JP2716120B2 - 乳頭腫ウイルスプローブ及び乳頭腫ウイルス感染のインビトロ診断方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、乳頭腫ウィルスのDNA特に該ウィルス由来
のプローブ、及びこれらを使用した該ウィルス感染症の
in vitro診断方法に係る。 「乳頭腫ウィルス」なる用語は、比較的良性の皮膚又
は粘膜のイボから上皮内腫瘍形成及び皮膚癌及び粘膜の
癌に変質し悪化易い過形成にわたる種々の形態のウィル
ス感染症の原因であることを共通点とする多数のウィル
スを包含する。乳頭腫ウィルス感染症のうちにはイボ状
表皮異形成も含まれており、本文中では以後「EV」とも
指称する。 乳頭腫ウィルスのいくつかのウィルス型はすでに文献
に記載されている。例えば、1985年11月29日付欧州特許
出願85.402362.9−2105（1986年 ９月10日、第0192001
号として公開）では、罹患したうちのかなりの割合の患
者で皮膚癌を増殖させるイボ、斑点状病変、皮膚の前癌
性病変、口腔の過形成病変及び子宮頚癌から単離された
いくつかの新型乳頭腫ウィルス及び該ウィルスの新しい
亜型を記載している。種々の型のヒト乳頭腫ウィルス
（HPV）が腫瘍形成が発生するときに主としてどのよう
な役割を果すかも認識された。該ウィルスの病原性はま
た、種々の遺伝因子、特に免疫的及び／又は外因的因子
の影響を受ける。例えば乳頭腫ウィルス感染症の発病に
は化学（活性）光線が影響を与える。 この先願には、いくつかの新型乳頭腫ウィルス及び該
ウィルスの新しい亜型が同定されている。また、これら
の新しい乳頭腫ウィルスのDNAを単離状態又は、互いに
結合した状態及び／又は従来公知のHPVのDNAと結合した
状態でより精密なin vitro診断技術で使用することも記
載されている。 該欧州特許出願に記載の乳頭腫ウィルスは概して、互
いに極めて異なってはいるが7000〜8000塩基対のオーダ
の寸法をもつ。更に、所謂ストリンジェント（緊縮）で
ない条件即ち緩やかな条件及びストリンジェントな条件
即ち厳密な条件下でのハイブリダイゼーションテストの
双方において乳頭腫ウィルスの種々の型及び亜型の互い
の相同のパーセンテージを測定すると、該ウィルスのデ
ノムは或る程度の相同を有する。 厳密な条件下で50％未満の割合の相同を有する乳頭腫
ウィルスは異なる型に属する。厳密な条件下で50％以上
の割合の相同をもつウィルスは同じ型に属する。これら
同型ウィルス内部に異なる亜型が形成され得る。 緩やかな条件下のハイブリダイゼーションテストは、
C.A.HEILMAN等、1980年、J.Virol.,36,395−407及びCRO
ISSANT等、1982年、C.R.Acad.Sc.Paris,294,581−586に
よって記載された条件下で２種類のウィルス単離株由来
のDNAを互いに接触させることによって行なわれる（ヘ
テロデュプレックス分子）。 厳密な条件下のハイブリダイゼーションテストは、C.
A.HEILMAN等（1980年）並びにD.KREMSDORF等（1982年、
J.Virol.43;436−447及び1983年、J.Vvrol.48;340−35
1）及びR.W.DAVIS等、1971年、Methods Enzymol.,21,41
3−418によって記載された条件下で２種類のウィルス単
離株由来のDNAを互いに接触させることによって行なわ
れる（ヘテロデュプレックス分子）。 以上の考察すると、先願は複数の新規なウィルスを記
載しており、また、これ等ウィルスのゲノム（HPV−DNA
と指称される）の全部又は一部を含む遺伝子組換え体を
記載している。従って、先願の発明は、7,000〜8,000塩
基対の範囲のサイズをもち、本出願でも再現された図面
に示す制限地図をもつことを特徴とするDNA集団のうち
から選択されたHPV−DNAの各々に係り、特に、乳頭腫ウ
ィルスから得られ、HPV2d,HPV10b,HPV14a,HPV14b,HPV1
5,HPV17A,HPV17b,HPV19,HPV20,HPV21,HPV22,HPV23,HPV2
4,HPV28,HPV29,HPV31,HPV32,HPV−IP2及びHPV−IP4と指
称させるものに対応しているHPV−DNAに係る。 先願の発明はまた、その出願時点で公知であった乳頭
腫ウィルス又は新規な乳頭腫ウィルスから単離されたHP
V−DNAの混合物に係る。また、これ等混合物を含有して
おり種々の感染症の診断に使用でき所定の乳頭腫ウィル
スが検出された患者の危険の程度の診断にも極めて有効
に使用できるハイブリダイゼーションプローブに係る。
先願に記載の乳頭腫ウィルスを含むプローブに、それま
でにすでに単離されていた乳頭腫ウィルスのゲノムDNA
から構成されたプローブを付加し、両者を同時に含む所
定混合物を調製することによって、種々の乳頭腫ウィル
