CN102839180A - 抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备方法与应用，属于基因工程领域。该RNA干扰载体以pEGFP-C1为骨架载体，包括猪U6RNA聚合酶Ⅲ启动子和干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。将pEGFP-C1BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变；将猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子和干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板通过酶切和连接的方式引入到pEGFP-C1载体上得到。该RNA干扰载通过持续抑制靶基因的表达来进行RNA干扰研究和/或鉴定基因功能，为抗病转基因育种猪奠定了基础。

Description

抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNA干扰载体，特别涉及一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体及其制备与应用。

背景技术

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（doublestranded RNA,dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默（post-transcriptional genesilencing,PTGS）。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（smallinterfering RNA,siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC），RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程。RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。这种技术已经成为研究基因功能的重要工具，并将在病毒病、遗传性疾病和肿瘤病的治疗方面发挥重要作用。

目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括：化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase Ⅲ类降解（e.g.Dicer,E.coli,RNase Ⅲ）、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs，以及PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。其中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达，该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶Ⅲ的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果，具有表达稳定、持久，抑制效果明显的特点。

通过质粒表达siRNAs大都是用Pol Ⅲ启动子启动编码shRNA（short hairpinRNA）的序列。选用Pol Ⅲ启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4-5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol Ⅲ启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。而且，由于质粒可以复制扩增，与其它合成方法相比，能够显著降低制备siRNA的成本。此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

本发明的另一目的在于提供一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。

本发明的再一目的在于提供上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法。

本发明的目的还在于提供上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

通过大量筛选和实验得到干扰猪源p53基因的有效靶片段，其序列为：

5’-GTTGGGAGAATTTATGAAA-3’。

根据上述靶片段序列设计shRNA的转录模板的正义链和反义链，loop结构的序列为TTCAAGAGA，转录终止序列采用6个T结构。为了便于插入载体，在正义链的5’端添加了BamH Ⅰ酶切位点粘性末端GATCC，3’端添加了HindⅢ酶切位点粘性末端A；反义链的5’端添加了HindⅢ酶切位点粘性末端AGCTT，3’端添加了BamH Ⅰ酶切位点粘性末端G。最终得到干扰猪源p53基因的shRNA的正义链，如SEQ ID NO.2所示，干扰猪源p53基因的shRNA的反义链，如SEQ ID NO.3所示。

一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3退火杂交形成的双链DNA。

一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，具有如图1所示的结构，命名为pGenesilencer-GFP-p53，包括骨架载体、猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子和上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

所述的骨架载体为pEGFP-C1载体；所述的pEGFP-C1载体的多克隆位点中的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点进行了突变；所述的BamH Ⅰ酶切位点由5’-AAGCTT-3’突变为5’-AAGTTT-3’，所述的Hind Ⅲ酶切位点由5’-GGATCC-3’突变为5’-GGAACC-3’。

所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体具有骨架载体pEGFP-C1的特性，其多克隆位点如图2所示。

所述的猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子取代了pEGFP-C1载体的f1复制起点，在猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子后接入了干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，包括如下步骤：

（1）突变pEGFP-C1载体多克隆位点（multiple cloning site，MCS）中的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点，得到BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH。

（2）PCR扩增得到如SEQ ID NO.4所示的Mlu Ⅰ酶切位点+TAT+Spe Ⅰ酶切位点+SV40ori（复制起点）序列+Stu Ⅰ酶切位点的DNA片段S。

（3）将步骤（2）得到的片段S和步骤（1）得到的重组载体pEGFP-C1-BH分别用Mlu Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-Spe Ⅰ；

（4）PCR扩增得到如SEQ ID NO.5所示的Spe I酶切位点+pU6基因全长序列（猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子序列）+BamH Ⅰ酶切位点+ATA+HindⅢ酶切位点+Mlu Ⅰ酶切位点的DNA片段U6。

