CN114686480B

CN114686480B - 一种lncRNA及其在调控轮状病毒复制中的应用

Info

Publication number: CN114686480B
Application number: CN202011625822.0A
Authority: CN
Inventors: 周艳; 李鸿钧; 胡晓青; 陈蓉; 吴晋元
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN114686480A

Abstract

本发明提供了一种lncRNA及其在调控轮状病毒复制中的应用。所述lncRNA具有SEQ ID No.1所示序列。本发明发现该lncRNA的表达水平与轮状病毒感染相关，并且能够抑制轮状病毒增殖。

Description

一种lncRNA及其在调控轮状病毒复制中的应用

技术领域

本发明是关于一种lncRNA及其在调控轮状病毒复制中的应用。

背景技术

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸(nt)的非编码RNA，由RNA聚合酶II和III转录。作为一类新型的关键细胞调控因子，lncRNA以多种机制参与哺乳动物细胞生物功能调控。在细胞核内，lncRNA能够通过与蛋白质和DNA相互作用，参与到转录调控和染色体重塑。在胞浆内，lncRNA能够通过与蛋白质、RNA及microRNA相互作用参与到转录后调控，从表观遗传学、转录及转录后等多个层面调控基因的表达和多种生物学过程。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，越来越多的宿主或病毒编码的lncRNA被发现，多个调控病毒感染的lncRNA功能的作用模式正在被揭示。这些差异表达的lncRNA，有来自病毒的，也有来自宿主细胞编码的。对于病毒而言，病毒在侵入宿主细胞或者潜伏感染过程中能够表达lncRNA，调控自身复制。宿主来源的lncRNA在抗病毒过程中具有更复杂的时空表达模式，能够通过激活模式识别受体(PRR)、表观遗传学，转录和转录后水平调控固有免疫反应，直接抑制病毒感染或者通过刺激抗病毒免疫反应来抑制病毒的进一步侵染。

轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起5岁以下婴幼儿严重腹泻的主要病原体之一。虽然已有相应的疫苗可以预防和控制轮状病毒的感染，但每年由于RV感染引起的儿童肠胃炎病例数仍然达到约1.25亿，导致约20万例儿童死亡。RV属于呼肠孤病毒属，是一种无包膜的二十面体形状的双链RNA病毒。RV基因组不连续，由11个节段(Segment)的双链RNA组成，编码6种结构蛋白(VP1-4,6,7)和6种非结构蛋白(NSP1-6)。完整的感染性病毒颗粒由外层衣壳蛋白(VP4和VP7)、内层衣壳(VP6)和核心(VP1，VP2和VP3)三层结构组成，被称为三层颗粒(triple-layered particles，TLP)。病毒结构蛋白和非结构蛋白协同作用，参与病毒基因复制和病毒颗粒组装的不同阶段。到目前为止，关于轮状病毒颗粒如何进入细胞内成功感染和转运的分子机制还不太清楚。

非编码RNA特别是lncRNAs在轮状病毒入胞、复制和增殖过程中是否发挥调控作用还未见报道。

发明内容

本发明的一个目的在于研究lncRNAs在轮状病毒入胞、复制和增殖过程中是否发挥调控作用。

本发明通过分离得到的人轮状病毒野毒株感染宿主细胞后进行全转录测序，发现了一种新的调控轮状病毒增殖的lncRNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明中将其命名为lncRNA 12798或TCONS-12798，其在轮状病毒感染的细胞中差异表达，并且该lncRNA分子具有抑制轮状病毒增殖功能，对于防治轮状病毒感染引起的腹泻具有重要意义。

从而，一方面，本发明提供了一种lncRNA分子，其具有如下核苷酸序列：

SEQ ID No.1所示核苷酸序列；

在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

本发明中将该具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列的lncRNA命名为lncRNA 12798。在本发明的一些实施方案中，lncRNA 12798也可以为在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列组成的lncRNA。

本发明中，所述“在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸”，优选是指经过这样的替换、缺失或添加后的核苷酸序列具有与SEQ IDNo.1所示核苷酸序列至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％一致的核苷酸序列，且具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列基本相同的调控轮状病毒增殖的功能。

