CN107190022B - 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，属于冠状病毒反向遗传技术领域。所述构建方法包括：以BAC载体为骨架，运用体外同源重组技术，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建，将构建的重组质粒直接转染细胞，在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装，将细胞与培养基的混合液接种SPF鸡胚并传代，获得禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。该构建方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传株具有传代稳定性，为体外研究病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有效的工具；本发明利用5’添加的CMV启动子，在细胞内进行转录，利用3’添加的HDVR序列，大大提高了病毒的拯救效率。

Description

一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
技术领域
本发明涉及冠状病毒反向遗传技术领域，具体涉及一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法。
背景技术
禽传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB)是危害养禽业的重大传染病之一，它是由禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种高度接触性传染病，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋量下降、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。IBV在全球流行，并且由于不同IBV毒株在致病性和组织嗜性上差异大，血清型极其复杂，不同的血清型之间缺乏有效的交叉保护，加上新的变异株不断出现，导致IBV的防控非常困难。
IB的病原IBV属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属中的γ属冠状病毒的成员。病毒粒子略呈球形，有的呈多形性，直径约为80-120nm。基因组为不分节段的单股正链RNA，与核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)结合形成螺旋状的核衣壳；其外包裹一层由膜蛋白(Membrane,M)构成的囊膜；小分子蛋白(Envelope,E)镶嵌于囊膜中；由S1和S2两个亚基组成的梨状的纤突蛋白(Spike,S)在囊膜中铆定并伸展形成突起。IBV的基因组RNA全长27000nt左右，编码结构蛋白、非结构蛋白和一些附属蛋白。
反向遗传操作技术(reverse genetics)，即病毒的全长感染性cDNA克隆技术，包括病毒基因组全长cDNA克隆构建技术和由cDNA转录病毒RNA的感染性转录本制备技术，能在病毒DNA水平上对其进行人工操作，解决了RNA病毒基因组难以操作的难题。基于构建病毒基因组全长cDNA感染性克隆的反向遗传方法成为研究冠状病毒分子生物学的一个有效的工具。借助感染性克隆在体外对冠状病毒的基因组进行基因敲除、定点诱变等人工操作，可深入了解病毒生命活动过程中各种基因的调控作用，以及病毒的致病机理。
但是目前仍然存在一些问题阻碍了冠状病毒全长感染性cDNA克隆的构建，例如冠状病毒的基因组是目前已知的RNA病毒中最大的(27-32kb)，常规技术很难操作、一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性、在体外得到的转录本具有异质性等。获得基因组cDNA全长片段克隆是病毒拯救技术的关键环节，大多数研究者均采取分段克隆的策略，为了避免病毒序列在细菌中的不稳定问题，研究者通常扩增小片段(2K-3K)，通过小片段连接成大片段(5K-7K)，制备大量的大片段模板，最后将大片段通过酶切连接的方法得到全长cDNA克隆。
如《鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建术》公开了一种构建IBV感染性克隆的方法，具体公开：利用酶切连接获得病毒基因组全长cDNA，通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA，转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。但该方法酶切位点选取限制较多，而且体外将多个大片段进行连接效率较低，获得病毒基因组全长cDNA非常困难。此外利用添加的T7启动子，进行体外转录获得的转录本具有异质性，病毒拯救效率较低。整个过程不仅操作步骤麻烦，而且耗时较长，成功率不高。
发明内容
本发明旨在建立一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，克服了现有技术中冠状病毒部分复制酶基因cDNA克隆在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统的酶切连接效率较低的问题，克服了体外转录导致的转录本异质性的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，包括以下步骤：
