DE69830911T2

DE69830911T2 - Screeningverfahren zur identifizierung von personen mit risiko einer krankheit, die mit verschiedenen polymorphen formen des wildtyps des p53 zusammenhängen, zu entwickelen

Info

Publication number: DE69830911T2
Application number: DE69830911T
Authority: DE
Inventors: J. Greg MATLASHEWSKI; Lawrence Banks; Alan St. Neots STOREY
Original assignee: McGill University; IMP CANCER RES TECHNOLOGY ICRT; Imperial Cancer Research Technology Ltd; ICGEB; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Current assignee: McGill University; IMP CANCER RES TECHNOLOGY ICRT; Cancer Research Horizons Ltd; ICGEB; International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology
Priority date: 1997-09-02
Filing date: 1998-08-31
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2018-09-01
Also published as: EP1012336B1; JP2001514860A; WO1999011817A1; CA2214461A1; BR9811441A; ATE299949T1; AU8969098A; JP5118115B2; EP1012336A1; US6489105B1; DE69830911D1; JP2010029215A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(a) Bereich der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Screening-Verfahren zum Identifizieren von Individuen, mit Risiko der Entwicklung von Krankheiten, die mit verschiedenen polymorphen Formen des Wildtyps p53 assoziiert sind.
b) Beschreibung des Standes der Technik
Das zelluläre Tumorsuppressorprotein p53 ist einer der Hauptregulatoren der Zellproliferation. In Abhängigkeit vom Kontext des Stimulans wird p53 Zellwachstumsarrest oder programmierten Zelltod (Apoptose) induzieren. Als eine Konsequenz verhindert dies fortgesetzte Proliferation von Zellen, welche DNA-Mutationen erfahren haben und diese Regulation ist eine der Schlüsselabwehrfunktionen des Organismus gegen Krebs. In vielen humanen Tumoren ist Inaktivierung von p53 einer der prinzipiellen Faktoren bei der Entwicklung des Tumors. In Krebsformen, die mit humanem Papillomarivurs (HPV) assoziiert sind, ist jedoch p53 nahezu immer vom Wildtyp. Dies ist aufgrund der Aktivität des viralen E6-Proteins, welches p53 für Ubiquitin-vermittelten Abbau markiert, und auf diese Weise normale p53-Funktionen überwindet. Aus diesem Grund sind HPVs ein Hauptkanzerogen für die Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs bzw. Zervixkarzinom bei Frauen, eine der häufigsten Formen von Krebs weltweit.
Zwei polymorphe Formen von p53 existieren, die entweder Prolin- oder Argininreste an der Aminosäureposition 72 des p53-Proteins codieren können. Dieser Polymorphismus führt zu einer Änderung der Migration des p53-Proteins in Polyacrylamidgelen, jedoch scheinen bis heute beide Formen von p53 nicht unterscheidbare Aktivitätsgrade aufzuweisen. Tatsächlich sind zahlreiche epidemologische Untersuchungen durchgeführt über die letzten 6 bis 7 Jahre worden, um zu bestimmen, ob einer der Polymorphismen einen Risikofaktor für die Entwicklung von verschiedenen humanen Tumoren darstellt. Bis heute war der Beweis überwältigend zu Gunsten der Betrachtungsweise, dass das Vorliegen von Prolin oder Arginin an der Aminosäureposition 72 kein wesentlicher Risikofaktor bei der Entwicklung einer speziellen Krebsform ist. Jedoch basierend auf unseren jüngsten Beobachtungen wäre es sehr wünschenswert über ein Screeningverfahren zu verfügen, um Individuen, die einem Risiko der Entwicklung von Krankheiten unterliegen, die mit verschiedenen polymorphen Formen von Wildtyp p53 verbunden sind, zu identifizieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Screeningverfahrens zum Identifizieren von Individuen, die dem Risiko der Entwicklung von Krankheiten unterliegen, die mit verschiedenen polymorphen Formen des Wildtyps p53 verbunden sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Screeningverfahren bereitgestellt zum Identifizieren von Individuen, die unter dem Risiko der Entwicklung von HPV-assoziiertem Krebs stehen, umfassend den Schritt des Bestimmens des Vorliegens von p53pro⁷²- oder p53arg⁷²-Wildtyp-Allelen in einer biologischen Probe, die erhalten wird von einem Patienten, worin das Allelmuster p53arg⁷²/p53⁷²arg kennzeichnend ist für einen Risikofaktor zum Entwicklen eines HPV-assoziierten Krebses.
Im Spezielleren umfassen die Krankheiten, ohne darauf begrenzt zu sein, genitale Warzen, zervikale Neoplasie oder zervikales Karzinom bzw. Zervixkarzinom.
Wenn z.B. ein Patientenallelmuster p53arg/p53arg ist, ist es kennzeichnend für ein Individuum mit größerem Risiko der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich genitalen Warzen, zervikaler Neoplasie oder zervikalem Karzinom, welche verbunden sind mit Infektionen durch humanen Papillomavirus (HPV).
