CZ247597A3 - Mnohočetné nádorové odchylné růstové geny - Google Patents

Mnohočetné nádorové odchylné růstové geny Download PDF

Info

Publication number
CZ247597A3
CZ247597A3 CZ972475A CZ247597A CZ247597A3 CZ 247597 A3 CZ247597 A3 CZ 247597A3 CZ 972475 A CZ972475 A CZ 972475A CZ 247597 A CZ247597 A CZ 247597A CZ 247597 A3 CZ247597 A3 CZ 247597A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
chromosome
cells
tumors
mag
Prior art date
Application number
CZ972475A
Other languages
English (en)
Inventor
Jörn Bullerdiek
Rafaël Mols
De Ven Willem Jan Marie Van
Henricus Franciscus Petrus Maria Schoenmakers
Original Assignee
K. U. Leuven Research & Development
Jörn Bullerdiek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8220025&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ247597(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by K. U. Leuven Research & Development, Jörn Bullerdiek filed Critical K. U. Leuven Research & Development
Publication of CZ247597A3 publication Critical patent/CZ247597A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

Mnohočetné nádorové odchylné růstové geny
Oblast techniky
Vynález se týká identifikace genové rodiny proteinů vysoce mobilní skupiny (HMG) jako rodiny genů, často souvisejících s odchylným buněčným růstem, které se nacházejí v celé řadě jak benigních, tak maligních nádorů. Vynález se zejména týká identifikace členu genové rodiny proteinů HMG jako genů oblasti zlomového bodu široce aktivního chromozomu 12, který je obsažen v celé řadě nádorů, včetně hemartomů mesenchymálních nádorů (např. plic a prsu), lipomů, pleomorfních adenomů slinných (salivárních) žláz, děložních (uterinních) leiomyomů, angiomyxomů, fibroadenomů plic, polypů děložní sliznice (endometria), aterosklerotických plaků, a dalších benigních nádorů stejně, jako různých maligních nádorů, například včetně sarkomů (např. rabdomyosarkomu, osteosarkomu) a karcinomů (např. plic, žaludku, kůže, štítné žlázy) stejně, jako leukemiů a lymfomů. Vynález se rovněž týká dalších členů genové rodiny proteinů HMG o kterých se zjistilo, že se podílejí na zlomech v chromozomu 6.
Vynález se dále týká identifikace členů rodiny_ LIM proteinů, jako dalšího typu genů specifické zlomové oblasti nádorového typu a častých fúzních partnerů HMG genů v těchto nádorech. Ukázalo se, že LPP gen této rodiny je specifický pro lipomy. Vynález se týká zejména použití členů genové rodiny HMG a LIM proteinů a jejich derivátů při diagnostice a terapii.
·· ·· ·· · ·· ·· ···· ··· ···· ·· · · · · · · ··· • · · · · · ···· · ··· · · ······ ··· ······ ·· · ·· ··
Dosavadní stav techniky
Mnohočetné nezávislé cytogenetické studie se zabývají oblastí ql3-ql5 chromozomu 12 v celé řadě druhů pevných benigních a maligních nádorů. Pokud jde o pevné benigní nádory, lze uplatnění oblasti 12ql3-ql5 často pozorovat u benigních nádorů tukových tkání [Sreekantaiah, C., Leong,
S.L.P., Karakousis, C.P., McGee, D.L., Rappaport, W.D., Villar, H.V., Neal, D., Fleming, S., Wankel, A., Wankel,
A., Herrington, P.N., Carmona, R. a Sandberg, A.A. (1991). Cytogenetic profile of 109 lipomas. Cancer Res. 51: 422433.], uterinních leiomyomů [Nilbert, M. a Heim, S. (1990). Uterine leiomyloma cytogenetics. Genes Chrom. Cancer 2: 313.; Pandis, N., Heim, S., Willen, H., Bardi, G., Loderus, U.M., Mandahl, N. a Mitelman, F. (1991). Chromosome analysis of 96 uterine leiomyomas. Cancer Genet. Cytogenet. 55: 11-18.] a u pleomorfních adenomů slinných žláz [Sandros, J. , Stenman, G. a Mark, J. (1990). Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet. Cytogenet. 44: 153167.; Bullerdiek, J., Wobst, G., Meyer-Bolte, K., Chilla,
R. , Haubrich, J. , Thode, B. a Bartnitzke, S., (1993).
Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histologicalsubtype, and in vitro cellurar behavior. Cancer Genet. Cytogenet. 65: 2 7-31'i]. Uplatnění stejné oblasti bylo rovněž z jištěno v případě endometriálních polypů [Walter, T.A., Xuan Fan,
S. , Medchill, M.T., Berger, C.S., Decker, H.J.H. a
Sandberg, A.A. (1989). Inv (12) (pll.2ql3) in an endometrial polyp. Cancer Genet. Cytogenet. 41: 99-103.;
Vanni, R. , Dal Cin, P., Marras, S., Moerman, P., Andrtia, A., Valdes, E., Deprest, J. a Van den Berghe, H., (1993).
Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by
4
12ql3-ql5 changes. Cancer Genet. Cytogenet. 68: 32-33.], hemangiopericytomu [Mandahl, N., Orndal, C., Heim, S., Willen, H., Rydholm, A., Bauer, H.C.F. a Mitelman, F. (1993). Aberrations of chromosome segment12ql3-15 characterize a subgroup of hemangiopericytomas. Cancer 71: 3009-3013.] a chondromatózních nádorů [Mandahl, N., Heim,
S. , Arheden, K., Rydholm, A., Willen, H. a Mitelman, F. , (1989). Chromosomal rearrangements in chondromatous tumors. Cancer 65: 242-248.; Bridge, J.A., Persons, D.L., Neff,
J. R. a Bhatia, P. (1992). Clonal karyotypic aberrations in enchonďroma. Cancer Detect. Prev. 16: 215-219.; Hirabayashi, Y., Yoshida, M.A., Ikeuchi, T., Ishida, T., Kojima, T. Higaki, S., Machinami, R. a Tonomura, A. (1992). Chromosome rearrangements at 12ql2 in two cases of chondrosarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 60: 35-40.;
Mandahl, N., Willen, H., Rydholm, A. a Mitelman, F. (1993). Rearrangement of band ql3 on both chromosomes 12 in a periosteal chondroma. Genes Chrom. Cancer 6: 121-123.]. V nedávné době bylo uplatnění chromozomové oblasti 12ql3-ql5 zaznamenáno rovněž v pulmonálním chondroidním hemartomu [Dal Cín, P., Kools, P., De Jonge, I., Moerman, Ph. , Van de Ven W., Van den Berghe H. (1993a). Rearrangement of 12ql415 in Pulmonary Chondroid Hamartoma. Genes Chrom. Cancer, 8: 131-133.; Schoenberg Fejzo, M., Yoon, S.J., Montgomery,
K. . Rein, M. S . , Weremowicz, S . , Krautor, K. S . r Dorman,
T. E., Fletcher, J.A., Mao, J. , Moir, D.T., Kucherlapati, R.S. a Morton, C.C. (1995). Identification of a YAC spanning the translocation breakpoints in uterine leiomyomata, pulmonary chondroid hamartoma and lipoma. Physical mapping of the 12ql4-15 breakpoint region in uterine leiomyomata. Genomics 26: 265-275.]. Konečně v několika případech byly zveřejněny zprávy, týkající se pevných nádorů s uplatněním chromozomové oblasti 12ql3-ql5, např. nádorů prsu [Birdsal, S.H., MacLenan, K.A. a Gusterson, B.A. (1992). t(6;12) (q23;ql3) a t(10;16) (q22;pll) in a phyllodes tumor of the breast. Cancer Genet.
Cytogenet. 60: 74-77.; Rohen, C., Bonk, U., Staats, B.,
Bartnizke, S. a Bullerdiek, J. (1993). Two human breast tumors with translocations involving 12ql3-15 as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 69: 6971.], difúzních astrocytomů [Jenkins, R.B., Kimmell, D.W., Moertel, C.A., Schulz, C.A., Menezes, R.M., Scheihauer, B., Kelly, P.J. a Dewald, G.W. (1989). Recurrent cytogenetic abnormalities in 80 gliomas. Cytogenet. Cell Genet. 51: 1019.] a buněčného nádoru kosti [Noguera, R. , LlimbartBosch, A., Lopez-Gines, C. , Carda, C. a Fernandez, Cl. (1989) . Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;19) (ql3;ql3). Virchows Archiv A Pathol.
Anat. 415: 377-382.]. Maligní nádorové typy s opakujícími se odchylkami v oblasti 12ql3-Q15 zahrnují myxoidní liposarkom [Turc-Carel, C., Limon, J. , Dal Cin, P,, Rao,
U., Karakousis, C. a Sandberg, A.A. (1986). Cytogenetic studies of adipose tissue tumours. II. Recurrent reciprocal tranlocation t(12;16) (ql3;pll) in myxoid liposarcomas. Cancer Genet. Cytogenet. 23: 291-299.], sarkom čiré buňky měkké tkáně [Rodriguez, E., Sreekantaiah, C., Reuter, V.E., Motzer, R.J. a Chaganti, R.S.K. (1992). t(12;22)_____(ql3;q!3) and trisomy 8 are nonrandom aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet. Cytogenet. 64: 107-110.; Reeves,
B.R., Fletcher, C.D.M. Translocation t(12;ql3) rearrangement in clear Cytogenet. 64: 101-103 a Gusterson, (ql3;ql3) is cell sarcoma.
; Fletcher,
B.A. (1992). a nonrandom Cancer Genet. J.A. (1992) .
Translocation (12;12) (ql3-14;ql2) is a nonrandom abeeation • · • · in soft-tissue clear-cell sarcoma. Genes. Chrom. Cancer 5: 184.] a podskupinu rabdomyo sarkomu [Roberts, P., Browne,
C.F., Lewis, I.J., Bailey, C.C., Špice, R.D. , Williams, J.
a Batcup, G._______(1992) . 12ql3 Occurrence, Cancer Genet.
Cytogenet. 60: 135-140.].
Ačkoliv tyto studie ukazují, že stejná cytogenetická oblast chromozomu 12 je často místem, kde dochází v těchto pevných nádorech k chromozómovým odchylkám a podobným translokacím, není ještě stále známá přesná povaha zlomových bodů chromozomu 12 různých nádorů a rovněž doposud nebylo stanoveno, které geny jsou přímo ovlivněny translokací.
zabývajících se H.F.P.M., Kools, Bartnitzke, S. ,
V předcházejících studiích, fyzikálním mapováním [Schoenmakers,
P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B.,
Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.] byl zlomový bod chromozomu 12q v lipomu, pleomorfním adenomu slinných žláz a děložním leiomyomu zmapován mezi místem D12S8 a genem CHOP a ukázalo se, že D12S8 je umístěno daleko od CHOP. V nedávné době se
_.pomocí.__.a_nalýzy FISH .^.rovněž_______zjist.ilo, _že zlomové__body chromozomu 12q v hemartomu prsu, angiomyxomu a multiplexních pulmonálních chondroidních hemartomech jsou mapovány v tomto DNA intervalu. Jako strukturní přístup pro definování DNA oblasti, vymezující tyto zlomové body, volí současní vynálezci při pokusech molekulárně klonovat geny, ovlivněné chromozómovými 12ql2-ql5 odchylkami v různých nádorech, směrové procházení chromozomem.
• 9
9 » 4 » 4 ·
Jako počáteční bod pro procházení chromozomem se použilo místo D12S8. Během těchto studií se ukázalo, že chromozomové zlomové body, které jsou přítomny v celé řadě buněčných linií děložního leiomyomu, se shlukují uvnitř 445 kb chromozomového segmentu, který byl označen jako Uterine Leiomyoma Cluster Region na chromozomu 12 (ULCR12) [Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.]. Následně se zjistilo, že 1,7 Mb oblast na chromozomu 12 vymezuje zlomové body chromozomu 12 uterinních leiomyomových buněk, lipomových buněk a adenomových buněk slinných žláz s oblastmi shluků zlomových bodů různých nádorových typů překryvů [Van de Ven, W.J.M. , Schoenmakers, H.F.P.M, Wanschura, S., Kazmierczak, B., Kools, P.F.J., Geurtus, J.M.W., Bartnitzke, S., Van den Berghe, H. a Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12ql3-ql5 implicated in various solid tumors. Genes Chrom. & Cancer. 12: 296-303.;
Genes, Chromosome & Cancer 12:296-303 (1995);
Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region on Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors;
Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.J. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe, and Jórn Bullerdiek;
Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium <W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.);
·· • ·
Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.).]. Tato 1,7 Mb oblast na dlouhém rameni chromozomu 12, která zřejmě obsahuje ULCR12, byla označena jako „oblast mnohočetr.ých odchylek (Multiple Aberration Region (MAR)). Při podrobném mapováni oblasti se MAR nedávno označila jako 12ql5.
Ukázalo se tedy, že v podstatě všechny zlomové body mapy chromozomu 12 se nachází v 1,7 Mb oblasti, označené zde jako „oblast mnohočetných odchylek nebo-li MAR. Výzkum dále odhalil, že v této oblasti lze identifikovat člena genové rodiny proteinů HMG, kterým je HMGI-C gen, jako postulátovaný vícenádorový odchylný růstový gen (MAG). Totéž se vztahuje na členy LIM rodiny, u nichž se rovněž zjistilo, že mohou být zahrnuty v chromozómových odchylkách. Z těchto členů se zejména pro lipom-preferovaný partnerský gen (LPP), odvozený od chromozomu 3, značně uplatňuje v lipomech.
LIM proteiny jsou proteiny, nesoucí cysteinové-zinkem obohacené-vazebné domény, tzv. LIM domény. Jsou zahrnuty v interakcích protein-protein [viz Sanchez-Garcia, I. & Rabbitts, T. (1994) The LIM domain: a new structural motiv found in zinc-finger-like proteins. Trends in Genetics 10(9), 315-320.]. Jedním ze členů proteinové rodiny je nyní ob jevený LPP .protein,__zrna p o_v a n ý. _v__ch romo_z omu ,...3., __ ________
Podstata vynálezu
Jak již bylo uvedeno, vynález se týká odchylek v HMGI-C genu na chromozomu 12 a LPP genu na chromozomu 3, který se použil jako model pro určení obecnějšího rámce uplatnění členů HMG a LIM genových rodin jak v benigních, * ·
tak v maligních nádorech. Aby se demonstrovalo to, že existuje obecnější rámec genové rodiny, který, pokud je ovlivněn chromozómovým přeuspořádáním, způsobuje nádorový růst příslušné skupiny, ukázali současní vynálezci, že se , HMGI(Y) gen, který je členem HMG rodiny, uplatňuje na zlomech v chromozomu 6.
Ačkoliv jak HMG, tak LIM genová rodina jsou samy o sobě známé, teprve současný vynález předpokládá vzájemné vztahy mezi těmito rodinami a chromozómovými odchylkami indukujícími nádor, např. translokacemi, delecemi, inzercemi a inverzemi. Kromě toho se dosud neuvažovalo, že se změny úrovně fyziologické exprese členů genové rodiny pravděpodobně rovněž uplatňují v nádorové evoluci. Vynález tedy ukazuje, že v normálních, dospělých buňkách je expresívní úroveň HMGI-C genu prakticky nedetekovatelná, zatímco u odchylných růstových buněk je expresívní úroveň podstatně zvýšena.
Vycházeje z těchto zjištění, vynález poskytuje členy genových rodin nebo jejich deriváty v izolované formě, a způsob jejich použití při diagnostických a terapeutických aplikacích. Kromě toho mohou být znalosti, týkající se umístění zmíněných genů a nukleotidové sekvence těchto genů, použity při studiu jejich přeuspořádání nebo exprese ______a při identifikaci možného_zvýšení nebo__snížení jejich expresívní úrovně a jejich účinků na buněčný růst. Na základě těchto informací lze navrhnout diagnostické testy nebo terapeutické léčebné metody.
Výraz „mnohonádorový odchylný růstový (nebo-li MAG) gen, jak je použit v této patentové přihlášce, se použije pro označení uplatnění těchto typů genů v různých typech karcinomů. Tento výraz označuje všechny HMG a LIM genové ···· ··· · · · · ·· · · ··· · · · · • · ♦ · · · ···· · ··· · · ······ * · · ··«· ·· · ·· ·· rodiny, které se uplatňují při nefyziologickém proliferačním růstu, a zejména při růstu maligních nebo benigních nádorů, včetně aterosklerotických plaků. Nicméně rovněž se , z jistilo, že i zlomy vně aktuálního genu, .. které se nacházejí v jeho těsném okolí, mohou způsobovat odchylný růst. Výraz „MAG gen tedy zahrnuje i bezprostřední okolí tohoto genu. Odborník v daném oboru ví, že výrazem „bezprostřední okolí lze rozumět okolí genu, jehož zlomy nebo přeuspořádání povedou k již definovanému nefyziologickému proliferačnímu růstu.
Výraz „standardní buňka se používá pro označení buňky, ve které se vyskytuje odchylný chromozom, nebo buňky, mající fyziologickou expresívní úroveň relevantního genu. „Standardní neboli „normální chromozom označuje neodchylný chromozom.
Vynález poskytuje různá diagnostická a terapeutická využití, která se zakládají na informacích, odvoditelných z genů. Tyto informace nejen, že vymezují nukleotidovou sekvenci, nebo-li sekvenci aminokyselin genového produktu odvozeného z tohoto genu, ale rovněž zahrnují úrovně transkripce nebo translace uvedeného genu.
Vynález se tedy na jedné straně zabývá myšlenkou, že odchylky buněčného růstu mohou být přímo nebo nepřímo způsobeny fyzickými zlomy, ke' kterým dochází v genu nebo jeho bezprostředním okolí. Na druhé straně se vynález zabývá myšlenkou, že odchylka buněčného růstu může být způsobena nefyziologickou expresivní úrovní zmíněného genu. Tuto nefyziologickou expresivní úroveň může způsobit zlom, nebo může být důsledkem jiného stimulu, který aktivuje nebo deaktivuje zmíněný gen. Doposud nebyl objasněn přesný mechanizmus nebo původ odchylného buněčného růstu. Nicméně ·· ·· * «I · · · · · · • · 9 · · · · • · · ·· C ···· • · · · · · ···· ·· *· · ♦ · ·· • · · · « · ·· » · · · · • · · ·· ·· přesná znalost tohoto mechanizmu není pro diagnostických a terapeutických metod nezbytná.
definování
Diagnostické metody podle vynálezu se tedy zakládají na faktu, že odchylky v chromozomu způsobuje detekovatelnou změnu chromozomového vzhledu nebo biochemického chování. Translokace má například za následek to, že první část chromozomu (a následně MAG gen) je substituována další (druhou) částí (dále označované jako „první a druhá substituční část). První část se bude rovněž objevovat v druhém chromozomu, ze kterého pochází druhá část. Potom se vytvoří následné hybridy mezi zbývajícími částmi obou chromozomů (nebo v případech tripletové i vícenásobné translokace) a substituovanou částí, poskytnutou jejich translokačními partnery, což, vzhledem k tomu, že se nyní zjistilo, že se zlomy objevují v MAG genu, povede ke vzniku hybridních genových produktů MAG genu. Signální znaky (markéry), například hybridizovatelné molekuly jako RNA, DNA nebo DNA/RNA hybridy nebo protilátky, budou schopné detekovat tyto hybridy jak na DNA úrovni, tak na RNA, nebo proteinové úrovni.
Například transkript hybridu bude ještě zahrnovat oblast poskytnutou zbývající částí genu/chromozomu, ale _z_trati_ oblast poskytnutou substituovanou část_í,__ kt e rá byla translokována. V případě inverzí, delatací, a inzercí, může být zmíněný gen postižen stejným způsobem.
Translokace jsou obvykle rovněž cytogeneticky detekovatelné. Další odchylky se zjišťují obtížněji, protože na cytogenetické úrovni často nejsou viditelné. Vynález nyní poskytuje možnosti diagnostikovat všechny tyto typy chromozómových odchylek.
