JPH05500010A - 生殖器の腫瘍を伴い得る乳頭腫ウイルス感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断で主に使用される乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ６６）プローブ、及びこの乳頭腫ウイルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生殖器の腫瘍を伴い得る乳頭腫ウィルス感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断で主に使用 される乳頭腫ウィルス（１ｌＰＶ６６　）プローブ、及びこの７Ｌ頭腫ウィルス に遺伝的且つ免疫学的に関連した産物 本発明は、乳頭腫ウィルス（ＩＰＶ６６　）のＤＮＡ又はこの乳頭腫ウィルスの 変株に係わり、より特定的にはこの乳頭腫ウィルスに由来するプローブに係わる 。本発明はまた、この乳頭腫ウィルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産物と、 これら種々の産物を用いて乳頭腫ウィルス感染のｉｎ　ｖｉｔｒ。

診断を行う方法と、これらの産物のうち成るものを用いてこれらの同じ乳頭腫ウ ィルスもしくは乳頭腫ウィルス変株に対する予防接種を行う方法とにも係わる。

「乳頭腫ウィルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産物（ｐｒｏｄｕｉｔ　ｇ６ ｎ４ｔｉｑｕｅｍｅｎｔ　ｏｕ　ｉｏ＋ｍｕｎｏｌｏｇｉｑｕｅｎｅｎｔ　１ｉ ｄｓ　ＡｕｎｐａｐｉｌｌｏＩＩＩａｖｉｒｕｓ）」という表現は、このウィル スの初期ＤＮＡに由来する種々の産物、例えばこの初期ＤＮＡに対応するＲＮ八 又はこの初期ＤＮへの全体もしくは一部分を含む組換えＤＮＡ、コンピテント宿 主細胞中での、場合によっては組換え体である、前記ＤＮＡの発現産物、並びに これら産物に対する抗体を意味する。従って、初期ＤＮＡの種々の読取り枠（ｐ ｈａｓｅｓ　ｄｅ　１ｅｃｔｕｒｅ　ｏｕｖｅｒｔｓ）の全体又は一部分の転写 及び翻訳の結果生じるポリペプチドはこれに当たる。更に、前記ポリペプチドに よりｉｎ　ｖｉｖｏて誘導された抗体もこれに当たる。

「乳頭腫ウィルスＪという用語には、比較的軽い皮膚又は粘膜のゆうせい（いぼ ）から、皮膚又は粘膜の癌に変質し得る上皮内腫瘍に至るまての様々な形態のウ ィルス感染を引き起こすとみなされている多数のウィルスが含まれる。

乳頭腫ウィルス感染のより特定的な具体例としては、皮膚のゆうぜい（特に尋常 性ゆうぜい及び足底ゆうぜい）、いぼ状表皮異形成、皮膚の偏平もしくは中間ゆ うぜい、皮膚の上皮内腫瘍及び癌、いぼ状表皮異形成の癌、子宮頚部及び外生殖 器の上皮内腫瘍及び癌、生殖器のコンジローマ及び乳頭腫が挙げられる。

乳頭腫ウィルスは幾つかのタイプが既に開示されている。

その具体例としては、仏国主特許第８４．１８３６９号／第２，５７８゜２６７ 号及びその追加特許第８５．０７０７３号／第２゜５８１，６５５号、特許第８ ６．０１４２５号／第２，５９３，８２８号、１９８８年６月出願の特許第８８ ．０８３２４号、並びに１９８９年１２月２８日付は特許出願筒８９゜１７３７ １号に記述されているものが挙げられる。これらの特許明細書はいずれも、皮膚 のゆうぜいもしくは黄斑性病変又は生殖器の病変から単離した新しい乳頭腫ウィ ルスタイプ又はサブタイプに関するものであり、これらの乳頭腫ウィルスのうち 成るものは、そのウィルスにおかされた病人の生殖器腫瘍特に子宮頚部の癌を早 期に発生させる能力が他のものより大きい。

−ｍ的には、先行特許に記述されているように、乳頭腫ウィルスは互いに極めて 異なるものであるが、約７０００〜８０００塩基対の大きさを有する。また、こ のウィルスのゲノムは、「ノンストリンジェント（ｎｏｎ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｅ）　」もしくは「ノンストリフト（ｎｏｎ　５ｔｒｉｃｔｅ）　Ｊ又は逆に「 ストリンジェントハイブリダイゼーション」もしくは「ストリフト」と称する条 件で行ったハイブリダイゼーション試験で評価して、成る程度の相同（ホモロジ ー）を有し得る。

