EP0507867A1 - Sonde a papillomavirus (hpv63), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus - Google Patents

Sonde a papillomavirus (hpv63), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus

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EP0507867A1
EP0507867A1 EP91902718A EP91902718A EP0507867A1 EP 0507867 A1 EP0507867 A1 EP 0507867A1 EP 91902718 A EP91902718 A EP 91902718A EP 91902718 A EP91902718 A EP 91902718A EP 0507867 A1 EP0507867 A1 EP 0507867A1
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EP
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dna
papillomavirus
hpv63
probe
dnas
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Withdrawn
Application number
EP91902718A
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Sylvie Beaudenon
Gérard Orth
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Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Institut Pasteur de Lille
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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Publication date
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Definitions

  • the invention relates to a papillomavirus DNA (HPV63) or variants of this papillomavirus, and more particularly to probes derived from this papillomavirus. It also relates to products genetically and im unologically linked to this papillomavirus, as well as to methods using these various products for the in vitro diagnosis of papillomavirus infections and, for some of them, for vaccination against these same papillomaviruses. or papillomavirus variants.
  • product genetically or immunologically linked to a papillomavirus means the various products derived from its initial DNA, whether they are corresponding RNAs or recombinant DNAs containing all or part of this initial DNA, expression products of these DNAs, where appropriate recombinant, in competent cell hosts and antibodies directed against these products. They are therefore polypeptides resulting from the transcription and translation of all or part of the different open reading phases of the initial DNA. They are also antibodies induced in vivo by said polypeptides.
  • papillomavirus covers a large number of viruses having in common to be held responsible for several forms of viral infections spreading between skin warts or relatively benign mucous membranes and hyperplasias liable to degenerate into intra- neoplasias. epithelial and in skin or mucosal cancers.
  • papillomavirus infections mention will also be made more particularly of skin warts (in particular, common and plantar warts), wart-shaped epidermodysplasia, flat or intermediate skin or mucous warts, intraepithelial neoplasia and skin cancer, epidermodysplasia wart cancer, intraepithelial neoplasia and cancer of the cervix and genitals external, condylomas and papiHomes.
  • skin warts in particular, common and plantar warts
  • wart-shaped epidermodysplasia flat or intermediate skin or mucous warts
  • intraepithelial neoplasia and skin cancer epidermodysplasia wart cancer
  • intraepithelial neoplasia and cancer of the cervix and genitals external condylomas and papiHomes.
  • papillomaviruses although very different from each other, have sizes of the order of 7000-8000 base pairs.
  • their genomes may have certain degrees of homology, evaluated in hybridization tests carried out under conditions known as “non-stringent” or “not strict” or, on the contrary, under conditions of “stringent hybridization” or " strict ".
  • Hybridization tests under non-strict or non-stringent conditions involve the mutual contacting of DNAs originating from two virus isolates under the following conditions described by HEILMAN CA. et al, 1980, J. Virol., 3, 395-407, and CROISSANT et al, 1982, CR Acad. Se. Paris, 294, 581-586 (heteroduplex molecules). It will be recalled that these non-strict or non-stringent conditions imply the performance of hybridization tests under the following conditions, in particular of medium and temperature: Non-strict conditions (Tm-40 , C);
  • Hybridization tests under strict or stringent conditions involve the mutual contacting of DNAs originating from two virus isolates under the conditions described by KREMSDORF, D. ET AL. ((1982), J. Virol. 43_: 436-447 and 1983, J. Virol. 4_8: 340-351) and Davis R.. et al., 1971, Methods Enzy ol., 21, 413-418 (heteroduplex molecules).
  • papillomaviruses which exhibit percentages of cross-hybridization of less than 50% under strict or stringent conditions belong to different types. Viruses for which we observe, under these strict or stringent conditions, percentages (or degrees) of hybridization greater than 50% are considered to belong to the same type. They can form different subtypes within this same type.
  • two HPVs belong to different types if their genomes have less than 50% cross hybridization under strict hybridization conditions, that is to say after hybridization in saturated liquid medium and treatment of SI nuclease hybrids.
  • Two HPVs represent subtypes of the same type if their genomes have incomplete homology, but greater than 50%. Differences in only a small number of cleavage sites by restriction enzymes define variants.
  • DNA-HPVs DNAs derived from these papillomaviruses, in particular genetic recombinants comprising all or part of the genomes (called DNA-HPVs) of these papillomaviruses, as hybridization probes.
  • DNA-HPVs genetic recombinants comprising all or part of the genomes
  • hybridization probes The use of mixtures or "cocktails" of DNA-HPVs, for the preparation of mixtures of hybridization probes, has also been described.
  • These mixtures of probes are then capable of being used, sometimes more effectively than isolated probes, for the in vitro diagnosis of various categories of infections, or even of the risk levels which accompany the discovery in a patient of certain papillomaviruses.
  • These categories of infections include those which are likely to be accompanied by genital neoplasia and, in particular, uterine cancer: see for example the cocktails indicated below (if we disregard DNA-HPV which is the object of the present invention).
  • the invention relates to a newly isolated papillomavirus, the genomic DNA which can be obtained from this new papillomavirus, fragments of this genomic DNA, as well as the new hybridization probes which can be formed from this DNA-HPV. or these DNA-HPV fragments.
  • HPV63 The DNA of this new HPV (hereinafter called HPV63), which has been isolated several times, from lesions having the clinical characteristics of genital intraepithelial neoplasias of the cervix, is characterized by the map of restriction shown in Figure 3 attached.
  • the physical map gives the position of sites of cleavages by various restriction endonucleases.
  • the origin of each card is constituted by a single cut-off site, in this case a BamHI site.
  • the distances of the other sites from the origin are expressed as a percentage of genome length.
  • the invention also relates to all variants of these papillomaviruses, belonging respectively to the same subtypes, therefore capable of hybridizing with 1 ⁇ DN-HPV63 under stringent conditions.
  • the invention also relates to "cocktails" of probes already described in the prior patents, but however supplemented with a probe derived from the papillomavirus according to the present application and, consequently, even more advanced diagnostic kits or “kits”.
