CN114469996B - 一种包含miR-135b-5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,尤其涉及轮状病毒外泌体及其应用。目前尚没有关于确认轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体,以及外泌体在病毒复制过程中的调控机制的相关报道。本发明公开了一种包含miR‑135b‑5p的外泌体以及这种外泌体在抑制轮状病毒感染中的应用,包括在制备治疗轮状病毒药物和中和轮状病毒试剂中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,尤其涉及轮状病毒外泌体及其应用。
背景技术
外泌体(Exosomes)是一种由多囊泡体(multivesicular bodies,MVB)与细胞质膜融合后释放的细胞外囊泡,起源于MVB形成过程中的腔内囊泡。具有典型的脂质双分子层结构,直径约为30-120nm的囊泡,浮密度约1.13-1.19g/mL。不同细胞分泌的外泌体表面具有一些共同的标记蛋白,如热休克蛋白70(HSC70),热休克蛋白90(HSP90)和四跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD82等。外泌体中携带多种分子,包括了特异性蛋白家族、功能性mRNA、miRNA。主要通过4种方式在细胞间发挥信息传递作用:(1)外泌体作为信号复合物,通过细胞表面配体直接刺激受体细胞;(2)外泌体在细胞间转移受体;(3)外泌体向受体细胞运送功能蛋白或传染性颗粒;(4)外泌体通过自身携带的mRNA、microRNA或转录因子改变转录和翻译影响受体细胞信息调控。在多个生物学过程肿瘤干细胞的动态平衡,自噬,免疫调节和肿瘤微环境中发挥调控作用。
轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起5岁以下婴幼儿严重腹泻的主要病原体之一。虽然已有相应的疫苗可以预防和控制轮状病毒的感染,但每年由于RV感染引起的儿童肠胃炎病例数仍然达到约1.25亿,导致约20万例儿童死亡。RV属于呼肠孤病毒属,是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒。RV基因组不连续,由11个节段(Segment)的双链RNA组成,编码6种结构蛋白(VP1-4, 6, 7)和6种非结构蛋白(NSP1-6) ,其中第11段基因编码NSP5和NSP6。完整的感染性病毒颗粒由外层衣壳蛋白(VP4和VP7)、内层衣壳(VP6)和核心(VP1,VP2和VP3)3层结构组成,被称为三层颗粒(triple-layered particles,TLP)。轮状病毒的结构蛋白和非结构蛋白协同作用,参与病毒基因复制和病毒颗粒组装的不同阶段。
作为双链RNA病毒,轮状病毒与宿主细胞间存在复杂的相互作用关系,但有关轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体及外泌体在病毒感染过程中的作用和具体调控机制尚未有报道,有待研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题包括确认轮状病毒感染宿主细胞后是否分泌外泌体,以及外泌体在病毒复制过程中的调控机制。
本发明公开了一种包含miR-135b-5p的外泌体以及这种外泌体在抑制轮状病毒感染中的应用:
miR-135b-5p成熟序列表uauggcuuuucauuccuauguga。
所述外泌体在制备轮状病毒感染药物中的应用。
所述外泌体在制备轮状病毒中和试剂中的应用。
所述miR-135b-5p过表达载体,miR-135b-5p过表达的外泌体或miR-135b-5p过表达细胞在轮状病毒感染药物中的应用。
一种轮状病毒感染的药物,其特征在于所述药物中包含由轮状病毒感染MA104细胞后分泌的外泌体,所述外泌体包含小RNAmiR-135b-5p。
