JPH05502792A - 生殖器腫瘍を伴い得るパピローマウイルス感染のインビトロ診断に主として使用されるパピローマウイルス（ｈｐｖ６３）プローブ、並びにこのパピローマウイルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生殖２ｉｉ腫瘍を伴い得るパピローマウィルス感染のインビ）・口診断に主とし て使用されるパピローマウィルス（ＨＰ　ＶＯ２）プローブ、並びにこのパピロ ーマウィルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産物 本発明は、パピローマウィルス（ｌ（Ｐ　Ｖ　６３　）のＤＮＡ又はこのパピロ ーマウィルスの変異株のＤＮＡに係わり、より特定的にはこのパピローマウィル スに由来するプローブに間する。本発明は、このパピローマウィルスに遺伝的且 つ免疫学的に関連した産物、並びにこれら種々の産物をパピローマウィルス感染 のｉｎ　ｖｉＬｒｏ３断に使用する方法、そしてこれら産物のうち特定のものを 同じパピローマウィルスもしくはパピローマウィルス変異株に対する予防接種に 使用する方法にも関する。

「パピローマウィルスに遺伝的且つ免疫学的に関連した産”ＰＩＪｊというのは 、初期ＤＮＡに由来する様々な産物、即ち対応するＲＮＡ、あるいはこの初期Ｄ ＮＡを全部もしくは一部分含む組換えＤＮＡ、これら組換えＤＮＡのコンビテン １〜細胞宿主内での発現産物、及びこれらの産物に対する抗体等を意味する。従 って、初期ＤＮＡの種々の読み取り枠の全部又は一部の転写及び翻訳の結果上じ るポリペプチドはこのような産物である。また、これらのポリペプチドによりｉ ｎ　ｖｉｖｏで誘導される抗体もこの種の産物である。

「パピローマウィルス」という用語には、比較的軽い皮膚又は粘膜のゆうぜい（ いぼ）がら、上皮内腫瘍（ｎＩ！ｏ−ｐｌａｓｉｅ）及び皮膚もしくは粘膜の癌 に変質し得る過形成（）Ｉｙｐｅｒｐｌａｓｉｅ）に至るまでの種々の形態のウ ィルス感染を引き起こすとみなされてきたという共通点を有する多数のウィルス が含まれる。パピローマウィルス感染としては、より特定的には、皮膚のゆうぜ い（特に尋常性ゆうぜい及び足底ゆうぜい）、いぼ状表皮異形成、表皮又は粘膜 の偏平又は中間ゆうぜい、上皮内Ｂｆｌｆ、、並びに皮膚癌、いぼ状表皮異形成 及び上皮内腫瘍からの癌、子宮頭部及び外部生殖器官の癌、コンジローム及び乳 頭腫が挙げられる。

幾つかの型のパピローマウィルスは既に開示されている。

例えば、仏国主特許８４．１８３６９／２，５７８，２６７及び追加特許８５゜ ０７０７３／２．５８”１，６５５、特許８６．０１４２５／２，５９３，８２ ８並びに１９８８年６月に出願された特許８８．０８３２４に記述されているも のがそうである。これらの先行特許明細書は総て、ゆうぜい又は散在性病変（ｌ ａｓｉｏｎｓ　＋５ａｃｕｌａｉｒｅｓ　ｄｉｓｓ６ｍｉｎ６ｅｓ）がら単離し た新しいパピローマウィルスの型又は亜をに関するものであり、そのうちの成る ものは、そのパピローマウィルスに感染した患者の生殖器腫瘍、特に子宮頂部底 を早期に発生させる力が他のものよりら強い。

一般的に言えば、これらの先行特許には、パピローマウィルスが互いに著しく異 なるにもかかわらず、塩基対約７０００〜８０００個の大きさを有すると記述さ れている。また、そのゲノムは、「ノンストリンジェント（ｎｏｎ　５ｔｒｉｒ ＋ｇｅｎｔ）　Ｊもしくは「ノ〉ストリフト（ｎｏｎ　５ｔｒｉｃｔ）」と称す る条件、又は逆に「スＩ・リンジエンＩ−ハイブリダイゼーション」もしくは「 ストリクｌ−Ｊと称する条件で行ったハイブリダイゼーション試験て評価すると 、成る程度の相同を有し得る。