スを原因とするか又はこれら種々の型の乳頭腫ウィルス
の作用で進展し得る種々の感染症の種類を大まかに識別
し、同一種類に属する感染症について、これらの感染症
がもっと恐ろしい病気に変化する危険の程度をより十分
に診断するための精密診断を行なうことが可能である。
特に、先願の発明は、イボ状表皮異形成が生じる感染症
において、これが皮膚癌に移行する危険の程度をより精
密に診断し得る。 従って先願の発明は特に診断組成物に係る。好ましい
組成物のグループを以下に示す。 （１） 少なくともHPV2dのDNA、 （２） HPV10b,28,29のDNAの少なくとも１つ、 （３） HPV17,24のDNAの少なくとも１つ、 （４） HPV14,15,17,19,20,21,22,23及びIP4のDNAの少
なくとも１つ、 （５） HPV15及び17のDNAの少なくとも１つ、 （６） HPV24のDNA、 （７） HPV14,32及びIP4のDNA （８） HPV31のDNA、 （９） HPV32のDNA、 （10） HPV16,18及びIP2のDNAの少なくとも１つ、 これら10グループの各グループのDNAは、いかなる場合
にも互いに異なるDNAであるように選択されている。 グループ（10）のうちHPV−IP2のDNAはHPV16又はHPV1
8のDNAと組み合わせるのが好ましい。 第１図から第９図は、関連するHPV−DNAの物理的制限
地図を示す。 物理的制限地図は、種々の制限エンドヌクレアーゼに
よる切断部位の位置を示す。地図の原点は一般に独特な
（唯一の）切断部位から成る。原点からの距離はゲノム
の長さのパーセンテージで示される。 本発明は、新しく単離された乳頭腫ウィルス、該ウィ
ルスから抽出され得るゲノムDNA又はこれらゲノムDNAの
断片、及び、これらHPV−DNA又はHPV−DNA断片から形成
され得る新規なハイブリダイゼーションプローブに係
る。 本発明はまた、HPV−IP5及びHPV−IP6のうちから選択
されたウィルスのDNAの全部又は一部と適当なベクター
との組換によって宿主中でのクローニング部位に該DNA
を組込んだ組換DNAが得られるようにベクターを予め変
性し、このベクターを適当な宿主中で特に細菌中でクロ
ーニングし、組換DNAクローンを回収して精製すること
を特徴とするHPV−DNAプローブの製造方法に係る。大腸
菌の如き原該微生物中で複製できるプラスミド又はファ
ージをベクターとして使用するのが有利である。 また、使用し易いようにこのHPV−DNAプローブをラベ
ル（標識）するのが有利である。放射性ラベル，免疫蛍
光ラベル，酵素ラベル等の任意のラベル物質を使用し得
る。 本発明はまた、前記の如きプローブを含む新規な混合
プローブに係り、また、先願の混合プローブに本発明の
HPV−DNAの１つを付加した混合プローブに係り、その結
果として、更に改良された診断用パッケージ即ちキット
を提供する。 本発明のHPV−DNAの特性は、第10図及び第11図に示す
HPV−IP5及びHPV−IP6の夫々のDNAの制限地図によって
決定される。 HPV−IP5のゲノム又はHPV−IP6のゲノムから作成され
たハイブリダイゼーションプローブは、生殖器官腫瘍形
成特に子宮頚癌の増殖の危険をもたらす乳頭腫ウィルス
のウィルス型のin vitro診断及び／又は早期発見のため
に特に有効である。このときの診断条件については先願
にも記載されており、また本文でも後述する。 これらハイブリダイゼーションプローブでは、後述す
る如き同じ型の病気の診断用混合物に混入されるのが有
利である。 本発明はまた、前記HPV−DNA断片、又は特に厳密な条
件下で該HPV−DNAとハイブリダイズし得る断片に係る。
本発明はまた、前記HPV−DNAの各々の全部又は一部を含
む組換DNA、特に、遺伝子E1、E2、E6−E7、L1、L2及び
遺伝子間領域（ｒgion intergnique）NCの夫々に対
応する断片を含む組換DNA又は前記HPV−DNAの遺伝子間
領域に対応する配列の断片を含む組換DNAに係る。最後
に本発明は、これらHPV−DNAの各々から作成されるか又
は対応する断片から作成されるプローブと、これらプロ
ーブを使用したin vitro診断方法に係る。 実施例１及び２で後述する技術を使用してウィルスDN
A調製物（試料）を抽出した。 ウィルスの単離条件及び該ウィルスからHPV−DNAを得
るための条件を以下に詳細に説明する。 生殖器腫瘍形成及び子宮頚癌関連の新型HPVの分子クロ
ーニング及び特性決定（HPV−IP5） HPV6又はHPV10の特異的放射性DNAプローブと共に緩や
かな条件下でのレプリカに対する分子ハイブリダイゼー
ションによって上皮内新形成（陰茎の退形成丘疹）の生
検抽出DNA中で新型HPVを検出した。いくつかの制限エン
ドヌクレアーゼに対するこのHPVのDNAの感染性を検査し
