DE19526717A1 - Verfahren zur Diagnose des Zervixkarzinoms - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diag­ nose des Zervixkarzinoms, das auf dem Nachweis von für ein krebserzeugendes Papillomavirus (HPV) spezifischer DNA oder RNA in einer Probe oberflächlicher Zellen im Bereich des Ge­ bärmuttermundes und des Gebärmutterhalses beruht. Die Erfin­ dung betrifft außerdem Kits zur Durchführung dieses Verfah­ rens.

Der Gebärmutterhalskrebs (Zervixkarzinom) ist der dritthäu­ figste Krebs bei Frauen in der westlichen Welt. Die derzeit gängige Krebsvorsorge hat eine Zelldiagnostik zur Grundlage, bei der oberflächliche Zellen des Gebärmutterhalses und des Muttermunds, deren Gestalt sich im Fortgang einer Krebsent­ wicklung ändert, untersucht werden (sog. Dysplasie = Zell­ formveränderung, die eine beginnende Entwicklung eines Ge­ bärmutterhalskrebses anzeigt). Die Infektion durch krebser­ zeugende Papillomviren (HPV), vor allem der Typen 16 (ca. 60% aller bösartigen Tumoren) und 18 (ca. 20% aller bösarti­ gen Tumoren), ist der ursächliche, wesentliche Faktor in der Entstehung dieses Krebses. Dabei verursachen annähernd 100% der HPV 16-Infektionen und mindestens 80% der HPV 18-Infek­ tionen einen Gebärmutterhalskrebs. Seit der Einführung der routinemäßig durchgeführten Krebsvorsorgediagnostik durch Untersuchung der Oberflächenzellveränderungen (nach Papanicoulaou) war es Anfang der 50er Jahre gelungen, den damals häufigsten Krebs der Frauen auf den dritten Platz zu verweisen. In der 3. und 4. Welt ist er noch heute der häu­ figste Krebs. Seit den letzten 4 Jahrzehnten konnte daran leider nichts wesentlich geändert werden. Dies liegt sicher­ lich an zwei wesentlichen Ursachen: Zum einen nehmen nicht alle Frauen in jährlichen Abständen an einer Routinevorsorge­ teil, zum anderen kann sich selbst bei regelmäßiger Vorsorge ein Gebärmutterhalskrebs im Intervall zwischen zwei Untersu­ chungsgängen vollständig entwickeln, ohne das sich bei einer der vorangegangenen Untersuchungen eine Oberflächenzellver­ änderung zeigte.

Werden im Rahmen einer Routinekrebsvorsorge auffällige Ober­ flächenzellen festgestellt, wird nach deren Entfernung eine Laserbestrahlung durchgeführt, die leider keine Gewißheit verschaffen kann, ob tatsächlich alle veränderten Zellen entfernt wurden. Alternativ dazu kann der Gebärmutterhals kegelförmig umschnitten werden (Konisation). Die diag­ nostisch höhere Sicherheit wird dabei leider durch eine um­ fangreiche Zerstörung des umliegenden gesunden Gewebes er­ kauft. Der so entstandene Gebärmutterhalsdefekt kann während einer Schwangerschaft zu einer sog. Gebärmutterhalsschwäche (Zervixinsuffizienz) führen, die operativ beseitigt werden muß (Cerclage) und gehäuft Ursache von Abgängen und Frühge­ burten ist.

Die therapeutische Konsequenz eines manifesten Gebärmutter­ halskrebses ist eine mehrstündige Operation, die eine weiträumige Entfernung der Gebärmutter und der Lymphknoten beinhaltet (Wertheim-Operation). Die Heilungsaussichten sind, trotz nachfolgender Bestrahlung, abhängig vom Stadium des Tumors, häufig leider nur begrenzt.

Im Gegensatz zu den Verhältnissen vor der Einführung der derzeitigen Routinevorsorge konnte zwar die Häufigkeit des manifesten Gebärmutterhalskrebses verringert werden, dennoch verursachen die therapeutischen Maßnahmen zum einen klinisch bedeutsame Nebenwirkungen und zum anderen hohe Kosten. Die­ ses nur bedingt befriedigende Ergebnis schlägt sich im dritthäufigsten Platz der Frauentumoren nieder, den dieser Tumor seit nunmehr vierzig Jahren unverändert innehält.

Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem war somit die Bereitstellung eines Verfahrens, das die vorstehend geschilderten Nachteile der im Stand der Technik bekannten Verfahren nicht aufweist, d. h. eine zu er­ wartende Gebärmutterhalskrebserkrankung in einem sehr frühen Stadium nachweisen kann und somit eine frühzeitige Therapie, vor einer manifesten Entartung, erlaubt.

Die Lösung dieses technischen Problems erfolgt durch die Be­ reitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausfüh­ rungsformen.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß durch die Diagnose einer stattgefundenen Infektion mit krebserzeu­ genden Papillomaviren in einer Gebärmutterhals-Epithelzellen enthaltenden Probe ein Zervixkarzinom in einem sehr frühen Stadium nachgewiesen werden kann. Somit betrifft die Erfin­ dung ein Verfahren zur Diagnose des Zervixkarzinoms, das da­ durch gekennzeichnet ist, daß für ein krebserzeugendes Pa­ pillomavirus (HPV) spezifische DNA oder RNA in Gebärmutter­ hals-Epithelzellen nachgewiesen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung der Zellpro­ ben auf krebserzeugende HPV-Virustypen gibt Aufschluß über die zu erwartende Entartung, lange bevor sich die Gestalt der Zellen verändert. Mit der herkömmlichen Routinediagno­ stik läßt sich zu diesem Zeitpunkt kein Hinweis auf eine ab­ sehbare tumoröse Veränderung zeigen. Eine Therapie, gestützt auf diesen Nachweis einer krebserzeugenden Virusinfektion, kann aber bereits zu diesem Zeitpunkt einsetzen, ist weniger umfangreich und somit auch kostengünstiger. Die Häufigkeit einer bereits manifesten Entartung durch die "gewonnene Vor­ laufzeit" ist auch meist geringer.

Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren in der Routine­ diagnostik dem Arzt einen wichtigen, entscheidenden zeitli­ chen Vorsprung verschaffen. Hierdurch kann die Patientin frühzeitiger auf ihre absehbare Erkrankung hingewiesen wer­ den und kann so die gewonnene Zeit für geeignete therapeuti­ sche Maßnahmen, beispielsweise für eine antivirale Therapie nutzen. Die Probeentnahme kann beispielsweise im Rahmen eines gewöhnlichen gynäkologischen Untersuchungsgangs als Abstrich (oberflächliches Zellmaterial) vom Gebärmuttermund, nach üblicher, dem Fachmann bekannter Vorgehensweise erfol­ gen.

Der Nachweis der DNA bzw. RNA krebserzeugender HPV kann, ge­ gebenenfalls nach vorheriger Aufarbeitung der Probe (Entfer­ nung von Proteinen durch Phenolextraktion und Konzentrierung der Nucleinsäuren über Ethanolfällung), über verschiedene, dem Fachmann bekannte Methoden erfolgen, beispielsweise über Hybridisierung mit nur an die DNA bzw. RNA krebserzeugender HPV unter üblichen Bedingungen hybridisierenden DNA-Sonden. Die Wahl geeigneter DNA-Sonden erfolgt anhand des Vergleichs der bekannten DNA-Sequenzen krebserzeugender bzw. nicht krebserzeugender HPV (H. zur Hausen, Deutsches Ärzteblatt 91, Heft 28/29 (1994); van den Brule et al., J. Clin. Microbiol. 30 (1992), 1716-1721; Beaudenon et al., Nature (London) 335 (1986), 246-249; Boshart et al., EMBO J. 3 (1984), 1151-1157; Dürst et al., PNAS (1986), 3812-3815; Lorincz et al., J. Gen. Virol. 70 (1989), 3099-3104; und Lorincz et al., Virology 159 (1987), 187-190). Eine stattge­ fundene Hybridisierung kann beispielsweise bei Verwendung von geeignet markierten Sonden über dem Fachmann bekannte Verfahren, beispielsweise "Southern", "Dot-Blot" etc., er­ folgen.