ノンストリフト又はノンストリンジェント条件でのハイブリダイゼーション試験 は、ＨＥＩＬＭ＾ＮＣ，＾らにより１９８０．Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、３６，３９５−４０７に記述されている条件、並びにＣＲＯＩＳ −ＳＡＮＴらにより１９８２．Ｃ，Ｒ，＾ｃａｄ、Ｓｃ、Ｐａｒｉｓ、２９４， ５８１−５８６に記述されている条件で、２つのウィルス単隈体に由来するＤＮ Ａを互いに接触させることによって行う（ヘテロ二重頌分子）。

これらのノンストリフト又はノンストリンジェント条件では、ハイブリダイゼー ション試験を、特に培地及び温度に関して、下記の条件で行う。

ノンスト１　ト灸−Ｔ険−４０℃　・ ５０１１ＩＭのリン酸す１リウムＭＮＨ（ｐＨ＝６．５＞と、　５ｘＳＳＣ（１ ｘＳＳＣ＝　０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸すｌ−リウム）と、 ２０２５のポルムアミ１；と、２００μＨ７ｍｌの酵母転移ＲＮＡと、０．０： 、’５のＤｅｎｈａｒＬｉ容液と２含む、容液中で４２℃て゛ハイブリダイゼー ションを行う。

ストリフト又はストリンジェント条件でのハイブリダイゼーション試験は、にＲ ＥＭＳＤＯＲＦ、Ｄらの条件＜　（１９８２）　、ＪＶｉｒｏｌ仕、４３６−４ ４７及び１９８３．Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４８：３４０−３５１）並びにＤａｖｉｓ 　ＲＪ、らの条件（１，９７１，ＭｅＬｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、２１，４ １３−４１８）で、２つのウィルス単離体に由来するＤＮＡを互いに接触させる ことによって行う（ヘテロ二重鎮分子）。

これらのストリフＩ・又はスＩ・リンジェント条件では、ハイプリダイゼーショ シＩ験を、特に培地及び温度に関して下記の条件で行う。

ストリクトＴｍ　２０°Ｃ。

５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６．５）と、５ｘＳＳＣ（１，ｘｘ ｓｓｃ＝　Ｏ，１，５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）と；５ ０％のホルムアミドと、２００μｇ／ｍｌの酵母転移ＲＮＡと、０．０２％のＤ ｅｎｈａｒｔ溶液とを含む溶液中で４２℃でハイブリダイゼーションを行う。

先行特許明細書には、ストリフト又はストリンジェント条件で５０％以下の交差 ハイブリダイゼーション率を示すパピローマウィルスは異なる型に属するもので あると記述されている。これらのストリクト又はストリンジェント条件で５０２ ６以上のハイブリダイゼーション率（又はハイブリダイゼーション度）が観察さ れるウィルスは、同一の型に属すると見なされる。これらのウィルスはこの同一 の型の中で異なる亜をを形成し得る。ちなみに、２つのＨＰ　Ｖは、スＩ・リク トハイプリダイゼーション条件で、即ち飽和するまて液体培地でハイブリダイズ し且つハイブリッドをヌクレアーゼＳ１で処理した後で、そのゲノムが５０％以 下の交差ハイブリダイゼーションを示す場きには異なる型に属する。２つのＨＰ 　Ｖは、そのゲノムが不完全ではあるが５０％以上の相同を有する場合には、同 一の型の亜をである。少数の制限酵素切断部位にしか差異が見られなければ変異 株である。

先行特許には、パピローマウィルスに由来するＤＮＡ、特にこれらパピローマウ ィルスのゲノ１１を全部又は一部含む遺伝子組換え体（Ｄ　Ｎ　Ａ−ＨＰ　Ｖと 称する）をハイブリダイゼーションプローブとして使用する方法も記述されてい る。ＤＮＡ−ＨＰＶの混合物又は「カクテルＪをハイブリダイゼーションプロー ブ温き物の調製に使用する方法も記述されている。これらのプローブ混合物は、 感染の種票、更には思考における所定のパピローマウィルスの発見に伴う危険度 のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断で、時には単独のグローブよりも効果的に使用し得る。

感染の種層としては、生殖器腫瘍、特に子宮癌を伴い得るものが挙げられる６例 えば、（本発明のＤ　Ｎ　Ａ　−ＨＰ　Ｖを除外する場合には）後述のカクテル を参照されたい。

ちなみに、前述のｉｎ　ｖｉｔｒｏ、４断検査で使用し得るプローブとしては、 特許８８．０８３２４に記載（７）７０−ブＨＰ　Ｖ　５４、）！ＰＶ５５　（ ａ及びｂ）を用いて構成できるものが挙げられる。これら公知のプローブの制限 地図を添付図面の図１及び図２に再現した。

