JP2742257B2 - 乳頭腫ウイルスに対するプローブ及び乳頭腫ウイルス感染の検出法 - Google Patents
乳頭腫ウイルスに対するプローブ及び乳頭腫ウイルス感染の検出法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は乳頭腫ウイルス（papillomavirus）のDNA及
びより特定的にはこの乳頭腫ウイルスから得られるプロ
ーブ、そしてこのプローブを用いるイン・ヴイトロ（生
体外）に於ける乳頭腫ウイルス感染の診断方法に係るも
のである。 “乳頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比
較的良性の（ウイルス性）いぼ（warts）から、上皮内
腫瘍又は種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成（hy
perplasias）までの幾つかの形態のウイルス感染症の原
因であると共通して考えられている多数のウイルスを含
むものである。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、こ
れ以降時々“EV"と表現されるいぼ状表皮異形成（epide
rmodysplasias verruciformis）があることにも注意し
なければならない。 乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告されてい
る。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規の型及び
亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於いて多大の
割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のあるウイルス性
のいぼ又は播種性斑紋（disseminated macular）病巣か
ら単離したことが報告されるであろう。 最近の研究により免疫因子の重要性及びヒト乳頭腫ウ
イルス（HPV）の主要な役割が明らかにされており、こ
れらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病原論に於ける様
々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関する文献中
に以前に記載されている役割が追加される。 本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウイルスの相
対的な挙動に関する観察に基づいてなされたものであ
り、その主要なゲノムの性質は以下で定義されよう。 少数のEV例に関する研究によつて、６つの型のHPVの
性質がそれらのゲノムの分子クローニングによつてすで
に明らかにされている（クレムスドルフ・デー（Kremsd
orf,D.）等、1982年、ジヤーナル・ヴイロロジー（J.Vi
rol）.43巻、436-447頁及びクレムスドルフ・デー等、1
983年、ジヤーナル・ヴイロロジー、48巻、340-351頁参
照）。異なるグループのゲノムの間でのハイブリダイゼ
ーションが欠如しているか又は非常に弱いかどうかによ
つて、上記のHPVは３つのグループに分類された。第１
のグループには、或る種のEV患者及び一般住民に於いて
見られる扁平なウイルス性いぼと関連のあるHPV3a及び1
0が含まれる。HPV3aに関連するDNA配列は一つのEV患者
のガンで発見された。第２のグループにはHPV5,8及び12
が含まれ、HPV5及び８のゲノムは複数のEV患者のガン中
で検出された。第３のグループは現在のところたった１
種のウイルス、HPV9である。免疫抑制を呈した腎臓移植
受容者がHPV5に感染していると判明したことは例外であ
るが、第２と第３のグループのウイルスはEV患者の間だ
けに検出され、彼らの殆んどは幾つかのウイルスに感染
していた。現在文献中に記述されている（以下に示す参
考文献１−５、8,9,13,14,16,18-20）14の型のHPVの中
で、４つのものは、珍しい病気であるEVに特に関係のあ
るものであることが判明したことに注目すべきである。 多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを単離し本
発明を完成せしめた研究によつてイン・ヴイトロに於け
るより高度に洗練された診断技術開発が可能になつた。
より特定的には、本発明は、例えば病巣又はバイオプシ
ー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に関する完璧
な技術を提供し、これによつて、問題となつている病巣
が悪化していく可能性があるかどうかに関する予測をも
より良く行うようにさせ得るようなより正確な診断法を
もたらす。 一般的に言つて、乳頭腫ウイルスは、互いに非常に異
つてはいるが、それでも7000〜8000のケタの塩基対の大
きさを有していることに注意しなければならない。加え
て、それらのゲノムには前述にもかかわらず或る程度の
相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭腫ウイル
スの様々な型及び亜型間の相同性の割合（％）を決定す
ることに言及する。これら相同性の割合は、“非ストリ
ンジエント（non-stringent）”又は“非ストリクト（n
on-strict）”と呼ばれる条件下、又は“ストリンジエ
ント（緊縮）”又は“ストリクト（厳格）”と呼ばれる
条件下で行なわれるハイブリダイゼーシヨンアツセイに
よつて決定される。 乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイルスに区別
され得、それらはストリクト又はストリンジエントの条
件下で測定された相同性の割合によつて区別され得る。
この条件下で、50％より小さい相同性の割合を示すもの
は別の型に属する。この点に関して、ストリクト又はス
トリンジエントな条件下で別の型のウイルス間の相同性
の割合は０まで低下し得るということに注意しなければ
ならない。これと同条件下で、50％より大きい相同性の
割合を示すウイルスは同じ型に属するものと考えられ、
それらはこの同型内の別々の亜型を形成する。 非ストリクト又は非ストリンジエントな条件下のハイ
ブリダイゼーシヨンアツセイは、ハイルマン・シー・エ
ー（Heilman.C.A）等、1980年、ジヤーナル、ヴイロロ
ジー36巻、395-407頁及びクロイサン（CROISSANT）等、
1982年、シー．アール．アカド・サイエンス（C.R.Aca
d.Sc.パリ、294巻、581-586頁（ヘテロ二重鎖分子）に
記載されている以下の条件下で単離された２種のウイル
スから取り出されたDNAを相互に接触させるものであ
る。 ストリクト又はストリンジエントな条件下のハイブリ
ダイゼーシヨンアツセイは、クレムスドルフ・デー等、
1982年、ジヤーナル・ヴイロロジー、43巻、436-447
頁、及び1983年ジヤーナル・ヴイロロジー、48巻、340-
351頁、及びデービス・アール．ダヴリユー（Davis,R.
W）等、1971年、酵素学に於ける方法（Methods Enzymo
l）、21巻、413-428頁（ヘテロ二重鎖分子）に記載され
ている条件下で単離された２種のウイルスから取り出さ
れたDNAを相互に接触させるものである。 概要的には、１つの同じ型に属する乳頭腫ウイルスは
それぞれの配列の長さ全体の80〜100％に亘る実質的に
同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な
配列を持つているが、これら相同的な配列は別の型に属
する乳頭腫ウイルスの間では60％又はそれ以下に低下し
得ることを言及しておく。非ストリクト又は非ストリン
ジエントの条件下で相互にハイブリツドを形成する別の
型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるいは類似であ
る程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より必らず明ら
かに低いものである。 本発明者らの研究によつて、種々の型の乳頭腫ウイル
スの間の遺伝的ヘテロ性の程度は以前考えられていたも
のよりも大きいこと、そして同時に、これら種々の型が
或る程度の特異性を示す感染形態又はその変形としばし
ば関連のあることの２つが明らかになつた。 従つて本発明は、単離された種々の新規の乳頭腫ウイ
ルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAから全部又は
部分的に構成され得るプローブに関するだけではなく、
或る乳頭腫ウイルスが発見される患者の危険の度合及び
様々のカタゴリーの感染の診断に最も有効に用い得る乳
頭腫ウイルスの型の混合物（カクテル）にも関するもの
である。場合によつては以前にすでに単離されている乳
頭腫ウイルスのゲノムDNAから構成されたプローブおよ
びこれを本発明のものと組み合わせた混合物も含めて本
願明細書に記載されている乳頭腫ウイルス用プローブの
数によつて、非常に正確な診断が実現される。特に、様
々の型の乳頭腫ウイルスにその原因を帰することができ
る感染又はこのような様々の型のウイルスの影響によつ
て進行悪化する可能性がある感染のいろいろなカテゴリ
ーのものがより容易に識別できるようになり、或るカテ
ゴリーの感染に於いては、その進行悪化によつてより深
刻な病気に転換するかどうかという危険の度合をより良
く経過予想することができるようになる。例えば、いぼ
状表皮異形成として発現する感染の場合にはそれが皮膚
ガンに進行するかどうかという危険の度合いをより正確
に評価することができる手段を本発明は提供することを
目的とするものである。 以下の表現を簡潔にする為に一般の方法に従つて、乳
頭腫ウイルスの全ゲノムを“HPV-DNA"という略語で示す
ことにする。 同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの乳頭腫ウイ
ルスを含むHPV-DNAの物理的制限地図が記載されている
添付図を参照する。 これらの物理的地図は様々の制限エンドヌクレアーゼ
による切断部位の位置を与える。この地図の起点は一般
的に単一の切断部位で構成されている。この起点からの
距離はゲノムの全長に対するパーセントで表わされる。
地図の１単位はゲノム長の１％を表わす。 本発明はまず第１に最も特別には、7000〜8000塩基対
の範囲の大きさをもつ全てのDNAから選ばれた各HPV-DNA
に関するものであり、これらDNAは図中に表わされる制
限地図によつて特徴づけられるものであり、それはより
特定的にはHPV-2d、HPV-10b、HPV-14a、HPV-14b、HPV-1
5、HPV-17a、HPV-17b、HPV-19、HPV-20、HPV-21、HPV-2
2、HPV-23、HPV-24、HPV-28、HPV-29、HPV-31及びHPV-3
2、HPV-IP2及びHPV-IP4で示される乳頭腫ウイルスから
得られたHPV-DNAに関するものである。 ここに列挙したものと同じ型に属すると考えられ得る
HPV-DNAに対しても本発明の効果が同じように及ぶこと
は言うまでもないことである。 新たに特徴づけられたウイルスのHPV-DNAに対応する
物理的地図は図中の黒丸で示されている。 本発明は同じように、前記HPV-DNAのフラグメント又
はそれと特にストリクトな条件下でハイブリツドを形成
し得るものに係る。同様に、本発明は上記各HPV-DNAの
全部又は一部を含む組換えDNA、そして特にそれぞれE
1、E6-E7、L1及びL2の遺伝子に対応するフラグメントを
含む組換えDNA又は前記HPV-DNAの遺伝子間（inter-gen
e）領域に対応する配列を含むフラグメント（またはこ
れを含む組換えDNA）にも関係するものである。最後
に、これらそれぞれのHPV-DNAまたは対応するフラグメ
ントから構成され得るプローブ及び該プローブを用いる
イン・ヴイトロ診断方法に係るものである。 ウイルスDNA調製物は６人のヨーロツパのEV患者及び
２人の南アメリカのEV患者の良性病巣を削りとつたもの
から選択的に抽出された（ラツナー・エム・エー（Lutz
ner,M.A.）等、1983年、ランセ（Lancet）ii422-424
頁）。HPV-DNAは平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び
／又はエチジウムブロミド存在下のシユークロース勾配
沈降法により、クレムドルフ等の前記の文献、及びオー
ツ・ジー（Orth,G.）等の1980年の細胞増殖に関するコ
ールド・スプリング・ハーバー会議（Cold Spring Harb
or Conf.Cell Proliferation）、７巻、259-282頁に以
前記載された操作方法に従つて精製された。このDNA調
製物は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生
成物をアガロースゲル電気泳動によつて分離した（クレ
ムスドルフ等の前記文献参照）。更に、患者の１人のい
ぼ状突起（rerruca warts）から得られたHPV5,8及び12
（クレムスドルフ等の前記文献参照）並びにHPV−２
（ハイルマン・シー・エー等、1980年、ジヤーナル．ヴ
イロロジー、36巻、395-407頁、及びオーツ・ジー等、1
980年、細胞増殖に関するコールド・スプリング・ハー
バー会議７巻、259-282頁参照）から、以前に特徴づけ
られた型とは異なる11の株が同定され、それによつて該
DNA類の制限酵素切断の主要なモデルが提供された。新
規なHPVの型には番号が付与され、１つの型に属する亜
型には番号の後にそれらの同定年代順に従つて文字が付
与された。（コギン・ジエイ・アール（Coggin.J.R.）
等、ガン研究（Cancer Res.）、39巻、545-546頁）。こ
の新規な11種のHPVのゲノムをエシエリヒア・コリ（Esc
hevichia Coli）K12、C600株内でクローン化した（前記
のクレムスドルフ等の文献、1983年参照）。エンドヌク
レアーゼBam HIによつて生成されたHPV-24DNAの２つの
フラグメントは例外として、DNAは単位長（unitary len
gth）の分子形態で挿入された。これらのDNAはAva l,Ba
m HI及びHind IIIの単一切断部位を用いてプラスミドpB
R322（サトクリフエ・ジエイ・ジー（Sutcliffe,J.