た結果、EcoRI酵素がウィルスDNAを１回切断することが
判明した。病巣から抽出したDNAをEcoRI酵素で消化し、
8kbのDNA分子を含む画分をショ糖濃度勾配中の遠心によ
って精製した。8kbのDNA分子をEcoRI部位によってバク
テリオファージλgt WESλＢのDNAに挿入した。組換DNA
をカプシド封入（encapsidation）して大腸菌K12（LA10
1株）に感染させた後、HPVのDNAを組込んだ組換バクテ
リオファージを溶菌プレートハイブリダイゼーション法
（Benton及びDavis）によって選別した。これは、HPV6
のDNA特異的放射性DNAプローブを使用し、緩やかな条件
下で行なった。全ウィルス配列を含む複数の組換バクテ
リオファージを単離した。挿入酵素EcoRIによって組換
バクテリオファージのDNAを切断すると、緩やかな条件
下でHPV6のDNAとハイブリダイズする8kbの断片が生成す
る。組換バクテリオファージのDNA及び病巣から抽出さ
れたDNA調製物のDNAをエンドヌクレアーゼEcoRIとPstI
との混合物によって切断すると、HPVゲノムの分子量（8
kb）に対応する総分子量をもつ等しい７つの断片が生成
する。 新しいHPVのDNAをファージDNAの配列から切除し、プ
ラスミドpSP65中で再クローニングした。16種類の制限
エンドヌクレアーゼに対するこのDNAの感受性を検査し
てウィルスDNAの制限地図を作成した。これにより22個
の切断部位を決定した（第10図）。新規なHPVの制限地
図は、これまでに同定された全てのHPVの制限地図とは
異なる。新規なHPVのDNAと同定済のHPVのDNAとの相同度
をレプリカハイブリダイゼーションテストによって分析
する。これは新規なHPVの精製DNAから調製された放射性
プローブを使用し厳密条件下で行なう。HPV18のDNAに対
する部位的相同が検出され、HPV26のDNAに対してはより
程度の低い相同が検出され、HPV2,6,10,13,29,31とHPV
−IP2に対しては僅かな相同が検出された。新規なHPVの
DNAとHPV18のDNAとの間の相同度をより精密に測定する
ために、液体媒質中でDNA−DNA再結合実験を行ない、続
いてハイブリッドをヌクレアーゼS1で処理した。これら
２種類のDNA間で２％のハイブリダイゼーション率が検
出された。従って、陰茎の退形成丘疹から特定決定され
た新しいDNAは新型HPVであり、仮にHPV−IP5と指称す
る。 種々の条件下でHPV−IP5のDNAとHPV−16のDNAとの間
に形成されたヘテロデュプレックス分子を電子顕微鏡分
析すると、これ等２種類のゲノムの物理的地図を位置合
せし、HPV−IP5のDNAの地図を原点に対する該DNAの種々
の遺伝子の理論位置を決定し得る。これらの位置は原点
（第10図の制限地図の点０）からのゲノムの長さのパー
センテージで示される。 HPV−IP5の主な遺伝子及び遺伝子間領域（NC）の推定位
置 IP5 E6−E7 18 −28 E1 28 −53 E2 51.5−66 L2 69.5−89 L1 87 −8 NC 7.5−18 精製HPV−IP5のDNAから精製された放射性プローブを
使用すると、該ウィルスの発病能力を測定し得る。子宮
頚の上皮に対するHPVの感染の頻度を測定するために152
2個の子宮頚−腔細胞サンプルを検査し、HPVを含む110
個のサンプル中の５個のサンプルでHPV−IP5を検出し
た。また、子宮頚の初期癌の93個の生検サンプルを分析
し、３個のサンプルでHPV−IP5を検出した。この３つの
サンプルでは、細胞DNAにHPV−IP5のDNAの全配列が組込
まれていた。 従って、HPV−IP5は発癌能をもつ生殖器HPVの１つの
型である。そのため、生殖器腫瘍形成特に子宮頚癌の増
殖の原因になり得るHPVの種々のウィルス型を診断又は
早期発見するために、分子プローブの調製に用いられる
HPVのDNAの全ての混合物にHPV−IP5を混入するのが望ま
しい。 生殖器官病巣（病変）関連の新型HPV（HPV−IP6）の分
子クローニング及び特定決定 別の新型HPVは、僅少細胞異型性（atypiescellulaire
s minimes）を示す乳頭腫として記載された女性外陰部
病変から抽出されたDNAとHPV−31の特異的放射性DNAプ
ローブとを厳密な条件下でハイブリダイズすることによ
って、前者のDNAから検出された。複数の制限酵素に対
するこのHPVのDNAの感受性を検査すると、BamHI酵素が
ウィルスDNA1回切断することが判明した。病変から抽出
したDNAをBamHI酵素で消化し、6kbのDNA分子をショ糖濃
度勾配中の遠心によって精製し、バクテリオファージλ
L47.1のDNAにBamHI部位によって挿入した。組換DNAをカ
プシド封入し、大腸菌K12（LA101株）に感染させてか
