CN102071196A - 抑制犬p53基因表达的siRNA和p53基因沉默的犬细胞模型 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制犬p53基因表达的siRNA，其序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了编码该siRNA的DNA，以及含有该siRNA或DNA的重组载体。较佳的该重组载体是慢病毒载体，用以感染犬细胞，即得到一种p53基因沉默的犬细胞模型。本发明的犬p53基因siRNA序列能够有效降解p53基因的mRNA，从而抑制p53基因的表达。利用本发明提供的siRNA序列干扰犬p53基因的表达，一方面可用于制备与p53基因相关疾病的治疗药物，如细胞凋亡相关疾病，另一方面，通过本发明建立p53 knock down细胞模型，对于研究p53蛋白在细胞先天性免疫中的作用及其可能的具体机制具有重要的意义。

Description

抑制犬p53基因表达的siRNA和p53基因沉默的犬细胞模型

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抑制犬p53基因表达的siRNA和一种p53基因沉默的犬细胞模型及它们的用途。

背景技术

肿瘤抑制蛋白p53是分子量为53KD的磷酸化蛋白，具有转录激活功能。p53蛋白在细胞周期调控、促进细胞凋亡、肿瘤发生和细胞分化等方面起到非常重要的作用。在正常细胞中p53蛋白的半衰期很短，含量极微。当细胞受到紫外线照射，基因毒试剂以及病毒感染等应激时，特别是细胞的DNA受到损伤时，p53蛋白的表达迅速增加，通过磷酸化、乙酰化等方式被激活。激活的p53蛋白进入细胞核，转录激活与调控细胞周期相关基因的表达，使DNA受到损伤的细胞周期停止在G1期，等待细胞修复受到损伤的DNA。当DNA的损伤严重时，细胞不能完成修复。为了防止不正常的细胞进行分裂，p53蛋白转录激活能促进细胞凋亡的基因，诱导不正常的细胞发生凋亡。当p53蛋白发生突变或肿瘤蛋白与p53蛋白结合影响了p53蛋白的正常功能时，细胞就可能发生癌变，使细胞永生化。在当今，癌症成为人们健康越来越严重的威胁。如何治愈癌症，或者延长病者的生存期，提高生存质量是医者迫切解决的问题。

近年来研究发现，p53蛋白在细胞先天性免疫中也发挥重要的作用。水泡性口炎病毒在p53基因缺失细胞(p53-/-)里复制的病毒滴度是正常细胞的30倍，在感染的p53-/-小鼠血清里的滴度比正常小鼠的高100倍；而在p53基因多拷贝细胞(super p53细胞)里，水泡性口炎病毒的滴度比正常细胞低10倍。在p53基因沉默细胞(p53knock down细胞)中丙型肝炎病毒RNA的复制和病毒蛋白的表达显著提高，而用IFN(Interferon，干扰素)处理p53knock down细胞却不能有效地抑制丙型肝炎病毒(HCV)RNA的复制。这些都表明p53分子在细胞先天性抗病毒免疫中也发挥重要作用。但是这些作用机制都未能明了，大量的免疫性疾病还没有有效的治疗方法。p53的作用机制亟待阐明，但是目前还没有一个可以用于研究p53的细胞模型，限制了研究的开展和深入。

近年来研究发现，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞后，被裂解成siRNA(Small interfering RNA，小分子干扰RNA)，siRNA的双链解开变成单链并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制被称为RNA干扰(RNAi)。RNA干扰技术已经发展为高效、特异性阻断细胞内目的基因表达的有效工具。是目前研究基因功能的一种重要的方法和手段。而且RNA干扰被广泛应用于病毒感染、癌症治疗。dsRNA的导入细胞有多种方法。根据不同的细胞和研究对象可以选择电穿孔法、微量注射法、浸泡法、磷酸钙共沉淀法、质粒转染法等方法。