  • Hybridization probes constructed from the genome of HPV63 are particularly useful, for diagnosis and / or screening in vitro, under the conditions which have been described in the prior patents and which will be recalled below, of the types of papillomavirus which constitute a risk, in particular of genital neoplasias and cancers of the cervix.
  • the invention also relates to fragments of each of 1 ⁇ DN-HPV63 or to DNA fragments, in particular of equivalent length, capable of hybridizing with the preceding one, in particular under strict conditions.
  • it relates to the recombinant DNAs containing all or part of the DNA-HPV mentioned above, and more particularly to the recombinant DNAs containing, respectively, fragments corresponding to the El, E2, E4, E6-E7, L1, L2 genes and to the intergenic region, NC, or alternatively fragments containing sequences corresponding to the intergenic regions of each of said DNA-HPVs.
  • probes which can be formed from these DNA-HPV or to starting from any fragment contained in this DNA-HPV, since it is capable of hybridizing with the previous one under strict conditions and under non-strict conditions with the DNA-HPV corresponding to the types previously described HPV16, HPV18 and HPV33 and in vitro diagnostic methods involving said probes or the mixtures containing them.
  • HPV63 Molecular cloning and characterization of a new type of HPV associated with genital neoplasias
  • HPV16 The new type of HPV has been demonstrated in DNA extracted from mild dysplasia (grade I intraepithelial neoplasia), by hybridization under non-strict conditions (Tm-40%), using a mixture of specific probes for HPV16, 18 and 33.
  • Tm-40% non-strict conditions
  • the study of the sensitivity of this DNA to various restriction endonucleases has shown that the BamHI enzyme once cuts the viral sequences, generating molecules of about 8
  • the recombinant plasmids were detected by hybridization of replicas of the infected bacterial cultures, with a mixture of the probes corresponding to types 16, 18 and 33, under non-strict conditions. Several recombinant plasmids, containing all of the viral sequences, have been isolated. The cleavage of the recombinant plamides by the BamHI insertion enzyme generates an 8 Kb fragment which hybridizes with probes 16, 18 and 33 under non-strict conditions. Cleavage of recombinant plasmids and DNA of the original lesion by mixing enzymes
  • the invention therefore also relates to any recombinant DNA containing the above-mentioned DNA-HPV or fragments of this DNA-HPV, in particular hybridization probes formed from these recombinant DNAs and specially adapted for the detection of '' an infection by the papillomavirus according to the invention or of a variant or subtype of this papillomavirus.
  • hybridization probes formed from these recombinant DNAs and specially adapted for the detection of '' an infection by the papillomavirus according to the invention or of a variant or subtype of this papillomavirus.
  • These probes can either be labeled themselves or be modified at the level of certain nucleotides, in particular with a view to their coupling, direct or indirect, with a separate marker.
  • nucleic acids possibly contained in the test sample for its possible DNA content of the corresponding papillomavirus or 1 • one of its variants.
  • the method according to the invention for the in vitro diagnosis on a biological sample to be tested is therefore characterized by bringing a probe as defined above into contact with the nucleic acids of this sample, if necessary previously made accessible to the probe, preferably under stringent hybridization conditions, and by detecting the hybrid formed between the desired viral DNA, possibly present in the sample and said probe.
  • HPV63 radioactive probes prepared from the DNA of the purified HPV63 made it possible to determine the pathogenic power of this virus.
  • HPV63 is therefore a type of genital tropism HPV with oncogenic potential. It is very desirable to incorporate it into everything mixture of HPV DNA intended for the preparation of molecular probes, for the diagnosis or screening of the types of HPV constituting a risk for the development of genital neoplasias and, in particular, cervical cancers.
  • the probe is therefore associated with probes derived from other papillomaviruses, in particular from those designated below:
  • HPV16 18, 33, 39, 54 or alternatively still, with HPV6, 11, 42, 54, for the in vitro diagnosis of genital neoplasms and cancers of the cervix, condylomas and papillomas,
  • each of the probes according to the invention or the mixtures containing the above-mentioned probe can in particular be used as follows, it being understood of course that the diagnostic tests described cannot be considered as limiting the conditions of use of the probes or mixtures of probes according to the invention.
  • this involves, for example, identifying an HPV in a biopsy, in cells obtained by scraping lesions, or in biopsy sections fixed by the Carnoy mixture (ethanol, chloroform, acetic acid 6 : 3: 1) and included in the paraffin.
  • the examination requires the prior extraction of DNA from the samples according to methods of which the principle is known and involves the analysis of this DNA by molecular hybridization experiments, carried out under strict or less strict conditions, to using radioactive probes (labeled with 32 p or 35 S) prepared from the HPV according to the invention or mixtures of DNAs or HPVs containing it.
  • radioactive probes labeled with 32 p or 35 S
  • This method comprises, after denaturation of the DNA, the deposit of an aliquot of DNA on membranes (nitrocellulose or "Genescreenplus”), the hybridization of each membrane, under the usual conditions, with a mixture of probes and the detection of radioactive hybrids, by exposure of the membranes to contact with an x-ray film.
  • a replica hybridization method can also be used. This method comprises the electrophoretic separation in agarose gel of the DNA fragments generated after treatment of the DNA by restriction enzymes, the transfer of the fragments, after alkaline denaturation, on membranes (nitrocellulose, "Genescreenplus”) and their hybridization, under usual conditions, with the appropriate mixture of probes. The formation of radioactive hybrids is detected after exposure of the membranes in contact with an X-ray film.
  • the radioactive probes consist either of DNAs from HPVs labeled by the nick-translation method, or by RNAs prepared by transcription of viral DNAs inserted into a vector, for example of the SP6 type.
  • the use of radioactive probes has the advantage of great sensitivity, but this does not exclude the use of non-radioactive probes, for example biotinylated probes which are capable of being recognized by antibodies or labeled themselves, either themselves recognized by antibodies carrying an enzymatic, fluorescent marker, etc.
