DE3786357T2

DE3786357T2 - Sonden für Papilloma-Virus und Verfahren zur Diagnose der Papilloma-Virusinfektionen.

Info

Publication number: DE3786357T2
Application number: DE87400218T
Authority: DE
Inventors: Sylvie Baudenon; Odile Croissant; Dina Kremsdof; Gerard Orth
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1986-01-31
Filing date: 1987-01-30
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2007-01-31
Also published as: DK52987A; JP2716120B2; EP0235004B1; FR2593828A2; JPS62248492A; DK176083B1; EP0235004A2; EP0235004A3; FI870366A0; DE3786357D1; DK52987D0; FR2593828B2; FI100407B; ATE91157T1; ES2056833T3; FI870366A

Description

Die Erfindung betrifft Papillomavirus DNA und insbesondere Sonden, die aus diesem Papillomavirus abgeleitet sind, sowie Verfahren, die von diesem Gebrauch machen, zur in vitro Diagnose von Papillomavirusinfektionen.
Der Begriff "Papillomavirus" umfaßt eine große Anzahl an Viren, die gemeinsam haben, daß man sie als das auslösende Agens für mehrere Formen viraler Infektionen hält, von relativ harmlosen Haut- oder Schleimhautwarzen bis zu Hyperplasien, die zur Degeneration in intra-epitheliale Neoplasien und Haut- oder Schleimhautkrebs neigen. Von den Papillomavirusinfektionen ist auch insbesondere die warzenartige Epidermodysplasie zu nennen, die manchmal unter der Bezeichnung "EV" bekannt ist.
Eine bestimmte Anzahl Papillomavirustypen sind bereits beschrieben worden. Die europäische Patentanmeldung Nr. 85 402 362.9, angemeldet am 29. November 1985 und veröffentlicht am 10. September 1986 unter der Nr. EP-0 192 001, beschreibt eine gewisse Anzahl von neuen Papillomavirustypen und Untertypen, die aus Warzen, verschmutzten Verletzungen, die zur Entwicklung von Hautkrebs bei einem bedeutenden Anteil der davon betroffenen Erkrankten Anlaß geben, und aus vorkrebsartigen Hautverletzungen, Hyperplasieverletzungen im Mund und aus Gebärmutterhalskrebs isoliert wurden.
Die Hauptbedeutung der verschiedenen humanen Papillomavirustypen (HPV) bei der Entwicklung von Neoplasien ist erkannt worden. Ihre Pathogenizität wird in gleicher Weise von verschiedenen genetischen Faktoren beeinflußt insbesondere von immunologischen und/oder äußerlichen Faktoren, wie aktinische Stahlung in der Pathogenese von Papillomavirusinfektionen.
Mehrere Typen und Untertypen neuer Papillomaviren sind in der früheren Anmeldung identifiziert worden. Die Verwendung von DNAs dieser neuen Papillomaviren bei der verfeinerten in vitro Diagnose bei der Isolierung oder bei der Assoziation zwischen ihnen und/oder mit DNAs von HPVs, die bereits bekannt sind, ist ebenfalls in dieser Anmeldung beschrieben.
Im allgemeinen ist in der europäischen Patentanmeldung bemerkenswert, daß die Papillomaviren, die untereinander sehr unterschiedlich sind, eine Größenordnung von 7000 bis 8000 Basenpaaren haben. Andererseits können ihre Genome ein bestimmtes Ausmaß an Homologie aufweisen, angegeben als Prozentsatz der Homologien zwischen den Typen und Untertypen des Papillomavirus in Hybridisierungsversuchen, die unter nicht stringenten oder nicht strikten Bedingungen, oder auch stringenten oder strikten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt wurden.
Man ist der Meinung, daß Papillomaviren, deren Homologie unter 50 % bei strikten oder stringenten Bedingungen aufweisen, verschiedenen Typen zugehören. Viren, bei denen man unter strikten oder stringenten Bedingungen eine Homologie über 50 % beobachtet, betrachtet man als zum selben Typ zugehörig. Sie können verschiedene Untertypen innerhalb desselben Typs bilden.
Die Hybridisierungsversuche unter nicht strikten oder nicht stringenten Bedingungen erfordern das gegenseitige in Kontaktbringen von DNAs, die aus zwei Virusisolaten stammen, unter den folgenden Bedingungen, beschrieben von Heilmann C.A. et al., 1980, J. Virol. 36:359-407 und Croissant et al., 1982, C. R. Acad. Sc. Paris, 294:581-586 (molécules hétéroduplexes).
Die Hybridisierungsbedingungen unter strikten oder stringenten Bedingungen erfordern das gegenseitige Inkontaktbringen von DNAs, die aus zwei Virusisolaten stammen, unter den Bedingungen beschrieben von Heilmann C.A. et al., 1980, und Kremsdorf D. et al., (1982), J. Virol. 43:436-447 und 1983, J. Virol. 48:340-351 und Davis R. W. et al., 1971 Methods Enzymol., 21:413-418 (molécules hétéroduplexes).
Die Bezeichnungen von bestimmten, im folgenden Text beschriebenen HPVs, sind gemäß der heutzutage gültigen internationalen Nomenklatur modifiziert worden. Insbesondere tragen die in der folgenden Aufzählung identifizierten Isolate jedesmal nach "anstelle von" (und diejenigen die im vorliegenden Text bezeichnet sind) heutige Bezeichnungen, die links angegeben sind:
HPV32 anstelle von HPV31 (BEAUDENON S. et al, 1987)
HPV34 anstelle von HPV32 (KAWASHIMA M. et al, 1986)
HPV33 anstelle von HPV-IP2 (BEAUDENON S. et al, 1986)
HPV36 anstelle von HPV-IP4 (KAWASHIMA M. et al, 1986)
HPV39 anstelle von HPV-IP5 (BEAUDENON S. et al, Virology 161:374- 384, 1987)
HPV42 anstelle von HPV-IP6 (BEAUDENON S. et al, Virology 161:374- 384, 1987)
Die in der vorliegenden Beschreibung zur Identifikation verschiedener Papillomaviren verwendeten abgekürzten Bezeichnungen stehen in Übereinstimmung mit der gültigen aktuellen internationalen Nomenklatur. Dennoch werden, wo angebracht, auch im folgenden, in geeigneten Fällen, die früher verwendeten Abkürzungen benutzt, wobei den früheren Abkürzungen immer sofort korrigierte Abkürzungen folgen, die in Übereinstimmung mit den Vorschriften der internationalen Nomenklatur stehen. Diese früheren Abkürzungen sind in () angegeben.
Ausgehend von vorhergehenden Überlegungen sind mehrere neue Viren Gegenstand der Beschreibung in der früheren Anmeldung. Von diesen sind auch die genetischen Rekombinanten, die das gesamte oder ein Teil des Genoms dieser Viren enthalten (bezeichnet DNA-HPVs), beschrieben. Die in der früheren Anmeldung beschrieben Erfindung betrifft folglich alle DNA-HPVs, ausgewählt aus der Gruppe der DNAs, die in einer schrittweisen Größe zwischen 7000 und 8000 Basenpaaren liegen und durch Restriktionskarten charakterisiert sind, die in den Zeichnungen, die auch in dieser Anmeldung wiedergegeben sind, erscheinen, insbesondere aus Papillomaviren erhaltene DNA-HPVs und den Bezeichnungen HPV2d, HPV10b, HPV14a, HPV14b, HPV15, HPV17a, HPV17b, HPV19, HPV20, HPV21, HPV22, HPV23, HPV24, HPV28, HPV29, HPV32 (HPV31), HPV34 (HPV32), HPV33 (HPVIP2) und HPV26 (HPV-IP4) entsprechen.
