－３で処置し、８－ＯＨ－ＤＰＡＴ投与の４８時間後に誘導される低体温症を検討した。２００μｇ（図１３のＣ）および１００μｇ（図１３のＢ）のｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の投与は、対照処置マウスと比べて、処置マウスの低体温症を有意に減少させた。５０μｇのｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の急性鼻腔内投与は、低体温症応答の減少について明らかな傾向（ｐ＝０．０５４）を示した（図１３のＡ）。同様の応答が、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－２（２００μｇ／日）の鼻腔内投与から７日後にも見られた（図１３のＤ）．
脳室内（ＩＣＶ）送達方法は髄腔内投与のモデルとなることを目的としており、いずれにおいても薬剤はＣＳＦに直接投与される。この実験では、マウス脳室内に留置されたカニューレに皮下浸透圧ミニポンプを繋げた。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３を２００μｇ／日の速度で第二脳室に７日間にわたり絶えず送達した。対照と比べてより少ない体温減少がｍｉＣｕｒｅ－１３５－２処置群に見られた（図１３のＥ）。総合すると、低体温症の結果（図１３のＡ～Ｅ）は、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体がセロトニン性自己受容体（５ＨＴ１ａ）の減少に成功したことを示唆している。
次に、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体のセロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）レベルに対する影響を調査するために、リアルタイムのＣＳＦの回収を可能にする微小透析プローブをマウスの内側前頭前野（ｍＰＦＣ）に固定し、続いて液体クロマトグラフィーを用いて５－ＨＴレベルを測定した。マウスを１匹ずつケージに入れ、各２０分の１８個の画分を回収した。７番目の画分から局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（１０μＭのシタロプラム）を逆透析によって浸潤させたところ、細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加がもたらされた。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置群における５－ＨＴレベルの増加は、対照群のレベルと比べて有意に低く（図１３のＦ）、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（例：ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）の鼻腔内投与が背側縫線核のセロトニントランスポーターの減少をもたらすことを示唆した。
実施例１０
ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の急性鼻腔内投与による、セロトニン機能に対する影響および抗うつ剤様応答の発生
非侵襲的に投与されたセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体のセロトニン機能に対する効果をさらに探索するために、野性型マウスに鼻腔内経路を用いてｍｉＣｕｒｅ－１３５－３を送達した。セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５がＳＥＲＴおよび５－ＨＴ１Ａ自己受容体（ＨＴＲ１ＡＲ）のタンパク質レベルを減少させることができるかを評価するために、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３で急性的にマウスを処置したところ、投与から３日後に採取したサンプルの免疫ブロット解析は、注射後７２時間の背側縫線においてＳＥＲＴおよびＨＴＲ１Ａｒのタンパク質レベルが有意に減少した（どちらのタンパク質も対照の７５％；図１４のＡ～Ｄ）ことを明らかにした。
次に、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体のセロトニントランスポーター（ＳＥＲＴ）レベルに対する効果を調査するために、リアルタイムのＣＳＦの回収を可能にする微小透析プローブをマウスの内側前頭前野（ｍＰＦＣ）に固定し、続いて液体クロマトグラフィーを用いて５－ＨＴレベルを測定した。投与から４８時間後に、マウスを１匹ずつケージに入れ、各２０分の１２個の画分を回収した。７番目の画分から局所選択的セロトニン再取り込み阻害薬（１０μＭのシタロプラム）を逆透析によって浸潤させたところ、細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加がもたらされた。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置群における５－ＨＴレベルの増加は、対照群のレベルと比べて有意に低く（図１４のＦ）、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（例：ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）の鼻腔内投与が背側縫線核のセロトニントランスポーターの減少をもたらすことを示唆した。
ｍＰＦＣに固定したのと同じプローブを使用し、ＨＴＲ１ＡＲレベルに対するｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の急性鼻腔内投与の効果の調査を目的とした追加の微小透析実験に同じ群のマウスを付した。液体クロマトグラフィーを用いて５－ＨＴレベルを測定するために、投与の７２時間後にリアルタイムのＣＳＦを回収した。マウスを１匹ずつケージに入れ、各２０分の１２個の画分を回収した。６番目の画分においては、選択的ＨＴＲ１ａアゴニスト（８－ＯＨ－ＤＰＡＴ、１ｍｇ ｋｇ－１，ｉ．ｐ．）の腹腔内注射は、細胞外５－ヒドロキシトリプタミン（５－ＨＴ）の増加をもたらした。ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置群における５－ＨＴレベルの減少は、対照群のレベルと比べて有意に短く（図１４のＥ）、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（例：ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）の鼻腔内投与による背側縫線核の５－ＨＴ１Ａ自己受容体の減少を示唆した。同じ実験群、即ち、２５００μｇのｍｉＣｕｒｅ－１３５－３またはコンジュゲート対照の鼻腔内投与を１回受けたマウス、をテールサスペンション試験で試験した。結果は、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３で処置したマウスは対照群と比べて不動性時間の有意な減少を示し（図１４のＧ）、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体（例：ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３）の抗抑うつ剤様効果を表している。
実施例１１
うつ病様誘導プロトコルに付したマウスにおける、セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体の急性鼻腔内投与による抑うつ様行動の減少
セルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体が抗うつ剤として働く潜在的能力をうつ病様マウスモデルで示した。飲料水中のコルチコステロンでマウスを処置し、２８日間にわたり、毎日２時間、拘束ストレス下に置いた。パラダイムに付したマウスは、うつ病様行動の増加を示した。プロトコルに続き、マウスを１用量のｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２５００μｇ）で処置した。抗抑うつ剤様効果は、処置から３日後のｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置マウスのテールサスペンション試験における、対照と比べて減少した不動性時間によって示された（図１５）。
実施例１２
鼻腔内投与に続く、ｍｉＲ－１３５模倣体の背側縫線核における選択的蓄積