  • the invention also relates to competent cell cultures transformed with recombinant DNAs of the above-mentioned type, in particular those in which the nucleotide sequence corresponding to the papillomavirus DNA is placed under the control of elements for transcription and regulation of this nucleotide sequence in said cell culture.
  • the invention relates to the polypeptides resulting in particular from the respective expressions of the El, E2, E4, E6, E7, Ll, L2 genes of 1 ⁇ DN-HPV63.
  • the process according to the invention for the production of these polypeptides therefore comprises the transformation of competent cell cultures with the recombinant DNAs containing the corresponding nucleotide sequences originating from HPV63, so that the nucleotide sequence corresponding to one of said proteins can be expressed in this cell host, the recovery of these polypeptides from the products synthesized by the competent cell host and the purification (for example by contacting the expression products previously extracted from the cell cultures or from the medium in which these have been developed, with antibodies previously formed against such polypeptides).
  • the expression products of the L2 sequences of each of the papillomavirus genomes according to the invention are however of very particular interest, in that they can themselves be used for the in vivo production of antibodies capable of recognizing the products of expression of the L2 gene in biological samples affected by a papillomavirus of the HPV63 type or of a variant thereof, and this more particularly when the preparations of the genus in question have been previously fixed.
  • the invention also relates to hybrid polypeptides containing the above-mentioned polypeptides and respectively derived from HPV63, for example the L2 protein fused to other polypeptide sequences, insofar as these do not essentially modify the immunogenic properties of the protein. L2.
  • these other polypeptide fragments can in particular result from the mode of production used for these hybrid polypeptides, for example by genetic engineering.
  • these hybrid polypeptides contain a sequence derived from ⁇ -galactosidase.
  • Such products can in particular be obtained by transformation of E. coli with appropriate vectors (phages or plasmids) modified by all or part of the lactose operon and comprising, in addition, inserted downstream of the promoter of the lactose operon (or any other suitable promoter, for example phage ⁇ ), the nucleotide sequence derived from an L2 gene derived from the papillomavirus concerned according to the invention.
  • plasmids or phages of this type comprising at least part of the gene for the ⁇ -galactosidase of the lacton operon.
  • the polypeptides according to the invention can also, when they have been purified, be used in techniques for purifying the antibodies which correspond to them, in particular from sera from animals which had been immunized with these polypeptides.
  • these polypeptides can be fixed on affinity columns.
  • the antibody purification operations then consist in passing the serum containing them in contact with affinity columns carrying the above-mentioned polypeptides.
  • the antibodies selectively attached to these columns can then be recovered by dissociation of the antigen-antibody complexes, using an appropriate buffer, having an adequate ionic strength, for example an aqueous solution of a salt such than ammonium acetate. Acidified solutions can also be used.
  • the invention also relates to a method for producing antibodies against said polypeptides, in particular against the expression products of the E6, E7 or, preferably L2 genes of HPV63, this method comprising the immunization of a suitable living host with said polypeptides and the recovery of the antibodies formed from a serum of the immunized host, in particular by bringing these sera into contact with the polypeptides corresponding to the purified state and by the recovery of these antibodies from the antigen- antibodies formed.
  • the invention relates to the compositions involving the antibodies according to the invention (or groups containing these antibodies in association with antibodies from other papillomaviruses), in particular the compositions containing the antibodies derived from the compositions or "cocktails" of DNA-HPVs listed above and to which it is again referred to in the following (or groups of corresponding antibodies).
  • the invention relates to the above-mentioned antibodies or mixtures of antibodies, previously purified, in association with an appropriate pharmaceutical vehicle.
  • This composition is then capable of being used for the treatment of the given condition, as soon as it has been diagnosed clinically, after an in vitro diagnostic test on a histological or cytological sample taken of the patient.
  • This composition (in particular in the form of a serum) can be administered, preferably parenterally. This serum is then capable of causing a regression of the infections induced by papillomaviruses of the HPV63 type.
  • These antibodies can more particularly be used in tests for the diagnosis of an infection with respect to one of the papillomaviruses according to the invention or of variants of these papillomaviruses, insofar as histological sections coming from infected persons may also contain expression products of certain of the structural genes, in particular L2, of papillomaviruses of the same type.
  • the invention therefore also relates to a method for in vitro diagnosis, in particular of general neoplasias and cancers of the cervix, comprising bringing into contact histopathological sections originating from lesions induced in the persons concerned under conditions allowing production of an antigen-antibody complex and the detection of this antigen-antibody complex.
  • the detection is done on preparations fixed beforehand under dissociating conditions, for example with the medium or mixture of CARNOY already mentioned above (also described in the work of L. LISON, entitled "Histochemistry and cytochemistry of animals”) .
  • the anti-L2 antibodies which may be attached can be recognized by other antibodies formed against the former, these other antibodies carrying appropriate markers, preferably non-radioactive. These markers are for example of an enzymatic or fluorescent nature.
  • the antibodies thus selected can therefore be used to diagnose in vitro the types of corresponding conditions.
  • the invention finally relates to the corresponding vaccine compositions containing one or preferably several other L2 proteins, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle suitable for the chosen mode of administration, in particular by parenteral.
  • a pharmaceutically acceptable vehicle suitable for the chosen mode of administration in particular by parenteral.
  • the strain containing 1 ⁇ DN-HPV63 was deposited at the CNCM on December 21, 1989 under the deposit number 1-918.
  • the strain deposited consists of a culture of E. coli K12 strain NM522 harboring a recombinant plasmid BamHI itself containing the DNA of HPV63.

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Abstract

L'invention concerne une sonde de papillomavirus dérivés d'ADN-HPV63 déposé à la CNCM le 21 décembre 1989 sous le numéro de dépôt I-918. Cette sonde est utilisable pour la détection in vitro, par hybridation avec les ADNs contenus dans un échantillon biologique humain, de néoplasies génitales ou de cancers du col de l'utérus.