G.）、1978年核酸研究（Nucleic Acids Res.）、５巻、
2721-2728頁）に挿入するか、又は単一のSac I部位を含
む、HPV−５のDNA由来のHind IIIBフラグメント（前記
のクレムスドルフ等、1982年）を組込んだ組換えプラス
ミドに挿入した。より特異的には、HPV17b及び22は、HP
V−５のDNA由来のHind IIIBフラグメントを含む組換え
プラスミドpBR322及びHPVのDNAをただ１ケ所で切断する
酵素（Sac I）で切断した後、単位長のDNA分子形態で挿
入された。HPV-14aのDNAは、Hind IIIによる該ウイルス
DNAの不完全消化後に単位長のDNA分子形態でプラスミド
pBR322に挿入された。このHind IIIはHPV-14aのゲノム
から96.1％及び3.9％の長さを持つ２つのフラグメント
を生成するものである。HPV-24のBam HI AおよびＢフラ
グメント（それぞれゲノム長の83.1％および16.9％に相
当する大きさを持つ）を別々にプラスミドpBR322に挿入
した。 単離したクローン及びそれに対応するHPV源を以下の
表１に挙げる。 組換えプラスミドを同定するために、プラスミドにウ
イルス配列を挿入するために用いられたエンドヌクレア
ーゼを含めた２種の制限酵素の混合物で処理後組換えDN
A類および非クローン化HPV-DNA類の消化生成物の電気泳
動移動度を比較した。単離された断片の数およびサイズ
から、各々の場合にウイルスゲノムが組込まれたことが
示された。非クローンHPV-DNA類或いはプラスミド配列
から切除されたHPV-DNA類をアガロースゲル電気泳動で
分析したところ（データは示さず）、DNAサイズの不均
一性が認められた。HPV14a,19,20および21からのDNA類
は、HPV3a,5,8および12のDNA類と同様のサイズ（約7700
ヌクレオチド対）を有している〔前掲のクレムスドルフ
（KREMSDORF）の論文〕がHPV15,17a,17b,22および23のD
NAはこれより短くHPV9のDNAと同様のサイズ（約7200ヌ
クレオチド対）を有している〔前掲のクレムスドルフ
（KREMSDORF）（1982）およびオルス（ORTH）（1980）
の論文〕。 クローン化ウイルスゲノムの14個の制限酵素に対する
感受性を分析し、物理的地図が確立された（第１図〜第
10図）。或るHPV-DNA類の制限地図を以下に述べる理由
により幾つかの図に繰り返し図示した。前記（９）の方
法によれば、22から33個の間の切断部位が局在化してい
た。HPV14aおよび14bの地図（第4a図および第4b図）とH
PV17aおよび17bの地図（第５図）を除けば、これらの地
図の間には明らかな相似性は認められなかつた。夫々HP
V14aおよび14bのDNA上に位置する21個および31個の部位
の中で、HPV-14aのDNAの２個のBam HI切断部位のひとつ
がHPV-14bのDNAの唯一のBam HI切断部位と並んでいると
きには15個が共通していることが判明した。同様に、唯
一のBam HI切断部位が並んでいるときには、HPV-17aのD
NA上の29個の切断部位のうち21個がHPV-17bのDNA上（全
部で26部位）でも等しく認められた。これらの地図と、
EVに関連するHPV類（HPV3a,5,8,9,10および12）（8,9,1
6,18および20）、皮膚いぼに関連するHPV類（HPV1,2,4
および７）、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するHP
V類（HPV6b,11a,13および16）（1,33,19）に対して既に
確立された地図との間に、EV保有日本人男性から単離さ
れたHPVの地図（24）と密接に関連するHPV-14aに対する
地図を除いては明らかな相似性はみられなかつた。この
後者の単離HPVとHPV-14aとの相違的は、１個の追加BamH
I部位と１個の追加Hind II部位である。２種のウイルス
において部位AvaI,BamHI,BglI,EcoRI,HindIIおよびHind
IIIの位置は同様であつた。交差ハイブリダイゼーショ
ン実験により、これら２種のウイルスが実際に密接に関
連していることが確認された。 （矢印で示した）幾つかの部位が所在していないこと
に注目されたい。ゲノムの長さの２％未満の差しかない
切断部位は保存されたもの（*）とみなした。分裂を生
起しない酵素は次の通りであつた。HPV14aおよび23のDN
Aに対してはPvuI,SalIおよびSmaI;HPV-14bのDNAに対し
てはPvuI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV15,17aおよび17bのD
NAに対してはBglI,PvuI,SalI,SmaI,HPV-19のDNAに対し
てはBglI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV-20のDNAに対しては
EcoRI,PvuI,SacIおよびSmaI;HPV-21のDNAに対してはSac
IおよびSmaI;HPV-22のDNAに対してはBamHI,BglI,PvuI,P
vu IIおよびSalI;HPV-24のDNAに対してはBglI,EcoRI,Pv
uI,SacI,SalIおよびSmaI。 既に特徴付けられたEVのHPV-DNA類（HPV3a,5,8,9,10
および12）、皮膚いぼに関連するHPV-DNA類（HPV1,2,4
および７）および粘膜病巣に関連するHPV-DNA類（HPV6
b,11a,13および16）と新たに特徴付けられたHPV-DNA類
との間、並びに新たに特徴付けられたHPV-DNA類のDNA類
間の配列相同の有無を研究した。ろ紙上への付着、およ
び飽和液層中でのDNA-DNAハイブリダイゼーシヨンとそ
れに続くS1ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーシ
ヨン実験は、前記した（8,9）偏性（ストリクトまたは
ストリンジエント）条件下で実施した。特に、HPV類のD
NA類は、前記したように（13）“ニツク翻訳”で標識
し、アルカリ性シヨ糖勾配（５〜20％）での沈降により
分離させた。標識（4000cpm）HPV-DNA類を、前記したよ
うに（8,9）牛胸腺DNA（20μｇ）あるいは非標識HPV-DN
A（0.20μｇ）の存在下でNaCl0.48M/EDTA1mM（pH6.8）
中、68℃でインキユベートした。HPV-DNAプローブの比
活性は5.3×107から２×108cpm/μｇの間で変化した。
ハイブリダイゼーシヨンの程度を、S1ヌクレアーゼに抵
抗する画分を目安にして調べた。数は、プローブの自然
復元（４〜15％）について校正し相同ハイブリダイゼー
シヨン（75〜95％）について100％に正規化した値を表
わす。NDは“測定せず”の略号である。上記条件下にお
けるHPV-DNA類間の交差ハイブリダイゼーシヨンの相対
量を、標識HPV-DNAと非標識HPV-DNAとのハイブリダイゼ
ーシヨンの％として表示する。 HPV1,2,4,6b,7および11aのゲノムと32Ｐ標識の新たに
クローン化されたEVのHPV-DNA類との間、或いはEVの非
標識HPV-DNA類とHPV13,16および18に特異なプローブと
の間の交差ハイブリダイゼーシヨンは全くないか或いは
殆どないことに注目されたい。同様に、飽和再結合（sa
turation reassociation）により、HPV14a,14b,15,17a,
17b,19,20,21,22,23および24のDNA類とHPV1aおよび11a
のDNA類との間に交差ハイブリダイゼーシヨンは殆んど
認められなかつた（表２）。新たにクローン化されたHP
V類のDNA類では、強力な交差ハイブリダイゼーシヨンを
示したHPV17aおよび17b、HPV14aおよび14bを除いて、相
互間かつEVに関連する他のHPV（HPV3a,5,8,9,10および1
2）のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーシヨンは
殆んど或いは全くみられなかつたし、認められたにせよ
50％未満であつた。これらの知見から、新しいウイルス
類が９個の新しいタイプ（型）（HPV14,15,17,19,20,2
1,22,23および24）と２個のサブタイプ（亜型）即ちタ
イプ14（HPV-14aと14b）及びタイプ17（HPV-17aと17b）
とに分類されることが確認された。 同様に、別のHPV類は、分子ハイブリダイゼーシヨン
の偏性（ストリクト）条件下での配列相同性の有無に基
いて分類された。これらのグループ（ＡからＨ）を表３
に示す。この表には、これらHPV類（単独で或いは組合
せて）のキヤリヤの中で診断された疾患およびその発癌
性が示されている。 HPV5,8,12,14,19,20,21,22および23のDNA類では、こ
れらの間の交差ハイブリダイゼーシヨン（グループ相
同）のレベルは５〜38％であり、HPV5,8および12のDNA
類との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーシヨン
（４〜13％）は示さない。従つて、これらのウイルス類
は前に定義した（９）EVのHPV類のグループの１部を形
成する。 同様に、相互間で約20％の交差ハイブリダイゼーシヨ
ンを示しかつHPV−９のDNAと約６％の交差ハイブリダイ
ゼーシヨンを示すHPV9,15および17のDNA類は等しく、前
記した（９）EVのHPV類のグループに属する。タイプ13
と31のHPV類は一つの同じグループに属するものと考え
られうる。また最後に、他のHPV類のゲノムと殆んど相
同性を示さないタイプ1,2,4,24および32のHPV類は、相
互にかつ従来のグループとは異なる他のグループの第１
のメンバーを形成するものとして考えられる。 本発明はまた特に、上記したHPV-DNA類から由来され
るDNA断片（フラグメント）および特に遺伝子E6-E7,E1,
L2,L1およびそれらの遺伝子間領域にそれぞれ対応するD
NA断片に関する。原点として採つた部位に対するこれら
各種断片の相対位置および長さを表４に示す（第１図〜
第９図）。 HPV−１のゲノム上の遺伝子の位置は、このゲノムの
ヌクレオチド配列から推論された〔オー．ダノス（O.DA
NOS），エム．カチンカ（M.KATINKA）およびエム．ヤニ
ブ（M.YANIV）のパテント〕。ハイブリダイゼーシヨン
の偏性条件（Tm −29℃）あるいは余り偏性でない条件
（Tm −40℃）下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子
顕微鏡分析した後、HPV-3,5,8,9,10a,12,14,15,17およ
び24のゲノムの物理的地図をHPV−１の物理的地図およ
び遺伝子地図と関連させて配列し、HPV-31のそれをHPV6
bの物理的地図および遺伝子地図と関連して配列した
〔イー．シユワルツ（E.SCHWARZ）ら、エンボジエー（E
MBO J.）1983,2,2341-2348〕。保存された制限酵素部位
を並列させた後、HPV10b,28および29の物理的地図をHPV
3aおよび10aの物理的地図に対して配列した。 表４に示した配位の値は、第１図−第９図に示した物
理的地図上で、遺伝子E6,E7,E1,L2およびL1およびHPV-1
aのゲノムに関するかHPV-31の場合にはHPV-6bのゲノム
に関する遺伝子間領域と相同なゲノムセグメントの５′
および３′末端の位置を示す。 遺伝子間領域（調節の要素を含む）および隣接のE6と
E7遺伝子（多分腫瘍中で発現される形質転換の主要遺伝
子に相当する）は、別のグループに属する多くのHPVタ
イプのゲノム間で（非偏性ハイブリダイゼーシヨン条件
下で）形成された、或いは同じグループに属する多くの
HPVタイプのゲノム間で（偏性ハイブリダイゼーシヨン
条件下で）形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微鏡分
析により検出されうる配列相同性を示さない。遺伝子E1
（ウイルスDNAの複製に主に関係する）および遺伝子L1
（ウイルス粒子の主要抗原決定基を有するウイルスカプ
シドの主要タンパク質のコーデイング）は、別のグルー
プに属するHPVタイプのゲノム間で（非偏性ハイブリダ
イゼーシヨン条件下で）形成された、或いは同じグルー
プに属するHPV類のゲノム間で（偏性条件下で）形成さ
れたヘテロ二重鎖の分析により検出されうる配列相同性
を示す。 E1およびL1領域を含む組換えプラスミドから作成され
たプローブを用いて、ケースに応じて偏性或いは非偏性
条件下での分子ハイブリダイゼーシヨン実験により最大
数のHPVタイプを検出することが理論的に可能である。
遺伝子間領域および遺伝子E6およびE7を含む組換えプラ
スミドから作成されたプローブは、或るHPVタイプある
いは関連するHPVタイプを特異的に検出することができ
る。 L2領域（ウイルスカプシドのマイナーな成分に対する
コーデイング）は、各種HPVタイプの中で種々のヌクレ
オチド配列保存度を示す。 ウイルスHPV-IP2およびHPV-IP4を単離する条件および
これらのウイルスからHPV-DNA類を得る条件を以下によ
り詳しく記載する。 新生物および性器ガンに関連した新しいタイプのHPV（H
PV-IP2の分子クローニングおよび特性づけ 新しいタイプのHPVは、HPVタイプ16に特異な放射性プ
ローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼーシヨ
ンにより子宮頸管ガンから抽出されたDNA中に存在して
いることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼーシヨン
条件下でハイブリダイゼーシヨンを実施したときには交
差ハイブリダイゼーシヨンは検出されなかつた。このHP
V-DNAの多数の制限酵素に対する感度の研究から、酵素B
gl IIがウイルスDNAを１度切断していることが知見され
た。腫瘍から抽出されたDNAをエンドヌクレアーゼBgl I
Iにより消化させた後、8kb（パピロマウイルスのゲノム
のサイズ）のDNA分子を含有する画分をシヨ糖勾配での
遠心により精製した。8kb分子を、BamHI部位でバクテリ
オフアージλL47.1のDNAに挿入されたプラスミドPL15.5
（Bgl IIおよびBamHIによる単一の切断部位を含む）か
ら校正されるベクターのBgl II部位に挿入した。組換え
DNAを包膜し宿主細菌〔大腸菌（Escherichia coli）菌
株LA101〕を感染後、組換えフアージに相当する溶菌領
域（プラーク）を感染細菌培養物のレプリカを放射性HP
V-16からのDNAを用いて非偏性条件下でハイブリダイゼ
ーシヨンすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオフアージを単離した。
挿入酵素Bgl IIによりフアージDNAを切断すると、非偏
性条件下でHPV-16プローブとハイブリダイズする8kbフ
ラグメントが得られる。原腫瘍のDNAおよび組換えフア
ージのDNAを酵素Bgl IIおよびPst Iの混合物で切断する
と、総分子量かパピロマウイルスのゲノムのサイズに等
しい同一の５個のフラグメントが得られる。新しいHPV
のDNAを組換えバクテリオフアージのDNAから切除し、電
気溶離（electroelution）により精製し、プラスミドPL
15.5で再クローン化した。ウイルスDNAの制限地図が、2
1個の切断部位を位置決めしうる（第９図）18種の制限
酵素に対するこのDNAの感度に基いて確立された。こう
して確立された地図は今までに同定されたHPV類のゲノ
ムの地図とは異なつている。新しいHPVのDNAと今までに
同定されたHPV類のDNAとの配列相同性を、偏性条件下で
行なわれたレプリカの分子ハイブリダイゼーシヨン実験
で分析した。検知された相同性は常に５％未満であつ