鼻腔内投与に続くｍｉＲ－１３５模倣体の脳内分布を検討するために、ａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３を合成した。標識分子は鼻腔内投与によってマウスに送達し、投与から６時間後に脳組織を回収した。共焦点蛍光顕微鏡は、鼻腔内投与後にＴＰＨ２陽性中脳５－ＨＴ神経細胞の細胞内からａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３が検出されることを明らかにした（図１６のＡ～Ｃ）。共焦点解析は、投与部位（嗅球）または脳室（海馬および線条体）の近傍の脳領域の細胞にａｌｅｘａ４８８標識ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３が不存在であることを示し（図１６のＤ）、表面ＳＥＲＴ発現がオリゴヌクレオチドの取り込みおよび内部移行に必須であり、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３がＤＲＮに選択的に蓄積されることを支持した。
実施例１３
ｍｉＲ－１３５模倣体は脳内の細胞生存率に影響しない
更にｍｉＲ－１３５模倣体の安全性について試験するために、コンジュゲート対照、ｍｉＣｕｒｅ－１３５－３、または細胞生存率に影響しないという既報のある陽性対照（Ferres-Coy et al., Mol. Psychiatr. (2016) 21(3): 328-38に教示の、ＳＥＲＴに対するコンジュゲートしたセルトラリン－ｓｉＲＮＡ）の単回直接注射をマウスの背側縫線核に直接行った。中脳縫線核の切片を、神経細胞性（ＮｅｕＮ陽性）、セロトニン性神経細胞性（ＴＰＨ陽性）またはマイクログリア性（Ｉｂａ－１陽性）のマーカーで染色した。免疫組織化学解析はｍｉＣｕｒｅ－１３５－３が神経細胞変性（図１７のＡ）、セロトニン性神経細胞変性（図１７のＣ）または免疫応答（図１７のＢ）を誘導しないことを示した。これらは、種々の治療下でＮｅｕＮ、Ｉｂａ１およびＴＰＨで染色した中脳縫線核の代表的画像からも見られる（図１７のＤ）。これらデータはｍｉＣｕｒｅ－１３５－３の特異性および安全性を支持する。
実施例１４
慢性社会敗北ストレスのうつ病様プロトコルにおけるセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５の急性鼻腔内投与による効果の評価
抗うつ剤としてのセルトラリンコンジュゲートｍｉＲ－１３５模倣体の効果は、攻撃性ＩＣＲマウスを用いた慢性社会的敗北ストレスプロトコルを用いて示された［Krishnan V. et al., Cell (2007) 131:391-404の既報］。このパラダイム提示に付されたマウスはうつ病様行動が増加した。マウスを１用量のｍｉＣｕｒｅ－１３５－３（２５００μｇ）で処置し、処置から２日および３日後にテールサスペンション試験の不動性時間を測定し、対照とｍｉＣｕｒｅ－１３５－３処置マウスを比較することで、抗抑うつ剤様効果を試験した。
本発明をその特定の実施形態との関連で説明したが、多数の代替、修正および変種が当業者には明らかであろう。従って、そのような代替、修正および変種の全ては、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれることを意図するものである。
本明細書で言及した全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許および特許出願のそれぞれについて具体的且つ個別に本明細書に援用する場合と同程度に、それらの全体を本明細書の一部を構成するものとして援用することを出願人は意図する。加えて、本願における如何なる参考文献の引用または特定は、このような参考文献が本発明の先行技術として使用できることの容認として解釈されるべきではない。また、各節の表題が使用される範囲において、必ずしも限定として解釈されるべきではない。更に、本出願の優先権書類は、その全体が本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
配列番号１： ｉｎ ｖｉｔｒｏのｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号２： ｉｎ ｖｉｔｒｏのｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；２２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号３：ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；２２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号４： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号５： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１０位～１１位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号６： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；１０位は２－ＯＭｅ修飾；２２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号７： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；４位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号８： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；４位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号９： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１０： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１１： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；２２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１２： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１３： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；１位は５’末端でセルトラリンまたは他の細胞標的化部分にコンジュゲート可能；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１４： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１１位～１３位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１５： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；９位～１０位は２－ＯＭｅ修飾；２２位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１６： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位～２位は２－ＯＭｅ修飾；４位は２－ＯＭｅ修飾；２３位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号１７： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１８： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１９： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２０： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２１： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２２： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２３： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２５： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２６： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２７： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２８： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２９： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３０： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３１： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３２： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３３： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３４： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３５： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３６： 一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７： 成熟ｍｉＲ－１３５ｂ
配列番号３８： 成熟ｍｉＲ－１３５ｂ＊
配列番号３９： ｍｉＲ－１３５ｂマイクロＲＮＡ前駆体
配列番号４０： ｍｉＲ－１３５ｂに相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４１： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；２４位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号４２： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；２４位は２－ＯＭｅ修飾；２５位～２６位は２－ＯＭｅ修飾；２５位～２６位はホスホロチオエート結合
配列番号４３： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；２位は２’－フルオロ；２位は２’－フルオロ；３位は２’－Ｏ－Ｍｅ；４位は２’－フルオロ；５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；６位は２’－フルオロ；７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；８位は２’－フルオロ；９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１０位は２’－フルオロ；１１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１２位は２’－フルオロ；１３位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１４位は２’－フルオロ；１５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１６位は２’－フルオロ；１７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１８位は２’－フルオロ；１９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２０位は２’－フルオロ；２１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２２位は２’－フルオロ；２３位～２４位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２５位～２６位は２－ＯＭｅ修飾；２５位～２６位はホスホロチオエート結合
配列番号４４： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；１位～３位はホスホロチオエート結合；２位は２’－フルオロ；２位は２’－フルオロ；３位は２’－Ｏ－Ｍｅ；４位は２’－フルオロ；４位～５位はホスホロチオエート結合；５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；６位は２’－フルオロ；６位～７位はホスホロチオエート結合；７位～７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；８位は２’－フルオロ；８位～９位はホスホロチオエート結合；９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１０位は２’－フルオロ；１０位～１１位はホスホロチオエート結合；１１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１２位は２’－フルオロ；１２位～１３位はホスホロチオエート結合；１３位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１４位は２’－フルオロ；１４位～２６位はホスホロチオエート結合；１５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１６位は２’－フルオロ；１７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１８位は２’－フルオロ；１９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２０位は２’－フルオロ；２１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２２位は２’－フルオロ；２３位～２４位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２５位～２６位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号４５： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；１位～３位はホスホロチオエート結合；２位は２’－フルオロ；４位～５位はホスホロチオエート結合；６位～７位はホスホロチオエート結合；８位～９位はホスホロチオエート結合；１０位～１１位はホスホロチオエート結合；１０位は２’－フルオロ；１１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１２位～１３位はホスホロチオエート結合；１４位～２６位はホスホロチオエート結合；１５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１６位は２’－フルオロ；１７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１８位は２’－フルオロ；１９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２０位は２’－フルオロ；２１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２２位は２’－フルオロ；２３位～２４位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２５位～２６位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号４６： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位は５’リン酸化；１位は２－Ｏ－ＭＯＥ－５－Ｍｅ；１位～２位はホスホロチオエート結合；２位は２’－フルオロ；１０位～１１位はホスホロチオエート結合；１０位は２’－フルオロ；１１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１５位～２６位はホスホロチオエート結合；１５位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１６位は２’－フルオロ；１７位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１８位は２’－フルオロ；１９位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２０位は２’－フルオロ；２１位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２２位は２’－フルオロ；２３位～２４位は２’－Ｏ－Ｍｅ；２５位～２６位は２－ＯＭｅ修飾