本発明は、新規に単離されたパピローマウィルスと、この新規のパピローマウィ ルスから得ることができるゲノムＤＮＡと、このゲノムＤＮＡのフラグメン）・ と、このＤ　Ｎ　Ａ−１，１Ｐ　ＶもしくはＤＮＡ−１−ＩＰ、Ｖフラグメント を用いて形成できる新規のハイブリダイゼーションプローブとに間する。

子宮よ部の生殖器上皮肉腫瘍の臨床的特徴を有する病巣から何回も繰り返し単離 された新規のＨＰＶ（以後ＨＰ　ＶＯ２と称する）のＤＮＡは、添付の図３に示 した制限地図を特徴とする。

この物理地図は、種々の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位の位置を示して いる。各地図の原点は非反復切断部位、この場きは部位ＢａｍＨ１からなる。こ の原点に対する他の部位の距離はゲノムの長さの％で表す。

この新規のパピローマウィルスの発見、並びにこのパピローマウィルスに由来し 得るＤＮＡの生産は、特にパピローマウィルスに起因するか又はパピローマウィ ルスの作用で発生し得る生殖器病変の元となる感染をより精密に詮所することを 可能にすると共に、これらの感染がもつと恐ろしい病気に変化する危険の度合い をより確実に判断することを可能にするものである。

本発明は、これらのパピローマウィルスの変異株であって、それぞれ同一の亜型 に属し、従ってストリンジエント条件でＨＰ　Ｖ　６３のＤＮＡとハイブリダイ ズすることができる総ての変異株にも関する。

本発明はまた、先行特許明細書に既に開示されているプローブ「カクテルＪを本 願発明のパピローマウィルスに由来するプローブで補完したものにも係わり、従 って更に改善された詮所キットにも関する。

１（Ｐ　Ｖ　６３のゲノムから形成したハイブリダイゼーシヨ〉プローブは特に 、後で述べる先行特許明細書に記載の条件で、特に生殖器腫瘍及び子宮頚部癌の ような危険を伴うパピローマウィルス型をｉｎ　ｖｉＬｒｏ於断及び詮所は検出 する場合に有用である。

これらのハイブリダイゼーションプローブは、同じタイプの症状の６断用「カク テル」に含ませると有利である。

これらの詮所用混＆物のＩＩ　Ｐ　Ｖ　５４．５５ａ及び５５ｂ以外の構成成分 の制限地図が載っている先行特許明細書も参考文献として挙げられる。従って、 これらの先行特許明細書は、これらの「カクテル」の組成に含まれる池のＤＮＡ −ｌ−Ｉ　Ｐ　Ｖの同定に関して本明細雷の一部分をなすとみなされる。

本発明は、各ＨＰＶ６３　ＤＮＡのフラグメント又はＤＮＡのフラグメント、特 に同等の長さを有し、主にストリク）−条件で前述のフラグメントとハイブリダ イズできるフラグメントにも関する。本発明はまた、前述のＤＮＡ−１（Ｐ　Ｖ を全部又は一部分含む組換えＤＮＡ、より特定的には、遺伝子Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ４ 、Ｅ６−Ｅ７、Ｌｌ、Ｌ２及び遺伝子開領域ＮＣに対応するフラグメント、又は 前記各Ｄ　Ｎ　Ａ−ＨＰ　Ｖの遺伝子開領域に対応する配列を含むフラグメント をそれぞれ含む組換えＤＮＡにも関する。本発明は更に、これらのＤ　Ｎ　Ａ　 −ＨＰ　Ｖがら形成できるプローブか、又はこのＤ　Ｎ　Ａ　−ＨＰ　Ｖに含ま れているフラグメントであって、ストリフ１〜条件で前述のものとハイブリダイ ズでき且つノンストリフＩ・条件で公知の型ＨＰＶ１６、Ｉｆ　Ｐ　Ｖ　１８及 びＨＰ　Ｖ　３３に対応するＤＮＡ−ＨＰＶとハイブリダイズできる任意のフラ グメントがら形成できるプローブと、これらのプローブが又はこれらのプローブ を含む混合物を用いるｉｎ　ｗｉＬｒｏ診断方法とにも関する。