た。HPV-16のゲノムで相同性が最大であつた。子宮頸管
ガンからの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイ
プのHPVであり、これを仮にHPV-IP2と呼称する。 HPV-IP2のDNAとHPV−１のDNAとの間で各種条件下で形
成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析すると、
これら２種のゲノムの物理的地図の配列およびHPV-IP2
のDNAが担持している種々の遺伝子の理論的位置決めが
可能であつた。 このゲノムの地図上のHPV-IP2の遺伝子間領域と主な遺
伝子の推定位置 各末端の座標 ５′末端 ３′末端 E6-E7 62 71.5 E1 71 95 E2 95.5 11.5 L2 11 30.5 L1 31.5 52 遺伝子間領域 52 63.5 精製HPV-IP2のDNAから作成した放射性プローブを使用
すれば、これらウイルスの病原力が測定できる。HPV-IP
2のDNAは、調べた外性器のボウエノイド丘疹（Bewenoid
papula）14例中１例に、侵入性子宮頸ガン51例中２例
に、子宮頸部の上皮内新生物（ｎoplasie）28例中１
例にみとめられた。従つて、HPV-IP2は、HPV-18に比べ
てやや弱くHPV-16に比べてかなり弱い腫瘍形成能を有す
る性器向性タイプ（genito-tropic type）のHPVであ
る。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険性を示
すHPV類のタイプを診断あるいはスクリーニングするた
めの分子プローブを作成することを目的とするHPV-DNA
混合物中に組み入れることが必要である。 皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプのHPV（HPV-I
P4）の分子クローニングおよび特性づけ 新しいタイプのHPVが、光線（紫外線）角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたDNA中に、HPVタイプ
5,8および14に特異な放射性プローブを含む混合物を用
いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシヨンにより
証明された。ハイブリダイゼーシヨンをタイプ1,2,3,7,
10,13,16,18,28,IP−１（前にHPV-31と呼称した）、IP
−２およびIP−３（前にHPV-32と呼称した）に特異なプ
ローブを用いて行つた場合には交差ハイブリダイゼーシ
ヨンは検知されなかつた。 このHPVのDNAの幾つかの制限酵素に対する感度を調べ
たところ、酵素EcoRIがウイルスDNAを１度切断している
ことが知見された。エンドヌクレアーゼEcoRIにより生
検から抽出されたDNAを消化させた後、8kb（パピロマウ
イルスのゲノムのサイズ）のDNA分子を含む画分をシヨ
糖勾配による遠心で精製した。8kb分子をEcoRI部位でバ
クテリオフアージλgt wes.λＢのDNAに挿入した。組換
えDNAを包膜し、宿主細菌〔大腸菌（Escherichia col
i）、菌株LA101〕の感染後、組換えフアージに相当する
溶菌プラークを、非偏性条件下でHPV−８および14から
のDNA類の放射性混合物により感染細菌性培養物のレプ
リカ（複製物）をハイブリダイゼーシヨンすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素EcoRIにより
フアージDNAを切断すると、非偏性条件下でHPV-5,8およ
び14に特異なプローブとハイブリダイズする8kbフラグ
メントが得られる。原病巣のDNAおよび組換えフアージ
のDNAを酵素EcoRIおよびPst Iの混合物で切断すると、
総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに等しい
同一の６個のフラグメントから得られる。新しいHPVのD
NAを組換えバクテリオフアージのDNAから切除し、電気
溶離で精製し、プラスミドpSP65で再クローン化した。
ウイルスDNAの制限地図をこのDNAの15種の制限酵素に対
する感度によって確立した。これにより23個の切断部位
の位置決めが可能となつた（第10図）。こうして確立さ
れた地図は、今までに同定されたHPV類のゲノムの地図
と異なつていた。新しいHPVのDNAと今までに同定された
HPV類のDNAとの配列相同を、偏性条件下で行つたレプリ
カに対する分子ハイブリダイゼーシヨン実験により調べ
た。いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイ
プのHPV類（HPV-5,8,12,14,19,20,21および25）のDNAと
新しいHPVのDNAとの間の相同性は50％未満であつたが、
他のタイプのHPV類との相同性は認められなかつた。こ
うして光線角皮症からの特性づけられた新しいウイルス
は新しいタイプのHPVであり、これを仮にHPV-IP4と呼称
する。 精製HPV-IP4のDNAから作成された放射性プローブを使
用すると、調べたいぼ状表皮異形成患者17例中42％に、
分析した光線角皮症の生検ｙ中ｘでHPV-IP4が検出され
た。皮膚ガンの頻繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表
皮異形成の患者で高率であつたことと、皮膚の有棘細胞
ガンの前駆体と考えられる光線角化症の病巣の割合に対
する関連とから、HPV-IP4は腫瘍形成能を有する皮膚向
性タイプのHPVである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣
の進行の危険を示すHPVタイプを診断もしくはスクリー
ニングするための分子プローブを作成することを目的と
しているHPV-DNA類混合物にはこれを組み入れなければ
ならない。 本発明は更に、特に各種HPV-DNA類の混合物（あるい
はこれらHPV-DNA類もしくはそれらからの配列を含有す
るプローブ）に関し、これら混合物は、多分感染の進行
可能性を予知するために各種形態のパピロマウイルス感
染を診断するべく組合せて使用されうる。本発明の好ま
しい混合物を表５に例示する。 この表には、混合物を使用して特に診断可能な疾患の
性質も示した。第１図〜第９図の制限地図の分類は表５
の“構成”欄に示した分類（グループ分け）と一致して
いることは注目すべきことである。このために、添附図
面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示されてい
るのである。 これら各混合物は、本発明の新しいプローブの少なく
とも１つを包含するものとして定義づけられうる。換言
すれば、本発明の診断用組成物は次のものを含むものと
して定義づけられうる。 （１） 少なくともHPV-2dのDNA、 （２） HPV10b,28および／又は29のDNAの少なくとも１
種、 （３） HPV17および／又は24のDNAの少なくとも１種、 （４） HPV14,15,17,19,20,21,22および／又は23のDNA
の少なくとも１種、 （５） HPV15および／又は17のDNAの少なくとも１種、 （６） HPV-24のDNA、 （７） HPV-14および32のDNA、 （８） HPV-31のDNA、 （９） HPV-32のDNA。 ９種のグループのDNAは全ゆる状況下で互いに異なる
ように選択されると理解されたい。 各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは粘膜病巣か
ら多くのHPV類が単離されうるが、表に示した各タイプ
の疾患の診断に１種あしるいは２種以上のHPV-DNA類を
含有する混合物を使用することが好ましい。なぜなら他
のHPV-DNA類は同タイプの疾患に同様に介在（interven
e）しうると考えられていたからである。感染の性質お
よびその進行可能性の診断は、使用するプローブの数が
増すにつれてより有効となるであろう。加えて、各種プ
ローブ混合物を用いて行うハイブリダイゼーシヨンアツ
セイにより、罹患疾患の識別（鑑別）診断を同等にかな
りの確率で行ないうる。 表５には、本発明者らの研究所で単離されたHPV-DNA
類から形成されたプローブのみを記載した。勿論前記し
た理由で、別の研究所の研究過程で得られた同じタイプ
の感染症を患つている患者において何度も検出されてい
る他のHPV-DNA類を添加することにより各種混合物を有
利に改良しうる。例えば混合物７は、上皮内新生物や皮
膚ガンへの移行の危険性を有するいぼ状表皮異形成中に
みられる他のHPV-DNA類を添加することによつてのみ改
良されうる。表５において、いくつかの混合物が同じ疾
患の診断に特有なものとして表示されていることに注目
されたい。いろいろな混合物により、腫瘍形成（cancer
ization）のリスクの少ない感染症とそのリスクの高い
感染症とを区別しうる。例えば、診断が下される患者か
ら得たウイルスサンプルが混合物７とハイブリダイゼー
シヨンすれば、サンプルが混合物３のプローブとそれ以
上にハイブリダイズした場合に比べて皮膚ガンに進行す
るリスクが高いことが示唆される。 同様に、混合物５により検出されたEVの症例では混合
物６を用いて検出されたこれら症例に比べて腫瘍形成の
リスクは高い。混合物４は、混合物５を用いて検出され
る症例に比べてより高いリスクを有するEV症例を識別で
きるであろう。 さらに以下に異なるHPV-DNA（あるいはこれらのHPV-D
NAを含むプローブあるいはHPV-DNAの配列）のその他の
混合物を記載する。これらは任意に、起り得る感染の進
行の予後経過を測定する目的で、異なる形の乳頭腫ウイ
ルス感染の全般的診断に組み合わせて使用することがで
きる。 本発明に一致する好ましい混合物は前記表５に特定さ
れている。本表はまた表の左側に記載した混合物の使用
によつて格別に診断し得る疾患の性質も示している。本
表に特定したその他のHPV-DNAの制限地図は第１〜９図
に示されている。 HPV-IP2は、性器腫瘍特に子宮頸ガンの進行の危険性
の検知に使用できる格別な代表的プローブと考えられる
こととを指摘しておく。 従つて本発明は格別に、前記表において混合物番号と
して示した１〜10の番号をつけて示した10のグループを
少なくとも含む診断用キツトにも係る。 これまでは特に、クローン化HPV-DNA全体のプローブ
としての使用について考慮してきた。しかしそれらはこ
れらの異なるDNAのクローン化フラグメント、特に遺伝
子E1あるいはL1及び遺伝子E6-E7によつて置き換ること
もできる。 in vitroにおけるHPV-DNA検知の基本的原理は当然、
制限（ストリクト）あるいは弱制限条件で行なわれるハ
イブリダイゼーシヨンを含む。 操作は例えば下記のように行なわれるが、記載する診
断方法は当然、本発明のプローブ及びプローブの混合物
の使用条件を制限するものではないと解されるものであ
る。 クローン化HPVのDNA混合物より得たプローブを使用す
る試験の目的は、バイオプシー中、病変部から採取して
得た細胞中、あるいはカルノイ（Carnoy）混合液（エタ
ノール、クロロホルム、酢酸、6:3:1）により固定され
パラフイン中に含まれるバイオプシー部分中のHPVの存
在を明らかにし、HPVのタイプを同定することである。
試験は、原理は公知の方法による試料からのDNAの予抽
出を必要とし、HPV-DNA混合物から調製した放射活性プ
ローブ（32ｐあるいは35ｓで標識されている）を使用し
た制限あるいは弱制限条件下での分子ハイブリダイゼー
シヨンによるこのDNAの分析を含む。一般には、各試験
はいくつかのプローブ混合物を必要とする。 いくつかのハイブリダイゼーシヨン方法が使用し得
る。例えばスポツトハイブリダイゼーシヨン法が使用で
きる。本方法はDNAの変性の後、DNAアリコートをメンブ
ラン（ニトロセルロースあるいはジーンスクリーンプラ
ス〔Genescreeuplus〕）上に沈積させ、各メンブランを
通常の条件下でプローブ混合物とハイブリダイゼーシヨ
ンさせ、ハイブリダイゼーシヨンさせたメンブランを放
射線写真フイルム上に接触露光させることにより放射活
性ハイブリツドの検知を行うことから成る。またレプリ
カに対するハイブリダイゼーシヨン法を使用することも
できる。本方法は、制限酵素でのDNA処理により得られ
たDNAフラグメントのアガロースゲル電気泳動による分
離、アルカリ変性後の該フラグメントのメンブラン（ニ
トロセルロースあるいはジーンスクリーンプラス）上へ
の移送、及び通常の条件下での異なるプローブ混合物と
のそれらのハイブリダイゼーシヨンから成る。放射活性
ハイブリツドの形成はやはり、メンブランの放射活性写
真フイルム上への接触露光によつて検知する。 放射活性プローブは、ニツクトランスレーシヨン法に
より標識されたHPV-DNA、あるいは例えばSP6型のような
ベクター中にインサートされたウイルスDNAの転写によ
り調製されたRNAにより構成される。放射活性プローブ
を使用すると格別な好感度という利点が得られるが、例
えばビオチン化されており、それ自体標識された抗体あ
るいは酵素的、螢光的あるいはその他の標識を有する抗
体により認識可能な抗体によって認識され得るような非
放射活性プローブの使用を除外するものではない。 プローブの選択は標本の性質に依る。例えばEVを有し
ている可能性がある患者の場合、混合物1,2,3,4,5,6及
び７が使用される。混合物１及び２はEV及び皮膚イボの
異なる診断を可能とする。プローブ３はEVに関連するHP
Vの３つのグループのそれぞれの最もよく検知されるも
のを含んでおり、プローブ７はEVのガンに関連するHPV
のDNAを含んでおり、大多数のEVの場合の診断を可能に
するものであり、特にガンに発展し易いHPVのタイプに
感染した患者の同定の診断を可能にするものである。混
合物4,5及び６の使用により、同一の患者に感染したHPV
の一つ以上のタイプを区別することができる。 従つて本発明はさらに、上記したプローブのいくつか
を含むセツトあるいはキツトにも係り、特に −上記した19のHPV-DNAのタイプあるいはサブタイプの
それぞれの代表的なもの、あるいは −プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロー
ブの種々のグループあるいは混合物を含むものである。
これらのキツトは、患者から得たウイルス調製物と種々
のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼーシ
ヨンによるin vitroでの診断試験を目的とするものであ
る。 言うまでもなく今まで記載したことから、本発明は特
異的に想定されるその実施態様あるいは適用に限定され
るものではなく、それどころか全ての変形例を包含する
ものであり、特定番号を付され図面中に制限地図を示し
たHPV-DNAの特許請求の範囲における記載は、特許請求
の範囲が前記した定義に従つて同じタイプに分類される
このHPV-DNAに共通なHPV-DNAを全て包含することを示す
ものであり、特に同じサブタイプに属するHPV-DNAにお
いてはなおさらそうである。 さらに図面に示したHPV-32から得られたDNAに関し
て、それが以下の酵素、AvaI,BalI,BamHI,ClaI.EcoRI,H
indIII,NdeI,NruI,PvuI,PvuII,SacI,SalI,SmaI,TthIII
あるいはXmaIのいずれによつても開裂されないことが特
に指摘される。 また、下記の組換えDNAは1984年11月30日に下記の番
号でC.N.C.M（ナシヨナルコレクシヨン・オブ・カルチ
ユア・オブ・マイクロオーガニズム・オブ・インステイ
テユート・パスツール、パリ）に寄託されていることも
