JPH06508525A - 乳頭腫ウイルス属ｈｐｖ−４２のｄｎａ配列及びその診断に対する応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウィルス属ＨＰＶ−４２のＤＮＡ配列及びその診断に対する応用 本発明は、その完全ゲノムに相応する配列を含めた、乳頭腫ウィルス属ＨＰＶ４ ２のゲノムから誘導された規定のＤＮＡ配列ならびに、特にこれらの乳頭腫ウィ ルス属の構造タンパク質又はこれらのタンパク質の一部分についてコードするこ れらのＤＮＡ配列のうちのいくつかの全て又は一部分を含むベクターである組換 え型ＤＮＡに関する。本発明は同様に、相応するタンパク質の形でＨＰＶ４２の ゲノムから誘導された相応する配列を発現することを場合によっては可能にする ような条件の下で前記組換え型ＤＮＡで形質転換された培養にも関する。最後に 、本発明は、上述の生成物のい（つか又は以下に記述する生成物を利用させる診 断キット及び特に良性の生殖器上皮病巣と乳腺腫つィルス属により誘発されたガ ン腫又は前ガン腫タイプの病巣の間の識別に対するその新たな利用分野に関係す る。

これまでに同定された６０種以上の異なるヒト乳頭種つィルス属の大部分は全て 、感染を受けた組織（１，３９）の異常な成長を誘発する原因であると推定され た上皮指向性のウィルスである。その組織特異性及びその悪性腫瘍又は良性腫瘍 内でのそれぞれの優越性に応じて、ヒト乳頭種つィルス属（ＨＰＶ）のタイプは 、さまざまな群、例えば低リスク群（ＨＰＶ６．１１）（２，３）、高リスク群 （ＨＰＶＩ６．１８．３１．３３．３９．５７）（１，４−８）、生殖器ＨＰＶ 及びゆうぜい状表皮発育異常症に結びつけられるＨＰＶ　（ＨＰＶ５．８．１９ ．２５．４７）（１，９−１１）などに分類された。これらの相互関係をより良 く理解するため、及び必要とあらばその組織特異性の性質を明らかにするため、 配列比較を行なうことも提案された。しかしながら、今日までのところ、ウィル スのい（つかの特徴とそのそれぞれのゲノムのいくつかの特異的特徴との間の相 関関係を打ち立てる試みは全（実を結んでいない。このような相関関係を樹立す ることのむずかしさは、すでに低ストリンジェント条件でのプローブとしての口 腔ＨＰＶ３２タイプのＤＮＡ（１２）の利用により外陰部乳頭腫から分離された 乳頭腫ウィルス属ＨＰＶ４２に対して実施された配列研究の結果により特に実証 されている（１３）。この後者の出版物によると、ＨＰＶ４２は、大部分がコン ジローム又は扁平乳頭腫の組織学的特徴を呈していた生殖器病巣の３５％におい て存在していることが判明した。

本発明は又、ＨＰＶ４２内に存在しそれを独自性とし又ＨＰＶ４２型の乳頭腫ウ ィルス属の特に微細な検出及びその他の乳頭腫ウィルス属からのＤＮＡ配列を含 むプローブを用いて行なわれたヱ２（エユ診断の結果の確認（又は否定）を可能 にする特定の配列の発見にも関するものである。これらの配列及びこれらの配列 のフラグメントは、特に感受性の高いハイブリダイゼーションプローブ特にＰＣ Ｒと呼ばれる方法による分析を可能にするプライマーの構成のためにも利用可能 である。

以下では、英語の表現に由来する一定数の観察事項（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ）が利用される。これらは、これらの略語に慣れた専門家による本文の読解を容 易にする目的で、本文中保存されている。

これらの略語について以下で喚起し、その後には対応する完全な英語表現とカッ コ中にその仏語訳（日本語訳）を付してお（。

−Ｎ　ＣＲ：　ｎｏｎ　ｃｏｄｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ（非コーディング領域）； −ＯＲＦ　：　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　（読取り枠）　；−Ｐ 　Ｖ　Ｆ　：　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｅｎｈａｎｃｅｒ　ａｓｓｏｃ ｉａｔｅｄ　ｆａｃｔｏｒ（乳頭腫ウィルス属エンハンサ関連因子の結合部位） ；−Ｇ　ＲＥ　：　ｃｏｎｓｅｎｓｅｓ　ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ　ｒｅ ｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ（グルココルチコイド応答性コンセンサス要 素）；−ｂ　ｐ　：　ｂａｓｅ　ｐａｉｒ（塩基対）；−Ｐ　ＣＲ：　ｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（連鎖重合による増幅）−ｎｔ： ヌクレオチド。

これらの配列又は配列フラグメントの記述をさらに押し進める前に、当該技術分 野の従来の状況について簡単に立ち戻り、次にＨＰＶ４２のゲノムの詳細説明を 提供することを提案する。