Die Erfindung der früheren Anmeldung betrifft ebenfalls Mischungen oder "Cocktails" von DNA-HPVs, die aus neuen oder zum Zeitpunkt der Anmeldung der früheren Patentanmeldung bereits bekannten Papillomaviren isoliert wurden, oder Hybridisierungssonden, die sie enthalten, und im höheren Maße zur Herstellung eines Diagnostikums für verschiedene Infektionskategorien geeignet sind, sogar bei der Höhe der Risiken, die die Entdeckung bestimmter Papillomaviren bei einem Menschen begleiten. Die Anzahl der Papillomavirussonden, die in der früheren Anmeldung beschrieben sind, zu denen diejenigen hinzukommen, die aus genomischen DNAs von vorisolierten Papillomaviren gebildet sind und ihre Verbindungen in bestimmten Mischungen, was folglich die Herstellung gereinigter Diagnostika erlaubt, insbesondere eine große Unterscheidung der diversen Infektionskategorien, die auf verschiedene Papillomavirustypen zurückzuführen sind oder sich unter Einwirkung der letzten Typen entwickeln können und innerhalb einer bestimmten Infektionskategorie besser das Ausmaß des Risikos, das diese letzteren bei schlimmeren Krankheiten mit sich bringen. Insbesondere liefert die Erfindung der früheren Anmeldung Mittel, die in Infektionsfällen, die sich durch warzenartige Epidermodysplasien manifestieren, die bessere Abschätzung der Höhe des Risikos erlauben, wie sich die letzteren in Hautkrebs entwickeln.
Insbesondere betrifft die Erfindung der früheren Anmeldung diagnostische Zusammensetzungen. Eine Gruppe bevorzugter Zusammensetzungen ist wie folgt:
1) mindestens eine DNA von HPV2d,
2) mindestens eine von den DNAs von HPV10b, 28 und 29,
3) mindestens eine von den DNAs von HPV17, 24,
4) mindestens eine von den DNAs von HPV14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23 und 36 (IP4),
5) mindestens eine der DNAs von HPV15 und 17,
6) DNA von HPV24,
7) DNA von HPV14, 34 (32) und 36 (IP4),
8) DNA von HPV32 (31),
9) DNA von HPV 34 (32),
10) mindestens eine der DNAs von HPV16, 18 und 33 (IP2), wobei sie DNAs aus sechs Gruppen umfassen, die in einer solchen Weise ausgewählt sind, daß in jedem Fall die einen von den anderen verschieden sind.
In der Gruppe 10) liegt die DNA von HPV33 (IP2) bevorzugt mit der DNA von HPV16 oder HPV18 assoziiert vor.
In den Fig. 1 bis 10 der anliegenden Zeichnungen sind die physischen Restriktionskarten der betreffenden DNA-HPVs dargestellt.
Die physischen Karten geben die Positionen der Schnittstellen von verschiedenen Restriktionsendonucleasen wieder. Der Ursprung der Karte wird im allgemeinen durch eine einzelne Schnittstelle gebildet. Die Abstände vom Ursprung sind in Prozent der Länge des Genoms ausgedrückt.
Die vorliegende Erfindung betrifft neu isolierte Papillomaviren, ihre genomischen DNAs, die Extrakte sein können oder Fragmente dieser genomischen DNAs, sowie neue Hybridisierungssonden, die aus diesen DNA-HPVs oder Fragmenten der DNA-HPVs gebildet sein können.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zu Herstellung einer DNA- HPV-Sonde, charakterisiert durch die Klonierung eines Vektors in einem geeigneten Wirts, wobei der Vektor zuvor durch in vitro Rekombination des gesamten oder eines Teils der DNA des Virus, ausgewählt aus HPV39 (IP5) und HPV42 (IP6) mit einem geeigneten Vektor modifiziert sein kann, unter Erhalt einer DNA-Rekombinante, die diese DNA an einer Stelle des Vektors enthält, was ihre Klonierung in dem Wirt insbesondere in einem Bakterium erlaubt und durch Gewinnung und Reinigung des rekombinanten DNA-Klons modifiziert wurde. Der verwendete Vektor ist vorteilhaft ein Plasmid oder ein Phage, der Replikation in einem procaryontischen Mikroorganismus, wie E. coli, in der Lage ist.
Bevorzugt ist auch, daß diese DNA-HPV-Sonde für ihren Einsatz markiert ist. Man kann auf alle Markierungsprinzipienv wie radioaktiv, immunofluoreszent, enzymatisch, usw. zurückgreifen.
Die Erfindung betrifft auch neue "Cocktails" von Sonden, die sie enthalten, oder ihre Verwendung in Cocktails von in der früheren Anmeldung beschriebenen Sonden, die noch mit einer oder anderer der DNA-HPVs die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, vervollständigt wurden, und schließlich Garnituren oder "Kits" von Diagnostika die noch weiter vervollkommnet wurden. Die erfindungsgemäßen DNA-HPVs sind charakterisiert durch ihre Restriktionskarten, die den Inhalt der Fig. 10 und 11 und entsprechend als HPV39 (HPV-IP5) und HPV42 (HPV-IP6) bezeichnet sind, bilden.
Die aus dem Genom von HPV39 (IP5) oder dem Genom von HPV42 (IP6) konstruierten Hybridisierungssonden wurden insbesondere zur Diagnose und/oder Früherkennung in vitro bei Erkrankungen von Papillomavirustypen eingesetzt die in der früheren Anmeldung oder noch früher beschrieben sind, die ein Risiko zur Ausbildung von genitalen Neoplasin und insbesondere Gebärmutterhalskrebs beinhalten.
Diese Hybridisierungssonden sind vorteilhaft enthalten in diagnostischen Mischungen für Erkrankungen vom selben Typ, wie die früher erhaltenen.
Die Erfindung betrifft auch Fragmente von DNA-HPV-Vorstufen oder die in der Lage, sind mit ihnen zu hybrisidieren, insbesondere unter strikten Bedingungen. Sie betrifft auch DNA-Rekombinanten, die alle oder ein Teil der nachfolgenden DNA-HPVs enthalten, und insbesondere Rekombinante DNAs, die Fragmente entsprechend den Genen E1, E2, E6-E7, L1, L2 und die intergenische Region und NC oder auch Fragmente, die Sequenzen entsprechend den intergenomischen Regionen besagten DNA-HPVs enthalten. Sie betrifft schließlich Sonden, die aus diesen entsprechenden DNA-HPVs oder aus entsprechenden Fragmenten gebildet sein können und Verfahren zur in vitro Diagnose unter Verwendung dieser Sonden.
Die viralen DNA-Präparationen werden nach Verfahren die in den folgenden Beispielen 1 und 2 beschrieben sind gewonnen. In diesem wird genauer die Art der Bedingungen beschrieben, unter denen die Viren isoliert werden, ferner die Bedingungen, unter denen die DNA-HPVs aus diesen Viren erhalten werden.

