CN116286982B - 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HPV基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用。本发明所述HPV基因分型检测阳性参考品是通过将含有HPV全基因组序列的重组表达载体和FLP重组酶载体共转导入含单拷贝FRT位点序列的HEK293T‑FRT细胞,再通过药物筛选和单细胞克隆筛选获得,所得含HPV全基因组序列的单克隆稳转细胞系,即为HPV基因分型检测阳性参考品。本发明所述阳性参考品的遗传背景稳定,接近临床样本,可稳定保存,在性能、稳定性上优于质粒产品,不会由于浓度偏差、基因结构复杂性问题导致检测偏差。另本参考品对下游使用平台的兼容性强,适用性广,生产成本低,可批量生产,无生物传染性、不产生核酸气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,更具体地,涉及一种HPV基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)是世界范围内一组极为常见的病毒,有100多种类型。临床上根据HPV的致癌能力将其分为高危型和低危型;在14种高危型HPV中,HPV-16型和HPV-18型与70%的宫颈癌和宫颈癌前病变有关。HPV不仅与宫颈癌相关,还与其他常见癌症,如乳腺癌、直结肠癌、肺癌、头颈癌和口腔癌等有关。因此,对于HPV的进一步研究可以促进其有关癌症特别是宫颈癌的预防和治疗。
宫颈癌是很常见的女性癌症,由通过性行为感染的某些特定类型的HPV引起,虽然大部分人的HPV感染会自行消退,大部分癌前病变也会自行消失,但所有妇女都面临着HPV感染转为慢性的风险,以及癌前病变发展为浸润性宫颈癌的风险。据世界卫生组织估计,全球每年有超过47万新发宫颈癌病例。世卫组织建议采用一套综合方法来防控宫颈癌,如三级防控:HPV疫苗接种、宫颈癌前病变的筛查和治疗、以及浸润性宫颈癌的管理。因此,及时确认HPV感染情况,可以降低女性罹患宫颈癌的风险,也可以及时得到干预和治疗。
对于HPV感染情况的确认,目前主要依赖于HPV基因检测,基于各类检测平台,市场上出现了不同方法原理且具有不同性能指标的HPV检测产品,由于这些产品均是基于临床进行使用的,在其研发、临床样品检测等方面都需要参考品的参与。参考品不仅可以验证和评价检测产品检测的准确性、稳定性等性能的重要方法和指标,也可用于实验室的室间质评、室内质量控制、产品出厂质控等方面。因此,不同厂家基于不同平台生产的HPV检测产品是否可以满足临床需求,需要一种公认的HPV参考品进行评估。
目前,HPV的国际标准物质为NIBSC建立的HPV-16和HPV-18国际标准物质,已经过世卫组织认证。我国也有HPV分型检测的国家标准物质,包括“人乳头瘤病毒全基因组分型参考品”和“人乳头瘤病毒L1基因分型参考品”。但一方面国际标准物质和国家标准物质价格昂贵、不易购买,且型别数较少,两类标准物质都不能完全满足企业需求,不能满足我国试剂标准化、实验室对试剂方法性能评价、室内质量控制和室间质评的需要;另一方面,这两类标准物质都采用HPV全基因组重组质粒或L1基因(黄杰,等.人乳头瘤病毒基因分型质控品的建立.中华检验医学杂志,2010,33(6):4.),质粒质控品的结构单一,稳定性不高,且复杂程度远远小于临床样本的复杂程度,不能真实反映基因组的真实情况,与临床样本相差较大。因此,依据国际或国家标准物质进行溯源,建立具有统一且可比量值单位的参考品,最终研发出一种接近HPV临床样本且较为稳定的参考品,来用于检测试剂的量值溯源和批间质检,实现不同试剂方法间的检测结果可比性,是十分有必要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的HPV分型检测标准物质所存在的质粒标准物质结构单一,稳定性不高,且复杂程度较小,不能真实反映基因组的真实情况的缺点,以及型别数较少、价格昂贵的问题,提供一种接近HPV临床样本、稳定性高、易于源源不断生产、成本显著降低的HPV阳性参考品及其制备方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于HPV基因分型检测阳性参考品的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种HPV基因分型检测阳性参考品。