配列番号４７： ｍｉＲ－１３５模倣体オリゴ；１位～２位は２’－Ｏ－Ｍｅ；１位は５’末端でセルトラリンまたは他の細胞標的化部分にコンジュゲート可能；１位～２位はホスホロチオエート結合；２２位～２３位はホスホロチオエート結合；２３位は２’－Ｏ－Ｍｅ

Claims (53)

  1. 配列番号３７に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す相補鎖を含む合成ｍｉＲ－１３５分子を含む、組成物。
  2. 前記ｍｉＲ－１３５分子が５０個以下の核酸を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 配列番号３７に示す前記ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す前記相補鎖が、二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子内に存在する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 配列番号３７に示す前記ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列および配列番号４０に示す前記相補鎖が、ヘアピンループ構造を形成する、請求項１または２に記載の組成物。
  5. 配列番号３７に示す前記ｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列と配列番号４０に示す前記相補鎖とが、配列番号３７および配列番号４０のそれぞれの全長にわたって相補性１００％である、請求項１または２に記載の組成物。
  6. 前記ｍｉＲ－１３５ｂおよび／または前記相補鎖の前記核酸配列が、糖修飾、核酸塩基修飾およびヌクレオチド間結合修飾からなる群より選ばれる１以上の修飾を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記糖修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ロック核酸（ＬＮＡ）および２’－フルオロアラビノオリゴヌクレオチド（ＦＡＮＡ）からなる群より選ばれる、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記ｍｉＲ－１３５ｂ内の前記糖修飾が、前記核酸配列の３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドに存在する、請求項６または７に記載の組成物。
  9. 前記ｍｉＲ－１３５ｂ内の前記糖修飾が、前記核酸配列の５’末端の少なくとも１つのヌクレオチドに存在する、請求項６～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記相補鎖内の前記糖修飾が、前記核酸配列の３’末端の最後のヌクレオチドの修飾を含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記相補鎖内の前記糖修飾が、前記核酸配列の５’末端の最初の２つのヌクレオチドの修飾を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記糖修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、および／または２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記糖修飾が、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）および５’リボースのメチル化（２’－Ｏ－ＭＯＥ－５’－Ｍｅ）である、請求項６～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記ヌクレオチド間結合の修飾が、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、ホスホジエステル、ホスホノ酢酸（ＰＡＣＥ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）からなる群より選ばれる、請求項６～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記ｍｉＲ－１３５ｂ中の前記ヌクレオチド間結合の修飾が、前記核酸配列の５’末端の最後のヌクレオチドに存在する、請求項６～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ヌクレオチド間結合の修飾が、リン酸塩またはホスホロチオエートを含む、請求項６～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ホスホロチオエート修飾が、前記ｍｉＲ－１３５ｂまたは前記相補鎖の前記核酸配列の３’末端の最後の２つのヌクレオチドの間に存在する、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記ホスホロチオエート修飾が、前記ｍｉＲ－１３５ｂまたは前記相補鎖の前記核酸配列の５’末端最後の２つのヌクレオチドの間に存在する、請求項１６または１７に記載の組成物。
  19. 前記修飾を含む前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が、配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものである、請求項６～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記修飾を含む前記相補鎖の前記核酸配列が、配列番号１３または４７のいずれか一に示すものである、請求項６～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すｍｉＲ－１３５ｂの核酸配列を含む合成ｍｉＲ－１３５分子、および配列番号１３または４７のいずれか一に示す相補鎖を含む、組成物。
  22. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号１０に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３に示すものである、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号４１に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３に示すものである、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号４２に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３に示すものである、請求項２１に記載の組成物。
  25. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号１０に示すものであり、前記相補鎖が配列番号４７に示すものである、請求項２１に記載の組成物。
  26. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、それぞれが二本鎖合成ｍｉＲ－１３５分子を形成する別個の核酸配列分子に存在する、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、これらはヘアピン構造を形成する、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列が配列番号１０、１６または４１～４６のいずれか一に示すものであり、前記相補鎖が配列番号１３または４７のいずれか一に示すものであり、相補性が１００％である、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 合成ｍｉＲ－１３５分子の核酸構築物を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. （ｉ）合成ｍｉＲ－１３５分子を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物と、