(1)根据禽传染性支气管炎病毒基因组序列以及BAC载体多克隆位点，设计n对含有同源臂的引物，以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，分别扩增出基因组序列的n个片段，命名为f1、F2、…Fn-1、fn，n为偶数，n≥4，其中F2～Fn-1的首尾部分序列与相邻片段重复；利用体外同源重组技术，分别将上述扩增片段克隆到BAC载体上，获得亚克隆载体pBAC-f1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、pBAC-fn；
(2)以含有巨细胞病毒启动子序列的质粒为模板，扩增得到含有同源臂的CMV序列，利用体外同源重组技术，将其融合到pBAC-f1基因组序列的5’端，获得亚克隆载体pBAC-F1；
(3)克隆丁型肝炎核酶序列和牛生长激素聚腺苷酸化信号序列，融合PCR获得HB序列；以所述HB序列为模板，扩增得到含有同源臂的HB序列，利用体外同源重组技术，将HB序列融合到pBAC-fn基因组序列的3’端，获得亚克隆载体pBAC-Fn；
(4)将pBAC-F1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、pBAC-Fn依次两两配对，每对中，取其中一个亚克隆载体作为模板，扩增出含有同源臂的目的片段，利用体外同源重组技术，将目的片段融合到另一个亚克隆载体上，获得相邻两片段融合的亚克隆载体pBAC-F1F2、…pBAC-Fn-1Fn；
(5)再按照步骤(4)的方法，将相邻的两个亚克隆载体进行融合，重复若干次，获得包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA的克隆载体pBAC-IBV；
(6)将克隆载体pBAC-IBV转染细胞，培养、收集培养基及细胞混合物，反复冻融，获得P0代拯救毒；
(7)将P0代拯救毒接种SPF鸡胚，传代、获得所述禽传染性支气管炎病毒反向遗传株
本发明采用分段克隆方式，将大片段的基因组序列进行拆分，由于相邻片段之间具有重复序列，利用同源重组，将相邻片段进行拼接，完成基因组全序列的克隆，该方法操作简单，阳性克隆率高。
另外，本发明采用BAC载体进行IBV的拯救，BAC载体具有大容量、低拷贝并且复制严谨性高的优点，能够保证IBV的大片段基因组序列在细菌中稳定保存。作为优选，所述BAC载体为pBeloBAC11。
本发明采用细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装。因此，在基因组cDNA序列5’端前添加巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子序列。本发明在克隆载体基因组序列的3’端添加HDVR序列，发挥剪切功能，获得精确的3’末端，大大提高了病毒的拯救效率。
由于病毒基因组5’UTR和3’UTR较难扩增，因此，本发明设计引物单独对这两个片段进行扩增。作为优选，步骤(1)中，所述f1包括5’UTR区段和基因编码段f1’，所述pBAC-f1分两步构建，包括：
(a)以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，扩增得到含有同源臂的基因编码段f1’，利用体外同源重组技术，将其克隆到BAC载体上，获得重组载体pBAC-f1’；
(b)以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，扩增得到含有同源臂的5’UTR区段，利用体外同源重组技术，将其融合到重组载体pBAC-f1’基因编码段f1’的5’端处，获得pBAC-f1。
步骤(1)中，所述fn包括3’UTR区段和基因编码段fn’，所述pBAC-fn分两步构建，包括：
(ⅰ)以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，扩增得到含有同源臂的基因编码段fn’，利用体外同源重组技术，将其克隆到BAC载体上，获得重组载体pBAC-fn’；
(ⅱ)以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，扩增得到含有同源臂的3’UTR区段，利用体外同源重组技术，将其融合到重组载体pBAC-fn’基因编码段fn’的3’端处，获得pBAC-fn。
步骤(ⅱ)中，扩增采用的下游引物除了含有同源臂，其5’端还含有30个T的poly(T)序列。
为了方便后续病毒拯救株的筛选鉴定，本发明在基因序列上引入定点突变。步骤(1)中，选择pBAC-f1、pBAC-F2、...pBAC-Fn-1、pBAC-fn中任意一个亚克隆载体为模板，设计定点突变引物，进行点突变PCR，获得具有拯救标记的亚克隆载体。
作为优选，步骤(6)中，所述细胞为BHK-21细胞。
作为优选，步骤(7)中，传代为盲传3～5代。
具体地，本发明提供了一种构建鸡传染性支气管炎病毒IBV H120反向遗传株的方法，包括：
(1)将IBV H120基因组编码区域分四段进行扩增，获得含有同源臂的片段，将四片段分别与经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切的载体BAC同源重组，初步完成四片段亚克隆载体的构建。