另一方面，本发明还提供了检测来自待测样品中lncRNA水平的试剂材料和/或仪器设备在制备用于诊断轮状病毒感染的检测系统中的应用，所述lncRNA包括如下核苷酸序列组成的lncRNA：SEQ ID No.1所示核苷酸序列；或在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述lncRNA表达水平升高，待测样品被轮状病毒感染。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述lncRNA表达水平与轮状病毒感染时间正相关。

根据本发明的具体实施方案，本发明中，待测样品来自粪便，例如可为感染了分离自幼儿粪便的轮状病毒野毒株的MA104细胞。

另一方面，本发明还提供了lncRNA 12798或上调其表达水平的试剂在制备用于调控轮状病毒的增殖的制剂中的应用。

另一方面，本发明还提供了lncRNA 12798或上调其表达水平的试剂在制备用于防治轮状病毒感染引起的腹泻的药物中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种检测轮状病毒感染的试剂盒，其包括用于检测来自待测样品中lncRNA水平的试剂材料，所述lncRNA包括如下核苷酸序列组成的lncRNA：SEQID No.1所示核苷酸序列；或在SEQ ID No.1所示核苷酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。

根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒，其中包括用于检测来自待测样品中lncRNA水平的引物。

根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒，其中所述引物具有SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示序列。

根据本发明的具体实施方案，本发明的试剂盒还可进一步包括SEQ ID No.4～SEQID No.6所示的探针引物。

综上所述，本发明发现了全新的lncRNA分子：lncRNA 12798。lncRNA12798在轮状病毒感染后表达明显上调。并且，lncRNA12798能够抑制轮状病毒的增殖，对于防治轮状病毒感染引起的腹泻具有重要意义。

附图说明

图1为病毒感染RV全转录测序差异表达lncRNA火山图。

图2显示RT-PCR检测病毒感染16h后lncRNA分子的表达的检测结果。

图3显示RT-PCR检测不同感染时间lncRNA 12798分子的表达的检测结果。

图4显示qRT-PCR检测下调lncRNA 12798分子后病毒拷贝数的检测结果。

图5显示免疫荧光检测上调和下调lncRNA 12798对RV复制的影响。

图6为lncRNA 12798与差异表达mRNA的共表达分析GO聚类分析图。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。

实施例所用方法

1.细胞培养

本实施例的研究使用的细胞为MA104细胞，培养条件为MEM培养基(GIBCO，41500034)，含8％的新生小牛血清(民海)和1％双抗(GIBCO)。

2.病毒感染和测序

(1)病毒感染

1)将轮状病毒病毒液从-80℃冰箱中取出，置于常温待病毒液完全融化后，加入乙酰化胰酶和氯化钙，37℃水浴60min，激活病毒；

2)用不含血清的细胞培养液轻柔地洗细胞面两次，随后加入已激活的病毒液；

3)将已接种病毒液的细胞防于37℃二氧化碳培养箱摇床上，慢摇吸附1～2h。随后吸弃病毒液，换成不含血清的细胞培养液(含终浓度为1μg/mL的胰蛋白酶)，放入37℃二氧化碳培养箱继续培养。

(2)lncRNA测序分析

1)用TRIZOL提取感染了RV的MA104细胞样本的总RNA，进行全转录组测序。

2)利用cufflinks软件对每个样本的比对结果进行基于概率模型重建样本中的转录本，对于链特异文库的数据，则能准确地判别转录本的所在链方向。对于多个样本的项目而言，利用cuffmerge软件对每个样的重建的转录本进行合并汇总生成一个可代表本项目样本转录情况的转录本集合。

3)将拼接转录本与参考转录本(reference_transcripts)进行比较分析，筛除已知编码转录本或已知基因座的新转录本。该步利用cuffcompare软件将merged_transcripts同reference_transcripts进行逐一比较，筛除与已知lncRNA，其他ncRNA，mRNA等完全匹配或相似的转录本，同时明确剩余转录本的位置类型。然后通过对候选lncRNA转录本的筛选，本发明对带有‘i’，‘u’，‘x’，‘o’字样的转录本留取，并进入到第二步筛选环节。

