Grundlagen
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Es gibt immer mehr epidemiologische Daten, die
zeigen, daß der humane Papillomavirus (HPV), als ein Faktor
oder Cofaktor, eng mit zytologischen Gebärmutterhals-
Anomalien, wie beispielsweise zervikale intraepitheliale
Neoplasie (CIN) und Carcinom in Situ (CIS), verbunden
ist. Syrjanen, K.J., In: Papillomaviruses and Human
Disease, K. Syrjanen, L. Gissman und L.G. Koss (Eds.),
Springer-Verlag, Seite 467-503, (1987). Im allgemeinen
werden diese Dysplasien im Übergangsbereich des
Gebärmutterhalses vorgefunden und anhand des
Verbreitungsausmaßes der neoplastischen Zellen von der
Basalschicht bis zur Epitheloberfläche von leicht bis
schwer (I bis 111) klassifiziert. Ein vollständiges
Verdrängen des Epithels durch neoplastische Zellen wird
als Carcinom in Situ bezeichnet (CIS).
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Es sind mindestens 60 HPV-Typen, die von
verschiedenen Bereichen des menschlichen Körpers isoliert wurden,
beschrieben worden, und bei mehr als 20 dieser Typen
konnte gezeigt werden, daß sie mit der genitalen Mucosa
zusammenhängen. E.M. de Villiers, J. Virol., 63(11):
4898-4903 (1989). Obwohl vorliegende Fakten den engen
Zusammenhang zwischen HPV und Gebärmutterhals-Neoplasie
sehr stützen und zeigen, daß viele Personen eindeutig
vorübergehend und/oder latent HPV-DNS besitzen (z. B.
Infektionen), ist es ebenso offensichtlich, daß Frauen,
in deren Gebärmutterhals-Zellen HPV vorkommt, nicht immer
eine schwere Dysplasie entwickeln. Syrjanen et al. in
Cancer Cells, Vol. 5, Cold Spring Harbor, Seite 281-288
(1987); deBrux et al., Bull. Cancer (Paris), 70:410-422
(1983); Mitchell et al., The Lancet, 1:573-575 (1986).
Folglich fehlt für die einfache Detektion von HPV-DNS in
Gebärmutterhalsabstrichen ein prognostizierendes
Unterscheidungsmerkmal für die Identifizierung von Frauen
mit einem Risiko einer schweren Erkrankung. Es besteht
ein Bedarf an einem anwendbaren Verfahren zur Bewertung
der HPV-Aktivität, um eine Progression einer schweren CIN
oder CIS zu prognostizieren.
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In WO-A-89/09940, EP-A-0301968, EP-A-0256321, WO-A-
87/05630, EP-A-0192001 und J. Exp. Med. 167 (1988) 225-
230 werden Sonden veröffentlicht, die bestimmte
Nucleinsäure-Sequenzen bestimmter Gene bestimmter HPV-Typen
enthalten, aber es wird nicht die Bestimmung der HPV
E6/E7 Transkriptionsaktivität und deren Verwendung für
die Prognose der Krankheitsprogression veröffentlicht.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren
zum Bestimmen der Prognose HPV infizierter Personen, das
die Schritte umfaßt: (1) Messen des
HPV-Aktivitätsspiegels mittels Detektion von Transkripten der gesamten
oder eines Teils der E6 und/oder E7 HPV-Gene (und/oder
deren gespleißten Transkripte) in einer Probe, z. B.
einem Gebärmutterhals-Abstrich, und (2) Vergleich der
HPV-Aktivitätsmessungen mit einer zuvor festgelegten
Relation zwischen Aktivität und Progressionsrisiko einer
schweren Gebärmutterhalsdysplasie oder eines -karzinoms.
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Das Verfahren dieser Erfindung basiert auf dem
Zusammenhang zwischen der Transkriptionsaktivität von HPV
und dem Risiko eine schwere Gebärmutterhals-Dysplasie
oder ein Carcinom zu entwickeln. Zum Beispiel können
Transkriptionsmuster und/oder die Transkriptionsmengen
von mindestens einem Teil der E6 und/oder E7 Gene und der
gespleißten downstream Sequenzen ausgewählter hoch
onkogener HPV-Typen verwendet werden, um die Progression
einer HPV-Infektion zu einer schweren CIN oder CIS zu
prognostizieren. Umgekehrt können die
Transkriptionsmuster und/oder Transkriptionsmengen des E6 oder E7 Gens
von gering onkogenen HPV-Typen als ein Hinweis auf ein
geringes Risiko einer ernsten CIN oder CIS verwendet
werden. Folglich liefert eine Detektion der E6 und/oder
E7 Transkripte ausgewählter HPV-Typen in Gebärmutterhals-
Proben eine wertvollere diagnostische Hilfe als nur die
Detektion von HPV-DNS.
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Bestimmte HPV-Transkriptionsmuster können einen
zuverlässigeren Indikator für ein Risiko einer Progression
einer schweren Dysplasie liefern als eine Detektion der
gesamten HPV-DNS. In Frauen sind geringe Mengen an HPV-
DNS tatsachlich weitverbreitet und folglich ist das
Vohandensein an HPV-DNS kein empfindliches Maß für ein
neoplastisches Risiko. Die Detektion und quantitative
Bestimmung der Gentranskripte, die mit hoch onkogenen
oder gering onkogenen HPV-Typen verbunden sind, und/oder
gespleißter mRNS, die diese Sequenzen enthalten, liefern
eine empfindliche, genaue und zuverlässige Prognose einer
schweren Dysplasie oder von Krebs.
Kurze Beschreibuna der Abbildunaen
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Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung des
Verfahrens der vorliegenden Erfindung.
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Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung des
Hybridisierungskomplexes der mRNS-Ziele, der
Oligonucleotid-Einfangsonden mit d(A) -Schwanz und der radioaktiv
markierten Detektorsonden zur Detektion der E6/E7
enthaltenden Transkripte von HPV.
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Abbildung 3 zeigt die Nucleotidsequenzen von 32
typ-spezifischen Oligonucleotid-Sonden mit einer Länge im
Bereich von 32 bis 42 Nucleotiden.
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Abbildung 4 zeigt Nucleotidsequenzen und
Zielstellen der Sonden zur typspezifischen Detektion
gespleißter E6 Transkripte (E6*) von HPV 16, HPV 18, HPV
31 und HPV 38. Es werden voraussichtliche Basenpaarungen
zwischen den gespleißten E6* Transkripten und
spezifischen Oligonucleotid-Sonden gezeigt, die sich über die
upstream und downstream Exons erstrecken.