Description

SONDE A PAPILLOMAVIRUS (HPV63) , NOTAMMENT POUR LE
DIAGNOSTIC IN VITRO D'INFECTIONS A PAPILLOMAVIRUS,
POUVANT S'ACCOMPAGNER DE NEOPLASIES GENITALES, ET
PRODUITS GENETIQUEMENT ET IMMUNOLOGIQUEMENT LIES A CE
PAPILLOMAVIRUS. L'invention concerne un ADN de papillomavirus (HPV63) ou des variants de ce papillomavirus, et plus paticulièrement des sondes dérivées de ce papillomavirus. Elle concerne aussi des produits génétiquement et im unologiquement liés à ce papillomavirus, ainsi que des procédés mettant en oeuvre ces divers produits pour le diagnostic in vitro d'infections à papillomavirus et, pour certains d'entre eux, pour la vaccination contre ces mêmes papillomavirus ou variants de papillomavirus.
Par l'expression "produit génétiquement ou immunologiquement liés à un papillomavirus", il faut entendre les divers produits dérivés de son ADN initial, qu'il s'agisse des ARNs correspondants ou d'ADNs recombinants contenant tout ou partie de cet ADN initial, des produits d'expressions de ces ADNs, le cas échéant recombinants, dans des hôtes cellulaires compétents et des anticorps dirigés contre ces produits. Il s'agit donc de polypeptides résultant de la transcription et de la traduction de tout ou partie des différentes phases de lecture ouvertes de 1'ADN initial. Il s'agit encore d'anticorps induits in vivo par lesdits polypeptides.
L'expression "papillomavirus" recouvre un grand nombre de virus ayant en commun d'être tenus pour responsables de plusieurs formes d'infections virales s'étageant entre les verrues cutanées ou de muqueuses relativement bénignes et des hyperplasies susceptibles de dégénérer en néoplasies intra-épithéliales et en cancers cutanés ou muqueux. Parmi des infections à papillomavirus, on mentionnera également plus particulièrement les verrues cutanées (en particulier, verrues vulgaires et plantaires), 1'épidermodysplasie verruciforme, les verrues planes ou intermédiaires cutanées ou muqueuses, les néoplasies intraépithéliales et cancers cutanés, les cancers de l'épidermodysplasie verruciforme, les néoplasies intraépithéliales et cancers du col de l'utérus et des organes génitaux externes, les condylomes et papiHomes.
Un certain nombre de types de papillomavirus a déjà été décrit. On mentionnera à titre d'exemples ceux décrits dans le brevet principal français n° 84.18369/ 2.578.267 et ses certificats d'addition n* 85.07073/ 2.581.655, le brevet n" 86.01425/2.593.828 et le brevet n° 88.08324 déposé en juin 1988, tous relatifs à des types et sous-types nouveaux de papillomavirus qui ont été isolés à partir de verrues ou lésions maculaires disséminées, parmi lesquels certains davantage susceptibles que d'autres de donner lieu au développement précoce de néoplasies génitales, notamment de cancers du col de l'utérus, chez les malades qui en sont affectés.
D'une façon générale, il a été remarqué dans les brevets antérieurs que les papillomavirus, bien que très différents entre eux, avaient des tailles de l'ordre de 7000-8000 paires de bases. En outre, leurs génomes peuvent présenter certains degrés d'homologie, évalués dans des essais d'hybridation réalisés dans des conditions dites "non stringentes" ou "non strictes" ou, au contraire, dans des conditions "d'hybridation stringente" ou "stricte".
Les essais d'hybridation dans les conditions non strictes ou non stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions suivantes décrites par HEILMAN CA. et al, 1980, J. Virol., 3 , 395-407, et CROISSANT et al, 1982, C.R. Acad. Se. Paris, 294, 581-586 (molécules hétéroduplexes) . On rappelle que ces conditions non strictes ou non stringentes impliquent la réalisation des essais d'hybridations dans les conditions, notamment de milieu et de température, suivantes : Conditions non strictes (Tm-40,C) ;
L'hybridation est effectuée à 2βC dans une solution contenant : 50 mM de tampon phosphate de sodium pH=6,5 ; 5XSSC (lxSSC=0,15 M NaCl, 0,015 M Na Citrate) ; 20 % de formamide ; 200 ug/ml d'ARN de transfert de levure ; 0,02 % de solution de Denhart.
Les essais d'hybridation dans les conditions strictes ou stringentes impliquent la mise en contact mutuelle d'ADNs provenant de deux isolats de virus dans les conditions décrites par KREMSDORF, D. ET AL. ((1982), J. Virol. 43_:436-447 et 1983, J. Virol. 4_8:340-351) et Davis R. . et al., 1971, Methods Enzy ol., 21, 413-418 (molécules hétéroduplexes) .
On rappelle que ces conditions strictes ou stringentes impliquent la réalisation des essais d'hybridations dans les conditions, notamment de milieu et de température, suivantes : Conditions strictes (Tm-20'C) ;
L'hybridation est effectuée à 42βC dans une solution contenant : 50 M de tampon phosphate de sodium pH=6,5 ; 5xSSC (lxxSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na Citrate) ; 50 % de formamide ; 200 ug/ml d'ARN de transfert de levure ; 0,02% de solution de Denhart.
Il a été dit dans les brevets antérieurs que les papillomavirus qui présentent des pourcentages d'hybridation croisée inférieurs à 50 % dans des conditions strictes ou stringentes appartenaient à des types différents. Les virus pour lesquels on observe, dans ces conditions strictes ou stringentes, des pourcentages (ou degrés) d'hybridation supérieurs à 50 % sont considérés comme appartenant au même type. Ils peuvent former des sous-types différents au sein de ce même type. Pour mémoire, on rappellera que deux HPV appartiennent à des types différents si leurs génomes présentent moins de 50 % d'hybridation croisée dans des conditions strictes d'hybridation, c'est-à-dire après hybridation en milieu liquide à saturation et traitement des hybrides par la nucléase SI. Deux HPV représentent des sous-types du même type si leurs génomes présentent une homologie incomplète, mais supérieure à 50 %. Des différences ne portant que sur un petit nombre de sites de coupure par des enzymes de restriction définissent des variants.