本发明的第三个目的是提供所述参考品在HPV基因分型检测或在制备HPV核酸检测试剂盒中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种HPV基因分型检测阳性参考品的制备方法,包括以下步骤:
S1.将HPV全基因组序列克隆至表达载体,构建得到HPV载体;
S2.以慢病毒为载体,构建含单拷贝FRT位点序列的细胞系;
S3.将FLP重组酶载体和步骤S1所得HPV载体共转导入步骤S2所得含单拷贝FRT位点序列的细胞系;
S4.通过药物筛选得到含有HPV全基因组序列的稳转细胞系,再通过单细胞克隆筛选获得含有HPV全基因组序列的单克隆稳转细胞系,即HPV基因分型检测阳性参考品。
作为一种可选择的实施方式,步骤S2构建含单拷贝FRT位点序列的细胞系所用细胞为HEK293T细胞,在HEK293T细胞处于对数增长期时进行实验。
本发明通过人工合成HPV全基因组序列并将其克隆至表达载体,构建得到含HPV基因组序列的重组HPV载体;另利用具有较强转染能力的慢病毒作为载体,将FRT位点序列插入HEK293T细胞基因组中,构建得到含单拷贝FRT位点序列的HEK293T-FRT细胞系;将所得HPV载体与FLP重组酶载体共转导入已构建好的含单拷贝的FRT-HEK293T细胞系,利用FLP重组酶载体及FRT-FLP系统的删除替换作用,通过药物筛选,有效的将外源基因整合入细胞基因组,且整合位点固定单拷贝,从而获得遗传背景更加稳定、不容易丢失的稳转细胞,即获得HPV基因重组到HEK293T细胞基因组的细胞株。在此基础上,为防非特异重组,本发明通过qPCR鉴定等方法进行了单克隆筛选,筛选出带有HPV全基因组序列的单克隆细胞系,即构建含有单拷贝HPV全基因组序列的稳转细胞系,使基因组背景相对单一,由此,可以获得稳定、源源不断的HPV阳性参考品。
利用上述方法,可通过合成不同HPV亚型的全基因组序列,例如HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV CP8304(HPV-81)或HPV-82的全基因组序列,构建得到相应的HPV基因分型检测阳性参考品。
作为一种可选择的实施方式,步骤S1中所述表达载体可以为pCDNA3.1或pcDNA5FRT载体。
具体地,步骤S1包括如下步骤:
a.根据HPV亚型的全基因组DNA序列信息,合成HPV亚型的全基因组片段;
b.将HPV亚型的全基因组序列片段连接至pcDNA5FRT表达载体上,构建获得含HPV亚型全基因组序列的重组表达载体;
c.对所得重组表达载体进行测序,确保其序列完全符合HPV亚型全基因组序列。
更具体地,步骤b中将HPV亚型的全基因组序列片段连接至pcDNA5FRT表达载体上的步骤为:
①同步双酶切:用Hind III和Xho I两种内切酶将pcDNA5FRT载体酶切2小时;
②连接反应:配制10μL连接体系(质粒和目的基因片段的比例为1:3~1:10μg),将合成的HPV亚型的全基因组序列和绿色荧光蛋白示踪基因序列用T4连接酶连接,室温连接反应1h;
③转化:连接反应结束后,将反应体系加至大肠杆菌感受态中,轻轻混匀,冰上孵育30min,然后42℃热激90s,再置于冰上1~2min,接着做转化,加入恢复培养基,在37℃摇床摇菌1小时,取出后,离心去上清至余下200μL,接种于LB琼脂平板中,培养过夜,筛选阳性克隆,获得成功转化HPV的工程菌,取部分菌种冻存保种。
具体地,所述HPV亚型的全基因组片段的合成方法为:先合成亚型同源区域的基因组信息,再单独合成亚型的非同源区域序列信息。
具体地,所述全基因组片段为以下HPV亚型全基因组序列之一:HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV CP8304(HPV-81)、HPV-82,其核苷酸序列可通过NCBI GenBank获取。
具体地,步骤S2包括如下步骤:
a.将FRT位点序列克隆至慢病毒载体,对慢病毒进行包装,得到包装好的FRT慢病毒;
b.用包装好的FRT慢病毒感染HEK293T细胞并进行药物筛选;
c.用数字PCR(ddPCR)检测FRT位点的拷贝数,获得含单拷贝FRT位点的HEK293T-FRT细胞系。
具体地,药物筛选所用药物为潮霉素(Hygromycin)。
