CN107779474A - 一个表达乳头瘤病毒hpv16的e6和e7自剪切慢病毒载体 - Google Patents

一个表达乳头瘤病毒hpv16的e6和e7自剪切慢病毒载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达HPV16的E6蛋白和E7蛋白的自剪切慢病毒载体及其制备与应用，本发明构建的慢病毒载体系统能协同表达自剪切的HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白以及绿色荧光蛋白，驱动HPV16病毒E6基因和E7基因在细胞中高效表达，荧光蛋白的表达可对所表达的HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白进行准确定位，同时，荧光蛋白的表达还可用于准确监测慢病毒包装效果。本发明构建的慢病毒载体系统表达的HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白可以在细胞内发生自剪切，不影响其蛋白的功能，可用于HPV16病毒关键蛋白致癌发生的分子机制研究。

Description

一个表达乳头瘤病毒HPV16的E6和E7自剪切慢病毒载体
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达HPV16的E6蛋白和E7蛋白的自剪切慢病毒载体及其制备与应用。
背景技术
HPV16病毒属于人乳头状瘤病毒，它是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，是双链闭环的小DNA病毒，其中包括8个早期开放读码框架（E1-E8）、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6基因和E7基因对细胞生长刺激最为重要，E6基因和E7基因编码的对应的E6蛋白和E7蛋白可引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。
Furin蛋白酶是一种广泛参与前体蛋白切割的内切蛋白酶， 弗林蛋白底物包括凝血因子，血清蛋白和生长因子受体等，如胰岛素样生长因子受体。 该蛋白酶最小切割位点是Arg-X-X-Arg，然而，酶优选位点为Arg-X-（Lys / Arg）-Arg，本发明中所用的Furin序列为RRKR。
口蹄疫病毒（FMDV）隶属于一种能表达单一和较长的多聚蛋白框架的小RNA病毒科，它表达的多聚蛋白大小约为225KD。该全长翻译产物能在2A区域的C末端发生快速的分子内剪切，即在衣壳蛋白前体P1-2A-2B-2C-P3中的P1-2A和2B-2C-P3的复制结构域之间进行剪切。在各种2A和2A类似序列中，口蹄疫病毒2A特别短，只有16-20个氨基酸大小。该2A序列显示其具有一种独特的，不依赖酶的方式在它自己的C末端介导剪切，且该活性可以在非FMDV多聚蛋白的环境中发挥作用，同时FMDV的2A序列上游和下游部分可以被不同的基因完全替换。但是2A序列对于多聚蛋白的表达可能也不是最佳的选择，因为2A序列的断裂部位是在它C端的Gly(G)和Pro(P)之间，会导致残留的2A部分肽段序列位于第一个表达蛋白的C端，与此同时，在第二种蛋白的N端会残留一个Pro(P)，这些肽段或氨基酸的残留可能会影响相应蛋白的活性。尽管有影响靶蛋白活性的风险，但是与IRES相比，2A仍然具有明显的优势。当前对FMDV2A介导的蛋白协同表达机制还不是很清楚，但却因为它的优势而得到较广泛的运用。FMDV2A介导的蛋白协同表达机制可能是（1）它是一种普遍存在的与核糖体相关的蛋白酶识别位点；（2）它是一种全新的，比较短的不依赖酶的蛋白剪切元件；（3）它是一种在蛋白合成的连续翻译过程中扰乱肽键形成的一个序列。一些研究表明2A介导的蛋白协同翻译过程不是酶切过程，而是通过核糖体的跳跃从而导致2A蛋白与其下游产物之间的不连续翻译。因为FMDV2A序列片段短，所以它特别适用于多聚蛋白的表达，它可以驱动只有一套启动子和终止子的阅读框中进行多聚蛋白的协同表达，而且，迄今为止已有多个FMDV2A介导的多聚蛋白协同表达成功的报道。
为实现HPV16病毒的E6蛋白、E7蛋白以及荧光蛋白能协同表达，从而有效地同时发挥E6蛋白和E7蛋白的生物学功能，并使荧光蛋白能对E6蛋白和E7蛋白效应部位进行准确定位。本专利旨在建立一种慢病毒介导的能高效表达自剪切的E6蛋白和E7蛋白以发挥其生物学功能，并能对E6和E7进行精确定位表达系统。
发明内容
本发明目的在于提供一种自剪切表达HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统及其制备与应用，此慢病毒载体系统同时还可在细胞中高效协同表达绿色荧光蛋白。
本发明公开了一种能协同自剪切表达HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白的慢病毒表达载体系统，是将PHR质粒、VSVG质粒和表达载体共转入HEK293T细胞，即在HEK293T细胞中包装获得慢病毒；所述的表达载体为pCDH-CMV-E6-Furin- FMDV2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro；所述的慢病毒载体系统是一种CMV启动子驱动表达自剪切E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统。
所述的慢病毒载体系统是利用CMV启动子驱动E6蛋白和E7蛋白以及荧光蛋白协同表达，其出发载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体。
所述的表达载体能协同表达能自我剪切的E6蛋白和E7蛋白以及绿色荧光蛋白，该慢病毒表达载体由CMV启动子驱动，可应用于体内外基因组操作。