Molekulare Klonierung und Charakterisierung eines neuen HPV-Typs, der mit genitalen Neoplasien und Gebärmutterhalskrebs in Verbindung gebracht wird (HPV39, HPV-IP5)

Ein neuer HPV-Typ wurde in einem DNA-Extrakt aus Biopsien von intraepithelialen Neoplasien (Bowenoiden Papula des Penis) durch Hybridisierung nach Vermehrung unter nicht-strikten Bedingungen mit einer radioaktiven, für HPV6 oder HPV10 spezifischen DNA-Sonde entdeckt. Die Untersuchung der Empfindlichkeit von der DNA dieses HPV gegenüber mehreren Restriktionsendonukleasen hat gezeigt, daß das Enzym EcoRI einmal die virale DNA schneidet. Nach Verdau des DNA-Extraktes der Spaltungen mit EcoRI-Enzym wurde die Fraktion, die das 8 kb-DNA-Molekül enthielt, durch Zentrifugation auf einem Saccharosegradienten gereinigt. Die DNA-Moleküle mit 8 kb wurden über die EcoRI-Schnittstelle in die DNA des Bakteriophagen λgtWESλB eingefügt. Nach Verkapselung der Rekombinanten DNA und Infektion von Eschericha coli K12-Bakterien (Stamm LA101) wurden die Rekombinanten Bakteriophagen mit der integrierten DNA des HPVs durch Hybridisierungstechniken über Lysierung (Benton und Davis) unter Verwendung einer radioaktiven, für HPV6-DNA spezifischen DNA-Sonde, unter nicht-strikten Bedingungen selektioniert. Mehrere Bakteriophagen-Rekombinante, die die Gesamtheit der viralen Sequenzen enthielten, wurden isoliert. Schnitt der rekombinanten Bakteriophagen DNA durch das Insertionsenzym EcoRI erzeugte ein Fragment eines 8 kb Hybriden mit HPV6-DNA unter nicht-strikten Bedingungen. Schnitt der rekombinanten Bakteriophagen DNA und Herstellung eines DNA-Extrakts aus Schnitten durch eine Mischung von Endonukleasen EcoRI und PstI erzeugt dieselben geschnittenen Fragmente, bei denen das gesamte Molekulargewicht davon dem HPV-Genom (8 kb) entspricht.
Die DNA des neuen HPVs wurde aus den Sequenzen der Phagen-DNA herausgeschnitten und in Plasmid pSP65 rekloniert. Durch Untersuchung der Empfindlichkeit dieser DNA gegenuber 16 Restriktionsendonukleasen wurde eine Restriktionskarte der viralen DNA erstellt. Auf diese Weise wurden 22 Schnittstellen lokalisiert (Fig. 10). Die Restriktionskarte des neuen HPVs ist von denen aller bis jetzt identifizierten HPVs verschieden. Das Ausmaß der Homologie zwischen der DNA des neuen HPVs und der DNA von bis jetzt identifizierter HPVs wurde durch Hybridisierungsexperimente mit der Matrize unter strikten Bedingungen unter Verwendung einer radioaktiven, aus gereinigter DNA des neuen HPVs hergestellten Sonde analysiert. Eine Teilhomologie wurde mit der DNA aus HPV18 und im geringeren Ausmaß mit HPV26 und eine kleine Homologie mit der DNA von HPVs der Typen 2, 6, 10, 13, 29, 32 (31) und HPV33 (IP2) entdeckt. Das Ausmaß der Homologie zwischen der DNA des neuen HPVs und der DNA von HPV18 wurde genauer durch DNA-DNA-Reassoziierungsexperimente im flüssigen Medium, gefolgt von einer Behandlung des Hybrids mit der Nuklease S1 bestimmt. Eine Hybridisierung von 2 % wurde zwischen diesen beiden DNAs entdeckt. Der neue Virus, charakterisiert durch seine Gewinnung aus bowenoiden Papula des Penis bildet folglich einen neuen HPV-Typ, vorläufig als HPV39 (IP5) bezeichnet.
Elektronenmikroskopische Analyse der gebildeten Heteroduplexmoleküle unter verschiedenen Bedingungen zwischen der DNA von HPV39 (IP5) und der DNA von HPV42 (IP16) erlaubt die Zuordnung der physikalischen Karten der beiden Genome und die Zuordnung der theoretischen Positionen der verschiedenen Gene auf der DNA des HPV39 (IP5) durch Beziehung mit dem Ursprung mit der Karte dieser DNA. Die Positionen sind als Prozentsatz der Länge des Genoms ausgehend von diesem Ursprung angegeben (Punkt 0 auf der Restriktionskarte der Fig. 10).
Mögliche Lokalisation der Hauptgene und der intergenetischen Region (NC) von HPV39 (IP5)
Die Verwendung von radioaktiven, aus HPV39 (IP5) DNA hergestellten Sonden hat die Ermittlung der Pathogenizität dieses Virus erlaubt. Im Verlauf einer Untersuchung von 1522 Abstrichen von cervico-vaginalen Zellen, zur Bestimmung der Infektionshäufigkeit des Epithels der Gebärmutterhalses mit HPV39 (IP5), hat gezeigt, daß 5 von 110 Abstrichen ein HPV enthalten. Andererseits wurde HPV39 (IP5) in 3 von 93 analysierten Biopsien von fortschreitendem Gebärmutterhalskrebs gefunden. Von diesen 3 Fällen wurde der Einbau der gesamten DNA-Sequenz des HPV39 (IP5) in die zelluläre DNA beobachtet.
HPV39 (IP5) bildet folglich einen genitalen HPV-Typ der ein starkes Oncogen darstellt. Es ist daher wünschenswert, es in alle Mischungen von HPV-DNA, die zur Herstellung von molekularen Sonden bestimmt sind, im Hinblick auf die Diagnostik oder Früherkennung von HPV-Typen, die ein Risiko zur Bildung von genitalen Neoplasien, insbesondere Gebärmutterhalskrebs, beinhalten, einzubauen.

