CN113981006A - 一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法包括：进行目的基因启动子及基因序列的扩增及获得；根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建；进行携带所述重组质粒的慢病毒的构建；进行慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建。本发明提供的慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，简单易行可靠，传染效率高，可以利用慢病毒构建稳定表达外源基因的鱼类细胞或两栖类细胞系，避免繁琐的筛选工作，可广泛用于筛选药物所构建的细胞系，并能准确的判断候选化合物的生物学活性，具有广泛的应用前景。

Description

一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法。
背景技术
目前，慢病毒(Lentiviral vector)是以人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒介导的转基因技术是当代基因治疗与转基因技术研究的热点。慢病毒可利用其基因组两端具有自主整合功能的长末端重复序列(LTR)将携带的目的基因稳定整合在宿主细胞染色体上，从而实现外源基因的持续转录或表达。慢病毒具有传染细胞类型多、携带的外源性目的基因片段大(～10Kb)、免疫反应小等优点。并且慢病毒剔除了毒力基因，且被拆分为三个或四个质粒系统，分别为转移质粒(Transfer plasmid)、包装质粒(Packaging plasmid)与外膜蛋白质粒(Envelop plasmid)，极大地增强了病毒载体的安全性。利用慢病毒进行哺乳动物细胞、禽类动物细胞的基因修饰已经得到较为深入的研究。但迄今为止，现有技术中针对慢病毒传染鱼类细胞系及两栖类动物细胞系的相关研究尚未见报道。因此，亟需一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，以填补现有技术的空白。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中针对慢病毒传染鱼类细胞系及两栖类动物细胞系的相关研究尚未见报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法。
本发明是这样实现的，一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法包括以下步骤：
步骤一，进行目的基因启动子及基因序列的扩增及获得：通过PCR扩增技术分别合成ATG7启动子序列和LUC2基因序列；在ATG7启动子序列两侧加酶切位点SnaBI和NheI，在LUC2基因序列两侧加酶切位点EcoRI和BamHI；分别将合成的ATG7启动子序列和LUC2基因序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，分别获得正确的ATG7启动子序列和LUC2基因序列；
步骤二，根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建：利用SnaBI和NheI对携带ATG7启动子的PMD19-T-simple进行双酶切；将酶切产物亚克隆至同样经过双酶切的慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到PATG7-pLOV-eGFP载体；根据目的病毒全基因序列设计一对扩增LUC2基因的PCR特异性引物，对LUC2基因进行PCR扩增和双酶切，并将酶切产物亚克隆至PATG7-pLOV-eGFP载体中，得到重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP；
步骤三，进行携带所述重组质粒的慢病毒的构建：对构建得到的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP利用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒；采用脂质体传染的方法，将无内毒素的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP、包装质粒pSPAX2、pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同传染293T细胞；传染后48～72h收集含慢病毒的细胞培养上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒；
步骤四，进行慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建：将无血清基础培养基与Lipofectamine 2000按体积比20～25：1混合后静置5～10min；加入稀释好的慢病毒悬液共孵育10min后感染BHK-21细胞，置于培养箱中培养；吸弃培养基，加入新鲜的含有10％胎牛血清的基础培养基继续培养，并用含嘌呤霉素培养基进行筛选，即得慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系。
进一步，步骤一中，所述PCR扩增体系如下：1×PCR Buffer，1.5mmol·L-1的MgCl2，0.5mmol·L-1的dNTPs，0.35nmol·L-1的上、下游引物，1.2U的Taq DNA聚合酶，DNA模板20ng，总体积60μL。
进一步，步骤一中，所述PCR的扩增程序为：95℃变性55s，57℃退火55s，73℃延伸55s，30个循环；72℃延伸10min；将PCR产物于4℃保存备用。