Les brevets antérieurs ont également décrit l'utilisation des ADNs dérivés de ces papillomavirus, en particulier de recombinants génétiques comprenant tout ou partie des génomes (dénommés ADN-HPVs) de ces papillomavirus, en tant que sondes d'hybridation. L'utilisation de mélanges ou "cocktails" d'ADN-HPVs, pour la préparation de mélanges de sondes d'hybridation, a également été décrite. Ces mélanges de sondes sont alors susceptibles d'être mis en oeuvre, quelquefois plus efficacement que des sondes isolées, pour le diagnostic in vitro de diverses catégories d'infections, voire des niveaux de risques qui accompagnent la découverte chez un patient de papillomavirus déterminés. Au titre de ces catégories d'infections, on citera celles qui sont susceptibles de s'accompagner de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers de l'utérus : voir par exemple les cocktails indiqués plus loin (si l'on fait abstraction de l'ADN-HPV qui est l'objet de la présente invention) .
Pour mémoire, on citera, parmi les sondes susceptibles d'être mises en oeuvre dans les essais de diagnostic in vitro susmentionnés, celles qui peuvent être constituées à partir de sondes HPV54, HPV55 (a et b) , décrites dans le brevet n" 88.08324 et dont les cartes de restriction ont été reproduites dans les figures 1 et 2 des dessins ci-annexés.
L'invention concerne un papillomavirus nouvellement isolé, l'ADN génomique qui peut être obtenu à partir de ce nouveau papillomavirus, des fragments de cet ADN génomique, ainsi que les nouvelles sondes d'hybridation qui peuvent être formées à patir de cet ADN-HPV ou de ces fragments d'ADN-HPV.
L'ADN de ce nouvel HPV (ci-après dénommé HPV63) , qui a été isolé à plusieurs reprises, à partir de lésions présentant les caractéristiques cliniques des néoplasies intra-épithéliales génitales du col de l'utérus, est caractérisé par la carte de restriction faisant l'objet de la figure 3 jointe.
La carte physique donne la position de sites de coupures par diverses endonucléases de restriction. L'origine de chaque carte est constituée par un site unique de coupure, en l'occurrence un site BamHl. Les distances des autres sites par rapport à l'origine sont exprimées en pourcentage de longueur de génome.
La découverte de ce nouveau papillomavirus et la production des ADNs qui peuvent en être dérivés fournit donc la possibilité de réaliser des diagnostics plus affinés, notamment des infections à 1'origine de lésions génitales imputables à des papillomavirus ou susceptibles de se développer sous l'effet de ces derniers, et de mieux pronostiquer le degré de risque que ces infections se transforment en des maladies plus redoutables.
L'invention concerne également tous les variants de ces papillomavirus, appartenant respectivement aux mêmes sous-types, donc capables de s'hybrider avec 1ΑDN-HPV63 dans des conditions stringentes.
L'invention concerne encore des "cocktails" de sondes déjà décrits dans les brevets antérieurs, mais cependant complétés avec une sonde dérivée du papillomavirus selon la présente demande et, par conséquent, des trousses ou "kits" de diagnostic encore davangage perfectionnés.
Les sondes d'hybridation construites à partir du génome de HPV63 sont particulièrement utiles, pour le diagnostic et/ou le dépistage in vitro, dans les conditions qui ont été décrites dans les brevets antérieurs et qui seront encore rappelées plus loin, des types de papillomavirus qui constituent un risque, notamment de néoplasies génitales et cancers du col de 1'utérus.
Ces sondes d'hybridation sont avantageusement incorporées à des "cocktails" de diagnostic des affections du même type. Il est encore fait référence aux brevets antérieurs dans lesquels figurent les cartes de restriction des constituants autres que HPV54, 55a et 55b de ces mélanges de diagnostic. A ce titre, les brevets antérieurs doivent être considérés comme faisant partie de la présente description, pour ce qui est de 1'identification des autres ADN-HPVs entrant dans la composition de ces "cocktails".
L•invention concerne également des fragments de chacun de 1ΑDN-HPV63 ou des fragments d'ADN, en particulier de longueurs équivalentes, capables de s'hybrider avec le précédent, notamment dans des conditions strictes. De même, elle concerne les ADNs recombinants contenant tout ou partie des ADN-HPV sus- indiqués, et plus particulièrement des ADNs recombinants contenant, respectivement, des fragments correspondant aux gènes El, E2, E4, E6-E7, Ll, L2 et à la région intergénique, NC, ou encore des fragments contenant des séquences correspondant aux régions intergéniques de chacun desdits ADN-HPV. Elle concerne aussi les sondes qui peuvent être constituées à partir de ces ADN-HPV ou à partir de tout fragment contenu dans cet ADN-HPV, dès lors qu'il est capable de s'hybrider avec le précédent dans des conditions strictes et dans des conditions non strictes avec les ADN-HPV correspondant aux types antérieurement décrits HPV16, HPV18 et HPV33 et les procédés de diagnostic in vitro mettant en jeu lesdites sondes ou les mélanges les contenant.