Virale Pathologien umfassen auch Hautkrebs, der durch humane Papillomaviren verursacht wird und umfasst virale Langzeitinfektionen und Suszeptibilität für initiale virale Infektionen in Individuen, die p53arg/p53arg sind. Präziser ausgedrückt, besteht die Bestimmung von Schritt b) des vorliegenden Verfahrens aus mindestens einem aus der folgenden Punkte, ohne darauf begrenzt zu sein:

a) Amplifizieren durch Polymerasekettenreaktion;
b) Sequenzieren von DNA oder Protein;
c) Hybridisieren mit mindestens einer Sonde, die spezifisch für entweder p53pro- oder p53arg-DNA ist; und
d) Immunnachweisen mit mindestens einem Antikörper, der spezifisch ist für entweder p53pro- oder p53arg-Protein, um die p53pro- oder p53arg-Allele zu identifizieren.

Das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um ein Screening von Patienten durchzuführen, die unter Immunsuppressionstherapie stehen und anfälliger sind für virale Infektionen und virale Pathologien.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Screeningverfahren bereitgestellt für potenzielle Impfkandidaten in einem HPV-Impfprogramm, umfassend die Schritte:

a) Erhalten einer biologischen Probe der Patienten;
b) Bestimmen des Vorliegens von p53pro- oder p53arg-Wildtypallelen in diesen; worin p53arg/p53arg-Patienten bevorzugt geimpft werden sollten.

Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Patienten einen anormalen PAP-Abstrich, geringfügige zervikale Läsionen aufweisen, können Neugeborene oder Neugeborene von Müttern mit genitalen HPV-Infektionen sein.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke und Abkürzungen unten definiert.
"Erkrankung, die verbunden ist mit verschiedenen polymorphen Formen des Wildtyps p53" soll jede Erkrankung bedeuten, die p53 umfasst und worin sich Wildtyp p53arg oder p53pro verschieden verhalten. Solche Erkrankungen umfassen, ohne Begrenzung, Krebsformen, die durch Viren, wie etwa Papillomavirus, bewirkt werden.
"p53arg" soll p53-Arginin bedeuten, worin ein Arginin an der Aminosäureposition 72 des p53-Widtypproteins gefunden wird.
"p53pro" soll p53-Prolin bedeuten, worin ein Prolin an der Aminosäureposition 72 des p53-Wildtypproteins gefunden wird.
"HPV" soll humane Papillomaviren bedeuten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Vergleich von HPV-18 E6-induziertem Abbau von p53pro und p53arg in vivo;
2 zeigt, dass HPV-16 und HPV-11 E6 bevorzugt auf p53Arg gegenüber p53Pro als Ziel für den Abbau in vivo gerichtet sind;
3A zeigt die Darstellung des p53-Gens, die funktionelle Domänen des Proteins zeigt;
3B zeigt den Nachweis von Arg- und Pro-p53-Allelen von Plasmid-DNA; und
3C zeigt die Amplifikation von p53-Sequenzen von Genom-DNA von Arg- und Pro-homozygoten Individuen.
DETALLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unser Interesse geweckt zur Bestimmung, ob die beiden Formen von p53 verschieden durch die humanen Papillomavirus-E6-Proteine als Ziele dienen. Wir haben gezeigt, dass die Argininform von p53 deutlich anfälliger ist für E6-vermittelten Abbau als die Prolinform von p53. Dies würde zu der Argumentation führen, dass bei einer viralen Infektion oder bei viraler Transformation Individuen, die nur Arginin-p53 exprimieren, anfälliger wären für die Wirkungen des Virus. Eine Vorraussage davon wäre, dass Individuen mit nur p53-Arginin wahrscheinlicher HPV-assoziierte Tumore entwickeln. Um diese Hypothese zu testen, haben wir eine Reihe von Patienten mit zerivikalem Karzinom und ebenfalls eine Reihe von Rezipienten von renalem Transplantat (RTRs) mit kutanem Krebs gescreent. Nach zerivikalem Karzionom stellt kutaner Krebs bzw. kutanes Karzinom die zweite Hauptgruppe von HPV-assoziierten Tumoren dar. Die Ergebnisse dieses Screenings zeigen ein überwältigendes Übergewicht von Individuen mit nur p53-Arginin unter den Krebspatienten, im Vergleich mit einer normalen Kontrollpopulation. Dieses Ergebnis zeigt, dass Individuen mit nur p53-Arginin wahrscheinlicher HPV-assoziierte Tumore entwickeln als Heterozygote oder Individuen mit nur p53-Prolin.
Das Aufzeigen, dass verschiedene polymorphe Formen von Wildtyp p53 verschieden anfällig für HPV-Inaktivierung sind, ist absolut neu. Das Aufzeigen, dass Individuen mit nur p53-Arginin wahrscheinlicher HPV assoziierte Krebsformen entwickeln ist ebenfalls absolut neu.