本論述の以下の部分では、次に説明する添付図面が参照されている。

図１：ｌ　（ａ）、１　（ｂ）、　１　（ｃ）、　１　（ｄ）、　１　（ｅ）、 １　（ｆ）、１　（ｇ）　、１　（ｈ）　、１　（ｉ）；ｍＲＮＡと類似したＨ ＰＶ４２のＤＮＡストランドのヌクレオチド配列。円形ゲノム上の位置１は、Ｈ ＰＶＩＩ及びＨＰＶ３９の位置１との心合せにより決定された。第１のヌクレオ チド：＋１、＋１８０１、＋３６０１及び＋７２０１゜ 図２：ＨＰＶ４２のＤＮＡ、ｍＲＮＡの３つの読取りフラグメント内の開始（ｓ ｔａｒｔ）コドン（上の棒線）と停止コドン（下の棒線）の分布、ＯＲＦはその 他のＨＰＶ型との比較により同定された。番号付けは図１のものと一致している 。

図３−非コーディング領域（ＮＣＲ）の主要な特性。ヌクレオチド７３４６から ヌクレオチド１１３まで（ｎｔ７３４６−１１３）広がるＮＣＲの次の配列パタ ーンが示されている。以下では、い（つかの要素特に乳頭腫ウィルス属に特異的 な１２ｂｐのパリンドローム（ｎｔ、７４６６．７８８３．４４．５９）；ポリ アデニル化部位：ｎｔ７４０１　；ＴＡＴＡ　（ホグネス）ボックスニｎｔ。

６．７４　；　ＣＡＡＴボックス、ｆｉｔ１５；保存プロモータ要素（ＡＡＡＧ ＧＧＡＧＴＡ）：　ｎｔ、３４　；核因子１（ＮＦＬ）に対する結合部位：ｎｔ 、７５０３；７６６３．７７７８．７８０３　；因子（ＮＦＩ）に対する関連因 子（Ｎ　Ｆ　Ａ）の結合部位：ｎｔ。

７５５２　；乳頭腫ウィルス属エンハンサ関連因子の結合部位（ＰＶＦ）（ｎｔ 、７７６０）について特定する。

プラスミドｐＳＰ６４の中で増殖したＨＰＶ４２のゲノムは、ファージＭ１３内 での無作為切断によりサブクローニングされ（英語では「ショットガン」）、ジ デオキシ連鎖の終端方法（１４）により配列決定された。全ゲノムの９３％に相 当する部分は各ストランドから得られ、各ヌクレオチドは５回の配列決定に付さ れた。疑いの残っていた領域は、プライマとして利用された合成オリゴヌクレオ チドの２方向における使用により２方向で新たに配列決定された。７９１７ｂｐ の長い配列（図１）は３９．５％のＧＣ含有量を有する。ヌクレオチド＋１は、 タイプ１１と３９のＨＰＶの配列とのこの配列の整列によって規定された。すで に公表されている制限地図（１３）は、ＢｇｌＩ［部位の両側の位置８９５及び ９４３における２つの補足的部位を除いて確認された。

読取り枠（ＯＲＦ）に相応する配列の分析は、ＨＰＶの全てのゲノムの中に再び 認められる構成の保存を明らかにした（図２）（１５，３９）。全てのＯＲＦは 同じＤＮＡストランド上に特定されている、領域Ｅ４は完全に領域Ｅ２内に含み 込まれており、一方Ｅ１ならびに領域Ｌ１及びＬ２は部分的に重なり合う。Ｅ４ もＥ５も、出発コドンＡＴＧを有していない（図１−表１）。ゲノム内に６つの ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が特定された。そのうちの２つ（ｎｔ 、４３７８．７４０１）は一連のチミジン及び隣接したプリンから成り、１つの ジヌクレオチドＣＡ（１６，１７）が、それぞれ早期及び晩期の機能的に相互連 結された遺伝子群（英語ではｒクラスター」）の下流に置かれている。

全てはおそらくポリアデニル化のために利用される。約６８０ｂｐの非コーディ ング領域（ＮＣＲ）がＬｌの停止コドンとＥ６の開始コドンの間に特定されてい る。

全ツノＨＰＶ（７）ＮＣＲ（７）一般的特性は、ＨＰＶ４２　（図３）の中で充 分に保存されている。増幅パターンＡＣＣＧＮＮＮＮＣＧＧＴの４つのコピーが Ｅ２に依存した状態に置かれたままであり（ｎｔ、４４４．５９．７４６６．７ ８８３）（１８，１９）、ＮＦＬ　（ｎｔ、７５０３．７６６３．７７７８．７ ８０３）の転写因子のための結合部位（２１，２２）、ＮＦＡ　（ｎｔ、７５５ ２）（２０）、乳頭腫ウィルス属の増幅タンパク質（ＮＦＡ　；　ｎｔ。

７７６０）（２０）、２つのＴＡＴＡボックス（ｎｔ、　６．７４）、１つの推 定ＣＡＡＴボックス（ｎｔ、１５）ならびに保存されたプロモータ要素ＡＡＡＧ ＧＧＡＧＴＡ　（ｎｔ、３４）（２３）がＮＣＲの中に位置づけられている。グ ルココルチコイド（ＧＲＥ）に対して明確な形で反応するコンセンサス要素はＮ ＣＲ内で全（特定されなかった（１８．１９．２４）、ＨＰＶ３９（７）場合と 同様に、ＨＰＶ３９ではＬｌのＯＲＦ　（ｎｔ、６５５８）（８）において３つ の誤対合（ｒｍｉｓｍａｔｃｈｅｓＪ　）を含むＧＲＥの存在が見られる。