一种如上述表达E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统的制备方法，包括以下步骤：
1）获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体：利用内切酶XbaI和BamHI对pCDH-CMV-SOX2-IRES-GFP-EF1-Puro载体（该载体发表相关应用发表于Cell Stem Cell. 2013,12(3), 304-315。）进行酶切，获得线性化的pCDH-CMV-IRES-GFP-EF1-Puro载体。设计包含多个MCS（酶切位点）的寡核苷酸Oligo，酶切位点及其顺序为：XbaI-NheI-EcoRI-BstBI -AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI，经退火后，连接入线性化的pCDH-CMV-IRES-GFP-EF1-Puro载体，获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP- EF1-Puro载体（图1，图3）；
2）HPV16病毒E6基因克隆：以addgene的pLXSN16E6E7(52394)中的HPV16病毒E6基因序列为模板，正向引物：5’- CGGAATTCGCCACCATGCACCAAA AGAGAACTG -3’（SEQ ID NO:1），末端为EcoRI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物： 5’-GCTCTAGACAGCTGGGTTTCTCTACGT-3’（SEQ ID NO:2），末端为XbaI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆E6基因，PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复30个循环，72℃延伸 5min；
3）HPV16病毒E7基因克隆：以addgene的pLXSN16E6E7(52394)中的HPV16病毒E7基因序列为模板，正向引物：5’-GCGGGCCCATGCATGGAGATACA CCTA-3’（SEQ ID NO:3），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物： 5’- CGGGATCCTTATGGTTTCTGAGAACAGA-3’（SEQID NO:4），末端为BamHI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆E7基因PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复30个循环，72℃延伸 5min；
4）包含Furin和口蹄疫病毒2A自剪切序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为：RRKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID NO:5），根据此氨基酸序列并在序列两端添加酶切位点如下：NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI，设计寡核苷酸片段进行合成，以合成的核苷酸序列为模板，设计引物进行高保真PCR克隆，正向引物：5’-GCTAGCGAATTCTTCGAAT-3’（SEQ ID NO:6），反向引物： 5’-GGATCCCTCGAGGATATCA-3’（SEQ ID NO:7），高保真克隆包含自剪切序列的片段，PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复30个循环，72℃延伸 5min；获得目的片段后，将该寡核苷酸片段连接入T/A克隆载体，获得NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI-T/A载体，载体命名为Oligo-Furin-2A-T/A；
5）利用酶切连接方法，将包含E7基因的高保真寡核苷酸片段连接入Oligo-Furin-2A-T/A载体，获得包含NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI- E7-BamHI片段载体，命名为Oligo -Furin-2A-E7-T/A载体；
6）利用酶切连接方法，将包含E6基因的高保真寡核苷酸片段连接入Oligo -Furin-2A-E7-T/A载体，获得包含NheI-EcoRI-E6-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI- E7-BamHI片段载体，命名为Oligo-E6-Furin-2A-E7-T/A载体；
7）利用酶切连接方法将Oligo-E6-Furin-2A-E7-T/A克隆载体中的E6-Furin-2A-E7片段转移入线性化的pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒表达载体，获得pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro载体(图1，图2，图3)；
8）慢病毒的包装：在转染前对HEK293T细胞进行无血清饥饿2小时，将PHR、VSVG和步骤4）中的慢病毒表达载体混匀后，再与PEI转染试剂混匀，共同加入HEK293T包装细胞中，6小时后将培养基替换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清并观察荧光强度，利用超速离心机浓缩病毒，获得pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒。