（5）将步骤（4）得到的片段U6和步骤（3）得到的重组载体pEGFP-C1-SpeI分别用Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-U6。

（6）将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火杂交得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

（7）将步骤（5）得到的重组载体pEGFP-C1-U6用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，酶切后的片段与步骤（6）得到的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板连接得到抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。

步骤（1）中所述的突变的方法优选为：

①以pEGFP-C1载体上1386-1646bp片段（即Sma Ⅰ到Mlu Ⅰ酶切位点之间）为靶片段，设计B1和B2引物突变掉BamH Ⅰ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段B；

B1：5’-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3’，

B2：5’-ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’；

②将①中得到的靶片段B和pEGFP-C1载体分别用Sma Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-B；

③以pEGFP-C1载体上606-1357bp片段（即Nhe Ⅰ到EcoR Ⅰ酶切位点之间）为靶片段，设计H1和H2引物突变掉Hind Ⅲ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段H；

H1：5’-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3’，

H2：5’-GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3’；

④将③中得到的靶片段H和②中得到的重组载体pEGFP-C1-B分别用Nhe I和EcoR I酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH。

步骤（2）中所述的PCR扩增是以pEGFP-C1载体为模板、S上游和S下游为引物，

S上游：5’-CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3’，

S下游：5’-GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3’。

步骤（4）中所述的PCR扩增是以ST细胞（猪睾丸细胞）的cDNA为模板、pU6-上游和pU6-下游为引物，

pU6-上游：5’-GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3’，

pU6-下游：5’-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3’。

步骤（6）中所述的退火杂交的条件优选为：95℃，5min；72℃，15min；4℃保存。

上述干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源p53基因表达中的应用。

上述抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源靶基因中的应用，通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板实现。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明公开的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板和抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体能有效抑制猪源p53基因的表达。

（2）抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体可以在猪源细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，可以进行较长期研究；即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选，也有助于富集带质粒的细胞，可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效率低造成的问题。

（3）抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体具有骨架载体pEGFP-C1的特性，其以EGFP作为转录效率指示标记，原核筛选标志Kan和真核筛选标志neo共用同为一段基因，质粒相对较小，可实施流式筛选和G418筛选；还可以表达外源基因，有利于稳定表达外源蛋白或基因敲除靶基因的细胞系的筛选。

（4）通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板能够得到抑制猪源其它基因表达的RNA干扰载体，为研究其它猪源基因的作用提供了基础。

附图说明

图1是抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体结构图。

图2抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的多克隆位点示意图。

图3是靶片段B PCR扩增结果图。

图4是靶片段H PCR扩增结果图。

图5是片段S结构示意图。

图6是片段S PCR扩增结果图。

图7是片段U结构示意图。

图8是片段U PCR扩增结果图。

图9是相对荧光定量-PCR检测PK-15细胞内p53基因的表达水平图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

表1.实施例中所用序列

实施例中所使用的pEGFP-C1载体购自Takara公司，大肠杆菌Top 10菌株购自天根生化科技（北京）有限公司，ST细胞、PK-15细胞购自中国典型培养物保藏中心（武汉大学），引物、shRNA的正义链及反义链均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例1

抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备

（1）突变pEGFP-C1载体MCS中的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点：

以pEGFP-C1载体上1386-1646bp片段（即Sma Ⅰ到Mlu Ⅰ酶切位点之间）为靶片段，设计B1和B2引物突变掉BamH Ⅰ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，通过PCR扩增（94℃ 3min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃终延伸8min。）得到靶片段B（如图3所示，M：DL2000，1：靶片段B，2：阴性对照），大小为265bp。

将靶片段B和pEGFP-C1载体分别用Sma Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top 10构建重组载体，经PCR和测序鉴定正确的载体为BamH Ⅰ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-B。