具体地,步骤S4中在获得含有HPV全基因组序列的稳转细胞系后,还需对稳转细胞系进行PCR检测,确保HPV分型基因成功重组至细胞基因组。
具体地,PCR检测不同HPV亚型(HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV CP8304、HPV-82)是否重组至细胞基因组所用引物的序列如SEQ ID No.1~104所示。
具体地,步骤S4所述单细胞克隆筛选方法为:
a.以构建的HPV载体为靶序列设计qPCR引物,制备基因拷贝的标准曲线;
b.对待测单克隆细胞样品进行细胞计数,然后提取细胞基因组进行qPCR检测,鉴定HPV基因拷贝数;
c.HPV基因拷贝数与细胞数换算确定一个细胞内HPV基因的拷贝数;若HPV基因分型克隆拷贝数与所取细胞数相近,可认为基因在细胞中表达为单拷贝。
具体地,qPCR检测不同HPV亚型(HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV CP8304、HPV-82)基因拷贝数所用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.105~152所示。
本发明还请求保护一种HPV基因分型检测阳性参考品,所述阳性参考品是通过本发明上述制备方法制备得到。
本发明还申请保护所述HPV基因分型检测阳性参考品在HPV核酸检测或制备HPV核酸检测试剂盒中的应用。
本发明所述阳性参考品适用于多种HPV核酸检测平台,例如,传统膜杂交、导流杂交、荧光PCR、Sanger测序或NGS测序平台本发明的
有益效果为:本发明公开了一种HPV基因分型检测阳性参考品及其制备方法,所述HPV基因分型检测阳性参考品是通过将含有HPV全基因组序列的重组表达载体和FLP重组酶载体共转导入含单拷贝FRT位点序列的HEK293T-FRT细胞,再通过药物筛选和单细胞克隆筛选,获得含有HPV全基因组序列的HEK293T-FRT/HPV单克隆稳转细胞系,即HPV基因分型检测阳性参考品。所得阳性参考品的遗传背景稳定,接近临床样本,可稳定保存,在性能、稳定性上优于质粒产品,不会由于浓度偏差、基因结构复杂性问题导致检测偏差。另本参考品对下游使用平台的兼容性强,适用性广,生产成本低,可批量生产,无生物传染性、不产生核酸气溶胶污染。而本发明所述HPV基因分型检测阳性参考品的制备方法适用于任何不同型别HPV全基因组序列的导入,可利用此方法制备出已知任意型别的HPV阳性参考品。
此外,由于本发明所述HPV基因分型检测阳性参考品含HPV基因组全长序列,而非区域短片段,可兼容市面上常见的HPV核酸检测平台及HPV核酸检测试剂盒,即本发明所述阳性参考品与下游使用平台的兼容性强,适用性广,适用于多种HPV核酸检测平台,例如,传统膜杂交、导流杂交、荧光PCR、Sanger测序或NGS测序平台。
附图说明
图1为重组表达载体IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18的结构示意图。
图2为重组表达载体IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18中HPV-18全基因组序列的部分测序结果。
图3为重组表达载体IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18中HPV-18全基因组序列的载体测序拼接结果。
图4为转导前,HEK293T-FRT细胞在白光显微镜下的观察结果。
图5分别为转导24和48小时后,HEK293T-FRT细胞白光显微镜下的观察结果;其中,图a为转导24小时后;图b为转导后48小时后。
图6分别为转导24和48小时后,HEK293T-FRT细胞荧光显微镜下的观察结果;其中,图a为转导24小时后;图b为转导后48小时后。
图7为药筛实验5天后,非转导组和转导组HEK293T-FRT细胞在白光显微下的观察结果;其中,其中,图a为非转导组;图b为转导组。
图8为HEK293T-FRT/HPV不同型别细胞PCR产物凝胶电泳图;
图中标注数字6、11、26、35、39、43、44、45、51、52、53、58表示HPV的各型别,具体分别表示HPV-6、HPV-11、HPV-26、HPV-35、HPV-39、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-58。