ノンストリフト又はノンストリンジェント条件でのハイブリダイゼーション試験 は、２つのウィルス単離体に由来するＤＮＡを、１９８０．Ｊ、ｖｉｒｏｌ、、 ３８．３９５−４０７に記載の）ＩＥＩＬＭＡＮ　Ｃ。

＾、らの条件及び１９８２．Ｃ，Ｒ，＾ｃａｄ、ｓｃ、Ｐａｒｉｓ、２９４，５ ８１−５８８に記載のＣＲＯＩＳＳＡＮＴらの条件に従って互いに接触させる操 作を含む（ヘテロ二重領分子）。

ちなみに、これらのノンストリフト又はノンストリンジェント条件では、ハイブ リダイゼーション試験を特Ｇこ媒質及び温度に関して下記の条件で実施する：ノ ン・ストリフト　Ｔ１１−４０°Ｃ。

５０ｍＭのリン酸ナトリウムバ’７フ７　、　ｐＨ・６．５と、５ｘＳＳＣ（ｌ ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）と、２０ ％のポルムアミドと、２００￥１ｇ／…ｌの酵母転移ＲＮΔと、０．０２％のＤ ｅｎｈａｒｄｔ溶液とを含む溶液中４２°Ｃでノ＼イブ１ノダイゼーションを行 う。

ストリフト又はストリンジェント条件でのハイブリダイゼーション試験は、２つ のウィルス単離体心こ由来するＤＮＡを、ＫＲＥＭＳＤＯＲＦ　Ｄ、らの条件（ （１９８２）　、ＪＪｉｒｏｌ　、４３　：４３６−４４７及び１９８３．ＪＪ ｉｒｏｌ　、４８：３４０−３５１）並びにＤａｖｉｓ　Ｒ，Ｗ、らＧこより１ ９７１、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、２１，４１３−４１８に記述され てνＡる条件で、互いに接触させる操作を含む（ヘテロ二重鎖分子）。

ちなみに、これらのストリフト又はスト１ノンジ工ント条件では、ハイブリダイ ゼーション試験を特Ｇこ媒質及び温度に関して下記の条件て実施する： ストリフト　−　Ｔｍ−弧エエ： ５０ｔａＭのリン酸ナトリウムバッファ、ｐ）ｌ＝６．５と、５ｘＳＳＣ（ｌｘ ＳＳＣ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）と、５０％ のホルムアミドと、２００ｕ８／ｎｌの酵母転移ＲＮ＾と、０．０２％のＤｅｎ ｈａｒｄｔ溶液とを含む溶液中４２℃でハイブリダイゼーションを行う。

先行特許には、ストリフト又はストリンジェント条件で交差ハイブリダイゼーシ ョン率が５０％以下の乳頭腫ウィルスは異なるタイプに属すると記述されている 。これらのストリフト又はストリンジェント条件で、５０％以上のハイブリダイ ゼーション率（又は度合い）が観察されるウィルスは同じタイプに属するとされ ている。これらのウィルスはこの同一タイプの中で異なるサブタイプを形成し得 る。ちなみに、ゲノムがストリフトハイブリダイゼーション条件で、即ち飽和液 体媒質中でのハイブリダイゼーションとヌクレアーゼＳ＋によるハイブリッドの 処理との後で、５０％以下の交差ハイブリダイゼーションを示す２つのＨＰＶは 異なるタイプに属する。ゲノムが、不完全な但し５０％以上の相同を有する２つ のＨＰＶは、同一タイプのサブタイプを表す、制限酵素による少数の切断部位に しか見られない相異が変株を決定する。

先行特許には、これらの乳頭腫ウィルスに由来するＤＮＡ、特にこれらの乳頭腫 ウィルスのゲノムの全体又は一部分な含む遺伝的組換え体（ＤＮＡ−ＲＰＶと称 する）をハイブリダイゼーションプローブとして使用することも記述されている 。

また、ＤＮＡ−ＨＰＶの混合物又は「カクテル」をハイブリダイゼーションプロ ーブ混き物の製造に使用することも記述されている。これらのプローブ混合物は 、種々の感染を１ｎｖｉｔｒｏて診断する場合、更には患者体内における所定乳 頭腫ウィルスの発見に伴う危険度を診断する場合に、単独のプローブより効果的 に使用し得ることがある。これらの感染の具体例としては、生殖器の腫瘍、特に 子宮癌を伴い得るものが挙げられる。例えば、（本発明のＤＮＡ−ＨＰＶを除外 する場合は）後述のカクテルを参照されたい。