−三　に　゛　Ｊ　のＩ−ＩＰＶ　７　ＨＰＶ６　Ｂ　の　−クローニング　び ＨＰ　Ｖ　１６．１８及び３３に特異的なプローブの混合物を用いて、ノンスト リフ１〜条件（Ｔｍ−４０？５）でのハイブリダイゼーションにより軽い異形成 （グレードエの上皮肉腫１）から抽出したＤＮＡ中に新規のＩ−ｉ　Ｐ　Ｖ型を 検出した。穫々の制限ヌクレアーゼに対するこのＤＮＡの感受性を調べたところ 、酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩがウィルス配列を一回切断し、その結果的８Ｋｂ（１− ＩＰＶの直線化ゲノムの大きさ）の分子が得られた。このＤＮＡ：Ｉｇ製物をＢ ａｍＨＩで消化した隆、８ＫｂのＤＮＡ分子を非反復部位ＢａｍＴ（Ｉてプラス ミドｐＵｃ１８中に挿入し、大腸菌に１２　（株Ｃ６００）にクローニングした 。怒染細菌培養物のレプリカを、ノンストリフト条件で、型１６．１８及び３３ に対応するプローブの混き物とハイブリダイズさせることにより組換えプラスミ ドを検出した。総てのウィルス配列を含む組換えプラスミドが複数単離された。

これらの組換えプラスミドを挿入酵素ＢａｍＨＩで切断すると、ノンストリフト 条件でプローブ１６．１８及び３３とハイブリダイズする８Ｋｂのフラグメント が得られる。これらの組換えプラスミドと元の病変のＤＮＡとを酵素Ｐｓｔｌと ＢａｍＨＩとの温き物で切断すると、３つのフラグメントが得られる。これらの フラグメントの分子量の合計はパピローマウィルスのゲノムの大きさに等しい、 このウィルスＤＮＡの制限地図を、１つの酵素に対するこのＤＮＡの恐受性の検 査に基づいてｆｔ成したところ、８つの切断部位が明らかになった（図１）。

二のようにして１ヤ成した地図は、現在公知のｌ（Ｐ　Ｖゲノムの地図とは異な る。新規のＨＰ　ＶのＤＮＡと池のＨＰ　ＶのＤＮＡとの閏の配列相開度を、極 めてスｌ−リクトな条件（Ｔｍ１０℃）で転移−ハイブリダイゼーション実験を 行うことによって分析した。この条件では、既述のＨＰＶのＤＮＡとの交差ハイ ブリダイゼーシヨ〉は全く検出されなかった。このような特徴を有する新規のＨ Ｆ’　Ｖは従って新規のＨＰ　Ｖ型を構成する。これをＨＰ　Ｖ　６３と称する 。

種々の条件でＨＰＶ６３のＤＮＡとＨＰ　Ｖ　１６のＤＮＡとの間で形成された ベテロ二重鎖分子を電子ぽ微鏡で分析した結果、２つのゲノムの物理地図を並べ ることができ、ＨＰ〜７６３のＤＮＡに担持された種々の遺伝子の理論的位置が 決定された。

このゲノノ、の地図上の、ＨＰ　Ｖ　Ｇ　３の主要遺伝子及び調節領域の推定位 置６ 末端の座標 ５′　３゜ Ｅ６−Ｅ７．、、、、、、、、．７１　８１Ｌ２．、、、、、、、、、、、．２ ２，５　４１．２Ｌ１．、、、、、、、、、、、、．４０　６０．７調節領域、 、、、、、、、、、、６０．７　７１従って本発明は、−ｍ的には、前記Ｄ　Ｎ 　Ａ−ＨＰ　Ｖ又はこのＤ　Ｎ　Ａ　−１１Ｐ　Ｖのフラグメントを含む総ての 組換えＤＮＡにも係わり、特にこれらの組換えＤＮＡで形成したハイブリダイゼ ーショングローブであって、本発明のパピローマウィルス又はこのパピローマウ ィルスの変異株もしくは亜型による感染の検出に特に適したプローブにも関する 。これらのプローブは、特に別のマーカーと直接的又は間接的に結きさせるため に、それ白木３凛識するか、又は特定のヌクレオチドのしベルで修飾することが できる。勿論、これらのプローブで、パピローマウィルスのＤ　Ｎ　Ａに対応す るヌクしオチド配列とは無関係であって通常はクローニシグベクターに由来する 部分は、対応するパピローマウィルス又はその変異株のＤＮＡの含量について検 査している試料に別の核酸が含まれていた場３に、ストリンジェント条件でその 核酸とハイブリダイズする危険がないようなものである。