但是由于RNAi在细胞内的半衰期很短，这些方法得到的RNAi效应不能持久。也有用腺病毒载体导入dsRNA片段，但也不能实现目的基因稳定地长期表达。慢病毒(Lentivirus)载体不但可以感染非分裂细胞，还具有容纳外源性目的基因片段大、能够整合到细胞基因组中、表达持久等优点。目前，已有利用RNA干扰技术抑制人p53基因表达的报道。但是，还没有利用RNA干扰技术抑制犬p53基因表达的文献资料。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现在还未有p53基因沉默的犬细胞模型，对于与犬p53有关的肿瘤研究造成一定的影响，而且进一步限制了p53作用机制的深入研究，而提供一种抑制犬p53基因表达的siRNA和一种p53基因沉默的犬细胞模型及它们的用途，该siRNA能够有效抑制犬p53基因表达，从而能够应用于治疗或预防犬p53基因相关的疾病，该p53基因沉默的犬细胞模型对于研究p53基因及其表达在肿瘤治疗、细胞分化、细胞周期调节以及p53蛋白参与细胞先天性免疫的机制具有重要意义，从而为肿瘤、疾病的有效治疗提供了可能性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种抑制犬p53基因表达的siRNA，其序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种编码如上所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的DNA，其序列如序列表中SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：含有如上所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的DNA的重组载体。

根据本发明，所述的重组载体所用的载体可以是本领域常规的质粒，优选pGC-LV质粒。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：含有如上所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的重组载体。

根据本发明，所述的重组载体所用的载体可以是常规的反转录病毒衍生的载体。所述的病毒衍生的载体可以是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体或痘苗病毒载体等，本发明优选慢病毒载体。慢病毒载体的优点是它们能使编码siRNA的DNA整合到宿主细胞的基因组中，得以产生特定基因受特异性阻抑的细胞系，某些病毒载体可用于体内转化细胞，从而可直接操纵体内和整个生物的基因表达。所述的慢性病毒载体，可以是常规的市售慢病毒载体。

慢病毒载体主要是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础，通过去除env、vif、vpr、vpu等毒性基因改造而来，用水泡口炎病毒G糖蛋白来代替HIV-1的包膜进行包装，宿主范围广，能增加病毒的滴度。慢病毒载体的毒性基因已被删除并被外源基因取代，属于假型病毒，并且该病毒感染细胞后不能再感染其它细胞，生物安全性高。慢病毒载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达。本发明所用的慢病毒载体系统较佳的包括pGC-LV质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三种载体。pGC-LV载体中含有HIV的基本元件5’LTR(long terminal repeat，LTR，长末端重复序列)和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE(woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。较佳的将DNA片段连接到pGC-LV质粒，然后将所得的pGC-LV重组质粒和两种辅助包装原件载体pHelper 1.0质粒、pHelper 2.0质粒三质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒。收集培养后细胞上清液中的慢病毒颗粒，即得到含有本发明siRNA的重组慢病毒载体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是：一种p53基因沉默的犬细胞模型，含有如上所述的重组载体。

根据本发明，所述的犬细胞作为宿主细胞，可以选自各种不同种类的犬细胞。本发明优选犬肾细胞。所述的犬肾细胞较佳的是指来源于犬肾上皮细胞的MDCK细胞，其英文名为Madin-Darby canine kidney。MDCK细胞对于多种病毒感染比较敏感，利用本发明建立的细胞模型有利用开展p53的先天性抗病毒的研究。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之六是：一种如上所述的p53基因沉默的犬细胞模型的制备方法，包括以下步骤：将如上所述的含有如上所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的重组载体感染犬细胞。

根据本发明，所述的重组载体感染犬细胞后，编码犬p53 siRNA的DNA重组到犬细胞基因组中，转录出来的siRNA，降解了p53的mRNA，使犬细胞内源的p53基因沉默。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之七是：一种如上所述的siRNA的用途，用于制备犬p53抑制剂，或者用于制备治疗或预防犬p53基因相关疾病的药物组合物。所述的犬p53基因相关疾病如犬细胞凋亡相关疾病的治疗。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之八是：一种药物组合物，至少包括一种如上所述的抑制犬p53基因表达的siRNA为活性成分和一种药用载体。所述的siRNA较佳的如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。所述的载体是常规的药用载体，如填充剂、稀释剂和赋形剂等。

本发明还提供如上所述的细胞模型的用途，用于研究p53蛋白在肿瘤治疗、细胞分化、细胞周期调节以及细胞先天性免疫中的作用或其具体机制。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明的犬p53基因siRNA序列能够有效降解p53基因的mRNA，从而抑制p53基因的表达。利用本发明提供的siRNA序列干扰犬p53基因的表达，一方面可用于制备与p53基因相关疾病的治疗药物，如细胞凋亡相关疾病，另一方面，通过本发明建立p53knock down细胞模型，对于研究p53蛋白在细胞先天性免疫中的作用及其可能的具体机制具有重要的意义。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1显示在Genbank的登录号为AF060514.1的犬p53基因序列及本发明的siRNA的定位。