ちなみに、前述のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断検査で使用し得るプローブとしては、特 許第８８．０８３２４号に記載のプローブＩ　Ｐ　Ｖ　５４、ＨＰＶ５５　（ａ 及びｂ）、並びに特許出願第８９１９３７１号に記載のＨＰ　Ｖ　６３から形成 し得るものが挙げられる。これらのプローブの制限地図を添付図面の第１図、第 ２図及び第３図に再現して示した。

本発明は、新たに単離された乳頭腫ウィルスと、この新しい乳頭腫ウィルスから 得ることができるゲノムＤＮ＾と、このゲノムＤＮΔのフラグメントと、このＤ ＮＡ−ＨＰＶ又はこれらのＤＮＡ−ＨＰＶフラグメントから形成し得る新規のハ イブリダイゼーションプローブとに係わる。

子宮須部の上皮的腫瘍の臨床的ｆｌ！徴を有する病変から何回も繰り返し単離さ れたこの新しいＨＰＶ　（以後ＨＰＶ６６と称する）のＤＮＡは、添付図面の第 ４図に示した制限地図を有することを特徴とする。

この物理的地図は、種々の制限エンドヌクレアーゼによる切断の位置を示すもの である。この地図の原点は非反復切断部位、この場合はＥｃｏＲ１部位からなる 。この原点からの他の部位の距離はゲノムの長さの割合で表される。

この新しい乳頭腫ウィルスの発見及び該ウィルスから誘導し得るＤＮＡの製造は 、特に乳頭腫ウィルスに起因するか又はこのウィルスの作用で発生し得る生殖器 の病変に由来する感染をより精確に診断し、且つこれらの感染がもつと恐ろしい 病気に変化する危険度をより良く予測する可能性をもたらす。

本発明は、これらの乳頭腫ウィルスの変株てあって、それぞれ同一のザブタイプ に属し、従ってストリンジエント条件でＤＮＡ−ＨＰＶ６６とハイブリダイズで きる総ての変株にも係わる。

本発明はまた、既に先行特許で開示されているプローブ「カクテル」を本明細書 に記載の乳頭腫ウィルスに由来するプローブで補完したプローブ「カクテル」と 、その結果更に改善された診断キットとにも係わる。

）ＩＰＶ６６のゲノムから形成したハイブリダイゼーションプローブは特に、主 として生殖器腫瘍及び子宮頚部癌のような危険を構成する乳頭腫ウィルスのタイ プを、後述の先行特許の条件に従いｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断及び／又は追跡する 場合に有用である。

この種のハイブリダイゼーションプローブは、同一タイプの症状の診断「カクテ ル」に組み込ませると有利である。

ここでは、これらの診断混合物のＨＰＶ５４及び５５以外の成分の制限地図を示 している先行特許も整照する。従って、これらの先行特許は、前記「カクテル」 の組成に含まれる他のＤＮＡ−１１ＰＶの同定に関して本明細書の一部分をなす とみなされる。

本発明は、特にストリフト条件で前述のものとハイブリダイズできるＤＮＡ−１ １Ｐ　Ｖ　６６フラグメ、・ト又はＤＮＡフラグメント、特に同等の長さを有す るものにも係わる。本発明はまた、前述のＤＮＡ−１（ＰＶの全体又は一部分を 含む組換え［ｌＮΔにも係わり、より特定的には、前述の各ＤＮＡ−［ＩＰＶの 遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６−Ｅ７、Ｌｌ、Ｌｌ及び遺伝子開領域ＮＣ に対応するフラグメント、又は前述の各ＤＮＡ−ＨＰＶの遺伝子開領域に対応す る配列を含むフラグメンＩ〜をそれぞれ含む組換えＤＮＡＩこも係わる。本発明 は更に、これらのＤＮＡ−ＨＰＶから形成し得るプローブ、又はこのＤＮＡ−Ｈ ＰＶに含まれたフラグメントであって、ストリフト条件で前述のものとハイブリ ダイズでき且つノンストリフト条件で先行特許に記載のタイプＨＰＶ１６、ＨＰ Ｖ１８及び［１ＰＶ３３４：対応すルＤＮＡ−ＨＰＶトＡ　イフＩＪ　’Ｉ　イ スできるフラグメント全体から形成し得るプローブと、前記プローブ又はこれを 含む混合物を使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法とにも係わる。