Das E6-Oncoprotein, das von Tumor-assoziierten HPV-Typen abgeleitet ist, bindet an und induziert den Abbau von dem zellulären Tumorsuppressorprotein p53 (Scheffner, M. et al., 1990, Cell, 63:1129–1136). Es ist gezeigt worden, dass Mutation des p53-Proteins häufig es nicht suszeptibel macht für E6-vermittelten Abbau, jedoch gab es keine vergleichbaren Berichte über die Wirkungen von E6 auf verschiedene polymorphe Formen des Wildtyp-p53. In dieser Untersuchung haben wir die Wirkung des Prolin/Arginin-Polymorphismus an Position 72 des Wildtyp-p53-Proteins untersucht (Matlashewski, G. et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:961–963). Die Ergebnisse zeigen, dass in vivo p53Arg deutlich anfälliger bzw. suszeptibler war für Abbau durch aus Hochrisiko-abgeleitetem HPV E6 als p53Pro. Darüber hinaus konnte E6 aus Niederrisiko-HPV-11 ebenfalls den Abbau von p53Arg vermitteln, jedoch nicht von p53Pro. Daher ist p53Arg anfälliger für den Abbau durch E6-Proteine aus sowohl Niederrisiko- als auch Hochrisiko-HPV-Typen, als es p53Pro ist. Zusammen betrachtet, legen diese Ergebnisse nahe, dass der Prolin/Arginin-Polymorphismus innerhalb von Wildtyp p53 einen Suszeptibilitätsmarker für HPV-induzierte Krebsformen darstellt.
Es ist ebenfalls gut eingeführt, dass die Entwicklung von zerivikalem Karzinom eng korreliert mit dem Vorliegen bestimmter humaner Papillomavirentypen, wie etwa HPV-16 und HPV-18. Im Gegensatz hierzu korreliert Infektion mit anderen HPV-Typen, wie etwa HPV-6 und HPV-11, hauptsächlich mit der Entwicklung von benignen Läsionen (Storey A. et al., 1986, in Keratinocyte Handbook von Irene Leigh et al., Cambridge University Press, 1994, S. 439–457). HPV-16 und HPV-18 codieren zwei Hauptoncoproteine, E6 und E7. Das E7-Protein bindet an und inaktiviert das zelluläre Tumorsuppressorprotein pRb; das E6-Protein bindet an den zellulären Tumorsuppressor p53 und führt später seinen Abbau über den Ubiquitinweg durch. Wenngleich Inaktivierung dieser beiden Tumorsuppressorproteine durch HPV als wichtig erachtet wird während der Tumorentwicklung, gibt es keine klaren Hinweise darauf, ob andere genetische Faktoren vorliegen, die ein infiziertes Individuum prädisponieren können zerivikale Karzinome zu entwickeln. Das p53-Protein wird häufig in einer großen Anzahl humaner Tumore mutiert, ist jedoch ein invariabler Wildtyp in frühen zerivikalen Tumoren, was zu der Ansicht führt, dass Inaktivierung von p53 durch E6 analog zu einer inaktivierenden Mutation ist. Viele der Mutanten-p53-Proteine, die in der Literatur beschrieben sind, sind nicht suszeptibel für E6-vermittelten Abbau, wodurch nahegelegt wird, dass die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Proteinen leicht gestört werden kann. Wir waren interessiert an der Untersuchung, ob Polymorphismus innerhalb des Wildtyp p53-Proteins die Fähigkeit von HPV E6 beeinträchtigen kann p53 für Ubiquitin-vermittelten Abbau zu markieren. Wir haben unsere Aufmerksamkeit auf den Prolin/Arginin-Polymorphismus an der Aminosäureposition 72 in dem p53-Protein gerichtet, da dieses kein konservativer Aminosäureaustausch ist und in der Tat diese Änderung zu einer dramatischen Veränderung der Migration des p53-Proteins auf SDS-PAGE führt (Matlashewski, G. et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:961–963).
Zum Untersuchen, ob das HPV-18 E6-Protein bevorzugt eine der beiden Formen von p53 erkennen kann, führten wir zuerst eine Reihe von in vivo-Abbauassays durch. P53 Null Saos-2-Zellen wurden transfiziert mit Plasmiden, die die eine oder andere der beiden polymorphen Formen von p53 exprimieren, zusammen mit ansteigenden Mengen eines HPV-18 E6-exprimierenden Plasmids. Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert und der p53-Protein-Rückstand durch Western Blot-Analyse mit einem Pool von Anti-p53-monoklonalen Antikörpern nachgewiesen.