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Abbildung 5 ist eine schematische Darstellung der
Einfang- und Detekorsonden an E6/E7 Transkripten von HPV
16, die die spezifische Anordnung der Sonden an den mRNS
von HPV 16 zeigt. Der Spleißstellen-Donor (Do) und -
Akzeptor (ek) sind in dem E6 ORF eingezeichnet.
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Abbildung 6 zeigt Nucleotidsequenzen möglicher
Basenpaarungen zwischen den HPV 16 Einfangsonden 16-3,
16-4 und 16-5 und den in den E7 ORF von HPV 6, HPV 11,
HPV 18, HPV 31, HPV 33 und HPV 35 angeordneten Sequenzen.
Unterstrichene Basen bilden voraussichtlich
Basenpaarungen mit der Oligonucleotid-Sonde.
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Abbildung 7 ist eine schematische Darstellung der
Klonierungsschritte von HPV 16-DNS in Lambda 47.1 und zur
Konstruktion rekombinanter Moleküle zur Synthese von
Detektorsonden und positiven Zieltranskripten. Die
Strategie zur Konstruktion eines Konstrukts zur
Herstellung der HPV 16-Ribosonde wird im linken Teil der
Abbildung gezeigt, und die Konstruktion eines rekombinanten
Moleküls zur in vitro Synthese eines mRNS Moleküls, das
die E6 und E7 ORF (z. B. positive Zieltranskripte)
enthält, wird im rechten Teil der Abbildung gezeigt.
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Abbildung 8 zeigt das Verhältnis zwischen der
Konzentration des positiven Ziels und des Signals in
einem HPV 16 Assay. Abbildung 8A zeigt typische
Ergebnisse eines HPV 16 Assays bei Verwendung einer ³²P
markierten Detektorsonde mit einer spezif ischen Aktivität
von 5 x 10&sup8; cpm/ug. In Abbildung 8B zeigt ein Diagramm
die lineare Beziehung zwischen der Konzentration des
positiven Ziels und der Signalstärke.
Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Wissen des
engen Zusammenhangs zwischen HPV und Gebärmutterhals-
Carcinoma; obwohl viele Personen in Gebärmutterhalszellen
HPV-DNS haben, entwickeln sie tatsächlich keine schwere
Dysplasie; und es fehlt eine Bestimmung, die eine
einfache Detektion von HPV-DNS in Gebärmutterhalsabstrichen
mit einem prognostizierenden Unterscheidungsmerkmal zur
Identifizierung von Personen mit einem Progressionsrisiko
einer schweren Krankheit ermöglicht.
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Im Gegensatz zu herkömmlichen Detektionsverfahren
von HPV-DNS erlaubt das vorliegende Verfahren eine
empfindliche und quantitative Detektion der spezifischen HPV
mRNS oder DNS. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die
aktive Transkription des HPV-Genoms einzuschätzen und den
Zusammenhang zwischen HPV-Transkriptionsmustern und
Enstehungsrisiko einer Zytopathologie und/oder einer
Progression einer schweren Erkrankung (z. B. hochgradige
CIN oder CIS) bei HPV infizierten Personen zu bestimmen.
Es folgt ein kurzer Überblick wie die Rolle von HPV bei
Gebärmutterhals-Anomalien eingeschätzt wird, den Bedarf
und folglich die Zweckdienlichkeit des vorliegenden
Verfahrens, eine genaue Beschreibung des Verfahrens, eine
Beschreibung der HPV spezifischen Nucleinsäuresonden, die
in dem Verfahren zweckdienlich sind, sowie Diskussion
einer Verfahrensanwendung im klinischen Bereich für
Diagnose und/oder Therapie.
Die Rolle von HPV bei Gebärmutterhals-Anomalien
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Die Rolle von HPV bei Gebärmutterhals-Anomalien,
die von einer leichten Dysplasie bis zum gesamten Ersatz
des Gebärmutterhals-Epithels reichen, sind umfassend
untersucht worden.
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Eine positive Korrelation zwischen dem Grad der
Dysplasie (z. B. CIN I, II oder III und CIS) und dem
Vorkommen von HPV ist erkannt worden. Kurman et al., Am.
J. Obstet. Gynecol., 159:293-296 (1988); Koutsky et al.,
Eidem. Rev., 10:122-163 (1988); deVilliers et al., The
Lancet, 2:703-706 (1987) . Es ist festgestellt worden, daß
hochgradige cytologische Anomalien häufiger mit den HPV
Typen 16, 18, 31 und 33 verbunden sind, als mit den
gering onkogenen HPV Typen. Die HPV Typen 6, 11, 16 und 18
werden in 80-90% der Dysplasien gefunden. Koutsky et al.,
ibid.
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Dennoch ist gezeigt worden, daß HPV DNS ebenfalls
in Gebärmutterhalsabstrichen vorkommt, die keine
Anomalien zeigten. Zum Beispiel zeigten Untersuchungen
von Gebärmutterhalsabstrichen auf die HPV Typen 6, 11,
16, und 18 mittels der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
von 150 Frauen ohne cytologische Anomalien, daß HPV DNS
in 70-84% der Frauen vorhanden ist. Young et al., British
Med. J., 298 (6665) : 11-14 (1989); Tidy et al., The Lancet,
(25. Feb. 1989) Seite 434.
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Epidemiologische Langzeitstudien, in denen die
klinische Progression von mit HPV verbundenen Infektionen
(Koilozytose und/oder HPV-DNS) zu CIN I oder höher
untersucht wird, lassen vermuten, daß 8-15% der HPV
Infektionen im Laufe der Zeit dysplastisch werden. Syrjanen, K.
et al., Papillomaviruses: Cancer Cells, Vol. 5, Cold
Spring Harbor, Seite 281-288, (1987); de Brux et al.,
Bull Cancer (Paris), 70:410-422, (1983); Mitchell et al.,
The Lancet, 1:573-575, (1986); Syrjanen, K. et al., J.
Cellular Biochem.. Suppl., 13C, Seite 198, (1989). Dies
läßt umgekehrt vermuten, daß 85-92% der HPV Infektionen
sich im Laufe der Zeit nicht weiterentwickeln. Eine
Progression wurde häufiger (etwa 35%) bei Personen
beobachtet, die mit HPV 16 infiziert waren, als bei Personen,
die mit den Typen 6, 11, 18, 31 und 33 (7,5%-20%)
infiziert waren. Es ist unklar, zumindest höchst
unwahrscheinlich, ob das Vorhandensein von HPV-DNS allein ein
prognostischer Indikator für eine Progression einer
schweren Dysplasie ist, weil zumindest teilweise sehr
wahrscheinlich Cofaktoren eine Rolle bei der
Krankheitsentwicklung spielen.