“　に　の　しいタイプのＨＰｖＨＰ■６６　の−クローニング　： この新しいタイプのＨＰＶは、ＨＰＶ１６．１８及び３３のＤＮＡに特異的な放 射性プローブの混合物を用いてノンストリフト条件（Ｔｍ−４０℃）でハイブリ ダイズすることにより、子宮頚部の表皮癌から抽出したＤＮＡにおいて明らかに された。種々の制限エンドヌクレアーゼに対する感度を調べたところ、この新し いＩ（ＰＶのＤＮＡはエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより一度切断されて、約 ８キロベース（ＩＩＰＶゲノムの平均的大きさ）の分子を形成することが判明し た。この腫１ＤＮＡｌ製物を酵素ＥｃｏＲＩて消化した後、ＤＮＡフラグメン１ 〜をバクチリオファ・−ジ＾２ａｐのＤＮＡ中に挿入した。この組換えＤＮＡの エンキャブジデーション（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）及び大腸菌株ＸＬＩ− Ｂｌｕｅの怒染の後、１（ＰＶ１６．１８及び３３に特異的なりＮＡプローブを 用いてストリクトハイブリダ、イゼーション条件で細胞溶解部分ハイブリダイゼ ーション（ｈｙｂｒｉｄａｔｉｏｎ　ｓｕｒｐｌａｇｅｓ　ｄｅ　１ｙｓｅ）を 行うことにより（Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ）、新しいＨＰＶのＤＮＡを挿入 した組換えバクテリオファージを選択した。ウィルス配列を全部含む組換え体が 複数単離された。組換えバクテリオファージのＤＮＡ及び浸潤性癌から抽出した ＤＮＡ調製物をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩの混合物によって処 理すると同一のフラグメントが形成され、その総分子量はＲＰＶゲノムの全分子 量に対応する。この新しい１（ＰＶのＤＮＡをファージの［ｌＮ＾配列から切除 し、プラスミドｐＢＲ３２２中に再クローニングした。

新しいＩＩＰＶのＤＮＡの制限地図（第４図）は、１５の制限エンドヌクレアー ゼに対するこのＤＮＡの感度の検査に基づいて作成した。１７の切断部位の位置 が決定された。この地図は、今日までに特徴が解明されている総てのＨＰＶの地 図とは異なる。新しいＨＰ　ＶのＤＮＡと前記ＨＰＶのＤＮＡとの間の相同度を 、この新しいＩＩＰＶに特異的な放射性ＤＮＡプローブを用いて、極めてストリ フトな条件（Ｔｎ＋−１０℃）で行った複製ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒ ｉｄａｔｉｏｎ　ｓｕｒ　ｒａｐｌｉｑｕｅ）実験により分析した。ＨＰＶ５３ 及び５６のＤＮＡについては部分的なハイブリダイゼーションが観察された。新 しいＨＰＶのＤＮＡとＨＰＶ５３及び５６のＤＮＡとの間の相同度は、飽和液体 媒質中でのハイブリダイゼーション実験とその後のヌクレアーゼＳ１による消化 とによる評価では５０％以下である。従って、子宮頚部の侵潤性症から羊離した ウィルスは新しいタイプのＨＰＶを構成する。このウィルスと仮に１（ＰＶ６６ と称する。

１１ＰＶ６６のＤＮＡと［１ＰＶ１６のＤＮＡとの間に形成されたベテロ二重鎖 分子を電子順微鏡で分析し、読取り枠（ＰＯＬ）　Ｅ６内に配置されているＨＰ Ｖ６６のＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列を決定したところ、ＨＰＶ６６ のＤＮＡの物理的地図とＨＰＶ１６のゲノムのＰＯＬの地図とを関連させること ができな、このゲノムの地図上におけるＨＰＶ６６の主要遺伝子及び調節用遺伝 子開領域の推定上の位置を次表に示す。