进一步，步骤一中，所述ATG7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述LUC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步，步骤二中，所述进行双酶切后，通过回收启动子片段及酶切完的质粒片段得到酶切产物。
进一步，步骤三中，所述传染条件为：置于37℃的CO2孵箱中孵育过夜传染。
进一步，步骤四中，所述置于培养箱中培养，包括：
置于30～32℃培养箱中培养2h后，转至26～28℃培养箱中培养2h，再根据所培养细胞的最适生长温度转至20～25℃培养箱中培养2h。
进一步，步骤四中，所述鱼类细胞系，包括匙吻鲟鳍条细胞系、草鱼肾脏细胞系、草鱼卵巢细胞系、鲤鱼上皮瘤细胞系、锦鲤鳍条细胞系、鲫鱼脑组织细胞系、虹鳟鱼性腺细胞系、胖头鱥肌肉细胞系以及大鳞大马哈鱼胚胎系。
进一步，步骤四中，所述两栖类细胞系为大鲵肌肉细胞系。
本发明的另一目的在于提供一种所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法在分析确定鱼类和两栖类细胞系基因功能中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，简单易行可靠，传染效率高，可以利用慢病毒构建稳定表达外源基因的鱼类细胞或两栖类细胞系，避免繁琐的筛选工作，可广泛用于筛选药物所构建的细胞系，并能准确的判断候选化合物的生物学活性，具有广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的目的基因启动子及基因序列的扩增及获得方法流程图。
图3是本发明实施例提供的根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建方法流程图。
图4是本发明实施例提供的携带所述重组质粒的慢病毒的构建方法流程图。
图5是本发明实施例提供的慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法包括以下步骤：
S101，进行目的基因启动子及基因序列的扩增及获得；
S102，根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建；
S103，进行携带所述重组质粒的慢病毒的构建；
S104，进行慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建。
如图2所示，本发明实施例提供的步骤S101中，所述进行目的基因启动子及基因序列的扩增及获得，包括：
S201，通过PCR扩增技术分别合成ATG7启动子序列和LUC2基因序列；
S202，在ATG7启动子序列两侧加酶切位点SnaBI和NheI，在LUC2基因序列两侧加酶切位点EcoRI和BamHI；
S203，分别将合成的ATG7启动子序列和LUC2基因序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，分别获得正确的ATG7启动子序列和LUC2基因序列。
本发明实施例提供的PCR扩增体系如下：1×PCR Buffer，1.5mmol·L-1的MgCl2，0.5mmol·L-1的dNTPs，0.35nmol·L-1的上、下游引物，1.2U的Taq DNA聚合酶，DNA模板20ng，总体积60μL。
本发明实施例提供的PCR的扩增程序为：95℃变性55s，57℃退火55s，73℃延伸55s，30个循环；72℃延伸10min；将PCR产物于4℃保存备用。
本发明实施例提供的ATG7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述LUC2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
如图3所示，本发明实施例提供的步骤S102中，所述根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建，包括：
S301，利用SnaBI和NheI对携带ATG7启动子的PMD19-T-simple进行双酶切；
S302，将酶切产物亚克隆至同样经过双酶切的慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到PATG7-pLOV-eGFP载体；
S303，根据目的病毒全基因序列设计一对扩增LUC2基因的PCR特异性引物，对LUC2基因进行PCR扩增和双酶切，并将酶切产物亚克隆至PATG7-pLOV-eGFP载体中，得到重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP。
本发明实施例提供的进行双酶切后，通过回收启动子片段及酶切完的质粒片段得到酶切产物。
如图4所示，本发明实施例提供的步骤S103中，所述进行携带所述重组质粒的慢病毒的构建，包括：
S401，对构建得到的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP利用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒；
S402，采用脂质体传染的方法，将无内毒素的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP、包装质粒pSPAX2、pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同传染293T细胞；
S403，传染后48～72h收集含慢病毒的细胞培养上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒。
本发明实施例提供的传染条件为：置于37℃的CO2孵箱中孵育过夜传染。
如图5所示，本发明实施例提供的步骤S104中，所述进行慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建，包括：
S501，将无血清基础培养基与Lipofectamine 2000按体积比20～25：1混合后静置5～10min；