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Verschiedene Tatsachen lassen vermuten, daß eine
Expression der E6 und oder E7 Gene von HPV für eine
Onkogenese notwendig ist. Die Expression dieser Gene
verursacht bei Ratten- oder Mäuse-Epithelzellen oder
-Fibrioblasten eine Transformation. Crook et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 85:8820-8824 (1988); Watanabe und
Yoshiike, Intl. J. Cancer, 41:896-900 (1988)), und
erzeugt nach der Insertion in einen retroviralen Vektor in
Nacktmäusen Tumore. Yutsudo et al., Virol., 166:594-597
(1988). Phelps und Mitarbeiter zeigten, daß das E7 Gen
mit einem aktivierten ras Onkogen kooperieren kann, um
primäre Nierenzellen von jungen Ratten zu transformieren,
und einen heterologen Virus-Promotor transaktivieren
kann. Sie zeigten ebenfalls, daß Teile des vorhergesagten
E7 Proteins mehreren konservierten Domänen des Adenovirus
E1a Proteins ähneln, einem transaktivierenden Protein,
das ebenfalls mit einem aktivierten ras Onkogen
kooperieren kann, um Ratten-Epithelzellen zu transformieren.
Außerdem scheint eine kontinuierliche Expression des E7
Gens zur Aufrechterhaltung des transformierten Phänotyps
in Zellen, die durch HPV 16 und EJ-ras transformiert
worden sind, notwendig zu sein. Banks et al., J. Cellular
Biochem., Suppl. 13C:202 (1988); Cook et al., EMBO
Journal, 8(2):513-519 (1989). Das E7 Protein ist im
Zytoplasma lokalisiert, und es konnte mittels Western
Blot Analyse gezeigt werden, daß es das häufigste HPV
Protein in Zellinien ist, die HPV 16 DNS (CaSki und SiHa)
oder HPV 18 (HeLa, C4-1 und 5W756) enthalten. Seedorf et
al., EMBO J., 6(1):139-144 (1987).
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In allen HPV enthaltenden Gebärmutterhals-Carcinoma
und davon abstammenden Zellinien sind die E6 und E7 Gene
intakt. Wilzynski et al., Virol., 166:624-627 (1988).
Außerdem werden die Transkripte der E6 und/oder E7 Gene,
aber nicht notwendigerweise anderer frühen Gene, durchweg
in Carcinoma und Carcinomzellinien gefunden. Baker et
al., J. Virol., 6(4):962-971 (1987); Pater und Pater,
Cancer Res., 48:324-328 (1988); Schneider-Gadicke und
Schwarz, EMBO Journal, 5(9):2285-2292 (1986); Schwarz et
al., In: Papillomaviruses and Human Disease, Springer
Verlag, Seite 443-466 (1987); Shirasawa et al., J. Gen.
Virol., 68:583-591 (1987); Smotkin und Wettstein, Proc.
Natl. Acad. Sci., 83:4680-4684 (1986). Dieser Beweis läßt
vermuten, daß die Expression der E6 und/oder E7 Gene von
HPV 16 und 18 für die zelluläre Transformation wichtig
ist und möglicherweise für die Entwicklung von CIS
wichtig sein könnten.
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Obwohl die zur Zeit verfügbaren Daten einen engen
Zusammenhang zwischen HPV-DNS in Gebärmutterhalsproben
und Gebärmutterhals-Anomalien, die von einer leichten
Dysplasie bis CIS reichen, vermuten lassen, ist es
offensichtlich, daß viele und möglicherweise die meisten
Frauen, in deren Gebärmutterhals-Proben HPV-DNS vorkommt,
keine Dysplasie entwickeln.
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Transkriptionsmuster, einschließlich gespleißter
Transkripte, sind auf verschiedene HPV Typen mit
hochonkogenem Potential untersucht worden. Eine Untersuchung
dreier, HPV 18 enthaltender Zellinien hat drei
Transkriptionsmuster (durch cDNS-Klon-Analyse
festgestellt) gezeigt. Schwarz et al., Nature, 314:111-114
(1985). Muster 1 enthält vollständige Transkripte der E6
und E7 Gene, und die 11 5'-terminalen Nucleotide (nt) der
E1
RNS (E1 beginnt bei nt 914; Spleiß-Donorstelle bei nt
925) spleißten an die zellulären 3'-Sequenzen. Muster 2
und 3 enthält verkürzte Transkripte von E6 (das Intron
mit 182 nt fehlt zwischen der Spleiß-Donorstelle bei nt
226-234 und der Spleiß-Akzeptorstelle bei nt 401-412),
als E6* bezeichnet, die mit den E7 Sequenzen und entweder
an zelluläre downstream Sequenzen (Muster 2) oder an HPV
downstream Sequenzen (Muster 3) geknüpft werden. Die E6*
Spleißstellen kommen ebenfalls in den DNS-Sequenzen von
HPV 16, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 43, HPV 52 und HPV
56, aber nicht in der DNS der gering onkogenen HPV Typen
(z. B. 6 und 11) vor. Goldsborough et al., Virol.,
171:306-311 (1989). Folglich können die E6* Transkripte
in Beziehung mit dem onkogenen Potential der HPV Typen
stehen. E6/E6* und E7 Transkripte werden in HPV 16
enthaltenden Zellen gefunden, aber diese enthalten ebenfalls
die gespleißten E2-E4 downstream Exons, gefolgt von
zellulären Sequenzen. Zwei HPV 16 E6* Transkripte sind in
SiHa-Zellen und zwei Krebsarten identifiziert worden.
Smotkin et al., J. Virol. 63:1441-1447 (1989). Beide
nutzen eine übliche Spleiß-Donorstelle bei nt 224-232 und
eine Spleiß-Akzeptorstelle entweder bei nt 399-412 (E6*I)
oder bei nt 516-543 (E6*II). Weil die E7 Translation in
einer größeren Entfernung vom E7 Translationsstartsignal
(AUG) endet als das Ende der Translation von E6*II, kann
das erstgenannte Transkript eine effizientere Translation
des E7 ORF ermöglichen.