对第一个亚克隆载体上BamHI酶切位点进行沉默突变(A5472C)并作为拯救标记，其引物为：上游引物：5’-TATTGTTGGCTCCAGTGTTGTTACTACA-3’，下游引物为：5’-AACACTGGAGCCAACAATAGCTTTCTTA-3’。
基因组5’UTR和3’UTR单独扩增，将第一个亚克隆载体和第四个亚克隆载体分别用BamHI和XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，分别与PCR扩增的5’UTR和3’UTR同源重组。
由此，获得覆盖基因组全长的四片段亚克隆载体，分别为pBAC-f1、pBAC-F2、pBAC-F3、pBAC-f4。
(2)扩增含有同源臂的CMV序列，将第一个亚克隆载体pBAC-f1用BamHI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将CMV序列添加到第一个亚克隆载体基因组序列之前，获得改造的亚克隆载体pBAC-F1。
扩增HDVR、BGH序列，将两个基因经融合PCR得到HB序列，设计含有同源臂的引物，扩增含有同源臂的HB序列，将第四个亚克隆载体pBAC-f4用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将HB序列添加到第四个亚克隆载体基因组序列之后，获得改造的亚克隆载体pBAC-F4。
由此，完成四片段亚克隆载体的改造。
(3)首先扩增含有同源臂的F2、F4片段，将第一个亚克隆载体pBAC-F1和第三个亚克隆载体pBAC-F3分别用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；然后利用同源重组策略，将F2片段融合到第一个亚克隆载体F1片段之后，将F4片段融合到第三个亚克隆载体F3片段之后；将四片段中相邻两片段两两融合，完成两个半分子亚克隆载体的构建，分别为pBAC-F1F2、pBAC-F3F4。
(4)扩增含有同源臂的F34片段，将含有F12片段的半分子亚克隆载体pBAC-F1F2用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；利用同源重组的策略，将F34片段融合到F12片段之后；将两个半分子片段融合，最终获得IBV H120基因组全长克隆重组质粒。
(5)将步骤(4)构建的含有H120病毒基因组全长cDNA克隆重组质粒转染BHK-21细胞，细胞置于37℃的培养箱中培养48h后，收获培养基及细胞混合物，反复冻融3次，命名为R-H120-A5472C P0代拯救毒。将P0代拯救毒无菌过滤后接种10日龄SPF鸡胚，3天后收获鸡胚尿囊液，盲传3代，最终获得鸡传染性支气管炎病毒H120反向遗传疫苗株R-H120-A5472C。
本发明采用的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120可以为商品化疫苗株。
本发明还提供了由上述方法制备得到的鸡传染性支气管炎病毒H120反向遗传疫苗株R-H120-A5472C。本发明研究证明，该疫苗株具有良好的鸡胚传代稳定性；接种SPF鸡胚表现出感染IBV的典型症状，发育迟缓、矮小、蜷缩。
本发明具备的有益效果：
(1)本发明以BAC载体为骨架，运用体外同源重组技术，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建，将构建的重组质粒直接转染细胞，在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装，将细胞与培养基的混合液接种SPF鸡胚并传代，获得禽传染性支气管炎病毒反向遗传疫苗株。该构建方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传疫苗株具有传代稳定性，为体外研究病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有效的工具。
(2)本发明将含有病毒基因组全长cDNA的重组质粒直接转染细胞，利用5’添加的CMV启动子，在细胞内进行转录，利用3’添加的HDVR序列，发挥剪切功能，获得精确的3’末端，大大提高了病毒的拯救效率。
(3)本发明的构建方法同样适用于其他种属冠状病毒的拯救，为冠状病毒的研究提供了一个切实有效的工具，对于加快冠状病毒的致病机理以及疫苗的开发具有重要的意义。
附图说明
图1为基于BAC载体的IBV H120 cDNA全长质粒构建策略。分析IBV H120基因组全长序列，计划采用分段克隆的方式，将全基因组分为四个片段进行扩增并最终获得病毒基因组全长cDNA，并在基因组cDNA序列5’UTR前添加CMV启动子序列；3’UTR序列末端添加含有30个A的poly(A)结构；poly(A)结构后添加HDVR序列和BGH序列即为HB序列；将病毒基因组上的BamHI酶切位点进行沉默突变(5472位的A突变为C)并作为拯救标记。基因组全长cDNA序列插入到pBeloBAC11质粒多克隆位点中的BamHI和XhoI位点之间。
图2为IBV H120基因组cDNA分四片段PCR扩增结果。