Molekulare Klonierung und Charakterisierung eines neuen HPV-Typs, der bei Genitalverletzungen auftritt (HPV42 (IP6))

Ein anderer neuer HPV-Typ wurde in dem DNA-Extrakt von Scheidenverletzungen, die als Papillomas beschrieben sind, die sich als minimale zelluläre Atypien zeigen, durch Hybridisierung unter strikten Bedingungen mit einer radioaktiven, für HPV32 (31) spezifischen Sonde nachgewiesen. Eine Untersuchung der Empfindlichkeit der DNA dieses HPVs gegenüber mehreren Restriktionsenzymen hat gezeigt daß das Enzym BamHI die virale DNA einmal schneidet. Nach Verdau des DNA-Extrakts aus den Verletzungen durch das Enzym BamHI wurden DNA-Moleküle mit 8 kb durch Zentrifugation auf einem Saccharosegradienten gereinigt und dann über die BamHI-Schnittstelle in die DNA des Bakteriophagen L47.1 eingefügt. Nach Verkapselung der rekombinanten DNA und Infektion des Bakteriums Eschericha coli K12 (Stamm LA 101) wurden die rekombinanten Bakteriophagen, die die DNA des neuen HPVs integriert hatten, durch Hybridisierungstechniken über Lyse (Benton und Davis) unter Verwendung einer radioaktiven, für HPV32 (31) spezifischen DNA-Sonde unter strikten Bedingungen selektioniert. Mehrere rekombinante Bakteriophagen, die die Gesamtheit der viralen Sequenzen enthielten, wurden isoliert. Der Schnitt der DNA der rekombinanten Bakteriophagen mit BamHI-Endonuklease erzeugt ein 8 kb-Fragment, das mit der DNA von HPV32 (31) unter strikten Bedingungen hybridisiert. Der Schnitt der DNA der rekombinaten Bakteriophagen und die Herstellung des DNA-Extrakts aus den Verletzungen durch die Mischung der endonukleasen BamHI und PstI erzeugt dieselben 7 Fragmente die ein Molekulargewicht ergeben, das insgesamt dem Genom des Papillomavirus entspricht.
Die DNA des neuen HPVs wurde aus den DNA-Sequenzen des Phagen ausgeschnitten und im Plasmid pSP64 subkloniert. Eine Restriktionskarte der DNA des neuen HPVs wurde aufgrund einer Untersuchung der Empfindlichkeit dieser DNA gegenüber 20 Restriktionsendonukleasen erstellt. Auf diese Weise wurden 26 Schnittstellen lokalisiert (Fig. 10) . Diese Karte unterscheidet sich von an derjenigen aller bislang isolierten HPVs. Das Ausmaß der Homologie zwischen der DNA des neuen HPVs und der DNA bislang bekannter HPVs wurde durch Hybridisierungsexperimente mit einer Matrize unter strikten Bedingungen unter Verwendung einer radioaktiven, für das neue HPV spezifischen DNA-Sonde analysiert. Eine Teilhybridisierung wurde mit der DNA von HPV32 (31) und eine schwache Kreuzhybridisierung mit den DNAs von HPV6, 13 und HPV33 (IP2) beobachtet. Die Homologien zwischen der DNA des neuen HPVs und der DNA von HPV32 (31) wurde genauer durch DNA-DNA- Reassoziierungsexperimente in einem flüssigen Milieu und anschließender Behandlung der Hybride durch Nuklease S1 bestimmt. Eine Hybridisierung von 20 % wurde zwischen den beiden DNAs beobachtet. Der aus bowenoiden vaginösen Papillomas isolierte Virus bildet daher einen neuen HPV-Typ, der vorläufig als HPV-IP6 bezeichnet wurde.
Elektronenmikroskopische Analyse von Heteroduplexmolekülen, die unter verschiedenen Bedingungen zwischen der DNA des HPV-IP6 und der DNA von HPV32 (31) gebildet wurden, hat das Aufstellen einer physikalischen Karte der beiden Genome und die Bestimmung der theoretischen Position der verschiedenen Gene auf der DNA des HPV42 (IP6) ermöglicht, wie im folgenden angegeben durch Vergleich des Ursprungs der Karte aus Fig. 11 und den Prozentangaben der Länge.
Mögliche Lokalisierung der Hauptgene und der intergenetischen Region (NC) von HPV (IP6)
Die Verwendung von radioaktiven Sonden, hergestellt aus gereinigter HPV-IP6-DNA hat die Bestimmung der Pathogenizität des Virus erlaubt.
Abstriche von fortschreitenden gutmütigen Verletzungen (Condylomen, Papillomen) oder intra-epitheliale Neoplasien der äußeren Genitalien in der perinalen Region und dem Gebärmutterhals von 163 Erkrankten wurden analysiert. HPV42 (IP6) DNA wurde bei 10 Erkrankten, die gutmütige Verletzungen zeigten (Condylome, Papillome), entdeckt.
Im Verlauf einer Untersuchung von 1522 Abstrichen von cervico-vaginalen Zellen, die dazu diente, die Häufigkeit der Infektion des Gebärmutterhalskrebses mit einem HPV genauer zu bestimmen, wurde HPV42 (IP6) DNA in 9 Abstrichen bei einer normalen oder entzündeten Zytologie oder einer leichten Dysplasie bei 110 Abstrichen entdeckt, die HPV-DNA enthielten.