• ·
Při translokacích signální znaky (markéry) nebo sondy na bázi MAG genu pro zbývající a substituované části chromozomu in sítu detekují zbývající část na původním chromozomu, ale substituční část na druhém translokačním partnerovi.
Například v případě inverzí se budou dvě sondy hybridizovat ve standardním genu v určité vzdálenosti. Tato vzdálenost se však může v důsledku inverze měnit. Inverze in sítu může být tedy vizualizována označením sady vhodných sond stejnými nebo odlišnými detekovatelnými signálními znaky (markéry), například fluorescenčními značkami. Deletace a inzerce lze detekovat podobným způsobem.
Výše popsané výhodné provádět aplikace in šitu podle vynálezu je pomocí technik FISH (fluorescenční hybridizace in sítu). Signálními znaky jsou například dva kosmidy, z nichž jeden obsahuje exony 1 až 3 MAG genu, zatímco druhý obsahuje exony 4 a 5. Oba kosmidy jsou označeny rozdílnými fluorescenčními signálními znaky, například modrým a žlutým. Normální chromozom bude vykazovat kombinaci obou označení, takže poskytne zelený signál, zatímco translokace je viditelná jako modrý signál na zbývající části jednoho chromozomu (např. 12), zatímco žlutý signál se nachází na druhém chromozomu, obsahujícím substituční část. V případě, kdy se pro obě sondy použijí stejná označení, bude intenzita signálu na normálním chromozomu 100%, zatímco signál na odchylných chromozomech bude 50%. V případě inverzí se jeden ze signálů posune z jednoho místa na normálním chromozomu do dalšího na odchylném chromozomu.
• · • ·
Π τ-r Y~\ r\ V\ O Τ» τ'τ r** Τ' ν' 1 ·ί 1/· -> Z-, 4 4 z> +- V-» —' λ .—. v· λ ▼ » v. Ά ~~. í FR »»Á ^- i· v νγϋς; po^ociii ý <-ui o -i. j_ jv cx j. jc uicva diuviiaii± z,avc:ou nebo invertované části se zlomy zpravidla, referenční vzorek. Zpravidla bývá ovlivněn pouze jeden ze dvou chromozomů. Takže bude velmi vhodné použít jako vnitřní referenci normální chromozom. Navíc je důležité, aby se jeden ze signálních znaků zvolil na zbývající nebo-li nezměněné části chromozomu a druhý na substituované V případě MAG genu chromozomu 12, jak ukazuje předložený vynález, nacházejí ve velkém intronu mezi exony 3 a 4. Kromě toho se zlomy detekovaly mezi exony 4 a 5. Jsou tedy velmi vhodné sondy ha bázi exonů 1 až 3 a 4 a 5 nebo sondy buď na bázi exonu 4 nebo exonu 5. Alternativně lze použít kombinaci sond na bázi translokačních nebo fúzních partnerů. Pro identifikaci lipomů lze například použít sondy na bázi exonů 1 až 3 HMGI-C genu na jedné straně, a na bázi LIM domén LPP genu na straně druhé.
Navíc se zjistilo, že se zlomy mohou vyskytovat rovněž vně genu, tj . v jeho 5' nebo 3' poloze. Volba sond bude potom samozřejmě zahrnovat alespoň jednu sondu hybridizující na DNA sekvenci umístěné v 5' nebo 3' poloze genu.
Výraz „sondy”, jak je zde použit, který by měl být interpretován v širším slova smyslu, zahrnuje neomezujícím . . = . z p ů s ob em ] i ne á r n i DN A nebo RN A. . ř et ě z ce , umě 3. é kvas ni c o v é chromozomy (YAC), nebo kruhové DNA formy, například plasmidy, fágy, kosmidy atd..
Tyto in šitu metody lze použít na metafázové a interfázové chromozomy.
Kromě výše popsaných metod in šitu lze různé diagnostické techniky provádět na biochemičtější úrovni, *· φφ • · · a • · i
Φ φ « • · a • · · · · · »· · ΦΦ φφ
Φ · · · · a
ΦΦΦ φ ΦΦΦ φφφφφ φ φφφφ a «Λ —. bi ί 1 xj -ι «, 1ζ 1 <4 r-f τν» VI iiapixj\.±au na ζ_α. jx._ucí<xo ^hicxí změn fyziologické expresivní úrovně genu.
Základem metod, určených pro sledováni . změn chromozomového biochemického chováni, je fakt, že vhodnou volbou sond lze na gelu nebo membráně detekovat změny délek nebo složeni genu, transktriptu nebo proteinu. Změny délky, jsou viditelné, protože normální gen, transkript(y), nebo protein(y) budou patrné na jiném místě gelu nebo membrány než odchylný gen, transkript, resp. protein. V případě translokace se objeví větší počet skvrn, než je normální počet skvrn.
Takže vycházeje z výše popsaných principů, vynález poskytuje způsob diagnostikování buněk majících nefyziologickou proliferační kapacitu, přičemž tento způsob zahrnuje odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány, izolaci vhodné makromolekuly příbuzné s MAG genem z těchto buněk, a analýzování takto získané makromolekuly, které se provede srovnáním této makromolekuly s referenční molekulou pocházející z buněk, které nevykazují nefyziologickou proliferační kapacitu, výhodně izolovanou ze stejného jedince. Makromolekulou, týkající se MAG genu, může být tedy DNA, RNA nebo protein. MAG gen může být buď členem HMG rodiny nebo LIM rodiny.
Specifické provedení tohoto typu diagnostické metody podle vynálezu zahrnuje odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány; extrahování jejich celé RNA; připravení prvního řetězce cDNA mRNA druhů v celkovém RNA extraktu nebo poly-A-izolované frakce (frakcí), přičemž cDNA obsahuje vhodný konec; provádění PCR za použití MAG genového specifického primeru a koncového-specifického primeru za účelem amplifikace MAG genových specifikovaných • · ·· • · >
···· ·β ·· · ·· »·
14.
x-.7~\K77\ · χ-\ *—» -λ -ν- ζ-~\ τ τ ο OC^GX X-/ V CiAi.
PCR ριτού-ίΐ k t ύ ns cfslu Ζ3 úcsJLsrú získání vzoru pásů; vyhodnocení přítomnosti odchylných pásů porovnáním se standardními pásy, výhodně pocházejícími ze stejného individua. . .....-......... .....................
Alternativní amplifikaci lze provádět pomocí NASBA techniky (amplifikace na bázi sekvence nukleové kyseliny) [Compton, J. (1991). Nucleic acid sequence-based amplification. Nátuře 350, 91-92.] nebo jejích variant.
U dalšího provedení způsob zahrnuje odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány; izolování celého proteinu z těchto buněk; separování celkového proteinu na gelu za účelem získání v podstatě individuálních pásů, případně přemístění pásů na Westernovu membránu; hybridizaci takto získaných pásů s protilátkami namířenými proti části proteinu kódované zbývající Částí MAG genu a proti části proteinu kódované substituční částí MAG genu; vizualizaci reakcí antigen-protilátka; a stanovení přítomnosti odchylných pásů srovnáním s pásy, získanými ze standardních proteinů, výhodně pocházejících ze stejného individua.
U dalšího provedení způsob zahrnuje odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány; izolování celkové DNA z těchto buněk; vyluhování DNA jedním nebo několika restrikčními enzymy, tzv. „vzácně štěpícími enzymy (zpravidla „6 nebo více vzácně štěpících enzymů); separování takto připraveného výluhu na gelu za účelem získání separačního vzoru, případně přenesení separačního vzoru na Southernovu membránu; hybridizaci separačního .vzoru v gelu nebo na membráně sadou sond za hybridizačních podmínek; vizualizaci hybridizaci a stanovení přítomnosti ····· ·9 · cí. c. i i _y inytui )ásů s 2?c vnán iin ss s t snúciirúnimi pásy,- výhodně pocházejícími ze stejného individua.
Změny expresivní úrovně genu lze detekovat měřením úrovní mRNA nebo proteinových úrovní pomocí vhodné sondy.
Diagnostické metody, založené na abnormálních expresních úrovních genu, mohou zahrnovat odebrání vzorku buněk, které mají být diagnostikovány; izolování mRNA z těchto buněk; a stanovení přítomnosti a/nebo (relativního) množství mRNA, získané transkripcí z MAG genu srovnáním s kontrolním vzorkem. Ke stanovení přítomnosti nebo (relativního) množství mRNA lze použít amplifikaci alespoň části mRNA MAG. genu, pomocí RT-PCR nebo podobných amplifikačních technik. U alternativního provedení lze expresní úroveň stanovit určením přítomnosti nebo množství genového produktu (například proteinu), například pomocí monoklonálních protilátek.
Diagnostické metody podle vynálezu lze použít pro diagnostikování chorob, přičemž buňky, mající nefyziologickou proliferační kapacitu, se zvolí ze skupiny, zahrnující benigní nádory, včetně hemartomů mesenchymálních nádorů (např. plic a prsu), lipomů, pleomorfních adenomů slinných (salivárních) žláz, děložních (uterinních) leiomyomů, angiomyxomů, fibro-adenomů plic, polypů děložní
(např. rabdomyosarkomu,
prsu, plic, kůže, štítné
a lymfomů. Vynález se
léčbu tzv. benigních a
sliznice (endometria), aterosklerotických plaků, a dalších benigních nádorů stejně, jako různých maligních nádorů, například včetně sarkomů osteosarkomu) a karcinomů (např. žlázy) stejně, jako leukemiů neomezuje pouze na diagnózu a maligních pevných nádorů, ale jeho principy lze rovněž dp.
o-’’*' O +* z'. Ί z-\ Ζ-Ύ i Cl l/ó 1 k, VXV<) J-k,
······ ··· ···· ·· ·· · ·· «· r£Hnr’ napři klad leukémie a lymfomy.
Nedávno vydané publikace naznačily, že aterosklerotické plaky rovněž zahrnují abnormální proliferaci [Casalone, R. a kol. (1991) Cytogenetic analysis reveals clonal proliferation of smooth muscle cells in atherosclerotic plaques. Hum. Gen. 87, 139-143.], zejména buněk hladkého svalstva, a že aterosklerotické plaky tvoří benigní nádory [Vanni, R. a kol. (1990) Atherosclerotic plaque as a benign tumor. Cancer Genet. Cytogenet. 47, 273-274.]. Tento typ poruchy může být rovněž chápán jako možná indikace při použití MAG genové rodiny, zejména při diagnostických a terapeutických aplikacích.
Jak již bylo naznačeno výše, zjistilo se, že v určitých maligních nádorech je zvýšena expresní úroveň HMG genů [Giancotti, V., a kol. Elevated levels of a specific class of nuclear phosphoproteins in cells transformed with ras and v-mos oncogenes and co-transfection with c-myc and polyoma middle T. genes. EMBO J. 6, 1981-1987 (1987).]. Dosud nebyl zjištěn důvod tohoto pozorovaného jevu. Vynález se tedy dále zaměřuje na provádění identifikace MAG genů v rámci terapie. Vynález například poskytuje protismyslné molekuly nebo-li expresivní inhibitory MAG genu, použitelné pří. léčbě chorob, zahrnujících buňky, které . mají nefyziologickou proliferační kapacitu modulací exprese genu. Nefyziologická vysoká exprese může být . tedy normalizována protismyslnou RNA, která se buď zavede do buňky, nebo exprimuje touto buňkou, a naváže se na mRNA nebo protilátky nasměrované proti genovému produktu, což může mít zase za následek normalizaci buněčného růstu. Příklady ukáží, že exprese protismyslné RNA v leukemických • · · · buňkách způsobí zpětnou diferenciaci buněk do normálního stavu.
Vynález tedy poskytuje deriváty MAG genů a/nebo jeho bezprostředního okolí, použitelné při diagnóze a přípravě terapeutických kompozic, přičemž tyto deriváty se zvolí ze skupiny, zahrnující smyslnou a protismyslnou cDNA nebo její fragmenty, transkripty genů, nebo jejich fragmenty, protismyslnou RNA, molekulu, indukující trojitou šroubovici, nebo další typy „transkripčních svorek, fragmentů genů nebo jeho komplementárního řetězce, proteiny kódované genem nebo jejich fragmenty proteinové nukleové kyseliny (PNA), protilátky směřující proti genu cDNA transkriptu proteinu nebo jejich fragmentů, a stejně tak fragmenty protilátky. Kromě použití přímých derivátů genů a jejich okolí (lemovacích sekvencí) při diagnóze a terapii, lze pro terapeutické aplikace podle vynálezu použít rovněž další molekuly jako expresní inhibitory nebo expresní zesilovače. Příkladem tohoto typu molekul jsou ribozymy, které ničí RNA molekuly.
Kromě výše popsaných terapeutických a diagnostických metod, lze principy vynálezu rovněž použít při produkci transgenního zvířecího modelu pro testování léčiv, určených pro léčení maligních nebo benigních nádorů a a t e ro.s k 1 e r o t i c kých p 1 a ků, =«- s ou v-i s e j i c i ch s MAG genem. Jeden z příkladů popisuje produkci takového zvířecího modelu.
Je zřejmé, že principy vynálezu jsou zde ilustrovány pouze na HMGI-C genovém mapování chromozomu 12 a HMGI(Y) genovém mapování na . chromozomu 6, a LPP genu na chromozomu 3. Na základě informací, poskytnutých touto přihláškou, je odborník schopen izolovat a sekvencovat odpovídající geny genové rodiny a aplikovat principy tohoto • · ·· • · vynálezu použitím genu a jeho sekvence, aniž by překročil rámec obecného konceptu tohoto vynálezu.
Vynález se stane zřejmějším po prostudování následujících konkrétních příkladů, které však mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1
Tento obrázek znázorňuje širokorozsahovou fyzikální mapu 6 Mb oblasti na dlouhém rameni lidského chromozómu 12, odvozenou z YAC kontigu obsahujícího 75 vzájemně se překrývajících CEPH YAC klonů a pokrývajícího zlomové body chromozómu 12q, které jsou přítomny v celé řadě různých benigních pevných nádorů. Širokorozsahovou fyzikální mapu kompozitní genomové DNA překrytou YAC inzerty reprezentuje černá souvislá čára a relativní polohy různých restrikčních míst vzácně štěpících enzymů. DNA oblasti, ve kterých by mohla být restrikčního polymorfní nalezena další enzymu, jsou štěpící místa příslušného označeny šipkami. Místa restrikční endonukleázy jsou označena hvězdičkami. Izolované a definované DNA signální znaky jsou zobrazeny zeleně. Získané DNA signální (markéry) znaky jsou znázorněny v rámečcích a jsou označeny pomocí akronymu (viz rovněž tabulka
II)
Relativní polohy těchto DNA signálních znaků (markérů) v širokorozsahové fyzikální mapě jsou naznačeny a ty, které odpovídají příslušným YAC koncům jsou spojeny s těmito polohami pomocí přerušované čáry.
·· ·· ·· · ·· ·· • · · » · · * · · · • · · · · · · · · ·· • · · · · · ···♦ « ·«· · «
Některé DNA signální znaky byly přiřazeny k DNA intervalu a ten byl označen pomocí šipek. Pro DNA signální znaky v bílých rámečcích byly vyvinuty STS a příměrové sady, které j sou uvedeny v tabulce II. Pro DNA signální znaky - ve žlutých rámečcích nebyly vyvinuty žádné příměrové sady. V mapě jsou rovněž naznačeny DNA intervaly zahrnující RAP1B, EST01096 nebo IFNG. Na místě, kde je to aplikovatelné, jsou použita D číselná označení. Pod širokorozsahovou fyzikální mapou jsou velikosti a relativní polohy vzájemně se překrývajících klonů, spadajících do konvenční širokorozsahové fyzikální mapy, vyjádřeny pomocí nepřerušovaných modrých čar. DNA oblasti YAC inzertů, které neodpovídají konvenční širokorozsahové restrikční mapě jsou reprezentovány přerušovanými modrými čárami. Rovněž je zde uveden seznam CEPH adres mikrotitrových ploten pro YAC klony. Dále je dána organizace YAC kontigu na chromozómu 12. Relativní polohy ULCR12 a MAR jsou označeny červenými plnými čarami, označenými pomocí odpovídajících akronymů. Přístupová čísla STS, neuvedená v tabulce I: CH9 (#U27142); RM1(#U29049); RM110 (#U29022); RM111 (#U29023) ; RM130 (#U27139); RM131 (#U29001); RM132 (#U27138); RM133 (#U27137). Restrikční místa: B: BssHII; K: KspI (=SacII); M: Mlul; N: Notl; P: Pvul; Sf: Sfil.
Obrázek 2
Tento obrázek znázorňuje kontig vzájemně se překrývajících kosmidů, širokorozpěťovou restrikci a STS mapu, pokrývající přibližně 445 kb segment MAR. Kontigové prvky jsou číselně označeny a definovány v níže uvedeném seznamu. LL12NC01-odvozené kosmidové klony jsou pojmenovány po adresách svých mikrotitrových ploten. Seznam »· ·· • · · přístupových čísel do genobanky (#) různých STS je rovněž uveden níže. STS jsou uvedeny ve zkrácené formě, například RM33 namísto STS 12-RM33. 40 kb mezera mezi STS „K a „O v kosmidovém kontigu byla překryta λ klony (klony 38 a 40) a PCR produkty (klony 37 a 39). Na obrázku je rovněž uvedena orientace kontigu na dlouhém rameni chromozomu 12 stejně, jako pořadí 37 STS (označených v rámečcích nebo označených pomocí zakroužkovaných velkých písmen). Šikmé čáry a šipky okolo některých STS symbolů v horní části obrázku vyznačují oblast, ve které byly určeny příslušné STS. Je třeba uvést, že kosmidový kontig je označen měřítkem; černé čtverečky označují STS kosmidových konců, zatímco přítomnost STS odpovídajících vnitřními kosmidovými sekvencemi je znázorněna pomocí teček. Širokorozsahová restrikční mapa: Bs: BssHII; K: KspI (=SacII); M: Mlul; N: Notl; P. Pvul; Sf: Sfil. Ve spodní části obrázku jsou znázorněny detailní restrikční mapy, jejichž oblasti obsahují exony (žluté rámečky) HMGI-C genu. Nekódující sekvence jsou prezentovány pomocí prázdných rámečků a kódující sekvence pomocí černých rámečků. NA obrázku jsou rovněž naznačeny zjištěné velikosti (kb) intronů. Relativní polohy translační iniciačního (ATG) a translačního koncového (TAG) kodonu v HMGI-C genu stejně, jako předpokládaný poly-adenylační signál jsou označeny pomocí šipek. Podrobná restrikční .mapa.:___B: BamHI; E:. EcoRI;__^H.:_.H.injdITT,. -MAR: oblast mnohočetný,ch (multiplexních) abnormalit; DBD: doména vážící DNA.