特記しておく。 pBR322/HPV2d ……No.I-379 pBR322/HPV10bA ……No.I-380 pBR322/HPV10bB ……No.I-381 pBR322/HPV14a ……No.I-382 pBR322/HPV14b ……No.I-383 pBR322/HPV15 ……No.I-384 pBR322/HPV17a ……No.I-385 pHPV5 HindIIIB/HPV17b ……No.I-386 pBR322/HPV19 ……No.I-387 pBR322/HPV20 ……No.I-388 pBR322/HPV21 ……No.I-389 pHPV5 HindIIIB/HPV22 ……No.I-390 pBR322/HPV23 ……No.I-391 pBR322/HPV24a ……No.I-392 pBR322/HPV24b ……No.I-393 pBR322/HPV28 ……No.I-394 pBR322/HPV29 ……No.I-395 pBR322/HPV31 ……No.I-396 pSP64/HPV32 ……No.I-397 pLI55/IP2 ……No.I-450 pSP65/IP4 ……No.I-449 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルス
から得た遺伝子E6及びE7の発現の産物にも特に係る。そ
れ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する腫
瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができる
ワクチンの活性主成分として使用することができる。 本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得られる血清
にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経口的に投与
可能な血清調製物とし得、それは対応する乳頭腫ウイル
スのタイプあるいはサブタイプにより生起された感染を
退行させ得る。 問題の種類の表現のポリペプチド生産物を得ること、
特に適当なプロモータのコントロール下にベクターにE6
及び／又はE7配列を結合すること、乳頭腫ウイルスが問
題のプロモーターを認識し易く、それに関する配列を発
現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺伝子工学の技術
によるものは、同業の通常の能力を有する者に対して強
調する必要はない。 このように本発明は、問題の種類の主成分（発現生成
物あるいは対応抗体）を生理的に許容可能な薬理学的担
体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組成物にも係
る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投与される場
合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成される。 最後に、参照した文献の書誌目録を以下に記した。こ
れは読者が本テキストを十分に理解するために有用であ
ると考えられる範囲において、先行技術水準の記載の要
件を満すものである。この理由から、これらの文献の内
容は記載の一部と考えられるべきものである。 参考文献 （１） エム・ダースト（M.Drst）他、プロク・ナト
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びより特定的にはこの乳頭腫ウイルスから得られるプロ
ーブ、そしてこのプローブを用いるイン・ヴイトロ（生
体外）に於ける乳頭腫ウイルス感染の診断方法に係るも
のである。 “乳頭腫ウイルス”という用語は、皮膚又は粘膜の比
較的良性の（ウイルス性）いぼ（warts）から、上皮内
腫瘍又は種々の形態の皮膚ガンに悪化し易い過形成（hy
perplasias）までの幾つかの形態のウイルス感染症の原
因であると共通して考えられている多数のウイルスを含
むものである。乳頭腫ウイルス感染の中には、特に、こ
れ以降時々“EV"と表現されるいぼ状表皮異形成（epide
rmodysplasias verruciformis）があることにも注意し
なければならない。 乳頭腫ウイルスの型の幾つかはすでに報告されてい
る。本発明の特許出願に於いて、幾つかの新規の型及び
亜型の乳頭腫ウイルスを、その感染患者に於いて多大の
割合で早発皮膚ガンを進行させる傾向のあるウイルス性
のいぼ又は播種性斑紋（disseminated macular）病巣か
ら単離したことが報告されるであろう。 最近の研究により免疫因子の重要性及びヒト乳頭腫ウ
イルス（HPV）の主要な役割が明らかにされており、こ
れらの因子に、乳頭腫ウイルス感染の病原論に於ける様
々な遺伝因子及び化学作用のある放射線に関する文献中
に以前に記載されている役割が追加される。 本発明は新たに単離された多数の乳頭腫ウイルスの相
対的な挙動に関する観察に基づいてなされたものであ
り、その主要なゲノムの性質は以下で定義されよう。 少数のEV例に関する研究によつて、６つの型のHPVの
性質がそれらのゲノムの分子クローニングによつてすで
に明らかにされている（クレムスドルフ・デー（Kremsd
orf,D.）等、1982年、ジヤーナル・ヴイロロジー（J.Vi
rol）.43巻、436-447頁及びクレムスドルフ・デー等、1
983年、ジヤーナル・ヴイロロジー、48巻、340-351頁参
照）。異なるグループのゲノムの間でのハイブリダイゼ
ーションが欠如しているか又は非常に弱いかどうかによ
つて、上記のHPVは３つのグループに分類された。第１
のグループには、或る種のEV患者及び一般住民に於いて
見られる扁平なウイルス性いぼと関連のあるHPV3a及び1
0が含まれる。HPV3aに関連するDNA配列は一つのEV患者
のガンで発見された。第２のグループにはHPV5,8及び12
が含まれ、HPV5及び８のゲノムは複数のEV患者のガン中
で検出された。第３のグループは現在のところたった１
種のウイルス、HPV9である。免疫抑制を呈した腎臓移植
受容者がHPV5に感染していると判明したことは例外であ
るが、第２と第３のグループのウイルスはEV患者の間だ
けに検出され、彼らの殆んどは幾つかのウイルスに感染
していた。現在文献中に記述されている（以下に示す参
考文献１−５、8,9,13,14,16,18-20）14の型のHPVの中
で、４つのものは、珍しい病気であるEVに特に関係のあ
るものであることが判明したことに注目すべきである。 多数の新規の型及び亜型の乳頭腫ウイルスを単離し本
発明を完成せしめた研究によつてイン・ヴイトロに於け
るより高度に洗練された診断技術開発が可能になつた。
より特定的には、本発明は、例えば病巣又はバイオプシ
ー切片から得られる乳頭腫ウイルスの同定に関する完璧
な技術を提供し、これによつて、問題となつている病巣
が悪化していく可能性があるかどうかに関する予測をも
より良く行うようにさせ得るようなより正確な診断法を
もたらす。 一般的に言つて、乳頭腫ウイルスは、互いに非常に異
つてはいるが、それでも7000〜8000のケタの塩基対の大
きさを有していることに注意しなければならない。加え
て、それらのゲノムには前述にもかかわらず或る程度の
相同性があり得る。以下の記載に於いて、乳頭腫ウイル
スの様々な型及び亜型間の相同性の割合（％）を決定す
ることに言及する。これら相同性の割合は、“非ストリ
ンジエント（non-stringent）”又は“非ストリクト（n
on-strict）”と呼ばれる条件下、又は“ストリンジエ
ント（緊縮）”又は“ストリクト（厳格）”と呼ばれる
条件下で行なわれるハイブリダイゼーシヨンアツセイに
よつて決定される。 乳頭腫ウイルスは幾つかの型の乳頭腫ウイルスに区別
され得、それらはストリクト又はストリンジエントの条
件下で測定された相同性の割合によつて区別され得る。
この条件下で、50％より小さい相同性の割合を示すもの
は別の型に属する。この点に関して、ストリクト又はス
トリンジエントな条件下で別の型のウイルス間の相同性
の割合は０まで低下し得るということに注意しなければ
ならない。これと同条件下で、50％より大きい相同性の
割合を示すウイルスは同じ型に属するものと考えられ、
それらはこの同型内の別々の亜型を形成する。 非ストリクト又は非ストリンジエントな条件下のハイ
ブリダイゼーシヨンアツセイは、ハイルマン・シー・エ
ー（Heilman.C.A）等、1980年、ジヤーナル、ヴイロロ
ジー36巻、395-407頁及びクロイサン（CROISSANT）等、
1982年、シー．アール．アカド・サイエンス（C.R.Aca
d.Sc.パリ、294巻、581-586頁（ヘテロ二重鎖分子）に
記載されている以下の条件下で単離された２種のウイル
スから取り出されたDNAを相互に接触させるものであ
る。 ストリクト又はストリンジエントな条件下のハイブリ
ダイゼーシヨンアツセイは、クレムスドルフ・デー等、
1982年、ジヤーナル・ヴイロロジー、43巻、436-447
頁、及び1983年ジヤーナル・ヴイロロジー、48巻、340-
351頁、及びデービス・アール．ダヴリユー（Davis,R.
W）等、1971年、酵素学に於ける方法（Methods Enzymo
l）、21巻、413-428頁（ヘテロ二重鎖分子）に記載され
ている条件下で単離された２種のウイルスから取り出さ
れたDNAを相互に接触させるものである。 概要的には、１つの同じ型に属する乳頭腫ウイルスは
それぞれの配列の長さ全体の80〜100％に亘る実質的に
同一のヌクレオチド配列を有するハイブリダイズ可能な
配列を持つているが、これら相同的な配列は別の型に属
する乳頭腫ウイルスの間では60％又はそれ以下に低下し
得ることを言及しておく。非ストリクト又は非ストリン
ジエントの条件下で相互にハイブリツドを形成する別の
型の乳頭腫ウイルスからの配列が同一あるいは類似であ
る程度は同じ型の乳頭腫ウイルスの場合より必らず明ら
かに低いものである。 本発明者らの研究によつて、種々の型の乳頭腫ウイル
スの間の遺伝的ヘテロ性の程度は以前考えられていたも
のよりも大きいこと、そして同時に、これら種々の型が
或る程度の特異性を示す感染形態又はその変形としばし
ば関連のあることの２つが明らかになつた。 従つて本発明は、単離された種々の新規の乳頭腫ウイ
ルスから単離され得るDNA及びこれらのDNAから全部又は
部分的に構成され得るプローブに関するだけではなく、
或る乳頭腫ウイルスが発見される患者の危険の度合及び
様々のカタゴリーの感染の診断に最も有効に用い得る乳
頭腫ウイルスの型の混合物（カクテル）にも関するもの
である。場合によつては以前にすでに単離されている乳
頭腫ウイルスのゲノムDNAから構成されたプローブおよ
びこれを本発明のものと組み合わせた混合物も含めて本
願明細書に記載されている乳頭腫ウイルス用プローブの
数によつて、非常に正確な診断が実現される。特に、様
々の型の乳頭腫ウイルスにその原因を帰することができ
る感染又はこのような様々の型のウイルスの影響によつ
て進行悪化する可能性がある感染のいろいろなカテゴリ
ーのものがより容易に識別できるようになり、或るカテ
ゴリーの感染に於いては、その進行悪化によつてより深
刻な病気に転換するかどうかという危険の度合をより良
く経過予想することができるようになる。例えば、いぼ
状表皮異形成として発現する感染の場合にはそれが皮膚
ガンに進行するかどうかという危険の度合いをより正確
に評価することができる手段を本発明は提供することを
目的とするものである。 以下の表現を簡潔にする為に一般の方法に従つて、乳
頭腫ウイルスの全ゲノムを“HPV-DNA"という略語で示す
ことにする。 同様に簡略化の為、すでに公知の幾つかの乳頭腫ウイ
ルスを含むHPV-DNAの物理的制限地図が記載されている
添付図を参照する。 これらの物理的地図は様々の制限エンドヌクレアーゼ
による切断部位の位置を与える。この地図の起点は一般
的に単一の切断部位で構成されている。この起点からの
距離はゲノムの全長に対するパーセントで表わされる。
地図の１単位はゲノム長の１％を表わす。 本発明はまず第１に最も特別には、7000〜8000塩基対
の範囲の大きさをもつ全てのDNAから選ばれた各HPV-DNA
に関するものであり、これらDNAは図中に表わされる制
限地図によつて特徴づけられるものであり、それはより
特定的にはHPV-2d、HPV-10b、HPV-14a、HPV-14b、HPV-1
5、HPV-17a、HPV-17b、HPV-19、HPV-20、HPV-21、HPV-2
2、HPV-23、HPV-24、HPV-28、HPV-29、HPV-31及びHPV-3
2、HPV-IP2及びHPV-IP4で示される乳頭腫ウイルスから
得られたHPV-DNAに関するものである。 ここに列挙したものと同じ型に属すると考えられ得る
HPV-DNAに対しても本発明の効果が同じように及ぶこと
は言うまでもないことである。 新たに特徴づけられたウイルスのHPV-DNAに対応する
物理的地図は図中の黒丸で示されている。 本発明は同じように、前記HPV-DNAのフラグメント又
はそれと特にストリクトな条件下でハイブリツドを形成
し得るものに係る。同様に、本発明は上記各HPV-DNAの
全部又は一部を含む組換えDNA、そして特にそれぞれE
1、E6-E7、L1及びL2の遺伝子に対応するフラグメントを
含む組換えDNA又は前記HPV-DNAの遺伝子間（inter-gen
e）領域に対応する配列を含むフラグメント（またはこ
れを含む組換えDNA）にも関係するものである。最後
に、これらそれぞれのHPV-DNAまたは対応するフラグメ
ントから構成され得るプローブ及び該プローブを用いる
イン・ヴイトロ診断方法に係るものである。 ウイルスDNA調製物は６人のヨーロツパのEV患者及び
２人の南アメリカのEV患者の良性病巣を削りとつたもの
から選択的に抽出された（ラツナー・エム・エー（Lutz
ner,M.A.）等、1983年、ランセ（Lancet）ii422-424
頁）。HPV-DNAは平衡塩化セシウム密度勾配遠心法及び
／又はエチジウムブロミド存在下のシユークロース勾配
沈降法により、クレムドルフ等の前記の文献、及びオー
ツ・ジー（Orth,G.）等の1980年の細胞増殖に関するコ
ールド・スプリング・ハーバー会議（Cold Spring Harb
or Conf.Cell Proliferation）、７巻、259-282頁に以
前記載された操作方法に従つて精製された。このDNA調
製物は制限エンドヌクレアーゼで処理され、この消化生
成物をアガロースゲル電気泳動によつて分離した（クレ
ムスドルフ等の前記文献参照）。更に、患者の１人のい
ぼ状突起（rerruca warts）から得られたHPV5,8及び12
（クレムスドルフ等の前記文献参照）並びにHPV−２
（ハイルマン・シー・エー等、1980年、ジヤーナル．ヴ
イロロジー、36巻、395-407頁、及びオーツ・ジー等、1
980年、細胞増殖に関するコールド・スプリング・ハー
バー会議７巻、259-282頁参照）から、以前に特徴づけ
られた型とは異なる11の株が同定され、それによつて該
DNA類の制限酵素切断の主要なモデルが提供された。新
規なHPVの型には番号が付与され、１つの型に属する亜
型には番号の後にそれらの同定年代順に従つて文字が付
与された。（コギン・ジエイ・アール（Coggin.J.R.）
等、ガン研究（Cancer Res.）、39巻、545-546頁）。こ
の新規な11種のHPVのゲノムをエシエリヒア・コリ（Esc
hevichia Coli）K12、C600株内でクローン化した（前記
のクレムスドルフ等の文献、1983年参照）。エンドヌク
レアーゼBam HIによつて生成されたHPV-24DNAの２つの
フラグメントは例外として、DNAは単位長（unitary len
gth）の分子形態で挿入された。これらのDNAはAva l,Ba
m HI及びHind IIIの単一切断部位を用いてプラスミドpB
R322（サトクリフエ・ジエイ・ジー（Sutcliffe,J.