HPV42 (IP6) bildet daher einen zusätzlichen relativ häufigen genitalen HPV-Typ, der wahrscheinlich ein schwaches onkogenes Potential besitzt. Es ist daher wünschenswert, den Virus in Gesamtmischungen von DNAs einzubauen, die zur Herstellung von Molekularsonden bestimmt sind, im Hinblick auf die Diagnose oder Früherkennung von sexuell übertragenen HPV-Typen, Auslösern von gutmütigen Genitaltumoren, die kein wesentliches Risiko zur Entwicklung von genitalen Neoplasien und insbesondere Gebärmutterhalskrebs aufweisen. Es wird eine große Vielzahl empfänglicher HPVs zur Verfügung gestellt, die aus verschiedenen Formen von Warzen oder anderen Hautverletzungen oder Schleimhautverletzungen isoliert wurden; daher ist zur Diagnose eines jeden Typs der in der Tabelle erwähnten Erkrankungen die Verwendung von Mischungen bevorzugt, die mehr als einen oder zwei HPV- DNA enthalten, seit dem man andere HPV-DNAs kennt, die in gleicher Weise bei der Entwicklung desselben Krankheitstyps eingreifen können. Die Diagnose der Natur der Infektion und ihrem möglichen Fortschreiten wird auch dadurch effektiver, daß die Anzahl der verwendeten Sonden vermehrt ist. Andererseits erlauben Hybridisierungsversuche, die mit unterschiedlichen Mischungen von Sonden unternommen werden, eine differenzielle Diagnose, die das Ausmaß der Wahrscheinlichkeit sowie auch, was besonders wichtig ist, die Natur der Erkrankung, unter der der Patient leidet, offenbart.
Die Erfindung betrifft daher insbesondere auch Mischungen oder Cocktails oder Zusammensetzungen, die DNA aus HPV39 (IP5) und/oder DNA aus HPV42 (IP6) allein oder in Mischung mit anderen HPV-DNAs enthalten (oder Sonden die diese HPV-DNAs oder Sequenzen der letzteren enthalten) die zur Verwendung in Kombination zur Herstellung allgemeiner Diagnosehilfsmittel für die verschiedenen Papillomavirusinfektionen und schließlich auch zur Prognose des möglichen Fortschritts der Infektion geeignet sind.
Die erfindungsgemäß bevorzugten Mischungen sind in der folgenden Tabelle angegeben: Tabelle Charakteristische Eigenschaften der Mischungen der HPV-DNAs, die zur virologischen Diagnose von Papillomavirusinfektionen geeignet sind. Bezeichnung der Mischung Konstitution (HPV-Typ) Diagnostizierbare Erkrankungen Haut- oder Schleimhautwarzen (insbesondere gewöhnliche oder Sohlenwarzen) Diagnose unterscheidet von warzenartiger Epidermodysplasie Flache oder intermediäre Haut- oder Schleimhautwarzen, intra-epitheliale Neoplasien und Hautkrebs, Diagnose unterscheidet von warzenartiger Epidermodysplasie Warzenartige Epidermodysplasie, intra-epitheliale Neoplasien und Hautkrebs Hautkrebs von warzenartiger Epidermodysplasie, intraepitheliale Neoplasien und Hautkrebs Fokale orale epitheliale Hyperplasie; Diagnose unterscheidet von intraepithelialen oralen Neoplasien Intraepitheale Neoplasien und Hautkrebs Genitale Neoplasien und Gebärmutterhalskrebs Condylome, Papillome
Die obige Tabelle gibt auch die Natur der Krankheiten an für die die Diagnostika durch Verwendung der im linken Teil der Tabelle angegebenen Mischungen besonders geeignet sind. Es ist zu bemerken, daß die Restriktionskarten der anderen der in der vorstehenden Tabelle angegebenen HPV- DNAs in den Fig. 1 bis 9 enthalten sind. Es ist bemerkenswert, daß HPV39 (IP5) als gesamte repräsentative Sonde angesehen werden kann, die zum Nachweis der Risiken für das Entstehen von Gebärmutterhalskrebs geeignet ist, und IP6 in gleicher Weise als repräsentative Sonde angesehen werden kann, die zum Nachweis von gutartigen Papillomainfektionen einsetzbar ist.
HPV42 (IP6) DNA kann mit der DNA von HPV6 und/oder HPV11 verbunden sein.
Schließlich betrifft die Erfindung auch die Mischung aller dieser Sonden.
Die Erfindung betrifft insbesondere einen Cocktail von Sonden, die HPV-DNAs enthalten, die für Genitalkrebs spezifisch sind, diese Cocktails enthalten:
HPV33 (IP2)
HPV39 (IP5)
HPV42 (IP6)
HPV6
HPV11
HPV16
HPV18
HPV32 (31)
HPV35
HPV42 (IP6) ist repräsentativ für Sonden, die zum Nachweis von gutartigen Papillomavirusinfektionen geeignet sind. Die DNA von HPV42 (IP6) kann mit der DNA von HPV6 und/oder HPV11 verbunden sein.
Die Erfindung betrifft demzufolge insbesondere auch Anordnungen oder "Kits" zur Diagnose, die mindestens 11 Gruppen, angegeben in den von Nr. 1 bis 11 in der Tabelle unter der Rubrik "Bestimmung der Mischungen" bezeichneten Gruppen enthalten.
Aus dem Vorhergehenden kann man die Verwendung der Titelsonden und der gesamten HPV-DNA-Klone entnehmen. Diese können schließlich durch Klonfragmente dieser verschiedenen DNAs insbesondere durch die der Gene E1 oder L1 und durch die Gene E6-E7 substituiert sein.