通常はヒト患者に由来する検査すべき生物学的試料を、生殖器腫瘍及び／又は子 宮頚部癌を誘発し得るが又は誘発したパピローマウィルスによる感染のｉｎ　ｖ ｉＬｒｏ３断のために検査する本発明の方法は、前述のプローブと、必要であれ ば該プローブにアクセスできるように予め処理した前記試料の核酸とを好ましく はスＩ・リンジェントハイプリダイゼーション条件で接触させ、試料中に所期の ウィルスＤＮＡが存在していればそのＤＮＡと前記プローブとの間に形成される ことになるバイブリドを検出することを特徴とする。

精製ＨＰ　Ｖ　６３のＤＮＡがら調製した放射性プローブを使用すると、このウ ィルスの病原体としての能力を測定することができた。現在同定されているもの とは異なる１−Ｉ　Ｐ　Ｖゲノムを含む生殖器病巣から抽出した９４のＤＮＡ調 製物におけるＨＰＶ６３のＤＮＡの存在を調べたところ、６つの子宮頂部上皮肉 腫瘍にＩ−Ｉ　Ｐ　Ｖ　６３のＤＮＡが存在していた（６．４％）。従ってＨＰ Ｖ６３は、ｌｉ癌影形成潜在能力有する生殖器向性Ｔ（Ｐ　Ｖ型である。生殖器 腫瘍、特に子宮頚部癌を発生させる危険のあるＨＰＶ型の詮所又は検出のために は、分子プローブの調製に使用される総てのＨＰＶ　ＤＮＡ混合物にこのＨＰＶ ６３を含まぜることが極めて望ましい。

そこで本発明の一変形実施ＢｆＲては、生殖器腫瘍、子宮頂部症、コンジローム 及び乳頭腫をｉｎ　ｖｉＬｒｏｉ断するために、プローブを他のパピローマウィ ルス、特にＨＰ　Ｖ　１６．１８．３３．３９．５４、あるいはＩＩＰＶ６．１ １．４２．５４に由来するプローブと組ごわせ、より特定的には一群の詮所がコ ンジローム及び乳頭腫にも係わる場合には、ＨＰＶ６．１１．４２．５５に由来 するプローブと組合わせる。本発明の各プローブ又は該プローブを含む混合物は 、特に下記のように使用し得る。但し、ここで説明する診断検査は、本発明の１ ０−ブ又はプローブ混合物の使用条件分限定するものではない。

この実施例は、例えば生検で、病巣の掻爬によって得た細胞、又はＣａｒｎｏｙ 混合物（エタノール、クロロホルム、酢ｉＲ６：３：ｌ）によって固定した、パ ラフィン中に含まれている生検切片中のＨＰ　Ｖの同定に係わる。この検査では 、公知の原理に基づく方法でＤＮＡを予め採取試料から抽出しておく必要がある 。そして、このＤＮＡの分析を、本発明のＨＰＶから、又はこれを含むＤＮＡも しくはＨＰＶ混合物から調製した放射性プローブ（Ｐ又はｆｆ５Ｓで標語）を用 いて、ストリフト条件又はそれほどストリフトではない条件で実施される分子ハ イブリダイゼーション試験で行う。

使用できるハイブリダイゼーション方法は幾つかある。

例えば、プロットハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄａＬｉｏｎｓｕｒ　Ｌ ａｃｈｅ）と称する方法を使用してもよい、この方法は、ＤＮＡの変性後、アリ コート量のＤＮＡをメンプラン（二Ｉ・ロセルロース又は°’ｆ；ｅｎｅｓｃｒ ｅｅｎｐ　ｌ　ｕｓ”　）上に配置し、通常の条件下で各メンプランをプローブ 混合物とハイブリダイズさせ、これらのメンプランをレントゲン写真フィルムと 接触させて露光することにより、放射性ハイブリッドを検出することからなる。

また、レフ゛リカハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄａｔｉｏｎ　ｓｕｒ　 ｒ６ｐｌｉｑｕｅ）という方法も使用し得る。

この方法は、ＤＮＡを料理酵素で処理することによって生じたＤＮＡフラグメン トをアガロースゲル電気泳動で分離し、これらのフラグメントをアルカリ変性し た後でメンプランにトロセルロース、“Ｃｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ”）上に 移動させ、通常の条件でプローブの適当な混合物とハイブリダイズさせることか らなる。放射性ハイブリッドの形成は、メンプランをレントゲン写真フィルムと 接触させて露光すれば検出される。