悪性腫瘍に結びつけられたＨＣＶのタンパク質Ｅ６及びＥ７は、細胞の形質転換 において非常に重要な役割を果たすものとして認識されている（２５〜２８）。

「ジンク・フィンガー」（ｒｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ　Ｊ　）の形を呈しその役 割がＨＰＶ１６の場合における形質転換にとって必須と判断されているパターン Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ　（２９，３０）は、それぞれＥ６及びＥ７において４ 回及び２回存在する。スプライシングされたタンパク質Ｅ７、Ｅ６゜に対しコー ドするｍＲＮＡへの転写が可能なＥ６のＯＲＦ内のアクセプタ部位（ｎｔ、４１ ２）及び潜在的なスプライシングドナ一部位（ｎｔ、２３７）は、ＨＰＶ４２内 で充分に保存されている（３２−３４）。これまで、スプライシング部位は、肛 門性器ガンに結びつけられたＨＰＶにおいてしか識別されてぃなかった。その形 質転換能力に結びつけられてきたタンパク質Ｅ７の細胞分裂パターン（３１，３ ５−３７）は、ＨＰＶ４２内で完全に保存されている。

配列が既知であるその他のタイプのＨＰＶとの著しい配列相同性は全く明らかに され得なかった。コンピュータを用いた相同性解析において、タイプ６ｂ、１１ ．１６．１８．３１及び３３のＨＰＶと約５２〜５６％の相同性が得られた。こ れらは、同じ小群のウィルス間で観察できる配列相同性と比較した場合に弱点が 顕著になる値である（４〜１１）。その上、良性生殖器病巣と結びつけられるＨ ＰＶ４２は、これまで、唯一のガン腫に結びつけられたＨＰＶについてしか知ら れていなかった特性を呈する；タンパク質Ｅ７の中に保存された細胞分裂パター ン及び部位Ｅ６°の存在に関しても同様のことが言える。その上、これまでに配 列決定された全ての生殖器ＨＰＶ（７）ＮＣＲ内に存在するＧＲＥ　（８）は、 反対にＨＰＶ４２のＮＣＲの中には欠如している。従ってＨＰＶ４２は、ヒト乳 頭腫ウィルス属の新しい群の最初の配列決定された代表としてみなすことができ る。

前述のことから、ゲノムの構成が全てのＨＰＶについてと同様にＨＰＶ４２につ いても保存されるという結果が得られる。良性の生殖器病巣に対するその結びつ きにも関わらず、ＨＰＶ４２は、これまで侵食ガンに結びつけられたＨＰＶ又は 非生殖器ＨＰＶにおいてのみ見られた特性を呈する。その上さらに、既知のＨＰ ＶとＨＰＶ４２の広がった配列の相同性は全く見られない。従って本発明が提供 するヌクレオチド配列は、ヒト乳頭腫ウィルス属の新しい小群の最初のタイプの 配列の同定を立証している。

従って、一般に、本発明は、上述のＤＮＡ−ＨＰＶ又はこのＤＮＡ−ＨＰＶのフ ラグメントを含む全ての組換え型ＤＮＡ、特にこれらの組換え型ＤＮＡで形成さ れＨＰＶ４２による感染又はこの乳頭腫ウィルス属の一変異体又はサブタイプの 検出に特に適合させられたハイブリダイゼーションプローブにも関する。これら のプローブは、それ自体標識付けさせることもできるし、或は又特に全く異なる 標識との直接的又は関節的なそのカップリングを目的として成る種のヌクレオチ ドレベルで修飾させることもできる。当然のことながら、これらのプローブの中 で、乳頭種つィルス属のＤＮＡに相応するヌクレオチド配列にとって外来性で通 常はクローニングベクターから来る部分は、厳しいつまりストリンジェント条件 の下で、相応する乳頭腫ウィルス属又はその変異体の１つの場合によって存在す るＤＮＡ含有量について試験された試料の中に場合によって含まれているその他 の核酸とハイブリッドを形成する危険性の無いようなものである。

従って、通常人間の患者に由来する試験すべき生物学試料について、生殖器新形 成特に子宮頚ガン、外陰部ガン又は陰茎ガンをひき起こしつるか又はひき起こし た乳頭種つィルス属による感染を工ｚ亘上二で診断するための本発明に基づ（方 法は、上述のようなプローブを、場合によってこのプローブにアクセス可能な状 態に予めされたこの試料の核酸と、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼ ーション条件下で接触させること、及び場合によって試料内に存在する研究対象 のウィルスＤＮＡと前記プローブの間で形成されたハイブリッドを検出すること を特徴とする。