末端の座標（％） 調節領域、、、、、、、、、、、、、、、、、、９４．７　５本発明は一般的に は、前述のＤＮＡ−ＨＰＶ又はこのＤＮＡ−１（ＰＶのフラグメントを含む総て の組換えＤＮＡ、特にこれらの組換えＤＮＡで形成したハイブリダイゼーション プローブであって、本発明の乳頭腫ウィルスによる感染又はこの乳頭腫ウィルス の変株もしくはサブタイプによる感染の検出に特に適しているプローブにも係わ る。これらのプローブはそれ自体を標識することがきるか、又は特に別個のマー カーと直接もしくは間接的に結合するように特定のヌクレオチドのレベルで修飾 することができる。勿論これらのプローブでは、乳頭腫ウィルスのＤＮＡに対応 し且つ通常はクローニングベクターに由来するヌクレオチド配列に対して異種の 部分が次のようなもの、即ち対応する乳頭腫ウィルス又はその変株の１つのＤＮ Ａを含んでいるかもしれない試料を前記ＤＮＡの含量を測定すべく検査する場合 、その試料中に他の核酸が含まれていたときにその核酸とハイブリダイズする危 険がないようなものである。

通常はヒト患者に由来する検査すべき生物試料について、生殖器腫瘍及び／又は 子宮頚部の癌、例えば子宮頚部の表皮癌又は子宮頚部もしくは陰茎の上皮内腫瘍 タイプの病変を発生させ得るか又は既に発生させた乳頭腫ウィルスによる感染を ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するための本発明の方法は、従って、前述のようなプロー ブを、場合によっては予めこのプローブにアクセスできるようにしておいた前記 試料の核酸に、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーション条件で接触 させ、試料中に所期のウィルスＤＮＡが存在している場合にそのＤＮＡと前記プ ローブとの間に形成されるハイブリッドを検出することを特徴とする。

精製ＨＰ’／６６　ＤＮＡを用いて製造した放射性プローブを使用すると、この ウィルスの病原体としての能力を測定することができた。今日までに同定された ものとは異なるＨＰＶのゲノムを含む生殖器病変から抽出した１６０のＤＮＡ調 製物中でＨＰＶ６６のＤＮＡを探したところ、子宮頚部の３つの上皮的腫瘍（６ ，４％）と陰茎の１つの病変とにＨＰＶ６６のＤＮＡが存在していた。従って、 　ＨＰＶ６６は発癌性の可能性がある生殖器向性を有するタイプの肝Ｖを構成す る。生殖器腫瘍、特に子宮東部の癌を発生させる危険を構成するタイプの肝ｖ′ ｌ−診断又は追跡するために、分子プローブの製造に使用される総てのＨＰＶの ＤＮＡの混合物には、この）ｌＰＶ６６を含ませることが極めて望ましい。

そこで−変形例では、生殖器腫瘍及び子宮頚部の癌又はコンジローム及び乳頭腫 をｉｎ　ｖｉｔｒｏＴ於断するために、本発明のプローブを他の１つ又は複数の 乳頭腫ウィルス、特に）ｌＰＶ１６．１８．３３．３９．５４．６３に由来する プローブと組合わせ、又は別の変形例として肝■６．１１．４２．５５と組合わ せる。

本発明の各プローブ又は前記プローブを含む混合物は特に下記のように使用でき るが、ここに記載の診ＵＴ試験は勿論本発明のプローブ又はプローブ混合物の使 用条件を限定するものではない。

該実施例では例えば、バイオプシーで、あるいは病変を措き取ることによって得 た細胞中で、又はＣａｒｎｏｙ混合物（エタノール、クロロホルム、酢酸８：３ ：１　）によって固定し且つパラフィンに含ませたバイオプシー切片で、ＲＰＶ を同定する。この検査には、本発明のＨＰＶ又はこれを含むＨＰＶのＤＮＡの混 合物から製造した放射性プローブ（１２Ｐ又はｊ５Ｓで標識）を用いて、ストリ フト条件又はそれほどストリフトではない条件で実施される分子ハイブリダイゼ ーション実験によりＤＮＡの分析を行う公知の原理の方法に従って、採取試料か ら予めＤＮＡを抽出することが必要である。