1 zeigt einen Vergleich von HPV-18 E6-induziertem Abbau von p53Pro und p53Arg in vivo. In diesem Versuch wurden Saos-2-Zellen transfiziert mit 3ug von entweder pCDNA-p53Pro oder pCDNA-p53Arg, zusammen mit ansteigenden Mengen pCDNA-18E6 oder Kontrollplasmid pCDNA-3, wie angegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert in einer Lösung von 50 mM Hepes, pH-Wert 7,0, 250 mM NaCl, 0,1 % NP40 und 1 % APROTININ^TM. Die Proteinkonzentrationen wurden bestimmt unter Verwendung des Bio Rad-Proteinassays und gleiche Mengen wurden auf SDS-PAGE laufengelassen und auf eine Nitrocellulosemembran übergeführt. p53-Protein wurde nachgewiesen unter Verwendung eines Pools der Anti-p53-monoklonalen Antikörper pAb1801, 1802 und 1803 und des Western Blots, entwickelt mit dem Amersham ECL-System. Transfektionseffizienzen wurden durchgehend beobachtet durch Cotransfizieren eines lacZ-exprimierenden Plasmids auf parallelen Platten und Färben auf lacZ-Expression. C33-Zellen stellen eine positive Kontrolle für p53-Expression dar.
Wie in 1 gezeigt, ist deutlich, dass ansteigende Mengen von HPV-18 E6 eine dramatische Abnahme der Menge von p53Arg induzieren. Im Gegensatz hierzu wurde kein wesentlicher Abbau des p53Pro unter identischen Bedingungen nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Prolin/Arginin-Polymorphismus an Aminosäureposition 72 in p53 seine Anfälligkeit bzw. Suszeptibilität für HPV-18 E6-induzierten Abbau in vivo verändert, und dass p53Arg anfälliger ist für HPV-18 E6 als p53.
Als nächstes interessierten wir uns für die Bestimmung, ob diese Veränderung der Suszeptibilität von p53 für E6-induzierten Abbau begrenzt war auf E6, das von HPV-18 abgeleitet war, oder ob es ebenfalls für E6-Proteine zutraf, die von anderen HPV-Typen abgeleitet waren. Um dies zu untersuchen, wiederholten wir die in vivo-Abbau-Assays, die in 1 durchgeführt wurden, einschließlich ansteigender Mengen von HPV-16 E6 und HPV-11 E6. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Saos-2-Zellen wurden mit pCDNA-p53Pro oder pCDNA-p53Arg transfiziert, zusammen mit ansteigenden Mengen pCDNA-16E6 (2, Paneel A) oder pCDNA-11E6 (2, Paneel B) oder Kontrollplasmid pCDNA-3, wie angegeben. Restliches p53-Protein wurde nachgewiesen wie in 1. pCDNA-18E6 wurde zum Vergleich mitaufgenommen.
Das HPV-16 E6-Protein (2A) zeigt eine Fähigkeit zum Abbau der verschiedenen Formen von p53, welcher ähnlich ist zu dem, der mit HPV-18 E6 beobachtet wird. Wie ersichtlich ist, wird nur bei hoher Zugabe (Input) von E6 ein wesentlicher Abbau von p53Pro erhalten, während viel geringere Konzentrationen des HPV16 E6-Proteins vollständigen Abbau von p53Arg hervorrufen. Von besonderem Interesse jedoch sind die Ergebnisse mit dem HPV-11 E6-Protein (2B). Eine Anzahl von in vitro-Untersuchungen hatte zuvor gezeigt, dass HPV-11 E6 nicht auf p53 gerichtet sein könnte für Ubiquitin-vermittelten Abbau. Die in vivo-Ergebnisse mit p53Pro würden bestimmt diese Betrachtungsweise stützen, da HPV-11 E6 nicht in der Lage war, den Abbau von p53Pro zu vermitteln (2B). Jedoch induziert HPV-11 E6 deutlich den Abbau von p53Arg in dem in vivo-Assay, wenn auch nicht so wirkungsvoll wie derjenige, der durch die oncogenen HPV-16- und HPV-18 E6-Proteine induziert wird. Diese Ergebnisse sind dahingehend sehr signifikant, dass sie zeigen, dass der Prolin/Arginin-Polymorphismus innerhalb des p53-Proteins an Position 72 die Suszeptibilität von Wildtyp p53 gegenüber E6-vermitteltem Abbau bestimmt, ungeachtet des HPV-Typs.
Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir einen klaren Unterschied in der Suszeptibilität der beiden polymorphen Formen von Wildtyp p53 gegenüber E6-vermitteltem Abbau gezeigt. Wenngleich sowohl die HPV-16- als auch HPV-18 E6-Proteine den Abbau der Prolinform von p53 induzieren können, ist dieser Abbau viel weniger wirkungsvoll bzw. effizient als der der Argininform von p53. Weiterhin ist das HPV-11 E6-Protein vollständig inaktiv bezüglich des p53Pro, jedoch zeigt es trotzdem geringere, jedoch signifikante Abbaugrade für p53Arg. Da p53 einen Schlüsselkontrollpunkt in der Wirtsabwehr gegen Tumorbildung darstellt, würden diese Studien vorraussagen, dass dieser Polymorphismus wesentlichen Einfluss auf den wahrscheinlichen Ausgang einer HPV-Infektion haben würde. Mehrere Untersuchungen richteten sich auf den p53-Polymorphismus innerhalb nicht HPV-assoziierter Tumore und es gelang nicht eine wesentliche Korrelation mit dem Vorliegen oder Fehlen einer speziellen polymorphen Form von p53 zu zeigen (Zhang, W. et al., 1992, Gene, 117:271–275; Birgander R. et al., 1995, Carcinogenesis, 16: 2233–2236; Weston A. et al., 1994, Carcinogenesis, 15: 583–587; Weston A. et al., 1992, Env. Health Pers., 98: 61–67). Im Gegensatz hierzu stützt unsere Untersuchung stark die Hypothese, dass in HPV-assoziierter Tumorgenese der Polymorphismus innerhalb p53 an Position 72 einen wesentlichen Risikofaktor darstellt. Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir den p53-Genotyp (p53pro oder p53arg) in einer Reihe von HPV-assoziierten zervikalen Krebsformen und Hautkrebsformen untersucht. Die Ergebnisse dieses Screenings auf den p53-Polymorphismus in diesen HPV-assoziierten Tumoren bestätigt diese Hypothese (siehe die Ergebnisse in den Tabellen 1 und 2). Wie darin detailliert dargestellt, zeigen diese Daten, dass über 85 % der Individuen mit HPV-assoziiertem zerivikalem Krebs (Tabelle 1) und Hautkrebs (Tabelle 2) homocygot für p53arg-Allele waren. Wir können schließen, dass die Natur des p53-Polymorphismus an der Aminosäureposition 72 ein wichtiger Faktor in HPV-assoziierter Tumorgenese ist, und dass Individuen, die homocygot für p53arg sind, unter einem höheren Risiko der Entwicklung dieser Tumore stehen.
Verfahren zum Bestimmen des Genotyps von Wildtyp p53 (p53pro oder p53arg)
Gewebeproben
Tumorprobekörper umfassen sowohl invasive als auch kutane Plattenzellen. Alle Läsionen wurden histologisch bestätigt und wurden zum Zeitpunkt der Biopsie oder des chirurgischen Exzision gesammelt, schockgefroren und bei –70 °C gelagert. Sieben der zervikalen SCCs wurden aus Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem archiviertem Material erhalten. Proben für die Kontrollgruppe bestanden aus DNA, die extrahiert war aus Gesamtblut, gesammelt von gesunden Freiwilligen.
DNA-Extraktion
DNA von gefrorenem Gewebe wurde extrahiert durch Proteinase K-Verdau und Phenol-Chloroform-Extraktion, DNA von in Paraffin eingebettetem Gewebe wurde ähnlich extrahiert nach Entparaffinierung. DNA wurde aus Gesamtblut von Kontrollindividuen extrahiert, unter Verwendung eines Nukleon-DNA-Extraktionskits (Scotlab).
PCR-Amplifikation von p53-polymorphen Sequenzen
p53 Pro-Sequenzen wurden nachgewiesen durch PCR, unter Verwendung des Primerpaars p53Pro+/p53- (p53Pro+ : 5'GCCAGAGGCTGCTCCCCC (SEQ ID NO:1), p53- : 5'CGTGCAAGTCACAGACTT (SEQ ID NO: 2) und p53Arg durch das Primerpaar p53+/Arg- (p 53+ : 5' TCCCCCTTGCCGTCCCAA (SEQ ID NO: 3), Arg- : 5' CTGGTGCAGGGGCCACGC (SEQ ID NO: 4)). Primerpaare (2ug jeweils) wurden gemischt und am Ende markiert mit [32P] durch Polynukleotidkinase (Promega) in einem Gesamtvolumen von 50 ul, enthaltend 50uCi [α32P] ATP (Amersham). 1 ul des markierten Primergemisches wurde je PCR-Reaktion verwendet. PCR-Reaktionen (25 Zyklen) wurden in einem Gesamtvolumen von 50 ul unter Verwendung von 0,2 Einheiten Red Hot-Polymerase (Advanced Biotechnologies) in Reaktionspuffer IV (bezogen vom Hersteller) bei 1,5 mM Mg++ durchgeführt. 10 ul des Reaktionsprodukts wurden fraktioniert auf einem 8 % Polyacrylamidgel in 1 × TBE-Puffer, getrocknet und entweder einem Röntgen-Film ausgesetzt oder quantifiziert unter Verwendung eines Storm 840-Phosphorimager Molecular Dynamics) und einer ImageQuant-Software.
Ergebnisse des p53-Genotypisierens
Wir untersuchten zuerst die Häufigkeit der p53-Pro- und -Arg-Allele in einer Reihe zervikaler Krebsbiopsien und verglichen diese mit der Häufigkeit, die in der Kontrollgruppe beobachtet wurde (Tabelle 1). Die relative Häufigkeit von jedem ist in Klammern gezeigt.