1=140A3 11=142G8 21=124D8 31=59A1 41=128A2 51=65E6
2=202Α1 12=154A10 22=128A7 32=101D8 42=142H1 52=196E1
3=78F11 13=163Dl 23=129F9 33=175C7 43=204A10.....53=215A8
4=80C9 14=42H7 24=181C1 34=185H2 44=145E1 54=147G8
5=109B12 : 15=113A5 25=238E1 35=189C2 45=245E8 55=211A9
6=148C12 ( 16=191H5 26=69B1 36=154B12 46=154F9 56=22D8
7=14H6 17=248E4 27=260C7 37=pRMl50 47=62D8 57=116B7
8=51F8 18=33H7 28=156A4 38=pRM144 48=104A4 58=144D12
9=57C3 19=50D7 29=27E12 39=PKXL 49=184A9
10=86A10 i 20=68B12 30=46G3 40=PRM147 50=56C2
A = STS 12-EM12 (#U27145) I = STS 12-CH12 (#U27153)
Q = STS 12-RM120 (#U27161) B = STS 12-EM30 (#U27146)
J = STS 12-EM10 (#U27154) R = STS 12-RM118 (#U27162)
C = STS 12-EM14 (#U27147) K = STS 12-EM37 (#U27155)
S = STS 12-RM119 (#U27163) D = STS 12-EM31 (#U27148)
L = STS 12-RM146 (#U27156) T = STS 12-EM2 (#U27164)
E = STS 12-CH11 (#U27149) M = STS 12-RM145 (#U27157)
U = STS 12-EM4 (#U27165) F = STS 12-EM18 (#U27150)
N = STS 12-RM151 (#U27158) V = STS 12-EM3 (#U27166)
G = STS 12-EM11 (#U27151) 0 = STS 12-EM16 (#U27159)
W = STS 12-EM15 (#U27167) H = STS 12-CH10 (#U27152)
P = STS 12-EM1 (#U27160) X = STS 12-EM17 (#U27168)
STS 12-CH5 (#U27136) STS 12-CH9 (#U27142)
STS 12-RM33 (#U27131) STS 12-RM53 (#U27134)
STS 12-RM76 (#U27132) STS 12-RM86 (#U27133)
STS 12-RM98 (#U27147) STS 12-RM99 (#U27130)
STS 12-RM103 (#U27189) STS 12-RM130 (#U27139)
STS 12-RM132 (#U27138) STS 12-RM133 (#U27137)
STS 12-RM151 (#U27158)
o O o
- 9 · -» · »
00 • O · · ··· ···· o·· o·»· o ooo • O ··· 999999 9999 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 9 9 9 9 9 9 9
Obrázek 3
Tento obrázek schematicky znázorňuje FISH mapující data, získaná z nádorových buněčných linií s odchylkami chromozomu 12ql3-ql5, zahrnujících 8 lipomových buněčných linií, 10 děložních leiomyomových buněčných linií a 8 pleomorfních adenomních buněčných linií slinných žláz v závěrečných experimentech, následujících po raných studiích FISH. Použité sondy zahrnovaly fágové klony pRM144 (odpovídající STS: RM86 a RM130) a pRM147 (RM151) a kosmido.vé klony 7D3 nebo 152F2 (RM103) , 154F9 (CH9) , 27E12 (EMU), 211A9 (RM33), 245E8 (RM53), 185H2 (RM76) , 202A1 (RM98), 142H1 (RM99), 154B12 (RM132) a 124D8 (RM133).
Určilo se, že DNA interval mezi RM33 a RM98 představuje přibližně 445 kb. Tečky označují konečné (potvrzující) FISH experimenty, které se prováděly chromozomech příslušné buněčné linie, molekulovou sondu klon, obsahující STS uvedené v rámečcích v horní části obrázku. Plné čáry označují DNA intervaly, které byly vymezeny zlomovými body příslušné buněčné linie, která má být mapována. Prázdné trojúhelníky označují FISH analýzy. Prázdné kruhy experimentů na -metafázových chromozomech LÍ-501/SV40 buněk s hybridizačními signály na cytogeneticky normálním chromozomu 3. Pozice zlomových bodů na metafázových používající jako delece, pozorované během označují výsledky FISH chromozomu 12 ”~hadořbvých buněčných linií, zmapovaných vně MAR, jsou naznačeny pomocí šipek. Molekulárně klonované zlomové body LM-30.1/SV40 a LM-608/SV40 jsou označeny hvězdičkami. Zlomové body v různých děložních leiomyomových buněčných liniích, rozdělující kosmid 27E12 (EMU) je značen pomocí „across.
·· ·· ·· · • · e · · · · · · · * • · · ···· ···· • · · · · · ···· · ··· · · ······ ··· ···· ·· ·· · ·· ·· ·· ··
Obrázek 4
Obrázek 4 znázorňuje 3'-RACE produkt, obsahující spojení mezi částí HMGI-C genu a částí LPP genu. Obrázek dále znázorňuje použité primery a jejich spojení. Syntéza cDNA byla primerována vnitřně a nikoliv na skutečném póly(A) konci.
Obrázek 5
Tento obrázek znázorňuje parciální cDNA sekvence LPP genu.
Obrázek 6
Tento obrázek znázorňuje aminokyselinovou sekvenci LPP genu. LIM domény jsou uvedeny v rámečcích. Zlomový bod je označen šipkou.
Obrázek 7 ob rá-z e-k-= -7— zná z o r ň u j e nukleoti do vou s e kve n c i HMGI - C (U28749). Transkripční startovací místo je označeno způsobem, který navrhl Manfioletti a kol. [Manfioletti, G. a kol., cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein, a nuclear protein associated withneoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucl. Acids Res. 19, 6793-6797 (1991).] bylo zvoleno jako startovací místo. Tato sekvence obsahuje úplnou kódovací sekvenci.
·· 99
9 9 * 9
9* 9
9
Obrázek 8
Obrázek 8znázorňuje gel PCR produktů, získaných způsobem popsaným v příkladu 5.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
1. Úvod
Tento příklad popisuje izolaci a analýzu 75 vzájemně se překrývajících YAC klonů a založení YAC kontigu (souboru vzájemně se překrývajících klonů), který zahrnuje přibližně 6 Mb délky genomové DNA okolo místa D12S8 a který rovněž zahrnuje MAR. Orientace YAC kontigu na dlouhém rameni chromozomu 12 .se určila pomocí dvoubarevné analýzy FISH. Na základě mapování obsahu STS a restrikční enzymové analýzy se vytvořila fyzikální mapa 'této 6“Mb ĎNA dblasti. Tento kontig představoval použitelný zdroj pro cDNA záchyt namířený na identifikační gen umístěný v 12ql5, včetně genu přímo ovlivněného různými odchylkami chromozomu 12.
·· · ··
2. Materiály a metody
2.1. Buněčné linie
Při specifikování chromozomu, používajícím somatické buněčné hybridové (CASH) experimenty se použily buněčné linie PK89-12 a LIS-3/SV40/A9-B4. PK89-12, která obsahuje chromozom 12 jako lidský chromozom v křeččím genetickém pozadí, byla již popsána [Warburton, D., Gersen, S., Yu, M.T., Jackson, C., Handelin, B. a Housman, D. (1990). Monochromosomal rodent-human from microcell fusion of human lymphoblastoid cells contaíning and inserted dominant selectable markér. Genomics 6: 358-366.]. PK89-12 buňky se pěstovaly v DME-F12 médiu, doplněném 10% fetálním bovinním sérem, 200 IU/ml penicilínu a 200 μg/ml streptomycinu. Somatický buněčný hybrid LIS-3/SV40/A9-B4 se získal jako důsledek fúze buněčné linie LIS-3/SV40 liposarkomu, která nesla t(12;16) buněk, a ukázalo se, že obsahují der(16), ale neobsahují der(12) ani normální chromozom 12 [Schoenmakers, H.F.P.M.,
Kools, P.F.J., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J. , Claussen, U., Horsthemke, B., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1993). Isolation of a somatic. cell hybrid retaining the der(16)t(12;16) (ql3;pll.2) from a myoxid liposarcoma cell line. Cytogenet. Cell Genet. 62: 159-161.]. LIS-3/SV40/A9B 4 buňky s e p ě s to v a 1 y v s e 1e k ť i vn im AO A mediu” (AOA mé d i um, ” myxoidního (ql3;pll.2) a myších A9 které tvořilo DME-F12 médium, doplněné 10% fetálním bovinním sérem, 0,05 mM adeninu, 0,05 mM ouabainu a 0,01 mM azaserinu). Obě buněčné linie se často testovaly pomocí standardních, cytogenetických technik.
2.2. Nukleotidová sekvenční analýza a oligonukleotidy ·· *9 99 · ·· 99 • · · · · · · · V · · • •9 · · · · 9···
9 9 9 9 · 9 φ φ · · · φ φ φ ·
999999 9 9 9
9999 ·Φ 99 φ φφ φ« označených pomocí syntetizovaných na
Nukleotidové sekvence se určily podle dideoxy řetězové terminační metody za použití T7 polymerázové sekvenční sady (Pharmacia/LKB) nebo dsDNA cyklického sekvenčního systému (GIBCO/BRL). DNA fragmenty se subklonovaly v pGEM-3Zf(+) a sekvencovaly pomocí standardních primerů SP6 nebo T7, FITC, nebo specifických primerů základě nově získaných sekvencí.
Sekvenční výsledky byly získány pomocí ALF (Automated Laser Fluorescent) DNA sekvenčního zařízení (Pharmacia Biotech) a standardních 30cm, 6% gelů Hydrolink, Long Range (AT
Biochem). Nukleotidové sekvence se analyzovaly za použití sekvenčního analytického programu Genepro (Riverside Scientific), PC/Gene (IntelliGenetics), programové balení IntelliGenetics Suitě (IntelliGenetics, lne.) a Oligo [Rychlík, W. a Rhoads, R.E. (1989). A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 17: 8543-8551.]. Všechny oligonukleotidy se získaly od společnosti Pharmacia Biotech.
2.3. Přípravy chromozomů a fluorescenční in šitu hybridizace _(FISH)______ ____________
FISH analýza YAC klonů se prováděla s cílem stanovit chromozomové pozice YAC klonů a identifikovat chimérické klony. FISH analýza kosmidových klonů odpovídajících STS YAC inzertním koncům měla za cíl stanovit jejich chromozomové pozice. Kosmidy se izolovaly z lidské genomové knihovny CMLW-25383 [Verbeek, J.SRoebroek, A.J.M., Van den Ouweland, A.M.W., Bloemers, H.P.J. a Van de Ven, W.J.M.
·· ·· • » « • · « • · · · e β »· « ·· · ···« e
(1985). Human c-fms proto-oncogene: comparative analysis with an abnormal allele. Mol. Cell. Biol. 5: 422-426.] nebo ze shromážděné specifické knihovny chromozomu 12, vytvořené v Národní knihovně Lawrence Livermore . (LL12NC01, viz Montgomery, K.T., Le Blanc, J.M., Tsai, P., McNinch, J.S., Ward, D.C., De Jong, P.J., Kucherlapati, R. a Krauter, K.S. (1993). Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17: 682-693.) pomocí standardních postupů [Sambrook, J., Frotsch, E.F. a Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Čold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprong Harbor, NY.]. Rutinní FISH analýza se provedla v podstatě již popsaným způsobem [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J., Claussen, U., Horsthemke, B., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1993). Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16) (ql3;pll.2) from a myoxid liposarcoma cell line. Cytogenet. Cell Genet. 62: 159-161.; Dal Cin, P., Kools, P., Sciot, R., De Wever, I., Van Damme, B., Van de Ven, W. and Van den Berghe, H. (1993b). Molecular c.ytogenetic characterization of ring chromosomes. in adipose tissue tumors. Cancer Genet. Cytogenet., 68, 85-90.]. DNA se označily pomocí biotinu-11dUTP (Boehringer) za použití postupu, který popsal Kievits a kol. [Kievits, T., Dauwerse, J.G., Wiegant, J. , Devilee,_ P., Breuning, M.H., Cornelisse, C.J. a Ommen, G., Pearson, P.L. (1990). Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in šitu hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 53: 134-136.]. Protizatemňovací médium, tvořené DABCO (2 g/100 ml, Sigma), 0,1 M tris-HCl pH 8, 0,02% Thimerosalem a glycerolem (90%), a obsahující propidiumjodid (0,5 pg/ml, Sigma) jako protibarvivo, se ·· ·· ·· » ·· ·· • · · · • · · · · « · · « « · • · · · .· ···· · · ·· přidal 15 minut před analýzou vzorků ve fluorescenčním mikroskopu Zeiss Axiophot za použití dvoupásmového propouštěcího filtru pro FITC/Texaská červeň (Omega Op t i ca1, I nc. ) . Výs 1 ed kyse za znamenal y .na film Scot ch (3M.) 640 asa.
Při dvoubarevných experimentech FISH se LLNL12NC0196C11 označil digoxygeninem-ll-dUTP (Boehringer) a kosmidy LLNL12NC01-1F6 a -193F10 se označily pomocí biotinu-11dUTP. Shodná množství jednotlivých sond se. smísila a tato směs se použila pro hybridizaci. Po hybridizaci se podložní sklíčka inkubovala 20 minut pomocí Avidinu-FITC a následně promyla způsobem, který popsal Kievits a kol. [Kievits, T., Dauwerse, J.G., Wiegant, J. , Devilee, P., Breuning, M.H., Cornelisse, C.J. a Ommen, G., Pearson, P.L. (1990). Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in šitu hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 53: 134-136.]. Následné série inkubací v TNB pufru (0,1 M tris-HCl pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,5% Boehringerově blokačním činidle (Boehringer)) a promývání se prováděla v TNT pufru (0,1 M tris-HCl pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20); všechny inkubace se prováděly při teplotě 37°C po dobu 30 minut. V průběhu druhé inkubace se současně aplikoval kozí-a-Avidinbiotin (Vector) a myší-a-digoxygenin (Sigma). Během třetí inkubace se aplikoval Avidin-FITC a králičí-a-myší-TRITC (Sigma). Během poslední inkubace se aplikoval kozí-akráličí-TRITC (Sigma). Po posledním propláchnutí v TNT pufru, se vzorky promyly dvakrát v 1 x PBS a následně dehydratovaly ethanolovou sérií (70%, 90%, 100%). Jako protibarvivo se použilo protizatemňovací médium obsahující 75 ng/μΐ DAPI (Serva). Vzorky se analyzovaly pomocí výše popsaného fluorescenčního mikroskopu Zeiss Axiophot.
·· «· ·> ·» ·· · · > · * ··· ···· • ♦ · ···· ···· • * · · · · ··«» · ··· · · • ••••· ·«· ···· *· ·· · «· ·«
2.4 Screenování YAC knihoven
YAC klony- se izolovaly z CEPH lidských genomových YAC knihoven, označených 1 a 3 [Albertsen, H.M., Abderrahim, H., Cann, H.M., Dausset, J., L Paslier, D. a Cohen, D. (1990). Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library. containing seven haploid human genome equivalents. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 4256-4260.; Chumakov, I., Rigault, P., Guillou, S., Ougen, P., Biilaut, A., Guasconi, G., Gervy, . P., Le Gall, I., Soularue, P., Grinas, L., Bougueleret, L., BellannéChantelot, C., Lacroix, B., Barillot, E., Gesnouin, P., Pook, S., Vaysseix, G., Frelat, G., Schmitz, A., Sambucy, J.L., Bosch, A., Estivill, X., Weissenbach, J., Vignal, A., Riethman, H., Cox, D., Patterson, D., Gardiner, K., Hattori, M., Sakaki, Y., Ichikawa, H., Ohki, M., L Paslier, D., Heilig, R. , Antonarakis, S. and Kohen, D. (1992). Continuum of overlapping dones spanning the entire human chromosome 21q. Nátuře 359: 380-387.], zpřístupněných
Centre d'Etudě du Polyphormisme Humain (CEPH). Screenování se provádělo již popsaným způsobem [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, s., Bullerdiek, J., Dal Cín, P., De Jong, P.J., Van den Berghe,
H .___s Var, de Ven, W. J . M. ,. (1994a) . ... Physica.1 mapping oř chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.]. Kontaminační Candida parapsylosis, na kterou bylo možné někdy narazit, se eliminovala přidáním terbinafinu (laskavě dodaným Dr. Dieterem Romerem, Sandoz Pharma LTD, Basle, Švýcarsko) do růstového média (konečná koncentrace: 25 pg/ml). Izolované YAC klony se • 9 *t
9 9 9
9 99
999 9 9 • 9 9
99 • 9 ·· ·Γ · • 9 9 9 9 · · • · 9 · 9 9 9 • 9 9 9 9 · 9999 9
9 9 9 9 ·
9999 99 99 9 charakterizovaly mapováním STS obsahu, gelovou elektroforézou konturou sevřeného homogenního elektrického pole (CHEF) [Chu, G., Vollrath, D. a Davis, R.W. (1986). Separation of larce DNA , molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. Science 234: 1582-1585.], restrikčním mapováním a hybridizační analýzou a analýzou FISH.
2.5. PCR reakce
K PCR amplifikaci se použil kontrolní přístroj Pharmacia/LKB Gene ATAQ (Pharmacia/LKB) v konečných objemech 100 μΐ, obsahujících 10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% želatiny, 2 mM dNTP, 20 pmolů každého amplimeru, 2,5 jednotek produktu Amplitaq (PerkinElmer Cetus) a 100 ng (pro supernádrže) nebo 20 ng (pro nádrže) DNA. Po počáteční pětiminutové denaturaci při 94°C, se provedlo 35 amplifikačních cyklů, z nichž každý zahrnoval jednominutovou denaturaci při 94°C, jednominutové temperování při příslušné teplotě (viz tabulka I) a jednominutovou extenzi při 72°C. PCR reakce se ukončila konečnou pětiminutovou extenzí při 12° Z. Výsledky se hodnotily analýzou 10 μΐ reakčního produktu na polyakrylamidových minigelech.
ι· ·« ·· · • · · · • · · · ··· · · · < • · · · · · ···· · ··· · »····· · · »· · ·· · · · ·· ·«
2.6. Analýza na bázi gelové pulzní elektroforézy a Southernova přenosu
--------- Analýza na bázi gelové pulzní elektroforézy a
Southernova přenosu se provádí přesně takovým způsobem, jaký popsali Schoenmakers a kol. [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, Ř. , Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J. , Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a) . Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.]. Agarózové vložky, obsahující vysokomolekulární YAC DNA (ekvivalent přibližně 1 x 108 kvasnicových buněk), se dvakrát třicet minut uváděly v rovnováhu v přibližně 25 ml TE pufru (pH 8,0) a následně se dvakrát podobně uváděly do rovnováhy při pokojové teplotě. Vložky se následně přemístily do 2 ml eppendorfových zkumavek se zaobleným dnem a dvakrát se 30 minut uváděly do rovnováhy v 500 μΐ vhodného 1 x restrikčního pufru při vhodné restrikční teplotě. Následně se po dobu 4 hodin DNA digerovala v agarózových vložkách podle instrukcí dodavatelů (Boehringer) za použití 30 jednotek restrikční endonukleázy na digerační reakci. Po digesci se agarové vložky spolu s vhodnými signálními znaky (markéry) molekulové hmotnosti _zavedly ._do 1% agarózy/0,25 x TBE _gel,„ překryly LMP-agarózou a 18 hodin rozměrově frakcionalizovaly na CHEF zařízení (Biorad) při 6,0 V/cm za použití pulzního úhlu 120 stupňů a konstantních pulzních časů, pohybujících se od 10 s (separace na 300 kbp) do 20 s (separace na 500 kbp). V případě velkých restrikčních fragmentů se provedly další běhy, které napomohly separaci fragmentů o velikosti větší než 500 kbp. Elektroforéza se
prováděla při 14 °C v 0,25 x TBE. Jako signální znaky molekulové hmotnosti se použily lambda kmenové žebříky (Promega) a připravené zátky, obsahující lambda DNA, nařezané, restrikční endonukleázou HindllI. Po provedení elektroforézy se gely zabarvily ethidiumbromidem, fotografovaly a ozařovaly UV zářením za použití sady stratalinkerových gelů (Stratagene) při 120 mJ. DNA se následně, během 4 až 16 hodin, přenesla pomocí 0,4 N NaOH jako přenosového pufru na membrány Hybond N+ (Amersham). Po přenesení se membrány 15 minut sušily při 80°C, zběžně neutralizovaly ve 2 x SSPE a předhybridizovaly alespoň 3 hodiny při 42°C v 50 ml roztoku, obsahujícího 50 % formamidu, 5 x SSPE, 5 x Denhardts, 0,1% SDS a 200 μς/ιηΐ heparinu. Filtry se následně hybridizovaly 16 hodin při teplotě 42°C v 10 ml roztoku, obsahujícího 50 % formamidu, 5 x SSPE, 1 x Denhardts, 0,1% SDS, 100 μg/ml heparinu, 0,5% dextransulfátu a 2 až 3 x 106 cpm/ml označené sondy. Potom se membrány nejprve dvakrát promývaly 5 minut ve 2 x SSPE/0,1% SDS při pokojové teplotě, následně 30 minut ve 2 x SSPE/0,1% SDS při 42°C a konečně 20 minut v 0,1 x SSPE/0,1% SDS při 65°C. Filmy Kodak XAR-5 se exponovaly 3 až 16 hodin při 80°C, v závislosti na výkonu sondy. Použily se kontrastní filtry (Kyokko speciál 500).