使用し得るハイブリダイゼーション法は多数ある。例えば、スティンハイブリダ イゼーション（ｈｙｂｒｉｃｉａｔｉｏｎ　５ｕｒｔａｃｈｅ　）法を使用する ことができる。この方法は、ＤＮＡを変性させた後アリコート量のＤＮＡを膜に トロセルロース又は’　Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐ　ｌ　ｕｓ”）上に配置し、各 膜を通常の条件でプローブ混合物とハイブリダイズさせ、これらの膜をＸ線写真 フィルムと接触させて照射づることにより、放射性ハイブリッドを検出すること からなる。また、複製ハイブリダイゼーション法を使用することもできる。この 方法は、ＤＮＡを制限酵素で処理した後に形成されたＤＮ＾フラグメントをアガ ロースゲルての電気泳動によって分離し、アルカリ変性の後てこれらのフラグメ ントを膜にトロセルロース、”Ｇｅｎｅｓｃｒｒｅｎｐｌｕｓ”）に移し、これ らの膜を通常の条件でプローブの適当な混合物とハイブリダイズさせることから なる。放射性ハイブリッドの形成は、膜をＸ線写真フィルムと接触させて照射す ることにより検出される。

放射性プローブは、ニックトランスレーション法によって標識したＨＰ■のＤＮ Ａか、又は例えばＳＰ６タイプのベクター中に挿入したウィルスＤＮへの転写に よって形成したＲＮ八からなる。放射性プローブを使用すれば感度が高いという 利点が得られるが、非放射性プローブ、例えば標識された抗体により認識され得 る、又は酵素標識、蛍光標識等を担持した抗体により認識される抗体によって認 識され得るビオチニル化プローブを使用することもできる。

本発明は、前述のタイプの組換えＤＮＡで形質転換したコンピテント細胞培養物 、特に乳頭腫ウィルスのＤＮＡに対応するヌクレオチド配列が前記細胞培養物中 でこのヌクレオチド配列の転写及び調節エレメントの制御下におかれるような組 換えＤＮＡで形質転換したコンピテント細胞培養物にも係わる。

従って本発明は、対応するコンピテント細胞宿主中でのこれら組換えＤＮへの発 現産物、並びにこれらの発現産物に対して産生され得る対応する抗体にも係わる 。

そのため本発明は、特にＤＮＡ−ＨＶ＾６６の遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６、 Ｅ７、Ｌｌ、Ｌｌのそれぞれの発現の結果径られるポリペプチドにも係わる。

これらのポリペプチドを製造するための本発明の方法は、従って、前記タンパク 質の１つに対応するヌクレオチド配列がこの細胞宿主中で発現され得るように、 ＨＰＶ６６由来の対応するヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡでコンピテント 細胞培養物を形質転換し、コンピテント細胞宿主により合成された産物からこれ らのポリペプチドを回収し、且つ（例えば細胞培養物又は細胞培養培地から予め 抽出した発現産物を、この種のポリペプチドに対して予め産生じた抗体と接触さ せることにより）精製する。

本発明の乳頭腫ウィルスの各ゲノムの配列し２の発現産物は、より特定的には問 題の種類の調製物を予め固定した場合に、ＨＰＶ６６タイプの乳頭腫ウィルス又 はその変株に汚染された生物学的採取物中での遺伝子Ｌ２の発現産物を認識し得 る抗体をｉｎ　ｖｉｖｏ産生ずるために使用できるという点で極めて有利である 。

本発明は、それぞれＨＰＶ６６に由来する前述のポリペプチドを含むハイブリッ ドポリペプチド、例えばタンパク質Ｌ２の免疫原特性を本質的に変えないという 条件を満たす別のポリペプチド配列に融合したタンパク質Ｌ２にも係わる。この ような別のポリペプチドフラグメントの存在は特に、例えば遺伝子工学によりこ れらハイブリッドポリペプチドの製造に使用される方法の結果として得ることが できる。例えば、これらのハイブリッドポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼに 由来する配列を含む。この種の産物は特に、ラクトースオペロンの全体又は一部 分によって修飾されており且つラクトースオペロンのプロモーター（又は他の任 意の適当なプロモーター、例えばファージλ）の上流に挿入された状態で本発明 の問題の乳頭腫ウィルスに由来する遺伝子Ｌ２に由来するヌクレオチド配列も含 む適当なベクター（ファージ又はプラスミド）での大腸菌の形質転換によって得 ることができる。有利には、ラクトースオペロンのβ−ガラクトシダーゼの遺伝 子の少なくとも一部分を含むこのタイプのプラスミド又はファージと使用する。

本発明のポリペプチドはまた、精製後に、特にこれらのポリペプチドて免疫した 動物の血清からこれらのポリペプチドに対応する抗体を精製する方法で使用する ことができる。特に、これらのポリペプチドはアフィニティカラムに固定できる 。従って、抗体精製操作は、これらの抗体を含む血清を前記ポリペプチドを担持 したアフィニティカラムと接触させることからなる。これらのカラムに選択的に 固定された抗体は次いで、適当なイオン力を有する適当なバッファ、例えば酢酸 アンモニウムのような塩の水溶液を用いて、抗原−抗体複合体を解離することに より回収し得る。