图2显示含犬p53 siRNA序列的不同MDCK细胞克隆p53基因的表达情况。1：含对照序列的MDCK细胞样品。2～12：含本发明siRNA序列的不同MDCK细胞克隆样品。

图3显示犬p53 siRNA序列对MDCK细胞中p53 mRNA的降解情况。

图4显示犬p53 siRNA抑制p53基因表达的稳定性检测。

图5显示5-Fu对含犬p53siRNA序列MDCK细胞及其对照细胞中p53基因表达的影响。

具体实施方式

本发明人希望通过建立一个p53基因沉默的细胞模型，以研究p53在肿瘤治疗、细胞分化、细胞周期调节以及p53蛋白参与细胞先天性免疫的可能机制，为进一步阐明p53的生物学功能奠定基础，从而有利于发现癌症或先天免疫性疾病的治疗药物。因此，本发明人经过广泛研究和反复试验，通过RNA干扰的方法，终于建立了p53基因沉默的犬细胞模型。本发明人先寻找高效的犬p53基因的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其人工合成后引入siRNA表达载体，再将该重组载体导入犬细胞，经过筛选和鉴定，证明获得的重组细胞中p53基因的表达被有效抑制，从而完成了本发明。

具体的，本发明的基本方案如下：根据p53基因的mRNA设计了RNA干扰的序列，然后化学全合成了DNA，将该DNA插入质粒中，和其它两个载体共同转染293T细胞，包装成重组慢病毒。该重组慢病毒的shRNA(shorthairpin RNA，shRNA)表达框中含有本发明的siRNA编码序列。然后用于转染犬肾细胞MDCK。重组慢病毒进入细胞后，利用逆转录酶转录出cDNA，然后将含有本发明的cDNA重组到细胞基因组中，利用宿主细胞的酶系统，转录出本发明的p53shRNA，本发明的p53shRNA与RNaseIII核酶家族的Dicer结合，并将其剪切成本发明的siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在犬p53mRNA上并切断犬p53mRNA，引发犬p53mRNA的特异性分解。

寻找高效的siRNA序列

本发明中，siRNA序列是犬p53基因的mRNA序列中的片段及其互补片段。具体包括19个核苷酸，位于犬p53mRNA全长序列的927-945位。图1显示了本发明的犬p53DNA序列及本发明的siRNA的定位。

利用siRNA设计软件进行设计，可以加快获得符合要求的siRNA序列。

将化学合成的编码犬p53 siRNA的DNA包装入载体，载体优选慢病毒载体。该慢病毒载体系统较佳的包括pGC-LV质粒、pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒三种载体。将DNA片段连接到pGC-LV质粒。PCR、测序鉴定阳性克隆。然后将阳性pGC-LV重组质粒和pHelper 1.0质粒、pHelper 2.0质粒共转染293T细胞，包装成慢病毒。培养后，在细胞上清液含有本发明siRNA的慢病毒颗粒，收集这些慢病毒颗粒即得本发明的重组慢病毒。

p53基因沉默的细胞模型的建立

本发明中，所述的p53基因沉默的细胞模型，又称p53 knock down细胞模型，其基因组中的p53基因的表达受到抑制。

将包装成功的重组慢病毒感染MDCK细胞(犬肾细胞)，然后用puromycin进行筛选，挑取11个筛选的MDCK细胞克隆，用western-blot方法检测不同的MDCK细胞克隆的p53蛋白量的情况。结果表明编码本发明siRNA的DNA序列序列成功重组到MDCK细胞基因组中，而且初步证实本发明的siRNA序列能够抑制犬p53基因的表达。

然后挑取p53蛋白量较低的MDCK细胞克隆，连续传代2代、4代、6代、8代后，用Trizol提取MDCK细胞mRNA，半定量RT-PCR方法分析MDCK细胞中p53mRNA的降解情况。表明本发明的p53siRNA序列能够有效降解MDCK细胞p53基因的mRNA。提取传代6次和8次的3号MDCK细胞克隆中的蛋白，用western-blot方面检测细胞内p53蛋白的含量，表明本发明的siRNA序列能够稳定的抑制p53基因的表达。

利用5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)能够诱导细胞内p53蛋白增加的特性，将含本发明siRNA序列的MDCK细胞和含对照序列的MDCK细胞，用10uM 5-Fu处理24h，收集细胞，提取蛋白，用western-blot方法分析细胞中p53蛋白量的情况。进一步证实了本发明的siRNA序列能够有效抑制犬p53基因的表达。