2.7. Generování STS z YAC inzertních konců
STS z YAC inzertních konců se získalo pomocí postupu „vectorette - PCR v kombinaci s přímou DNA sekvenční analýzou, kterou v podstatě popsali Geurts J. a kol. [Geurts, J. , Schoenmakers, H.F.P.M. , Mols, R. a Van de Ven, W.J.M. (1994) v „Improved proceduře for rapid isolation and sequencing of DNA insert termini in yeast artificial chromosomes Meth. Mol. Cell. Biol., 4: 257-265.]. Sady • · ·· · · · «· ·» ···· ··· ···· ·· · · · · · · ··· • · · · · ·····♦ ···· · • · · · · · · · · «····· ·· · ·· · · primerů se vyvinuly a testovaly na lidské genomové DNA, podle výše popsaných postupů. STS budou z důvodu vyšší přehlednosti v celém textu této přihlášky vynálezu označovány pomocí svých zkratkových názvů (například: RMl namísto STS 12-RM1).
3. Výsledky
3.1. Sestavování YAC kontigu okolo místa D12S8
V předcházejících studiích [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R. , Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.] byl popsán 800 kb YAC kontig, vyskytující se okolo D12S8. Tento kontig sestává z následujících tří částečných vzájemných překryvů nechimerických CEPH YAC klonů: 258F11, 320F6 a 234G11.
Tento kontig se použil jako výchozí bod pro procházení chromozomy, a jeho úkolem je definovat DNA oblast na dlouhém rameni chromozomu 12, který obklopuje zlomové body variety benigních pevných nádorů, které se nacházejí v bií zkost i Dl2S8 a daleko od CHOPr Procházení- · chromozomy- se -nejprve provádělo ve dvou směrech až do okamžiku, kdy se získala velikost kontigu, která umožnila spolehlivě určit orientaci tohoto kontigu. Ve dvousměrném a následně jednosměrném kroku procházení chromozomy se použil následující obecný postup. Nejprve se zajistily a sekvencovaly konce YAC klonů rezultující v DNA signální znaky charakterizující jejich pravé a levé strany « · *· ♦ * • · · • · · »»
(tabulka I) . Na základě sekvenčních dat konců čtyřiceti YAC inzertů se vyvinuly primerové sady pro specifickou amplifikaci DNA zakládající STS (místa se sekvenční adresou) (tabulka II). Jejich výskyt na 12ql3-qter se určil pomocí analýzy CASH a rovněž pomocí analýzy FISH po izolování odpovídajících kosmidových klonů. Je třeba uvést, že izolované YAC klony se často hodnotí také analýzou FISH, takže se provádí nejen nalezení chromozomového původu těchto inzertů, ale v mnoha případech se provádí i stanovení a definování jejich chimérické povahy. Kromě toho je třeba zdůraznit, že při hodnocení vzájemně se překrývajících YAC klonů a následném řazení se rovněž berou v úvahu data, získaná restrikční endonukleázovou analýzou. S následně zvolenými a zhodnocenými sadami primerů se provedlo prohledávání YAC a kosmidových knihoven s cílem izolovat stavební bloky pro sestavení kontigů. Sestavení kontigů se provedlo za použití dat, odvozených z mapování FISH a obsahu STS stejně, jako z restrikční endonukleázové analýzy. Při použití tohoto přístupu se založil YAC kontig obsahující 75 vzájemně se překrývajících YAC klonů, pokrývajících přibližně 6 Mb DNA (obr, 1) . Ukázalo se, že tento kontig obklopuje zlomové body chromozomu 12 všech studovaných buněčných linií majících spojitost s nádory [Schoenmakers,· H.F.P.M., ' Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, s., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.]. Charakteristiky YAC, které se použily při stavbě tohoto kontigů, jsou uvedeny v tabulce I.
• 9 · * 9 • · · · · 9 9 9 9 9 9
9 · 9 9 9 9 · · · 9
9 9 9 9 999999 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 99 9 φ· ·9
3.2. Založení ohromozomové orientace YAC kontigu
Aby se umožnilo nesměrové procházení chromozomy směrem k centromeře chromozomu 12, dvoubarevnou interfázovou analýzou FISH se určila orientace DNA oblasti, obklopené STS RM14 a RM26 (přibližná velikost: 1450 kb). Kosmidové klony, odpovídající těmto STS (tj . LL12NCO1-1F6 (RM14) a LL12NC01-96C11(RM26)), se odlišně označily tak, aby vykazovaly zelené, resp. červené signály. Jako referenční místo se označil kosmid LL12NC01-193F10 tak, aby po detekci vykazoval zelené signály. LL12NC01-193F10 byl již v oblasti vzdálené od zlomového bodu LIS-3/SV40 (tj. CHOP) a v blízkosti zlomových bodů chromozomu 12q v lipomové buněčné linii LÍ-14/SV40 a děložní leiomyomové buněčné linii LM-30.1/SV40 zmapován. Ukázalo se, že LL12NCO1-1F6 a LL12NC01-96C11 mapují v blízkosti zlomových bodů 12q v lipomázové buněčné linii LÍ-14/SV40 a LM-30.1/SV40 děložní leiomyomové buněčné linii. Proto byl LL12NCO1-193F10 ukončen, aby mapoval v blízkosti jak RM14, tak RM26 (nepublikované výsledky). Ze 150 hodnocených informativních interfází vykazovalo 18 % pořadí signálů červená-zelená-zelená, zatímco 72 % vykazovalo pořadí signálů zelená-červená-zelená. Na základě těchto pozorování byl vyvozen závěr, že se mapovaný RM26 nachází v blízkosti RM14 a proto se pokračovalo pouze s cílem rozšířit YAC kontig směrem od RM26 (tj. přilehlé) strany našeho kontigu. Dvoubarevným fázovým mapováním byly seřazeny pouze kosmidy obsahující RM14 a RM26; přičemž pořadí všech dalších se vydedukovalo z dat YAC kontigu. Konečně je třeba se zmínit, že chromozomová orientace kontigu, jak byla navržena na základě výsledků dvoubarevných interfá.zových studií FISH, se nezávisle potvrdila po rozšíření YAC kontigu přes zlomové body chromozomu 12, který je přítomen ve varietě • · · · • · · · · 9 nádorových buněčných linií. Tato potvrzující informace se získala při extenzívních studiích FISH, při kterých se pozice YAC a kosmidových klonů určily ve vztahu k chromozómovým 12ql3-ql5 zlomovým bodům primárních lipomů, děložních leiomyomů, pleomorfních adenomů slinných žláz a pulmonálních chondroidních hemartomů nebo odvozených buněčných linií [Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J. , Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.; Kools, P.F.J., Wanschura, S., Schoenmakers, E.F.P.M., Geurts, J.W.M., Mols, R., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J. , Van den Berghe, H., a Van de Ven, W.J.M. (1995). Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12) (p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 79: 1-7.; Van de Ven, W.J.M., Schoenmakers, H.F.P.M, Wanschura, S., Kazmierczak, B.,
Kools, P.F.J., Geurtus, J.M.W., Bartnitzke,
Van den
Berghe, H. a Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12ql3-ql5 implicated in various solid tumors. Genes Chrom. & Cancer. 12: 296-303. (Genes, Chromosome & Cancer 12:296-303 (1995);
Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region on Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors;
Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.J. Kools,
Jan ·· • ·
M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe, and Jórn Bullerdiek;
Center for Human Genetics, University of Le.uven, Belgium (W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.); . Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.); Kazmierczak, B., Wanschura, S.,
Rosigkeit, J. , Meyer-Bolte, K., Uschinsky, K., Haupt, R., Schoenmakers, E.F.P.M., Bartnitzke, S., Van de Ven, W.J.M. a Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of 12ql4-15 rearrangements in three pulmonary chondroid hamartomas. Cancer Res., v tisku].
3.3. Konstrukce fyzikální mapy, získané pomocí vzácně štěpících enzymů od 6 Mb YAC kontigu okolo D12S8
Southernovy přenosy celé kvasnicové plus YAC DNA, kompletně digerované pomocí vzácně štěpících enzymů (viz Materiály a Metody) a separované na CHEF gelech, se sekvenčně hybridizovaly pomocí i) počáteční průzkum těchto YAC; ii)
STS, použitých pro pYAC4 pravoramenných sekvencí; iii) pYAC4 levoramenných sekvencí; a iv) lidské ALU-opakující se sondy (BLUR-8) . Konstrukce široké restrikční mapy, která se získala tímto způsobem, - se dokončila sondováním PCR-izolovanými STS/YAC koncovými sondami.
Restrikční mapy jednotlivých YAC klonů se seřadily a založila se konvenční restrikční mapa. Je důležité zde uvést, že celá konvenční mapa, získaná pomocí vzácně štěpících enzymů, je podepřena alespoň dvěma nezávislými klony, vykazujícími úplnou vnitřní spojitost.
• · · »
3.4. Fyzikální mapování CA repetic a monomorfních STS/EST
Na základě integrovaných mapujících dat, které byly získány od Second International Workshopu na lidském chromozomu 12 [Kucherlapati, R. , Craig, I. a Maryen, P. (1994). Report of the second international workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet. Cell Genet. 67: 246-276.] se dá očekávat, že celá řada publikovaných signálních znaků bude zmapováno uvnitř zde přítomného YAC kontigu. S cílem umožnit úplnou integraci našich mapujících dat s daty získanými někým jiným, byla celá řada signálních znaků STS obsahem zmapována na našem kontigu a ty, co našly pozitiv se následně subklonovaly (příměrovou) hybridizací na YAC Southernových přenosech. Mezi signálními znaky, u nichž se zjistilo, že se nacházejí uvnitř zde přítomného kontigu byly CA repetice D12S313 (AFM207xf2) a D12S335 (AFM273vg9) [Gyapay, G., Morissette, J. , Vignal, A., Dib, C., Fizames, C., Millasseau, P., Marc, S., Bernardi, G., Lathrop, M. a Weissenbach, J. (1994). The 1993-94 Généthon Nátuře Genetics 7: 246-339.],
D12S56 [Ulinowski, Z., Taylor,
K. , Griffin, D., Delhanty, J. a Wolfe, J. (1991). D12S56: a highly polymorphic locus on human chromosome 12gl4. Ann. Hum. Genet. 55: 279-282.]. Kromě toho, interferonový gama gen (IFNG) [Trent, J.M., Olson, S. a Lawn, R.M. (1982). ChromosomaJ localizatá on of human leukocyte, fibroblasť, and immune interferon genes by means of in sítu hybridization. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 79: 78097813.], ras-proteinový gen RaplB [Pizon, V., Lerosey, I., Chadrin, P. a Tavitian, A. (1988) . Nucleotide sequence of a human cDNA encoding a ras-related protein (raplB). Nucleids Acids Res. 16: 7719.] a exprimovaný sekvenční konec EST01096 [Adams, M.D., Dubnick, M. , Kerlavage, A.R., human genetic linkage map. D12S375 (CHLC GATA3F02) a ···· ·· « ·
Mořeno, R., Kelley, J.M., Utterback, T.R., Nagle, J.W., Fields, C. a Venter, J.C. (1992). Sequence identification of 2,375 human brain genes. Nátuře 355: 632-634.] se mapovaly pomocí příměrových sad, které se vyvinuly na základě veřejně dostupných sekvenčních dat (viz tabulka II). Signální znaky, které byly testovány a nalezly negativ zahrnují D12S80 (AFM102xd6), D12S92 (AFM203va7), D12S329 (AFM249xh9) a D12S344 (AFM296xd9) .
4. Diskuse
Tento příklad popisuje zakládání YAC kontigu a konvenční restrikční mapy, získané pomocí vzácně štěpících enzymů, překrývající přibližně 6 Mb na 12ql5, oblast na dlouhém rameni lidského chromozomu 12 obsahujícího MAR, ve které je zakreslena celá řada opakujících se chromozómových zkratek benigních pevných nádorů, které jsou známé pro mapování.
Rozsah překryvu mezi jednotlivými YAC bezpečně určil umístění celé délky kontigu při přibližně 6 Mb (obr. 1) . Je třeba uvést, že zde uvedená rozměrová data pro některé YAC klony se mírně liší od rozměrů, určených pomocí CEPH [Kohen, D., Chumakov, I. a Weissenbach, J. (1993). A firstg e neration p h vsi ca 1 map o f t h e , h uma n g e nome . · N a t u r e 3 6 6 : 698-701.]. Tento rozdíl je nejpravděpodobněji způsoben rozdílnými parametry při provádění pulzních gelových elektroforéz v různých laboratořích.
Za použití restrikčního mapování a analýzy STS-obsahu, byla sestavena konvenční širokorozsahová fyzikální mapa (obr. 1) . Celá kompozitní mapa je podepřena alespoň dvojím ·· ·· ·* · ·· +· * · · · · · φ «·· ·· · · · · · · ··· • · · · · ····»» *··· ^překrytím. Restrikční analýzou a analýzou obsahu STS se charakterizovala přes 30 Mb YAC DNA, což odpovídá přibližně pětinásobku průměrného kontigového překryvu. Přestože přirozeně omezené rozlišení, související s technikou pulzní gelové elektroforézy neumožňuje příliš přesná stanovení, ukazuje porovnání omezených mapujících dat, získaných z 500 kb kosmidového kontigu obsaženého ve zde prezentovaného YAC kontigu, velmi dobrou korelaci. Extrapolací z kosmidových dat se stanovila přesnost uvedené fyzikální mapy přibližně na 10 kb.
i zolovaných obrázku 1).
Výsledky studií fyzikálního mapování, uvedené v této přihlášce vynálezu, umožnily integraci tří genově specifických a rovněž pěti anonymních signálních znaků někým jiným (naznačeno mezi šipkami na Anonymní signální znaky zahrnují jeden monomorfní a čtyři polymorfní signální znaky. Pět již publikovaných jednotlivých kopií STS odvozených z YAC konce (RM1, RM4, RM5, RM7 a RM21) stejně, jako čtyři publikované CA repetice (D12S56, D12S313, D12S335 a D12S375) a tři publikované genově související STS/EST (RAP1B, EST01096 a IFNG) byly umístěny do stejné fyzikální mapy, což usnadnilo (spojování) mapování a identifikaci celé řady znaků/chorobných genů, které mapují .danou oblast. Navíc jsme schopni umístit do stejné fyzikální mapy sedmdesát dva -DNA s igná lni ch zna ků odvozehých od YAC konců (tabulka I) sT osm DNA signálních znaků odvozených od kosmidových konců nebo interinter-ALU-odvozených DNA signálních znaků (CH9, RM1, RM110, RM111, RM130, RM131, RM132 a RM133), které se vyvinuly v průběhu procházení chromozomy. Pro hledání odvozených sekvencí těchto DNA signálních znaků za účelem zjištění přítomnosti repetic se použil automatický mailový server na PYTHIA@anl.gov. Pro čtyřicet tři z těchto • ·· · • φ · · · · φφφφ φφ φφ φ φφ ·φ sedmdesáti dvou DNA signálních znaků (uvedených v tabulce II) se vyvinuly sady primerů a odpovídající STS se určily tak, aby byly jedinou kopií pomocí PCR a rovněž pomocí Southernova přenosu lidské genomové DNA. Dvacet devět zbývajících DNA signálních znaků (znázorněných ve žlutých rámečcích) reprezentuje sekvence odvozené od YAC konců, pro které jsme nevyvinuli primerové sady. Předpokládá se, že tyto YAC koncové sekvence se mapují na chromozomu 12 na základě restrikčního mapování. Konečný obrázek ukazuje celkovou hustotu signálních znaků v této oblasti, která představuje přibližně jeden signální znak na každých 70 kb.
Analýza zde přítomného kontigu odhaluje mnoho oblastí bohatých na CpG, potenciální HTF ostrůvky, o nichž se ví, že mají často souvislost s provozními geny. Tyto CpG ostrůvky jsou nejpravděpodobněji umístěny na koncích 5' ještě neidentifikovaných genů, což ukázalo, že v 90 % případů, ve kterých se tři nebo více restrikčních míst (při restrikci vzácně štěpícími restriktázami) v YAC DNA shoduje, existuje související gen -[Larsen, F. , Gundersen, G. a Prydz, H. (1992a). Choice of enzymes for mapping based on CpG islands in the human genome. GATA 9: 80-85.].To je dáno pravděpodobně příliš nízkým odhadem počtu genů, které mají být ještě identifikovány v této oblasti, protože 60 % pro tkáň specifických genů nosouvis5 s CpG ostrůvky [Larsen, F. , Gundersen, G. , Lopez, R. a Prydz, H. (1992b). CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics 13: 1095-1107.] a rovněž proto, že je možné z jediného ostrůvku přepsat dva geny s odlišnou orientací [Lavia, P., MacLeod, D. a Bird, A. (1987). Coincident start sites for divergent transcripts at randomly selected CPG-rich island of mouše. EMBO J. 6: 2773-2779.].
9 · ·· 99 '9 9 9 9 9 9 9 9 · 99 .99 9·9 9 ···· 9 ··· 9 9
99 9 9 9 999
999 9 9 9 9 9 9 9 9 ··
I když se ukázalo, že některé z YAC klonů, které se izolovaly z CEPH YAC knihovny 1 jsou chimérickými, vzájemně se překrývajícími YAC klony, které se jevily na základě analýzy FISH restrikčního mapování a. analýzy STS obsahu jako nechimerické, by se mohly získat při každém průzkumu, který by byl v souladu s uvedenou komplexitou knihovny. Stupeň chimerizmu pro CEPH YAC knihovnu 1 je pro zde zkoumanou oblast 18%. Malý počet YAC z CEPH YAC knihovny 3 (pouze 7 MEGA YAC bylo zahrnuto v této studii) neumožňuje spolehlivě určit procento chimérických klonů, přítomných v této knihovně. Vypočtená průměrná velikost YAC odvozených z knihovny 1 činila 381 kb; nechimerické YAC (n=58) měly průměrnou velikost 366 kb, zatímco chimérické YAC (n=12) , jak se ukázalo, měly podstatně větší průměrnou velikost; tj. 454 kb.
V podstatě lze říci, že se získal 6 Mb YAC kontig, odpovídající lidské chromozomové oblasti, která je ve varietě benigních pevných nádorů často přeuspořádána. Tento kontig spojuje přes 84 genových míst včetně STS, souvisejících s genem 3. Kromě toho restrikčním mapováním se zjistilo alespoň 12 CpG ostrůvků, které by měly být příznačné pro zde se vyskytující geny. Konečně, v tomto kontigu byly lokalizovány rovněž 4 CA repetice. Integrace genetických fyzikálních a transkripčních map této oblasti poskytuj e základní rámec pro další studie této oblasti chromozomu 12. Počáteční studie se pravděpodobně zaměří na MAR a ULCR12, protože tyto oblasti obsahují oblasti shluků zlomových bodů alespoň tří odlišných typů pevných nádorů. Různé, zde popsané, YAC klony jsou hodnotnými zdroji pro tyto studie. Měly by usnadnit výzkum genů, nacházejících se v této oblasti, a identifikaci těch genů, které přímo • 9
9 9 • · ·
9·· ··· 9 ovlivňují chromozomové 12q anomálie různých benigních pevných nádorů.