ら、新HPVのDNAを組込んだ組換バクテリオファージを溶
菌プレートハイブリダイゼーション法（Benton及びDavi
s）によって選別した。これは、HPV31の特異的放射性DN
Aプローブを使用し、厳密な条件下で行なった。全ウィ
ルス配列を含む複数の組換バクテリオファージを単離し
た。エンドヌクレアーゼBamHIによって組換バクテリオ
ファージのDNAを切断すると、厳密な条件下でHPV31のDN
Aとハイブリダイズする8kbの断片が生成する。組換バク
テリオファージのDNA及び病変から抽出されたDNA精製物
のDNAをエンドヌクレアーゼBamHIとPstIとの混合物によ
って切断すると、乳頭腫ウィルスのゲノムの分子量に対
応する総分子量をもつ等しい７つの断片が生成する。 新しいHPVのDNAをファージDNAの配列から切除し、プ
ラスミドpSP64中で再クローニングした。20種類の制限
エンドヌクレアーゼに対するこのDNAの感受性を検査し
て新しいHPVのDNAの制限地図を作成した。これにより26
個の切断部位を決定した（第11図）。この制限地図は、
これまでに単離された全てのHPVの制限地図とは異な
る。新HPVのDNAと同定済のHPVのDNAとの相同度をレプリ
カハイブリダイゼーションテストによって分析する。こ
れは新HPVの特異的放射性DNAプローブを使用し厳密条件
下で行なう。HPV31のDNAとの間に部分ハイブリダイゼー
ションが観察され、HPV6,13のDNA及びHPV−IP2のDNAに
対しては僅かな交差ハイブリダイゼーションが観察され
た。新HPVのDNAとHPV31のDNAとの間の相同をより正確に
決定するために、液体媒質中でDNAを再結合させ、引続
いてヌクレアーゼS1でハイブリッドを処理した。これら
の２つのDNAの間で20％のハイブリダイゼーションが検
出された。従って外陰部退形成乳頭腫から単離されたウ
ィルスは、新型HPVであり、仮にHPV−IP6と指称する。 種々の条件下でHPV−IP6のDNAとHPV31のDNAとの間に
形成されたヘテロデュプレックス分子を電子顕微鏡分析
すると、これ等２種類のゲノムの物理的地図を位置合せ
し、HPV−IP6のDNAの地図の原点に対する該DNAの種々の
遺伝子の理論位置を決定し得る。これらの位置は原点
（第11図の制限地図の点０）からのゲノムの長さのパー
センテージで示される。 HPV−IP6の主な遺伝子及び遺伝子間領域（NC）の推定位
置 IP6 E6−E7 11.5−21.5 E1 21.5−46.5 E2 45 −59.5 L2 63 −82.5 L1 80.5−15 NC 1.5−11.5 精製HPV−IP6のDNAから精製された放射性プローブを
使用すると、該ウィルスの発病能を測定し得る。163名
の患者から得た外部生殖器官、肛門周囲領域及び子宮頚
の良性増殖性病変（コンジローム、乳頭腫）又は上皮内
腫瘍形成のサンプルを分析したところ、良性の病変（コ
ンジローム、乳頭腫）を呈する患者10名でHPV−IP6のDN
Aが検出された。子宮頚の上皮に対するHPVの感染の頻度
を測定するために1522個の子宮頚−腔細胞サンプルを検
査し、HPVのDNAを含む110個のサンプル中の正常もしく
は炎症性細胞学または軽度の異形成に対応する９個のサ
ンプルでHPV−IP6を検出した。 従って、HPV−IP6は弱い発癌能しかもたない比較的多
い生殖器HPVの１つの追加型である。そのため、生殖器
腫瘍形成時に子宮頚癌の増殖の主原因にはならない、性
行為で伝播するHPVの種々のウィルス型（良性の生殖器
腫瘍の要因である）を診断又は早期発見するために、分
子プローブの調製に用いられるHPVのDNAの全ての混合物
にHPV−IP6を混入するのが望ましい。 種々の形態のイボ又はその他の皮膚もしくは粘膜の病
変から単離され得るHPVは極めて多様であるが、次表に
示す如く各病気を診断するためには、同種類の病気の増
殖に関与することが認識されている１種類又は２種類以
上のHPV−DNAを含む混合物を使用するのが好ましい。感
染症の種類及びその進行の診断は、使用プローブの数が
多い程有効に行なわれる。更に、種々のプローブ混合物
を用いてハイブリダイゼーションテストを行なうと、患
者が罹っている疾患の種類をより確実に示す鑑別診断が
可能である。 従って本発明は更に、種々の形態の乳頭腫ウィルス感
染症の総合的診断、任意に感染症の進行の可能性の診断
のために組合せて使用されることが可能な種々のHPV−D
NAの混合物（又はこれらHPV−DNAを含むか又はその配列
を含むプローブ）に係る。 本発明の混合物の好ましい例を次表に示す。 前記の表はまた、表の左側部分に記載の混合物を使用
すると特に診断し易い病気の種類を示している。この表
で指定された本発明以外のHPV−DNAの制限地図は第１図
から第９図に示されている。 注目すべきは、HPV−IP5及びHPV−IP2は子宮頚癌の増