图9为HEK293T-FRT/HPV不同型别细胞PCR产物凝胶电泳图;
图中数字16、18、42、59、66、68、73、33表示HPV的各型别,具体分别表示HPV-16、HPV-18、HPV-42、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV-33。
图10为HEK293T-FRT/HPV-18单克隆细胞显微图。
图11为本发明构建所得HPV所有型别HEK293T-FRT/HPV的溶解曲线。
图12为利用本发明构建所得HPV分型检测阳性参考品,通过HPV杂交法检测HPV的显色示意图;其中,图a为HPV阴性阳性检测结果;图b为HPV-18阳性样本检测结果阳性;图c为HPV-18、HPV-61双阳性样本检测结果。
图13为HPV-18参考品的荧光检测曲线图;图中标注a~j为10份亚型参考品检测结果,k为全基因型国家参考品。
图14为HPV-18参考品的杂交结果图;图中标注a~j为10份亚型参考品检测结果,k为全基因型国家参考品。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下述实施例中所使用试验方法如无特殊说明,均为常规的分子生物学方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1用于HPV基因分型HPV-18检测阳性参考品的制备
1、构建HPV-18全基因组序列的克隆载体
(1)在Genbank获取HPV-18的全基因组DNA序列信息,根据HPV-18的全基因组DNA序列信息,合成HPV-18的全基因组片段;先合成HPV-18序列同源区域的基因组信息,再单独合成HPV-18的非同源区域序列信息(此合成方法为本领域常规方法,只要为HPV-18的全基因组序列片段即可,合成方法在此不再赘述)。
(2)将HPV-18的全基因组序列片段连接至表达载体上,所用表达载体的名称:pcDNA5FRT;抗性:Amp;克隆位点:Hind III和Xho I,连接完HPV-18的全基因组序列片段后的重组载体的名称为IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18,大小12859bp,抗性为Amp,且为低拷贝载体。构建所得含有HPV-18全基因组序列的重组载体的结构示意图如图1所示。
具体连接方法如下:
a.同步双酶切:将pcDNA5FRT载体使用Hind III和Xho I两种内切酶酶切2小时;
b.连接反应:配制10μL连接体系,质粒和片段比例为1:7,将合成的HPV各亚型的全基因组序列、绿色荧光蛋白示踪基因序列与酶切后的载体用T4连接酶连接,室温连接反应1h;
c.转化:连接体系加到大肠杆菌感受态中冰上孵育30min,然后42℃热激90s,再置于冰上1~2min,接着做转化,加入恢复培养基,在37℃摇床摇菌1小时,取出后,离心去上清至余下200μL,接种于LB琼脂平板中,培养过夜,筛选阳性克隆,获得成功转化HPV的工程菌,取部分菌种冻存保种。
(3)对含HPV-18全基因组序列的载体IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18进行测序,确保其序列完全符合HPV-18全基因组序列。
IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18测序结果的部分截图如图2所示,对测序结果进行拼接,拼接结果如图3所示,由图2和3可知,本发明制备的IG190647-4pcDNA5FRT-4.HPV-18重组载体符合预期设计。
2、以慢病毒为载体,构建含单拷贝FRT位点序列的HEK293T-FRT细胞
a.将FRT位点序列(FRT全长48bp,为公知序列,具体序列在此不在赘述)克隆至慢病毒载体,将构建好的慢病毒载体连同慢病毒包装质粒共感染HEK293T细胞,来对慢病毒进行包装,培养48小时后收集病毒悬液进行浓缩纯化,得到包装好的FRT慢病毒。
b.用包装好的FRT慢病毒浓缩液稀释不同浓度梯度,感染处于对数生长期的HEK293T细胞并培养过夜,第二天在荧光显微镜下观察感染情况,选用效果最好的一组继续培养至足够量,进行药物筛选。
c.对获得的转染FRT的HEK293T细胞进行单克隆培养。