本発明に従った各々のプローブ又はこのプローブを含む混合物は特に以下のよう に利用されるが、ここで当然のことながら、記述されている診断用試験を、これ らのプローブ又はプローブ混合物が実際に使用されつる使用条件を制限するもの としてみなすことはできない。

考慮の対象となっている例において、問題となっているのは、生検において、病 巣の掻爬によって得られた細胞内で又はＣａｒｎｏｙの混合物（エタノール、ク ロロホルム、酢酸を６：３：１）で固定されパラフィン内に内含された生検切片 内でＨＰＶ４２と同じタイプのＨＰＶを同定することである。検査には、本発明 に基づ＜ＨＰＶ又はそれを含むＨＰＶとＤＮＡの混合物から調製された放射性プ ローブ（３２Ｐ又はｓｓ３で標識付けされたもの）を用いて厳しい又はさほど厳 しくない条件下で行なわれる、分子ハイブリダイゼーション実験によるこのＤＮ Ａの分析を利用する既知の原理の方法に従って採取標本からＤＮＡを予め抽出す ることが必要である。

複数のハイブリダイゼーション方法を利用することが可能である。例えば、スポ ットハイブリダイゼーションを利用することが可能である。この方法は％ＤＮＡ の変性の後、膜にトロセルロース又はｒＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓＪ　）上 でアリコート量のＤＮＡを沈着させる段階、通常の条件下でプローブ混合物を各 膜をハイブリッド形成させる段階、及びＸ線フィルムと接触させた膜の露光によ り放射性ハイブリッドを検出する段階を含んでいる。同様にレプリカハイブリダ イゼーション法を使用することもできる。この方法には、制限酵素によるＤＮＡ の処理後に生成されたＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで電気泳動分離する 段階、アルカリ性変性の後膜にトロセルロース、ｒＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕ ｓＪ　）上にフラグメントをトランスファする段階及び、通常の条件下で適切な プローブ混合物とこれをハイブリッド形成させる段階、が含まれる。放射性ハイ ブリッドの形成は、Ｘ線フィルムと接触させた膜の露光の後に検出される。

放射性プローブは、ニックトランスレーション（ｒｎｉｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔ ｉｏｎ　Ｊ　）法により標識付けされたＨＰＶのＤＮＡ、又は例えばＳＰＳ型の ベクター内に挿入されたウィルス性ＤＮＡの転写によって調製されたＲＮＡ１′ 構成されている。放射性プローブの利用は、高い感受性という利点を呈するが、 これによって、例えば、それ自体標識づけされているか又はそれ自体酵素標識、 螢光標識などをもつ抗体により認識される抗体によって認識され得るビオチニル 化されたプローブといった非放射性プローブの利用が排除されるわけではない。

本発明は同様に、上述のタイプの組換え型ＤＮＡで形質転換されたコンピテント 細胞培養、特にＤＮＡに相応するヌクレオチド配列又はＨＰＶ３９のＤＮＡの配 列がこの細胞培養内のこのヌクレオチド配列の転写及び／又は調節要素の制御下 に置がれている細胞培養にも関する。

さらに、ＨＰＶ４２の新たに発見された特徴を考慮に入れると、特にＥ６、Ｅ６ ”及び／又はＥ７の０ＲＦ（７）レベルでＨＰＶ４２０’）特徴と似た特徴を呈 するＨＰＶを活用するプローブの利用（特に上記条件における）から導き出され る潜在的な又はすでに存在するガン腫のインビトロ診断を確認（又は否定）する ためのその利用。

つまりここで特に問題にされるのは以下のような単数又は複数のＨＰＶである： すなわちＨＰＶ６、ＨＰＶＩＩ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ ３３、ＨＰＶ３９及びＨＰＶ５７゜ 従って本発明は、より特定的には、 −一方では、ＨＰＶ４２のＤＮＡ又は厳しい条件下で先行のものとハイブリッド 形成するＤＮＡの全部又は一部分に相応するＤＮＡを含むプローブ、 −他方では、乳頭腫ウィルス属ＨＰＶ６、ＨＰＶＩＩ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８ 、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９及びＨＰＶ５７のうち少な（とも１つの ウィルスのＤＮＡの全部又は一部に相応するＤＮＡを含む少なくとも１つのプロ ーブを含むインビトロ診断キットに関する。

専門家であれば明らかに分かるように、これらのプローブ全体を用いて、以下で さらに示される条件下（特に厳しいハイブリダイゼーション条件下）で行なわれ るハイブリダイゼーション試験の実施により、専門家は、潜在的ガン腫の診断を 確認するか、又は少な（ともそれを暗示するか或は又さらにこのような診断を否 定することが可能となる。特に、潜在的な又は既知のガン腫の診断は、乳頭腫ウ ィルス属のＤＮＡを含む採取標本内に含まれたこのＤＮＡとＨＰＶ４２のＤＮＡ とのハイブリダイゼーションは無いもののキットのＤＮＡの１つ又はその他のＤ ＮＡとのハイブリダイゼーション試験においては陽性応答が見られることを認知 するという仮定の下で、確認することができるだろう。これに対して、ＨＰＶ４ ２のＤＮＡと同様に陽性のハイブリダイゼーションは、場合に応じてこのタイプ の悲観的診断を暗示するか又は否定することを可能にする。より明白な診断を得 るためには、ＨＰＶ４２のＤＮＡからのより特異的なフラグメント、より特定的 には例えばｎｔ７３４２〜ｎｔ８７０というそれぞれ指示された末端ヌクレオチ ドの間に広がるフラグメントの全部又は一部分を含むフラグメントを内含するプ ローブによりハイブリダイゼーション試験を補完することが必要でありうる。