放射性プローブは、ニックトランスレージコン法で標識したＨ　Ｐ　ＶのＤＮＡ か、又は例えばＳＰ６型のベクター中に挿入したウィルスＤＮＡの転写によって 形成したＲＮＡからなる。放射性プローブの使用には感度が高いという利点があ るが、だからといって、例えばそれ自体が漂工されているか又はそれ自体が酵素 マーカー、蛍光マーカー等を有する抗体によって認諾される抗体により認識され 得るビオチニル化プローブのような非放射生プローブを使用できないわけではな い。

本発明は、前述のタイプの組換えＤ　Ｎ　Ａで形質転換したコンビテンＩ・細胞 培養物、特にパピローマウィルスのＤＮＡに対応するヌクレオチド配列が前記細 胞培養物中て該ヌクレオチド配列の転写及び調節エレメントの制御下におかれる ような組換えＤＮＡで形質転換したコンピテント細胞培養物にも関する。

従って、本発明は対応するコ〉ビテンＩ−細胞宿主中でのこれら組換えＤＮＡの 発現産物と、これらの発現産物に対して産生され得る対応する抗体とにも関する 。

そのため本発明は、特にＤＮＡ　ＩＩＰ■６３の遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６ 、Ｅ７、ＬＬ、Ｌ２のそれぞれの発現の結果上じたポリペプチドに関する。

従って、これらのポリペプチドを産生するための本発明の方法は、これらのタン パク質の１つに対応するヌクレオチド配列がこの細胞宿主中で発現され得るよう に、ＨＰＶ６３由来の対応するヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡでコンピテ ント細胞培養物を形質転換し、コンピテント細胞宿主によって合成された産物か らこれらのポリペプチドを回収し、精製する（例えば、細胞培養物又は発現産物 が発生した培地から予め抽出した発現産物を、このようなポリペプチドに対して 予め形成した抗体と接触させる）ことからなる。

本発明のパピローマウィルスの各ゲノムの配列Ｌ２の発現産物は、より特定的に は問題のジャンルの調製物が予め固定さ！している場合には、ＨＰＶ６３里パピ ローマウィルス又はその変異株に感染した生物学的試料中の遺伝子Ｌ２の発現産 物を認識し得る抗体のｉｎ　ｖｉｖｏ産生にそれ自体を使用できるという点で特 別な利点を有する。

本発明は、ＨＰ　Ｖ　６３にそれぞれ由来する前記ポリペプチドを含むハイブリ ッドポリペプチド、例えばタンパク質Ｌ２を、このタンパク質Ｌ２の免疫ＪＷ持 性を本質的に変えることのない別のポリペプチド配列に融合させたものにも関す る。これら別のポリペプチドフラグメントは特に、これらのハイブリッドポリペ プチドの産生に使用されている方法、例えば遺伝子工学の結果として存在し得る ０例えば、これらのハイブリッドポリペプチドはトガラフＩ・シダーゼに由来す る配列を含む、この種の産物は特に、ラクトースオペロンの全部又は一部によっ て修飾されており且つ本発明の問題のパピローマウィルスに由来する遺伝子Ｌ２ 由来のヌクレオチド配列をラクトースオペロンのプロモーター（又は他の任意の 適当なプロモーター、例えばファージ＾）の下流に挿入した状態で含む適当なベ クター（ファージ又はプラスミド）で大ｙｓｍを形質転換することによって得る ことができる。有利には、ラクトースオペロンのトガラフ）・シダーゼの遺伝子 の少なくとも一部分を含む前述タイプのプラスミド又はファージを使用する。

本発明のポリペプチドはまた、精製した状態では、特に二ノｔらのポリペプチド で免疫した動物の血清から、これらのポリペプチドに対応する抗体を精製する方 法で使用できる。特に、これらのポリペプチドはアフィニティカラムに固定し得 る。従って、これらの抗体の精製操ｆヤは、前記ポリペプチドを担持しているア フィニティカラムにこれらの抗体を含む血清を接触させて通すことからなる。こ れらのカラムに選択的に固定した抗体は、適当なイオン強度を有する適当な榎Ｗ ｉ液、例えば酢酸アンモニウムのような塩の水溶液を用いて抗原−抗体後自体を 解離することにより回収し得る。酸性化した溶液を使用してもよい。