酸性化した溶液を使用してもよい。

本発明は、前記ポリペプチドに対する抗体、特にＨＰＶ６６の遺伝子Ｅ６、Ｅ７ 又は好ましくはＬｌの発現産物に対する抗体の製造方法にも間する。この方法は 、適当な生体宿主を前記ポリペプチドで免疫し、免疫した宿主の血清から形成さ れた抗体を回収することからなり、この回収を特に、前記血清と精製状態の対応 するポリペプチドと接触させて形成された抗原−抗体複合体から前記抗体を回収 することにより実施する。

本発明は、本発明の抗体を使用した組成物（又はこれらの抗体を別の乳頭腫ウィ ルスに由来する抗体と組合わせて含むグループ）、特に前述のＤＮＡ−ＨＰＶ組 成物又は「カクテル」に由来する後述の抗体（又は対応する抗体グループ）を含 む組成物にも係わる。

特に、本発明は予め精製した前記抗体又は抗体混合物を適当な医薬ビヒクルと組 合わせたものに係わる。この組成物は、患者に由来する組織学的又は細胞学的採 取物の１ｎｖｉＬｒｏ診断検査の結果、所期の疾患が臨床的に診断された場合に その疾患の治療に使用し得る。この組成物（特に血清形態のもの）は好ましくは 非経口法で投与し得る。この血清は、ＨＰＶ６６タイプの乳頭腫ウィルスによっ て誘発された恐染の退行を誘起し得る。

これらの抗体はより特定的には、感染したヒトに由来する組織学的切片が同一タ イプの乳頭腫ウィルスの成る構造遺伝子特にＬ２の発現産物も含んでいれば、本 発明の乳頭腫ウィルスの１つ又はこれらの乳頭腫ウィルスの変株に関する怒染鈴 断検査に使用できる。

従って本発明は、特に生殖器の腫瘍及び子宮頚部の癌をｉｎ　ｖｉｔｒｏｉ断す る方法であって、被験者の体内で誘発された病変に由来する組織病理学的切片を 抗原−抗体複合体を産生せしめる条件で接触させ、この抗原−抗体複合体を検出 することからなる方法にも関する。有利には、例えば前述の媒質又はＣＡＲＮＯ Ｙ混合物（Ｌ、ＬＩＳＯＮの著書”ｌ１ｉｓｔｏｃｈｉｉｉｅｅｔ　ｃｙｔｏｃ ｈｉｍｉｅ　ａｎｉｍａｌｓ　（動物の組織化学及び細胞化学）゛にも記述され ている）を用いて解離条件で予め固定した調製物について検出を行う。

任意に固定した抗し２抗体は、第１の抗体に対して形成さねた別の抗体であって 、好ましくは非放射性の適当な標識を備えている抗体を認識し得る。これらの標 識は例えば酵素性又は蛍光性のものである。

このようにして選択された抗体、即ちこれらの抗体に対応する前述のハイブリダ イゼーションプローブとして選択された抗体は、対応する疾患のタイプをｉｎ　 ｖｉｔｒｏ診断するのに使用できる。

本発明は、１つ又は好ましくは複数の別のタンパク質Ｌ２を、選択した投与法特 に非経口投与に適した医薬的に許容し得るビヒクルと組合わせて含む、対応する ワクチン組成物にも係わる。この種の組成物は、ＨＰＶ６６又は対応するタイプ の乳頭腫ウィルスによる５染の危険が高い個体を保護するために使用できる。

ＤＮＡ−ＨＰ　Ｖ　６６を含む株は、１９９０年５月１０日に寄託番号ｌ−９５ １でＣＮＣＭに寄託された。この寄託された株は、ＨＰＶ６６のＤＮＡを陰むＥ ｃｏＲＩ組換えプラスミドを含む大腸菌に１２　ＥｃｏＲｉ株Ｃ６００培養物か らなる。