4)对上一步筛选得到转录本按长度大于200bp和外显子数目大于等于2进行筛选。

5)对上一步筛选得到的转录本进行编码能力预测分析，筛除掉具有编码潜能的转录本，所用软件为CPC、CNCI、Pfam、PLEK。

3.RT-PCR检测lncRNA 12798

轮状病毒感染MA104细胞24h后，将细胞取出，吸弃上清液，加入2ml Trizol对细胞样品进行裂解。将裂解后的样品吸入1.5mlEP管中(每管1ml)后，向每管加入0.2ml的氯仿，加盖后用手或在涡旋震荡仪上剧烈震荡15秒，在RT放置2-3分钟，然后离心12,000×RPM，15minutes，4℃。将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10minutes，RT，然后离心12,000×RPM，10minutes，4℃。去上清，加入1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500×rpm，5minutes，4℃。重复此步骤一次。去上清，空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA样品其A260/280ratio<1.6。用无RNase水重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静置10分钟，55-60℃。测浓度后，使用SYBR Green染料一步法试剂盒(iTaq Universial SYBR GreenOne-Step Kit，Thermo scientific)进行RT-PCR。

引物序列为：

LncRNA 12798上游引物：GATGAAGGCGGGAGAAGATTTA(SEQ ID No.2)

LncRNA 12798下游引物：TCACAAGGAACTCAGCGAC(SEQ ID No.3)

4.上调lncRNA 12798

(1)细胞培养板中加入细胞爬片。待MA104细胞达到40％-60％汇合度时，用DMEM清洗细胞面两次，第三次换成opti-MEM。

(2)配制转染试剂(六孔板)，Ⅰ液：过表达质粒2.5μg，P3000 5μL，用opti-MEM补足125μL；Ⅱ液lip3000 3.75μL，opti-MEM121.25μL，将Ⅰ液与Ⅱ液1：1混匀，室温10～20mim后，加入六孔板中250μl/孔。转染6h后，换成不含双抗的细胞培养液。

5.下调lncRNA 12798

(2)配制转染试剂(六孔板)，Ⅰ液：siRNA 2.0μg，P3000 5μL，用opti-MEM补足125μL；Ⅱ液lip3000 3.75μL，opti-MEM121.25μL，将Ⅰ液与Ⅱ液1：1混匀，室温10～20mim后，加入六孔板中250μl/孔。转染6h后，换成不含双抗的细胞培养液。

6.qRT-PCR检测病毒拷贝数

转染si-12798 24h后，感染轮状病毒。感染24h后，将细胞取出，置于-20℃反复冻融三次；将病毒液4℃高速离心(8000r/20min)后取上清用病毒核酸提取试剂盒(ThermoScientific，K0821)提取病毒总RNA。用已知滴度(10^6.0PFU/mL)的RV标准株进行10倍梯度稀释至10^2.0PFU/mL，进行one-step probe qRT-PCR，以标准毒株10为底的对数作为横坐标，cq值为纵坐标，绘制标准曲线。随后检测样品Cq值代入标准曲线，计算出样品中RV拷贝数。qRT-PCR反应体系为2×Supermix 10μL；上下游引物(20μmol/mL)0.4μL；Enzyme Mix 0.4μL；RNA样品500ng；；Probe(10umol/mL)0.4μL；RNAase-free水补至20μL。反应程序为50℃10min；94℃ 30s；94℃ 5s，60℃ 30s，循环45次。

引物序列如下表1所示：

表1 NSP3-G1探针引物序列

7.免疫荧光

(2)配制转染试剂(六孔板)，Ⅰ液：质粒2.5μg，P3000 5μL，用opti-MEM补足125μL；Ⅱ液lip3000 3.75μL，opti-MEM121.25μL，将Ⅰ液与Ⅱ液1：1混匀，室温10～20mim后，加入六孔板中250μl/孔。转染6h后，换成不含双抗的细胞培养液。