Clonage moléculaire et caractérisation d'un nouveau type d'HPV associé à des néoplasies génitales (HPV63) :
Le nouveau type d'HPV a été mis en éidence dans l'ADN extrait d'une dysplasie légère (néoplasie intraépithéliale de grade I) , par hybridation dans des conditions non strictes (Tm-40 %) , à l'aide d'un mélange de sondes spécifiques des HPV16, 18 et 33. L'étude de la sensibilité de cet ADN à diverses endonucléases de restriction a montré que l'enzyme BamHI coupait une fois les séquences virales, générant des molécules d'environ 8
Kb (taille d'un génome linéarisé d'HPV). Après digestion de la préparation d'ADN par BamHI, les molécules d'ADN de
8 Kb ont été insérées dans le plasmide pUC18, au site unique BamHI, et clonées dans Escherichia coli K12
(souche C600) . Les plasmides recombinants ont été détectés par hybridation de répliques des cultures bactériennes infectées, avec un mélange des sondes correspondant aux types 16, 18 et 33, dans des conditions non strictes. Plusieurs plasmides recombinants, contenant la totalité des séquences virales ont été isolés. La coupure des plamides recombinants par 1•enzyme d'insertion BamHI engendre un fragment de 8 Kb qui hybride avec les sondes 16, 18 et 33 dans des conditions non strictes. La coupure des plasmides recombinants et de l'ADN de la lésion d'origine par le mélange des enzymes
PstI plus BamHI engendre les mêmes trois fragments dont la somme des poids moléculaires est égale à la taille d'un génome de papillomavirus. Une carte de restriction de l'ADN viral a été établie à partir de l'étude de la sensibilité de cet ADN à 19 enzymes, ce qui a permis de localiser 8 sites de coupure (figure 1) . La carte ainsi établie est différente de celle des génomes d'HPV décrits à ce jour. Le degré d'homologie de séquence entre l'ADN du nouvel HPV et l'ADN des autres HPV a été analysé par des expériences de transfert-hybridation effectuées dans des conditions très strictes (Tm-10"C) . Aucune hybridation croisée n'a été détectée dans ces conditions avec l'ADN des HPV déjà décrits. Le nouvel HPV ainsi caractérisé constitue donc un nouveau type d'HPV, dénommé HPV63.
L'analyse, au microscope électronique, de molécules hétéroduplexes formées, dans différents conditions, entre l'ADN du HPV63 et l'ADN du HPV16 a permis d'aligner les cartes physiques des deux génomes et de définir la position théorique des différents gènes portés par l'ADN du HPV63.
Localisation putative des principaux gènes et de la région de régulation du HPV63 sur la carte de ce génome :
Coordonnées des extrémités
5' 3'
E6-E7 71 81
El 19 5,8
E2 4,7 19
L2 22,5 41,2
Ll 40 60,7
Région de régulation 60,7 71
D' ne façon générale, 1'invention concerne donc également tout ADN recombinant contenant 1'ADN-HPV susdit ou des fragments de cet ADN-HPV, en particulier des sondes d'hybridation formées de ces ADNs recombinants et spécialement adaptées à la détection d'une infection par le papillomavirus selon l'invention ou d'un variant ou sous-type de ce papillomavirus. Ces sondes peuvent, soit être marquées elles-mêmes, soit être modifiées au niveau de certains nucléotides, notamment en vue de leur couplage, direct ou indirect, avec un marqueur distinct. Il va de soi que dans ces sondes les parties étrangères à la séquence nucléotidique correspondante à l'ADN du papillomavirus et provenant normalement d'un vecteur de clonage, sont telles qu'elles ne risquent pas d'hybrider dans des conditions stringentes avec les autres acides nucléiques éventuellement contenus dans l'échantillon testé pour sa teneur éventuelle en ADN du papillomavirus correspondant ou de 1•un de ses variants.
Le procédé selon 1'invention pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique à tester, provenant normalement d'un patient humain, d'une infection par un papillomavirus pouvant entraîner ou ayant entraîné une néoplasie génitale et/ou un cancer du col de l'utérus, est donc caractérisé par la mise en contact d'une sonde telle que ci-dessus définie avec les acides nucléiques de cet échantillon, le cas échéant préalablement rendus accessibles à la sonde, de préférence dans des conditions d'hybridation stringentes, et par la détection de l'hybride formé entre l'ADN viral recherché, éventuellement présent dans l'échantillon et ladite sonde.
L'utilisation de sondes radioactives préparées à partir de l'ADN du HPV63 purifié a permis de déterminer le pouvoir pathogène de ce virus. La recherche de l'ADN du HPV63 dand 94 préparations d'ADN extraites de lésions génitales contenant des génomes d'HPV différents de ceux identifiés à ce jour, a permis de révéler la présence de l'ADN du HPV63 dans six néoplasies intraépithéliales du col de l'utérus (6,4 %) . HPV63 constitue donc un type d'HPV à tropisme génital présentant un potentiel oncogène. Il est très souhaitable de l'incorporer à tout mélange d'ADN d'HPV destiné à la préparation de sondes moléculaires, en vue du diagnostic ou du dépistage des types d'HPV constituant un risque pour le développement de néoplasies génitales et, en particulier, de cancers du col de l'utérus.
Dans une variante de l'invention, la sonde est donc associée à des sondes dérivées d'autres papillomavirus, en particulier de ceux désignés ci-après :
- HPV16, 18, 33, 39, 54 ou en variante encore, avec les HPV6, 11, 42, 54, pour le diagnostic in vitro de néo¬ plasies génitales et cancers du col de l'utérus, les condylomes et les papillomes,
- HPV6, 11, 42, 55, plus particulièrment lorsque les diagnostics, groupés portent aussi sur les condylomes et papillomes.
Chacune des sondes selon 1*invention ou les mélanges contenant la susdite sonde peuvent notamment être utilisés comme suit, étant naturellement entendu que les essais de diagnostic décrits ne sauraient être considérés comme limitatifs des conditions d'emploi des sondes ou mélanges de sondes selon l'invention.
Dans l'exemple considéré, il s'agit par exemple d'identifier un HPV dans une biopsie, dans des cellules obtenues par grattage de lésions, ou dans des coupes de biopsies fixées par le mélange de Carnoy (éthanol, chloroforme, acide acétique 6:3:1) et incluses dans la paraffine. L'Examen nécessite l'extraction préalable de l'ADN des prélèvements selon des méthodes dont le principe est connu et met en jeu 1'analyse de cet ADN par des expériences d'hybridation moléculaire, effectuées dans des conditions strictes ou moins strictes, à l'aide de sondes radioactives (marquées au 32 p ou au 35 S) préparées à partir de l'HPV selon l'invention ou de mélanges d'ADNs ou d'HPVs le contenant. Plusieurs méthodes d'hybridation peuvent être utilisées. On peut, par exemple, mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur tache. Cette méthode comporte, après dénaturation de l'ADN, le dépôt d'une quantité aliquote d'ADN sur des membranes (nitrocellulose ou "Genescreenplus", l'hybridation de chaque membrane, dans les conditions usuelles, avec un mélange de sondes et la détection des hybrides radioactifs, par exposition des membranes au contact d'un film radiographique. On peut aussi utiliser une méthode d'hybridation sur réplique. Cette méthode comprend la séparation électrophorétique en gel d'agarose des fragments d'ADN engendrés après traitement de l'ADN par des enzymes de restriction, le transfert des fragments, après dénaturation alcaline, sur des membranes (nitrocellulose, "Genescreenplus") et leur hybridation, dans les conditions usuelles, avec le mélange approprié de sondes. La formation d'hybrides radioactifs est détectée après exposition des membranes au contact d'un film radiographique.