Zu den krebserzeugenden Papillomaviren (HPV) zählen bei­ spielsweise HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33, wobei HPV 16 und HPV 18 wie bereits vorstehend erwähnt, die klinisch be­ deutsamsten Stämme darstellen. Somit betrifft in einer be­ vorzugten Ausführungsform die vorliegende Erfindung ein Diagnoseverfahren zum Nachweis der krebserzeugenden Papillo­ maviren HPV 16 oder HPV 18.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das er­ findungsgemäße Diagnoseverfahren weiter dadurch gekennzeich­ net, daß die die spezifische HPV-DNA oder -RNA enthaltenden Gebärmutterhals-Epithelzellen nach Probeentnahme in einem ein anionisches Detergens enthaltenden Puffer aufbewahrt werden. Vor allem bei einer (kurz- oder längerfristigen) er­ forderlichen Lagerung der entnommenen Probe vor einer weite­ ren Aufarbeitung bzw. Untersuchung ist es wichtig, dafür Sorge zu tragen, daß die in der Probe enthaltenden Nuclein­ säuren keinem Abbau unterliegen, z. B. durch zelleigene Nucleasen oder durch sich physiologischerweise in der Scheide befindende Bakterien. Im Stand der Technik waren bisher keine für die erfindungsgemäßen Zwecke geeigneten Puffer beschrieben worden. Es stellte sich jedoch überra­ schenderweise heraus, daß eine für die Durchführung des er­ findungsgemäßen Verfahrens ausreichende Stabilität der in der Probe enthaltenen DNA oder RNA durch die Zugabe eines anionischen Detergens zum Puffer, in dem die Probe suspen­ diert wird, erreicht wird. Das in dem erfindungsgemäßen Pro­ benpuffer enthaltene anionische Detergens störte außerdem überraschenderweise die nachfolgenden Untersuchungsschritte nicht. Die weitere Zusammensetzung des Puffers entspricht den für die Aufbewahrung von solchen Proben üblicherweise verwendeten Zusammensetzungen und ist dem Fachmann bekannt.

Beispielsweise kann der Puffer 0,1 bis 0,2 M Tris-HCl, pH- Wert 7,5, enthalten.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Diagnoseverfahrens handelt es sich bei dem anionischen Detergens um Natriumdodecylsulfat (SDS), vor­ zugsweise in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 2 Gew.-%, besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 0,5 Gew.-%.

Der Nachweis der HPV-DNA oder -RNA kann nach vorangegangener Amplifikation über eine "Polymerase Chain Reaction" (PCR) unter Verwendung von 2 Primern, die spezifisch an die DNA oder RNA krebserzeugender HPV ausreichend hybridisieren, er­ folgen. Beim Nachweis von HPV-RNA wird diese vor der Ampli­ fikationsreaktion in DNA überführt, z. B. mittels des Enzyms Reverse Transkriptase. Durch das PCR-Verfahren, bei dem eine gewünschte Zielsequenz selektiv enzymatisch amplifiziert wird, kann eine hohe Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens erreicht werden. Dieses Verfahren und die zur Durchführung des Verfahrens erforderliche Aufbereitung der Probe sind dem Fachmann vertraut und auch z. B. ausführlich in EP-B1-0 201 184 und in Maniatis et al. "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben. Auch die Wahl geeigneter Primer kann aus diesen Veröffentlichungen abgeleitet werden. Beispielsweise sollten die Primer, die für die Amplifikation verwendet wer­ den, nur die Amplifikation krebserzeugender HPV-DNA oder -RNA gestatten. Dies kann dadurch erreicht werden, daß nach Vergleich der Sequenzen von krebserzeugenden und nicht krebserzeugenden HPV Primer (oder Sätze von Primern) entwor­ fen werden, die zu Sequenzen im wesentlichen komplementär sind (beispielsweise zu 100%), die nahezu ausschließlich für krebserzeugende HPV charakteristisch sind und keine Komplementarität zu solchen HPV-Sequenzen aufweisen, die von nicht-krebserzeugendem HPV stammen.