Tabelle 1 Häufigkeit des Nachweises von Arg- und Pro-Allelen in normalen Biopsien von Freiwilligen und zervikalen Tumorbiopsien
HPV-Typen, die in zervikalen Karzinomen nachgewiesen werden:
HPV16 N = 12, HPV18 N = 4, HPV45 N = 2, HPV positiv, jedoch nicht typisiert = 6
Beide Gruppen verglichen Individuen mit breitem ähnlichen ethnischen Hintergrund und die Allelhäufigkeiten, die wir in unseren Kontroll-DNA-Proben beobachteten, waren ähnlich denjenigen, die in früher beschriebenen Studien beobachtet worden sind, vorausgesetzt, dass p53-Allelhäufigkeit zwischen verschiedenen ethnischen Gruppen variiert (Beckman, G. et al., 1994, Hu. Hered., 44: 266–270). In unserer Untersuchung war ein deutlicher Unterschied in der Häufigkeit des Nachweises des Arg-Allels relativ zu der des Arg/Pro-Genotyps, was deutlich verschieden war zwischen den Biopsien von zervikalen Karzinomen und den normalen Kontrollen (x² = 218,89, p = 0,000013), wobei nur das Arg-Allel in einer viel größeren Anzahl von Proben (88 % bei den Krebsformen gegenüber 36 % in den Kontrollen) nachgewiesen wird, mit einer einhergehenden Verringerung der Anzahl von Pro/Arg-Genotypen, die beobachtet werden (4 % bei den Krebsformen, verglichen mit 57 % in den Kontrollen). Es gab keinen wesentlichen Unterschied zwischen der Häufigkeit des Nachweises von nur dem Pro-Allel in dieser Untersuchung, wenngleich die Anzahlen in jeder Gruppe gering waren.
Die klare Unterschied der Allel-Häufigkeiten zwischen den zervikalen Tumorproben im Vergleich mit der Kontrollgruppe zeigt, dass das Vorliegen des p53arg-Allels bei Abwesenheit des Pro-Allels eine Suszeptibilität für die Entwicklung der Erkrankung in zervikalen Tumoren verleiht, die einen-Hoch-Risiko HPV-Typ aufweisen. Dies ist in deutlichem Kontrast zu anderen Tumoren (Zhang, W. et al., 1992, Gene, 117: 271–275; Birgander, R. et al., 1995, Carcinogenesis, 16: 2233–2236; Weston A. et al., 1994, Carcinogenesis, 15: 583–587; Weston A. et al., 1992, Env. Health Pers., 98: 61–67), worin keine wesentlichen Unterschiede in p53-Polymorpie-Häufigkeiten beobachtet worden sind zwischen Tumor- und Kontrollbiopsien. Die Tatsache, dass das p53Arg-Protein leichter inaktiviert wird, indem es anfälliger für E6-vermittelten proteolytischen Abbau ist, korreliert stark mit den Tumor-p53 Genotyp-Ergebnissen.
Zusätzlich zu der gut dokumentierten Rolle bei zervikalem Krebs, ist postuliert woren, dass HPVs beteiligt sind an der Entwicklung von kutanen Karzinomen. In immunsupprimierten Individuen, wie etwa Renaltransplantat-Empfängern, wird ein breiteres Spektrum viraler Typen in den Läsionen gefunden und im Unterschied zu zervikalen Tumoren enthalten diese Läsionen mehr als einen HPV-Typ.
Zusätzlich zu den früher definierten HPV-Typen sind auch mehrere neu identifizierte EV-bezogene HPV-Sequenzen in Biopsien von RTRs identifiziert worden. Wir erweiterten dann unsere p53-Polymorphismus-Untersuchungen, um Tumore zu umfassen, die von Renaltransplantat-Empfängern stammten, wobei die Ergebnisse von diesen in Tabelle 2 gezeigt sind.
Tabelle 2
Arg- und Pro-Status-p53-Allele in SCCs von Renaltransplantat-Empfängern. Es ist anzumerken, dass im Unterschied zu zervikalen Tumoren verschiedene kutane Läsionen, die von dem gleichen Patienten stammten, häufig mehr als einen HPV-Typ enthalten.

*gibt den Locus-Namen für eine HPV-Sequenz an, die erhältlich ist von der GenBank-Datenbank, für welche die volle Genomsequenz bisher nicht veröffentlicht worden ist (Zugriffsnummern sind in Klammern): HPVRTRx1 (L38918), HPV-Gruppe24 B1 HPVRTRx5 (L38922), HPV-Gruppe B1 HPWS42L1 (X79943), HPV-Gruppe B1 HPWS92L1 (X79943), HPV-Gruppe B1

Diese Ergebnisse zeigen erneut eine ausgesprochene Tumoranfälligkeit, assoziiert mit dem p53arg-Allel mit einem deutlichen Überschuss von Arg (87,5 %) relativ zu Arg/Pro- (12,5 %) und Pro- (0 %) Allelen in diesen kutanen HPV-enthaltenden Tumoren.