(3)转染24h后种毒，放入37℃二氧化碳培养箱继续培养16h。

(4)拿出细胞培养板，用PBS轻柔的清洗细胞面一次，随后用2％多聚甲醛4℃固定30min后，再用甲醇4℃固定15min。

(5)PBS轻柔地清洗细胞面3次，每次5min。

(6)用2％BSA于37℃培养箱中封闭45min。

(7)PBS清洗细胞面一次，随后每孔加入500μL山羊抗RV一抗(1∶500稀释)，放入37℃恒温箱中孵育1.5h。PBST轻柔地清洗细胞面3次，每次5min。

(8)每孔加入500μL FITC标记的兔抗山羊二抗(1∶200稀释),37℃恒温箱中孵育1h。PBST轻柔地清洗细胞面3次，每次5min。

(9)每孔加入1mL DAPI，37℃恒温箱中放置10min。PBST轻柔地清洗细胞面3次，每次5min。

(10)挑出细胞爬片，抗荧光猝灭剂封片，用荧光显微镜观察RV阳性细胞数。

实施例一、lncRNA 12798的发现及表达分析

本发明对分离的野生型轮状病毒强毒株ZTR-68株(G1[8]型)感染MA104细胞后做全转录测序分析，经过CPC、CNCI、Pfam蛋白结构域和PLEK分析四种方法进行编码潜能的筛选，发现有一些lncRNA在轮状病毒感染后表达水平发生改变(图1)。经过RT-PCR验证后发现一个lncRNA表达水平显著上调，经测序分析其是一个全新的lncRNA分子，本发明中将该lncRNA分子命名为lncRNA 12798。其全长序列如SEQ ID No.1所示。

本发明中，通过RT-PCR检测lncRNA的表达发现，lncRNA12798的表达差异倍数高达378倍(图2)。

将轮状病毒感染MA104细胞，分别于感染后的0,2,4,8,12,24,36和48h，收集样品。提取RNA，通过RT-PCR检测lncRNA12798的表达。结果显示，病毒感染MA104细胞12h后，lncRNA12798的表达开始出现上调，随感染时间延长，不断上调(图3)。

实施例二、lncRNA 12798在轮状病毒增殖中的作用

本实施例研究了lncRNA 12798在调控轮状病毒的复制中的作用。首先构建了lncRNA12798的过表达质粒，合成了抑制lncRNA 12798表达的siRNA，转染MA104细胞，上调和下调lncRNA 12798的表达水平并于转染24h后感染轮状病毒。感染病毒24h后，提取总RNA进行病毒拷贝数检测。结果显示，下调lncRNA 12798的表达能够明显增加轮状病毒的病毒拷贝数(图4)。感染病毒16h后通过免疫荧光检测轮状病毒蛋白表达情况。免疫荧光结果显示上调lncRNA 12798后，病毒的蛋白表达明显减少。下调lncRNA 12798后，病毒的蛋白表达增加(图5)，说明lncRNA 12798能够抑制轮状病毒的复制。

实施例三、共表达基因预测及GO分析

根据轮状病毒感染宿主细胞后的全转录测序结果，进行lncRNA 12798与差异mRNA共表达分析。对共表达的mRNA进行差异聚类分析，选择富集GO数目最多、且富集数目不小于5的前10条lncRNA，分别绘制每一条lncRNA的GO富集分析top30发现在病毒感染宿主细胞后，与lncRNA 12798显著共表达的基因在生物学过程中主要聚类于response to virus和defense response to virus(图6)，且相关的基因为多个ISGs和C3。这些基因均与干扰素信号通路的激活有关，且在轮状病毒感染宿主细胞后均表达上调。提示lncRNA 12798可能是通过激活和增强干扰素信号通路抑制病毒增殖的。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种lncRNA及其在调控轮状病毒复制中的应用