尚、ＨＰ　Ｖ　５４．５５八、５５Ｂ及び６３ハｔ９ｓｓ年５月６日４：下記ノ 番号ニ ーＰＳＰ　６４　ＨＰＶ５４　：　ｊ−７５６−ＰＣＭ　４　ＨＰＶ５５Δ　： 　ｌ−７５７−ＰＧＭ　４　ＨＰＶ５５Ｂ　：　ｒ−７５８でＣＮＣＨに寄託さ れ、 ＤＮＡ−）ＩＰＶ６３を含む株ＮＭ５２Ｚは１９８９年１２月２１日に番号１− ９１８て寄託された。

ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、ａ 要　約　書 本発明は、１９９０年５月ＩＯ日に番号１−９５１でＣＮＣＭに寄託したＨＰＶ ６６−ＤＮＡ由来の乳頭腫ウィルレスプローブ龜こ係る。このプローブはヒト生 物学的試料に含まれるＤＮＡとハイブリダイゼーンヨンすることにより、生殖器 の腫瘍または子宮頚の癌のｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断に使用できる。

国際調査報告 国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的に、第４図の制限地図（ＨＰＶ６６）を特徴とするＤＮＡもしくはそ のフラグメント、又はこれらのＤＮＡもしくはフラグメントとストリクト条件で ハイブリダイズする対応するＤＮＡもしくはそのフラグメントからなることを特 徴とする乳頭腫ウイルスＤＮＡ。
2. ２．１９９０年５月１０日に番号Ｉ−９５１でＣＮＣＭに寄託されたものの中に 含まれているＤＮＡもしくはそのフラグメントに対応するか、又はストリクト条 件で前記ＤＮＡもしくはフラグメントとハイブリダイズする対応するＤＮＡもし くはフラグメントからなることを特徴とする請求項１に記載の乳頭腫ウイルスＤ ＮＡ。
3. ３．ストリクト条件でＨＰＶ６６とハイブリダイズし且つノンストリクト条件で ＨＰＶ１６、ＮＰＶ１８又はＨＰＶ３３とハイブリダイズするフラグメントから なることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
4. ４．前記フラグメントがＨＰＶ６６の遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６−Ｅ ７、Ｌ１、Ｌ２のうちの１つ又は遺伝子間領域ＮＣの全体もしくは一部分に対応 することを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ。
5. ５．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡに由来するＤＮＡで構成され たハイブリダイゼーションプローブ。
6. ６．請求項１から４のいずれか一項に記載の乳頭腫ウイルスＤＮＡのうち１つの ＤＮＡの構造遺伝子のうち１つの遺伝子の発現産物に対応するポリペプチド。
7. ７．より特定的には、乳頭腫ウイルスＨＰＶ６６のゲノムの配列Ｌ２の発現産物 からなることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
8. ８．請求項６又は７に記載のポリペプチドに対する抗体。
9. ９．検査すべき生物学的試料について、ＨＰＶ６６タイプの乳頭腫ウイルスによ る感染をｉｎｖｉｔｒｏ検出するための方法であって、請求項５に記載のような 対応するプローブを、場合によっては予め前記プローブにアクセスできるように した前記試料の核酸と、好ましくはストリンジェントハイブリダイゼーション条 件で接触させ、試料中に所期のウイルスＤＮＡが存在する場合にそのウイルスＤ ＮＡと前記プローブとの間に形成されるハイブリッドを検出することを特徴とす る方法。
10. １０．ｉｎｖｉｔｒｏ診断を、生殖器の腫瘍及び子宮頚部もしくは陰茎の癌の検 出に向けることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. １１．生殖器の腫瘍及び子宮頚部の癌を誘発し得るタイプの乳頭腫ウイルスによ る感染をｉｎｖｉｔｒｏ診断するための請求項８に記載の抗体の使用であって、 請求項８に記載のような抗体を、ｉｎｖｉｔｒｏ診断される個体に由来する生物 学的試料と接触させ、形成された抗原−抗体複合体を検出することを特徴とする 使用。
12. １２．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ又は請求項５に記載のプロ ーブを、別個の乳頭腫ウイルスの１つ又は複数の対応するＤＮＡ、特に −ＨＰＶ１６、１８、３３、３９、５４−ＨＰＶ６、１１、４２、５４ −ＨＰＶ６、１１、４２、５５ −ＨＰＶ６、１１、４２、５４及び５５又は前記した各列毎の混合物と組合わせ て含む乳頭腫ウイルスＤＨＡ混合物。
13. １３．請求項１２に記載のＨＰＶのＤＮＡの構造遺伝子の発現産物に対応するポ リペプチド混合物。
14. １４．請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体混合物。