Der Nachweis der amplifizierten HPV-DNA oder -RNA kann über verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, z. B. über Agarose-Gelelektrophorese in Gegenwart eines Farbstoffs (z. B. Ethidiumbromid), der die Sichtbarmachung der amplifi­ zierten Nucleinsäure (z. B. bei UV-Bestrahlung) ermöglicht. In diesem Fall sollte der Abstand der beiden Primer so ge­ wählt werden, daß die amplifizierten Produkte eine geeignete Länge, beispielsweise 100 bis 1000 bp, aufweisen. Der Nach­ weis kann auch über Hybridisierung in einem "Dot-Blot", wie er in EP-B1-0 237 362 beschrieben ist, mittels einer ge­ eigneten Sonde erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Primer folgende Sequenzen:
5′-TTTGT TACTG TGGTA GATAC-3′
5′-GAAAA ATAAA CTGTA AATCA-3′.

Diese degenerierten Primer sind von v.d. Brule et al., J. Clin. Microbiology 28 (1990), 2739-2743, beschrieben und erlauben die selektive Amplifikation folgender HPV: HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33. Die bei Verwen­ dung dieser Primer erhaltenen positiven Befunde lassen den Schluß zu, daß es sich bei der Patientin, von der die Probe stammt, um eine Risikopatientin hinsichtlich des Zervixkar­ zinoms handelt, da sie nach Kontakt mit einem HPV-Virus von diesem infiziert wurde.

Der Nachweis der DNA oder RNA von krebserzeugenden HPV kann auch über eine "Ligase Chain Reaction" (LCR), unter Verwen­ dung von 2 doppelsträngigen Oligonucleotiden erfolgen, die nur bei Anwesenheit von DNA krebserzeugender HPV miteinander ligiert werden.

Dieses Verfahren und die zur Durchführung des Verfahrens er­ forderliche Aufbereitung der Probe und die Wahl geeigneter Oligonucleotide sind dem Fachmann vertraut (siehe auch bei­ spielsweise Lardegren et al., Science 241 (1988), 1077-1081). Die beiden doppelsträngigen Oligonucleotide werden so gewählt, daß sie nach Denaturierung nur mit der denaturier­ ten DNA von krebserzeugenden HPV unter üblichen Bedingungen ausreichend hybridisieren und nach erfolgter Hybridisierung unmittelbar benachbart sind, so daß sie durch eine DNA-Li­ gase ligiert werden können. Die ligierten Produkte können durch zahlreiche, dem Fachmann bekannte Verfahren nachgewie­ sen werden, beispielsweise durch die bereits vorstehend für das PCR-Verfahren beschriebenen Nachweismethoden. Die Aus­ wahl geeigneter Oligonucleotide kann beispielsweise anhand der von van den Brule, a.a.O., beschriebenen Sequenzen für verschiedene HPV-Stämme erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Nachweisverfahrens trägt mindestens einer der Primer oder eines der Oligonucleotide eine nachweisbare Mar­ kierung, beispielsweise eine radioaktive Markierung. Die Herstellung solcher markierter Primer bzw. Oligonucleotide kann durch im Stand der Technik bekannte Methoden erfolgen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Markierung um eine nicht-radioaktive Markierung, die beispielsweise einen spek­ troskopischen, photochemischen, biochemischen oder einen im­ munchemischen Nachweis der amplifizierten bzw. ligierten Produkte erlaubt, beispielsweise kann es sich dabei um eine Markierung mit einem Fluoreszenz-Farbstoff, einem Material mit hoher Elektronendichte, mit einem Enzym, beispielsweise alkalischer Phosphatase, Biotin etc. handeln. Beispielsweise kann bei der LCR ein Oligonucleotid mit einem Hapten, bei­ spielsweise Biotin, verknüpft werden und das andere Oligo­ nucleotid mit einer Reportergruppe, beispielsweise alkali­ scher Phosphatase, wodurch der Nachweis ligierter Produkte und damit des Vorhandenseins von DNA krebserzeugender HPV ohne die Notwendigkeit einer gelelektrophoretischen Auftren­ nung der Produkte erfolgen kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfin­ dungsgemäßen Nachweisverfahrens erfolgt der Nachweis der am­ plifizierten DNA nach Kopplung an einen Biosensor. Ein sol­ cher Biosensor wird beispielsweise von Kößlinger et al., Biosensors and Bioelectronics 7 (1992), 397-404 beschrieben.