d.收集细胞并计数,提取DNA,用ddPCR检测FRT位点的拷贝数,获得含单拷贝FRT位点的HEK293T-FRT细胞。
3、构建HPV-18全基因组序列的稳转细胞系
(1)HEK293T-FRT细胞准备
第一天,从液氮中取出含单拷贝FRT位点的HEK293T-FRT细胞置于37℃水浴锅复苏并接种至T25培养瓶中培养;第二天,观察细胞状态和密度是否正常,然后给细胞更换新鲜培养基并继续培养;第三天,按细胞传代操作将细胞进行传代扩增,具体扩增量根据后续实验所需,细胞接种密度约为4×104/cm2,细胞混匀后放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养;待细胞长至70%~80%融合时,将细胞消化传代接种至6孔板,每孔接种约3×105细胞量用于次日进行重组导入实验;
(2)重组导入实验
1)实验前观察细胞是否适合实验,主要观察指标:细胞是否接种均匀,细胞融合度是否在30~40%左右,若细胞状态合适,则去除旧培养液并更换新鲜培养液,然后放回37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养;
2)DNA-Lipo2000复合物的准备及转导实验
准备一个1.5mL EP管,加入150μL无血清Opti-MEM培养液以及1μgHPV-18质粒(上述构建的HPV-18全基因组序列的载体)和2μg FLP质粒(即FLP重组酶载体,又称FRT重组酶载体,FRT位点的重组酶叫做FLP,该方法是将表达重组酶的质粒一起转导入细胞内,细胞内表达出重组酶,重组酶工作将HPV-18引导并重组到FRT位点(早期用慢病毒转入的位点)),充分颠倒混匀;准备另外一个1.5mL EP管,加入150μL无血清Opti-MEM培养液和10μLLipo2000试剂,轻轻颠倒混匀;把含有质粒DNA的无血清Opti-MEM培养液加入到含Lipo2000的无血清Opti-MEM培养液,轻轻颠倒混匀,室温孵育5分钟;将DNA-Lipo2000复合物加入到步骤1)换液后的HEK293T-FRT细胞中,轻轻前后摇晃培养板使复合物均匀混合;转导4~6小时后,观察细胞状态是否正常,然后更换新鲜培养基;转导约48h后将细胞进行传代用于筛选实验。
转导前,HEK293T-FRT细胞在白光显微镜下的观察结果如图4所示。转导24和48小时后,HEK293T-FRT细胞白光显微镜下的观察结果如图5所示;其中,图5a为转导24小时后;图5b为转导后48小时后。转导24和48小时后,HEK293T-FRT细胞荧光显微镜下的观察结果如图6所示;其中,图6a为转导24小时后;图6b为转导后48小时后。由图4~6可知,转导后的重组细胞正常生长,于荧光显微镜下见细胞表达GFP荧光示踪蛋白,表示目标序列成功重组入细胞基因组内。即本发明成功构建得到了含有HPV-18全基因组序列的稳转细胞系,记录为HEK293T-FRT/HVP-18细胞系。
(3)Hygromycin药筛实验
将HEK293T-FRT/HVP-18和HEK293T-FRT这2株细胞进行传代,按一定量接种至6孔板,每株各一孔;次日,将2孔细胞换液,采用最佳药筛剂量进行药筛;药筛过程中每2-3天更换含药物的培养液直至HEK293T-FRT空白细胞完全被筛死,然后更换正常的培养液继续培养HEK293T-FRT/HPV;
HEK293T-FRT/HPV-18扩增培养至足够细胞量时,取部分用于PCR检测重组情况,部分用于单克隆筛选。
药筛实验5天后,非转导组和转导组HEK293T-FRT细胞在白光显微下的观察结果如图7所示;其中,图7a为非转导组;图7b为转导组。由图7可知,非转导组细胞无法通过药物筛选,重组细胞可通过药物筛选,表示耐药基因成功表达,可作为压力筛选手段。
(4)PCR检测重组
1)按iPure细胞/血液/动物组织gDNA提取试剂盒说明书进行HEK293T-FRT/HPV-18细胞的gDNA提取。
2)根据HPV-18的序列设计特异引物并进行合成,引物序列如表5中HPV分型HPV-18-1(SEQ ID No:15、SEQ ID No:16);另外,本方案引物也可以使用HPV-18-2(SEQ ID No:17、SEQ ID No:18)。
3)PCR反应体系配置:
PCR检测重组的反应体系包括IPure 2×Taq Master Mix、引物、gDNA模板、ddH2O,含量如表1所示。
表1 PCR检测重组的反应体系
