CN102363792A - 制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法 - Google Patents

制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法 Download PDF

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张成锋
董在杰
朱健
邴旭文
苏胜彦
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Abstract

本发明公布了一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法，其特征在于：通过构建含有靶基因的慢病毒载体来进行转基因鱼的生产，其含有GFP报告基因可用于检测转基因的效果。本发明能够生产慢病毒转基因鱼，转基因鱼的成活率12.2%。

Description

制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法
技术领域
本发明涉及一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法的方法。
背景技术
目前，生产转基因动物的方法有原核内显微注射法、精子载体法、脂质体转染法、反转录病毒载体法、以及细胞核移植方法，但这些方法皆因成本高、转基因效率低或者插入片段小等缺点而无法广泛应用。慢病毒载体法的出现，不仅克服了以往逆转录病毒表达沉默的缺陷，而且转基因的效率远远高于传统的显微注射法，是转基因动物研究领域的突破性进展。随后，利用该方法，已经有转基因猪、转基因牛、转基因鼠、转基因鸡、绵羊、猕猴等出生。
在我国，朱作言等就通过显微注射的方法获得了转草鱼生长激素的转基因鲤鱼，黑龙江水产研究所也通过同样的方法获得了转大马哈生长激素基因的转基因鲤鱼，而使用慢病毒生产转基因鲤鱼还未见报道。因此，本发明期望获得转基因鲤鱼的慢病毒方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种基于慢病毒的转基因鲤鱼生产方法，该处理方法既能提高转基因的效率，又能降低转基因鲤的生产成本。
本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：
制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于：首先构建所要转基因的慢病毒载体，其次，获得人工授精的鲤鱼未分裂的受精卵并进行脱粘处理；使用显微注射的方式进行慢病毒注射；
具体操作步骤为：
制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现：
（1）、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF402958，设计引物：
IGF2b-BamHI-F，GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA
IGF2b-NheI-R，CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；
扩增其CDS区
ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGG
TCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGT
GGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGT
TTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGT
GTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGA
CGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACAT
GTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCC
CCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCA
CCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，
用Trizol（购自南京基天生物）抽提2个样品中的RNA，反转录成cDNA；PCR扩增条件优化：用Taq DNA polymerse(Fermentas)（购自上海英骏英骏生物技术有限公司）扩增目的片段，摸索PCR条件；以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下：
Component Final Con. Volume (μL)
10× Buffer 1× 5
MgSO4(50 mM) 2.5 mM 2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 1
IGF2b-BamHI-F (10 μM) 0.5 μM 1
IGF2b-NheI-R (10 μM) 0.5 μM 1
Template   1
Taq HIFI (5 U/μL, Invitrogen) 1 U 0.2
ddH2O   To 50 ul
循环条件：
Figure 913586DEST_PATH_IMAGE001
回收PCR产物(Axygen PCR纯化试剂盒) （购自上海英骏英骏生物技术有限公司，后克隆测序验证，而后进行慢病毒载体（上海瑞赛生物技术有限公司）包装（根据上海瑞赛生物技术有限公司慢病毒的包装步骤进行），同样会的包装后的慢病毒载体同样要进行IGF2b基因克隆测序验证；
（2）在（1）的基础上，通过荧光显微镜观察法进行慢病毒滴度测定，在感染293T细胞（购自上海瑞赛生物技术有限公司）后观察GFP表达状况以及IGF2b基因mRNA的表达情况；
（3）在（2）基础上，通过人工授精的方式获得鲤鱼的未分裂的受精卵。通过显微注射的方法进行转基因鲤鱼的生产。
有益效果
1本发明提供了一种制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，可成功通过慢病毒方法制作转基因鲤鱼；
2 本发明提供了一种研究鲤IGF2b基因过表达的遗传模型，该模型IGF2b基因mRNA平均表达水平显著高于对照组，可多达9个拷贝。
 