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Derartige oben beschriebene Translationsmuster
bilden die Grundlage in der vorliegenden Erfindung für die
Konstruktion von Sonden und deren Verwendung im
Detektionsverfahren und/oder der mengenmäßigen Bestimmung der
spezifischen Transkripte von HPV in Proben. Zusätzlich
liefern sie die Grundlage für die Risikoabschätzung der
Progression von Gebärmutterhals-Anomalien mit Hilfe des
vorliegenden Verfahrens. Sie liefern die Grundlage für
die Anwendung des vorliegenden Verfahrens, um die oben
beschriebenen Transkriptionsmuster und/oder weitere
Transkriptionsmuster zur Risikoabschätzung einer
Progression einer Gebärmutterhals-Anomalie zu einer schweren
Erkrankung zu detektieren oder zu quantifizieren. Ebenso
wird erklärt und erläutert, daß mit dem vorliegenden
Verfahren RNS, DNS oder das RNS/DNS Verhältnis
spezifischer HPV-Typen in Gebärmutterhals - Proben detektiert
und/oder quantitativ bestimmt wird als ein Maß für ein
neoplastisches Risiko. Die Detektion und/oder
quantitative Bestimmung von E6, E7 und gespleißten Transkripten
von HPV-Typen, die mit einer Onkogenese oder Progression
einer Gebärmutterhals-Dysplasie verbunden sind, als ein
Mittel zur Bestimmung eines neoplastischen Risikos,
liefert ein neues Verfahren, das nicht nur für die
Diagnose (z. B. zum Einschätzen des gegebenen oder nicht
gegebenen Progressionsrisikos), sondern auch in der
Therapie (z. B. als ein Verfahren durch das eine
Behandlungsmethode entwickelt und/oder kontrolliert werden
kann) eingesetzt werden kann.
Detektion spezifischer HPV Transkripte mit Hilfe des
vorliegenden Verfahrens
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Man geht davon aus, daß die Expression der E6
und/oder E7 Gene auch die downstream Gene einschließen
kann, und deren Expression im Verhältnis zu anderen Genen
eine Voraussetzung für eine HPV verbundene Onkogenese
ist, In einer Anwendung des vorliegenden Verfahrens
werden die HPV Transkriptionsspiegel, besonders Transkripte
von mindestens einem Teil der E6 und/oder E7 Gene
ausgewählter HPV Typen, gemessen. Das heißt, es wird die in
einer Probe vorhandene Menge an E6 und/oder E7 mRNS
detektiert und quantitativ bestimmt. Bicistronische
und/oder gespleißte Transkripte dieser Gene können
ebenfalls gemessen werden.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
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Ein Verfahren gemäß der Erfindung ist in Abbildung
1 schematisch dargestellt und es wird unten beschrieben,
wie es bei einem beliebig ausgewählten HPV-Typ angewendet
werden kann, Es wird des weiteren für einen spezifischen
HPV-TYp (HPV 16) beschrieben. Die mit dem vorliegenden
Verfahren auf E6/E7 und andere gespleißte mRNS
Transkripte zu untersuchenden Proben sind im allgemeinen, zum
Beispiel eine Gebärmutterhals-Ausschabung, -Abstrich,
Schleimproben, Biopsie- oder Tumorprobe. Die Probe muß
vor der Untersuchung mit dem vorliegenden Verfahren nicht
abgetrennt, gefiltert oder vorkultiviert werden. Die
Probe kann gemischt oder in einem geeigneten Medium verdünnt
sein und, wenn nötig, mit einem die Zellen und die
molekulare Strukturen in den Zellen zerstörenden Agens
vorbehandelt werden. Dieser Schritt setzt die zu
detektierenden Nucleinsäuren (die Zielnucleinsäuren) frei. Die
Zellen können zum Beispiel durch Verwendung chaotroper
Agentien, die die molekulare Struktur der Zelle
zerstören, zerstört werden. Das heißt, das Agens denaturiert
die Sekundär-, Tertiär- und/oder Quartärstrukturen von
Biopolymeren, einschließlich Proteinen, Nucleinsäuren und
Polysacchariden, die im allgemeinen in biologischen
Proben gefunden werden. Beispiele für chaotrope Agentien
schließen chaotrope Salze (z. B. Guanidiniumthiocyanat),
hydrolytische Enzyme (z. B. Proteasen, RNAsen) und
Verbindungen, die hydrophobe Wechselwirkungen stören (z. B.
Natriumdodecylsulfat, Phenole, Dimethylformamid,
Dimethylsulfoxid, Tetramethylharnstoff oder
Guanidiniumhydrochlorid). Physikalische oder mechanische Mittel zur
Zerstörung molekularer Strukturen, z. B. Ultraschall,
können ebenfalls zur Freisetzung von Nucleinsäuren
verwendet werden. Es können auch in den Zellen vorhandene
und aus den Zellen freigesetzte Nucleinsäuren behandelt
werden, falls notwendig, um sie für die Hybridisierung
mit komplementären Nucleinsäuresequenzen (z. B. durch
Erhitzen, um Doppelstränge einzelsträngig zu machen)
verfügbar zu machen.
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Zwei Typen von HPV typspezifischen Sonden werden
dann mit der Probe entweder gleichzeitig oder
nacheinander in-Kontakt gebracht. Eine Sonde ist die HPV
typspezifische
Einfangsonde mit Schwanz, die frei oder an einen
festen Träger gebunden sein kann. Die Einfangsonden
können mit den Zieltranskripten in der Probenmischung
hybridisieren und bilden dabei einen
Einfangsonde/Zieltranskript Komplex. Entweder mit der Einfangsonde zusammen
oder nach Bildung des Einfangsonde/Zieltranskript
Komplexes werden ebenfalls markierte Detektorsonden mit der
Probe unter geeigneten Bedingungen (z. B. Zeit,
Temperatur, pH, Salzkonzentration, Chaotropkonzentration) zur
Hybridisierung der komplementären Nucleotidsequenzen in-
Kontakt gebracht, um einen
Einfangsonde/Zieltranskript/Detektorsonde Komplex zu bilden. Der
Einfangsonde/Zieltranskript/Detektorsonde Komplex, der im folgenden
einfach als der Hybridisierungskomplex bezeichnet wird,
wird aus der Probenmischung rückgewonnen. Die
Rückgewinnung wird mittels Zugabe eines festen Substrats, das
mit einem zum Schwanz der Einfangsonde komplementären
Polynucleotid beschichtet ist, zu der die
Hybridisierungskomplexe enthaltenden Mischung durchgeführt. Der im
Hybridisierungskomplex vorhandene Schwanz der
Einfangsonde hybridisiert mit dem komplementären Substrat und
ermöglicht den gesamten Hybridisierungskomplex von der
Probe abzutrennen. Bei vorhybridisierten Einfangsonden
wird das Substrat, das sie haftende Sonde enthält, aus
der Probenmischung entfernt. Intakte
Hybridisierungskomplexe könnten von dem festen Substrat durch eine die
Baasenpaarungen (Die Einfangsonde bildet weniger
Basenpaarungen mit dem festen Substrat als die Sonde mit dem
Zieltranskript) irreversibel zerstörende Behandlung
freigesetzt werden, und die Komplexe können an anderen festen
Substraten wiedereingefangen werden. Das Ergebnis dieser
zyklischen Hybridisierung der Komplexe ist Minderung des
Rauschens, das normalerweise nicht-spezifische Bindungen
an das feste Substrat sind.