G.）、1978年核酸研究（Nucleic Acids Res.）、５巻、
2721-2728頁）に挿入するか、又は単一のSac I部位を含
む、HPV−５のDNA由来のHind IIIBフラグメント（前記
のクレムスドルフ等、1982年）を組込んだ組換えプラス
ミドに挿入した。より特異的には、HPV17b及び22は、HP
V−５のDNA由来のHind IIIBフラグメントを含む組換え
プラスミドpBR322及びHPVのDNAをただ１ケ所で切断する
酵素（Sac I）で切断した後、単位長のDNA分子形態で挿
入された。HPV-14aのDNAは、Hind IIIによる該ウイルス
DNAの不完全消化後に単位長のDNA分子形態でプラスミド
pBR322に挿入された。このHind IIIはHPV-14aのゲノム
から96.1％及び3.9％の長さを持つ２つのフラグメント
を生成するものである。HPV-24のBam HI AおよびＢフラ
グメント（それぞれゲノム長の83.1％および16.9％に相
当する大きさを持つ）を別々にプラスミドpBR322に挿入
した。 単離したクローン及びそれに対応するHPV源を以下の
表１に挙げる。 組換えプラスミドを同定するために、プラスミドにウ
イルス配列を挿入するために用いられたエンドヌクレア
ーゼを含めた２種の制限酵素の混合物で処理後組換えDN
A類および非クローン化HPV-DNA類の消化生成物の電気泳
動移動度を比較した。単離された断片の数およびサイズ
から、各々の場合にウイルスゲノムが組込まれたことが
示された。非クローンHPV-DNA類或いはプラスミド配列
から切除されたHPV-DNA類をアガロースゲル電気泳動で
分析したところ（データは示さず）、DNAサイズの不均
一性が認められた。HPV14a,19,20および21からのDNA類
は、HPV3a,5,8および12のDNA類と同様のサイズ（約7700
ヌクレオチド対）を有している〔前掲のクレムスドルフ
（KREMSDORF）の論文〕がHPV15,17a,17b,22および23のD
NAはこれより短くHPV9のDNAと同様のサイズ（約7200ヌ
クレオチド対）を有している〔前掲のクレムスドルフ
（KREMSDORF）（1982）およびオルス（ORTH）（1980）
の論文〕。 クローン化ウイルスゲノムの14個の制限酵素に対する
感受性を分析し、物理的地図が確立された（第１図〜第
10図）。或るHPV-DNA類の制限地図を以下に述べる理由
により幾つかの図に繰り返し図示した。前記（９）の方
法によれば、22から33個の間の切断部位が局在化してい
た。HPV14aおよび14bの地図（第4a図および第4b図）とH
PV17aおよび17bの地図（第５図）を除けば、これらの地
図の間には明らかな相似性は認められなかつた。夫々HP
V14aおよび14bのDNA上に位置する21個および31個の部位
の中で、HPV-14aのDNAの２個のBam HI切断部位のひとつ
がHPV-14bのDNAの唯一のBam HI切断部位と並んでいると
きには15個が共通していることが判明した。同様に、唯
一のBam HI切断部位が並んでいるときには、HPV-17aのD
NA上の29個の切断部位のうち21個がHPV-17bのDNA上（全
部で26部位）でも等しく認められた。これらの地図と、
EVに関連するHPV類（HPV3a,5,8,9,10および12）（8,9,1
6,18および20）、皮膚いぼに関連するHPV類（HPV1,2,4
および７）、皮膚粘膜あるいは粘膜の病巣に関連するHP
V類（HPV6b,11a,13および16）（1,33,19）に対して既に
確立された地図との間に、EV保有日本人男性から単離さ
れたHPVの地図（24）と密接に関連するHPV-14aに対する
地図を除いては明らかな相似性はみられなかつた。この
後者の単離HPVとHPV-14aとの相違的は、１個の追加BamH
I部位と１個の追加Hind II部位である。２種のウイルス
において部位AvaI,BamHI,BglI,EcoRI,HindIIおよびHind
IIIの位置は同様であつた。交差ハイブリダイゼーショ
ン実験により、これら２種のウイルスが実際に密接に関
連していることが確認された。 （矢印で示した）幾つかの部位が所在していないこと
に注目されたい。ゲノムの長さの２％未満の差しかない
切断部位は保存されたもの（*）とみなした。分裂を生
起しない酵素は次の通りであつた。HPV14aおよび23のDN
Aに対してはPvuI,SalIおよびSmaI;HPV-14bのDNAに対し
てはPvuI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV15,17aおよび17bのD
NAに対してはBglI,PvuI,SalI,SmaI,HPV-19のDNAに対し
てはBglI,SacI,SalIおよびSmaI;HPV-20のDNAに対しては
EcoRI,PvuI,SacIおよびSmaI;HPV-21のDNAに対してはSac
IおよびSmaI;HPV-22のDNAに対してはBamHI,BglI,PvuI,P
vu IIおよびSalI;HPV-24のDNAに対してはBglI,EcoRI,Pv
uI,SacI,SalIおよびSmaI。 既に特徴付けられたEVのHPV-DNA類（HPV3a,5,8,9,10
および12）、皮膚いぼに関連するHPV-DNA類（HPV1,2,4
および７）および粘膜病巣に関連するHPV-DNA類（HPV6
b,11a,13および16）と新たに特徴付けられたHPV-DNA類
との間、並びに新たに特徴付けられたHPV-DNA類のDNA類
間の配列相同の有無を研究した。ろ紙上への付着、およ
び飽和液層中でのDNA-DNAハイブリダイゼーシヨンとそ
れに続くS1ヌクレアーゼ消化によるハイブリダイゼーシ
ヨン実験は、前記した（8,9）偏性（ストリクトまたは
ストリンジエント）条件下で実施した。特に、HPV類のD
NA類は、前記したように（13）“ニツク翻訳”で標識
し、アルカリ性シヨ糖勾配（５〜20％）での沈降により
分離させた。標識（4000cpm）HPV-DNA類を、前記したよ
うに（8,9）牛胸腺DNA（20μｇ）あるいは非標識HPV-DN
A（0.20μｇ）の存在下でNaCl0.48M/EDTA1mM（pH6.8）
中、68℃でインキユベートした。HPV-DNAプローブの比
活性は5.3×107から２×108cpm/μｇの間で変化した。
ハイブリダイゼーシヨンの程度を、S1ヌクレアーゼに抵
抗する画分を目安にして調べた。数は、プローブの自然
復元（４〜15％）について校正し相同ハイブリダイゼー
シヨン（75〜95％）について100％に正規化した値を表
わす。NDは“測定せず”の略号である。上記条件下にお
けるHPV-DNA類間の交差ハイブリダイゼーシヨンの相対
量を、標識HPV-DNAと非標識HPV-DNAとのハイブリダイゼ
ーシヨンの％として表示する。 HPV1,2,4,6b,7および11aのゲノムと32Ｐ標識の新たに
クローン化されたEVのHPV-DNA類との間、或いはEVの非
標識HPV-DNA類とHPV13,16および18に特異なプローブと
の間の交差ハイブリダイゼーシヨンは全くないか或いは
殆どないことに注目されたい。同様に、飽和再結合（sa
turation reassociation）により、HPV14a,14b,15,17a,
17b,19,20,21,22,23および24のDNA類とHPV1aおよび11a
のDNA類との間に交差ハイブリダイゼーシヨンは殆んど
認められなかつた（表２）。新たにクローン化されたHP
V類のDNA類では、強力な交差ハイブリダイゼーシヨンを
示したHPV17aおよび17b、HPV14aおよび14bを除いて、相
互間かつEVに関連する他のHPV（HPV3a,5,8,9,10および1
2）のゲノムとの間での交差ハイブリダイゼーシヨンは
殆んど或いは全くみられなかつたし、認められたにせよ
50％未満であつた。これらの知見から、新しいウイルス
類が９個の新しいタイプ（型）（HPV14,15,17,19,20,2
1,22,23および24）と２個のサブタイプ（亜型）即ちタ
イプ14（HPV-14aと14b）及びタイプ17（HPV-17aと17b）
とに分類されることが確認された。 同様に、別のHPV類は、分子ハイブリダイゼーシヨン
の偏性（ストリクト）条件下での配列相同性の有無に基
いて分類された。これらのグループ（ＡからＨ）を表３
に示す。この表には、これらHPV類（単独で或いは組合
せて）のキヤリヤの中で診断された疾患およびその発癌
性が示されている。 HPV5,8,12,14,19,20,21,22および23のDNA類では、こ
れらの間の交差ハイブリダイゼーシヨン（グループ相
同）のレベルは５〜38％であり、HPV5,8および12のDNA
類との場合を除いて顕著な交差ハイブリダイゼーシヨン
（４〜13％）は示さない。従つて、これらのウイルス類
は前に定義した（９）EVのHPV類のグループの１部を形
成する。 同様に、相互間で約20％の交差ハイブリダイゼーシヨ
ンを示しかつHPV−９のDNAと約６％の交差ハイブリダイ
ゼーシヨンを示すHPV9,15および17のDNA類は等しく、前
記した（９）EVのHPV類のグループに属する。タイプ13
と31のHPV類は一つの同じグループに属するものと考え
られうる。また最後に、他のHPV類のゲノムと殆んど相
同性を示さないタイプ1,2,4,24および32のHPV類は、相
互にかつ従来のグループとは異なる他のグループの第１
のメンバーを形成するものとして考えられる。 本発明はまた特に、上記したHPV-DNA類から由来され
るDNA断片（フラグメント）および特に遺伝子E6-E7,E1,
L2,L1およびそれらの遺伝子間領域にそれぞれ対応するD
NA断片に関する。原点として採つた部位に対するこれら
各種断片の相対位置および長さを表４に示す（第１図〜
第９図）。 HPV−１のゲノム上の遺伝子の位置は、このゲノムの
ヌクレオチド配列から推論された〔オー．ダノス（O.DA
NOS），エム．カチンカ（M.KATINKA）およびエム．ヤニ
ブ（M.YANIV）のパテント〕。ハイブリダイゼーシヨン
の偏性条件（Tm −29℃）あるいは余り偏性でない条件
（Tm −40℃）下で形成されたヘテロ二重鎖分子を電子
顕微鏡分析した後、HPV-3,5,8,9,10a,12,14,15,17およ
び24のゲノムの物理的地図をHPV−１の物理的地図およ
び遺伝子地図と関連させて配列し、HPV-31のそれをHPV6
bの物理的地図および遺伝子地図と関連して配列した
〔イー．シユワルツ（E.SCHWARZ）ら、エンボジエー（E
MBO J.）1983,2,2341-2348〕。保存された制限酵素部位
を並列させた後、HPV10b,28および29の物理的地図をHPV
3aおよび10aの物理的地図に対して配列した。 表４に示した配位の値は、第１図−第９図に示した物
理的地図上で、遺伝子E6,E7,E1,L2およびL1およびHPV-1
aのゲノムに関するかHPV-31の場合にはHPV-6bのゲノム
に関する遺伝子間領域と相同なゲノムセグメントの５′
および３′末端の位置を示す。 遺伝子間領域（調節の要素を含む）および隣接のE6と
E7遺伝子（多分腫瘍中で発現される形質転換の主要遺伝
子に相当する）は、別のグループに属する多くのHPVタ
イプのゲノム間で（非偏性ハイブリダイゼーシヨン条件
下で）形成された、或いは同じグループに属する多くの
HPVタイプのゲノム間で（偏性ハイブリダイゼーシヨン
条件下で）形成されたヘテロ二重鎖分子の電子顕微鏡分
析により検出されうる配列相同性を示さない。遺伝子E1
（ウイルスDNAの複製に主に関係する）および遺伝子L1
（ウイルス粒子の主要抗原決定基を有するウイルスカプ
シドの主要タンパク質のコーデイング）は、別のグルー
プに属するHPVタイプのゲノム間で（非偏性ハイブリダ
イゼーシヨン条件下で）形成された、或いは同じグルー