Da Biopsien von Tumoren unweigerlich verunreinigt sind mit entweder stromalem Gewebe oder entzündlichen Zellen, waren wir interessiert an der Bestimmung der Wirkung des Mischens von entwerder p53Arg- oder p53Pro-DNA-Templaten in einer einzelnen Reaktion, welche als ein Leitfaden für den Gehalt verunreinigender Nicht-Tumorzellen dienen würde. Als die PCR-Reaktionen durchgeführt wurden unter Verwendung von Plasmid-DNA, die entweder p53Arg- oder p53Pro-Sequenzen in einem Verhältnis von 95:5 oder 5:95 enthielt, unter Verwendung von 100 ng von der jeweiligen DNA als die größte Einbringungsmenge, wurde das Produkt, das aus dem Allel mit kleinerer Kopiezahl abgeleitet war, wirkungsvoll zu dem gleichen Ausmaß amplifiziert wie das der DNA mit höherer Einbringungsmenge, unter diesen Bedingungen (3B), wodurch angezeigt wird, dass die Amplifikation eines Allels nicht beeinflusst wurde durch das Vorliegen des anderen.
Plasmid-DNA, die bekanntermaßen entweder das Arg- oder Pro-Allel, kloniert in einem pcDNA-Vektor, wurde PCR amplifiziert, entweder einzeln oder in der Gegenwart des Plasmids, das das andere Allel enthält, unter Verwendung von Primern, die spezifisch nur ein Allel nachweisen. Die spezifischen Produkte des Arg- (141bp) oder Pro- (277 bp)-Allels wurden nur von dem Plasmid nachgewiesen, das dieses Allel enthält, selbst in der Gegenwart eines Überschusses Kompetitortemplat.
Die Position des Polymorphismus an Codon 72 und die Positionen der Primer, die in der PCR-Studie verwendet werden, sind in 3A angegeben.
Die Unterscheidung von tatsächlich heterozygoten DNA-Proben von denjenigen Tumorbiospien, die verunreinigendes Nicht-Tumorgewebe enthalten, verlief relativ deutlich, da Amplifikation von Genom-DNA von heterozygoten Individuen Produkte erzeugte, die routinemäßig etwa gleiche Intensität aufwiesen und niemals einen zweifachen Unterschied überschritten, wie durch die Quantifizierung der radioaktiven Produkte bestimmt. Zur Abschätzung möglicher stromaler Verunreinigung wurden genomische DNA-Proben, die bekanntermaßen entweder für das Pro- oder Arg-Allel homozygot sind, in gleichen Verhältnissen gemischt, unter Verwendung von 100 ng genomischer Gesamt-DNA als die höhere Eingabemenge. In diesem Fall fanden wir, dass welche DNA auch immer in der untersten Kopie war, diese zu einem viel geringeren Ausmaß amplifiziert wurde als die DNA der höheren Kopie (3C).
Das Mischen der Template erfolgte gemäß 3b, unter Verwendung von 100 ng genomischer Gesamt-DNA als die höchste Eingabemenge.
In nur zwei Proben wurde Verunreinigung mit Nicht-Tumorgewebe nachgewiesen, gemäß Bestimmung des Verhältnisses der PCR-Produkte, worin die Verhältnisse der Intensitäten der Arg/Pro-Produkte zwischen 1:20 und 1:40 lagen, was sehr ähnlich den Bandenmustern war, die durch die bewußt gemischten Proben in 3c erzeugt wurden.
Basierend auf dieser Forschung können in Zusammenhang mit der HPV- assoziierten Erkrankung Individuen mit nur p53arg-Allelen daher so betrachtet werden, dass sie unter einem höheren Risiko der Entwicklung von Malignitäten liegen als Individuen, die mindestens eine Kopie des p53pro-Allels behalten. Dessen bewußt, dass wir leicht eine 5-%ige Verunreinigung unserer Proben mit dem anderen Allel nachweisen können und dass Tumorbiopsien routinemäßig verunreinigt sind mit 10 bis 50 % stromalem Gewebe, legt die Tatsache, dass das Pro-Allel nicht nachgewiesen wurde in der großen Mehrzahl der Tumorbiopsien, nahe, dass die Patienten homozygot für das Arg-Allel waren. Beachtenswert ist auch, dass der Codon 72-Polymorphismus lokalisiert ist in einer in jüngerer Zeit identifizieten SH3-Domäne, die erforderlich war für wirkungsvolle Wachstumssuppression durch p53.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse eine wesentliche Suszeptibilität, die verbunden ist mit dem p53Arg-Allel zur Entwicklung HPV-assoziierter Malignitäten und legen weiterhin nahe, dass p53-polymorphe Varianten nicht funktionell äquivalent sind, wie früher angenommen wurde. Diese Entdeckungen werden einen unmittelbaren Einfluss auf Screeningprogramme haben, da sie nahelegen, dass der p53-Genotyp nun ebenfalls in Betracht gezogen werden muss bei dem Umgang mit Individuen mit anormalen PAP-Abstrichen und/oder zervikaler Neoplasie und Individuen, die immunsupprimiert sind. Solche Programme können Langzeit-Implikationen für eine erhöhte Überwachung und möglicherweise eine frühere Behandlung von Individuen mit HPV-Infektionen und HPV-assoziierten Neoplasien aufweisen.