图3为基于BAC载体的IBV H120 cDNA全长质粒构建步骤。首先将病毒基因组cDNA四片段定向克隆到复制严谨性较高的低拷贝载体pBeloBAC11上，初步完成四片段亚克隆载体的构建。然后对第一个亚克隆载体上BamHI酶切位点进行沉默突变(A5472C)并作为拯救标记；将病毒基因组5’UTR、3’UTR单独扩增后分别融合到第一个和第四个亚克隆载体上，完成覆盖全长的四片段亚克隆载体的构建。然后扩增含有同源臂的CMV序列并融合到第一个亚克隆载体基因组序列之前；扩增含有同源臂的HB序列并融合到第四个亚克隆载体基因组序列之后，完成四片段亚克隆载体改造。在获得覆盖全长四片段亚克隆载体的基础上，将四片段中相邻两片段两两融合，完成两个半分子亚克隆载体的构建。最后利用同源重组的策略，将两个半分子片段融合，完成包含病毒基因组全长cDNA克隆载体的构建。
图4为包含IBV H120基因组全长cDNA重组质粒双酶切结果，其中M：λ-HindⅢdigest DNA Marker；1，2：pBAC-IBV-H120FL，pBeloBAC11质粒分别用BamHI和XhoI双酶切。
图5为重组质粒转染BHK-21细胞。
图6为拯救病毒感染鸡胚的病变。
图7为IBV H120拯救毒拯救标记鉴定结果，其中A为RT-PCR扩增拯救后传代毒拯救标记片段的凝胶电泳图，B为测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明所用鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120由本实验室毒种库保存；使用的传代细胞BHK-21由本实验室细胞库保存。
克隆载体pBeloBAC11和大肠杆菌DH10B株均为浙江大学动物科学学院黄耀伟教授惠赠。
RNA抽提试剂、PCR高保真酶、同源重组试剂盒、定点突变试剂盒购自Vazyme公司，反转录试剂盒购自Thermo公司，限制性内切酶BamHI、XhoI购自takara公司，转染试剂jetPRIME购自达科为生物技术有限公司。
引物由生工生物工程股份有限公司合成，序列测定由铂尚生物技术有限公完成。
一、IBV H120基因组全长cDNA构建策略：
根据本实验室保存并测定的IBV疫苗株H120基因组全序列，利用PrimerPremier5.0进行酶切位点分析，计划将全基因组分为四个片段进行扩增并最终获得基因组全长cDNA，在基因组cDNA序列5’UTR前添加巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子序列；3’UTR序列末端添加含有30个A的poly(A)结构；poly(A)结构后添加丁型肝炎核酶(Hepatitis Delta Virus Ribozyme,HDVR)序列和牛生长激素聚腺苷酸化信号序列(Bovine Growth Hormone Polyadenylation Signal,BGH)，两个序列合并，简称为HB序列；将病毒基因组BamHI酶切位点进行沉默突变(5472位的A突变为C)并作为拯救标记。整个全基因组序列插入到pBeloBAC11质粒多克隆位点中的BamHI和XhoI酶切位点之间，构建策略见图1。
IBV H120基因组全长cDNA构建包括以下四步骤：
1、IBV H120 cDNA四片段亚克隆载体的构建与鉴定：
根据病毒基因组序列中所含有的特异酶切位点分析结果，将病毒全基因组分为四个片段，设计含有同源臂的引物，以病毒基因组反转录产物cDNA为模板，按照确立的PCR反应条件用高保真酶进行扩增长片段f1、F2、F3和f4，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测显示与预期大小一致见图2。
利用PCR扩增序列与线性化载体上的同源臂，用同源重组法将各片段克隆到复制严谨性较高的低拷贝载体pBeloBAC11上，完成四片段亚克隆载体pBeloBAC11-f1、pBeloBAC11-F2、pBeloBAC11-F3和pBeloBAC11-f4的构建。对第一个亚克隆载体pBeloBAC11-f1上BamHI酶切位点进行沉默突变(5472位的A突变为C)并作为拯救标记。
对于较难扩增的5’UTR、3’UTR片段，设计含有同源臂的引物单独扩增，同时将pBeloBAC11-f1和pBeloBAC11-f4载体分别用BamHI和XhoI限制酶酶切用来制备线性化载体，运用同源重组的方法将5’UTR融合到pBeloBAC11-f1载体上，将3’UTR融合到pBeloBAC11-f4载体上，完成亚克隆载体pBeloBAC11-F1和pBeloBAC11-F4的构建。
构建策略见图3，引物设计如表1。测序结果表明成功获得了覆盖H120基因组全长cDNA的四片段亚克隆载体。
表1 f1、F2、F3和f4片段扩增和BamHI酶切位点突变以及5’UTR和3’UTR扩增引物
Figure BDA0001334990100000071
Figure BDA0001334990100000081
注：“agctcggtacccggggatcc”等其他引物中的类似序列为同源臂序列。
2、IBV H120 cDNA四片段亚克隆载体的改造与鉴定：
从pcDNA3.0上扩增含有同源臂的CMV启动子序列，运用同源重组的方法添加到第一个亚克隆载体基因组序列之前，构建载体pBeloBAC11-F1(CMV)。
含有84个核苷酸的HDVR序列通过设计两条含有重叠序列的引物退火结合，并以此为模板进行PCR扩增获得。从pcDNA3.0上扩增含有同源臂的BGH序列，将HDVR和BGH两个基因经融合PCR得到HB序列。扩增含有同源臂的HB序列，运用同源重组的方法将其添加到第四个亚克隆载体基因组序列之后，构建载体pBeloBAC11-F4(HB)。
载体改造策略见图3，引物设计如表2。测序结果表明成功对四片段亚克隆载体进行了改造。