Les sondes radioactives sont constituées soit par des ADNs d'HPVs marqués par la méthode de translation de coupure ("nick-translation") , soit par des ARNs préparés par transcription d'ADNs viraux insérés dans un vecteur, par exemple de type SP6. L'utilisation de sondes radioactives présente l'avantage d'une grande sensibilité, mais ceci n'exclut pas l'utilisation de sondes non radioactives, par exemple de sondes biotinylées et susceptibles d'être reconnues par des anticorps soit marqués eux-mêmes, soit eux-mêmes reconnus par des anticorps portant un marqueur enzymatique, fluorescent, etc...
L'invention concerne également des cultures cellulaires compétentes transformées avec des ADNs recombinants du type sus-indiqué, en particulier ceux dans lesquels la séquence nucléotidique correspondant à l'ADN du papillomavirus est placée sous le contrôle d'éléments de transcription et de régulation de cette séquence nucléotidique dans ladite culture cellulaire.
Par conséquent, elle concerne également les produits d'expression de ces ADNs recombinants dans les hôtes cellulaires compétents correspondants et les anticorps correspondants susceptibles d'être produits contre ces produits d'expression.
A ce titre, l'invention concerne les polypeptides résultant notamment des expressions respectives des gènes El, E2, E4, E6, E7, Ll, L2 de 1ΑDN-HPV63.
Le procédé selon 1'invention pour la production de ces polypeptides comprend par conséquent la transformation de cultures cellulaires compétentes avec les ADNs recombinants contenant les séquences nucléotidiques correspondantes issues de HPV63, de façon telle que la séquence nucléotidique correspondant à l'une desdites protéines puisse être exprimée dans cet hôte cellulaire, la récupération de ces polypeptides à partir des produits synthétisés par l'hôte cellulaire compétent et la purification (par exemple par mise en contact des produits d'expression préalablement extraits des cultures cellulaires ou du milieu dans lequel celles-ci ont été développées, avec des anticorps préalablement formés contre de tels polypeptides) .
Les produits d'expression des séquences L2 de chacune des génomes des papillomavirus selon l'invention présentent cependant un intérêt tout particulier, en ce qu'ils peuvent eux-mêmes être utilisés pour la production in vivo d'anticorps susceptibles de reconnaître les produits d'expression du gène L2 dans des prélèvements biologiques affectés par un papillomavirus du type HPV63 ou d'un variant de celui-ci, et ce plus particulièrement lorsque les préparations du genre en question ont préalablement été fixées. L'invention concerne encore des polypeptides hybrides contenant les polypeptides susdits et dérivés respectivement de HPV63, par exemple la protéine L2 fusionnée à d'autres séquences polypeptidiques, dans la mesure où celles-ci ne modifient pas de façon essentielle les propriétés immunogènes de la protéine L2. La présence de ces autres fragments polypeptidiques peut notamment résulter du mode de production utilisé de ces polypeptides hybrides, par exemple par génie génétique. Par exemple, ces polypeptides hybrides contiennent une séquence dérivée de la y9-galactosidase. De tels produits peuvent notamment être obtenus par transformation de E. coli avec des vecteurs appropriés (phages ou plasmides) modifiés par tout ou partie de l'opéron lactose et comportant en outre, insérée en aval du promoteur de 1'opéron-lactose (ou de tout autre promoteur approprié, par exemple de phage λ) , la séquence nucléotidique dérivée d'un gène L2 issu du papillomavirus concerné selon l'invention. On a avantageusement recours à des plasmides ou phages de ce type comprenant une partie au moins du gène de la ^-galactosidase de l'opéron-lactose.
Les polypeptides selon 1'invention peuvent également, lorsqu'ils ont été purifiés, être mis en oeuvre dans des techniques de purification des anticorps qui leur correspondent, notamment à partir de sérums d'animaux qui avaient été immunisés par ces polypeptides. En particulier, ces polypeptides peuvent ête fixés sur des colonnes d'affinité. Les opérations de purification des anticorps consistent alors à faire passer le sérum les contenant au contact de colonnes d'affinité portant les susdits polypeptides. Les anticorps sélectivement fixés sur ces colonnes peuvent ensuite être récupérés par dissociation des complexes antigènes-anticorps, au moyen d'un tampon approprié, présentant une force ionique adéquate, par exemple une solution aqueuse d'un sel tel que l'acétate d'ammonium. On peut également avoir recours à des solutions acidifiées.
L'invention concerne également un procédé de production d'anticorps contre lesdits polypeptides, en particulier contre les produits d'expression des gènes E6, E7 ou, de préférence L2 de HPV63, ce procédé comprenant l'immunisation d'un hôte vivant approprié avec lesdits polypeptides et la récupération des anticorps formés à partir d'un sérum de l'hôte immunisé, notamment par mise en contact de ces sérums ave les polypeptides correspondant à l'état purifié et par la récupération de ces anticorps à partir des complexes antigène-anticorps formés.
L'invention concerne enfin les compositions mettant en jeu les anticorps selon l'invention (ou groupes contenant ces anticorps en association avec ds anticorps issus d'autres papillomavirus), en particulier les compositions contenant les anticorps dérivés des compositions ou "cocktails" d'ADN-HPVs répertoriés plus haut et sur lesquels il est encore revenu dans ce qui suit (ou groupes d'anticorps correspondants).