これらのフラグメントの中で、往々にして好まれるのは、０ＲＦＥ６°又はＥ７ の全て又は一部、或は又ＧＲＥ部位が備わっておらずｎｔ７３４２〜ｎｔ　１０ ８特にｎｔ７５５６〜ｎｔ７５７６の間に広がるＮＣＲの全て又は一部をより特 定的に含むフラグメントである。

本発明はさらに、乳頭腫ウィルス属の特徴であるヌクレオチド配列との比較によ る乳頭腫ウィルス属のＤＮ’Ａの同定用微分析を可能にしＰＣＲプライマとして 利用できるＨＰＶ４２の全配列からの又はこれから誘導された少なくとも１５の ヌクレオチドひいては２０〜４０のヌクレオチドの配列にも関する。好ましいプ ライマは、前に識別されたヌクレオチド配列からのものである。これらのプライ マは、２本鎖又は−氷核の形を呈する。

従って、上述のことと関連して、本発明は、ＨＰＶ４２に対しコードする核酸又 はｍ　ＲＮ　Ａの存在をインビトロ検出するための方法において、特に、 ａ）研究対象のＤＮＡとプライマの間のハイブリダイゼーションを可能にする条 件下で第１のプライマに対しアクセス可能な状態に予めされたＨＰＶ４２に類似 のＤＮＡを含んでいる疑いのある生物学試料を三リン酸ヌクレオシド及び重合誘 発剤（場合に応じてポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下で接触させ、ｍＲＮ Ａ又はｃＤＮＡに対しハイブリッド形成されたこれらのプライマから重合を行な い、研究対象の核酸ストランド又は生物学試料内にそれらが存在する場合には相 応するｍＲＮＡとハイブリッド形成されたプライマの伸長生成物との間に形成さ れた２本鎖を生成する段階、ｂ）検出すべきｍＲＮＡ又はＤＮＡのプライマから 伸長生成物を「分離する」ような形で、段階ａ）で得た２本鎖を変性させる段階 、 Ｃ）（１）第１のプライマのヌクレオチド配列と相補的でない及び（２）前に形 成された伸長生成物の配列と相補的な、ヌクレオチド配列をもつ第２のプライマ （この表現について以前に示した意味合いで）と、得られた伸長生成物を接触さ せる段階：ｄ）場合によっては、検出されるに充分な量の利用されたプライマの 伸長生成物が得られるまで、それ自体補足的合成のための鋳型として利用される 新しい伸長生成物の産主に必要な試薬及び余分に使用された第１及び第２のプラ イマの存在下で、段階（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を繰返す段階、 （ｅ）相応するＲＮＡ又はＨＰＶ４２のＤＮＡの存在の特徴である伸長生成物の 存在を検出する段階、 を含む方法に関する。

上述の検出方法の利用は、患者から採取され、生検、手術片、生物学的流体で構 成された生物学試料を用いて実施される。

上述の検出方法に関係する技術に関するさらなる詳細について、又この方法の変 形態様の練成について、当業者は、特許ＵＳ。

４．６８３，２０２及びＵＳ、４，６８３，１９５に記述された原理を参照する と有用である。

ＰＣＲ又はより一般的にＨＰＶ４２からの遺伝子配列の増幅に基づ（分析方法の 利用プロトコルの如何に関わらず、重合鎖は、少なくとも関連する領域レベルで の検出された乳頭腫ウィルス属のＤＮＡの同一性がプローブを生み出したＨＰＶ ４２の領域に近ければ近いほど長くなる、ということがわかるだろう。

以下の表は、さらに、 −ＨＰＶ４２のゲノムの主要な特徴、 −比較分析結果（ＨＰＶ４２とその他の乳頭腫ウィルス属のゲノムの間の配列相 同性百分率） に関する分析要素を提供している。