Das Grundprinzips des in vitro Nachweises von HPV-DNA erfordert natürlich Hybridisierungsoperationen unter strikten oder weniger strikten Bedingungen. Man kann z. B. wie folgt vorgehen, wobei natürlich selbstverständlich ist, daß die beschriebenen Diagnoseversuche nicht auf die Anwendung der erfindungsgemäßen Sonden oder Sondenmischungen beschränkt ausgelegt werden sollen.
Das Ziel der Untersuchungen mit einem Satz von Sonden, die aus einer Mischung von kloniertem HPV-DNAs hergestellt wurden, ist der Nachweis eines HPVs und die Identifikation des HPVs in einer Biopsie, in Zellen, die durch Abschürfen von Verletzungen erhalten wurden oder in fixierten Biopsieschnitten, z. B. durch eine Mischung von Carnoy (Ethanol, Chloroform, Essigsäure 6:3:1) und in Paraffin eingeschlossen sind. Die Prüfung erfordert die vorhergehende Extraktion der DNA der Abstriche nach Verfahren, die im Prinzip bekannt sind, und die Analyse dieser DNAs durch molekulare Hybridisierungsexperimente die unter strikten oder weniger strikten Bedingungen mit Hilfe von radioaktiven Sonden (markiert mit ³²P oder mit ³&sup5;S), die aus HPV-DNA-Mischungen hergestellt wurden. Jede Prüfung erfordert im allgemeinen die Verwendung mehrerer Sondenmischungen.
Mehrere Hybridisierungsverfahren können durchgeführt werden. Man kann z. B. die Fehlerhybridisierung anwenden. Dieses Verfahren liefert nach Denaturierung der DNA, der Aufbringung eines bestimmten Aliquats-DNA auf Membranen (Nitrozellulose oder Genscreenplus), Hybridisierung jeder Membran unter üblichen Bedingungen mit einer Sondenmischung den Nachweis der radioaktiven Hybride durch Exposition der Membran unter Kontakt mit einem radiographischen Film. Man kann auch das Verfahren der Matrizenreplikation einsetzen. Dieses Verfahren umfaßt die elektrophoretische Trennung der erzeugten DNA-Fragmente nach Behandlung der DNA mit Restriktionsenzymen, Transfer der Fragmente nach alkalischer Denaturieren auf Membranen (Nitrozellulose, Genscreenplus) und ihre Hybridisierung unter üblichen Bedingungen mit verschiedenen Sondenmischungen. Die Bildung radioaktiver Hybride wurde nach Exposition der Membranen und durch Kontakt mit einem radiographischen Film nachgewiesen.
Man kann auch auf ein in vitro Hybridisierungsverfahren zurückgreifen, z. B. auf mit Carnoy-Mischung fixierte Gewebeschnitte und Einschlüsse in Paraffin.
Die radioaktiven Sonden sind aus HPV-DNAs gebildet, die durch das "Nick-Translationsverfahren" markiert wurden aus DNAs, die durch Transkription von in einem Vektor eingefügten viralen DNAs hergestellt wurden, z. B. vom Typ pSP6. Die Verwendung der radioaktiven Sonden zeigt den Vorteil einer großen Empfindlichkeit, es ist jedoch nicht die Verwendung nicht-radioaktiver Sonden, z. B. biotinylierter Sonden, ausgeschlossen und solche, die durch Antikörper, die ihrerseits markiert sind, erkannt werden, die ihrerseits durch Antikörper erkannt werden, die Enzymmarker, Fluoreszenzmarker, usw. tragen.
Die Erfindung betrifft daher auch Zusätze oder Kits, die eine Vielzahl der oben angegebenen Sonden enthalten und umfassen:
- HPV39 (IP5) und HPV42 (IP6)
- die vorhergehenden Sonden in einer Mischung mit anderen, insbesonderen solchen die weiter oben definiert wurden,
wobei diese Kits bestimmt sind für Untersuchungen zur in vitro Diagnose durch Hybridisierung zwischen den viralen Präparationen, erhalten von Patienten und verschiedenen Gruppen von Mischungen.
Da es selbstverständlich ist, und es sich ohne weiteres aus dem Vorhergehenden ergibt, ist die Erfindung in keiner Weise auf die Ausführungsformen, die insbesondere angegeben sind, beschränkt, sie umfaßt im Gegenteil auch alle Varianten, insbesondere die Bezugnahme in den Ansprüchen auf eine DNA-Bezeichnung, gefolgt von einer bestimmten Nummer und entspricht einer HPV-DNA angegeben in der Restriktionskarte und wiedergegeben in den Zeichnungen, wobei es als bedeutsam zu verstehen ist, daß diese Ansprüche alle HPV-DNAs umfassen, die zusammen mit dieser HPV- DNA insbesondere als derselbe Typ, entsprechend der weiter oben angegebenen Definition, klassifiziert sein können, umsomehr bei HPV-DNAs, die zum selben Sub-Typ gehören.
Es wird festgestellt, daß die rekombinanten DNAs, wie oben bezeichnet, am 21. Januar 1986 beim C.N.C.M. (Collection Nationale des Cultures de Micro-Organismes de l'INSTITUT PASTEUR de Paris) unter den im folgenden angegebenen Nummern hinterlegt wurden:
pSP65/HPV39 (IP5) (Plasmid in E. coli) Nr. I-507
pSP64/HPV42 (IP6) (Plasmid in E. coli) Nr. I-508