以pEGFP-C1载体上606-1357bp片段（即Nhe Ⅰ到EcoR Ⅰ酶切位点之间）为靶片段，设计H1和H2引物突变掉HindⅢ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，通过PCR扩增（94℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 40s，72℃ 30s，30个循环；72℃终延伸8min。）得到靶片段H（如图4所示，M：DL2000，1：靶片段H，2：阴性对照），大小为751bp。

将靶片段H和pEGFP-C1-B载体分别用Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切，将酶切后的片段用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top 10构建重组载体，经PCR和测序鉴定正确的载体为BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH。

（2）以pEGFP-C1载体为骨架，利用该载体中已有的Mlu Ⅰ和Stu Ⅰ酶切位点，再插入Spe Ⅰ酶切位点以备下一步通过Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位点插入猪U6RNA聚合酶Ⅲ启动子。

所需DNA片段S示意图如图5所示，其序列如SEQ ID NO.4所示，大小为328bp；以pEGFP-C1载体为模板、S上游和S下游为引物，进行PCR扩增：94℃ 3min；94℃ 30s，62℃ 40s，72℃ 30s，30个循环；72℃终延伸8min。经琼脂糖凝胶电泳检测（如图6所示，M：DL2000，1：片段S，2：阴性对照）表明得到目的片段S。

（3）将片段S和pEGFP-C1-BH载体分别用Mlu Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，将酶切后的片段用T4DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top 10构建重组载体，经PCR和测序鉴定正确的载体为重组载体pEGFP-C1-Spe Ⅰ。

（4）设计pU6-上游和pU6-下游引物，在Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切位点之间插入猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子以及BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点；所需DNA片段U6示意图如图7所示，其序列如SEQ ID NO.5所示，预期大小为606bp；以ST细胞cDNA为模板、pU6-上游和pU6-下游为引物，进行PCR扩增：94℃ 3min；94℃ 30s，61℃ 40s，72℃ 30s，30个循环；72℃终延伸8min。经琼脂糖凝胶电泳检测（如图8所示，M：DL2000，1：片段S，2：阴性对照）表明得到目的片段U6。

（5）将片段U6和重组载体pEGFP-C1-Spe I分别用Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top 10构建重组载体，经PCR和测序鉴定正确的载体为重组载体pEGFP-C1-U6。

（6）将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3于95℃，5min，缓慢退火，得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

（7）将重组载体pEGFP-C1-U6用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，再将酶切后的片段与干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌Top 10构建重组载体，经PCR和测序鉴定正确的载体为抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体pGenesilencer-GFP-p53。

实施例2

相对荧光定量-PCR检测抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的干扰效率

（1）用Invitrogen的Lipofectamine^TM2000按相同条件将pGenesilencer-GFP（对照组）和实施例1中的RNA干扰载体pGenesilencer-GFP-p53（实验组）分别转染入PK-15细胞。

pGenesilencer-GFP载体中的shRNA模板为对照shRNA正义链和对照shRNA反义链退火杂交得到，其余序列与pGenesilencer-GFP-p53一样。

（2）继续培养PK-15细胞48h后收集细胞，用Takara公司的MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver4.0试剂盒提取PK-15细胞的总RNA。

（3）将提取的总RNA用Takara公司的PrimeScript RT Master Mix Perfect Realtime试剂盒进行反转录得到cDNA，反转录条件为：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。

（4）用Takara公司的

Premix Ex Taq^TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒以步骤（3）得到cDNA为模板、猪源β-Action为内参在Roche公司的LightCycle480仪器上进行相对荧光定量-PCR检测p53的表达水平；相对荧光定量-PCR条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s（40个循环）；定量引物为β-Action-F、β-Action-R和p53-F、p53-R。

结果如图9所示，表明RNA干扰载体pGenesilencer-GFP-p53能有效抑制PK-15细胞内p53基因的表达。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板，其特征在于：为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3退火杂交形成的双链DNA。

2.一种抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：包括骨架载体、猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子和权利要求1所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

3.根据权利要求2所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：

所述的骨架载体为pEGFP-C1载体；所述的pEGFP-C1载体的多克隆位点中的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点进行了突变；