最後に本書で参照指示されている出版物の目録はこの記述の最後に提供されてい る。

表１ ＨＰＶ４２のゲノムの主要な特徴 Ｅ６　１０８　１１４　５６３　４５０　１７．５Ｅ７　４７６　５４２　８２ ０　２７９　１０．７Ｅｌ　７２４　８２９　２７５７　１９２９　７２Ｅ２　 ２６７２　２７０２　３８９５　１１９４　４５．２Ｅ４　３２８２　−−一− ３６４１３６０１３，４Ｅ５　３９１９　−−−−　４２０３　２８５　１０． ６Ｌ２　４３４８　４４２３　５ｇ５３　１４３１　５１．２Ｌｌ　５７５６　 ５８３７　７３４２　１５０６　５６．１表２ ＨＰＶゲノムの比較分析 ＨＰＶＩ　ＨＰＶ６　ＨＰＶ８　ＨＰＶＩＩ　ＨＰＶＩ６　ＨＰＶＩ８　ＨＰＶ ３１　ＨＰＶ３３ＤＮＡ’　ｎ、ｔ　５６　ｎ、ｔ　５４　５５　５２　５２　 ５３Ｅ６″３０．７　４８．４　２７．１　４９．０　４１．３　３９．４　４ ０．６　４１．３Ｅ７ｂ４４．１　Ｂｏ、３　３５．５　５９．６　５５．９　 ４９．５　６１．３　６０．２Ｅｌ”　４３．１　６３．８　４２．８　６０． ７　４４．３　５７．７　５３．７　５５．２Ｅ２”　３２．５　４６．３　３ Ｂ、０　５０．０　３５．５　４２．０　３０．３　４３．８Ｅ４”　３１．８ 　３２．６　１７．０　３２．０　３６．２　３３．３　３１．７　３７．９Ｅ ５！１ｎ、ｔ、２０．７　ｎ、ｔ、２４．８　３４．３　３０．７　３５．１　 ２８．３Ｌ２１１４２．１　５６．４　４６．３　５６．８　５９．７　４７． ２　４Ｂ、０　５８．３Ｌｌｂ５３．２　６９．５　４９．６　６８．９　７３ ．３　６３．７　７４．３　７１．３値は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃ ｈ　（３８）のプログラムとの整列の後の相同性百分率を表わす。

ｎ、ｔ：テストされず　ａ：ヌクレオチドの相同性％ｂ＝アミノ酸相同性％ 参考文献 １、　ド・ヴイリエ、　Ｂ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、６３．４８９８−４９０３　 （１９８９）　。

２、シェワルツ、Ｂ、、デュルスト１Ｍ、デルマンコブスキー。

Ｃ６，ラテルマン、０．．ゼッヒ、Ｒ０，ヴオルフスペルシャー、Ｅ、。

スハル、Ｓ及びツール、ハウゼン、　Ｈ，、ＥＭＢＯ，Ｊ、　２．２３４１−２ ３４８（１９８３）。

３、　ダルトマン、に、シュワルツ、Ｂ９．ジスマン、Ｌ及びツール・ハウゼン 、Ｈ，、ｒウィルス学Ｊ　１５１．１２４−１３０　（１９８６１゜４、　ソッ クトルク、に、、クレーマー、Ｇ、、デュルスト９Ｍ、、スハイ、Ｓ、、及びル ーペツカンブ、　Ｗ、　Ｇ、、　ｒウィルス学Ｊ　１４５．１８１−１８５　（ １９８５）。

５、　コール、　Ｓ、Ｔ、及びダノス、０．Ｊ１．　Ｊ、　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、 、　１９３．５９９−６０８　（１９８７）。

６、　ゴールズボロー、　Ｍ、　Ｄ、、ディシルヴエストル、Ｄ、、テンプル、 　Ｇ、Ｆ、及びロリンクス、Ａ、Ｔ、、ｒウィルス学Ｊ　１７１．３０６−３１ １（１９８９）。

７、　コール、　Ｓ、Ｔ、及びストリーク、　Ｒ，Ｅ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、 　５６．８５−９１（１９８６）。

８、　ヴオルパース、Ｃ１及びストリーク、Ｒ，Ｅ、、ｒウィルス学」１８１、 ４１９−４２３　（１９９１）。

９、　ザラショウ、　Ｋ、Ｒ，、オスドロー、　Ｒ，Ｓ、及びファシス、　Ａ、 Ｊ、。

「ウィルス学Ｊ　１５８．２５１−２５４　（１９８７）。

１０、フークス、　Ｐ、Ｇ、、リフドナー、■、、ウエニンガー、Ｊ０．及びブ フィスタ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５８．６２６−６３４　（１９８６） 。

１１、Ｔ、清野、Ａ１足立及び、Ｍ１石橋、「ウィルス学Ｊ　１７７、４０１− ４０５（１９９０）。

１２、ボードノン、Ｓ、、ブラエトリウス、Ｆ９．クレンムスドルフ。

Ｄ、、ルーツナ−１Ｍ０．ウーセー、Ｎ、、ブホウー・アルノープツト。

Ｇ、及びオルス、　Ｇ、、　Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　８８ ．１３０−１３５　（１９８７）。

１３、ボードノン、Ｓ、、クレムスドルク、Ｄ、、オバレック、Ｓ、。

ヤブロンス力、Ｓ、、クロワツサン、０．、ブホウー・アルノープツトＧ、及び オルス、Ｇ、、ｒウィルス学Ｊ　１６１．３７４−３８４　（１９８７１゜１４ 、サンジャー、Ｒ９，ニックレン、Ｓ、及びコウルソン、　Ａ、Ｒ，。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４ ６７　（１９７７）。

１５、クニッパース、　Ｒ，Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　（微生物学及び免疫学の最近の話題）１４４中。（クニッパー スＲ２及びレヴアイン、　Ａ、Ｊ、、編）　、　１３７−１４２　（１９８９） 。