    （ｉｉ）細胞標的化部分と
    を含む、コンジュゲート。
  31. 前記細胞標的化部分が前記相補鎖の前記核酸配列の５’末端にコンジュゲートしている、請求項３０に記載のコンジュゲート。
  32. 前記細胞標的化部分が前記ｍｉＲ－１３５ｂの前記核酸配列の５’末端にコンジュゲートしている、請求項３０に記載のコンジュゲート。
  33. 前記合成ｍｉＲ－１３５分子と前記細胞標的化部分とが連結基によって連結されている、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  34. 前記細胞標的化部分が、脳細胞上に発現または提示された分子に特異的に結合する、請求項３０～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  35. 前記細胞標的化部分が、神経伝達物質輸送体に特異的に結合する、請求項３０～３４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  36. 前記細胞標的化部分が、セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＲＩ）、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン－ノルエピネフリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）、ノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗鬱剤（ＮＡＳＳＡ）、ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＮＲＩ）、ドーパミン再取り込み阻害薬（ＤＲＩ）、内在性カンナビノイド再取り込み阻害薬（ｅＣＢＲＩ）、アデノシン再取り込み阻害薬（ＡｄｏＲＩ）、興奮性アミノ酸再取り込み阻害薬（ＥＡＡＲＩ）、グルタミン酸塩再取り込み阻害薬（ＧｌｕＲＩ）、ＧＡＢＡ再取り込み阻害薬（ＧＲＩ）、グリシン再取り込み阻害薬（ＧｌｙＲＩ）およびノルエピウネフリン－ドーパミン再取り込み阻害薬（ＮＤＲＩ）からなる群より選ばれる、請求項３５に記載のコンジュゲート。
  37. 前記選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）が、セルトラリン、セルトラリン－構造類似体、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、インダルピン、ジメリジン、シタロプラム、ダポキセチン、エスシタロプラム、およびそれらの混合物からなる群より選ばれる、請求項３６に記載のコンジュゲート。
  38. 前記細胞標的化部分がセルトラリンのとき、前記コンジュゲートが下記構造を有する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
    Figure 2024503711000043
  39. 前記細胞標的化部分がセルトラリンのとき、前記コンジュゲートが下記構造を有する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
    Figure 2024503711000044
  40. 前記細胞標的化部分がセルトラリンのとき、前記コンジュゲートが下記構造を有する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
    Figure 2024503711000045
  41. 前記細胞標的化部分がセルトラリンのとき、前記コンジュゲートが下記構造を有する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
    Figure 2024503711000046
  42. 前記細胞標的化部分が、腫瘍関連抗原、あるいは骨細胞、筋肉細胞または胃腸細胞上に発現または提示された分子と特異的に結合する、請求項３０～３３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  43. 細胞膜透過部分または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送用の部分の少なくとも１種をさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～４２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  44. 前記細胞膜透過部分または前記ＢＢＢを通過する輸送用の部分と、前記合成ｍｉＲ－１３５分子との間にリンカーをさらに含む、請求項４３に記載の組成物またはコンジュゲート。
  45. 請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  46. 治療を必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）関連病態を治療するための方法であって、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～４１または４３～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項４５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することで、ＣＮＳ関連病態を治療することを含む、方法。
  47. 治療を必要とする対象のうつ病関連障害を治療するための方法であって、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～４１または４３～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項４５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することで、うつ病関連障害を治療することを含む、方法。
  48. 治療を必要とする対象のがん性疾患を治療するための方法であって、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～３４または４２～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項４５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することで、がん性疾患を治療することを含む、方法。
  49. 治療を必要とする対象の骨再生または筋肉細胞分化を促進するための方法であって、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、請求項３０～３３または４２～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項４５に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与することで、骨再生または筋肉細胞分化を促進することを含む、方法。
  50. 治療を必要とする対象のＣＮＳ関連病態の治療用である、治療有効量の、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～４１または４３～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  51. 治療を必要とする対象のうつ病関連障害の治療用である、治療有効量の、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～４１または４３～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  52. 治療を必要とする対象のがん性疾患の治療用である、治療有効量の、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～３４または４２～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  53. 治療を必要とする対象の骨関連疾患または病態あるいは筋肉関連疾患または病態の治療用である、治療有効量の、請求項１～２９または４３～４４のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３０～３３または４２～４４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