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Die Menge an Detektorsonden und folglich des
vorhandenen spezifischen HPV Transkripts auf dem
abgetrennten Substrat kann dann durch Verwendung bekannter
Techniken, wie Szintillationszählung, densitometrisches
Einlesen von Autoradiogrammen, Fluoreszenz - Spektroskopie und
Beta-Emissions-Zählern (z. B. Betagen) bestimmt werden.
Das angewandte Verfahren hängt von der Markierung der
Detektorsonde ab. Die Signalstärke ist von der Menge der
eingefangenen Zielnukleinsäure abhängig, die wiederum
proportional zur Menge an Transkript in der Probe ist.
Die Menge an Transkript ist von der aktiven
Transkriptionsrate des gewählten Gens abhängig, (z. B. der E6/E7
Gene), deren Aktivität ein Hinweis auf ein neoplastisches
Risiko ist. Folglich liefert das Verfahren eine
empfindliche Untersuchung zur Risikobestimmung einer Progression
der HPV Infektion zu einer schweren CIN oder CIS.
HPV-spezifische Nukleinsäuresonden.
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Nucleinsäuresonden und Sonden-Sets, die spezifisch
für HPV-Gene, die mit cytologischen Gebärmutterhals-
Anomalien verbunden sind, die sich oft zu schweren CIN
oder CIS entwickeln, werden in dem vorliegenden Verfahren
verwendet. Besonders zweckdienliche Sonden im
vorliegenden Verfahren sind Oligonucleotid-Sonden mit einer
Nucleotidsequenz, die zumindest zu einem Teil der E6
und/oder E7 ORF, oder gespleißten Teilen davon,
komplementär ist. Eine Nucleinsäuresequenz ist komplementär zu
einer zweiten oder Zielnucleotidsequenz (z. B. die E6
oder E7 Gene von HPV), wenn sie an die zweite oder
Zielnucleotidsequenz hybridisiert und unter den im
Verfahren verwendeten Bedingungen hybridisiert bleibt.
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Zwei Sondentypen werden verwendet: mit Schwanz
versehene Oligonucleotide "Einfangsonden" und markierte
"Detektorsonden" (auch als markierte Ribosonden
bezeichnet). Die Einfangsonden mit Schwanz erfüllen zwei
Aufgaben: Sie sind komplementär zu/ hybridisieren an
zumindest einen Teil der ORF-Sequenz eines Gens eines
ausgewählten HPV-Typs oder des codierten Transkripts (mRNS),
und sie binden den Hybridisierungskomplex
(Einfangsonde/Zielnucleotidsequenz/Detektorsonde) an einen festen
Träger, was folglich eine Trennung des
Hybridisierungskomplexes vom Rest der Probe ermöglicht. Eine
schematische Darstellung des Komplexes aus Detektorsonde,
Zieltranskript, Einfangsonden und festem Träger wird in
Abbildung 2 gezeigt. Markierte Detektorsonden sind im
allgemeinen einzelsträngige RNS-oder DNS-Sonden, die an
Teile der bi- oder polycistronischen Gentranskripte
ausgewählter HPV-Typen hybridisieren; sie hybridisieren
spezifisch an Teile dieser Gene, die zwar erkannt werden
können, aber vorzugsweise nicht von den Einfangsonden
erkannt werden. Die ausgewählten HPV-Typen sind entweder
hoch onkogen oder gering onkogen.
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Die Einfangsonden sind durch einen Polynucleotid
Schwanz gekennzeichnet, der normalerweise aus einem
Nucleotid-Homopolymer wie Polydesoxyriboadenylat (poly(da)),
Polydeoxyribocytidylat (poly(dC)), Polydeoxyriboguanylat
(poly(dg)) oder Polydeoxyribothymidylat (poly(dT))
besteht. Der Sondenschwanz ist zu einer
Polynucleotidsequenz komplementär, die an einem festen Träger, wie
Magnetkügelchen, Polystyrol-Kügelchen oder Polystyrol-
Tauchstäben, haftet, was ein Einfangen der Sonde und ein
Trennen von der zu untersuchenden Probe ermöglicht.
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In der vorliegenden Erfindung besonders
zweckdienliche Sonden als Einfangsonden besitzen folgende
Merkmale:
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1. Sie können einfach durch in vivo Transkription (für
die Detektorsonde) oder mit chemischen Verfahren
(für die Oligonucleotid-Einfangsonden)
synthetisiert werden. Die Detektorsonden sollten sich
leicht und mit hohen spezifischen Aktivitäten
wahrend der in vitro Transkription oder chemischen
Synthese oder durch Modifikation nach der Synthese
entweder mit isotopen oder nicht-isotopen Marker,
die leicht quantifiziert werden können, markieren
lassen.
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2. Sie sind HPV typspezifisch. Obwohl HPV 6 manchmal
mit Carcinoma verbunden ist, ist HPV 6 und HPV 11
meistens mit einem geringen Progressionsrisiko
einer hochgradigen Dysplasie verbunden. Weil E6 und
E7 Gene von HPV 6 und HPV 11 eine hohe
Sequenzkonservierung zeigen, können Sonden an diese
Bereiche kreuzhybridisieren; dieses Resultat würde
die Effizienz des Assays nicht schmälern. Im
vorliegenden Verfahren besonders zweckdienliche Sonden
sind spezifisch für HPV 16, 18, 31, 33 und 35.
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3. Sie sind von hinreichender Länge und Nucleotid-
Sequenzen, damit sie nicht von den spezifischen
Zielsequenzen auf viralen Transkripten bei
Durchführung des Assays abdissozieren können, und
hybridisieren spezifisch sowie quantitativ an HPV-
Transkripte.
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4. Sie hybridisieren an gewählte HPV-DNS Sequenzen
oder Transkripte der ausgewählten HPV-Typen. Die
Zieltranskripte enthalten mindestens einen Teil des
ORF, um eine stabile Hybridisierung der
Detektorsonden und mindestens einer Einfangsonde zu
ermöglichen. Die Sonden sind so konstruiert, daß die
Hybridisierungseffizienz der Sonden an die
Zieltranskripte nicht durch das Ausschneiden der
Introns aus den Transkripten (z. B. die Bildung von
E6*I und E6*II) verringert wird.
