CN102250912A - 含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：获取鲤的肝脏组织，提取RNA，后反转录为cDNA，根据基因库中公布的鲤IGF2b基因序列开放阅读框设计引物；在目的片段的5’端和3’端设计内切酶，测序检测是IGF2b基因后，用BamHI和NheI双酶切含有IGF2b基因的PCR回收产物及载体pLenti6.3-IRES-EGFP，然后回收酶切后的载体pLenti6.3-IRES-EGFP及IGF2b基因片段；将酶切回收的IGF2b基因片段与pLenti6.3-IRES-EGFP连接，获得含有IGF2b基因的慢病毒载体。本发明的有益效果为：无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能转染终末分化细胞和非分裂细胞；是获取转基因鲤的一项关键技术，可在短期内确定具有目的基因的品系，缩短鱼类育种时间。

Description

含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法

技术领域

本发明涉及鱼类生物工程育种领域，尤其涉及一种含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法。

背景技术

传统的鱼类育种一直采用杂交育种技术，杂交可以使杂交种后代增加变异性和异质性，综合双亲的优良性状，产生某些双亲所没有的新性状，使后代获得较大的遗传改良，出现可利用的杂种优势，是鱼类育种的基本途径之一，也是为培育出优质鱼种的有效措施。但这种技术用来固定目的基因需要较长的时间。

基因工程是20世纪70年代开展起来的一项遗传育种新技术。我国学者朱作言率先提出了鱼类转基因研究。由于鱼类具有它自身的有利条件，如属较低等的脊椎动物、可对多种高等脊椎动物的生长激素作出反应，因此继1985年第一批转基因鱼在中国问世以后，世界上许多国家相继开展了鱼类转基因研究。在短短几年中，取得了很大的成绩。我国是水产大国，而且又有鱼类核移植的良好基础，在许多单位开展了鱼类转基因研究，并取得较好成绩。基因工程育种是在目的基因及其决定的目标性状确定的情况下，将该基因分离出来，构建表达载体后转入到个体中，就可能使其遗传性状在短期内转给个体，可在短期内确定具有目的基因的品系。因此，开发一个可用于转基因鲤开发的新载体及其构建方法将是解决生产实践中育种时间长的有效方法。

发明内容

本发明的目的是一种含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法，以解决针对目的基因生长功能的实践验证和转基因鱼开发新方法的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

获取鲤的肝脏组织，提取RNA，后反转录为cDNA，根据基因库中公布的鲤IGF2b基因序列开放阅读框设计引物；在目的片段的5’端和3’端设计内切酶，测序检测是IGF2b基因后，用 BamHI和NheI双酶切含有IGF2b基因的PCR回收产物及载体pLenti6.3- IRES-EGFP，然后回收酶切后的载体pLenti6.3- IRES-EGFP及IGF2b基因片段；将酶切回收的IGF2b基因片段与pLenti6.3- IRES-EGFP连接，获得含有IGF2b基因的慢病毒载体。

所述的鲤IGF2b基因开放阅读框的获得包括：从表达目的基因的鲤鱼组织中，用RT-PCR的方式从cDNA上扩增出IGF2b基因，并克隆到pMD-19Tsimple载体进行测序鉴定，其中所用上下游引物如下：上游引物：

5'-->3' GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA；下游引物：5'-->3' CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；在目的序列的5'端添加BamHI酶切位点，3'端添加NheI酶切位点。

本发明的有益效果为：含有鲤IGF2b基因的慢病毒载体的病毒液不仅能感染分裂细胞，且能转染终末分化细胞和非分裂细胞（如神经细胞、干细胞、肌纤维细胞、视网膜和肝细胞等），并且使整合于靶细胞基因组的目的基因能够长期、稳定表达，初期感染可观察绿色荧光来确定感染与否；是获取转基因鲤的一项关键技术，可在短期内确定具有目的基因的品系，缩短鱼类育种时间。

具体实施方式

1、获取鲤的肝脏组织，提取RNA，后反转录为cDNA，根据基因库中公布的鲤IGF2b基因序列开放阅读框设计引物用RT-PCR的方式从cDNA上扩增出IGF2b基因，并克隆到pMD-19Tsimple载体进行测序鉴定；其中，所用上下游引物如下：

上游引物：

5'-->3' GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA；下游引物：

5'-->3' CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；

在目的序列的5'端添加BamHI酶切位点，3'端添加NheI酶切位点。

2、构建含有IGF-2基因的慢病毒表达载体pLenti6.3- IGF-2-IRES-EGFP：用 BamHI和NheI双酶切含有IGF2b基因的PCR回收产物及载体pLenti6.3- IRES-EGFP，回收酶切后的载体pLenti6.3- IRES-EGFP及IGF2b基因片段，将酶切回收的IGF2b基因片段与pLenti6.3- IRES-EGFP连接；取连接液转化DH5α感受态细胞，收集菌液，进行PCR、酶切、测序鉴定。

3、将含有IGF2b基因慢病毒表达载体与包装质粒共转293T细胞，进行该基因的慢病毒包装，收集病毒液后进行滴度测定，并用qPCR检测IGF2b基因的表达（所用引物见表1）。

 表1 ：qPCR检测IGF2b基因的表达的引物

 含有IGF2b基因的慢病毒载体感染293细胞，24小时后，经荧光显微镜观察，检测到了绿色荧光；用实时荧光定量PCR检测到了IGF2b基因的表达，对该慢病毒的滴度检测结果为5.54 ×10⁶，并发现与空白对照、与只含有绿色荧光的慢病毒对照相比，含有IGF2b基因的293细胞中，IGF2b基因表达量显著高于其他组。

慢病毒载体( lentiviral vector)是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能转染终末分化细胞和非分裂细胞（如神经细胞、干细胞、肌纤维细胞、视网膜和肝细胞等），整合于靶细胞基因组的目的基因能够长期、稳定表达。慢病毒载体常常用于研究基因表达的调控、转基因动物的制作。因此，本发明构建的含有IGF2b基因的慢病毒载体可用于研究鲤IGF2b基因的过表达及转IGF2b基因鲤的开发。

Claims (2)

1.一种含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取鲤的肝脏组织，提取RNA，后反转录为cDNA，根据基因库中公布的鲤IGF2b基因序列开放阅读框设计引物；

在目的片段的5’端和3’端设计内切酶，测序检测是IGF2b基因后，用 BamHI和NheI双酶切含有IGF2b基因的PCR回收产物及载体pLenti6.3- IRES-EGFP，然后回收酶切后的载体pLenti6.3- IRES-EGFP及IGF2b基因片段；

将酶切回收的IGF2b基因片段与pLenti6.3- IRES-EGFP连接，获得含有IGF2b基因的慢病毒载体。

2.根据权利要求1所述的含有IGF2b基因的慢病毒载体的构建方法，其特征在于，所述的鲤IGF2b基因开放阅读框的获得包括：从表达目的基因的鲤鱼组织中，用RT-PCR的方式从cDNA上扩增出IGF2b基因，并克隆到pMD-19Tsimple载体进行测序鉴定，其中所用上下游引物如下：上游引物：

5'-->3' GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA；下游引物：5'-->3' CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；在目的序列的5'端添加BamHI酶切位点，3'端添加NheI酶切位点。