Příklad 2
1. Úvod
Ukázalo se, že 1,7 Mb oblast mnohočetných anomálií na lidském chromozomu 12ql5 obsahuje současně zlomové body chromozomu 12, které se často nacházejí v různých typech benigních pevných nádorů. V tomto příkladu je popsána identifikace HMG genu uvnitř MAR, která se zdá být patogeneticky relevantní. Za použití pozičního klonování se identifikoval ve 175 kb segmentu MAR HMGI-C gen proteinu vysoce mobilní skupiny a charakterizovala se jeho genomová organizace. Pomocí analýzy FISH se v tomto genu přesně určila většina zlomových bodů sedmi různých typů benigních pevných nádorů. Southernovým přenosem a analýzou na bázi rychlé amplifikace cDNA konců 3' se demonstruje konzistentní přeuspořádání v HMGI-C a/nebo exprese střídajících se HMGI-C traskriptů. Tyto výsledky naznačují vazbu mezi členem HMG rodiny a vývojem benigního pevného nádoru.
2. Materiály a metody
2.1. Buněčná kultura a vzorky primárního nádoru
Nádorové buněčné linie, uvedené na obrázku 3, byly založeny transkripčním postupem [Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Hartl, M., & Bullerdiek, J., In vitro transformation by the SV40 „early region of cells from a
44 44 44 • * · · • · 4 4 4 · · • · · • · · · · · 44 4 »4 • · · . · · · · • · · · · · »· • 4 ···· · ··· · ·
• 4 • · • · · · • ·· 44
human benign salivary gland tumor with a 12ql3-ql5
rearrangement. Cytogenet. Cell Genet. 53, 37- 39 (1990).] a
ten byl popsán již dříve [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R.,~ Kazmierczak, B., Bartnitzke, S. , Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.; Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R. , Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke,
S., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.] a v článku Van de Ven a kol., Genes Chromosom. Cancer 12, 296-303 (1995) [Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region oň Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors; Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.J. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe, and Jórn Bullerdiek; Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium (W.J.Μ.V.D.V. , E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.); Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.)]. Buňky rostly v TC199 médiu, doplněném 20% plodovým bovinním sérem a v pravidelných intervalech se testovaly standardními cytogenetickými technikami. Lidské hepatocelulární karcinomové buněčné linie Hep 3B a Hep G2 se získaly z ATCC (depozitní čísla ATCC HB 8064 a ATCC HB 8065) a kultivovaly se v DMEM/F12, doplněném 4% roztokem Ultroseru (Gibco/BRL).
• ·· ·· • · · · • · ·· • ·· · · · • · · ·· ··
Primární pevné nádory byly získány od různých univerzitních klinik.
2.2. YAC a kosmidové klony
YAC klony se izolovaly z CEPH 1 [Green, E.D. & Olson, M.V. Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries using the polymerase chain reaction. Proč. nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1213-1217 (1990).] a 3 [Montgomery, K.T. a.kol., Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17, 682-693 (1993) .] YAC knihovny, za kombinačního použití průzkumu na bázi PCR [Geurts, J.M.W., Schoenmakers E.F.P.M., Mols, R. & Van de Ven, W.J.M. Improved proceduře for rapid isolation and sequencing of DNA insert termini in yeast artificial chromosomes. Meth. Mol. Cell. Biol. 4, 257-265 (1994).] a hybridizační analýzy kolony. Kosmidové klony se izolovaly z kosmidové knihovny, specifické pro testovaný lidský chromozom 12 (LL12NC01) [Nelson, D.L. a kol., polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from comlex DNA sources. Proč. nati. Acad. Sci. U.S.A. 86, 6686-6690 (1989).], získané z Lawrence Livermore National Laboratory (P. de Jong) . Kosmidové klony, odvozené z LL1.2NC01, jsou označeny pomocí adres svých mikrotitrových ploten, tj . například 27E12.
Kosmidové DNA se extrahovala pomocí standardních technik zahrnujících čištění přes hroty Qiagen (Diagen) . Připravily se agarózové gely, obsahující kvasnice s vysokou molekulovou hmotností + YAC DNA (ekvivalent k 1 x 109
99 9 99 99 • 9 · · · · 9 · a · · • · 9 9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 · 999999 9999 ·
9 9 9 9 9 9 9 9
9999 99 9 9 9 99 99
6 buněk x ml-1) [Rychlík, W. , & Rhoads, R.E. A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 17, 8543-8551 (1989).]. Gely se před tím, než byly podrobeny pulznímu restrikčnímu enzymatickému mapování nebo vytržení YAC konců, zcela dialyzovaly proti čtyřem změnám 25 ml Τχ0Ει (pH 8,0) a následně proti dvěma změnám 0,5 ml 1 x restrikčního pufru. Vytržení YAC konců se provedlo za použití postupu „vectorette-PCR v kombinaci s přímým sekvencováním DNA pevné fáze, které již bylo popsáno [Rychlík, W. & Rhoads, R.E. A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 17, 8543-8551 (1989).]. Inter-Alu PCR produkty se izolovaly pomocí publikovaných oligonukleotidů TC65 nebo 517 [Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13 (1984).], ke kterým se přidaly Sáli konce, jejichž úkolem bylo usnadnění klonování. Po ukončení sekvenční analýzy se pomocí počítačového algoritmu OLIGO vyvinuly primerové páry [Rychlík, W., & Rhoads, R.E. A Computer program for choosing optimal oligonucleotides for filter hybridization, sequencing and in vitro amplification of DNA. Nucl. Acids Res. 17, 8543-8551 (1989) . ] ._______ __ _____
2.3. Značení DNA
DNA z YAC kosmidů PCR produktů a oligonukleotidů se značila pomocí celé řady technik. V případě analýzy FISH se kosmidové klony nebo inter-Alu PCR produkty YAC značily pomocí chemicky modifikovaného nukleotidu s označením ϋ· bioton-ll-dUTP (Boehringer) za použití posunu jednořetězcového zlomu. V případě hybridizací filtru se sondy značily pomocí radioaktivního izotopu a-32P-dCTP za použití nahodilýchhexamerů [Feinberg, A. P. & Vogelstein,
B. A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal. Biochem. 132, 6-13 (1984).]. V případě PCR produktů, menších než 200 bp, se aplikoval podobný postup, ale pro základní značení reakcí se použily specifické oligonukleotidy. Oligonukleotidy se značily pomocí y-32P-ATP.
2.4. Analýza nukleotidových sekvencí a PCR amplifikace
Nukleotidové sekvence se určily způsobem, použitým v příkladu 1. Výsledky sekvencování se analyzovaly pomocí A.L.F. DNA sekvencéru (Pharmacia Biotech.) na standardních 30cm gelech 6% Hydrolink, Long Range (AT Biochem) . PCR amplifikace se prováděly v podstatě již popsaným způsobem [Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P. J. , Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland_adenoma,__gterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.].
2.5. Rychlá amplifikace cDNA konců . (RACE)
Rychlá amplifikace 3' cDNA-konců (3'-RACE) se prováděla za použití mírné modifikace části postupu GIBCO/BRL 3'-ET. Pro syntézu prvního řetězce cDNA se použil ·· ·· • · · « » 4 «4 • · · · 4 • · « ·· 44 • · • Λ · « · adaptérový primer (AP2) AAG GAT CCG TCG ACA TC(T)i7. Pro iniciační a sekundární kolo PCR se jako „zpětný primer použil univerzální amplifikační primer (UAP2) CUA CUA CUA CUA AAG GAT CCG TCG ACA TC. V prvním PCR kole se použily následující specifické „původní primery: i) 5'-CTT CAG CCC AGG GAC AAC-3' (exon 1); ii) 5'-CAA GAG GCA GCA CTA GGA-3' (exon 3); nebo iii) 5'-AAC AAT GCA ACT TTT AAT TAC TG-3' (3'-UTR). V druhém PCR kole se použily následující specifické „původní primery („uhnízděné primery použité jako srovnání s primery v prvním kole) : i) 5'-CAU CAU CAU CAU CGC CTC AGA GAG GAC-3' (exon 1); ii) 5'-CAU CAU CAU CAU GTT CAG AAG AAG CCT GCT-3' (exon 4); nebo iii) 5'-CAU CAU CAU CAU TTG ATC TGA TAA GCA AGA GTG GG-3' (3'-UTR). CUA/CAU-zakončení uhnízděných specifických primerů umožnilo použití směrového klonovacího systému CloneAmp (GIBCO/BLR).
3. Výsledky
3.1. Vývoj kosmidových kontigových a STS map segmentu MAR
V průběhu pozičního klonování, zaměřeného na dlouhé rameno lidského chromozomu 12, se zkonstruoval YAC kontig, pokrývající přibližně 5 Mb a obsahující 75 vzájemně se .„-překrývají cích, YAC... Charakteristiku tohoto - kontigu lze nalézt v příkladu 1. Tento kontig vymezuje MAR (viz rovněž obr. 2), ve které se nachází většina zlomových bodů chromozomu 12ql3-ql5, které se nacházejí ve varietě primárních benigních pevných nádorů (34 nádorů z osmi různých typů testovaného sofaru; tabulka 5) a nádorové buněčné linie (26 linií testovaného sofaru, odvozených z lipomů, děložních leiomyomů a pleomorfních adenomů slinných • ··
• · · · · • · · · ···· · • · · · ·· • · · · · • · * • 9 99 žláz; obr. 3) se jeví jako shluk. Byly vyvinuty širokorozpěťové STS fyzikální mapy a fyzikální mapy, získané pomocí vzácně štěpících enzymů, a pomocí analýzy FISH se zjistilo, že většina zlomových bodů je zmapována ve 445 kb oblasti MAR, lokalizované mezi STS RM33 a RM98 (viz obr. 2a 3). Experimenty FISH včetně kontroly extenzívní kvality se prováděly podle již popsaných rutinních postupů [Van de Ven, W.J.M., Schoenmakers, H.F.P.M, Wanschura, S., Kazmierczak, B., Kools, P.F.J., Geurtus, J.M.W., Bartnitzke, S., Van den Berghe, H. a Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12ql3-ql5 implicated in various solid tumors. Genes Chrom. & Cancer. 12: 296-303.
((1995), Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region on Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors; Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.J. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe a Jórn Bullerdiek; Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium (W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.); Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.)); Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). . Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.; Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke,
S., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, .. molecular cloning and ·· ·· • · · « • · « • · 1 • · « ···· ·· ·· ·· » · · I » · ·· ··« t « • · « ·· ·* • · · • ···· • · ·· · characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.; Kools, P.F.J., Wanschura, S., Schoenmakers, E.F.P.M., Geurts, J.W.M., Mols, R., Kazmierczak, Β., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H., a Van de Ven, W.J.M. (1995). Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12) (p22;gl5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 79: 1-7.; Kievits, T., Dauwerse, J.G., Wiegant, J. , Devilee, P., Breuning, M.H., Cornelisse,
C.J. a Ommen, G., Pearson, P.L. (1990). Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in šitu hybridization. Cytogenet. Cell Genet. 53: 134-136.]. Pro upřesněni distribuce zlomových bodů uvnitř tohoto 445 kb MAR segmentu se vyvinul kosmidový kontig, obsahující 54 vzájemně se překrývajících kosmidových klonů a založila se hustá STS mapa (obr. 2) . Tento kosmidový kontig byl dvakrát kontrolován porovnáním s fyzikální mapou, získanou pomocí vzácně štěpících enzymů a mapováním obsahu STS.
3.2. Shlukování zlomových bodů chromozomu 12q ve 175 kb DNA segmentu MAR
Zlomové body chromozomu 12q, zjištěné v různých nádorových buněčných liniích se uvnitř kosmidového kontigu přesně určily pomocí metody FISH (obr. 3). Součástí experimentů FISH, zaměřených na kvalitativní kontrolu [Van de Ven, W.J.M., Schoenmakers, H.F.P.M, Wanschura, S., Kazmierczak, B., Kools, P.F.J., Geurtus, J.M.W., Bartnitzke, Ξ., Van den Berghe, H. a Bullerdiek, J. (1995). Molecular characterization of MAR, a multiple aberration region on human chromosome segment 12ql3-ql5 implicated in
9 various solid tumors. Genes Chrom. & Cancer. 12: 296-303. ((1995), Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region on Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors; Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernd Kazmierczak, Patrick F.J. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe a Jórn Bullerdiek; Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium (W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.); Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.)); Schoenmakers, H.F.P.M., Kools, P.F.J., Mols, R., Kazmierczak, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J., Dal Cin, P., De Jong, P.J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.; Schoenmakers, H.F.P.M. , Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke,
S., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.; Kools, P.F.J., Wanschura, S., Schoenmakers, E.F.P.M. , Geurts, J.W.M., Mols, R. , Kazmierczak, B., Bullerdiek, J. , Vary dgn Berghe,_ H^_z__a. _Van_ de_Ven, W.J.M. (1995) . Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12) (p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 79: 1-7.], je testování metafázových růstů zvolených kosmidů, odvozených z normálních lymfocytů. Výsledky analýzy FISH naznačují, že většina (alespoň 18 z 26 případů) zlomových bodů chromozomu λ
·· · · ·· v těchto zjištěných nádorových buněčných liniích se nachází ve formě shluků ve 175 kb DNA intervalu mezi RM99 a RM133, což naznačuje, že tento interval tvoří hlavní oblast shluků , zlomových bodů. Výsledky analýzy FISH, - získané pomocí LÍ-501/SV40 naznačují, že část MAR se translokovala do zřejmě normálního chromozomu 3; odchylku chromozomu lze potvrdit pomocí aplikovaných cytogenetik. Konečně je zajímavé zmínit fakt, že zlomové body děložních leiomyomových buněčných linií LM-5.1/SV40, LM-65/SV40 a LM-608/SV40 jsou, jak se zjistilo, zmapovány ve stejném kosmidovém zlomu, tj. kosmidu 27E12.
Rovněž se provedly experimenty FISH na osmi různých typech primárních benigních pevných nádorů s chromozómovými 12ql3-ql5 abnormalitami (tabulka 4) . Jako molekulová sonda se použila směs kosmidových klonů 27Έ12 a 142H1. Souhrnem lze říci, že výsledky FISH studií primárních nádorů se shodovaly s výsledky, získanými pro nádorové buněčné linie. Z pozorování, která ukázala, že zlomové body každého ze sedmi různých typů testovaných nádorů se nacházejí uvnitř stejného 175 kb DNA intervalu MAR, lze usuzovat, že tento interval je rozhodujícím pro vývoj těchto nádorů a může tedy představovat pravděpodobné MAG místo nebo jeho důležitou část(i).
3.3. Identifikace kandidátových genů zmapovaných uvnitř MAR
Při pokusu identifikovat kandidátové geny, zmapované v 175 kb oblasti MAR mezi STS RM99 a RM133, se použilo zachránění 3'-koncového exonu a vytvoření vzorků genomové sekvence (GSS) [Smith, M.W., Holmsen, A.L., Wei, Y.H., Peterson, M. & Evans, G.A. Genomic sequence sampling: a • 4 stratégy for high resolution sequence-based physical mapping of complex genomes. Nátuře Genetics 7, 40-47 (1994) .] . Použitím GSS se získala DNA sekvenční data zakončení 4,9 kb.....BamHI . subfragmentu kosmidu 27E12, který, jak ukázala analýza FISH, je rozdělen anomáliemi chromozomu 12 na tři testované děložní leiomyomové buněčné linie. Výzkum BLAST [Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990).] ukázal, že část těchto sekvencí vykazuje sekvenční identitu s veřejně dostupnou cDNA sekvencí (EMBL, registrační číslo Z31595) genu HMGI-C proteinu vysoce mobilní skupiny (HMG) [Patel, U.A. a kol., Expression and cDNA cloning of human HMGI-C phosphoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 63-70 (1994).], což je člen HMG genové rodiny [Bustin, M., Lehn, D.A. & Landsman,
D. Structural features of the HMG chromosomal proteins and their genes. Biochem. Biophys. Acta 1049, 231-243 (1990).]. Ve světle těchto pozorování byl HMGI-C považován za kandidátový MAG gen a byl studován podrobněji.
3.4. Genomová organizace HMGI-C a přeuspořádání v benigních pevných nádorech
Vzhledem k tomu, že veřejně dostupných je pouze 1200 nukleotidů HMGI-C transkriptu (uvedená velikost přibližně 4 kb [Patel, U.A. a kol., Expression and cDNA cloning of human HMGI-C phosphoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 63-70 (1994).; Manfioletti, G. a kol., cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein, a nuclear protein associated withneoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucl. Acids Res. 19, 6793-6797 (1991).], bylo třeba nejprve určit většinu zbývajících nukleotidových sekvencí HMGI-C • ·
transkriptu (genBank, # U28749). To umožnilo následně založit genomovou organizaci genu. Pokud jde o sekvenční data je zajímavé uvést, že CT repetice se objevuje v 5' -UTR HMGI-C a GGGGT-pentanukleotid se opakuje v 3'-UTR, což by mohlo představovat určitou regulační relevanci. Srovnání popsaného s genomovými DNA sekvencemi (GenBank, # U28750, U28751, U28752, U28753 a U28754) genu ukázalo, že HMGI-C obsahuje alespoň 5 exonů (obr. 2). Transkripční orientace genu je směrována směrem k telomeru dlouhého ramene chromozomu. Každý z prvních tří exonů kóduje pravděpodobnou DNA vazebnou doménu (DBD), a exon 5 kóduje kyselinovou doménu, která se separuje od tří DBD mezerníkovou doménou, kódovanou exonem 4. Tři exony, kódující DBD, jsou uspořádány relativně blízko sebe a jsou od dalších dvou exonů odděleny velkým intronem o velikosti přibližně 140 kb, přičemž tyto další exony jsou od sebe odděleny přibližně 11 kb. Za pozornost zvláště stojí ta skutečnost, že pět exonů je dispergovaných v genomové oblasti o velikosti alespoň 160 kb, takže většinou pokrývají celkem 175 kb hlavní, výše popsané, oblasti shluků zlomových bodů MAR. Výsledky molekulárních cytogenetických studií, využívajících jako molekulovou sondu směs kosmidů 142H1 (obsahujících exony 1 až 3) a 27E12 (obsahujících exony 4 a 5), jasně ukazují, že HMGI-C gen je ve většině nádorů a nádorových, buněčných linií, které se hodnotily, přímo ovlivněn pozorovanými odchylkami chromozomu 12 (obr. 3; tabulka 4). Tato cytogenetická pozorování byla v případě LM-608/SV40 (výsledky nejsou zařazeny), LM-30.1/SV40 [Schoenmakers, H.F.P.M., Mols, R., Wanschura, S., Kools, P.F.J., Geurts, J.M.W., Bartnitzke,
S., Bullerdiek, J. , Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1994b). Identification, molecular cloning and • · • ·
characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chrom. & Cancer. 11: 106-118.] a Ad-312/SV40 nezávisle potvrzena analýzou na bázi.. Southernova přenosu; přičemž použité sondy zahrnovaly CH76, RM118-A a EM26. Neúspěch při detekci zlomových bodů LM-65/SV40, LM-609/SV40, Ad-211/SV40, Ad-263/SV40, Ad-302/SV40, LÍ-14/SV40 a LÍ-538/SV40, prováděné pomocí libovolné z těchto tří sond, se rovněž shodoval s FISH daty, určujícími relativní polohy zlomových bodů v oblasti MAR (viz obr. 3) . Tyto výsledky učinily z genu HMGI-C základního kandidáta na MAG gen.