如上所述的药物,其特征在于所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
一种中和轮状病毒的试剂,其特征在于所述试剂中包含由轮状病毒感染MA104细胞后分泌的外泌体,所述外泌体包含小RNAmiR-135b-5p。
附图说明
图1:轮状病毒感染MA104细胞后分离得到的外泌体及标志蛋白检测(A)电镜观察外泌体形态(B)WB检测外泌体中CD63和CD81的表达水平;
图2:NTA检测轮状病毒感染MA104细胞后分离得到的外泌体;
图3:免疫荧光检测RV-Exosome对轮状病毒复制的影响(A)RV control(B)ControlExosome+RV(C)Exosome与RV同时加入组(D)RV感染6h后加入外泌体组;
图4 轮状病毒感染MA104细胞分泌的外泌体中miRNA的差异表达倍数(前10);
图5: 小RNA测序分析RV-Exosome中差异miRNA数量;
图6:差异miRNA靶基因KEGG分析(A)总的差异miRNAs靶基因KEGG分析(B)Top 20差异miRNAs靶基因KEGG分析;
图7:免疫荧光检测miR-135b-5p对轮状病毒复制的影响(A)RV control(B)阴性对照小RNA组(C)miR-135b-5p上调组(D)miR-135b-5p下调组;
图8:Western blot检测miR-135b-5p对轮状病毒VP7蛋白复制的影响
图9:外泌体在乳鼠腹泻模型中的作用-腹泻评分。MOCK为模型对照组(未治疗组),C-EXO为空白对照细胞分离外泌体治疗组,RV-EXO为病毒感染细胞分离外泌体治疗组。
具体实施方式
实施例1:RV感染分泌的外泌体生物学性质分析,将野生型轮状病毒强毒株ZTR-68株(G1[8]型)感染MA104细胞后,收集上清,采用超滤离心和磁珠分选等外泌体分离步骤进行操作,希望分离到轮状病毒感染产生的外泌体。将收集的分离物通过NTA对外泌体进行粒径分析,鉴定分离物颗粒大小及浓度;通过电镜观察分离物的大小及形态;提取外泌体样品的蛋白,通过WB检测外泌体标志物CD63、CD81,Alix和CD9在分离物中的表达情况。
分离物透射电镜结果显示,分离物颗粒大小约为140nm,具有膜结构,符合外泌体特征(图1A)。通过纳米粒子分析(NTA)分析分离物的纯度和大小,结果显示,轮状病毒感染MA104细胞后分泌物为外泌体,大小约为140nm,含量为5×106纯度达到98%(图2)。WB检测结果显示,分离物高表达CD63,表达CD9、CD81和Alix,符合外泌体标记物特征(图1B)。
外泌体在RV复制中的体外作用。确认分离物为RV感染细胞,细胞能够释放外泌体后,进一步分析外泌体对RV的感染和复制的作用。为分析外泌体在RV中是否发挥作用,我们将外泌体和RV同时加入MA104细胞。于加入后16h进行轮状病毒特异性免疫荧光检测,结果显示,与对照组分离的外泌体作用相比,轮状病毒的蛋白表达出现明显下降,提示我们RV感染后分离的外泌体可能会通过直接与病毒结合或者细胞上RV受体结合,阻止RV的入胞,抑制轮状病毒的复制(图3C)。在MA104细胞先感染病毒6h后加入外泌体,于病毒感染后16h进行免疫荧光检测,结果显示,与对照组分离的外泌体作用相比,轮状病毒特异性蛋白表达也明显下降,提示轮状病毒感染后分泌的外泌体也能够影响轮状病毒的复制过程(图3D)。
研究报道,多个生物学过程中,外泌体能够携带miRNA发挥调控作用。为了分析轮状病毒感染后分泌的外泌体的内容物,我们提取了外泌体总RNA,进行小RNA测序,将对照组来源的外泌体miRNAs和病毒感染组的外泌体miRNAs进行差异比较分析,明确与病毒感染相关的外泌体内的功能miRNAs,并分析差异表达的miRNA及其靶标,并对差异miRNAs靶标基因进行GO分析和KEGG分析,明确可能参与的信号通路和靶基因。