所述的慢病毒载体系统是一种能自剪切表达HPV16病毒E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统。
本发明的有益效果在于：
（1）通过载体构建的方式，构建了由CMV启动子驱动的pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒载体，因为有绿色荧光蛋白的表达，因此该慢病毒载体也适用于其它基因的表达和定位。
（2）通过载体构建的方式，构建了由CMV启动子驱动的pCDH-CMV-E6- Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒载体，E6基因和E7基因之间用Furin序列和口蹄疫病毒的2A片段进行藕联。
（3）利用PHR、VSVG和慢病毒表达载体，对E6蛋白和E7蛋白双顺反子协同表达的慢病毒进行了高效包装，获得表达E6蛋白和E7蛋白的慢病毒；将该病毒感染食管上皮细胞HEEC后，用嘌呤霉素进行筛选后，获得相应的食管上皮细胞系（图5）。
（4）利用蛋白免疫印迹方法，发现构建的自剪切E6蛋白和E7蛋白双顺反子和荧光蛋白表达的慢病毒载体不仅能有效监测慢病毒包装进程，同时，该慢病毒载体还能使E6蛋白和E7蛋白自剪切（图6）。
附图说明
图1pCDH-CMV-E6- Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒载体构建流程。
图2高保真PCR、中间载体和病毒载体酶切鉴定图。其中泳道1为E7基因PCR产物，泳道2为Oligo-Furin-2A-E7-T/A载体酶切鉴定产物，泳道3为E6基因PCR产物，泳道4为Oligo-E6-Furin-2A-E7-T/A载体酶切鉴定产物，泳道5为pCDH-CMV-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro载体酶切鉴定产物。
图3 pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体图谱。
图4 pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro载体图谱。
图5慢病毒感染HEEC细胞后建立的细胞系荧光图。
图6 慢病毒感染HEEC细胞后建立的细胞系免疫印迹分析。泳道1和泳道2分别为pCDH-CMV-E6-IRES-GFP-EF1-Puro和pCDH-CMV-E7-IRES-GFP-EF1-Puro病毒感染建立的HEEC细胞蛋白产物电泳，泳道3为pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro感染后建立的细胞蛋白泳道。
具体实施方式
表达HPV16的E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统是将PHR、VSVG和表达载体共转入HEK293T细胞，即在HEK293T宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统；其表达载体为pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro。
实施例1
表达自剪切HPV16的E6蛋白和E7蛋白的慢病毒载体系统的制备方法包括以下步骤：
步骤1）获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体：利用内切酶XbaI和BamHI对pCDH-CMV-SOX2-IRES-GFP-EF1-Puro载体进行酶切，获得线性化的pCDH-CMV-IRES-GFP-EF1-Puro载体。设计包含多个酶切位点MCS的寡核苷酸Oligo，酶切位点及其顺序为：XbaI-NheI-EcoRI-BstBI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI，经退火后，连接入线性化pCDH-CMV-IRES-GFPP-EF1-Puro载体，获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体（图1，图3）；
步骤2）HPV16病毒E6基因克隆：以addgene的pLXSN16E6E7(52394)中的HPV16病毒E6序列为模板，正向引物：5’- CGGAATTCGCCACCATGCACCAAA AGAGAACTG -3’（SEQ ID NO:1），末端为EcoRI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物： 5’-GCTCTAGACAGCTGGGTTTCTCTACGT-3’（SEQ ID NO:2），末端为XbaI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆E6基因，PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复35个循环，72℃延伸 5min；
步骤2）HPV16病毒E7基因克隆：以addgene的pLXSN16E6E7(52394)中的HPV16病毒E7序列为模板，正向引物：5’-GCGGGCCCATGCATGGAGATAC ACCTA-3’（SEQ ID NO:3），末端为ApaI酶切位点（下划线表示的碱基），反向引物： 5’-CGGGATCCTTATGGTTTCTGAGAACAGA-3’（SEQID NO:4），末端为BamHI酶切位点（下划线表示的碱基），高保真克隆E7基因，PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复35个循环，72℃延伸 5min；