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5. Die Vollständigkeit der verwendeten Sonden wird
durch die Untersuchungsbedingungen aufrecht
erhalten.
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Als besonders zweckdienliche Einfangsonden in der
vorliegenden Erfindung dienen Oligonucleotid-Sonden mit
poly- (dA) -Schwanz, die beispielsweise gemäß dem von M.L.
Collins beschriebenen Verfahren, Europäische
Patentanmeldung 0265244, eingereicht am 21. Oktober 1987,
hergestellt werden. An einem festen Träger vorhybridisierte
Einfangsonden können ebenfalls verwendet werden.
Vorhybridisierte Sonden werden in der von M.L. Collins und
D.V. Morrissey veröffentlichten PCT Anmeldung, PCT/US
90/01205, eingereicht am 6. März 1990, detailliert
beschrieben.
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Der in der vorliegenden Erfindung verwendete zweite
Einfangsondentyp ist eine Ribosonde oder Detektorsonde,
deren Sequenz spezifisch für ein HPV Transkript oder
ausgewählte HPV-DNS ist, und im allgemeinen eine
detektierbare Markierung besitzt, wie beispielsweise ein
Radionuklid oder Fluoreszenzindikator. Die Detektorsonden werden
zur Bestimmung der DNS- oder RNS-Menge verwendet.
Detektorsonden können mit bekannten Verfahren hergestellt
werden. Detektorsonden sind im allgemeinen
einzelsträngige RNS-Sonden, die an bi- oder polycistronische
Transkripte eines ausgewählten HPV-Gens, wie beispielsweise
der E6 oder E7 Gene, hybridisieren. Die Detektorsonden
sind vorzugsweise mit einem Radionuklid, wie ³²P oder
¹²&sup5;I, markiert, können aber mit beliebigen Mitteln
markiert werden, die nicht mit der Fähigkeit der
Detektorsonden interferieren, an eine komplementäre Sequenz zu
hybrisieren, und mittels üblicher Verfahren detektiert
werden können.
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Das vorliegende Untersuchungssystem und das
Anwendungsverfahren kann zu einem Set für die klinischen
Verwendung zusammengestellt werden. Ein derartiges Set
schließt ein: Eine Probenbehandlungslösung, die einen
Chelatbildner, wie EDTA, und ein Agens zur Zerstörung der
molekularen Strukturen (z. B. Membranen) der Zellen (z.
B. ein chaotropes Agens) enthält; die Einfangsonden mit
Schwanz und markierte Detektorsonden; mindestens einen
Puffer; ein Agens zur Inhibierung von RNAsen-Enzymen (um
einen Abbau der Zieltranskripte zu verhindern); einen
festen Träger (z. B. Magnetkügelchen oder Polystyrol-
Substrat), der mit einem zum Schwanz der Einfangsonde
komplementären Polynucleotid beschichtet ist;
Referenzoder Standardnucleinsäuren, die gleichzeitig mit der
Probe als Kontrolle laufen; und einen Waschpuffer, der
ein Detergens und ein Agens (z. B. ein chaotropes Agens)
zum Zerstören der molekularen Struktur der Zellen
enthält. Das Set kann gegebenenfalls zusätzliche
Waschpuffer, ein Mittel zur Detektion der markierten
Detektorsonde, einen oder mehrere Elutionspuffer,
Amplifizierungs- oder Klonierungsreagenzien und/oder zusätzliche
positive Kontrollproben oder negative Kontrollproben
enthalten. Wenn man es wünscht, kann eine Amplifizierung
der Zielsequenzen, zum Beispiel mit der von Mullis, im
U.S. Patent 4.683.202, beschriebenen Technik,
durchgeführt werden. Eine Amplifizierung der Detektorsonde kann,
nachdem sie den Hybridisierungskomplex-Zyklus durchlaufen
hat und/oder die Zielsequenzen kloniert wurden, z. B. mit
dem von Maniatis et al. in Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY (1982) beschriebenen Verfahren, durchgeführt
werden.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
näher erläutert.
Beispiele
Konstruktion, Herstellung und physikalische Beschreibung
der Sonden.
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HPV-typspezifische Oligonucleotid-Einfangsonden mit
einer Länge von ca. 40 Nucleotiden werden in Abbildung 3
gezeigt. Die Wordsearch/Segments-Programme der
Universität Wisconsin Suite wurden verwendet, um den HPV
Genombereich, Sinnstränge (z. B. RNS-Sinn), die an diese 33
Oligonucleotid-Sonden hybridisieren können, zu
identifizieren, und die Ergebnisse dieser Analysen werden in
der Tabelle aufgeführt.
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Tabelle. Voraussichtliche Anzahl von Basenpaarungen
zwischen den Oligonucleotid-Sonden und den diskreten
Bereichen der HPV Genome.
Sonden Nr
Sonden Länge
von der Sonde erkannte Nt
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Die Zahlen in der Tabelle beziehen sich auf die
Baasenpaare in einem diskreten Bereich des viralen
Genoms, von denen in einer Computer Analyse (Algorhitmen
von Wilbur und Lipman; P.N.A.S. 80:726-739 (1983))
vorausgesagt wurde, daß sie mit Bereichen der
Oligonucleotide paaren. Die Zahlen nach dem Schrägstrich (/)
zeigen die Lücken, die in dem Oligonucleotid oder
Zielsequenz gebraucht werden, um die Anzahl der
Basenpaarungen zu ermöglichen. Für jeden HPV-Typ werden die
Nucleotidsequenzen (Genbank Bezeichnungen) gezeigt, die
durch jedes typspezifische Oligonucleotid abgedeckt sind.
In einigen Fällen fand das Computerprogramm keine
beliebig in Frage kommenden signifikanten Bereiche mit
Basenpaarungen zwischen den Oligonucleotid-Sequenzen und
den genomischen Sequenzen; diese Fälle werden als "nicht
gefunden" (NG) bezeichnet. Die Oligonucleotide in Tabelle
1 können unmöglich stabile Hybride mit anderen HPV-Typen
bilden, deshalb werden sie als typspezifisch betrachtet.
Konstruktion von Exon-spezifischen Einfangsonden für HPV
16, HPV 18, HPV 31, HPV 33 und HPV 35.