上述一系列研究结果表明，本发明的犬p53基因siRNA序列能够有效降解犬p53基因的mRNA，从而抑制犬p53基因的表达。本发明已经成功的用RNA干扰技术来抑制犬p53基因的表达，获得了p53基因沉默的细胞模型。

本发明的细胞模型与正常的MDCK细胞培养方法、保存、活化、传代一样，通常用10％血清的DMEM培养基，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中进行培养，用含20％血清、10％DMSO的DMEM培养基作为冻存液冻存细胞。用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的细胞消化液进行消化。

下面用实施例来进一步说明本发明的具体实施方式及效果，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。本发明中，所述的百分比未特别指明的是指质量百分比。

实施例1犬p53siRNA的序列设计

从GenBank中获得犬p53基因的基因序列(登录号为：AF060514.1)。设计可能可以抑制犬p53基因表达的siRNA序列如下：

5’-GCCACUAGAUGGAGAAUAU-3’(SEQ ID No.1)；

3’-CGGUGAUCUACCUCUUAUA-5’(SEQ ID No.2)。

该犬p53siRNA干扰的靶序列位于犬p53基因序列的927～945位(见图1)。该犬p53 siRNA的靶序列(编码本发明siRNA的DNA)如下：

正义链：5’-GCCACTAGATGGAGAATAT-3’(SEQ ID No.3)；

反义链：3’-CGGTGATCTACCTCTTATA-5’(SEQ ID No.4)。

并选用一条随机序列作为对照。对照序列如下：

正义链：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’；

反义链：3’-AAGAGGCTTGCACAGTGCA-5’。

上述正义链和反义链由吉凯基因化学有限公司化学合成。

实施例2含犬p53 siRNA慢病毒的包装

上述合成的编码本发明siRNA的DNA片段及对照序列，由吉凯基因化学有限公司包装入慢病毒载体。将DNA片段连接到pGC-LV质粒。PCR筛选阳性克隆，测序鉴定。然后将所得的pGC-LV重组质粒和pHelper 1.0质粒、pHelper 2.0质粒三质粒共转染293T细胞，培养48小时，包装产生慢病毒，收集细胞上清液。细胞上清液含有包装了本发明siRNA片段的慢病毒颗粒，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。

用293T细胞测定重组慢病毒的病毒滴度。含本发明siRNA序列的慢病毒的病毒滴度为10⁸TU/mL，含对照序列的慢病毒的病毒滴度为10⁸TU/mL。

实施例3含犬p53siRNA的MDCK细胞克隆的筛选及其p53基因表达情况分析

A、在试验前一天将5×10⁴个MDCK细胞(美国ATCC)接种三个35mmdish(细胞培养皿)中。

B、当细胞生长到30～50％细胞密度左右时，吸去上清，用PBS洗两次。分别用含本发明siRNA序列的慢病毒和含对照序列的慢病毒感染MDCK细胞，病毒感染量为20MOI。并设未用慢病毒感染的MDCK细胞作为对照组。加入含10％(v/v)血清的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养。

C、培养24小时后，去掉培养基，加入含10μg/ml Puromycin(嘌呤霉素)、10％血清的DMEM培养基，继续培养。观察细胞的生长状态，当未用慢病毒感染的MDCK细胞的对照组中细胞全部死亡时，用慢病毒感染的MDCK细胞试验组中未死亡的细胞就是重组成功的MDCK细胞。

D、将用Puromycin筛选的含本发明的siRNA序列的MDCK细胞及含对照序列的MDCK细胞用胰酶消化，用含10％血清的DMEM培养基稀释消化的细胞到10⁷倍，然后在96孔细胞培养板中加入消化的细胞，在显微镜下观察，保证96孔板中每孔只有一个细胞。在37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养。

E、当细胞生长到30％细胞密度时，加入含10μg/ml Puromycin、10％血清的DMEM培养基，继续培养。

F、将在含10μg/ml Puromycin、10％血清的DMEM培养基成功生长的细胞转移到48孔板中继续培养。然后将细胞又转移到24孔板中培养，直到用10μg/ml Puromycin筛选到阳性细胞克隆。

E、将用puromycin筛选的11个含本发明的siRNA序列的MDCK细胞克隆和含对照序列的MDCK细胞1×10⁶个接种到100mm细胞培养皿中，当细胞生长到80％细胞密度左右时，去掉培养基，用冰冷的PBS洗细胞两次。然后在冰上用细胞刮铲刮取细胞。用冷冻离心机在4℃、3000转/分钟离心5分钟。去掉上清，收集细胞沉淀。然后在细胞沉淀中加入100μl细胞裂解液，用枪头反复吹打细胞数次，使细胞充分裂解。然后再用细胞超声仪破碎细胞2秒。最后，将细胞煮沸5分钟。12000转/min离心5min，取上清。用BCA蛋白浓度测定方法测定上清中蛋白的浓度。然后加入1×上样缓冲液，在沸水中煮沸5min中，室温12000r/min离心5min。