殖の危険を検出するために有効な代表的プローブとなり
得、IP6は良性乳頭腫の感染を検出するために使用でき
る代表的プローブとなり得ることである。 HPV−IP6のDNAはHPV−６および／またはHPV11のDNAと
組み合わせることができる。 最後に本発明は全てのプローブの混合物にも係る。 さらに本発明は、より特定的には、生殖器癌に特異的
なHPVのDNAを含むプローブのカクテル（混合物）に係
り、このカクテルはHPV−IP2、HPV−IP5、HPV−IP6、HP
V6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV35を含む。 IP6は良性乳頭腫ウィルスの感染を検出するのに使用
可能なプローブの代表例であり、IP6のDNAはHP6および
／またはHPV11のDNAと組み合わせることができる。 従って本発明は特に、前出の表の「混合物の名称」の
欄に１〜11の番号で示された11個のグループを少なくと
も含む診断用パッケージ即ち「キット」に係る。 前記の記載では、主としてクローン化したHPV−DNA全
体がプローブとして使用されている。しかし乍らこれら
クローン化HPV−DNA全部の代りに、種々のDNAのクロー
ン化断片、特に遺伝子E1又はL1及び遺伝子E6−E7を使用
してもよい。 HPV−DNAのin vitro検出の基本原理では、当然厳密な
条件又はやや緩和した条件下で処理するハイブリダイゼ
ーションを使用する。例えば以下の如く処理する。但
し、本発明のプローブ又は混合プローブの使用条件は記
載の診断テストに限定されないことは言う迄もない。 クローニングされたHPVのDNAの混合物から調製された
プローブは、病変から掻爬された細胞の生検サンプル、
又は例えばCarnoy混合物（エタノール、クロロホルム、
酢酸＝6:3:1）で固定しパラフィンに封入した生検サン
プル切片中のHPVを検出しHPVの型を同定するための検査
で使用される。この検査では、公知の方法でサンプルか
らDNAを予め抽出し、分子ハイブリダイゼーション実験
で該DNAを分析する必要がある。このハイブリダイゼー
ション実験は、HPV−DNA混合物から調製され（³²P又は
³⁵Sでラベルされ）た放射性プローブを用い厳密な条件
又はやや緩和された条件下で行なわれる。各検査には通
常、複数の混合プローブが必要である。 いくつかのハイブリダイゼーション法の使用が可能で
ある。例えば、ブロットハイブリダイゼーションを使用
し得る。この方法は、DNAの変性後に所定量のDNAの部分
サンプルを膜（ニトロセルロース又はGenescreenplus）
に付着させ、常用条件下で各膜と混合プローブとをハイ
ブリダイズさせ、ラジオグラフフィルムと接触した膜を
露光して放射性ハイブリッドを検出する。また、レプリ
カハウブリダイゼーションを使用してもよい。この方法
は、制限酵素によるDNAの処理後に得られたDNA断片をア
ガロースゲル電気泳動で分離、しこれら断片をアルカリ
変性後に膜（ニトロセルロース、Genescreenplus）に移
植し、種々の混合プローブと共に常用条件下でハイブリ
ダイズさせ、ラジオグラフフィルムと接触した膜を露光
して放射性ハイブリッドの形成を検出する。 また、例えばCarnoy混合物で固定しパラフィンに封入
された組織切片を用いたin situハイブリダイゼーショ
ンを行なってもよい。 放射性プローブは、「ニック−トランスレーション」
の方法でラベルされたHPVのDNAから構成されてもよく、
例えばpSP6のタイプのベクターに挿入されたウィルスDN
Aの転写によって調製されたRNAから構成されてもよい。
放射性プローブの使用を感受性が高いという利点を与え
るが、非放射性プローブの使用は勿論可能である。非放
射性プローブの例としては、ラベルされた抗体又は酵素
ラベル、蛍光ラベル等のラベルを含む抗体によって認識
され得るビオチニル化プローブがある。 従って本発明は更に、前記プローブを複数種含むキッ
トを提供する。本発明キットは、 − 夫々単離されたHPV−IP5及びHPV−IP6と、 − 従来のプローブと別のプローブ、特に前記プローブ
との混合物とを含む。 本発明のキットは、患者から得られたウィルス調製物
と種々のプローブ又は混合プローブとのハウブリダイゼ
ーションによってin vitro診断検査に使用される。 本発明が記載の実施態様に限定されないこと、逆にそ
の全ての変形を包含することは前記の記載より勿論明ら
かであろう。特に、特許請求の範囲において所与の符号
で特定され図面において対応する制限地図が示されたHP
V−DNAに関しては、該HPV−DNAが、本文中の定義によれ
ば該HPV−DNAと同じ型に分類できまた同じ亜型に属する
と判断できる全てのHPV−DNAを意味すると理解された
い。 以下の組換DNAは1986年 １月21日に以下の受託番号