<130> GAI20CN8015

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2100

<212> DNA

<213> 轮状病毒（Rotavirus）

<400> 1

cccgtctccg gttcctagct acaaacctca gccccacctt ccttcttcct gcgcgcacac 60

acagacacat tcagccacca tccccagaaa acgcaaacac ggcacgcacc caccgggata 120

cgtgtccaaa ctctgcctcc tgccacgcag ccttgctcct gcgtccgcac gtctcgctct 180

ggtttccaag ggagactctg gttacccctt cccccttcca tcctgtgggt tttcccaggg 240

aaggcccccg gggcaggcat catccattca gtcacctggc tcagcctccc gcagtgcctt 300

aaccccacag cactgaaagt cattctcagg ggcccagtgg ccgttacttt gctttctctt 360

gactgcagga tggcttatcc aggtcccttt ttagtgatgt gtggctgggg cgggcaggat 420

tctctctctc cttttctgtt gggtggaggg actaatgatt cctcttttag atccagggga 480

gtctgacctg ttctttgtgg ggtggtatag gcactgacta ctggctgcca gcctcaggtg 540

ctgaggctaa agcaccctgg agggtgcctg gccatctgct tgtgcctggc aagaggaagg 600

ggtgtcctga agggtgtctg ggaggtgaca tgctcctggc cctacccagc tagctggctt 660

gggcttaatt ctctggtaag actagcccag gcatctggcc aaactctgct tcttaattag 720

tttgtgtgtg tcttactgca tggcccctca cagaggccag caaaggcagg aaagaatgca 780

gcagggactg ggagaggctg ggtttggggg aggaggccac ggggcaggtc ctggaggcct 840

tggcctctcc agggcagatg aggatgccag tagactgggg tttctctttc ttctttctcc 900

ccaagtcttc tttctcccca agtcaaggtg cctaagagag gtgctgctga ggtctttgcc 960

ttctcaacac agccttgggg ctggggaggg tgatggagag cccttcctgc atgctgctgt 1020

cctccaccct accctccttc cctgtgccat tgcgtgcatt tggcaagatc cattcctggt 1080

catgcctgtc ctctatcccc tccagcttct ctaaccttct ctaggctgct tggggctcat 1140

cttcaggagg ttcctctgtt cctagtctag taaacccagc aatgagagtg ggatttggag 1200

tcaggggcag tggtctctgt ggaccctcat ttcagagtac tctagggcca ggattcagcc 1260

ataggcttat atattaccct tttctctctg tgttttctcc cctcccttct gtgcctaggt 1320

cccagttgct ctcactcaga gccaatcaaa gtgggctggg tgtgctgggc ccaagggcga 1380

catgggtgac caaggcatgg gtgacatgcc acttttcctt tgagagcttg gcttcaggca 1440

gtgttgaggc ctcaggggaa ttgctgggtt taaaagtctt tattgaggtg gatgaaggcg 1500

ggagaagatt taggaggagg aggaggatga caggaggtcg ctgagttcct tgtgatgcta 1560

gaatctttgg ccagattcag cagaagggag gatctctgta ggaccaggac tggcttaaga 1620

agtaggtcaa agatctggga ctagttcttc tggccccctc cccagcagtc tttctgtacc 1680

cccaaagcag aataaacagc atgagagtga aggcggcaca tagggaccag ggatggccac 1740

tccagcccgg cattgcatcc agcacccagc atagtccccg tcacaacagc aggagctcgg 1800

caggaacatg aagacagatg ttgaataatt tgacaagagc aacatagctt acagaattat 1860

caccaaatcc gtttttttcc ctcctctggg gagtacggag aaggaatttc aggaaaaatt 1920

gcacaagcga gggagagcac cttgtgtcca caaatccaag ctgctttgtt tgctttgctg 1980

gcgttacctc cccaccccaa gttgattttg gccccttagc cagcctgagg gctccccaga 2040

cccttggtgt caggctggag agcccctgcc ttagggtcaa gattctcatg acgtcccgtc 2100

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 2

gatgaaggcg ggagaagatt ta 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

tcacaaggaa ctcagcgac 19

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

atgagcacaa tagttaaaag ctaacactgt caa 33

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 5

accatctaca catgaccctc 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 6

ggtcacataa cgcccc 16

Claims

1. 一种lncRNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

2. 检测来自待测样品中lncRNA水平的试剂在制备用于诊断轮状病毒感染的检测系统中的应用，其中，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，lncRNA表达水平升高，待测样品被轮状病毒感染。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其中，lncRNA表达水平与轮状病毒感染时间正相关。

5.根据权利要求2所述的应用，其中，待测样品来自粪便。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，待测样品为感染了分离自幼儿粪便样本的轮状病毒野毒株的MA104细胞。

7.权利要求1所述的lncRNA分子或上调其表达水平的试剂在制备用于调控轮状病毒的增殖的制剂中的应用。

8.权利要求1所述的lncRNA分子或上调其表达水平的试剂在制备用于防治轮状病毒感染引起的腹泻的药物中的应用。

9. 一种检测轮状病毒感染的试剂盒，其包括用于检测来自待测样品中lncRNA水平的试剂材料，所述lncRNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中包括用于检测来自待测样品中lncRNA水平的引物。

11. 根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述引物的序列如SEQ ID No. 2和SEQ IDNo. 3所示。

12. 根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括SEQ ID No. 4~ SEQID No. 6所示的探针引物。