Die Kopplung der DNA an den Biosensor und deren Nachweis er­ folgen wie nachstehend beschrieben: Die Kopplung kann über eine übliche Hybridisierungsreaktion wie sie dem Fachmann bekannt ist erfolgen und wie sie beispielsweise bei Southern-Blots etc. durchgeführt wird. Dabei kommt es gege­ benenfalls zur Anlagerung der Ziel-DNA (RNA)-Sequenz des nachzuweisenden HPV-Virus an die komplementäre Sequenz des am Quarz des Biosensors befestigten Oligonucleotids. Dies hat eine deutliche Massenänderung am Quarz zur Folge, was zu einer Resonanzfrequenzänderung des schwingenden Quarzes führt. Diese ist linear zur angelagerten Ziel-DNA (oder RNA), somit kann diese, gegebenenfalls quantitativ, nachge­ wiesen werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Kit, der die zum Nachweis des Vorhandenseins von für krebserzeugende HPV spezifischer DNA oder RNA mittels PCR erforderlichen Komponenten umfaßt, nämlich mindestens 2 Primer, die nur an diese DNA bzw. RNA ausreichend hybridisieren, ein Polymeri­ sationsmittel, beispielsweise eine hitzestabile DNA-Polyme­ rase, Nucleosidtriphosphate und gegebenenfalls Pufferlösun­ gen und Mittel zum Nachweis des amplifizierten Produkts. Vorzugsweise weisen die Primer folgende Sequenzen auf:
5′-TTTTGT TACTG TGGTA GATAC-3′
5′-GAAAA ATAAA GTGTA AATCA-3′.

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Kit, der die zum Nachweis des Vorhandenseins von für krebserzeugende HPV spezifische DNA mittels LCR erforderlichen Komponenten umfaßt, nämlich mindestens 2 doppelsträngige Oligonucleo­ tide, die nur bei Anwesenheit dieser DNA ligiert werden, ein Ligierungsmittel, beispielsweise Pfu-DNA-Ligase und gegebe­ nenfalls Pufferlösungen und Mittel zum Nachweis des ligier­ ten Produkts.

Fig. 1: Untersuchungen zum erfindungsgemäßen Puffer

Die Proben wurden wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt und gelelektrophoretisch aufgetrennt (1, 5%iges Agarosegel, Anfärbung mit Ethidiumbromid). Die in den Spuren 1 bis 15 erkennbare Bande entspricht der amplifizierten DNA aus dem Untersuchungsmaterial.
Spur 1, 6, 11: Kontrolle, ohne Probe
Spur 2, 3, 7, 8, 12, 13: Aufbewahrung in Puffer A
Spur 4, 5, 9, 10, 14, 15: Aufbewahrung in Puffer B
Spur 16: Kontrolle, ohne Matritzen-DNA
Spur 17: Längenmarker
Spuren 1-5: Aufbewahrung der Proben bei Raumtemperatur
Spuren 6-10 : Aufbewahrung der Proben bei +8°C
Spuren 11-15: Aufbewahrung der Proben bei -20°C.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 1. Untersuchungsgang

Im Rahmen eines gewöhnlichen gynäkologischen Untersuchungs­ ganges wurde neben den Abstrichen, die der zytologischen Be­ gutachtung dienten, oberflächliches Zellmaterial von der Portio (Gebärmuttermund) und vom Gebärmutterhals zur moleku­ larbiologischen Bearbeitung abgenommen.

2. Gewinnung des Untersuchungsmaterials

Hierbei erwies sich die Verwendung eines zuvor verkleinerten "Zytobrush"-Zellabnahmebürstchens als vorteilhaft. Andere Geräte, die gewöhnlich der Abnahme von Zellmaterial dienen, erwiesen sich als weniger vorteilhaft, da sie entweder bei Eintauchen in den Transportpuffer diesen größtenteils auf­ saugten, oder andere Zellgewinnungsgeräte zu breit für die Einbringung in das Eppendorfreaktionsgefäß waren.

3. Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials

In die Eppendorfreaktionsgefäße, die in 100 µl Transportpuf­ fer oberflächliches Zellmaterial enthielten, wurden 100 µl Phenol gegeben. Das Gemisch wurde geschüttelt, abzentrifu­ giert und der wäßrige Überstand in ein neues Eppendorfreak­ tionsgefäß verbracht. Der Vorgang wurde unter Verwendung von 100 µl Chloroform wiederholt. 100 µl der wäßrigen Phase wur­ den mit 11 µl 3 M Natriumacetat-Lösung (pH 4,8) sowie 280 µl 100%igem Ethanol versetzt, wodurch die Nucleinsäuren präzi­ pitiert wurden. Das nach Zentrifugation und Vakuumtrocknung zurückgebliebene Nucleinsäurepellet wurde in 50 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, und 0,1 mM EDTA) aufgenommen und konnte als "Template-DNA" (= zu untersuchende DNA) bei der nachfolgenden PCR-Reaktion verwendet werden.

4. PCR

Die folgenden degenerierten Primer wurden verwendet:
HPV-GP5 TTTGT TACTG TGGTA GATAC (5′-3′)
HPV-GP6 GAAAA ATAAA CTGTA AATCA (5′-3′).

Der Reaktionsansatz hatte ein Gesamtvolumen von 50 µl. Fol­ gende Substanzen befanden sich im Reaktionsansatz:
5 µl "Template"-DNA
2 µl GP5-Primer
2 µl GP6-Primer
2 µl dATP, dCTP, dGTP, dTTP (jeweils 10 mM, bereits zu­ sammenpipettiert)
5 µl 10 × PCR-Puffer (n. Maniatis et al., a.a.O.)
33 µl H₂O
1 µl Taq-Polymerase.

Die Reaktion wurde in einem "Termocycler"-Gerät durchge­ führt. Die Einstellungen des "Termocycler-Gerätes waren:
30′′ 94°C (Denaturierung)
30′′ 50°C (Anlagerung der Primer)
90′′ 72°C (Polymerisation).

Es wurden 25 Zyklen durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde zum Nachweis auf ein 1,5%iges Agarose-Gel verbracht und elektrophoretisch aufgetrennt. Der Nachweis erfolgte nach Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid unter UV-Licht.

Beispiel 2 Untersuchungen zum erfindungsgemäßen Transportpuffer

Zur Verwahrung und zum Transport des oberflächlich an der Portio (Muttermund) und dem Gebärmutterhals gewonnenen Zell­ materials wurden die hierbei verwendeten Zellabnahme-Bürst­ chen (cyto-brush) in zwei unterschiedliche Transportpuffer verbracht. Hierbei wurde neben dem erfindungsgemäßen Puffer (Puffer B) vergleichsweise ein für die Aufnahme von Proben für eine nachfolgende PCR beschriebener Puffer (Puffer A; Ehrlich, PCR Technology (1989), Seite 35, Stockton Press) verwendet. Puffer B hatte folgende Zusammensetzung:
130 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5
0,4% SDS (Natriumdodecylsulfat).

Zur Überprüfung, inwieweit Puffer B tatsächlich den Anforde­ rungen genügte, wurde einer HeLa-Zellkultur (Zellkultur einer Gebärmutterhalskrebslinie, die HPV 16 enthält) Joghurt zugesetzt (entspricht den physiologischen Scheidenbakte­ rien), bis ein scheidenähnlicher pH-Wert (pH 4) eingestellt werden konnte. Dieses Gemisch wurde zu gleichen Anteilen auf 17 Aufbewahrungsbehälter verteilt. Mit Puffer A wurden die Aufbewahrungsbehälter 2, 3, 7, 8, 12 und 13 versetzt. Puffer B wurde den Aufbewahrungsbehältern 4, 5, 9, 10, 14 und 15 zugesetzt. Die Aufbewahrungsbehälter 1, 6 und 11 erhielten die entsprechende Menge Joghurt-Lösung ohne HeLa-Zellen.