でC.N.C.M（Collection Nationale des Cultures de Mi
cro−Organismes de l′INSTITUI PASTEUR de Paris）
に寄託された。 pSP65/IP5（大腸菌中のプラスミド）:I−507 pSP64−IP6（大腸菌中のプラスミド）:I−508 文 献 目 録 （１） Ｄrst,M.et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,80:3812−3815. （1bis）Bospart M.et al.d,1984,Embo J.3＝1151−115
7 （２） Coggin,J.R.,Jr.et al.,1979,Cancer Res.,39:
545−546 （３） Gissmann,L.et al.,1982,J.Virol.44:393−40
0. （４） Green,M.et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.79:4437−4441. （５） Heilman,C.A.et al.,1980,Virol.36:395−407. （６） Jablonska.S.et al.,1972.Cancer Res.,32:583
−589. （７） Jablonska.S.et al.,1982,Springer Semin,Imm
unopathol.５:33−62. （８） Kremsdorf,D.et al.,1982d,J.Virol.43:436−4
47. （９） Kremsdorf.D.et al.,1983,J.Virol.48:340−35
1. （10） Lutzner,M.A.et al.,1978,Bull.Cancer,65:169
−182. （11） Lutzner,M.A.et al.,1983,Lancet 11:422−42
4. （12） Migozzi,M.et al.,1965,Bull.Soc.Franc.Derm.
Syph.72:747−748. （13） Orth,G.et al.,1980,Cold Spring Harbor Con
f.Cell Proliferation,７:259−282. （14） Orth,G.et al.,1981.J.Invest.Dermatol.76:97
−102. （15） Orth,G.et al.,1979,Cancer Res.39:1074−108
2. （16） Ostrow,R.S.et al.,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.,79:1634−1638. （17） Ostrow,R.S.et al.,1983,Ann.Acad.Dermatol.
８:398−404. （18）Pfister,H.et al.,1983,Cancer Res.43:1436−14
41. （19） Pfister,H.et al.,1983,J.Virol.47:363−366. （20） Pfister,H.et al.,1981,Int.J.Cancer,27:645
−650. （21） Rueda,L.A.et al.,1976,Med.Cut.I.L.A.２:113
−136. （22） Ruiter,M.et al.,J.Invest.Dermatol.,47:247
−252. （23） Sutcliffe,J.G.,1978,Nucleic Acids Res.５:2
721−2728. （24） Tsumori,T.et al.,1983,J.Gen.Virol.64:967−
969. 以下の文献も考慮すべきである（いくつかの文献の前
に付けたHPVの名称はその文献で最初に記載されたもの
である）。 HPV18: BOSHART M.et al.,1984,EMBO J.３:1151−1157 HPV−IP2: BEAUDENON S.et al.,1986,Nature,321:246,
249 BEAUDENON S.et al.,1987,j.Inv.Dermatol.,88 No1 KAWASHIMA M.et al.,1986a,J.Virol.,57:688−692 KAWASHIMA M,et al.,1986b,Virology,154:389−394 HPV6: DE VILLIERS E.M.et.al.,1981,J.Virol.,40:932
−935 HPV11: GISSMANN L.et al.,1982,J.Virol.,44:393−40
0 HPv31: LORINCZ A.et al.,1986a,J.Virol.,58:225−22
9 HPV35:LORINCZ A.et al.,1986b,Bamburyreport,21:225