步骤3）包含Furin和口蹄疫病毒2A自剪切序列的设计和合成：合成的核苷酸翻译后对应的氨基酸序列为：RRKRAPVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID NO:5），根据此氨基酸序列并在序列两端添加酶切位点如下：NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI，设计寡核苷酸片段进行合成，以合成的序列为模板，设计引物进行高保真PCR克隆，正向引物：5’-GCTAGCGAATTCTTCGAAT-3’（SEQ ID NO:6），反向引物： 5’-GGATCCCTCGAGGATATCA-3’（SEQ ID NO:7），高保真克隆自剪切片段，PCR反应条件为：PCR反应条件为：95℃ 变性2min，95℃ 变性20sec-60℃退火20sec-72℃ 15sec延伸重复33个循环，72℃延伸 5min；获得目的片段后，将该寡核苷酸片段连接入T/A克隆载体，获得的载体命名为Oligo-Furin-2A-T/A；
步骤4）利用酶切连接方法，将包含E7基因的高保真寡核苷酸片段连接入Oligo-Furin-2A-T/A载体，获得包含NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-E7-BamHI片段载体，命名为Oligo -Furin-2A-E7-T/A载体；
步骤5）利用酶切连接方法，将包含E6基因的高保真寡核苷酸片段连接入Oligo -Furin-2A-E7-T/A载体，获得包含NheI-EcoRI-E6-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-E7-BamHI片段载体，命名为Oligo-E6-Furin-2A-E7-T/A载体；
步骤6）利用酶切连接方法将Oligo-E6-Furin-2A-E7-T/A克隆载体中的E6-Furin-2A-E7片段转移入线性化的pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒表达载体，获得pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro (图1，图2，图3)；
步骤7）慢病毒的包装：在转染前对HEK293T细胞进行无血清饥饿2小时，将PHR、VSVG和步骤5）中的慢病毒表达载体混匀后，再与自制的PEI转染试剂混匀，共同加入HEK293T包装细胞中，6小时后将培养基替换为含2%的血清的培养基，连续收集3天上清，利用超速离心机浓缩病毒，获得pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒。
步骤8）将pCDH-CMV-E6-Furin-2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro慢病毒感染食管上皮细胞HEEC后，用嘌呤霉素进行抗性筛选后，获得相应的食管上皮细胞系，并用荧光显微镜观察绿色荧光，确认细胞系的正确性。
实施例2
蛋白免疫印迹实验检测表达自剪切HPV16的E6蛋白和E7蛋白包括以下步骤：
步骤1）将细胞接种于6cm培养板，利用荧光显微镜观察荧光，并将细胞培养至细胞密度80%-90%。
步骤2）吸弃培养基，并用包含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解细胞后，离心收获蛋白，并进行蛋白质的浓度测定。
步骤3）取40ug总蛋白加入蛋白buffer混匀后置100℃加热3min使其变性，上样。
步骤4）电泳：先80V待蛋白跑至浓缩胶与分离胶分界处，改为120V，电泳约1.5h。
步骤5）转膜：切出目的蛋白所在区域的凝胶，取与凝胶大小相当的PVDF转印膜，泡于甲醇中活化15min，按正负极顺序依次装好转膜装置，150mA转膜2h。
步骤6）丽春红染色；TBST清洗，5%milk室温封闭2h。
步骤7）TBST清洗1-2次，稀释E6和E7一抗至1:200，室温孵育2h。
步骤8）TBST洗膜3次，每次5min，稀释二抗（羊抗鼠）至1:2000，室温1h；
步骤9）TBST洗膜3次，每次5min，加ECL显色液，孵育3min；吸去多余的显色液，保鲜膜封好，置暗盒内曝光8min，先显影再定影；
步骤10）曝光后，取出膜，加stripple buffer洗膜10min，以除去一抗二抗，TBST洗膜3次，每次5min；5%milk室温封闭50min；
步骤11）再加Actin一抗1:1000，室温孵育1h；TBST洗膜3次，每次5min，二抗（羊抗鼠）1:5000，室温孵育1h；TBST洗膜3次，每次5min，加ECL孵育3min，暗盒内曝光1min，最后显影及定影。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 一个表达乳头瘤病毒HPV16的E6和E7自剪切慢病毒载体
<130> 8
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggaattcgc caccatgcac caaaagagaa ctg 33
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctctagaca gctgggtttc tctacgt 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcgggcccat gcatggagat acaccta 27
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgggatcctt atggtttctg agaacaga 28
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Arg Arg Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu
1 5 10 15
Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctagcgaat tcttcgaat 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggatccctcg aggatatca 19
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> Furin序列
<400> 8
Arg Arg Lys Arg
1

Claims (6)

1.一个表达乳头瘤病毒HPV16的E6蛋白和E7蛋白自剪切慢病毒载体，其特征在于：所述自剪切序列由Furin序列RRKR和FMDV2A序列构成。
2.一种如权利要求1所述的E6蛋白和E7蛋白自剪切慢病毒载体构建方法，其特征在于：利用基因合成和高保真PCR将包含多克隆位点和自剪切序列的片段插入T/A克隆载体，再将E6基因和E7基因克隆入该T/A克隆载体，最后，获得的E6-Furin-2A-E7片段插入慢病毒载体，获得自剪切的慢病毒双价表达载体。
3.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的E6基因和E7基因全长开放阅读框定向插入至包含NheI-EcoRI-BstBI-XbaI- Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI T/A载体中，获得NheI-EcoRI- E6-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-E7-BamHI-T/A载体。
4.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：利用克隆技术和载体构建技术，将pCDH-CMV-SOX2-IRES-GFP-EF1-Puro载体用XbaI和BamHI双酶切后，获得线性化载体后，设计Oligo，通过退火后，连接插入线性化载体，获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体。
5.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：利用克隆技术和载体构建技术，将经过酶切获得的具有特定黏性末端的EcoRI-E6-XbaI- Furin-FMDV2A-ApaI-E7-BamHI片段定向插入至pCDH-CMV-MCS- IRES-GFP-EF1-Puro，获得pCDH-CMV-E6-Furin-FMDV2A-E7-IRES-GFP- EF1-Puro表达载体。
6.根据权利要求2所述的E6蛋白和E7蛋白自剪切慢病毒载体构建方法，其特征在于：先通过高保真PCR技术，获得E6基因和E7基因高保真片段，将E6基因和E7基因分别克隆入包含Furin和FMDV2A片段介导的自剪切T/A克隆载体后，再将包含了由Furin和FMDV2A片段介导的E6基因和E7基因自剪切片段插入慢病毒载体；具体包括以下步骤：
1）应用设计引物，以pLXSN16E6E7的质粒为模板，对E6基因和E7基因表达阅读框进行高保真PCR扩增；
2）利用基因合成方法合成包含多克隆位点、Furin和FMDV2A的片段NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI；
3) 应用设计引物，以步骤2）中合成的片段为模板，高保真扩增获得NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI片段，克隆入T/A克隆载体，获得NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin-FMDV2A-ApaI-AgeI- EcoRV-XhoI-BamHI-T/A载体；
4）利用酶切连接方法，将步骤1）中克隆获得的E6基因和E7基因插入至NheI-EcoRI-BstBI-XbaI-Furin- FMDV2A -ApaI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI-T/A载体；获得NheI-EcoRI-E6-XbaI-Furin- FMDV2A -ApaI-E7-BamHI-T/A载体；
5）应用设计引物，合成寡核苷酸片段，对应于以下限制性酶切位点XbaI-NheI-EcoRI-BstBI-AgeI-EcoRV-XhoI-BamHI，退火后形成双链Oligo；
6) 利用酶切方法将pCDH-CMV-SOX2-IRES-GFP-MCS-EF1-Puro载体用XbaI和BamHI双酶切后，获得线性化载体；
7) 利用连接方法，将步骤5）中的Oligo连接入步骤6）中获得的线性化载体，获得pCDH-CMV-MCS-IRES-GFP-EF1-Puro载体；
8)应用酶切连接方法，将步骤4）中获得载体中的NheI-EcoRI-E6-XbaI- Furin-FMDV2A-ApaI-E7-BamHI插入至线性化的pCDH-CMV-MCS-IRES- GFP-EF1-Puro载体，获得pCDH-CMV-E6-Furin-FMDV2A-E7-IRES-GFP-EF1 -Puro载体；
9) 利用共转染方法，将pCDH-CMV-E6-Furin-FMDV2A-E7-IRES-GFP-EF1-Puro和相应的包装质粒共转染入HEK293T 细胞，分别观察其荧光的出现，确定构建的载体正确性；慢病毒感染相应的食管上皮细胞HEEC后经筛选，获得相应的细胞系；以pCDH-CMV-E6-IRES-GFP-EF1-Puro和pCDH-CMV-E7-IRES-GFP -EF1-Puro病毒感染建立的HEEC细胞系为对照，经免疫印迹实验，确定其E6蛋白和E7蛋白的表达水平。
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