本発明は、前記ポリペプチドに対する抗体、特にＨＰ　ＶＯ２の遺伝子Ｅ６、Ｅ ７又は好ましくはＬ２の発現産物に対する抗体の産生方法にも関する。この方法 は、適当な生きている宿主を前記ポリペプチドで免疫し、免疫した宿主の血清か ら形成された抗体を、特にこの血清を精製状官の対応するポリペプチドと接触さ せ且つ形成された抗原−杭木複合体から前記抗体を回収することによって回収す る操作を含む。

本発明は更に、本発明の抗体（又はこれらの抗体と他のパピローマウィルスに由 来する抗体との組合わせがちなる抗体群）を１１１用した組成物、特に前述のＤ 　Ｎ　Ａ　７　ＨＰ　Ｖの組成物又は「カクテル」に由来する後述の抗体（又は 対応する抗体群）をよむ組成物にも関する。

本発明は特に、予め精製した前述の抗体又は抗体混合物を適当な医薬用ビヒクル とＭｉ＆わせたものに関する。この組成物は、患者に由来する組織又は細胞試料 のｉｎ　ｖｉＬｒｏ於断検査詮所果所与の症状が臨床的に詮所された場きに、そ の症状の治療に使用できる。この組成物はぐ特に血清形態で）好ましくは非経口 的に投与し得る。その結果この血清は、Ｉ（Ｐ　Ｖ　６３型パピローマウイルス によって発生した感染の退行を誘起し得る。

これらの抗体はより特定的には、感染した個体に由来する組織切片が、同じ盟の パピローマウィルスの特定の構造遺伝子、特にＬ２の発現産物をも含み得る限り 、本発明のパピローマウィルス又はその変異株の１つに関する感染診断検査に使 用し得る。

そこで本発明は、特に一般的腫瘍及び子宮頚部癌を１ｎｖｉＬｒｏ診断するため に、問題の個体に発生した病変に由来する組織切片を抗原−抗体複合体が発生す るような条件で接触させ、この抗原−抗体複合体を検出する方法も提供する。検 出は有利には、例えば培地又は前述のＣＡＲＮＯＹ混合物（Ｌ、ｌ、ｌ５ＯＮ著 ”ｌｌｉｓｔｏｃｈｉｍｉｅ　ｅＬ　ｃｙｔｏｃｈｉ＋ｎｉｅ　ａｎｉｍａｌｅ ｓ″にも記述されている）を用いて解に条件で予め固定した調製物に対して行う 。

抗し２抗体が固定された場合には、第１の抗体に対して形成した別の抗体によっ てこの抗し２抗体を認識することがてきる。これら別の抗体には、好ましくは非 放射性の適当なマーカーを付ける。これらのマーカーは例えば酵素性又は蛍光性 のものがよい。

このようにして選択された抗体は、これらの抗体に対応する前述のハイブリダイ ゼーションプローブと同様に、対応する病気のタイプをｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断す るのに使用できる。

本発明は、１種預又は好ましくは複数種の別のタンパク質Ｌ２を、選択した投与 形態、特に非経口投与に適した医薬的に許容し得るビヒクルと組合わせて含む、 対応する予防接種組成物にも間する。この種の組成物は、ＨＰ＼−Ｉ３又は対応 する型のパピローマウィルスによる感染の危険が高い個体を防護するのに使用し 得る。

ＤＮＡ−ＨＰＶ６３を含む株は、１９８９年１２月２１０に寄託番号ｌ−９１８ でＣＮＣＭに寄託した。寄託した株は、ＨＰ　Ｖ　６３のＤＮＡを含む組換えプ ラスミドＢａｍ１−ＩＩを含む大腸菌に１２株ＮＭ５２２の培ｉｔ物からなる。

尚、ＨＰ　Ｖ　５４．５５Ａ及び５５Ｂゝは１９８８年５月６日に下記の番号で （下記の形態で）ＣＮＣＭに寄託されている・ −ＰＳＰ６４ＨＰＶ５４：丁−７５６、−ＰＧＭ　４　ＨＰＶ５５Ａ　：Ｔ−７ ５７、−ＰＧＭ　４　ＨＰＶ５５Ｂ　：ｌ−７５８゜要約 本発明は、１９８９年１２月２１日に寄託番号ニー９１８でＣＮＣＭに寄託した ＤＮＡ−１（ＰＶ６３に由来するパピローマウィルス１０−ブに関する。このプ ローブは、ヒ１−生物学的試料中に含まれているＤＮＡとのハイブリダイゼーシ ョンによって、生殖器腫瘍又は子宮頚部癌を１ｎｖｉｔｒｏ検出するのに使用し 得る。