Die vorliegende Erfindung wird leichter verständlich unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche angegeben sind, um die Erfindung zu veranschaulichen, jedoch nicht ihren Bereich zu begrenzen.
BEISPIEL I
Der p53-Genotyp könnte bestimmt werden in Individuen, die einen anormalen PAP-Abstrich zeigen. Individuen, von denen bestimmt wird, dass sie homozygot sind für p53Arg-Allele (p53Arg/p53Arg) würden daher klassifiziert werden mit größerem Risiko zur Entwicklung HPV-assoziierter zerivikaler Neoplasie und zerivikalem Krebs bzw. zervikalem Karzinom. Die homozygoten p53Arg-Individuen könnten dann durch Kliniker in einer aggressiveren Art behandelt werden als Individuen, die mindestens ein p53Pro-Allel aufweisen.
BEISPIEL II
Beachtlicher Fortschritt besteht in Richtung der Entwicklung eines Impfstoffs gegen HPV zum Verringern des Auftretens zervikaler Neoplasie und zervikalem Krebs bzw. Karzinom. Individuen, von denen bestimmt wurde, dass sie homozygot sind für p53Arg-Allele (p53Arg/p53Arg) würden daher so klassifiziert werden, dass sie unter einem höheren Risiko der Entwicklung HPV-assoziierter zervikaler Neoplasie und zervikalem Karzinom stehen. Die homozygoten p53Arg-Individuen könnten dann bevorzugt geimpft werden, da sie unter dem größten Risiko zur Entwicklung HPV-assoziierter Pathologien, wie etwa Krebs, stehen.
BEISPIEL III
Individuen können aus einer Vielzahl von Gründen immunsupprimiert werden, wie etwa durch Immunsuppressions-Arzneimittel oder infektiöse Mittel, wie etwa HIV, bewirkt. Immunsupprimierte Individuen, von denen bestimmt wurde, dass sie homozygot sind für p53Arg-Allele (p53Arg/p53Arg) würden daher so klassifiziert werden, dass sie unter einem höheren Risiko der Entwicklung HPV-assoziierter Pathologien, wie etwa Krebs, stehen.
Wenngleich die Erfindung in Verbindung mit spezifischen Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, versteht es sich, dass es möglich ist, weitere Modifikationen durchzuführen und diese Anmeldung soll alle Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung umfassen, einschließlich solche Abweichungen von der vorliegenden Veröffentlichung, die innerhalb bekannter oder herkömmlicher Praxis innerhalb der Technik stehen, auf welche sich die Erfindung bezieht, welche in den Bereich der anhängigen Ansprüche fallen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Screeningverfahren zur Identifikation von Personen mit Risiko der Entwicklung eines HPV-assoziierten Krebses, das den Schritt zur Bestimmung des Vorliegens von p53Pro⁷²- oder p53Arg⁷²-Wildtyp-Allelen in einer von einem Patienten gewonnenen biologischen Probe umfasst, worin das Allelmuster p53Arg⁷²/p53⁷²Arg auf einen Risikofaktor der Entwicklung eines HPV-assoziierten Krebses schließen lässt.
Screeningverfahren nach Anspruch 1, worin es sich bei der Erkrankung um genitale Warzen, eine zervikale Neoplasie oder ein zervikales Karzinom handeln kann.
Screeningverfahren nach Anspruch 1, worin der Bestimmungsschritt mindestens aus einem des Folgenden besteht: (a) Amplifikation mittels Polymerasekettenreaktion; (b) Sequenzierung von DNA oder Protein; (c) Hybridisierung mit mindestens einer Sonde, die spezifisch entweder für p53Pro⁷²- oder p53Arg⁷²-DNA ist; und (d) Immunnachweis mit mindestens einem Antikörper, der spezifisch entweder für p53Pro⁷²- oder p53Arg⁷²-Protein zur Identifikation der p53Pro⁷²- oder p53Arg⁷²-Allele darstellt.
Screeningverfahren nach Anspruch 1, worin sich der Patient unter Immunsuppressionstherapie befindet und für Virusinfektionen und Viruspathologien anfälliger ist.
Screeningverfahren nach Anspruch 4, worin die Viruspathologie mit humanen Papillomaviren assoziierter Hautkrebs darstellt.
Screeningverfahren nach Anspruch 1, worin bei jedem HPV-Vakzinationsprogramm p53Arg⁷²/p53Arg⁷²-Patienten zur präferenziellen Vakzination identifiziert werden.
Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3–6, worin die Patientinnen einen abnormen PAP-Abstrich, genitale Warzen oder niedriggradige zervikale Läsionen aufweisen.
Screeningverfahren nach einem der Ansprüche 1–7, worin die Patienten Neugeborene oder Neugeborene von Müttern mit genitalen HPV-Infektionen sind.