１６、バーンスティール、Ｍ、Ｌ１．ブスリンジャー１Ｍ、及びストラブ、　Ｋ 、、ｒｃｅｌｌ　（細胞）　Ｊ　４１．３４９−３５９　（１９８５）。

１７、ヴアイス、　Ｅ、Ａ、、ジルマルチイン、　Ｇ、Ｍ、及びネヴイース。

Ｊ、Ｒ，、ＥＭＢＯＪ、　１０．２１５−２１９　（１９９１）。

１８、クロス、Ｂ、、ベルナール、　Ｈ，Ｕ、、シードルフ、に、及びクロック 、　Ｇ、、　ＥＭＢＯＪ、　１２．７３５−３７４３　（１９８７）。

１９、ガルシアーガランカ、Ａ１．ティエリ−１Ｆ及びヤニヴ１Ｍ、。

ｒＪ、　Ｖｉｒｏｌ、（ウィルス学ジャーナル）　Ｊ　６２．４３２１−４３３ ０　（１９８８）。

２０、チョング、Ｔ０．チャン、　Ｗ、に、及びベルナール、　Ｈ，Ｕ、、　Ｎ ｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、（核酸研究）　１８．４６５−４７０　（１９９０）。

２１、ベノイスト、Ｃ及びチャンポン、　Ｐ、、ｒＮａｔｕｒｅ　（自然）」２ ９０、　３０４−３１０　（１９８１）　。

２２、ウィンジェンノー、　Ｅ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１ ６．１８７９−１９０２（１９８８）。

２３、クロス、Ｂ、、チヨツク、Ｔ、及びベルナール、　Ｈ，Ｕ、、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　６３．１１４２−１１５２　（１９８９）。

２４、ジャンセン、　Ｈ，Ｍ、、シュドレーレ、Ｕ、、クロス、Ｂ１．スチュワ ード、Ｆ０．シュミット、Ｗ、、ホシャート、Ｍ、、ミツクシセック。

Ｒ１及びシューブ、　Ｇ、、ｒｃｅｌｌ　（細胞）　Ｊ　４９．２９−３８（１ ９８７）。

２５、ランヘルティ、Ｃ，，モリセイ、　Ｌ、Ｃ，、グ０ス７ン、　Ｓ、Ｔ、及 びアンド０７（、Ｂ、Ｊ、、　ＥＭＢＯＪ、　９．１９０７−１９１３　（１９ ９０）。

２６、ベコラロ、Ｇ、１モルゲン、Ｄ、及びデフエンデ＜　、　Ｖ、、　Ｐｒｏ ｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６．５６３−５６７　（１９８ ９）。

２７、ハルハート＋　Ｃ，、Ｆｖ−ス、　Ｇ、Ｗ、及びガロウエイ、Ｄ、Ａ、。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５．４７３−４７８　（１９９１）。

２８、ストーレ−１Ａ、、ビム、Ｄ、、ムレイ、Ａ、、オスポーン、に、。

バンクス、Ｌ、及びクローフォード、　Ｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　７゜１８１５− １１１１２０（１９８８）。

２９、ミラ＋、ＩＪ、、ｖクラクラン、Ａ、Ｄ、及びフラグ、　Ａ、、　ＥＭＢ ＯＪ。

４、１６０９−１６１４　（１９８５）。

３０、バーブ、　Ｊ、Ｍ、、ｒｓｃｉｅｎｃｅ（科学）Ｊ　２３２．４８５−４ ８７　（１９８６）。

３１、スト−レイ、Ａ１．アルモンド、Ｎ０．オスポーン、Ｋ、及びクローフォ ード、　Ｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　（遺伝子学及びウィルス学ジ ャーナル）　、　７１．９６５−９７０　（１９９０）。

３２、シュナイダー・ゲーディヶ、Ａ及びシュヮルス、　Ｅ、、　ＥＭＢＯＪ、 ５．　２２８５−２２９２　（１９８６１゜３３、シードルフ、に、、オルテル スドルフ、Ｔ、、クレマー、Ｇ及びルーヴエカンブ、　Ｗ、、　ＥＭＢＯＪ、　 ６．１３９−１４４　（１９８７）。

３４、スモットキン、Ｄ、及びヴエ’７トスタイン、　Ｆ、Ｏ，、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３．４６８０−４６８４　（１ ９８６）　。

３５、フエルブス、　Ｗ、Ｃ，、イー、　Ｃ，Ｌ、、ミュンガー、に、及びホウ レイ、　Ｐ、Ｍ、　ｒｃｅｌｌ　（細胞’）　Ｊ　５３．５３９−５４７　（１ ９８８）。

３６、ミュンガー、に、、ヴイクネス、　Ｂ、Ａ、、ダイソン、Ｎ、、フエルブ ス、Ｗ、Ｃ，、バーロウ、Ｅ、及びホウレイ、　Ｐ、Ｍ、、　ＥＭＢＯＪ、　８ ．４０９９−４１０５　（１９８９）。