成分 | 添加量 |
IPure 2×Taq Master Mix | 10μL |
上游引物 | 1μL |
下游引物 | 1μL |
gDNA模板 | XμL(50~80ng) |
ddH2O | YμL(余量) |
总体积 | 20μL |
4)将体系混合物置于PCR仪,按以下程序(表2)进行扩增:
表2 PCR扩增条件及程序
5)PCR产物进行凝胶电泳鉴定
本发明利用上述方法构建了不同的HEK293T-FRT/HPV细胞,所得细胞经PCR扩增检测的电泳结果分别如图8和9所示,其中,图8为HPV-6、11、26、35、39、43、44、45、51、52、53和58的HEK293T-FRT/HPV不同型别细胞的PCR产物凝胶电泳图;图9为HPV-16、18、42、59、66、68、73、33的HEK293T-FRT/HPV不同型别细胞的PCR产物凝胶电泳图;各型别的重组、转导及药物筛选方法参照上述HPV-18。由图8和9可知,各型别HPV序列在预定位点处均能扩增出条带,表示按所述方法可将不同亚型的HPV基因组序列成功整合入预定位点,将HPV分型基因成功重组至细胞基因组。
(5)细胞株单克隆筛选、培养、保种
先将待单克隆细胞株培养至所需实验量,消化收集细胞,用培养基稀释细胞浓度为10个/mL,接种于96孔板中每孔0.1mL,持续培养至细胞生长成细胞团,获得的单克隆细胞,将单克隆细胞传代至培养瓶继续培养至足够量,取部分细胞用冻存培养基冻存至液氮保种,本实施例获得的HEK293T-FRT/HPV-18单克隆细胞的显微图如图10所示,由图10可知,所得单克隆细胞株能正常增殖。
(6)HEK293T-FRT/HPV-18单克隆细胞的鉴定
a.以构建的HPV载体为靶序列设计qPCR引物,制备基因拷贝的标准曲线;
b.对待测单克隆细胞样品进行细胞计数,然后提取细胞基因组进行qPCR检测,鉴定HPV基因拷贝数;本发明所得单克隆细胞样品编号分别为:HPV-18-1号克隆、HPV-18-2号克隆、HPV-18-3号克隆;
c.HPV基因拷贝数与细胞数换算确定一个细胞内HPV基因的拷贝数;若HPV基因分型克隆拷贝数与所取细胞数相近,可认为基因在细胞中表达为单拷贝。
qPCR反应体系和条件如下:
1)反应体系成分包括:SYBR Green Realtime PCR Master Mix、引物、样品溶液、ddH2O,具体加入浓度和体积见表3,表中3列分别代表保存液浓度,配置扩增体系时所需的体积,和扩增体系中的浓度。
表中×的含义是指浓度倍数,比如说PCRmix溶液加入体积是10μL,而扩增体系是20μL,浓度稀释2倍,终浓度为1×,则原浓度为2×,其中引物见表6中HPV分型HPV-18(SEQID No:111、SEQ ID No:112)。
表3 qPCR反应体系
2)反应条件:温度维持时间及循环数分别为:95摄氏度维持10分钟,95摄氏度30秒、60摄氏度1分钟并进行40个循环,在60摄氏度进行荧光采集,95摄氏度维持1分钟,然后进行55摄氏度到95摄氏度的溶解曲线检测。
实验结果如下,根据荧光PCR溶解曲线法,测各个型别细胞株的相应型别得到的溶解曲线如图11所示,由图11可知,所得溶解曲线峰均为单峰,表示型别特异性良好,q-PCR的拷贝数结果如表4,可见HPV-18基因分型克隆拷贝数与所取细胞数相近,可以认为基因在细胞中表达为单拷贝。
表4 HPV-18拷贝数表达分析结果
单克隆细胞样品编号 | 拷贝数 | 细胞数 |
HPV-18-1号克隆 | 3.21E+04 | 3.00E+04 |
HPV-18-2号克隆 | 3.00E+04 | 3.00E+04 |
HPV-18-3号克隆 | 3.16E+04 | 3.00E+04 |
实施例2用于不同HPV基因分型检测阳性参考品的制备
利用实施例1所述阳性参考品的制备方法,可通过合成不同HPV亚型的全基因组序列,例如HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV CP8304(HPV-81)或HPV-82的全基因组序列,构建得到相应的HPV基因分型检测阳性参考品。
具体地,对于不同的HPV分型,在构建HPV分型全基因组序列的克隆载体时,采用相应的HPV分型全基因组序列(根据GenBank获取相应分型的全基因型序列),通过PCR检测不同HPV亚型的基因组是否整合至细胞基因组时,所用PCR引物的序列如表5所示,SEQ IDNo.1~104;用于HEK293T-FRT/HPV单克隆细胞鉴定时所用qPCR引物的序列如表6所示,SEQID No.105~152。