プに属するHPV類のゲノム間で（偏性条件下で）形成さ
れたヘテロ二重鎖の分析により検出されうる配列相同性
を示す。 E1およびL1領域を含む組換えプラスミドから作成され
たプローブを用いて、ケースに応じて偏性或いは非偏性
条件下での分子ハイブリダイゼーシヨン実験により最大
数のHPVタイプを検出することが理論的に可能である。
遺伝子間領域および遺伝子E6およびE7を含む組換えプラ
スミドから作成されたプローブは、或るHPVタイプある
いは関連するHPVタイプを特異的に検出することができ
る。 L2領域（ウイルスカプシドのマイナーな成分に対する
コーデイング）は、各種HPVタイプの中で種々のヌクレ
オチド配列保存度を示す。 ウイルスHPV-IP2およびHPV-IP4を単離する条件および
これらのウイルスからHPV-DNA類を得る条件を以下によ
り詳しく記載する。 新生物および性器ガンに関連した新しいタイプのHPV（H
PV-IP2の分子クローニングおよび特性づけ 新しいタイプのHPVは、HPVタイプ16に特異な放射性プ
ローブを用いる非偏性条件下でのハイブリダイゼーシヨ
ンにより子宮頸管ガンから抽出されたDNA中に存在して
いることがみとめられた。偏性ハイブリダイゼーシヨン
条件下でハイブリダイゼーシヨンを実施したときには交
差ハイブリダイゼーシヨンは検出されなかつた。このHP
V-DNAの多数の制限酵素に対する感度の研究から、酵素B
gl IIがウイルスDNAを１度切断していることが知見され
た。腫瘍から抽出されたDNAをエンドヌクレアーゼBgl I
Iにより消化させた後、8kb（パピロマウイルスのゲノム
のサイズ）のDNA分子を含有する画分をシヨ糖勾配での
遠心により精製した。8kb分子を、BamHI部位でバクテリ
オフアージλL47.1のDNAに挿入されたプラスミドPL15.5
（Bgl IIおよびBamHIによる単一の切断部位を含む）か
ら校正されるベクターのBgl II部位に挿入した。組換え
DNAを包膜し宿主細菌〔大腸菌（Escherichia coli）菌
株LA101〕を感染後、組換えフアージに相当する溶菌領
域（プラーク）を感染細菌培養物のレプリカを放射性HP
V-16からのDNAを用いて非偏性条件下でハイブリダイゼ
ーシヨンすることにより検出した。ウイルス配列の全体
を含む幾つかの組換えバクテリオフアージを単離した。
挿入酵素Bgl IIによりフアージDNAを切断すると、非偏
性条件下でHPV-16プローブとハイブリダイズする8kbフ
ラグメントが得られる。原腫瘍のDNAおよび組換えフア
ージのDNAを酵素Bgl IIおよびPst Iの混合物で切断する
と、総分子量かパピロマウイルスのゲノムのサイズに等
しい同一の５個のフラグメントが得られる。新しいHPV
のDNAを組換えバクテリオフアージのDNAから切除し、電
気溶離（electroelution）により精製し、プラスミドPL
15.5で再クローン化した。ウイルスDNAの制限地図が、2
1個の切断部位を位置決めしうる（第９図）18種の制限
酵素に対するこのDNAの感度に基いて確立された。こう
して確立された地図は今までに同定されたHPV類のゲノ
ムの地図とは異なつている。新しいHPVのDNAと今までに
同定されたHPV類のDNAとの配列相同性を、偏性条件下で
行なわれたレプリカの分子ハイブリダイゼーシヨン実験
で分析した。検知された相同性は常に５％未満であつ
た。HPV-16のゲノムで相同性が最大であつた。子宮頸管
ガンからの特性づけられた新しいウイルスは新しいタイ
プのHPVであり、これを仮にHPV-IP2と呼称する。 HPV-IP2のDNAとHPV−１のDNAとの間で各種条件下で形
成されたヘテロ二重鎖分子を電子顕微鏡で分析すると、
これら２種のゲノムの物理的地図の配列およびHPV-IP2
のDNAが担持している種々の遺伝子の理論的位置決めが
可能であつた。 このゲノムの地図上のHPV-IP2の遺伝子間領域と主な遺
伝子の推定位置 各末端の座標 ５′末端 ３′末端 E6-E7 62 71.5 E1 71 95 E2 95.5 11.5 L2 11 30.5 L1 31.5 52 遺伝子間領域 52 63.5 精製HPV-IP2のDNAから作成した放射性プローブを使用
すれば、これらウイルスの病原力が測定できる。HPV-IP
2のDNAは、調べた外性器のボウエノイド丘疹（Bewenoid
papula）14例中１例に、侵入性子宮頸ガン51例中２例
に、子宮頸部の上皮内新生物（ｎoplasie）28例中１
例にみとめられた。従つて、HPV-IP2は、HPV-18に比べ
てやや弱くHPV-16に比べてかなり弱い腫瘍形成能を有す
る性器向性タイプ（genito-tropic type）のHPVであ
る。性器新生物、特に子宮頸管ガンの進行の危険性を示
すHPV類のタイプを診断あるいはスクリーニングするた
めの分子プローブを作成することを目的とするHPV-DNA
混合物中に組み入れることが必要である。 皮膚の前ガン病巣に関連する新しいタイプのHPV（HPV-I
P4）の分子クローニングおよび特性づけ 新しいタイプのHPVが、光線（紫外線）角化症の生
検、前ガン皮膚病巣から抽出されたDNA中に、HPVタイプ
5,8および14に特異な放射性プローブを含む混合物を用
いる偏性条件下での分子ハイブリダイゼーシヨンにより
証明された。ハイブリダイゼーシヨンをタイプ1,2,3,7,
10,13,16,18,28,IP−１（前にHPV-31と呼称した）、IP
−２およびIP−３（前にHPV-32と呼称した）に特異なプ
ローブを用いて行つた場合には交差ハイブリダイゼーシ
ヨンは検知されなかつた。 このHPVのDNAの幾つかの制限酵素に対する感度を調べ
たところ、酵素EcoRIがウイルスDNAを１度切断している
ことが知見された。エンドヌクレアーゼEcoRIにより生
検から抽出されたDNAを消化させた後、8kb（パピロマウ
イルスのゲノムのサイズ）のDNA分子を含む画分をシヨ
糖勾配による遠心で精製した。8kb分子をEcoRI部位でバ
クテリオフアージλgt wes.λＢのDNAに挿入した。組換
えDNAを包膜し、宿主細菌〔大腸菌（Escherichia col
i）、菌株LA101〕の感染後、組換えフアージに相当する
溶菌プラークを、非偏性条件下でHPV−８および14から
のDNA類の放射性混合物により感染細菌性培養物のレプ
リカ（複製物）をハイブリダイゼーシヨンすることによ
り検出した。ウイルス配列の全体を含む幾つかの組換え
バクテリオフアージを単離した。挿入酵素EcoRIにより
フアージDNAを切断すると、非偏性条件下でHPV-5,8およ
び14に特異なプローブとハイブリダイズする8kbフラグ
メントが得られる。原病巣のDNAおよび組換えフアージ
のDNAを酵素EcoRIおよびPst Iの混合物で切断すると、
総分子量がパピロマウイルスのゲノムのサイズに等しい
同一の６個のフラグメントから得られる。新しいHPVのD
NAを組換えバクテリオフアージのDNAから切除し、電気
溶離で精製し、プラスミドpSP65で再クローン化した。
ウイルスDNAの制限地図をこのDNAの15種の制限酵素に対
する感度によって確立した。これにより23個の切断部位
の位置決めが可能となつた（第10図）。こうして確立さ
れた地図は、今までに同定されたHPV類のゲノムの地図
と異なつていた。新しいHPVのDNAと今までに同定された
HPV類のDNAとの配列相同を、偏性条件下で行つたレプリ
カに対する分子ハイブリダイゼーシヨン実験により調べ
た。いぼ状表皮異形成病巣中で既に同定された或るタイ
プのHPV類（HPV-5,8,12,14,19,20,21および25）のDNAと
新しいHPVのDNAとの間の相同性は50％未満であつたが、
他のタイプのHPV類との相同性は認められなかつた。こ
うして光線角皮症からの特性づけられた新しいウイルス
は新しいタイプのHPVであり、これを仮にHPV-IP4と呼称
する。 精製HPV-IP4のDNAから作成された放射性プローブを使
用すると、調べたいぼ状表皮異形成患者17例中42％に、
分析した光線角皮症の生検ｙ中ｘでHPV-IP4が検出され
た。皮膚ガンの頻繁な進行を特徴とする病気のいぼ状表
皮異形成の患者で高率であつたことと、皮膚の有棘細胞
ガンの前駆体と考えられる光線角化症の病巣の割合に対
する関連とから、HPV-IP4は腫瘍形成能を有する皮膚向
性タイプのHPVである。皮膚のガンあるいは前ガン病巣
の進行の危険を示すHPVタイプを診断もしくはスクリー
ニングするための分子プローブを作成することを目的と
しているHPV-DNA類混合物にはこれを組み入れなければ
ならない。 本発明は更に、特に各種HPV-DNA類の混合物（あるい
はこれらHPV-DNA類もしくはそれらからの配列を含有す
るプローブ）に関し、これら混合物は、多分感染の進行
可能性を予知するために各種形態のパピロマウイルス感
染を診断するべく組合せて使用されうる。本発明の好ま
しい混合物を表５に例示する。 この表には、混合物を使用して特に診断可能な疾患の
性質も示した。第１図〜第９図の制限地図の分類は表５
の“構成”欄に示した分類（グループ分け）と一致して
いることは注目すべきことである。このために、添附図
面の幾つかの図面に幾つかのプローブが数回示されてい
るのである。 これら各混合物は、本発明の新しいプローブの少なく
とも１つを包含するものとして定義づけられうる。換言
すれば、本発明の診断用組成物は次のものを含むものと
して定義づけられうる。 （１） 少なくともHPV-2dのDNA、 （２） HPV10b,28および／又は29のDNAの少なくとも１
種、 （３） HPV17および／又は24のDNAの少なくとも１種、 （４） HPV14,15,17,19,20,21,22および／又は23のDNA
の少なくとも１種、 （５） HPV15および／又は17のDNAの少なくとも１種、 （６） HPV-24のDNA、 （７） HPV-14および32のDNA、 （８） HPV-31のDNA、 （９） HPV-32のDNA。 ９種のグループのDNAは全ゆる状況下で互いに異なる
ように選択されると理解されたい。 各種形態のいぼあるいは他の皮膚もしくは粘膜病巣か
ら多くのHPV類が単離されうるが、表に示した各タイプ
の疾患の診断に１種あしるいは２種以上のHPV-DNA類を
含有する混合物を使用することが好ましい。なぜなら他
のHPV-DNA類は同タイプの疾患に同様に介在（interven
e）しうると考えられていたからである。感染の性質お
よびその進行可能性の診断は、使用するプローブの数が
増すにつれてより有効となるであろう。加えて、各種プ
ローブ混合物を用いて行うハイブリダイゼーシヨンアツ
セイにより、罹患疾患の識別（鑑別）診断を同等にかな
りの確率で行ないうる。 表５には、本発明者らの研究所で単離されたHPV-DNA
類から形成されたプローブのみを記載した。勿論前記し
た理由で、別の研究所の研究過程で得られた同じタイプ
の感染症を患つている患者において何度も検出されてい
る他のHPV-DNA類を添加することにより各種混合物を有
利に改良しうる。例えば混合物７は、上皮内新生物や皮
膚ガンへの移行の危険性を有するいぼ状表皮異形成中に
みられる他のHPV-DNA類を添加することによつてのみ改
良されうる。表５において、いくつかの混合物が同じ疾
患の診断に特有なものとして表示されていることに注目
されたい。いろいろな混合物により、腫瘍形成（cancer
ization）のリスクの少ない感染症とそのリスクの高い
感染症とを区別しうる。例えば、診断が下される患者か
ら得たウイルスサンプルが混合物７とハイブリダイゼー
シヨンすれば、サンプルが混合物３のプローブとそれ以
上にハイブリダイズした場合に比べて皮膚ガンに進行す
るリスクが高いことが示唆される。 同様に、混合物５により検出されたEVの症例では混合
物６を用いて検出されたこれら症例に比べて腫瘍形成の
リスクは高い。混合物４は、混合物５を用いて検出され