Bibliographie

(1) Dürst, M. et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:3812-3815
(1a) Bospart M. et al., 1984, Embo J. 3=1151-1157
(2) Coggin, J.R., Jr. et al., 1979, Cancer Res., 39:545-346.
(3) Gissmann, L. et al., 1982, J. Virol. 44:393-400.
(4) Green, M. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:4437- 4441.
(5) Heilman, C.A. et al., 1980, Virol, 36:395-407.
(6) Jablonska, S. et al., 1972, Cancer Res., 32:583-589.
(7) Jablonska, S. et al., 1982, Springer Semin. Immunopathol. 5:33-62.
(8) Kremsdorf, D. et al., 1982, J. Virol. 43:436-447.
(9) Kremsdorf, D. et al., 1983, J. Virol. 48:340-351.
(10) Lutzner, M.A. et al., 1978, Bull. Cancer, 65:169-182.
(11) Lutzner, M.A. et al., 1983, Lancet ii:422-424.
(12) Migozzi, M. et al., 1965, Bull. Soc. Franc. Derm. Syph. 72:747-748.
(13) Orth. G. et al., 1980, Cold Spring Harbor Conf. Cell Proliferation, 7:259-282.
(14) Orth, G. et al., 1981, J. Invest. Dermatol. 76:97-102.
(15) Orth G. et al., 1979, Cancer Res. 39:1074-1082.
(16) Ostrow, R.S. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:1634-1638.
(17) Ostrow, R.S. et al., 1983, Ann. Acad. Dermatol. 8:398-404.
(18) Pfister, H. et al., 1983, Cancer Res. 43:1436-1441.
(19) Pfister, H. et al., 1983, J. Virol. 47:363-366.
(20) Pfister, H. et al., 1981, Int. J. Cancer, 27:645-650.
(21) Rueda, L.A. et al., 1976, Med. Cut. I.L.A. 2:113-136.
(22) Ruiter, M. et al. J. Invest. Dermatol., 47:247-252.
(23) Sutcliffe, J.G., 1978, Nucleic Acids Res. 5:2721-2728.
(24) Tsumori, T. et al., 1983, J. Gen. Virol. 64:967-969.
Die folgenden bibliographischen Daten können noch mit berücksichtigt werden (bestimmte Bezugnahmen sind Vorgänger der Bezeichnungen bestimmter HPV, wenn sie nicht zum ersten mal von anderen Forschern beschrieben wurden).
HPV18: BOSHART M. et al., 1984, EMBO J., 3:1151-1157,
HPV-IP2: BEAUDENON S. et al., 1986, Nature, 321:246, 249,
BEAUDENON S. et al., 1987, J. Inv. Dermatol., 88 Nr. 1,
KAWASHIMA M. et al., 1986a, J. Virol., 57:688-692,
KAWASHIMA M. et al., 1986b, Virology, 154:389-394,
HPV6: DE VILLIERS E.M. et al., 1981, J. Virol., 40:932-935,
HPV11: GISSMANN L. et al., 1982, J. Virol., 44:393-400,
HPV31: LORINCZ A. et al., 1986a, J. Virol., 58:225-229,
HPV35: LORINCZ A. et al., 1986b, Bambury report, 21:225-237,
HPV16: DURST et al., 1983.

Claims

1. HPV-DNA mit einer Länge von ca. 7000 bis ca. 8000 Basenpaaren oder ein Fragment dieser HPV-DNA, wobei diese HPV-DNA aus einem der Papillomaviren mit den Bezeichnungen HPV39 (IP5) und HPV42 (IP6) erhalten ist.

2. DNA-Fragment nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es den Genen E1, E6-E7, L1 oder L2 entspricht oder daß es auch einem Fragment entsprechend der intergenetischen Region der HPV-DNA entspricht.

3. Rekombinante DNA, enthaltend eine HPV-DNA nach Anspruch 1 oder ein Fragment nach Anspruch 2.

4. DNA, Fragment oder rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, zur Verwendung als Sonde für den Nachweis von HPV-DNAs.

5. Zusammensetzung, enthaltend eine Mischung von HPV-DNAs, zur Verwendung für den Nachweis von Papillomavirus in einem biologischen Milieu, das es enthält, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine HPV-DNA nach Anspruch 1 zusammen mit einer oder mehreren verschiedenen HPV-DNAs enthält.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Mischung der HPV-DNAs enthält

33 (IP2)

39 (IP5)

42 (IP6)

6

11

16

18

32 (31)

35.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie HPV42(IP6)-DNA in einer Mischung mit HPV6-DNA oder mit HPV11-DNA oder mit die beiden zugleich enthält.

8. Verfahren zur Herstellung einer Sonde zum Nachweis einer HPV- DNA, gekennzeichnet durch Klonierung eines Vektors in einem bestimmten Wirt, wie einem procaryontischen Mikroorganismus, wobei der Vektor zuvor durch in vitro Rekombination durch die HPV-DNA nach Anspruch 1 oder dem DNA-Fragment nach Anspruch 2 und einem geeigneten Vektor unter Erhalt eines rekombinanten Vektors modifiziert wurde, der die DNA oder das DNA-Fragment aus dem Virus in einer Schnittstelle des Vektors enthält, was seine spätere Klonierung im Wirt erlaubt, und durch Wiedergewinnung und Reinigung und, gegebenenfalls Markierung des erhaltenen rekombinanten DNA- Klons.