3.5. Exprese odchylných HMGI-C transkriptů v buňkách pevných benigních nádorů
Obsah následujících studií se zaměřil na určování možné odchylné HMGI-C exprese. Počáteční studie založené na Northernovu přenosu ukázaly, že transkripty HMGI-C by nemohly být detekovány v celé řadě normálních testovaných tkání (mozek, srdce, plíce, játra, ledvina, slinivka, placenta, kosterní sval) , a stejně tak ani v celé řadě nádorových buněčných linií, jejichž výčet je uveden v tabulce 3 (data nejsou uvedena). Je známo, že koncentrace HMGI-C mRNA v normálních diferencovaných tkáních jsou podstatně nižší než v maligních tkáních [Patel, U.A. a kol., Expression and cDNA cloning of human HMGI-C phosphoprotein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201, 63-70 (1994).; Manfioletti, G. a kol., cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein, a nuclear protein associated wíthneoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucl. Acids Res. 19, 67936797 (1991).]. Jako kontrola byla v Northernových studiích použita hepatomová buněčná linie Hep 3B o níž se ví, že exprimuje relativně vysoké koncentrace HMGI-C. Snadno se určily dva hlavní HMGI-C transkripty, přibližně o velikosti 3,6 a 3,2 kb; přičemž diference v molekulové hmotnosti jsou pravděpodobně způsobeny rozdíly v jejich 5'-nekódujících oblastech. Při alternativním a citlivějším přístupu, který měl detekovat HMGI-C nebo 3'-odchylné HMGI-C transkripty, se provedly 3'-RACE experimenty. V kontrolních experimentech, používajících širokou škálu tkání a odlišné koncentrace HMGI-C transkriptů (vysoké koncentrace v Hep 3B hepatomových buňkách, střední koncentrace v Hep G2 hepatomových --buňkách a nízké koncentrace v myometriu, normální tukové tkáni a pseudomyxomu), se získaly 3'-RACE klony, které, jak se zdá, po molekulárním klonování a analýze nukleotidové sekvence, reprezentovaly perfektní parciální cDNA kopie 3'-HMGI-C mRNA sekvencí; bez ohledu na to, která ze tří zvolených příměrových sad se použila (viz metodologie) . Případně byly pozorovány RACE produkty nejpravděpodobněji odpovídající latentním nebo odchylně sestřiženým HMGI-C transkriptům; jejichž ektopické sekvence se mapovaly zpět na HMGI-C intron 3 nebo 4.
Při podobných 3'-RACE analýzách deseti různých primárních nádorů nebo , nádorových . buněčných linií odvozených z lipomu, děložního leiomyomů a pleomorfního adenomu slinných žláz, se detekovaly jak konstantní, tak tfnik'á'ťní·PCR”produkty7 ΪΖdá^MeT ”že“konsfarrtni”PČFČ=proclukty’ jsou ve většině případů perfektními parciálními cDNA kopiemi 3'-HMGI-C mRNA sekvencí. Nejpravděpodobněji pochází z pravděpodobně neovlivněné HMGI-C alely, a lze je považovat za vnitřní kontroly. Zdá se, že unikátní PCR produkty deseti zde přítomných nádorových buněčných vzorků obsahují ektopické sekvence, nekondenzované na HMGI-C sekvence. Ve většině případů se zjistilo, že jsou tyto • · • φ » 4
Φ Φ ektopické sekvence odvozeny od založených translokačních partnerů, což poskytuje nezávislou evidenci pro translokačně indukovaná přeuspořádání HMGI-C genu. Informace, týkající se nukleotidových sekvencí, diverzních bodů a chromozómových původů ektopických sekvencí těchto RACE produktů, jsou shrnuty v tabulce 5. Je vhodné zmínit, že původy chromozomů ektopických sekvencí byly určeny CASH (chromozomové označení pomocí somatických buněčných hybridů) analýzou pomocí NIGMS lidského/hlodavčího somatického hybridního mapovacího panelu 2, získaného od Coriell· Cell Repositories. Chromozomové označení se pro případy pCHllll, pCH172, pCHl74, pCH193 a pCH117 nezávisle potvrdilo dalšími údaji, které jsou shrnuty v tabulce 5. Pokud se vezmou v úvahu omezení běžné cytogenetické analýzy, zejména v případech se složitými karyotypy, souhlasí chromozomová označení ektopických sekvencí poměrně dobře s předcházejícím cytogenetickým popisem translokací.
Poněkud neočekávané byly údaje získané při použití Ad-312/SV40, protože dostupná molekulární cytogenetická analýza naznačila, že jeho chromozomový 12 zlomový bod je mapován daleko od HMGI-C genu a vzdálenost od tohoto genu přesahuje 1 Mb [Kools, P.F.J., Wanschura, S., Schoenmakers,
E.F.P.M., Geurts, J.W.M., Mols, R., Kazmierczak, B., Bullerdiek, J., Van den Berghe, H. a Van de Ven, W.J.M. (1995). Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12) (p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet. Cytogenet., 79: 1-7.]. Ukázalo se, že tyto ektopické sekvence pochází z chromozomu 1 (přesněji ze segmentu uvnitř M.I.T. YAC částečně mapován na lp22) kontigu WC-511, který je zavedeného translokačního partnera (obr. 2). Provedení další molekulární analýzy je «
« · potřebné pro přesné definování účinku na funkční expresi odchýleného HMGI-C genu v tomto konkrétním případě. Dále je zajímavé zmínit, že sekvence vycházející z chromozomu 1 zřejmě odstraňuje GGGGT repetici, zjištěnou v 3'-UTR oblasti HMGI-C, protože v RACE produktu již tato repetice není přítomná. Na druhé straně v případě primárního děložního leiomyomu LM-#58 (t(8;12) (q24;ql4-ql5) ) , který, jak se ukázalo, má svůj zlomový bod rovněž v oblasti 3'-UTR, byla tato repetice v RACE produktu přítomna. Takže odstranění této repetice není pravděpodobně podstatné pro vývoj. nádoru. Výsledky, dosažené za použití nádoru LM-#168.1, ve kterém je X chromozom cytogeneticky označený translokační partner, ukázaly, že ektopické sekvence se odvodily z chromozomu 14 preferenčního translokačního partnera v leimyomu. Je možné, že zařazení chromozomu 14 nelze v tomto konkrétním případě detekovat pomocí standardního karyotypování jako v případě LÍ-501/SV40. V primárním lipomu Li-#294 (t (8;12) (q22;ql4)), byly detekovány dvě ektopické sekvence. Další CASH analýza, používající hybridní buněčný mapovací panel pro regionální lokalizaci sond na lidský chromozom 8 [Wagner, M.J., Ge, Y., Siciliano, M. & Wells, D.E. A hybrid cell mapping panel for regional localization of probes to-human chromosome 8. Genomics 10, 114-125 (1991).] ukázala, že obě tyto sekvence byly odvozeny z chromozomu 8q22-qter (tabulka 5) . Je velmi dobře možné, že tyto RACE produkty odpovídají alternativně sestřiženým transkriptům. Konečně ve čtyřech případech (tabulka 5, případy pCH114, pCHllO, pCH109, pCH116) se zdá, že RACE produkty odpovídají latentním nebo odchylně sestřiženým HMGI-C transkriptům, protože se zjistilo, že odpovídající ektopické sekvence jsou odvozeny bud’ z HMGI-C intronu 3 nebo 4. Tyto RACE produkty byly rovněž pozorovány • ·
při výše popsaných kontrolních experimentech. Na závěr je možné říci že detekce odchylných HMGI-C transkriptů v nádorových buňkách poskytuje další silný argument pro HMGI-C, který je konzistentně přeuspořádán různými odchylkami chromozomu 12. Je vhodné uvést, že odchylné HMGI-C transkripty by měly být v jednotlivých případech charakterizovány celou svou délkou před vyslovením jakéhokoliv závěru, týkajícího se biologických implikací.
První a předběžné vyhodnocení izolovaných ektopických sekvencí poskytlo fázové otevřené čtecí rámce různé délky. Například v případě primárního nádoru LM-#25 se již druhý kodon ektopických sekvencí zdál být koncovým kodonem (tabulka 5) . Zde je třeba upozornit, že sekvenční data byla získána pouze pro klony, které byly produkovány během dvou kol extenzívní PCR (zahrnující pravděpodobně mutace). V případě LÍ-501/SV40 je zajímavé zmínit, že při Northernově přenosu izolované ektopické sekvence detekovaly v různých tkáních, včetně srdce, ledviny, jater, plic, slinivky, placenty a kosterního svalu, ale s výjimkou mozku (data nejsou uvedena), transkript, přesahující 10 kb. Protože chromozom 3 je výhodným partnerem při chromozómových 12ql3-ql5 translokacích v lipomech a protože se zjistilo, že tyto chromozomové 3 zlomové body různých lipomů jsou překryty YAC klonem CEPH192B10, mohl by detekovaný transkript odpovídat. genu partnera, výhodného pro pravděpodobný lipom (LPP).
4. Diskuse
V dodatku 1 je uvedeno, že chromozomové 12ql3-ql5 zlomové body lipomů pleomorfního adenomu slinných žláz a • · • · · • · · • ···· · ···· ·· děložního leiomyomu, v minulosti označovány cytogeneticky nesprávně jako segment ql3, ql4 nebo ql5 chromozomu 12, se shlukují v 1,7Mb DNA intervalu, označeném jako MAR. Potvrzení tohoto, shlukování zlomových bodů představuje nedávná studie Schoenberga Fejza a kol. [Schoenberg Fejzo, M., Yoon, S.J., Montgomery, K.T., Rein, M.S., Weremowicz, S., Krauter, K.S., Dorman, T.E., Fletcher, J.A., Mao, J., Moir, D.T., Kucherlapati, R.S. a Morton, C.C. (1995). Identification of a YAC spanning the translocation breakpoints in uterine leiomyomata, pulmonary chondroid hamartoma and lipoma. Physical mapping of the 12ql4-15 breakpoint region in uterine leiomyomata. Genomics 26: 265275.], identifikující CEPH mega-YAC rozpětí translokačních zlomových bodů chromozomu 12 ve dvou ze tří popisovaných typů nádorů. Analýza FISH ukazuje, že zlomové body chromozomu 12 sedmi různých typů pevných nádorů se shlukují v relativně malém (175 kb) segmentu MAR. V případě některých nádorových buněčných linií se získala pomocí Southernova přenosu data, která ve všech případech potvrzovala výsledky analýzy FISH. Ze všech těchto pozorování vyplývá, že tento segment MAR tvoří hlavní cílovou oblast pro odchylky chromozomu 12 těchto nádorů, a že pravděpodobně reprezentuje předpokládané MAG místo (místo růstu multinádorových odchylek), které lze považovat za společný jmenovatel těchto nádorů. ___ __________.
V 175 kb MAR segmentu se identifikoval HMGI-C gen a stanovily se charakteristiky jeho genomové organizace. Strukturně HMGI-C kóduje fosforprotein, tvořený třemi pravděpodobnými DNA vazebnými doménami, mezerníkovou oblastí a terminační doménou, zakončenou kyselinovou karboxyskupinou a obsahující potenciální fosforylační místa jak pro kaseinkinázu II, tak pro p34/cdc2 [Patel, U.A. a • · ·«· ·· ·· · kol., Expression and phosphoprotein. Biochem.
cDNA cloning of human HMGI-C Biophys. Res. Commun. 201, 63-70 (1994).; Manfioletti, G. a kol., cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein, a nuclear protein associated withneoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucl. Acids Res. 19, 67936797 (1991) . ] . Z těchto studií vyplývá, že HMGI-C je hlavním kandidátem pro cílový gen v různých typech zde testovaných nádorů. Při studiích FISH se zjistilo, že 29 ze 33 zlomových bodů primárních nádorů je zmapováno mezi dvěma vysoce informativními kosmidy 142H1 a 27E12, přičemž první z nich' obsahuje tři exony kódující DBD a druhý obsahuje zbývající exony, které kódují dvě další domény. Takže většina těchto zlomových bodů je zmapována uvnitř zmíněného genu, přičemž většina z nich se pravděpodobně nachází ve 140 kb intronu (intronu 3), což rovněž odpovídá výsledkům analýzy FISH, získaným při hodnocení 26 nádorových buněčných linií. Je třeba uvést, že 5'-konec HMGI-C genu není ještě zcela charakterizován. Protože je známo, že HMGI(Y), což je další člen této genové rodiny, vykazuje různé alternativní první exony [Friedman, M., Holth, L.T., Zoghbi, H.Y. & Reeves, R. Organization, inducibleexpression and chromosome of the human HMG-I(Y) nonhistone protein gene. Nucl. Acids Res. 21, 4259-4267 (1993).], velikost HMGI-C genu může být větší, než se předpokládá.
že HMGI-C je .ovlivněn___odchylkami
3'-RACE
Dal_ší _ důkaz toho, chromozomu 12 lze vydedukovat z výsledků experimentů. Odchylné HMGI-C transkripty byly zjištěny v nádorových buňkách, tvořených přepsanými HMGI-C sekvencemi kondenzovanými na nově získané sekvence, které ve většině případů zřejmě pocházejí z chromozomů, které byly cytogeneticky identifikovány jako translokační partneři. Ukázalo se, že mnoho chromozomů se nachází ve studovaných • · nádorech jako translokační partner. Tato heterogenita v převrácených oblastech zlomových bodů při zmíněných translokacích připomíná varietu hematologických malignancí s chromozómovým llq23 přeuspořádáním, zahrnujícím MLL gen [Rabbitts, T.H. Chromosomal translocations in human cancer. Nátuře 372, 143-149 (1994).], jehož translační produkt nese motiv zakončený aminoskupinou, příbuzný s motivy, vážícími DNA HMGI proteinů.
Spekulativní výsledky se týkají vlivu odchylek chromozomu 12 na expresi HMGI-C genů a přímý vliv na fyziologické implikace. Některé funkční vlastnosti HMGI-C jsou známy nebo mohou být spekulativně odvozeny ze studií dalších členů této genové rodiny. Protože se váže v minoritním žlábku DNA, dá se předpokládat, že HMGI-C může hrát určitou roli při organizování satelitního chromatinu nebo působit jako transkripční faktor [Yang-Yen, H.F. & Rothblum, L.I. Purification and characterization of a highmobility-group-like DNA-binding protein that stimulates rRNA synthesis in vitro. Mol. Cell. Biol. 8, 3406-3414 (1988).; Reeves, R., Langan, T.A. & Nissen, M.S. Phosphorylation of the DNA-binding domain of nonhistone high-mobility group I protein by cdc2 kinase: reduction of binding affinity. Proč. nati. Acad. Sci. U.S.A. 88, 16711675 (1991).]. Studie, prováděné na HMGI(Y), který je členem nejblíže příbuzným HMGI-C, navrhly, že HMGI (Ϋ) může působit jako pomocný faktor pro NF-κ B transkripční aktivity, specifické pro promotor [Thanos, D. & Maniatis, T. The high mobility group protein HMGI(Y) is required for NF- B-dependent virus induction of the human IFN-β gene. Cell 71, 777-789 (1992).]. Rovněž se ukázalo, že HMGI(Y) stimuluje nebo inhibuje DNA vaznost distinktních ATF-2 isoformů transkripčního faktoru [Du, W. & Maniatis, T. The • · · » · I • · · · ·· ► · · « ··*· ·· high mobility group protein HMGI(Y) can stimulate or inhibit DNA binding of distinct transcriptional factor ATF-2 isoforms. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1131811322. (1994) .]. Obě.....studie naznačuj í, -- že protein může jednoduše tvořit strukturní složku transkripčního aparátu, fungujícího ve smyslu promotoru a zesilovače. Nedávno bylo poukázáno na protein vysoce mobilní skupiny (HMGI), což je ještě další člen HMG genové rodiny s podobnou doménovou strukturou jako HMGI-C, který působí jako kvazitranskripční faktor při genovém přepisu a jehož zkrácený HMGI ^protein postrádá oblast končící kyselinovou karboxyskupinou a inhibuje, jak se ukázalo, genový přepis [Aizawa, S., Nishino, H., Saito, K., Kimura, K., Shirakawa, H. & Yoshida, M. Stimulation of transcription in cultured cells by high mobility group protein 1: Essential role of acidic carboxy-terminal region. Biochemistry 33, 1469014695 (1994).]. Rovněž bylo je, podstatné pro zvýšení genové exprese. Protože se většina zlomových bodů chromozomu 12 nachází ve 140 kb intronu, dochází k separaci DBD domény zakončené karboxylovou skupinou poměrně často. V případě kyselinové domény v HMGI-C má podobnou funkci jako v HGMI(Y), přičemž výsledkem odchylek chromozomu 12 je pravdě podobně. ovlivn ění_ ...genoy é^expr es e. _^Kon.ečně„_j.e _.t. ř.eba zmínit, že předurčení sekvencí kódujících oblast zakončenou kyselinovou karboxylovou skupinou není doposud známo.
zjištěno, že kyselinové kromě eliminace represe zakončení HMGI molekuly způsobené navázáním DNA,
Protože HMGI-C je prvním členem HMG genové rodiny, která se může podílet na vývoji benigních nádorů, vyvstává zde otázka, zda lze výše získané poznatky aplikovat na další členy této rodiny. HMG proteinová rodina je tvořena třemi podrodinami: i) typem proteinů HMGI a 2, které, jak
• 4 4 4 4 • ···· « • · • 4 ·
se zjistilo, zvyšují transkripci in vitro a mohou být velmi dobře členy větší třídy regulátorů s HMG boxy; ii) nahodile svinutými proteiny HMG14 a 17 s ještě neznámou funkcí; iii) HMGI-typem proteinů, které se váží do menšího žlábku a zahrnují HMGI-C, HMGI a HMGI-Y; přičemž poslední dvě jsou kódovány stejným genem. Je zajímavé zmínit, že publikované, zmapované polohy členů HMG rodiny odpovídají publikovaným zlomovým bodům chromozomů benigních pevných nádorů, které zde byly popsány. HMGI(Y) gen byl například zmapován na lidském chromozomu 6p21 [Friedman, M., Holth, L.T., Zoghbi, H.Y. & Reeves, R. Organization, inducible-expression and chromosome of the human HMG-I(Y) nonhistone protein gene. Nucl. Acids Res. 21, 4259-4267 (1993) . ] který, jak je známo, je zahrnut v souběžných translokacích, pozorovaných v děložním leiomyomu, lipomu a pleomorfním adenomu slinnýeh žláz [Mitelman F. (1994): Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. 4. vyd., New York, Wiley-Liss.]. Jak je uvedeno v lidské genomové databázi, ne všichni známí členové HMG rodiny jsou v současnosti chromozomálně označeni, ačkoliv poloha některých z těchto členů byla relativně přesně zmapována. Například HMG17 pro chromozom Ip36.1-p35, HMG1L pro 13ql2 a HMG14 pro 21q22.3 představují chromozomové segmenty, ve kterých byly zjištěny chromozomové zlomové body zde studovaných typů nádorů [Mitelman F. (1994): Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. 4.' vyd. , New
York, Wiley-Liss.]. Nyní zbývá zjistit, zda jsou HMGI(Y) , nebo libovolný další člen této HMG skupiny, skutečně ovlivněny v dalších podskupinách těchto nádorů. Za zmínku stojí dále syndromy, například Bannayan-Zonana (McKusick # 153480) , Próteus (McKusick # 176920) a Cowden (McKusick # 158350); přičemž poslední syndrom se rovněž označuje jako mnohočetný hemartomový syndrom. V 60 % jedinců s ·
► a
4
4 4
4444 4« kongenitálním Bannayan-Zonana syndromem byly zjištěny makrocefalie s mesodermálními hemartomy, diskrétními lipomy a hemangiomy [Rabbitts, T.H. Chromosomal translocations in human cancer. Nátuře 372, 143-149 (1994).]. .
Konečně posledním faktem vyplývajícím ze získaných výsledků, který by neměl uniknou pozornosti, je to, že všechny hodnocené nádory v této studii byly mesenchymálního původu nebo obsahovaly mesenchymální složky. Zajímavé by bylo zjistit, zda je pozorované zařazení HMGI-C specifické pouze pro nádory mesenchymálního původu, nebo zda-li se může nacházet rovněž v nádorech jiného původu. Různé, zde popsané DNA klony jsou hodnotnými zdroji pro zjištění těchto důležitých faktů, které mohou usnadnit studie výsledné implikace HMGI-C genů v genezi nádorů.
Příklad 3
Přeuspořádání dalšího členu HMG genové rodiny
1. Úvod
Tento příklad jasně ukazuje, že v dané nádorové entitě (t j . pulmonálních chondroidních hemartomech, děložních leiomyomech a endometriálních polypech) dojde ke vzniku his t o 1 o g i c kyprakti c k y v z á j emn ě me r o z 1 řši t e 1 n ýc h ná do rύ”ν'“ případě, že je HMGI-C gen nebo HMGI(Y) gen ovlivněn chromozómovým přeuspořádáním. Takže ve skutečnosti je možné definovat skupinu genů, která vede k abnormálnímu mesenchymálnímu růstu a zahrnuje neomezujícím způsobem HMGI-C a HMGI(Y).