る症例に比べてより高いリスクを有するEV症例を識別で
きるであろう。 さらに以下に異なるHPV-DNA（あるいはこれらのHPV-D
NAを含むプローブあるいはHPV-DNAの配列）のその他の
混合物を記載する。これらは任意に、起り得る感染の進
行の予後経過を測定する目的で、異なる形の乳頭腫ウイ
ルス感染の全般的診断に組み合わせて使用することがで
きる。 本発明に一致する好ましい混合物は前記表５に特定さ
れている。本表はまた表の左側に記載した混合物の使用
によつて格別に診断し得る疾患の性質も示している。本
表に特定したその他のHPV-DNAの制限地図は第１〜９図
に示されている。 HPV-IP2は、性器腫瘍特に子宮頸ガンの進行の危険性
の検知に使用できる格別な代表的プローブと考えられる
こととを指摘しておく。 従つて本発明は格別に、前記表において混合物番号と
して示した１〜10の番号をつけて示した10のグループを
少なくとも含む診断用キツトにも係る。 これまでは特に、クローン化HPV-DNA全体のプローブ
としての使用について考慮してきた。しかしそれらはこ
れらの異なるDNAのクローン化フラグメント、特に遺伝
子E1あるいはL1及び遺伝子E6-E7によつて置き換ること
もできる。 in vitroにおけるHPV-DNA検知の基本的原理は当然、
制限（ストリクト）あるいは弱制限条件で行なわれるハ
イブリダイゼーシヨンを含む。 操作は例えば下記のように行なわれるが、記載する診
断方法は当然、本発明のプローブ及びプローブの混合物
の使用条件を制限するものではないと解されるものであ
る。 クローン化HPVのDNA混合物より得たプローブを使用す
る試験の目的は、バイオプシー中、病変部から採取して
得た細胞中、あるいはカルノイ（Carnoy）混合液（エタ
ノール、クロロホルム、酢酸、6:3:1）により固定され
パラフイン中に含まれるバイオプシー部分中のHPVの存
在を明らかにし、HPVのタイプを同定することである。
試験は、原理は公知の方法による試料からのDNAの予抽
出を必要とし、HPV-DNA混合物から調製した放射活性プ
ローブ（32ｐあるいは35ｓで標識されている）を使用し
た制限あるいは弱制限条件下での分子ハイブリダイゼー
シヨンによるこのDNAの分析を含む。一般には、各試験
はいくつかのプローブ混合物を必要とする。 いくつかのハイブリダイゼーシヨン方法が使用し得
る。例えばスポツトハイブリダイゼーシヨン法が使用で
きる。本方法はDNAの変性の後、DNAアリコートをメンブ
ラン（ニトロセルロースあるいはジーンスクリーンプラ
ス〔Genescreeuplus〕）上に沈積させ、各メンブランを
通常の条件下でプローブ混合物とハイブリダイゼーシヨ
ンさせ、ハイブリダイゼーシヨンさせたメンブランを放
射線写真フイルム上に接触露光させることにより放射活
性ハイブリツドの検知を行うことから成る。またレプリ
カに対するハイブリダイゼーシヨン法を使用することも
できる。本方法は、制限酵素でのDNA処理により得られ
たDNAフラグメントのアガロースゲル電気泳動による分
離、アルカリ変性後の該フラグメントのメンブラン（ニ
トロセルロースあるいはジーンスクリーンプラス）上へ
の移送、及び通常の条件下での異なるプローブ混合物と
のそれらのハイブリダイゼーシヨンから成る。放射活性
ハイブリツドの形成はやはり、メンブランの放射活性写
真フイルム上への接触露光によつて検知する。 放射活性プローブは、ニツクトランスレーシヨン法に
より標識されたHPV-DNA、あるいは例えばSP6型のような
ベクター中にインサートされたウイルスDNAの転写によ
り調製されたRNAにより構成される。放射活性プローブ
を使用すると格別な好感度という利点が得られるが、例
えばビオチン化されており、それ自体標識された抗体あ
るいは酵素的、螢光的あるいはその他の標識を有する抗
体により認識可能な抗体によって認識され得るような非
放射活性プローブの使用を除外するものではない。 プローブの選択は標本の性質に依る。例えばEVを有し
ている可能性がある患者の場合、混合物1,2,3,4,5,6及
び７が使用される。混合物１及び２はEV及び皮膚イボの
異なる診断を可能とする。プローブ３はEVに関連するHP
Vの３つのグループのそれぞれの最もよく検知されるも
のを含んでおり、プローブ７はEVのガンに関連するHPV
のDNAを含んでおり、大多数のEVの場合の診断を可能に
するものであり、特にガンに発展し易いHPVのタイプに
感染した患者の同定の診断を可能にするものである。混
合物4,5及び６の使用により、同一の患者に感染したHPV
の一つ以上のタイプを区別することができる。 従つて本発明はさらに、上記したプローブのいくつか
を含むセツトあるいはキツトにも係り、特に −上記した19のHPV-DNAのタイプあるいはサブタイプの
それぞれの代表的なもの、あるいは −プローブの混合物、好ましくは前記に規定したプロー
ブの種々のグループあるいは混合物を含むものである。
これらのキツトは、患者から得たウイルス調製物と種々
のグループあるいは混合物との間のハイブリダイゼーシ
ヨンによるin vitroでの診断試験を目的とするものであ
る。 言うまでもなく今まで記載したことから、本発明は特
異的に想定されるその実施態様あるいは適用に限定され
るものではなく、それどころか全ての変形例を包含する
ものであり、特定番号を付され図面中に制限地図を示し
たHPV-DNAの特許請求の範囲における記載は、特許請求
の範囲が前記した定義に従つて同じタイプに分類される
このHPV-DNAに共通なHPV-DNAを全て包含することを示す
ものであり、特に同じサブタイプに属するHPV-DNAにお
いてはなおさらそうである。 さらに図面に示したHPV-32から得られたDNAに関し
て、それが以下の酵素、AvaI,BalI,BamHI,ClaI.EcoRI,H
indIII,NdeI,NruI,PvuI,PvuII,SacI,SalI,SmaI,TthIII
あるいはXmaIのいずれによつても開裂されないことが特
に指摘される。 また、下記の組換えDNAは1984年11月30日に下記の番
号でC.N.C.M（ナシヨナルコレクシヨン・オブ・カルチ
ユア・オブ・マイクロオーガニズム・オブ・インステイ
テユート・パスツール、パリ）に寄託されていることも
特記しておく。 pBR322/HPV2d ……No.I-379 pBR322/HPV10bA ……No.I-380 pBR322/HPV10bB ……No.I-381 pBR322/HPV14a ……No.I-382 pBR322/HPV14b ……No.I-383 pBR322/HPV15 ……No.I-384 pBR322/HPV17a ……No.I-385 pHPV5 HindIIIB/HPV17b ……No.I-386 pBR322/HPV19 ……No.I-387 pBR322/HPV20 ……No.I-388 pBR322/HPV21 ……No.I-389 pHPV5 HindIIIB/HPV22 ……No.I-390 pBR322/HPV23 ……No.I-391 pBR322/HPV24a ……No.I-392 pBR322/HPV24b ……No.I-393 pBR322/HPV28 ……No.I-394 pBR322/HPV29 ……No.I-395 pBR322/HPV31 ……No.I-396 pSP64/HPV32 ……No.I-397 pLI55/IP2 ……No.I-450 pSP65/IP4 ……No.I-449 本発明はさらに、前に言及した異なる乳頭腫ウイルス
から得た遺伝子E6及びE7の発現の産物にも特に係る。そ
れ等は有効量で投与すれば乳頭腫ウイルスに関連する腫
瘍の進行に対する抵抗性を宿主に生起することができる
ワクチンの活性主成分として使用することができる。 本発明はまた、哺乳動物の免疫化により得られる血清
にも係る。該血清は患者に有効量で特に非経口的に投与
可能な血清調製物とし得、それは対応する乳頭腫ウイル
スのタイプあるいはサブタイプにより生起された感染を
退行させ得る。 問題の種類の表現のポリペプチド生産物を得ること、
特に適当なプロモータのコントロール下にベクターにE6
及び／又はE7配列を結合すること、乳頭腫ウイルスが問
題のプロモーターを認識し易く、それに関する配列を発
現し易い細胞宿主の形質転換から成る遺伝子工学の技術
によるものは、同業の通常の能力を有する者に対して強
調する必要はない。 このように本発明は、問題の種類の主成分（発現生成
物あるいは対応抗体）を生理的に許容可能な薬理学的担
体と共に含む、薬理学的使用を目的とする組成物にも係
る。特に問題の種類の組成物が非経口的に投与される場
合は、担体は注射可能な飽和溶液により構成される。 最後に、参照した文献の書誌目録を以下に記した。こ
れは読者が本テキストを十分に理解するために有用であ
ると考えられる範囲において、先行技術水準の記載の要
件を満すものである。この理由から、これらの文献の内
容は記載の一部と考えられるべきものである。 参考文献 （１） エム・ダースト（M.Drst）他、プロク・ナト
ル・アカド・スシ（Proc.Nafl.Acad.Sci）,U.S.A,80:38
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J.R.,Jr）他、1979、カンサー・レス（Cancer Res.），
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エイ・ヴイロル（J.Virol.）44:393-400。 （４） エム・グリーン（Green,M.）他、1982、プロク
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80、ヴイロル（Virol.）36:395:407。 （６） エス・ジヤブロンスカ（Jablonska,S.）他、19
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ロル、48:340-351。 （10） エム・エー・ルツツナー（Lutzner,M.A.）他、
1978、ブル・カンサー（Bull.Cancer）、65:169-182。 （11） エム・エー・ルツツナー他、1983、ランセツト
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ーシヨン（Cold Spring Harbor Conf.Cell Proliferati
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ダーマトール（J.Invest.Dermatol.）76:97-102。 （15） ジー・オルス他、1979、カンサー・レス39:107
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他、1982、プロク・ナトル・アカド・スシ、U.S.A.,79:
1634-1638。 （17） アール・エス・オストロウ他、1983、アン・ア
カド・ダーマトール（Ann.Acad.Dermatol）、8:398-40
4、 （18） エツチ・フイスター（Pfister,H.）他、1983、
カンサー・レス、43:1436-1441。 （19） エツチ・フイスター他、1983、ジエイ・ヴイロ
ル、47:363-366。 （20） エツチ・フイスター他、1981、イント・ジエイ
・カンサー（Int.J.Cancer）、27:645-650。 （21） エル・エー・リユーダ（Rueda,L.A.）他、197
6,メド・カツト・アイ・エル・エー（Med.Cut.I.L.
A.）、2:113-136。 （22） エム・リユイター（M.Ruiter）他、ジエイ・イ
ンベスト・ダーマトール、47:247-252。 （23） ジエイ・ジー・シユトクリフエ（Sutcliffe,J.