S502，加入稀释好的慢病毒悬液共孵育10min后感染BHK-21细胞，置于培养箱中培养；
S503，吸弃培养基，加入新鲜的含有10％胎牛血清的基础培养基继续培养，并用含嘌呤霉素培养基进行筛选，即得慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系。
本发明实施例提供的置于培养箱中培养，包括：置于30～32℃培养箱中培养2h后，转至26～28℃培养箱中培养2h，再根据所培养细胞的最适生长温度转至20～25℃培养箱中培养2h。
本发明实施例提供的鱼类细胞系，包括匙吻鲟鳍条细胞系、草鱼肾脏细胞系、草鱼卵巢细胞系、鲤鱼上皮瘤细胞系、锦鲤鳍条细胞系、鲫鱼脑组织细胞系、虹鳟鱼性腺细胞系、胖头鱥肌肉细胞系以及大鳞大马哈鱼胚胎系。
本发明实施例提供的两栖类细胞系为大鲵肌肉细胞系。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法包括以下步骤：
步骤一，进行目的基因启动子及基因序列的扩增及获得：通过PCR扩增技术分别合成ATG7启动子序列和LUC2基因序列；在ATG7启动子序列两侧加酶切位点SnaBI和NheI，在LUC2基因序列两侧加酶切位点EcoRI和BamHI；分别将合成的ATG7启动子序列和LUC2基因序列克隆进入PMD19-T-simple，筛选阳性克隆并测序，分别获得正确的ATG7启动子序列和LUC2基因序列；
步骤二，根据扩增获得的目的基因启动子及基因序列进行重组质粒的构建：利用SnaBI和NheI对携带ATG7启动子的PMD19-T-simple进行双酶切；将酶切产物亚克隆至同样经过双酶切的慢病毒表达系统pLOV-eGFP载体中，得到PATG7-pLOV-eGFP载体；根据目的病毒全基因序列设计一对扩增LUC2基因的PCR特异性引物，对LUC2基因进行PCR扩增和双酶切，并将酶切产物亚克隆至PATG7-pLOV-eGFP载体中，得到重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP；
步骤三，进行携带所述重组质粒的慢病毒的构建：对构建得到的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP利用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒；采用脂质体传染的方法，将无内毒素的重组质粒PATG7-LUC2-pLOV-eGFP、包装质粒pSPAX2、pLP1、pLP2和pLP/VSVG共同传染293T细胞；传染后48～72h收集含慢病毒的细胞培养上清液，去除细胞碎片，收集包装好的慢病毒；
步骤四，进行慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的构建：将无血清基础培养基与Lipofectamine 2000按体积比20～25：1混合后静置5～10min；加入稀释好的慢病毒悬液共孵育10min后感染BHK-21细胞，置于培养箱中培养；吸弃培养基，加入新鲜的含有10％胎牛血清的基础培养基继续培养，并用含嘌呤霉素培养基进行筛选，即得慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系。
2.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR扩增体系如下：1×PCR Buffer，1.5mmol·L-1的MgCl2，0.5mmol·L-1的dNTPs，0.35nmol·L-1的上、下游引物，1.2U的Taq DNA聚合酶，DNA模板20ng，总体积60μL。
3.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤一中，所述PCR的扩增程序为：95℃变性55s，57℃退火55s，73℃延伸55s，30个循环；72℃延伸10min；将PCR产物于4℃保存备用。
4.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤一中，所述ATG7启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述LUC2基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
5.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤二中，所述进行双酶切后，通过回收启动子片段及酶切完的质粒片段得到酶切产物。
6.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤三中，所述传染条件为：置于37℃的CO2孵箱中孵育过夜传染。
7.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤四中，所述置于培养箱中培养，包括：
置于30～32℃培养箱中培养2h后，转至26～28℃培养箱中培养2h，再根据所培养细胞的最适生长温度转至20～25℃培养箱中培养2h。
8.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤四中，所述鱼类细胞系，包括匙吻鲟鳍条细胞系、草鱼肾脏细胞系、草鱼卵巢细胞系、鲤鱼上皮瘤细胞系、锦鲤鳍条细胞系、鲫鱼脑组织细胞系、虹鳟鱼性腺细胞系、胖头鱥肌肉细胞系以及大鳞大马哈鱼胚胎系。
9.如权利要求1所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法，其特征在于，步骤四中，所述两栖类细胞系为大鲵肌肉细胞系。
10.一种如权利要求1～9任意一项所述慢病毒传染鱼类或两栖类细胞系的方法在分析确定鱼类和两栖类细胞系基因功能中的应用。
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