国際調査報告 国際調査報告 Ｔｈ１ｌ−一−―−雷−１−−〜鮨町ｔ・−ｍ−−（７）ａｍｃｓｅｄ−ｍ−Ｑ □１・−ｋｍｎ＊ｗｂｍａ１ｗｅｄ−Ｔｈｅ＠ＩｌＩＩＩ−ｗｖｗｃ＋＋ｍｓｉ ＋ｗ７ｍ＋）ｗＩシｗ＊ｐｅｍＰａ電ｅ１１喀ＯｆｆｗｖＥＤＰＦＡＩ＊ａ２＠ Ｉｔ）５１９１叛し・ＩＮ誠Ｐ制麹喧動ピ剛詐ｉ岬ｍｂｋｌｅ＋−ｐ＋ｗｔ＋ｃ ｗｌａ−晒一−ｌ・「−−ｄ−〇Ｉ翻ス国、 ス国、 ラールシエルシュΦメディカル αａ３０・ソー、リュ・ドユ・ドクトウール・ル−・４９７５６５４・パリ・セ デクス・１３、リュ・ドウ・トルビア

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．図３に示した制限地図を特徴とするＤＮＡもしくは該ＤＮＡのフラグメント か、又はストリクト条件で前記ＤＮＡもしくはフラグメントとハイブリダイズす る対応するＤＮＡもしくはＤＮＡフラグメントで主に構成されていることを特徴 とするパピローマウイルスＤＮＡ。
2. ２．１９８９年１２月２１日にＮｏ．Ｉ−９１８でＣＮＣＭに寄託されたものの 中に含まれているＤＮＡもしくはそのフラグメントに対応するか、又はストリク ト条件で前記ＤＮＡもしくはフラグメントとハイブリダイズする対応するＤＮＡ もしくはＤＮＡフラグメントからなることを特徴とする請求項１に記載のパピロ ーマウイルスＤＮＡ。
3. ３．ストリクト条件でＨＰＶ６３とハイブリダイズし且つノンストリクト条件で ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８又はＨＰＶ３３とハイブリダイズするフラグメントから なることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
4. ４．前記フラグメントが、ＨＰＶ６３の遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ６−Ｅ７、 Ｌ１、Ｌ２の１つ又は遺伝子間領域ＮＣの全部もしくは一部分に対応することを 特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ。
5. ５．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡに由来するＤＮＡで構成され たハイブリダイゼーションプローブ。
6. ６．請求項１から４のいずれか一項に記載のいずれか１つのパピローマウイルス ＤＮＡのいずれか１つの構造遺伝子の発現産物に対応するポリペプチド。
7. ７．より特定的には、パピローマウイルスＨＰＶ６３のゲノムの配列Ｌ２の発現 産物からなることを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド。
8. ８．請求項６又は７に記載のポリペプチドに対する抗体。
9. ９．生物学的試料をＨＰＶ型パピローマウイルスによる感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ 検出検査にかける方法であって、請求項５に記載のような対応するプローブを、 必要に応じて該プローブにアクセスできるように予め処理した試料の核酸と、好 ましくはストリンジェントハイブリダイゼーション条件で接触させ、試料中に所 期のウイルスＤＮＡが存在していればそのＤＮＡと前記プローブとの間で形成さ れることになるハイブリドを検出することからなることを特徴とする方法。
10. １０．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断が、生殖器腫瘍及び子宮頚部癌を検出するためのも のであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. １１．生殖器腫瘍及び子宮頚部癌を誘発し得る型のパピローマウイルスによる感 染をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するための請求項８に記載の抗体の使用方法あって、 請求項８に記載のような抗体をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断すべき個体に由来する生物 学的試料と接触させ、形成された抗原−抗体複合体を検出することからなる方法 。
12. １２．請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ又は請求項５に記載のプロ ーブを別のパピローマウイルス、特に−ＨＰＶ１６、１８、３３、３９、５４、 −ＨＰＶ６、１１、４２、５４、 −ＨＰＶ６、１１、４２、５５、 −ＨＰＶ６、１１、４２、５４及び５５の複数の対応するＤＮＡと組合わせたも のを含むパピローマウイルスＤＮＡ混合物。
13. １３．請求項１２に記載のＨＰＶ　ＤＮＡの構造遺伝子の発現産物に対応するポ リペプチドの混合物。
14. １４．請求項１３に記載のポリペプチドに対する抗体の混合物。