F、将等量的蛋白提取物上样到丙烯酰胺12％(wt)SDS-PAGE凝胶上，然后转印到硝酸酸纤维膜上，5％(wt)脱脂乳封闭过夜，倒掉封闭液，用1∶1000稀释的兔多克隆抗体p53(FL-393)(生产商Sant Cruz，用p53全长的393个氨基酸进行免疫兔制备的抗体)反应2h，TBST洗三次，每次10分钟，然后加入1∶10000稀释的羊抗兔IgG-HRP(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，生产商SantCruz)，室温反应2h，TBST洗三次，每次10分钟，最后用ECL(增强型化学发光试剂盒，生产商Pierce)显示p53蛋白条带。

G、用ECL发光试剂盒显示p53蛋白完成后，将NC膜(硝酸纤维膜)置于Stripping Buffer(抗体剥离缓冲液)中，55℃温育30min。完成后用TBST洗3次，每次10min，然后用5％(wt)的脱脂奶粉封闭过夜。封闭完成后，用鼠源肌动蛋白(Actin)一抗(1∶1000稀释)和辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗(1∶5000稀释)进行Western-blot分析Actin蛋白。然后用ECL发光试剂盒显示Actin条带。

结果如图2所示，在含对照序列的MDCK细胞中，p53蛋白量较高。在含本发明siRNA序列的11个MDCK细胞克隆中，p53蛋白的表达不一致，有的细胞克隆的p53蛋白表达比较高，有的细胞克隆中的p53蛋白量明显降低。这可能与本发明的siRNA序列插入MDCK细胞基因组的位置有关。这些结果表明本发明的siRNA序列成功重组到MDCK细胞基因组中，而且初步证实本发明的siRNA序列能够抑制犬p53基因的表达。

实施例4含本发明siRNA序列的MDCK细胞中p53mRNA的降解情况

1、细胞总RNA的提取

细胞总RNA的提取按照Trizol试剂(invitrogen公司)的说明书进行操作。

A、选择在实施例3中用puromycin筛选的含本发明siRNA序列的3号MDCK细胞克隆和含对照序列的MDCK细胞连续传2、4、6、8代，然后将MDCK细胞1×10⁶个接种到100mm细胞培养皿中，轻轻摇动细胞培养皿，使细胞分布均匀。用含10％(v/v)血清的DMEM培养基在37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养。

B、当细胞生长到80％细胞密度左右时，去掉培养基，用冰冷的PBS洗细胞两次。然后在冰上用细胞刮铲刮取细胞。用冷冻离心机在4℃、3000转/分钟离心5分钟。去掉上清，收集细胞沉淀。

C、向EP管(离心管)中加入1mL Trizol试剂，用枪头反复轻轻吹打细胞，在室温中放置5min，使核蛋白复合物充分分离。

D、加入0.2mL氯仿，用手振荡混匀，在室温中放置2～3min。然后，4℃，12000g/min离心15min，将上层水相转移至新的灭活核糖核酸酶离心管中。

E、加入0.5mL异丙醇到转移的水相中，混匀，室温放置10min。4℃，12000g/min离心10min，去上清，RNA沉于管底。

F、用1mL 75％(v/v)乙醇(DEPC水配制)洗RNA沉淀，温和振荡，悬浮沉淀。

G、4℃，7500g/min离心5min，去上清。沉淀在室温中干燥10min，在RNA沉淀还没有完全干燥前加入40μL灭活RNA酶的水，在55～60℃温育10min，使RNA溶解。放置-70℃保存备用。

H、测定总RNA的浓度。

2、cDNA的制备

将提取的细胞总RNA用反转录试剂盒进行反转录制备cDNA。具体的步骤如下：

A、在PCR管中加入如下试剂：

B、混匀PCR反应液，轻微离心。在PCR仪上42℃反应60min。然后在冰上放置2min，中止cDNA的合成。

3、用半定量RT-PCR鉴定MDCK细胞中p53mRNA的降解情况

A、设计半定量RT-PCR的p53引物和Actin引物，序列如下：

p53上游引物：5’-AGGTTGGCTCTGACTGTA-3’

p53下游引物：5’-CCTCTGTCTTGAACATGA-3’