JP2023543102A 2021-01-18 2022-01-18 修飾ｍｉＲ－１３５、そのコンジュゲートおよびその使用 Pending JP2024503711A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163138555P 2021-01-18 2021-01-18
US63/138,555 2021-01-18
US202163272329P 2021-10-27 2021-10-27
US63/272,329 2021-10-27
PCT/IL2022/050075 WO2022153322A1 (en) 2021-01-18 2022-01-18 Modified mir-135, conjugated form thereof, and uses of same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2024503711A true JP2024503711A (ja) 2024-01-26

Family

ID=82448023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023543102A Pending JP2024503711A (ja) 2021-01-18 2022-01-18 修飾ｍｉＲ－１３５、そのコンジュゲートおよびその使用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240026357A1 (ja)
EP (1) EP4277635A1 (ja)
JP (1) JP2024503711A (ja)
CA (1) CA3204415A1 (ja)
IL (1) IL304504A (ja)
WO (1) WO2022153322A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017506228A (ja) 2014-02-05 2017-03-02 イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドＹｅｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ． セロトニン放出ホルモン、アドレナリン放出ホルモン、ノルアドレナリン放出ホルモン、グルタミン酸放出ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのマイクロｒｎａおよび該マイクロｒｎａを含む組成物
CN114469996B (zh) * 2021-12-23 2023-10-20 中国医学科学院医学生物学研究所 一种包含miR-135b-5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2010006925A (es) * 2007-12-20 2011-05-02 Angiochem Inc Conjugados de polipeptido-acido nucleico y sus usos.
KR20130103662A (ko) * 2010-04-19 2013-09-24 엔라이프 떼라퓨틱스, 에스.엘. 올리고뉴클레오티드 분자들의 특정 뉴런 유형들로의 선택적인 전달을 위한 조성물들 및 방법
JP2017506228A (ja) * 2014-02-05 2017-03-02 イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッドＹｅｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ． セロトニン放出ホルモン、アドレナリン放出ホルモン、ノルアドレナリン放出ホルモン、グルタミン酸放出ホルモンおよび副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン関連の医学的状態の処置および診断のためのマイクロｒｎａおよび該マイクロｒｎａを含む組成物

Also Published As

Publication number Publication date
CA3204415A1 (en) 2022-07-21
IL304504A (en) 2023-09-01
US20240026357A1 (en) 2024-01-25
WO2022153322A1 (en) 2022-07-21
EP4277635A1 (en) 2023-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6741673B2 (ja) 抗ｔｎｆ化合物
AU2020202533A1 (en) Compositions and methods for selective delivery of oligonucleotide molecules to specific neuron types
KR102617833B1 (ko) 인터류킨 17 수용체 mRNA의 특이적 녹다운을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)를 제시하는 리포좀성 구형 핵산 (SNA) 구축물
AU2017310146B2 (en) Peptide nucleic acid complex having improved cell permeability and pharmaceutical composition comprising same
ES2586593T3 (es) Liposomas de retinoide para potenciar la modulación de la expresión de hsp47
US20240026357A1 (en) Modified mir-135, conjugated form thereof, and uses of same
KR101708385B1 (ko) 골수 섬유증 치료제
US10590423B2 (en) Treatment of age-related macular degeneration using RNA complexes that target MyD88 or TLR3
US20180282728A1 (en) Organic compositions to treat beta-catenin-related diseases
KR20170136542A (ko) C/EBP 알파 saRNA 조성물 및 사용 방법
Scaggiante et al. Aptamers as targeting delivery devices or anti-cancer drugs for fighting tumors
WO2019048632A1 (en) STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATORY RNA (PARNA) OF HNF4A AND METHODS OF USE
US20120288536A1 (en) Stabilized Stat3 Decoy Oligonucleotides And Uses Therefor
US20230357771A1 (en) P21 mrna target areas for silencing
JP2024502432A (ja) がん治療のための鋳型指向性免疫調節
WO2020218494A1 (ja) ｍｉＲ３０２核酸改変体
CN117440816A (zh) 修饰的mir-135、其缀合形式及其用途
EP3436583A1 (en) Androgen receptor nucleic acids and uses thereof
EP3436586B1 (en) Myc nucleic acids and uses thereof
CN103025357B (zh) 选择性递送寡核苷酸分子至特定神经元类的组合物和方法
JP2017012028A (ja) 人工マッチ型ｍｉＲＮＡおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20230913

RD01 Notification of change of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426

Effective date: 20230912