G.）、1978、ニユークレイツク・アシズ・レス（Nuclei
c Acids Res）、5:2721-2728。 （24） テイー・ツモリ（Tsumori,T.）他、1983、ジエ
イ・ジエン・ヴイロル（J.Gen.Virol.）、64:967-969。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第９図は本発明のHPV-DNA及びその他のHPV-DNA
の制限地図を示す図である。
の制限地図を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(72)発明者 ミツシエル・フアーヴル
フランス国、75015・パリ、リユ・ギル
ー、７
(72)発明者 デイナ・クレムスドルフ
フランス国、75013・パリ、リユ・エス
キロル、35
(72)発明者 オデール・クロワツサン
フランス国、75013・パリ、リユ・オー
ギユスト・ランソン、19
(72)発明者 ジエラール・ペオ―アルノーデ
フランス国、93100・モントロイユ、ア
ヴニユ・ポール・シニヤツク、25
(72)発明者 シルヴイ・ボードウノン
フランス国、77450・エズブリ、モント
リ、アヴニユ・フオツシユ、108
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．HPV-14a,HPV-14b,HPV-15,HPV-17a,HPV-17b,HPV-19,
HPV-20,HPV-21,HPV-22,HPV-23,HPV-24,HPV-28,HPV-29,H
PV-31,HPV-32,HPV-IP2,HPV-IP4からなる群から選択され
る乳頭腫ウイルスから得られる約7,000ないし約8,000塩
基対からなり、明細書記載の図１〜図９の制限地図の一
つを有するヒト乳頭腫ウイルス（HPV）の精製されたDN
A、又は該乳頭腫ウイルスの１つに特異的であり、スト
リンジェント条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブ
リダイゼーションをすることができる、前記の精製され
たDNAのフラグメント。 ２．DNAフラグメントが、E1,E6-E7,L1,L2からなる遺伝
子の群から選択される、HPVのDNAの一つの遺伝子をコー
ドすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
精製されたDNA。 ３．DNAフラグメントが、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）の
遺伝子をコードするHPV-DNAの間に位置するHPVのDNAの
セグメントに対応することを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の精製されたDNA。 ４．DNAフラグメントが、HPV-14a,HPV-14b,HPV-15,HPV-
17a,HPV-17b,HPV-19,HPV-20,HPV-21,HPV-22,HPV-23,HPV
-24,HPV-28,HPV-29,HPV-31,HPV-32,HPV-IP2,HPV-IP4の
各DNAからなる群から選択されるDNAまたはこれらのDNA
のいずれかに相補的なDNAを、明細書記載の図１〜図９
で示される各HPV-DNAに対応する制限地図に示される制
限酵素からなる群から選択される少なくとも一つの制限
酵素で処理することによって得られる制限フラグメント
に対応することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
載のDNA。 ５．HPV-14a,HPV-14b,HPV-15,HPV-17a,HPV-17b,HPV-19,
HPV-20,HPV-21,HPV-22,HPV-23,HPV-24,HPV-28,HPV-29,H
PV-31,HPV-32,HPV-IP2,HPV-IP4からなる群から選択され
る乳頭腫ウイルスから得られる約7,000ないし約8,000塩
基対からなり、明細書記載の図１〜図９の制限地図の一
つを有するヒト乳頭腫ウイルス（HPV）の精製されたDN
A、又は該乳頭腫ウイルスの１つに特異的であり、スト
リンジェント条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブ
リダイゼーションをすることができる、前記の精製され
たDNAのフラグメントを、含む組換えヒト乳頭腫ウイル
ス（HPV）DNA。 ６．DNAフラグメントが、（ｉ）E1,E6-E7,L1,L2からな
る遺伝子の群から選択される、HPV DNAの一つの遺伝子
をコードするDNAフラグメント、（ii）HPVの遺伝子をコ
ードするHPV-DNAの間に位置するHPV DNAのセグメントに
対応するDNAフラグメント、あるいは（iii）HPV-14a,HP
V-14b,HPV-15,HPV-17a,HPV-17b,HPV-19,HPV-20,HPV-21,
HPV-22,HPV-23,HPV-24,HPV-28,HPV-29,HPV-31,HPV-32,H
PV-IP2,HPV-IP4の各DNAからなる群から選択されるDNAま
たはこれらのDNAのいずれかに相補的なDNAを、明細書記
載の図１〜図９で示される各HPV DNAに対応する制限地
図に示される制限酵素からなる群から選択される少なく
とも一つの制限酵素で処理することによって得られる制
限フラグメントに対応するDNAフラグメントであること
を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の組換えヒト
乳頭腫ウイルス（HPV）DNA。 ７．HPV-14a,HPV-14b,HPV-15,HPV-17a,HPV-17b,HPV-19,
HPV-20,HPV-21,HPV-22,HPV-23,HPV-24,HPV-28,HPV-29,H
PV-31,HPV-32,HPV-IP2,HPV-IP4からなる群から選択され
る乳頭腫ウイルスから得られる約7,000ないし約8,000塩
基対からなり、明細書記載の図１〜図９の制限地図の一
つを有するヒト乳頭腫ウイルス（HPV）DNA;または該乳
頭腫ウイルスの１つに特異的であり、ストリンジエント
条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーシ
ョンをすることができる該DNAのフラグメント；または
該DNAもしくはそのフラグメントを含む組換えHPV DNA、
からなることを特徴とするヒト乳頭腫ウイルス（HPV）D
NAの検出のためのプローブ。 ８．ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）DNAプローブの生産方法
であって、該プローブはヒト乳頭腫ウイルス（HPV）のD
NAを含み、 （ａ） 該DNAが約7,000ないし約8,000塩基対からなるD
NAであるかまたはそのフラグメントであり、 （ｂ） 該DNAまたはそのフラグメントは、該乳頭腫ウ
イルスに特異的であり、ストリンジェント条件下で該乳
頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼーションをするこ
とができ、 （ｃ） 該DNAまたはそのフラグメントは、HPV-14a,HPV
-14b,HPV-15,HPV-17a,HPV-17b,HPV-19,HPV-20,HPV-21,H
PV-22,HPV-23,HPV-24,HPV-28,HPV-29,HPV-31,HPV-32,HP
V-IP2,HPV-IP4からなる乳頭腫ウイルスの群から得られ
ることを特徴とし、該生産方法は （Ａ） 前記のHPV-DNAまたはそのフラグメントと適切
なベクターを含む組換えベクターの生産であって、適切
な宿主に組換えベクターの次の段階のクローニングがで
きる部位にHPV-DNAまたはそのフラグメントを挿入する
ことを特徴とする組換えベクターの生産、 （Ｂ） 該組換えベクターを適切な宿主にクローニング
すること、 （Ｃ） その結果できるクローン化された組換えHPV-DN
Aを回収すること、 を含むことを特徴とするヒト乳頭腫ウイルス（HPV）DNA
プローブの生産方法。 ９．宿主が原核微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第８項に記載の方法。 １０．組換えベクターが、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）
の完全なDNA配列を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第８項に記載の方法。 １１．組換えベクターが、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）
の完全なDNA配列のフラグメントを含み、該フラグメン
トが該乳頭腫ウイルスに特異的であり、ストリンジェン
ト条件下で該乳頭腫ウイルスと安定なハイブリダイゼー
ションができることを特徴とする特許請求の範囲第８項
に記載の方法。 １２．クローン化された組換えHPV-DNAを、酵素、放射
性化合物、蛍光化合物からなる群から選択されるマーカ
ーで標識することを更に含むことを特徴とする特許請求
の範囲第８項に記載の方法。 １３．一つ以上のヒト乳頭腫ウイルス（HPV）のプロー
ブを含有する診断キットであって、該キットは （ａ） HPV-2dのHPV-DNA、 （ｂ） HPV-10b,HPV-28,HPV-29のHPV-DNAの少なくとも
一つ、 （ｃ） HPV-17、HPV-24のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｄ） HPV-14、HPV-15、HPV-17、HPV-19、HPV-20、HP
V-21、HPV-22、HPV-23のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｅ） HPV-15、HPV-17のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｆ） HPV-24のHPV-DNA、 （ｇ） HPV-14、HPV-32のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｈ） HPV-31のHPV-DNA、 （ｉ） HPV-32のHPV-DNA の各プローブ群を含み、各群のヒト乳頭腫ウイルス（HP
V）のDNAは、９個の各群が唯一のHPV-DNAのグループメ
ンバーを含む場合９群の各々のHPV-DNAは互いに異なる
ように選択されることを特徴とする診断キット。 １４．一つ以上のヒト乳頭腫ウイルス（HPV）のプロー
ブを含有する診断キットであって、該キットは （ａ） HPV-2dのHPV-DNA、 （ｂ） HPV-10b,HPV-28,HPV-29のHPV-DNAの少なくとも
一つ、 （ｃ） HPV-17、HPV-24のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｄ） HPV-14、HPV-15、HPV-17、HPV-19、HPV-20、HP
V-21、HPV-22、HPV-23のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｅ） HPV-15、HPV-17のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｆ） HPV-24のHPV-DNA、 （ｇ） HPV-14、HPV-32のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｈ） HPV-31のHPV-DNA、 （ｉ） HPV-32のHPV-DNA、 （ｊ） HPV-16、HPV-18、HPV-IP2のHPV-DNAの少なくと
も一つ、 の各プローブ群を含み、各群のHPV-DNAは、10群の各々
が唯一のHPV-DNAのグループメンバーを含む場合10群の
各々のHPV-DNAは互いに異なるように選択されることを
特徴とする診断キット。 １５．疾病に冒された組織がヒト乳頭腫ウイルスのDNA
を含む疾病の検出方法であって、 （ａ） HPV-2dのHPV-DNA、 （ｂ） HPV-10b,HPV-28,HPV-29のHPV-DNAの少なくとも
一つ、 （ｃ） HPV-17、HPV-24のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｄ） HPV-14、HPV-15、HPV-17、HPV-19、HPV-20、HP
V-21、HPV-22、HPV-23のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｅ） HPV-15、HPV-17のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｆ） HPV-24のHPV-DNA、 （ｇ） HPV-14、HPV-32のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｈ） HPV-31のHPV-DNA、 （ｉ） HPV-32のHPV-DNA、 のプローブ群［但し、各群のヒト乳頭腫ウイルス（HP
V）のDNAは、９個の各群が唯一のHPV-DNAのグループメ
ンバーを含む場合９群の各々のHPV-DNAは互いに異なる
ように選択される］を含むキット、又は （ａ） HPV-2dのHPV-DNA、 （ｂ） HPV-10b,HPV-28,HPV-29のHPV-DNAの少なくとも
一つ、 （ｃ） HPV-17、HPV-24のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｄ） HPV-14、HPV-15、HPV-17、HPV-19、HPV-20、HP
V-21、HPV-22、HPV-23のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｅ） HPV-15、HPV-17のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｆ） HPV-24のHPV-DNA、 （ｇ） HPV-14、HPV-32のHPV-DNAの少なくとも一つ、 （ｈ） HPV-31のHPV-DNA、 （ｉ） HPV-32のHPV-DNA、 （ｊ） HPV-16、HPV-18、HPV-IP2のHPV-DNAの少なくと
も一つ、のプローブ群［但し、各群のHPV-DNAは、10群
の各々が唯一のHPV-DNAのグループメンバーを含む場合1
0群の各々のHPV-DNAは互いに異なるように選択される］
を含むキット、 のプローブを該組織と接触させ、プローブと該乳頭腫ウ
イルスのDNAとのハイブリダイゼーションを検出するこ
とを含むことを特徴とする検出方法。 １６．組織が細胞を含み、方法が細胞とプローブを接触
させることを含むことを特徴とする特許請求の範囲第15
項に記載の方法。 １７．細胞が細胞構成要素を含み、方法が少なくとも一
つの細胞構成要素とプローブを接触させることを含むこ
とを特徴とする特許請求の範囲第16項に記載の方法。 １８．疾病が、（ａ）いぼ、（ｂ）上皮内新生物、
（ｃ）表皮ガン、（ｄ）口腔上皮過形成、（ｅ）性器新
生物、（ｆ）子宮頸ガン、（ｇ）コンジローム、（ｈ）
乳頭腫、を含む群から選択される少なくとも一つの疾病
であることを特徴とする特許請求の範囲第15項に記載の
方法。 １９．疾病が良性いぼおよび良性過形成からなる群から
選択されることを特徴とする特許請求の範囲第15項に記
載の方法。 ２０．疾病がいぼまたは上皮内新生物を示す過形成の形
態からなることを特徴とする特許請求の範囲第18項に記
載の方法。 ２１．疾病がいぼまたは皮膚もしくは粘膜のガンを示す
過形成からなることを特徴とする特許請求の範囲第15項
に記載の方法。 ２２．いぼが、表皮、中間表皮、粘膜、扁平いぼからな
る一つ以上の群のメンバーとして分類されることを特徴
とする特許請求の範囲第20項に記載の方法。 ２３．いぼが、尋常性いぼまたは足底いぼであることを
特徴とする特許請求の範囲第21項に記載の方法。 ２４．診断される疾病が、いぼ状表皮異形成であること
を特徴とする特許請求の範囲第15項に記載の方法。 ２５．生物サンプルにおいて乳頭腫ウイルスの検出と同
定のための方法であって、HPV-14a,HPV-14b,HPV-15,HPV
-17a,HPV-17b,HPV-19,HPV-20,HPV-21,HPV-22,HPV-23,HP
V-24,HPV-28,HPV-29,HPV-31,HPV-32,HPV-IP2,HPV-IP4か
らなる群から選択される乳頭腫ウイルスから得られる約
7,000ないし約8,000塩基対からなり、明細書記載の図１
〜図９の制限地図の一つを有するヒト乳頭腫ウイルス
（HPV）の精製されたDNA、又は該乳頭腫ウイルスの１つ
に特異的であり、ストリンジェント条件下で該乳頭腫ウ
イルスと安定なハイブリダイゼーションをすることがで
きる、前記の精製されたDNAのフラグメント、の一つ以
上を用いてハイブリダイゼーションアッセイを行い、そ
の結果できるハイブリダイズされたHPV-DNAまたはその
フラグメントを検出することを含む方法。 ２６．ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）DNAを保有するプラス
ミドであって、pBR322/HPV14a（C.N.C.M.受託番号Ｉ−3
82）,pBR322/HPV14b（C.N.C.M.受託番号Ｉ−383）,pBR3
22/HPV15（C.N.C.M.受託番号Ｉ−384）,pBR322/HPV17a
（C.N.C.M.受託番号Ｉ−385）,pHPV5Hind III B/HPV17b
（C.N.C.M.受託番号Ｉ−386）,pBR322/HPV19（C.N.C.M.
受託番号Ｉ−387）,pBR322/HPV20（C.N.C.M.受託番号Ｉ
−388）,pBR322/HPV21（C.N.C.M.受託番号Ｉ−389）,pH
PV5Hind III B/HPV22（C.N.C.M.受託番号Ｉ−390）,pBR
322/HPV23（C.N.C.M.受託番号Ｉ−391）,pBR322/HPV24a
（C.N.C.M.受託番号Ｉ−392）,pBR322/HPV24b（C.N.C.
M.受託番号Ｉ−393）,pBR322/HPV28（C.N.C.M.受託番号
Ｉ−394）,pBR322/HPV29（C.N.C.M.受託番号Ｉ−395）,
pBR322/HPV31（C.N.C.M.受託番号Ｉ−396）,pSP64/HPV3
2（C.N.C.M.受託番号Ｉ−397）,pLI55/IP2（C.N.C.M.受
託番号Ｉ−450）およびpSP65/IP4（C.N.C.M.受託番号Ｉ
−449）からなる群から選択されるプラスミド。
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