9. Ausrüstung oder Kit, das neue Gruppen von Sonden oder Mischungen verschiedener Sonden enthält, wobei die Gruppen (1 bis 9) entsprechend bestehen aus

1) mindestens einer DNA von HPV2d,

2) mindestens einer der DNAs von HPV20b, 28 und 29,

3) mindestens einer der DNAs von HPV17 und 24,

4) mindestens einer der DNAs von HPV14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 23 und 36 (IP4),

5) mindestens einer der DNAs von HPV15 und 17,

6) der DNA von HPV24,

7) mindestens eine der DNA von HPV14, 34 (32) und 36 (IP4),

8) der DNA von HPV32 (31),

9) der DNA von HPV 34 (32),

dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem zwei andere Gruppen (10 und 11) enthält, bestehend aus:

10) der DNA von HPV39 (IP5) allein oder in Mischung mit mindestens einer der DNAs von HPV16, 18 und 33 (IP2),

11) der DNA von HPV42 (IP6) allein oder in Mischung mit mindestens einer der DNAs von HPV6 und 11, mit der Maßgabe, daß die DNAs aus den 11 Gruppen derart ausgewählt sind, daß in jedem Fall die einen von den anderen in dem Maße verschieden sind wie jede der 11 Gruppen auf nur eine der DNAs, die sie enthalten, beschränkt ist.

10. Ausrüstung oder Kit zur Diagnose, die in vitro zwischen verschiedenen Typen von Warzen und Hyperplasien unterscheidet, die sich durch veränderliche Anzeichen äußern, die sich abstufen vom Erhalt eines gutartigen Charakters dieser Warzen bis zu Formen, die zur Entwicklung intra-epithelialer Neoplasien und Hautkrebs und Schleimhautkrebs in der Lage sind, wobei das Kit neue Gruppen von rekombinanten Sonden enthält, die Einschübe von DNAs von Papillomavirus enthalten, wobei die Gruppen entsprechend hergestellt sind aus

1) mindestens einer der DNAs von HPV1 2d, 4,

2) mindestens einer der DNAs von HPV3, 10a, 10b, 28 und 29,

3) mindestens einer der DNAs von HPV5, 17a und 24,

4) mindestens einer der DNAs von HPV5, 8, 12, 14a, 14b, 19, 20, 21, 22, 23 und 36 (IP4),

5) mindestens einer der DNAs von HPV9, 15, 17a

6) der DNA von HPV24,

7) mindestens einer der DNAs von HPV5, 8, 14b, 34 (32) und 36 (IP4),

8) mindestens einer der DNAs von HPV13 und 32 (31),

9) mindestens einer der DNAs von HPV34 (32) und 36 (IP4),

11) der DNA von HPV42 (IP6) allein oder in Mischung mit mindestens einer DNA von HPV6 und 11 mit der Maßgabe, daß die DNAs aus den 11 Gruppen derart ausgewählt sind, daß in jedem Fall die einen von den anderen in dem Maße verschieden sind wie jede der 11 Gruppen auf nur eine der DNAs, die sie enthalten, beschränkt ist, wobei die Sonden in diesem Fall durch Hybridisierung von bestimmten Mischungen, die hierzu in der Lage sind, mit der DNA Präparation aus dem betreffenden Patienten, den sicheren Nachweis erlauben, daß eine der folgenden Krankheiten vorliegt oder vorliegen könnte:

1) Haut- oder Schleimhautwarzen Sohlenwarzen). Diagnose unterscheidet von warzenartiger Epidermodysplasie

2) Flache oder intermediäre Haut- oder Schleimhautwarzen, intraepitheliale Neoplasien und Hautkrebs. Diagnose unterscheidet von warzenartiger Epidermodysplasie

3) Warzenartige Epidermodysplasie, intra-epitheliale Neoplasien und Hautkrebs

4) Warzenartige Epidermodysplasie

5) Warzenartige Epidermodysplasie

6) Warzenartige Epidermodysplasie

7) Hautkrebs von warzenartiger Epidermodysplasie, intra-epitheliale Neoplasien und Hautkrebs

8) Fokale orale epitheliale Hyperplasie; Diagnose unterscheidet von intra-epithelialen oralen Neoplasien

9) intra-epitheliale Neoplasien und Hautkrebs

10) Genitale Neoplasien und Gebärmutterhalskrebs

11) Condylome, Papillome

11. Verfahren zum Nachweis und Identifizierung von Papillomavirus, enthalten in einer biologischen Probe, umfassend die Durchführung von Hybridisierungsversuchen mit einer HPV-DNA, einem DNA-Fragment oder einer rekombinanten DNA nach Anspruch 3 oder mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 und Nachweis der von den zuvor aus diesen biologischen Flüssigkeiten erhaltenen HPV-DNAs, die eine Hybridisierung ergeben.

12. Verfahren nach Anspruch 11, angewandt auf den in vitro Nachweis des Gebärmutterhalskrebsrisikos, dadurch gekennzeichnet , daß die HPV-DNA, ein Fragment von der DNA, oder rekombinante DNA hervorgegangen aus HPV39 (IP5), eingesetzt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 11, angewandt auf den in vitro Nachweis des genitalen Krebsrisikos, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Zusammensetzung diejenige aus Anspruch 6 ist.

14. Verfahren nach Anspruch 11, angewandt auf den in vitro Nachweis von gutartigen Papillomavirusinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte HPV-DNA, das Fragment der DNA oder die rekombinante DNA von HPV42 (IP6) abstammt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, angewandt auf den in vitro Nachweis von gutartigen Papillomavirusinfektionen, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzte Zusammensetzung diejenige aus Anspruch 7 ist.