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Spleißstellen-Verknüpfungssequenzen in dem E6 ORF
sind in mehreren onkogenen HPV-Typen, einschließlich HPV
16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, und HPV 35, identifiziert
worden, aber sie sind nicht in den E6 ORF von HPV 6 und
HPV 11 vorhanden. Diese Spleißdonor- und Akzeptorstellen
werden in HPV 16 und HPV 18 gebraucht, wie es durch das
Auftreten von gespleißten mRNS (durch die Sequenzierung
der cDNS bestimmt) in Karzinomzellinien gezeigt wird. Das
Auftreten gespleißter Transkripte kann als Prognose für
eine Progression einer schweren Erkrankung verwendet
werden. Folglich wurden Spleißstellen-Einfangsonden
konstruiert, von denen nur mit den gespleißten Transkripten eine
Bildung stabiler Hybride prognostiziert wird. Ungefähr 20
Nucleotide jeder Einfangsonde hybridisieren an das 3'-
Ende des upstream Exons, und die verbleibenden 20
Nucleotide hybridisieren an das 5'-Ende des downstream
Exons. Sequenzen dieser Sonden und ihren Zielstellen auf
den Transkripten werden in Abbildung 4 gezeigt. Analysen
der Anordnung (Algorithmen von Wilbur und Lipman) der
Spleißstellen-Verknüpfungssonden und der Genome von HPV
6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31 und HPV 33 ergaben, daß
jede Sonde voraussichtlich nur an die Transkripte des
HPV-Typs hybridisiert, für die die Sonde konstruiert
wurde. Unterschiedliche Sonden wurden zur Detektion der
beiden gespleißten E6 mRNS (E6*I und E6*II) von HPV 16
konstruiert.
Konstruktion von HPV 16 spezifischen Einfangsonden und
die Anordnung der Sonden in dem HPV16 Assay.
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Zehn HPV 16 spezifische Oligonucleotid-Sonden (ca.
40 Nucleotide lang) wurden konstruiert und in dem unten
beschriebenen Assay getestet. Drei dieser Sonden, als 16-
3, 16-4 und 16-5 bezeichnet, wurden für die Verwendung im
Assay adaptiert, da sie eine hohe Empfindlichkeit und
Spezifität boten. Die Anordnung dieser drei Sonden
bezüglich
des RNS-Ziels und der Detektorsonden wird in
Abbildung 5 gezeigt. Die Einfangsonde 16-3 ist der
Detektorsonde am nächsten und hybridisiert an die Zielsequenz 46
Nucleotide nach dem 3'-Ende der Hybridisierungsstellen,
die durch die Detektor-Ribosonde abgedeckt werden.
Deshalb bleibt nach der Hybridisierung der Detektorsonde an
die mRNS nur ein kurzer Teil einzelsträngig (z. B. nicht
von Einfangsonden oder Detektorsonden bedeckt), was
folglich einen möglichen Abbau durch RNAsen minimalisiert.
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Die Anordnung dieser Einfangsonden mit Sequenzen
aus HPV 6, HPV 11, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33 und HPV
35 wird in Abbildung 6 gezeigt. Die Untersuchung
möglicher Basenpaarungen zwischen diesen Sonden und anderen
genitalen HPV-Typen, einer Anordnung, die durch visuelle
Analysen und Computeranalysen gemacht wurde, zeigt, daß
Basenfehlpaarungen (nicht unterstrichen) zahlreich
vorkommen und annähernd gleichmäßig über die Einfangsonde
verteilt sind. Als Ergebnis würden diese Hybride sehr
instabil sein.
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Die 3'-Enden der Einfangsonden werden durch die
anschließende Zugabe von d(A)-Resten mit terminaler
Transferase verlängert, so daß schließlich der poly-d(A)
"Schwanz" 150-200 Nucleotide lang ist, was die minimale
Länge ist, die ein ungehindertes Einfangen des
Hybridisierungskomplexes an d(T) modifizierten Magnetkügelchen
erlaubt.
Konstruktion und Herstellung einer HPV-spezifischen
Detektor-Ribosonde und Ziel-RNS
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Die HPV 16 DNS wurde aus CaSki Zellen, die
bekanntlicherweise die HPV 16 Genome enthalten (Baker et al., J.
Virol.,61(4):962-971, 1987), in Lambda 47,1 kloniert, von
dem sie in das pT7/T3α-18 Plasmid (Bethesda Research
Laboratory) subkloniert wurden. Eine Übersicht des
Klonierungs/Subklonierungs-Schemas wird in Abbildung 7
gezeigt. Ein 630 Nucleotid großes Dde I Fragment
(Nucleotide 25-655; Seedorf et al., Virol., 145:181-185,
1985) wurde ausgeschnitten, aufgefüllt und in ein Sma I
geschnittenes pT7/T3α-18 Plasmid subkloniert. Die durch
zweifaches oder in den meisten Fällen dreifaches Lesen
erhaltene Sequenzananlyse zeigte, daß das Insert nur die
Nucleotide 25-655 des HPV 16 Genoms enthielt. Eine in
vitro Transkription mit T7 Polymerase dieses Konstrukts,
das mit Ssp I Restriktionsendonuclease linearisiert
wurde, ergab ein einziges Produkt mit einer homogenen
elektrophoretischen Mobilität und einer Größe von
offensichtliche 0,5 Kb, die an das 3'-Dreiviertel vom E6 ORF
und dem 5'-Drittel vom E7 ORF hybridisieren sollte. Die
Detektorsonde enthält zusätzlich zu den 471 Nucleotiden
der HPV 16 Sequenz 22 zusätzliche Nucleotide der
Plasmidsequenz an ihrem 5'-Ende, was ein Ergebnis der
Transkriptionsiniation des T7 Promotors und der Verlängerung über
einen Teil der multiplen Klonierungsstelle im Vektor ist.
Diese zusätzlichen 5'-Nucleotide interferieren nicht mit
der Hybridisierung der Einfangsonden, die meist annähernd
46 Nucleotide entfernt sind. Nach der Hybridisierung an
die Ziel-mRNS sollte sich die Detektorsonde über 40
Nucleotide 5' zu der Spleißdonorstelle bei den
Nucleotiden 224-232 erstrecken (Abbildung 5); dieses Hybrid ist
voraussichtlich sehr stabil. Das Ausschneiden jedes E6
Introns würde ein mRNS-Molekül ergeben, das
Basenpaarungen mit entweder 162 oder 288 Nucleotiden der
Detektorsonden besitzt. Diese Hybride sollten im Assay stabil
sein. Nach den Herstellerangaben für die Synthese eines
Transkriptes mit der T7 Palymerase, wurden ³²P markierte
Ribosonden mit spezifischen Aktivitäten von 5 x 10&sup8;
cpm/ng hergestellt. Die Anordnung der Detektorsonden auf
den E6/E7 Transkripten wurde so gestaltet, daß die E6/E7
Zielsequenzen, die die Hybridisierungsstelle der
Detektor-Ribosonde flankieren, für eine Hybridisierung an
Einfangsonden verfügbar wären.