β-actin上游引物：5’-GACCCAGATCATGTTTGA-3’

β-actin下游引物：5’-CAGCTTCTCCTTAATGTCA-3’

将设计的引物送上海英骏生物有限公司合成。

B、采用invitrogen公司生产的Tfi DNA聚合酶试剂盒进行PCR扩增，在PCR管中，加入如下试剂：

C、混匀PCR反应液，轻微离心。按照下列条件进行PCR

D、PCR完成后，用1.5％(wt)Agarose琼脂糖胶进行电泳，用凝胶成像仪拍照，分析试验结果。

如图3所示，在含有阴性对照序列的MDCK细胞中，能检测到p53 mRNA，而与本发明siRNA序列重组的MDCK细胞克隆中p53 mRNA基本上检测不到。这进一步表明本发明的p53siRNA序列能够有效降解MDCK细胞p53基因的mRNA。

实施例5犬p53 siRNA抑制p53基因表达的稳定性检测

为了验证所挑取的含本发明siRNA序列的MDCK细胞经过多次传代后，本发明的siRNA是否还能够抑制犬p53基因的表达，将选择的含本发明siRNA序列的MDCK细胞连续传6代和8代后，收集细胞，提取细胞总蛋白，用western-blot方法分析p53基因的表达情况，如图4所示，在含有对照序列的MDCK细胞中，p53蛋白含量较高，而含有本发明siRNA序列的MDCK细胞中p53蛋白量较低，这进一步表明本发明的siRNA序列能够抑制p53基因的表达。

实施例6 5-氟尿嘧啶对含犬p53siRNA序列MDCK细胞及其对照细胞中p53基因表达的影响

利用5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)能够诱导细胞内p53蛋白增加的特性，将含本发明siRNA序列的MDCK细胞和含对照序列的MDCK细胞，用10μM 5-Fu处理24h，收集细胞，提取总蛋白，用western-blot方法分析细胞中p53蛋白量的情况。结果如图5所示，用10μM 5-Fu处理MDCK细胞24h后，含有对照序列的MDCK细胞中p53蛋白量很高，而含有本发明siRNA序列的MDCK细胞中p53蛋白含量很低，基本检测不到。这也进一步证实了本发明的siRNA序列能够有效抑制犬p53基因的表达。

本发明中的一些术语的含义如下：

PBS：磷酸氢二钠1.44g磷酸二氢钾0.24g NaCl 8g KCl 0.2g溶解于1L的超纯水中。

BCA：二喹林甲酸。

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

TBST：Tris碱2.42g NaCl 8g Tween 0.5mL溶解于1L的蒸馏水中，调节pH到7.6。

DEPC水：焦碳酸二乙酯水。

Tfi DNA聚合酶：来源Thermus filiformis菌的一种突变的DNA聚合酶，其中Tfi是Thermus filiformis菌的简称。

以上描述是对本发明的解释，不是对发明的限制，本发明所限定的范围参见权利要求书，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以做任何形式的修改。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<120>抑制犬p53基因表达的siRNA和p53基因沉默的犬细胞模型

<130>P4-091511C

<160>4

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA

<400>1

gccacuagau ggagaauau                        19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>siRNA

<400>2

auauucucca ucuaguggc                        19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>编码siRNA的DNA正义链

<400>3

gccactagat ggagaatat                    19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<223>编码siRNA的DNA反义链

<400>4

atattctcca tctagtggc                    19

Claims (10)

1.一种抑制犬p53基因表达的siRNA，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的DNA，其特征在于，其序列如序列表中SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。

3.含有如权利要求2所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的DNA的重组载体。

4.含有如权利要求1所述的抑制犬p53基因表达的siRNA的重组载体。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体所用的载体是慢病毒载体。

6.一种p53基因沉默的犬细胞模型，其特征在于，含有如权利要求4或5所述的重组载体。

7.如权利要求6所述的犬细胞模型，其特征在于，所述的犬细胞是犬肾细胞MDCK。

8.一种如权利要求6或7所述的p53基因沉默的犬细胞模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求4或5所述的重组载体感染犬细胞。

9.一种如权利要求1所述的siRNA的用途，其特征在于，用于制备犬p53抑制剂或治疗或预防犬p53基因相关疾病的药物组合物。

10.一种药物组合物，其特征在于，至少包括一种如权利要求1所述的抑制犬p53基因表达的siRNA为活性成分和一种药用载体。

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