小RNA测序结果显示,宿主细胞中的多个miRNAs如miR-135b-5p,miR-7e-3p,miR-30b-5p,miR-374b-5p,miR-21-3p,novel241_mature,miR-130a-5p,miR-421,miR-29b-3p和miR-769-5p出现上调和下调,其中miR-135b-5p上调表达水平最高。将外泌体中的差异miRNAs的靶基因进行聚类分析后发现,主要集中在胰岛素分泌,脂代谢,细胞通讯和钙离子信号等通路(图5, 6)。经过软件预测, miR-135b-3p的靶基因为轮状病毒的NSP4基因。
发明按以下方式实施:
步骤1、细胞培养:本研究使用的细胞为MA104细胞,培养条件为MEM培养基,含8%的新生小牛血清和1%双抗。
步骤2、病毒感染:
(1)将RV病毒液从-80℃冰箱中取出,置于常温待病毒液完全融化后,加入乙酰化胰酶和氯化钙,37℃水浴60 min,激活病毒;
(2)用不含血清的细胞培养液轻柔地洗细胞面两次,随后加入已激活的病毒液;
(3)将已接种病毒液的细胞放于37℃二氧化碳培养箱摇床上,慢摇吸附1h。随后吸弃病毒液,换成不含血清的细胞培养液(含终浓度为1 μg/mL的胰蛋白酶),放入37℃二氧化碳培养箱继续培养。
步骤3:外泌体分离,准备4个T-75培养瓶培养的MA104细胞,按照MOI 0.2感染轮状病毒,感染24h后,收集细胞培养上清。使用0.22微米的滤器过滤培养上清去除细胞碎片。将过滤上清使用超滤管(3K)进行浓缩,8000rpm离心浓缩至1ml。在浓缩液中加total exosomeisolation纯化分离液(Thermo scientific),混匀。4℃过夜。次日,20000g离心2h,收集白色沉淀,使用PBS清洗两次。使用PBS重悬,-80℃保存备用。
步骤4:外泌体小RNA测序,过TROZOL提取外泌体的总RNA,通过15%变性聚丙烯酰胺凝胶纯化18-30nt的RNA,通过专有接头链接sRNA(18-30nt)。将连接产物逆转录为cDNA并通过PCR扩增产生测序文库提交给Illumina Hiseq2500进行测序分析。原始 FASTQ 文件数据需经过引物与接头序列去除,并经过对测序片段碱基的质量检验和长度筛选,最终选择质量可靠的测序片段。使用bowtie 软件,对 clean reads 序列同 Rfam (version 10.0) 数据库进行比对,提取 E-value ≤ 0.01 的结果,注释出 rRNA、snRNA、Cis-reg、tRNA 等序列。尽可能的发现并去除其中可能的 rRNA、scRNA、Cis-reg、snRNA、tRNA,并进行小 RNA 的去除。最终将这些注释到 Rfam 数据库的序列进行过滤去除。不用于后续的已知 miRNA 比对以及新的miRNA 预测。使用 bowtie[8] 软件,将 Rfam 数据库过滤后的 reads 同转录本序列进行无错配比对,能完全 match 上转录本序列,并且长度大于 26nt 的序列,认为可能是 mRNA 的降解片段序列,对这部分序列进行过滤。提取出比对结果中序列长度在15-26 nt 之间的序列,将这部分同无法比对上转录本的序列进行合并,用于后续的已知miRNA 比对及新的 miRNA 预测分析。使用 bowtie 软件,将 mRNA 降解片段过滤后的序列同Repbase 数据库进行比对,鉴定可能的重复序列。针对鉴定出的重复序列进行过滤去除,并不用于后续的已知 miRNA 比对及新 miRNA 预测分析。通过上一步骤的重复序列过滤,对过滤后的reads 使用 Bowtie 软件与 miRBase 中该 miRNA 成熟体序列进行无错配比对,比对上的序列认为是已知的miRNA。并以此为依据作为 miRNA 的表达量统计,并进行后续差异分析。
步骤5:免疫荧光:
(1)细胞培养板中加入细胞爬片。待MA104细胞达到40%-60%汇合度时,用DMEM清洗细胞面两次,第三次换成opti-MEM;