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Die Empfindlichkeit des HPV 16 Assays wurde
ebenfalls bestimmt. Zu diesem Zweck war es wichtig durch eine
in vitro Transkription, gut charakterisierte positive
Ziele (z. B. mRNS ähnelnde Moleküle, die die ORF der E6
und E7 Gene enthalten) herzustellen. Die Transkription
von dem T3 Promotor in das Konstrukt, das den
vollständigen genomischen HPV 16 enthält, zeigte einen möglichen
Transkriptionsterminator genau upstream der E6 und E7
Gene (Nucleotide 7400-7600 im nicht-codierenden Bereich).
Eine visuelle Untersuchung der Sequenzen in diesem
Bereich, der genau downstream von einem
Polyadenylisierungssignal liegt, läßt vermuten, daß die Transkription
der Plus-Sinn RNS von diesem Teil des Genoms RNS
produziert, die zahlreiche Bereiche von U-Resten besitzen,
ein Kennzeichen eines Transkriptionsterminators; deshalb
wurde eine 1,3 Kb großes Sph I Fragment entfernt, das
etwa die Hälfte der an Terminationssequenzen reichen
Bereiche und einige Sequenzen im Vektor umfaßt. Die
Transkription des daraus resultierenden Konstrukts (mit
Spe I linearisiert) mit T3 Polymerase ergibt ein
erwartetes Haupttranskript von 1,9 Kb und ebenso kürzere
RNS Nebenprodukte (ca 600 Nucleotide kürzer als die
Haupt-RNS). Das 1,9 Kb Transkript wurde als positives
Ziel im Assay verwendet.
Konstruktion und Durchführung des HPV 16 Assays
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Die Probenpräparation und das
Durchführungsverfahren des Assays erfolgen entsprechend der
Beschreibung von M. Collins, Europäische Patentanmeldung, Nummer
0265244, wobei das wesentliche hier angeführt ist. Die
Zellen von Gebärmutterhals-Proben (z. B.
Gebärmutterhals-Ausspülungen, Abstrich, Biopsien und Tumoren) werden mit
den Probenbehandlungspuffer (PBP) gemischt, der 5 M
Guanidiniumisothiocyanat (GuSCN) und 1 M
Ethylendiamintetraacetat (EDTA) enthält, um die Zellen sowie die
Probenmatrix zu lösen und RNasen zu inhibieren. Die
Proben werden verdünnt, so daß die GuSCN Endkonzentration
2,5 M beträgt, und mit 67 ng/ml jeder Einfangsonde und
1,4 x 10&sup7; cpm/ml Detektorsonde bei 37 ºC 2-18 Stunden
inkubiert. Dann werden die d(T)-beschichteten
Magnetkügelchen
(Endkonzentration 0,125% Festkörper) zugefügt
und die entstandene Mischung 15 Minuten bei 37 ºC
inkubiert; die Einfangsonden mit d(A) -Schwanz
hybridisieren an die d(T) -beschichteten Magnetkügelchen in
dieser Zeit. Der Waschpuffer (0,5 M GuSCN, 40 mM Tris-HCl,
pH 7,8, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl, 0,2%
Rinderserumalbumin und 0,1% Antischaummittel) wird zu der Mischung
gegeben, und die Magnetkügelchen werden dann an den
Röhrchenwänden mit Hilfe eines magnetischen Felds
gesammelt. Die überstandsflüssigkeit wird abgesaugt. Die
Kügelchen werden zusätzlich zweimal mit Waschpuffer
gewaschen, wie eben beschrieben, und dann in einem 3,25 M
GuSCN, 100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 65 mM EDTA, 0,5% BSA und
5% Sarkosyl enthaltenden Puffer resuspendiert. Nach einer
10 minütigen Inkubation bei 37 ºC sollten die
Nucleinsäurekomplexe von den Kügelchen aufgrund der Störung der
A-T-Bindungen zwischen den Poly-d(A) Schwänzen der
Einfangsonden und den Oligo-d(T) Ketten der Magnetkügelchen
freigesetzt werden. Nach dem Ansammeln der
Magnetkügelchen an den Röhrchenwänden mit Hilfe eines Magnetfelds
wird der Freisetzungspuffer und der Nucleinsäurekomplex
in ein anderes Röhrchen überführt, und die
Hybridisierungskomplexe werden, wie eben beschrieben, mit einem
zweiten Satz Magnetkügelchen eingefangen. Dieses
Einfangen, Freisetzen und Neueinfangen der
Nukleinsäurekomplexe mit Magnetkügelchen wird als reversibles
Ziel einfangen bezeichnet.
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Das reversible Ziel einfangen wird einmal wiederholt
und die Nukleinsäurekomplexe in dem Freisetzungspuffer
werden mit einem dritten Satz Kügelchen eingefangen. Nach
einmal Waschen der Kügelchen, werden diese in Waschpuffer
resuspendiert und ein Aliquot der Suspension wird auf
eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Radioaktivität
kann durch Exposition der Membran auf einem Film oder
durch Bestimmung der Counts mit einem Beta-Emmissions-
Blotanalysator (z. B. Betagen) detektiert werden. Die
Exposition auf dem Film kann mit einem Densitometer
quantitativ bestimmt werden, Wahlweise können
Fluoreszeinmarkierte Detektor-Oligonucleotide oder Ribosonden in dem
Assay verwendet werden.
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Anstrengungen wurden unternommen, um die
quantitative Empfindlichkeit des HPV 16 Assays durch Verwendung
von in vitro gebildeten positiven Zieltranskripten zu
bestimmen. Untersuchungen des Röntgenfilms (Abbildung 8A)
zeigten, daß 500 fg Ziel (500.000 Moleküle) sichtbar
gemacht werden konnten, und daß kein Signal detektiert
wurde, wenn die Ziel RNS weggelasen wurde; kein Signal
wurde detektiert, wenn die Lysate von 200.000 HeLa Zellen
(die HPV 18 Sequenzen enthalten) im Assay verwendet
wurden. Eine Eichkurve, die durch Auftragen der
Radioaktivität der Kügelchen gegen die Menge an positiver
Ziel-RNS erhalten wurde, ist eine Gerade für RNS-Werte
von 100 fg bis 100 ug (Abb 8B).