Die Aufbewahrungsbehälter 1, 2, 3, 4 und 5 wurden bei Raum­ temperatur, die Aufbewahrungsbehälter 6, 7, 8, 9 und 10 in einen Kühlschrank bei 8°C, und die Aufbewahrungsbehälter 11, 12, 13, 14 und 15 bei -20°C für die Dauer von 2 Wochen ver­ wahrt und anschließend auf den Gehalt noch nachweisbarer HPV 16-DNA mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hin untersucht. Die Reaktionsprodukte der 15 Einzelproben wurden zur optischen Dokumentation auf ein Agarosegel aufge­ tragen und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid unter UV-Licht fotografiert (Fig. 1).

Es zeigte sich, daß das Untersuchungsmaterial lediglich in Puffer B so aufbewahrt werden kann, daß zum einen die DNA-zer­ störende Kraft der noch stoffwechselaktiven Scheiden­ flora, die sich ebenfalls im Untersuchungsgut befindet, ent­ scheidend verringert werden kann, die nachfolgenden DNA-Ana­ lyseschritte aber nicht mehr meßbar beeinträchtigt werden.

Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, war das Untersuchungsmate­ rial am besten nach Aufbewahrung in dem erfindungsgemäßen Puffer nachweisbar. Dabei kommen die Unterschiede zu dem im Stand der Technik verwendeten Puffer A am deutlichsten bei Aufbewahrung bei +8°C zum Ausdruck.

Claims (14)

1. Verfahren zur Diagnose des Zervixkarzinons, dadurch ge­ kennzeichnet, daß für ein krebserzeugendes Papillomavi­ rus (HPV) spezifische DNA oder RNA in Gebärmutterhals- Epithelzellen nachgewiesen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das krebserzeugende Pa­ pillomavirus HPV 16 oder HPV 18 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, weiter dadurch gekenn­ zeichnet, daß die die spezifische HPV-DNA oder -RNA ent­ haltenden Gebärmutterhals-Epithelzellen nach Entnahme in einem ein anionisches Detergens enthaltenden Puffer auf­ bewahrt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das anionische Deter­ gens Natriumdodecylsulfat (SDS) ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Konzentration von SDS im Bereich von 0,1 bis 2%, vorzugsweise im Bereich von 0,2 bis 0,5% liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die HPV-DNA oder -RNA nach Amplifikation über eine "Polyme­ rase Chain Reaction" (PCR) unter Verwendung von 2 Pri­ mern, die nur an die DNA oder RNA krebserzeugender HPV ausreichend hybridisieren, nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Primer folgende Se­ quenzen umfassen:
5′-TTTGT TACTG TGGTA GATAC-3′
5′-GAAAA ATAAA CTGTA AATCA-3′.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die HPV-DNA über eine "Ligase Chain Reaction" (LCR) unter Verwendung von 2 doppelsträngigen Oligonucleotiden, die nur bei Anwesenheit von DNA oder RNA krebserzeugender HPV miteinander ligiert werden, nachgewiesen wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei minde­ stens ein Primer oder Oligonucleotid eine nachweisbare Markierung trägt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei es sich um eine nicht­ radioaktive Markierung handelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Nachweis der amplifizierten DNA nach Kopplung an einen Biosensor erfolgt.

12. Kit zum Nachweis des Vorhandenseins von für krebserzeu­ gende HPV spezifischer DNA oder RNA mittels PCR, enthal­ tend mindestens 2 Primer, die nur an diese DNA oder RNA ausreichend hybridisieren, ein Polymerisationsmittel und Nucleosidtriphosphate, und gegebenenfalls Pufferlösungen und Mittel zum Nachweis des amplifizierten Produkts.

13. Kit nach Anspruch 12, wobei die Primer folgende Sequen­ zen aufweisen:
5′-TTTGT TACTG TGGTA GATAC-3′
5′-GAAAA ATAAA CTGTA AATCA-3′.

14. Kit zum Nachweis des Vorhandenseins von für krebserzeu­ gende HPV spezifischer DNA mittels LCR, enthaltend min­ destens 2 doppelsträngige Oligonucleotide, die nur bei Anwesenheit dieser DNA ligiert werden, ein Ligationsmit­ tel, und gegebenenfalls Pufferlösungen und Mittel zum Nachweis des ligierten Produkts.