En particulier, l'invention concerne les anticorps ou mélanges d'anticorps susdits, préalablement purifiés, en association avec un véhicule pharmaceutique approprié. Cette composition est alors susceptible d'être mise en oeuvre pour le traitement de l'affection donnée, dès lors que celle-ci aurait été diagnostiquée cliniquement, à 1'issue d'un essai de diagnostic in vitro sur un prélèvement histologique ou cytologique provenant du malade. Cette composition (notamment sous forme de sérum) peut être administrée, de préférence par voie parentérale. Ce sérum est alors susceptible de provoquer une régression des infections induites par des papillomavirus du type HPV63. Ces anticorps peuvent plus particulièrement être mis en oeuvre dans des essais de diagnostic d'une infection à l'égard de l'un des papillomavirus selon l'invention ou de variants de ces papillomavirus, dans la mesure où des coupes histologiques provenant des personnes infectées peuvent également contenir des produits d'expression de certains des gènes de structure, notamment L2, de papillomavirus du même type.
L'invention concerne donc encore un procédé de diagnostic in vitro, en particulier de néoplasies générales et de cancers du col de l'utérus, comprenant la mise en contact de coupes histopathologiques provenant de lésions induites chez les personnes concernées dans des conditions permettant la production d'un complexe antigène-anticorps et la détection de ce complexe antigène-anticorps. Avantageusement, la détection se fait sur des préparations fixées au préalable dans des conditions dissociantes, par exemple avec le milieu ou mélange de CARNOY déjà mentionné plus haut (également décrit dans l'ouvrage de L. LISON, intitulé "Histochimie et cytochimie animales") .
Les anticorps anti-L2 éventuellement fixés peuvent être reconnus par d'autres anticorps formés contre les premiers, ces autres anticorps portant des marqueurs appropriés, de préférence non radioactifs. Ces marqueurs sont par exemple de nature enzymatique ou fluorescente.
Les anticorps ainsi sélectionnés, comme les sondes d'hybridation sus-définies qui leur correspondent, peuvent par conséquent être utilisées pour diagnostiquer in vitro les types d'affections correspondants.
L'invention concerne enfin les compositions vaccinantes correspondantes contenant une ou de préférence plusieurs autres protéines L2, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté au mode d'administration choisi, notamment par voie parentérale. Ces compositions sont utilisables pour protéger les personnes soumises à de hauts risques d'infection par HPV63 ou par des papillomavirus de type correspondant.
La souche contenant 1ΑDN-HPV63 a été déposée à la CNCM le 21 décembre 1989 sous le numéro de dépôt 1-918. La souche déposée consiste en une culture de E. coli K12 souche NM522 hébergeant un plasmide recombinant BamHI contenant lui-même l'ADN de HPV63.
Il est rappelé que les HPV54, 55A et 55B ont été déposés à la CNCM (sous les formes aussi indiquées ci- dessous) le 6 mai 1988, sous les numéros suivants :
- PSP 64 HPV54 : 1-756
- PGM 4 HPV55A : 1-757
- PGM 4 HPV55B : 1-758.

Claims

REVENDICATIONS
1 - ADN de papillomavirus caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement en l'ADN caractérisé par la carte de restriction de la figure 3 ou en un fragment de celui-ci, ou encore en un ADN ou fragment d'ADN correspondant hybridant avec les précédents dans des conditions strictes.
2 - ADN de papillomavirus selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond à celui contenu dans le dépôt effectué auprès de la CNCM le 21 décembre 1989 sous le n" 1-918 ou à un fragment de celui-ci, ou encore en un ADN ou fragment d'ADN correspondant hybridant avec les précédents dans des conditions strictes.
3 - ADN selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il consiste en un fragment hybridant dans des conditions strictes avec HPV63 et dans des conditions non strictes avec HPV16, HPV18 ou HPV33.
4 - ADN selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit fragment correspond à 1'un des gènes suivants de HPV63 : El, E2, E4, E6-E7, Ll, L2 ou à tout ou partie de la région intergénique NC.
5 - Sonde d'hybridation constituée par un ADN dérivé de l'ADN selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6 - Polypeptide correspondant au produit d'expression de l'un des gènes de structure de l'un des ADNs de papillomavirus, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
7 - Polypeptide selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il consiste plus particulièrement en un produit d'expression de la séquence L2 du génome du papillomavirus HPV63.
8 - Anticorps dirigés contre le polypeptide selon la revendication 6 ou la revendication 7.
9 - Procédé de détection in vitro sur un échantillon biologique à tester, d'une infection par un papillomavirus du type HPV63, caractérisé par la mise en contact d'une sonde correspondante, telle que définie dans la revendication 5, avec les acides nucléiques de cet échantillon, le cas échéant préalablement rendus accessibles à la sonde, de préférence dans des conditions d'hybridation stringente, et par la détection de l'hybride formé entre l'ADN viral recherché, éventuellement présent dans l'échantillon, et ladite sonde.
10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le diagnostic in vitro est orienté vers la détection de néoplasies génitales, et de cancers du col de l'utérus.
11 - Application des anticorps selon la revendication 8 au diagnostic in vitro d'une infection par un papillomavirus d'un type susceptible d'induire des néoplasies génitales et des cancers du col de l'utérus, caractérisée par la mise en contact d'un anticorps, tel que défini dans la revendication 8, avec un échantillon biologique provenant de la personne soumise au diagnostic in vitro, et par la détection du complexe antigène- anticorps formé.
12 - Mélange d'ADNs de papillomavirus comprenant un ADN conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou une sonde conforme à la revendication 5, associé à plusieurs ADNs correspondants de papillomavirus distincts, notamment des suivants :
- HPVs 16, 18, 33, 39, 54
- HPVs 6, 11, 42, 54
- HPVs 6, 11, 42, 55,
- HPVs 6, 11, 42, 54 et 55.
13 - Mélange de polypeptides correspondant aux produits d'expression de gènes de structure des ADNs HPV de la revendication 12. 14 - Mélange d'anticorps dirigés contre les polypeptides selon la revendication 13.
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