−2371. HPV16: DURST et al.1983 本明細書中に記載したいくつかのHPVの名称は現在実
施されている国際命名法の範囲内で改称されている。特
に、以下の表で右にあげた単離株の名称（本明細書中で
の名称）はその後表中の左にあげた名称でよばれてい
る。 HPV32＝HPV31 （BEAUDENON S.et al.,1987） HPV34＝HPV32 （KAWASHIMA M.et al.,1986） HPV33＝HPV−IP2（BEAUDENON S.et al.,1986） HPV36＝HPV−IP4（KAWASHIMA M.et al.,1986） HPV39＝HPV−IP5（BEAUDENON S.et al.,準備中） HPV42＝HPV−IP6（BEAUDENON S.et al.,準備中）

【図面の簡単な説明】 第１図〜第９図は関連するHPV−DNAの制限地図、第10図
及び第11図はそれぞれ本発明のHPV−IP5及びHPV−IP6の
DNAの制限地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイナ・クレムスドルフ フランス国、75013・パリ、リユ・エス キロル・35 (72)発明者 オデール・クロワツサン フランス国、75013・パリ、リユ・オー ギユスト・ランソン・19 (72)発明者 ジエラール・オルト フランス国、92330・ソー、リユ・ド ユ・ドクトウール・ルー・49

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト乳頭腫ウィルスHPV−1P5もしくはHPV−IP6から
   得られる約7,000〜約8,000塩基対からなるヒト乳頭腫ウ
   ィルス（HPV）DNA、又は前記乳頭腫ウィルスの１つに特
   異的であって且つストリンジェントな条件下でその乳頭
   腫ウィルスに安定にハイブリダイズ可能である前記DNA
   の断片。 ２．前記HPVの遺伝子E1,E2,E6−E7,L1もしくはL2、又は
   これらの遺伝子間領域に対応するセグメントからなる群
   から選択されるHPV DNAの遺伝子である特許請求の範囲
   第１項記載のDNA。 ３．組換えDNAである特許請求の範囲第１項又は第２項
   に記載のDNA。 ４．HPV DNAの検出用プローブとして使用可能である特
   許請求の範囲第１〜３項のいずれか一項に記載のDNA。 ５．下記（ｉ）に示される制限部位間のHPV−IP5 DNA
   又は下記（ii）に示される制限部位間のHPV−IP6 DNA
   であるか、あるいは前記HPV−IP5もしくはHPV−IP6DNA
   に相補的なDNAである特許請求の範囲第１、３および４
   項のいずれか一項に記載のDNA。 ６．ヒト乳頭腫ウィルスHPV−IP5もしくはHPV−IP6から
   得られる約7,000〜約8,000塩基対からなるHPVDNA、又は
   該HPVの１つに特異的であって且つストリンジェントな
   条件下でそのHPVに安定にハイブリダイズ可能である前
   記DNAの断片からなるHPV DNAプローブの製造方法であ
   って、 （Ａ） 前記HPV DNAもしくは安定なハイブリダイゼー
   ションを可能にするその断片を、適切な宿主中で後に行
   なう組換えベクターのクローニングを可能にする適切な
   ベクターの部位に挿入して、前記HPV DNAもしくはその
   断片と前記ベクターとを含む組換えベクターを調製し、 （Ｂ） この組換えベクターを適切な宿主中でクローニ
   ングし、 （Ｃ） 得られたクローン化組換えHPV DNAを回収す
   る、ことを包含する前記方法。 ７．前記宿主が原核微生物である特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 ８．前記組換えベクターが、前記HPVの完全DNA配列を含
   有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９．前記組換えベクターが、前記HPVの完全DNA配列の断
   片で且つ安定なハイブリダイゼーションを可能にする断
   片を含有する特許請求の範囲第６項記載の方法。 １０．得られたクローン化組換えHPV DNAを、酵素、放
   射性化合物および蛍光性化合物からなる群から選択され
   るマーカーでラベルすることをさらに含む特許請求の範
   囲第６項記載の方法。 １１．下記のグループ： （ｉ） HPV−2dのHPV DNA、 （ii） HPV−10b、HPV−28およびHPV−29のHPV DNAの
   少なくとも１つ、 （iii） HPV−17およびHPV−24のHPV DNAの少なくと
   も１つ、 （iv） HPV−14、HPV−15、HPV−17、HPV−19、HPV−2
   0、HPV−21、HPV−22、HPV−23およびHPV−IP4のHPV D