附图说明
图1慢病毒表达质粒及包装质粒共转染293T细胞（A和B：pLenti-IGF2b-IRES-EGFP，C和D：pLenti-EGFP Nomal Control；A和C为荧光检测，B和D：对照组）
图2 Lenti-IGF2b感染293T的表达检测
图3 转IGF2b基因鲤鱼的GFP表达状况 （A： 转基因组 B：对照组）
图4 转IGF2b基因鲤鱼的IGF2b表达状况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
（1）   以构建转IGF2b基因鲤为例：根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF402958，设计引物
IGF2b-BamHI-F，GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA
IGF2b-NheI-R，CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG），扩增其CDS区ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGGTCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGTGGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGTTTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGT
GTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGACGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACATGTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCCCCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCACCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，
用Trizol（购自南京基天生物）抽提2个样品中的RNA，反转录成cDNA；PCR扩增条件优化：用Taq DNA polymerse(Fermentas)（购自上海英骏英骏生物技术有限公司）扩增目的片段，摸索PCR条件；以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下：
Component Final Con. Volume (μL)
10× Buffer 1× 5
MgSO4(50 mM) 2.5 mM 2
dNTP (10 mM) 0.2 mM 1
IGF2b-BamHI-F (10 μM) 0.5 μM 1
IGF2b-NheI-R (10 μM) 0.5 μM 1
Template   1
Taq HIFI (5 U/μL, Invitrogen) 1 U 0.2
ddH2O   To 50 ul
循环条件：
回收PCR产物(Axygen PCR纯化试剂盒) （购自上海英骏英骏生物技术有限公司，后克隆测序验证，而后进行慢病毒载体（上海瑞赛生物技术有限公司）包装（根据上海瑞赛生物技术有限公司慢病毒的包装步骤进行），同样会的包装后的慢病毒载体同样要进行IGF2b基因克隆测序验证。
（2）在（1）的基础上，通过荧光显微镜观察法进行慢病毒滴度测定，在感染293T细胞（购自上海瑞赛生物技术有限公司）后观察GFP表达状况以及IGF2b基因mRNA的表达情况(如下图)。
（3）在（2）基础上，通过人工授精的方式获得鲤鱼的未分裂的受精卵。通过显微注射的方法进行转基因鲤鱼的生产。
（4）在转基因操作结束后48-72h，通过荧光倒置显微镜观察GFP的表达状况，若有表达，通过实时荧光定量PCR的方法检测目地基因（IGF2b）的表达状况。
（5）显微注射鲤鱼未分裂的受精卵131玫，获得孵化成功的鱼苗32玫（孵化率：32/131），获得10g鲤鱼16玫（成活率16/131）。
综合以上步骤，我们可以得到，构建好的IGF2b慢病毒载体感染293T细胞后，显示较强的GFP表达，同时IGF2b基因表达量提高，通过显微注射的方法生产的慢病毒转基因鲤鱼在48h后检测倒了GFP的表达，通过实时荧光定量PCR检测，发现转基因鲤鱼IGF2b表达量提高。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
 <120>  制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法
<130> 
<160>  3    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  624
<212>  DNA
<213>  鲤鱼IGF2b基因cDNA序列的CDS区
<400>  1
atggaggacc aactaaaaca tcattctttg tgccatactt gtttgagaac agacagtgtc     60
ataaataagg tcataaagat gtactggtcc atacgaatgc ccatatgcat actgttttta    120
accctgtctg ccttcgaagt ggcttcagct gaaacgttat gcggcggaga gctggtggac    180
gcgctacagt ttgtgtgtgg agacagaggt ttctatttca gtcgaccaac tagcaggttg    240
agcagtcgac gttctcaaaa tcgtgggatt gtggaagagt gttgttttaa cagttgtaac    300
ctagctcttc tagaacagta ctgcgctaaa cctgccaagt cagagaggga cgtttcagcc    360
acatccctac aggtcatccc ggtgatgccc acattaaaac aggaggtccc aagaaaacat    420
gtgaccgtga aatattccaa atacgacatg tggcaacgaa aggccgccca gaggctacgg    480
aggggcgtcc ccgccatcct gcgggccaag aagtttaggc ggcaggcgga gagaatcagg    540
gcccaagagc aactgcacca ccacaggcct ctcatcacgc ttcccagcaa gctcccgccc    600
atcctttttg cacagagtcg atga                                           624
<210>  2
<211>  43
<212>  DNA
<213>  IGF2b-BamHI-F
<400>  2
gatcatacgg atccgccacc atggaggacc aactaaaaca tca                       43
<210>  3
<211>  36
<212>  DNA
<213>  IGF2b-NheI-R
<400>  3
cagttgacgc tagctcatcg actctgtgca aaaagg                               36
 

Claims (1)

1.制备IGF2b转基因鱼的慢病毒方法，其特征在于按如下步骤实现：
（1）、根据鲤鱼IGF2b基因cDNA序列Genbank登录号为AF402958，设计引物：
IGF2b-BamHI-F：GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA
IGF2b-NheI-R：CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；
扩增其CDS区
ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGGTCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGTGGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGTTTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGTGTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGACGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACATGTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCCCCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCACCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，
用Trizol抽提鲤鱼中的RNA，反转录成cDNA；PCR扩增条件优化：以cDNA为模板，用高保真酶扩增目的片段，PCR体系如下：
Component Final Con. Volume (μL) 10× Buffer 1× 5 MgSO4(50 mM) 2.5 mM 2 dNTP (10 mM) 0.2 mM 1 IGF2b-BamHI-F (10 μM) 0.5 μM 1 IGF2b-NheI-R (10 μM) 0.5 μM 1 Template   1 Taq HIFI (5 U/μL, Invitrogen) 1 U 0.2 ddH2O   To 50 ul
循环条件：
Figure 869910DEST_PATH_IMAGE001
回收PCR产物，后克隆测序验证，而后进行慢病毒载体包装，同样会的包装后的慢病毒载体同样要进行IGF2b基因克隆测序验证；
（2）在（1）的基础上，通过荧光显微镜观察法进行慢病毒滴度测定，在感染293T细胞后观察GFP表达状况以及IGF2b基因mRNA的表达情况；
（3）在（2）基础上，通过人工授精的方式获得鲤鱼的未分裂的受精卵;通过显微注射的方法进行转基因鲤鱼的生产。
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