(2) 配制转染试剂(六孔板),Ⅰ液:质粒2.5μg,P3000 5μL,用opti-MEM补足125μL;Ⅱ液lip3000 3.75μL,opti-MEM121.25μL,将Ⅰ液与Ⅱ液1:1混匀,室温10~20mim后,加入六孔板中250μl/孔。 转染6h后,换成不含双抗的细胞培养液;
(3)转染24h后种毒,放入37°C二氧化碳培养箱继续培养16h;
(4)拿出细胞培养板,用PBS轻柔的清洗细胞面一次,随后用2%多聚甲醛4°C固定30min后,再用甲醇4°C固定15min;
(5)PBS轻柔地清洗细胞面3次,每次5min;
(6)用2%BSA于37°C培养箱中封闭45min中;
(7)PBS清洗细胞面一次,随后每孔加入500μL山羊抗RV一抗(1∶500稀释),放入37°C恒温箱中孵育1.5h。PBST轻柔地清洗细胞面3次,每次5min;
(8)每孔加入500μL FITC标记的兔抗山羊二抗(1∶200稀释), 37°C恒温箱中孵育1h。PBST轻柔地清洗细胞面3次,每次5min;
(9)每孔加入1mL DAPI,37°C恒温箱中放置10min。PBST轻柔地清洗细胞面3次,每次5min;
(10)挑出细胞爬片,抗荧光猝灭剂封片,用荧光显微镜观察RV阳性细胞数。
步骤6、乳鼠临床症状的观察,攻毒后0到7天,将乳鼠与母鼠同笼喂养,每天观察攻毒后乳鼠的精神状态、腹泻情况等。每隔24h通过按压乳鼠腹部采集乳鼠粪便,依据BOSHUIZEN JA等人对乳鼠腹泻的评分规则,根据粪便的颜色、软硬、数量等等,对乳鼠的腹泻进行评分(0到4),无粪便排出评分0分、棕色成形大便评分1 分、棕色软大便评分2 分、黄色软大便评分3 分、黄色稀水样便评分4 分、肛周粪便污染评分4 分,大于2分被认为是有腹泻。
除体外试验外,为了验证携带miR-135b-5p的外泌体对轮状病毒的体内抑制作用,我们进行了乳鼠腹泻模型的治疗研究。实验分为Exo组、RV-Exo组和空白对照组三个组,每组3只母鼠,每组配一只公鼠,待母鼠分娩。Exo组、RV-Exo组分别采用80ul 5%葡萄糖溶液溶解5ug Exo、RV-Exo后,对出生4天的乳鼠进行腹腔注射给药,MOCK组不给药。按照每只105PFU(100微升)的病毒量对出生4天的乳鼠进行灌胃感染轮状病毒,灌胃后立即进行相应药物的腹腔注射处理。各组乳鼠攻毒后0-96h,每24h动态对每只乳鼠进行腹泻评分。根据粪便的颜色、软硬、数量等等,对乳鼠的腹泻进行评分(0到4),无粪便排出评分0分、棕色成形大便评分1 分、棕色软大便评分2 分、黄色软大便评分3 分、黄色稀水样便评分4 分、肛周粪便污染评分4 分,大于2分被认为是有腹泻。模型组腹泻评分结果显示,病毒感染乳鼠24h后对照组乳鼠腹泻发生,评分为4分。与模型组相比,RV-EXO组明显抑制轮状病毒感染导致的腹泻。
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种包含miR-135b-5p的外泌体及在抗轮状病毒感染中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> miR-135b-5p
<400> 1
uauggcuuuu cauuccuaug uga 23
Claims (6)
1.一种由轮状病毒感染MA104细胞后分泌的外泌体,其特征在于所述外泌体包含小RNAmiR-135b-5p。
2.如权利要求1所述外泌体在制备治疗轮状病毒感染药物中的应用。
3.如权利要求1所述外泌体在制备轮状病毒中和试剂中的应用。
4.一种治疗轮状病毒感染的药物,其特征在于所述药物包含权利要求1所述的外泌体。
5.如权利要求4所述的药物,其特征在于所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
6.一种中和轮状病毒的试剂,其特征在于所述试剂包含权利要求1所述的外泌体。
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