   NAの少なくとも１つ、 （ｖ） HPV−15およびHPV−17のHPV DNAの少なくとも
   １つ、 （vi） HPV−24のHPV DNA、 （vii） HPV−14、HPV−32およびHPV−IP4のHPV DNA
   の少なくとも１つ、 （viii） HPV−31のHPV DNA、 （ix） HPV−32のHPV DNA、 （ｘ） HPV−16、HPV−18、HPV−IP2およびHPV−IP5の
   HPV DNAの少なくとも１つ、 （xi） HPV−６、HPV−11およびHPV−IP6のHPV DNAの
   少なくとも１つ、 のプローブを含み、前記グループのDNAは、前記11グル
   ープの各々がただ１つのHPV DNAグループ構成員を含む
   場合、11グループの各々のHPV DNAが互いに異なるよう
   に選択される、１つ以上のヒト乳頭腫ウィルス（HPV）
   プローブを含有するHPV検出用キット。 １２．病気によって影響を受けた組織がヒト乳頭腫ウィ
   ルス（HPV）DNAの含む前記病気の存在を検出する方法で
   あって、下記のグループ： （ｉ） HPV−2dのHPV DNA、 （ii） HPV−10b、HPV−28およびHPV−29のHPV DNAの
   少なくとも１つ、 （iii） HPV−17およびHPV−24のHPV DNAの少なくと
   も１つ、 （iv） HPV−14、HPV−15、HPV−17、HPV−19、HPV−2
   0、HPV−21、HPV−22、HPV−23およびHPV−IP4のHPV D
   NAの少なくとも１つ、 （ｖ） HPV−15およびHPV−17のHPV DNAの少なくとも
   １つ、 （vi） HPV−24のHPV DNA、 （vii） HPV−14、HPV−32およびHPV−IP4のHPV DNA
   の少なくとも１つ、 （viii） HPV−31のHPV DNA、 （ix） HPV−32のHPV DNA、 （ｘ） HPV−16、HPV−18、HPV−IP2およびHPV−IP5の
   HPV DNAの少なくとも１つ、 （xi） HPV−６、HPV−11およびHPV−IP6のHPV DNAの
   少なくとも１つ、 のプローブから選択される１種以上のHPVプローブを前
   記組織と接触させ、前記プローブと前記乳頭腫ウィルス
   DNAとのハイブリダイゼーションを検出することを包含
   する前記方法。 １３．前記組織が細胞を含み、この細胞に前記プローブ
   を接触させる特許請求の範囲第12項記載の方法。 １４．前記細胞が細胞成分を含み、この細胞成分の少な
   くとも１つに前記プローブを接触させる特許請求の範囲
   第13項記載の方法。 １５．前記病気が、 （ｉ） イボ、 （ii） 上皮内腫瘍形成、 （iii） 皮膚癌、 （iv） 病巣状口腔上皮過形成、 （ｖ） 生殖器腫瘍形成、 （vi） 子宮頚癌、 （vii） コンジローム、および （viii） 乳頭腫、 からなる群から選択される病気の少なくとも１つである
   特許請求の範囲第12項記載の方法。 １６．前記病気が、良性イボおよび良性過形成からなる
   群から選択される特許請求の範囲第12項記載の方法。 １７．前記病気が、上皮内腫瘍形成を示すイボ又は過形
   成の形態からなる特許請求の範囲第15項記載の方法。 １８．前記病気が、皮膚又は粘膜の癌を示すイボ又は過
   形成からなる特許請求の範囲第12項記載の方法。 １９．前記イボが、表皮、中間上皮、粘膜、偏平イボか
   らなる群の１種以上の構成員として分類される特許請求
   の範囲第17項記載の方法。 ２０．前記イボが、尋常イボ又は足底イボである特許請
   求の範囲第18項記載の方法。 ２１．検出すべき前記病気がイボ状表皮異形成である特
   許請求の範囲第12項記載の方法、 ２２．生物サンプル中の乳頭腫ウィルスを検出および同
   定するための方法であって、ヒト乳頭腫ウィルスHPV−I
   P5もしくはHPV−IP6から得られる約7,000〜約8,000塩基
   対からなるHPV DNA、又は前記乳頭腫ウィルスの１つに
   特異的であって且つストリンジェントな条件下でその乳
   頭腫ウィルスに安定にハイブリダイズ可能である前記DN
   Aの断片、の１種以上とサンプルとのハイブリダイゼー
   ションアッセイを実施し、その結果得られたハイブリダ
   イズしたHPV DNA又はその断片を検出することを包含す
   る前記方法。 ２３．前記DNA又はそのDNA断片が、HPV遺伝子E1,E2,E6
   −E7,L1もしくはL2、又はこれらの遺伝子間領域に対応
   するセグメントからなる遺伝子の群から選択される特許
   請求の範囲第22項に記載の方法。 ２４．前記DNA又はそのDNA断片が組換えDNAである特許
   請求の範囲第22項又は第23項に記載の方法。