2. Materiál a metody
2.1. Příprava chromozomu
Příprava chromozomu se prováděla .....následujícími rutinními způsoby. Buňky se ošetřily 30 μΐ colcemidu (10 gd/ml) v průběhu dvou až tří hodin a následně se sklidily za použití trypsinové metody (0,05 % trypsinu a 0,02 % EDTA) a následně se podrobily dvacetiminutovému hypotonickému šoku v šestinásobně naředěném médiu TC 199 při pokojové teplotě a fixaci směsí methanolu a kyseliny octové (3 : 1). Chromozomy se následně GTG-pásmovaly.
2.2. Hybridizace insert šitu
Hybridizace in šitu se provedla způsobem popsaným v jednom z předcházejících příkladů.
2.3. Průzkum PAC knihovny
PAC Service, metodou HMGI(Y) knihovna (Genome Systems Library Screening
St. Louis, Missouri, USA) byla prozkoumávána PCR za použití primerové sady, specifické pro gen. Pro průzkum byl navržen původní primer s následující sekvencí:
5'-CTC CAA GAC AGG CCT CTG ATG T-3' (intron 3) a zpětný primer:
5'-ACC ACA GGT CCC CTT CAA ACT A-3' (intron 3) poskytující fragment 338 bp. Pro amplifikaci následující konečné cyklizace se použilo: 94°C, 5 min, (94°C, 1 min,
59°C, 1 min, 72°C, 2 min) x 30, 72°C, 10 min.
• φ · · φ φ · · φ φ φ φ
2.4. DNA přípravky z PAC klonů
Bakteriální kolonie, obsahující jednoduché PAC klony, se inkubovaly v LB médiu a nechaly růst přes noc při 37°C. 660 μΐ této kultury se doředilo do 25 ml LB média a klony rostly na OD550 0,05 až 0,1. Přidáním IPTG do konečné koncentrace 0,5 mM se indukoval PÍ lytický replikon. Po přidání IPTG se pokračovalo v růstu na OD55o 0,5 až 1,5 a plasmid DNA se extrahoval za použití alkalického lyzového postupu doporučeného genomovými systémy.
3. Výsledky
Primerová sada pro průzkum lidské PAC knihovny se navrhla ze sekvencí, příslušících intronu 3 HMGI(Y). Vzhledem k sekvenční homologii mezi HMGI-C a HMGI(Y) amplifikovanou sekvencí 338 bp bylo možno testovat homologickým průzkumem, specifickým výlučně pro HMGI(Y). Průzkum knihovny poskytl tři pozitivní PAC klony, které měly průměrnou délku inzertu přibližně 100 kb. Dva z těchto klonů (Pac604, Pac605) se použily pro následující FISH studie. Pro potvrzení přeuspořádání HMGI(Y) v nádorech s translokacemi, zahrnujícími 6p21.3 buď v jednoduché nebo složité formě, se použila analýza FISH na rozšíření metaf á-ze=~=ze—čfe-y-ř- primárních pulmonálnich chondroidních hemartomů a dvou endometriálních polypů s abnormalitou 6p21.3. V každém případě se hodnotilo 20 metafází. Alespoň jeden ze dvou výše popsaných PAC klonů Pac604 a Pac605 byl přetnut zlomovým bodem ve všech šesti analyzovaných případech. Tyto výsledky jasně ukazují, že zlomové body těchto nádorů se zde zjištěnými abnormalitami 6p21 se shlukují buď v HMGI(Y) genu nebo v jeho těsné blízkosti.
• ·
Příklad 4
Hybridní HMGI-C v lipomových buňkách
Izclovsly se cDNA klony genu LPP, “ představujícího výhodného partnera lipomu odvozeného od chromozomu 3 (>50 kb) a stanovila se jejich nukleotidová sekvence. Data kompozitu cDNA jsou znázorněna na obrázku 4. Identifikoval se otevřený čtecí rámec pro protein (612 aminokyselin (aa)) s aminokyselinovou sekvenční podobností (přes 50 %) s kuřecím zyxinem. Zyxin je členem LIM proteinové rodiny, jejíž všechny členy obsahují tak zvané LIM domény [Crawfod, A.W., Pino, J.D. & Beckerie, M.C.J., Cell. Biol., 124, 117127 (1994).]. LIM domény jsou na cystein bohaté proteinové sekvence vážící zinek, které se nacházejí v rostoucím počtu proteinů s diverzními funkcemi, včetně transkripčních regulátorů, proto-onkogenových produktů a složek adhezních plak. Zjistilo se, že mnoho členů LIM rodiny hraje určitou roli při signalizaci buněk a kontrolách předurčení buněk během vývoje. V nedávné době bylo dokázáno, že LIM domény jsou modulárními rozhraními, vážícími proteiny [Schmeichel,
K.L. & Beckerie, M.C. Cell, 79, 211-219 (1994).]. Podobně jako zyxin, který se nachází na místech buněčného přilnutí k extracelulární matrici a k dalším buňkám, bude odvozený protein, kódovaný pomocí LPP (obr. 6), vykazovat tři domény a postrádat klasické^ homeodomény., vážící DNA....... .
Ve 3'-RACE analýze LÍ-501/SV40 se identifikoval HMGI-C, obsahující kondenzační transkript, z něhož je možné předpovědět hybridní protein (324 aa), a který se následně navrhne tak, aby obsahoval tři DBD (83 aa) HMGl-C a karboxylové konce těchto tří LIM domén (241 aa), kódovaných pomocí LPP. Při PCR analýze, používající příslušné sady uhnízděných amplimerů se v různých primárních lipomech a
• · lipomových buněčných liniích, nesoucích t(3;12) a rovněž v cytogeneticky normálním lipomu detekovaly podobné HMGI-C/LPP hybridní transkripty. Tato data ukázala, že cytogeneticky detekovatelné a rovněž skryté t(3;12) translokace v lipomech mají za následek fúzi molekul HMG1-C, vážících DNA na předpokládaná molekulová rozhraní proteinu kódovaného pomocí LPP, vážící protein ve fázi, čímž se kyselinová doména HMG1-C nahradila LIM doménami. Následně tato rozhraní, vážící protein, která se nejpravděpodobněji nachází v okolí jádra těchto lipomových buněk, mohla ovlivnit genovou expresi, což může vést k odchylné růstové kontrole. Mimo velkou varietu benigních mesenchymálních nádorů s odchylkami chromozomu 12ql3-ql5 je toto první příklad chromozomového translokačního partnera, který přispívá současně a následně k vytvoření dobře definovaného HMG1-C fúzního proteinu, souvisejícího s nádorem.
Obrázek 5 znázorňuje cDNA sekvenci zcela izolovaného LPP genu.
Příklad 5
Diagnostický test pro lipom
Pacientovi, majícímu lipom se odebrala biopsie. Z takto získaného materiálu se pomocí standardního postupu TRIZOL LS od společnosti GIBCO/BRL, popsaného v manuálu výrobce, extrahovala celá RNA. Tato celá RNA se použila pro přípravu prvního řetězce cDNA, který se připravil pomocí reverzní transkriptázy (GIBCO/BRL) a oligo dT(17) primerů, obsahujícího navázaný krátký, dodatečný nukleotidový úsek.
Sekvence použitého primeru je popsána v příkladu 2, odstavci 2.5. RNáza H se následně použila pro separování RNA ze syntetizované DNA/RNA hybridní molekuly. PCR se provedlo za použití genově specifického primeru (příklad 2, odst. 2.5.) a primeru, komplementárního k navázanému krátkému doplňkovému nukleotidovému řetězci. Takto získaný PCR produkt se analyzoval pomocí gelové elektroforézy. Fúzní konstrukty se detekovaly srovnáním s pásy pozadí normálních buněk stejného jedince.
V ' dalším experimentu se provedlo druhé kolo polouhnízděných PCR za použití jednoho vnitřního primeru a primeru, komplementárního ke krátkému nukleotidovému úseku. Tím se značně zvýšila citlivost testu.
Obrázek 8 znázorňuje typický gel.
Příklad 6
Odchylky 12ql4-15 a 6p21 v pulmonálních chondroidních hernartomech
1. Úvod
Pulmonální chondroidní hemartomy (PCH) se často děťékují při rentgenování plic, jako tzv. „korunové léze. Nicméně plicní metastázy maligních nádorů, a řidčeji plicní rakoviny, mohou rovněž existovat jako korunové léze. Tento příklad ukazuje, že ke správnému rozlišení většiny PCH a maligních nádorů lze použít metodu FISH, vyžadující minimální množství nádorových buněk. Tento test lze tedy úspěšně aplikovat například na nádorové buňky, získané pomocí tenké jehly.
• ·
9
2. Materiály a metody
V této studii byly zahrnuty vzorky z 80 histologicky charakterizovaných PCH. Buněčné kultury se získaly způsobem popsaným v předcházejících příkladech a rovněž příprava chromozomu a analýza FISH se prováděly způsoby již popsanými v předcházejících příkladech.
3. Výsledky
Cytogenetické studie ukázaly, že 80 PCH, studovaných cytogeneticky, poskytlo 51 detekovatelných odchylek, zahrnujících bud’ 12ql4-15 nebo 6p21. Pomocí analýzy FISH, používající buď skupinu kosmidů příslušících k HMGI-C genům, nebo PAC klony HMGI(Y) , popsané v předcházejícím příkladu, se detekovala skrytá strukturní přeuspořádání těchto oblastí ve čtyřech dalších případech (tři se začleněním 12q a jedno se začleněním 6p). Samotný test FISH může být tedy použit jako sada pro přesné detekování, přeuspořádání HMGI-C nebo HMGI(Y) genová přeuspořádání ve více než 50 % PCH, a je tedy hodnotným pomocným nástrojem pro diagnostikování těchto nádorů (aniž by se omezoval na tento typ nádorů, jak bude ukázáno ve dvou dalších případech).
·· ·· ·· · ·· ·· ···« · · · · · · · • · * · ··· · · · · • · · · · ··♦··· · · · · · ······ · · · ···· ·· ·· · ·· ·»
Příklad 7
Diagnóza nádorů měkké tkáně, zejména adipocytového původu
1, Úvod
Nádory adipócytové tkáně často způsobují problémy s diagnostikováním, zejména pokud se materiál odebere z biopsií odebraných tenkou jehlou nebo kryosekcí. Tento příklad ukazuje platnost testu FISH v případě diferenční diagnózy nádorů adipocytové tkáně a řídkých nádorů měkké tkáně.
2. Materiály a způsoby
2.1. Nádorové vzorky
Nádorové vzorky ze tří nádorů měkké tkáně se testovaly pomocí analýzy FISH. První vzorek se získal z adipocytového nádoru a histologicky představoval buď atypický lipom nebo dobře diferencovaný liposarkom. Druhým diagnostikovaným vzorkem byl nejpravděpodobněji myxoidní liposarkom, ale rovně lze uvažovat další typy maligních nádorů měkké tkáně, včetně agresivního agiomyxomu. Třetí nádor byl rovněž adipocytového původu a uvažoval se jak lipom, tak dobře diferencovaný liposarkom.
2.2. Izolace buněk a FISH
Nádorové vzorky se enzymaticky dezintegrovaly následujícími rutinními metodami. Výsledné jednobuněčné suspenze se odstřeďovaly a fixovaly pomocí směsi methanolu ·· · a ledové kyseliny octové (3:1), 1 hodinu při pokojové teplotě. Tyto buněčné suspenze se následně nakapaly na čistá a suchá podložní sklíčka a nechaly stárnout 6 hodin při 60°C. Při analýze FISH se použily molekulové sondy z HMGI-C genu, které byly popsány v předcházejících příkladech.
3. Výsledky
Na. interfázové úrovni jak první nádor, tak nádor druhý vykazoval dělící signály pro jednu z alel. Tato zjištění se slučují s diagnózou benigních nádorů, tj . atypickým lipomem v prvním případě a agresivním agiomyxomem v případě druhém. Tato zjištění umožňují vyloučit přítomnost maligních a dipocytových tkáňových nádorů.
Ve třetím případě analýza FISH zjistila vysoký stupeň amplifikace oblasti MAR nebo její části. Protože amplifikační jednotky, pozorované v obřích signálních znacích, nebo kruhové chromozomy, v dobře diferencovaných liposarkomech, mohou zahrnovat MAR oblast, vedou tato zjištění k diagnostikování dobře diferencovaného liposarkomu. Tři případy, prezentované v tomto příkladu, potvrzují použitelnost popsaných DNA sond. Lze je použít v .sadě™pro^=--rel-a-t-i-vuě=-=—r-y-Ghlý-“:=-a= =j^ednoduchý-^^inter fázový experiment. FISH, nabízející další nástroj pro diagnostikování nádorů v měkké tkáni.
·· · ···*
Příklad 8
Exprese HMGI-C genu v normální tkáni
1. Úvod
Cílem tohoto příkladu je ukázat, že exprese HMGI-C genu se omezuje hlavně na lidské tkáně, vznikající v průběhu embryonálního a fetálního vývoje, zatímco u většiny normálních tkání dospělé osoby, zejména zahrnujících ty tkáně a orgány, ze kterých mohou vzniknout nádory s HMGI-C přeuspořádáními, nebyla žádná exprese zjištěna. To naznačuje, že i transkripční reaktivace genu může iniciovat genezi nádoru. Na druhé straně je třeba podtrhnout použitelnost protismyslných strategií (včetně těch protismyslných molekul, které směřují k normální HMGI-C mRNA) při inhibici nebo zastavení nádorového růstu.
2. Materiály a metody
2.1. Tkáňové vzorky
Všechny dospělé tkáňové vzorky, použité pro tuto studii, se odebraly z chirurgicky izolované tkáně, zmrazené v kapalném dusíku během 15 minut po chirurgické izolaci těchto tkání. Většina vzorků byla izolována během chirurgického odstraňování nádoru z normální tkáně, sousedící s tímto nádorem. Konkrétně se použilo osm vzorků odebraných z tukové tkáně v různých anatomických místech, dvacet vzorků odebraných z myometrické tkáně, osm vzorků z plicní tkáně, čtyři vzorky ze slinných žláz (Glandula parotis a Glandula submandibularis) , jeden tkáňový vzorek odebraný ze srdečního svalu, dvacet pět vzorků odebraných ·· 9 »· 99 • · · • · 9
9 ·· ·· » 9 9 · · 9 « »99· · · 99 » 9 99·· 9 ··· 9 « ► 9 · 9 9, • 9 9 99 99 od pacientů různého stáří z prsní tkáně, dva vzorky z mozku, tři jaterní vzorky, sedm vzorků odebraných z ledvinové tkáně a embryové/fetální tkáně (šest vzorků) z embryí/plodů (desátý až čtrnáctý týden těhotenství) po interrupcích, provedených ze sociálně ekonomických důvodů.
Dále se použily tři buněčné linie: jako kontrolní vzorek HMGI-C exprese se použila hepatomová buněčná linie Hep 3B a buněčná linie L14, získaná z lipomů s typickou translokací t(3;12). Jako negativní kontrola se použily buňky HeLa, protože RT experimenty, reprodukované desetkrát, nezjistily v prováděných studiích HMGI-C expresi.
2.2. RT-PCR pro expresi HMGI-C
100 ml tkáňového vzorku se homogenizovalo a RNA se izolovala pomocí trizolového reakčního činidla (GibcoBRL, Eggenstein, Německo), obsahujícího fenol a isothiokyanát. K syntéze cDNA se použil póly(A)-oligo(dt)17 primer a M-MLV reverzní transkriptáza (GibcoBRL, Eggenstein, Německo). Následně se použila polouhnízděná PCR. Pro první a druhou PCR se použil stejný nižší primer (Revex 4) (5'-TCC TCC TGA GCA GGC TTC-3' (exon 4/5)). V prvním kole -PC R po užil - specifický vyšší prime r ,= (SE Ij (5'-CTT CAG CCC AGG GAC AAC-3' (exon 1)) a v druhém kole PCR se použil uhnízděný vyšší primer (Pl) (5'-CGC CTC AGA AGA GAG GAC-3' (exon 1)). Obě kola PCR se provedla ve lOOml objemu, obsahujícím 10 mM tris/HCl pH 8,0, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,001 % želatiny, 100 μΜ dATP, 100 μΜ dTTP, 100 μΜ dGTP, 100 μΜ dCTP, 200 nM vyššího primerů, 200 nM nižšího primerů a jednu jednotku/100 μΐ • · ·*
AmpliTaq polymerázy (Perkin Elmer, Weiterstadt, Německo) . Amplifikace se prováděla ve třiceti cyklech (1 minuta 94°C, 1 minuta 53°C, 2 minuty 72°C). Jako matrice v prvním kole PCR se použila cDNA, odvozená z 250 ng celkové RNA, a v druhém kole PCR se použil 1 μΐ první PCR reakční směsi.
2.3. Kontrolní test pro intaktní mRNA/cDNA
Jako kontrolní reakce pro intaktní RNA a cDNA se použil -test PCR, založený na amplifikaci cDNA glyceraldehyd
3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) provozního genu. PCR reakce se prováděla ve třiceti pěti cyklech, za stejných podmínek, jaké byly použity ve výše popsaném prvním kole PCR HMGI-C exprese.
3. Výsledky
Všechny experimenty, prováděné ve studiích exprese se zopakovaly alespoň dvakrát. Exprese provozního genu GAPDH se prováděla rutinním RT-PCR způsobem, čímž se zajistilo, aby všechny RNA cDNA přípravky, použité pro RT-PCR byly intaktní (jinak by se dosáhlo nesprávných negativních výsledků). Pozitivní GAPDH RT-PCR poskytla 299 bp fragment. Do této studie se zahrnuly pouze vzorky, poskytující pozitivní GAPDH RT-PCR. Výsledkem RT-PCR v HMGI-C pozitivních buňkách, například Hep 3B a L14, byla detekce specifického 220 bp fragmentu. HeLa buňky nevykazovaly expresi HMGI-C. Kromě dvou myometrických vzorků (pravděpodobně v důsledku submikroskopické hladiny myomů) , všechny vzorky normální tkáně, odebrané z dospělých jedinců, nevykazovaly detekovatelnou hladinu HMGI-C ·· 9· 9 ·· *· » · · · · · β 9 9«· • · · 9 9 9 9 .9 9 ·· • · · 9 9 · ···· · 999 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 • •99 ·· 99 9 ·· ·· exprese. Na druhou stranu všechny fetální/embryové testované tkáně ukazovaly HMGI-C expresi.
Příklad 9
Exprese HMGI-C genu jako diagnostický nástroj pro včasnou detekci leukémií
1. Úvod
Cytogeneticky detekovatelné odchylky, ovlivňující HMGI-C gen byly nalezeny v celé řadě různých benigních pevných nádorů mesenchymálního původu. Odchylky zřejmě rovněž vedou ke transkripční aktivaci genů. Vzhledem k tomu, že krevní buňky jsou rovněž mesenchymálního původu, provedla se u leukemiových buněk analýza na HMGI-C expresi. Příklad 9 ukazuje, že aktivace genů v buňkách periferní krve je vhodným signálním znakem, označujícím nezralé buňky a abnormální kmenové buňky, zjištěné při leukémii. Protože exprese HMGI-C lez určit s vysokým stupněm citlivosti, může být RT-PCR metoda pro stanovení exprese genů pro velmi brzkou detekci různých hematologických chorob použita.
2. Materiály a způsoby . . .
Vzorky, získané z periferní krve dvaceti sedmi pacientů s různými typy leukémií, včetně devatenácti pacientů s pozitivním CML chromozomem Philadelphia, pěti pacientů s AML a třemi pacienty s ALL, se použily pro stanovení HMGI-C expresi. Krevní vzorky z patnácti zdravých jedinců se použily jako kontrolní vzorky.