表5 PCR检测重组各HPV分型引物及序列号
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表6单克隆鉴定qPCR引物及序列号
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实施例3性能验证实验
(1)参考品制备
对实施例1构建的HPV-18参考品细胞系进行复苏,传代培养,收集足够量的细胞,制备成参考品,-15℃及以下冷冻存储。
(2)准确性验证与精密度验证
1)检测要求
(a)采用实时荧光PCR原理的检测试剂盒,要求批内精密度应符合Ct值的变异系数(CV,%)不大于5.0%,目标基因的CT值范围在20~30之间。
(b)采用PCR-杂交等其他原理的试剂盒,要求检测试剂盒检测范围人乳头瘤病毒多个型别参考品反应结果应一致、且达到均为阳性要求。
2)检测方法
(a)按照试剂盒说明书对上述的实验样本采用核酸提取试剂盒(DNA-L型磁珠法)进行提取;
(b)采用实时荧光PCR、PCR-杂交等原理检测试剂盒检测上述实验样本与对照测试样本。
①37种人乳头状瘤病毒分型检测试剂盒(PCR+导流杂交法)
②人乳头瘤病毒(23个型)核酸分型检测试剂盒(荧光PCR法)
按说明书中操作方法检测参考品,对每亚型参考品检测10份,每份检测1次,统计检测结果。
杂交法试验结果可以通过肉眼观察:检测结果阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点;根据膜条上各型HPV探针排列,判断阳性点为何种HPV类型。膜条上各型HPV探针排列如表7所示,探针所示位置与试剂盒的方形位置相对应,其中数字表示各亚型HPV探针;HPV阴性、HPV-18阳性及HPV-18、HPV-61阳性的显色如图12所示,图中阴性结果如图12a所示,由图12a可知,仅有Biotin(杂交膜质控点)和IC(样本内参点)显色,表示杂交膜正常,同时采样正常,提示结果可用、样本检测结果为HPV阴性。HPV-18阳性结果如图12b所示,由图12b可知,Biotin和IC点显色,同时18点显色,提示检测结果可用,检测样本中含有HPV-18型别,样本检测结果为HPV-18阳性。HPV-18、HPV-61双阳性结果如图12c所示,由图12c可知,Biotin和IC点显色,同时18点、61点显色,提示检测结果可用,检测样本中含有HPV-18、HPV-61型别,样本检测结果为HPV-18、HPV-61双阳性。
表7膜条上各型HPV探针排列
3)检测结果
(a)参考品荧光结果
HPV-18参考品的荧光结果如图13所示,Ct值结果如表9所示,所研制的HPV-18参考品检测结果一致,Ct值偏差小,未有非特异扩增,结果表明:HPV-18参考品准确性、精密度均达到要求。
(b)参考品杂交结果
HPV-18参考品的杂交结果如图14所示,由图14可知,杂交膜上18点位显色,无其他杂点,10组结果一致,与国参结果一致,颜色清晰可分辨,杂交结果准确性和精密度记录如表8,其中杂交结果中以“+”表示各阳性结果的深浅程度,“+++”表示深浅正常;“++”表示相对较浅;“+”表示相对过浅。“-”表示阴性结果。由表8可见各个平行结果一致,表示HPV-18参考品准确性和精密度达到要求。
表8杂交结果准确性和精密度记录表
(c)荧光及杂交实验的ICct值和参考品ct值
荧光及杂交实验的ICct值和参考品ct值如表9所示,根据计算分析可知:
CV(IC)=标准差/平均值=(1.19174/24.804)×100%=4.8046%
CV(HPV-18)=标准差/平均值=(0.38142/26.307)×100%=1.4499%
表9实验ICct值和参考品ct值
ICct值 | 参考品ct值 | |
HPV-18(1) | 24.04 | 26.36 |
HPV-18(2) | 26.27 | 26.48 |
HPV-18(3) | 26.69 | 26.28 |
HPV-18(4) | 26.82 | 27.17 |
HPV-18(5) | 24.05 | 26.33 |
HPV-18(6) | 24.16 | 26.33 |