３７、フィジュ、Ｊ、及びスミス、　Ｔ、Ｆ、、ｒＮａｔｕｒｅＪ　３３４．１ ０９（１９８８１゜ ３８、ニードルマン、　Ｓ、Ｂ、及びヴユンシｚ、　Ｃ，Ｄ、、　Ｊ、　Ｍｏ１ ．　Ｂｉｏｌ。

（分子生物学ジャーナル）　４８．４４３−４５０　（１９７０）。

３９、コララスキー、　Ｌ、Ａ、、ガロウェイ、　Ｄ、Ａ、及びホルメス、Ｋ。

Ｋ、、　Ａｍ　Ｊ、　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　１０．１２２−１６３ 　（１９８８）。

ＦＩＧＵＲＥ　１（ｈｌ ＦＩＧＬＩＲε　１（１） フロントページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：９２） （Ｃ１２Ｎ　１５／１１ Ｃ１２Ｒ１：９２） （７２）発明者　コール、スチュワードフランス国、９２１４０　クラマール、 リュ・デュ・シュド、６エー Ｉ （７２）発明者　オノール、ナダン フランス国、９２７００　コロンブ、リュ・デ・グリシン　１１

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．−　乳頭腫ウイルス属ＨＰＶ４２からの又はそれから誘導されたＤＮＡにお いて、基本的に図１の全体的又は部分的ヌクレオチド配列により特徴づけされる ＤＮＡ又はそのフラグメントから成るか、或は又、厳しい条件下で先行するもの とハイブリダイゼーションする対応するＤＮＡ又はそのフラグメントから成るこ とを特徴とするＤＮＡ。
2. ２．その配列が、それぞれの末端ヌクレオチドのｎｔ７３４２〜ｎｔ８７０とい った位置によって規定される配列のうちの１つ、或は又この配列内に含まれるか 又はそれから誘導されることになるあらゆるフラグメントに一致し、このフラグ メントには少なくとも１５個のヌクレオチドが含まれていることを特徴とする、 請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ。
3. ３．配列には、ｎｔ７３４２及びｎｔ１０８、特にｎｔ７５５６〜７５７６の配 列のうちの１つが含まれていることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のＤ ＮＡ。
4. ４．−　前記フラグメントがＨＰＶ４２のＥ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２という 遺伝子の１つ又は遺伝子間領域ＮＣの全て又は一部分に一致することを特徴とす る、請求の範囲第１項又は第２項に記載のＤＮＡ。
5. ５．−　前記フラグメントがＨＰＶ４２のＥ６又はＥ７という遺伝子の１つに一 致することを特徴とする、請求の範囲第１項又は第２項に記数のＤＮＡ。
6. ６．−　配列が、ヌクレオチド７３４２と１０８の間に広がる非コーティング領 域（ＮＣＲ）の配列、又はこの配列内に含まれている全てのフラグメントに一致 すること、及びこのＮＣＲ又はフラグメントにはグルココルチコイド（ＧＲＥ） に対し反応するコンセンサス要素が備わっていないことを特徴とする、請求の範 囲第１項又は第２項に記載のＤＮＡ。
7. ７．−　請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか１項に記載のＤＮＡから誘導さ れたＤＮＡで構成されるハイブリダイゼーションプローブ。
8. ８．−　請求の範囲第１項乃至第６項のいずれか１項に記載のＤＮＡの１つ又は ＤＮＡフラグメントからの、少なくとも１５、好ましくは２０〜４０個のヌクレ オチドを含むＰＣＲのプライマー。
9. ９．−　ＨＰＶ４２型の乳頭腫ウイルス属による感染を、試験すべき生物学的試 料上でインビトロ検出する方法において、請求の範囲第６項に記載のもののよう な対応するプローブを、場合によってプローブに対しアクセスできる状態に予め されているこの試料の核酸と、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーシ ョン条件下で接触させること及び場合によって試料の中に存在する研究対象のウ イルス性ＤＮＡと前記プローブの間に形成されたハイブリッドを検出することを 特徴とする方法。
10. １０．−　インビトロ診断が、ガン腫に転換する可能性の無い扁平乳頭腫又はコ ンジロームの検出を指向していることを特徴とする、請求の範囲第９項に記載の 方法。
11. １１．乳頭腫ウイルス属感染の潜在的又は有効なガン腫特性のインビトロ診断の 確認又は否定を可能にする診断キットにおいて、−　一方では、ＤＮＡ又は先行 するものと厳しい条件下でハイブリッド形成するＤＮＡ又はフラグメント。 −　他方では、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、 ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３９及びＨＰＶ５７のゲノミックＤＮＡの中から選択された 少なくとも１つのＤＮＡ、を含む診断キット。
12. １２．少なくともそれぞれのゲノミックＤＮＡの相応する領域レベルでのＨＰＶ ４２のものに対するその同一性又はそれぞれの類似度に関する生物学的試料内に 含まれた乳頭腫ウイルス属のＤＮＡの検出及び微分析に対する、請求の範囲第８ 項に記載の２つの全く異なるプライマの応用。