表2 CMV、BGH、HDVR序列PCR扩增
Figure BDA0001334990100000082
3、IBV H120 cDNA半分子亚克隆载体的构建：
半分子亚克隆载体构建在获得覆盖全长四片段亚克隆载体并完成必要元件的添加与改造的基础上，扩增F2片段，与pBeloBAC11-F1(CMV)用XhoI酶切后得到的线性化载体同源重组反应；扩增F4(HB)片段，与pBeloBAC11-F3用XhoI酶切后得到的线性化载体同源重组反应，将四片段中相邻两片段两两融合，完成两个半分子亚克隆载体pBeloBAC11-F12(CMV)、pBeloBAC11-F34(HB)的构建，构建策略见图3，引物设计如表3。测序结果表明成功完成了包含H120基因组全长cDNA的两个半分子亚克隆载体的构建。
表3 F2和F4(HB)片段PCR扩增引物
Figure BDA0001334990100000091
4、IBV H120基因组全长cDNA克隆载体的构建：
全长克隆载体构建在获得两个半分子亚克隆载体的基础上，扩增F34(HB)片段，与pBeloBAC11-F12(CMV)用XhoI酶切后得到的线性化载体同源重组反应，利用同源重组的策略，将两个半分子片段融合，最终获得冠状病毒基因组cDNA全长克隆载体，构建策略见图3，引物设计如表4。重组全长质粒命名为pBAC-IBV-H120FL，对重组质粒用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切，将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，条带数量与各条带大小与预期一致，见图4。测序结果表明成功完成了包含H120基因组全长cDNA克隆载体的构建。
表4 F34(HB)片段扩增引物
Figure BDA0001334990100000092
二、H120基因组cDNA全长的重组质粒转染BHK-21细胞与接种鸡胚：
将重组质粒pBAC-IBV-H120FL直接转染BHK-21细胞，培养48h后，显微镜下观察细胞，与未转染质粒的阴性对照组相比，发现转染细胞出现轻微圆缩和老化现象，见图5。收获培养基及细胞混合物，反复冻融3次，取上清并命名为R-H120-A5472C P0代拯救毒。
将P0代拯救毒无菌过滤后接种10日龄SPF鸡胚，3天后收获鸡胚尿囊液，盲传3代，在鸡胚传代过程中发现每代中均有鸡胚死亡现象。在接种了H120拯救株的第三代SPF鸡胚表现出IBV感染的典型侏儒胚病变，即胚体发育迟缓、矮小、蜷缩，见图6。
三、拯救病毒拯救标记的鉴定：
为了排除野生型毒株污染的问题，我们将P0代拯救毒和接种鸡胚盲传三代收获的鸡胚尿囊液(F1-F3)抽提RNA，用反转录试剂盒进行反转录反应得到病毒cDNA。根据IBVH120的序列，在引入的拯救标记前后设计引物，上游引物为：AAAAGCGCCAGTCTACTACCC，下游引物为：GGACCACATAAAGAACCCTCA，扩增病毒基因组5211～5831bp之间的大小为621bp的片段，均获得与目的基因大小一致的条带，但是P0代条带较弱，见图7。将扩增的片段构建到pMD-18T载体上并进行测序分析，结果显示扩增的产物均含有引入的沉默突变(A突变为C)，见图7，表明我们获得了正确的反向遗传株R-H120-A5472C，而非野生型毒株污染。
四、拯救病毒生物学特性鉴定：
将拯救毒在鸡胚中盲传5代后，测感染鸡胚尿囊液中的EID50，同时与在鸡胚中盲传相同代次野生毒比较。发现拯救毒的EID50与野生毒的EID50非常接近。用Real-time PCR检测也发现拯救毒与野生毒M基因的拷贝数相似。表明拯救毒与野生毒具有类似的生长特性。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
<130>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
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agctcggtac ccggggatcc gattatgttt ctgacgcac 39
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agctcggtac ccggggatcc acttaagata gatattaata ta 42
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tcaagcttgc atgcctcgag tttttttttt tttttttttt tttttttttt gctctaactc 60
t 61
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tatttatatc acacttaagt acggttcact aaacgagc 38
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tagagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaggcc ggcatggtcc cagc 54
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ggtttctatt tctggctct 19