HPV-18(7) | 24.23 | 26.27 |
HPV-18(8) | 24.28 | 26.25 |
HPV-18(9) | 23.61 | 25.52 |
HPV-18(10) | 23.89 | 26.08 |
对上述结果进行分析可知:
1)采用实时荧光PCR原理的检测试剂盒,批内精密度符合Ct值的变异系数(CV,%)小于5.0%。
2)采用PCR-杂交等其他原理的试剂盒,检测试剂盒检测范围HPV-18参考品反应结果一致、且均为阳性。
3)检测试剂盒检测范围内HPV-18参考品结果均为阳性,且与国家参考品相一致,准确度达到要求。
由上述结果可知,本发明所述阳性参考品符合准确性要求与精密度要求,且适用于不同的检测体系(不同的检测试剂盒产品)。
本发明所述阳性参考品经过了测序,其遗传背景清晰,将该序列整合到细胞后,可确保细胞培养后提取的DNA含有HPV序列,并确保遗传信息可以通过细胞分裂,细胞培养来稳定制备。与质粒质控品相比,由于质粒质控品是一种单链环状的DNA分子,容易降解。而本发明所述HPV基因分析检测阳性参考品的遗传背景稳定,可稳定保存,在性能、稳定性上优于质粒产品的参考品。
此外,本发明所述阳性参考品的制备方法适用于任何不同型别HPV全基因组序列的导入,可制备出已知任意型别的HPV阳性参考品,将其用于HPV分型检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种HPV基因分型检测阳性参考品的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.将HPV全基因组序列克隆至表达载体,构建得到HPV重组表达载体;
S2.以慢病毒为载体,构建含单拷贝FRT位点序列的细胞系;
S3.将FLP重组酶载体和步骤S1所得重组表达HPV载体共转导入步骤S2所得含单拷贝FRT位点序列的细胞系;
S4.通过药物筛选得到含有HPV全基因组序列的稳转细胞系,再通过单细胞克隆筛选获得含有HPV全基因组序列的单克隆稳转细胞系,即得HPV基因分型检测阳性参考品;
步骤S1中所述表达载体为pCDNA3.1或pcDNA5FRT载体;
步骤S2包括如下步骤:
a.将FRT位点序列克隆至慢病毒载体,对慢病毒进行包装,得到包装好的FRT慢病毒;
b.用包装好的FRT慢病毒感染HEK293T细胞并进行药物筛选;
c.用数字PCR检测FRT位点的拷贝数,获得含单拷贝FRT位点的HEK293T-FRT细胞系;
步骤S4所述单细胞克隆筛选方法为:
a.以构建的HPV载体为靶序列设计qPCR引物,制备基因拷贝的标准曲线;
b.对待测单克隆细胞样品进行细胞计数,然后提取细胞基因组进行qPCR检测,鉴定HPV基因拷贝数;
c.HPV基因拷贝数与细胞数换算确定一个细胞内HPV基因的拷贝数;若HPV基因分型克隆拷贝数与所取细胞数相近,可认为基因在细胞中表达为单拷贝;
所述HPV全基因组序列为以下HPV亚型全基因组序列之一:HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-26、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-66、HPV-68、HPV-73、HPV-81、HPV-82。
2.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,步骤S4中在获得含有HPV全基因组序列的稳转细胞系后,还需对稳转细胞系进行PCR检测,确保HPV分型基因成功重组至细胞基因组。
3.根据权利要求2所述制备方法,其特征在于,PCR检测所述不同HPV亚型是否重组至细胞基因组所用引物的序列如SEQ ID No.1~104所示。
4.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,qPCR检测不同HPV亚型基因拷贝数所用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.105~152所示。
5.权利要求1~4任一所述方法制备得到的HPV基因分型检测阳性参考品。
6.权利要求5所述HPV基因分型检测阳性参考品在作为HPV核酸检测用质控品或制备HPV核酸检测试剂盒中的应用。
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