所述的猪U6RNA聚合酶Ⅲ启动子取代了pEGFP-C1载体的f1复制起点，在猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子后接入了权利要求1所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板。

4.根据权利要求3所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体，其特征在于：所述的BamH Ⅰ酶切位点由AAGCTT突变为AAGTTT，所述的HindⅢ酶切位点由GGATCC突变为GGAACC。

5.权利要求4所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）突变pEGFP-C1载体多克隆位点中的BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点，得到BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH；

（2）PCR扩增得到如SEQ ID NO.4所示的Mlu Ⅰ酶切位点+TAT+Spe Ⅰ酶切位点+SV40复制起点序列+Stu Ⅰ酶切位点的DNA片段S；

（3）将步骤（2）得到的片段S和步骤（1）得到的重组载体pEGFP-C1-BH分别用Mlu Ⅰ和Stu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-Spe Ⅰ；

（4）PCR扩增得到如SEQ ID NO.5所示的Spe Ⅰ酶切位点+猪U6 RNA聚合酶Ⅲ启动子序列+BamH Ⅰ酶切位点+ATA+Hind Ⅲ酶切位点+Mlu Ⅰ酶切位点的DNA片段U6；

（5）将步骤（4）得到的片段U6和步骤（3）得到的重组载体pEGFP-C1-SpeⅠ分别用Spe Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-C1-U6；

（6）将SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3退火杂交得到干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板；

（7）将步骤（5）得到的重组载体pEGFP-C1-U6用BamH Ⅰ和HindⅢ酶切，酶切后的片段与步骤（6）得到的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板连接得到抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体。

6.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的突变的方法为：

①以pEGFP-C1载体上1386-1646bp片段为靶片段，设计B1和B2引物突变掉BamH Ⅰ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段B；

B1：5’-CCCCGGGAACCCGGATCTAGATAA-3’，

B2：5’-ACGCGTAGATACATTGATGAGTTTGGACAA-3’；

②将①中得到的靶片段B和pEGFP-C1载体分别用Sma Ⅰ和Mlu Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-B；

③以pEGFP-C1载体上606-1357bp片段为靶片段，设计H1和H2引物突变掉HindⅢ酶切位点，以pEGFP-C1载体为模板，PCR扩增得到靶片段H；

H1：5’-CTAGCTAGCTACCGGTCGCCA-3’，

H2：5’-GGAATTCGAAGTTTTTGAGCTCGA-3’；

④将③中得到的靶片段H和②中得到的重组载体pEGFP-C1-B分别用Nhe Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切，将酶切后的片段连接得到BamH Ⅰ和HindⅢ酶切位点突变的重组载体pEGFP-C1-BH。

7.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的PCR扩增是以pEGFP-C1载体为模板、S上游和S下游为引物，

S上游：5’-CGACGCGTTATACTAGTGGTGTGGAAAGTCCCCA-3’，

S下游：5’-GAAGGCCTTAGGCCTCCAAAAAAGCCTC-3’；

步骤（4）中所述的PCR扩增U6是以ST细胞cDNA为模板、pU6-上游和pU6-下游为引物，

pU6-上游：5’-GGACTAGTTGGCTCCAGACCTCGCGGTGGT-3’，

pU6-下游：5’-CGACGCGTAAGCTTATAGGATCCTGTGCTGCCGAAGCGA-3’。

8.根据权利要求5所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体的制备方法，其特征在于：

步骤（6）中所述的退火杂交条件为：95℃，5min；72℃，15min；4℃保存。

9.权利要求1所述的干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板或权利要求2～4任一项所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源p53基因表达中的应用。

10.权利要求2～4任一项所述的抑制猪源p53基因表达的RNA干扰载体在抑制猪源靶基因中的应用，其特征在于：通过将干扰猪源靶基因的shRNA的转录模板取代干扰猪源p53基因的shRNA的转录模板实现。

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