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gattatgttt ctgacgcac 19
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ttatgatctc ctcaagtatg 20
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tcaagcttgc atgcctcgag ccaccgcatc cccagcat 38
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ggaccacata aagaaccctc a 21

Claims (1)

1.一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，所述禽传染性支气管炎病毒为IBV H120，所述方法包括以下步骤：
(1)将IBV H120基因组编码区域分四段进行扩增，获得含有同源臂的片段，其引物分别为：
f1-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCCTTGTTTTGCCGTGTCTC-3’，
f1-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGATGCCTGTTACTGCGTGC-3’；
F2-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCGGTTTCTATTTCTGGCTCT-3’，
F2-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGTCACTACAGTCACGGCAG-3’；
F3-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCTTATGATCTCCTCAAGTATG-3’，
F3-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAG AATCCTGTGCAATGTCATA-3’；
f4-F：5’-AGCTCGGTACCCGGGGATCCGATTATGTTTCTGACGCAC-3’，
f4-R：5’-TCAAGCTTGCATGCCTCGAGAGACAGATTAGACATTTCCC-3’；
将四片段分别与经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切的载体BAC同源重组，初步完成四片段亚克隆载体的构建；
对第一个亚克隆载体上BamHI酶切位点进行沉默突变并作为拯救标记，其引物为：上游引物：5’-TATTGTTGGCTCCAGTGTTGTTACTACA-3’，下游引物为：5’-AACACTGGAGCCAACAATAGCTTTCTTA-3’；
基因组5’UTR和3’UTR单独扩增，将第一个亚克隆载体和第四个亚克隆载体分别用BamHI和XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，分别与PCR扩增的5’UTR和3’UTR同源重组；
由此，获得覆盖基因组全长的四片段亚克隆载体，分别为pBAC-f1、pBAC-F2、pBAC-F3、pBAC-f4；
(2)扩增含有同源臂的CMV序列，将第一个亚克隆载体pBAC-f1用BamHI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将CMV序列添加到第一个亚克隆载体基因组序列之前，获得改造的亚克隆载体pBAC-F1；
扩增HDVR、BGH序列，将两个基因经融合PCR得到HB序列，设计含有同源臂的引物，扩增含有同源臂的HB序列，将第四个亚克隆载体pBAC-f4用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体，运用同源重组的方法将HB序列添加到第四个亚克隆载体基因组序列之后，获得改造的亚克隆载体pBAC-F4；
由此，完成四片段亚克隆载体的改造；
(3)首先扩增含有同源臂的F2、F4片段，将第一个亚克隆载体pBAC-F1和第三个亚克隆载体pBAC-F3分别用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；然后利用同源重组策略，将F2片段融合到第一个亚克隆载体F1片段之后，将F4片段融合到第三个亚克隆载体F3片段之后；将四片段中相邻两片段两两融合，完成两个半分子亚克隆载体的构建，分别为pBAC-F1F2、pBAC-F3F4；
(4)扩增含有同源臂的F34片段，将含有F12片段的半分子亚克隆载体pBAC-F1F2用XhoI限制酶酶切后制备线性化载体；利用同源重组的策略，将F34片段融合到F12片段之后；将两个半分子片段融合，最终获得IBV H120基因组全长克隆重组质粒；
(5)将步骤(4)构建的含有H120病毒基因组全长cDNA克隆重组质粒转染BHK-21细胞，细胞置于37℃的培养箱中培养48h后，收获培养基及细胞混合物，反复冻融3次，得到P0代拯救毒，将P0代拯救毒无菌过滤后接种10日龄SPF鸡胚，3天后收获鸡胚尿囊液，盲传3代，最终获得鸡传染性支气管炎病毒H120反向遗传疫苗株。
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