• 9 9
999 999 9 * » 9
999 9999 99 ·9
9 999 999999 9999 9
9 9 9 9 9 999
9999 99 99 9 99 99
RT/PCR pro expresi HMGI-C se prováděla způsobem, popsaným v příkladu 8;
3. Výsledky
Zatímco exprese HMGI-C byla jasně detekována ve všech krevních vzorcích leukemických pacientů, nebyla zjištěna ani v jednom ze vzorků, odebraným kontrolním osobám. Není zcela zřejmé, zda je transkripční aktivace genů způsobena mutacemi, ovlivňujícími gen nebo jeho okolí. Je rozumnější předpokládat, že aktivace je spíše sekundárním jevem, souvisejícím s nezralostí buněk nebo jejich abnormální proliferací. Nicméně vysoká a dokonce zvýšená senzitivita činí například ze sady, fungující na bázi RT-PCR analýzy exprese HMGI-C genu, velmi vhodný diagnostický nástroj.
Příklad 10
Transkripční reexprese HMGI-C genu může vést k iniciaci nádorů
1. Úvod
Tento příklad jasně ukazuje, že pro chromozomové zlomové body určitých nádorových entit, nacházejících se na 5'-konci HMGI-C genu, rovněž existuje indikace, která se zakládá na skutečnosti, že zvýšená transkripce genu je dostatečná pro iniciaci růstu odpovídajících typů nádorů.
·· *· • · * · · • · · ·
2. Materiály a metody
2.1. Buněčná kultura doplněným (200 gg/ml) střeptornyčinem
Po chirurgické izolaci buněčných vzorků (tří pulmonálních chondroidních hemartomů a jednoho děložního leiomyomu) se tyto vzorky promyly Hankovým roztokem, penicilínem (200 IU/ml) a
Nádory se dezintegrovaly kolagenázou 5 až 6 hodin při 37°C. Suspenze, obsahující malé fragmenty a jednoduché buňky, se resuspendovaly v kultivačním médiu TC 199 s Earleovými solemi, doplněným 20% fetálním bovinním sérem, 200 IU/ml penicilínu a 200 μg/ml streptomycinu.
2.2. Přípravy chromozomů
Pro přípravu chromozomů se použily následující rutinní způsoby. Buňky se ošetřily 30 μΐ colcemidu (10 μg/ml) v průběhu 2 až 3 hodin a následně sklidily za použití trypsinové metody (0,05% trypsin, 0,02% EDTA), následně se podrobily dvacetiminutovému hypotonickému šoku v šestinásobně naředěném médiu TC 199 při pokojové teplotě a fixaci směsí methanolu a kyseliny octové (3 : 1). Chromozomy se následně GTG-pásmovaly.
2.3. Studie FISH
Pro zřejmou identifikaci chromozomů se po GTG-pásmování stejných metafázových růstů použila analýza FISH. Jako DNA sondy se použilo pět kosmidů, náležících k YAC kontigu překrývajícímu HMGI-C, jak je popsáno v legendě ·« ·♦ » · · a • · a ·· * · a • ea »··· ·· k obrázku 2. Tři z těchto kosmidů (27E12, 185H2 a 142H1) jsou zmapovány ve třetím intronu HMGI-C, zatímco kosmidy 260C7 a 245E8 se nacházejí na 3', resp. 5'-konci. Podložní sklíčka se analyzovala pomocí Zeissova ..(Zeiss, Oberkochem, Německo) fluorescenčního mikroskopu Axioplan. Výsledky se zpracovaly a zaznamenaly za použití systému „Power Gene Karyotyping System (PSI, Halladale, Velká Británie). Rychlá amplifikace cDNA konců (RACE) se provedla způsobem, popsaným v jednom z předcházejících příkladů.
3. Výsledky
Všechny čtyři nádory vykazovaly stejný typ cytogenetické abnormality, tj . přítomnost 47 chromozomů zahrnujících dva zřejmě normální chromozomy 12, a dalších odvozených 14 der(14)t(12; 14 ) (ql4-15;q24) , ale bez odpovídajícího der(12). Vzhledem k orientaci 3'-5' HMGI-C směřující k centromeru, by mohl jediný zlom uvnitř HMGI-C genu vést ke ztrátě 5'-části společně se ztrátou der(12). Proto byla provedena série experimentů FISH, jejichž úkolem bylo přesnější stanovení zlomových bodů. Při použití pěti kosmidů 260C7, 27E12, 185H2, 142H1 a 245E8 byly u obou normálních chromozomů 12 a v dalším der(14) pozorovány hybridizační signály o stejné intenzitě. Výsledky analýzy FISH ukázaly, že ve všech čtyřech případech jsou chromozomové zlomové body umístěny na 5'-konci HMGI-C genu.
Zjištění zlomových bodů ve všech čtyřech případech na 5'-konci HMGI-C genu se dobře shoduje s výsledky RACE-PCR. Kromě normálních HMGI-C transkriptů bylo možné ve všech třech nádorech detekovat odchylné transkripty. Sekvence ukázaly, že nejsou odvozeny z chromozomu 14, ale z intronu
9 49 99 9 9 9
9 9 9 9 9 9 ···· • · · · 999 9 999 • · · · · ····«· ··«· · ··· · · · ··· ···· «· 99 9 99 99
HMGI-C, pravděpodobně v důsledku skrytých sestřihových míst. Nicméně RACE výsledky ukazují, že HMGI-C exprese je obsažena skutečně ve všech čtyřech případech.
Příklad 11
Přerozdělení leukemických buněk
1. Úvod
Exprese HMGI-C genu je často zjištěna v širokém rozpětí různých nádorů, pevných nádorů a leukémií. Předpokládalo se, že HMGI-C protein může hrát klíčovou roli při transformaci buněk. Tento příklad ukazuje, že exprese HMGI-C genu může být podstatně zredukována exprimováním protismyslných HMGI-C sekvencí, a že redukce HMGI-C hladin v nádorových buňkách má za následek reverzi transformovaného fenotypu, takže exprese nebo podání protismyslných molekul lze úspěšně terapeuticky aplikovat.
2. Materiály a metody
2.1. Nádorové buněčné linie
Nádorové buněčné linie se generovaly z. primárního maligního nádoru slinných žláz a primárního karcinomu prsu. Buněčné linie se stanovily způsobem, který popsal Kazmierczak, B., Thode, B., Bartnitzke, S., Bullerdiek, J. , a Schloot, W. , „Pleomorphic adenoma cells vary in their susceptibility to SV40 transformation depending on the initial karytotype, Genes. Chrom. Cancer 5:35-39 (1992).
·· ·♦ ·· · ·· ·· • · * · · · · ···· • · · · ··· · « ·· • · · · · · ···* · ·»· « · ······ ··· ···· «· ·· · ·ι ··
2.2. Zkouška transformovaného stavu
Testování měkké agarové kolonie se provedlo způsobem, který popsal Macpherson a Montagnier, „Agar suspension culture for the selective assays of cells transformed by polyoma virus, Virology 23, 291-294 (1964).
Buňky slinných žláz a nádoru prsu se propagovaly v TC199 kultivačním médiu s Earleovými solemi, doplněném 20% fetálním bovinním sérem (GIBCO), 200 IU/ml penicilínu a
200 μρ/ιηΐ streptomycinu.
Tvorba nádorů v případě transfekovaných buněčných linií slinných žláz (AD64) a prsních buněčný linií se testovala podkožním injektováním do athymických myší.
2.3. Transfekční test
Transfekce se prováděly za použití různých postupů, konkrétně se použily:
1. Grahamův a Van der Ebův postup, používající fosforečnan vápenatý („A new technique for the assay of the infectivity of human adenovirus. Virology 52, 456 až 467 (1973)).
2. Lipofekce: transfekce se provádějí za použití liposomem zprostředkovaného DNA transferu (lipofectamin, GibcoBRL), podle, pokynů výrobce.
2.4. Protismyslné konstrukty
Smyslné a protismyslné konstrukty HMGI-C genu se získaly vložením lidských HMGI-C cDNA sekvencí jak ve v
·· ·· ·· 9 • · · · · « · • · · · · · · • · · · · · ··»· • · · · · · ···· ·» ·· · ·· ·· !V · · · • . · ·« ··· · « • · · ·<
smyslné, vektorech kontextů, tak v protismyslné orientaci v expresních za transkripční kontroly různých promotorových např. dlouhé terminační repetice Moloneyova . myš ího leukemického _- viru , CMV- promotoru - - nebo časného promotoru SV40. CMV/HMGI-C plazmid se například konstruoval klonováním lidského HMGI-C cDNA fragmentu obsahujícího všechny kódovací sekvence lidského HMGI-C v pRC/CMV (Invitogen), umožňujícího expresi pod kontrolou lidského cytomegalovirového časného promotoru a zesilovače a selekci na G418 resistenci.
3. Výsledky
3.1. Reverze transformovaného fenotypu
Reverze transformovaného fenotypu byla pozorována v prsních nádorových buňkách a nádorových buňkách slinných žláz po indukci protismyslné HMGI-C exprese v těchto nádorových buňkách. Silná redukce tvorby nádoru byla zaznamenána měřením za použití testu měkké agarové kolonie a in vivo v athymických myších. Imunologické vysrážení a analýza na bázi Westernová přenosu naznačily silnou redukci úrovní HMGI-C proteinu v buňkách, exprimujících protismyslné HMGI-C sekvence. Tento přístup může být tedy terapeuticky využit u nádorů se začleněním HMGI-C.
• ·
Příklad 12
Modely zvířecích nádorů, zahrnující HMGI-C jako nástroje - při in vivo terapeutickém testování'účinné látky.* '
Na základě získaných znalostí, týkajících se HMGI-C genu, lze jako nástroje pro in vivo testování účinné látky vyvinout zvířecí nádorové modely. Pro dosažení objektivity (například v případě děložního leiomyomů) lze použít dva přístupy, konkrétně genový přenos (generace transgenových zvířat) na jedné straně, a technologie cílení genů (imitování in vivo specifické genetické odchylky pomocí homologické rekombinace v embryonálních kmenových buňkách (ES buňkách)) na straně druhé.
Tyto technologie umožňují specifickým a předem navrženým způsobem manipulovat s genetickou konstrukcí komplexu živých systémů. Velké množství technických detailů lze nalézt například v manuálu, jehož autory jsou B. Hogan, R. Beddington, F. Contantini a E. Lacy, „Manipulating the mouše embryo, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1994; ISBN 0-87969-384-3.
Pro dosažení inaktivace nebo mutace HMGI-C genu, konkrétně ve zvolených buněčných typech a zvolených časových okamžicích, je_možné použít nedávno popsaný
Cre/LoxP systém (Gu H. a kol., Deletion of a DNA polymerase β gene segment in T cells using type-specific gene targeting. Science 265, 103-106, 1994). Tento Cre enzym je rekombinázou z bakteriofágu Pl, jehož fyziologickým úkolem je separovat fázové genomy, které se vzájemně spojily během infikování. Za účelem získání takto krátkých sekvencí fágu DNA Cre linií byly označeny loxP místa a odstraněna DNA, • · ležící mezi takto označenými místy při ponechání jednoho loxP místa vzadu. Nyní se ukázalo, že tento systém je efektivní pokud je excidování savčích buněk při vysoké účinnosti chromozomové- DNA. Tkáňově specifickou inaktivaci nebo mutaci genu, která využívá tento systém, lze získat díky tkáňově specifické expresi Cre enzymu.
Například vývoj zvířecích systémových modelů pro děložní leiomyom, používající člen MAG genové rodiny, bude popsán níže jako nástroj pro in vivo testování terapeutických účinných látek.
Pro testování účinných látek in vivo lze použít dva následující přístupy:
a) in vivo indukování specifických genových odchylek, které byly pozorovány u lidských pacientů ((podmíněný) genově (isogenový) cílený přístup); a
b) zavedení DNA konstruktů, reprezentujících genetické odchylky pozorované u pacientů (genově přenosový přístup).
DNA konstrukty, které mají být použity při genovém přenosu, lze generovat na základě pozorování, provedených u pacientek s děložním leiomyomem, pokud jde o strukturu a expresní kontrolu; například HMGI-C fúzní geny s různými translokačními partnerskými geny, zejména preferenční translokační partnerský gen chromozomu 14, umístěného v YAC kontigu, reprezentovaném CEPH YAC 6C3, 89C5, 308H7, 336H12, 460A6, 489F4, 902F10, 952F5, 958C2, 961E1 a- 971F5, zkrácenými geny kódujícími v podstatě tři DNA vážící domény HMGI-C a kompletní HMGI-C nebo deriváty HMGI-C pod kontrolou silného promotoru.
Příklad 13
Příprava protilátek namířených proti HMGI-C
Jedním typem vhodných molekul, pokud jde o použití při diagnostice a terapii, jsou protilátky namířené proti MAG genům. Při přípravě králičích polyklonových protilátek proti HMGI-C se použily následující tři komerčně dostupné peptidy:
(H-ARGEGAGQPSTSAQGQPAAPAPQKR) 8-Multiplexní Antigenový Peptid, (H-SPSKAAQKKAEATGEKR)8-MAP, (H-PRKWPQQVVQKKPAQEE)8-MAP, které nabízí společnost Research Genetics lne., Huntsville, AL, USA. Polyklonové protilátky se připravily pomocí standardních technik.
TABULKA I
ANALÝZY YAC KLONŮ
CEPH- kód Velikost (kb) Levý mezní bod # Pravý bod # mezní Chimérický
183F3 715 [RM1Ó] ANO (L+P)
70E1 450 RM2 9 U27125 ND
95F1 390 RM30 U29054 ND
201H7 320 RM13 U29051 RM14 U29053 ND
186G12 320 ND
354B6 280 ANO (P)
126G8 410 ND
258F11 415 RM4 U29052 ND
320F6 290 RM5 U29050 RM21 U29047 ND
234G11 475 RM7 U29046 ND
375H5 290 ND
262E10 510 [RM15] RM16 U29048 ANO (L)
181C8 470 RM26 U29045 ND
107D1 345 RM31 U29043 ND
499C5 320 RM4 4 U29044 RM4 6 U29037 ND
340B6 285 ND
532C12 400 RM4 5 U29041 ND
138Č5' 510 [RM59] RM65 U29042 ANO (L)
145F2 490 RM60 U29030 RM66 U29040 ND
106E8 340 RM57 U29033 RM63 U29038 ND
55G1 365 RM5 6 U29031 RM62 U29039 ND
103G7 370 RM85 U29025 RM80 U29036 ND
295B10 295 RM77 U29035 RM81 U29026 ND
338C2 200 RM7 8 U29034 RM82 U29029 ND
• · • ·
TABULKA I (pokračování)
ANALÝZY YAC KLONŮ
CEPH- kód Velikost (kb) ' Levý mezní bod # Pravý bod # mezní Chimérický ..
391C12 160 [RM79] RM83 U29027 ANO (L)
476A11 225 [RM87] RM84 U29032 ANO (L)
138F3 460 RM90 U29028 RM91 U29019 ND
226E7 500 RM4 8 U29024 RM54 U29015 ND
499E9 375 RM51 U29016 ANO (P)
312F10 580 [RM50] RM69 U29021 ANO (L)
825G7 950 ND
34B5 315 RM88 029020 RM89 U29013 ND
94A7 610 ANO (P)
305B2 660 ANO (L)
379H1 280 RM104 U29014 RM105 U29009 ND
444E6 350 RM92 U29017 RM93 U29010 ND
446H3 370 RM94 U29011 RM95 U29018 ND
403B12 380 ND
261E5 500 RM102 U29012 RM103 U26689 ND
78B11 425 ND
921B9 1670 ND
939H2 17 50 ND
188H7 360 ND
142F4 390 ND
404E12 360 ND
164A3 375 ND
244B12 415 RM106 U29007 RM107 U29008 ND
275H4 345 RM108 U29004 RM109 U29.005 ND
320F9 370 ND
51F8 450 ND
242A2 160 CH1 U29006 ND
253H1 400 ND
303F11 320 ND
TABULKA I (pokračování)
ANALÝZY YAC KLONŮ
CEPH- kód Velikost (kb) * Levý m< bod # szní Pravý mezní bod # Chimérický
322C8 410 CH2 U29003 ND
208G12 370 RM96 U29002 RM97 U27135 ND
341C1 270 RM98 U26647 RM99 U27130 ND
354F1 270 ND
452E1 270 CH5 U27136 ND
41A2 310 ND
934D2 1370 ND
944E8 1290 CH8 U28792 ND
2G11 350 ND
755D7 1390 ANO (L)
365A12 370 ND
803C2 1080 ND
210C1 395 RM7 0 U28998 RM8 6 U27133 ND
433C8 360 RM7 3 U29000 RM7 6 U27132 ND
402A7 500 RM41 U28994 [RM42] ANO (P)
227E8 485 RM53 U27134 RM55 U28996 ND
329F9 275 RM72 U28793 RM75 U28997 ND
261E6 395 [RM71] RM7 4 U28995 ANO (L)
348F2 370 [RM136] ANO (P)
6F3 320 RM35 U27140 RM36 U27141
59F12 430 RM34 U28794 RM33 U27131
2 65H3 300 ’ RM4 0 ........ U28999
YAC klony se izolovaly z CEPH YAC knihovny způsobem popsaným v části, nazvané Materiály a metody. ND: nebyly určeny použitými metodami. Mezní body, vymezujicí širší rozsah než 6 Mb, jsou uvedeny v závorkách. Identifikační číslo genobanky (#).
• ·
TABULKA II
PCR primery ······ ·· ···· ·· ·· · ·· ··
STS Nukleotidová sekvence Velikost označení 5'-3' produktu (STS 3 2-) --------- - · ·' - · - - - · (bp) - CH1 TGGGACTAACGGATTTTCAA 213
TGTGGTTCATTCATGCATTA
CH2 TCCATCATCATCTCAAAACA 145
CTCTACCAAATGGAATAAACAG
CH5 GCAGCTCAGGCTCCTTCCCA 143
TGGCTTCCTGAAACGCGAGA
CH8- TCTCCACTGCTTCCATTCAC 147
ACACAAAACCACTGGGGTCT
CH9 CAGCTTTGGAATCAGTGAGG 262
CCTGGGGAAGAGGAGTAAAG
RM1 GAGCTTCCTATCTCATCC 308
ATGCTTGTGTGTGAGTGG
RM4 TTTGCTAAGCTAGGTGCC 236
AGCTTCAAGACCCATGAG
RM5 CAGTTCTGAGACTGCTTG 324
TAATAGCAGGGACTCACG
RM7 CTTGTCTCATTCTTTTAAAGGG 538
CACCCCTTTTTAGATCCTAC
RM13 GAATGTTCATCACAGTGCTG +500
AATGTGAGGTTCTGCTGAAG
RM14 TTCTCATGGGGTAAGGACAG 158 • · AAAGCTGCTTATATAGGGAATC
RM16 CCTTGGCTTAGATATGATACAC 252
GCTCTTCAGAAATATCCTATGG
RM21 CCTTAGCAGTTGCTTGTCTG 290
TCGTCACAGGAGATAGTCAC
RM26 TCTATGGTATGTTATACAAGATG 102
CAGTGAGATCCTGTCTCTA
RM31 TCTGTGATGTTTTAAGCCACTTAG 239
AATTCTGTGTCCCTGCCACC
Itemp.
(°C) ···· · ····
TABULKA II (pokračování)
PCR primery
STS Nukleotidová sekvence Velikost označení 5'-3' produktu (STS 12-) - - (bp) RM33 ATTCTTCCTCACCTCCCACC +600
AATCTGCAGAGAGGTCCAGC
RM34 AATTCTCCATCTGGGCCTGG +600
GAACGCTAAGCATGTGGGAG
RM36 CTCCAACCATGGTCCAAAAC 296
GACCTCCAGTGGCTCTTTAG
RM4 6 ACCATCAGATCTGGCACTGA 241
TTACATTGGAGCTGTCATGC
RM48 TCCAGGACATCCTGAAAATG 391
AGTATCCTGCACTTCTGCAG
RM51 GATGAACTCTGAGGTGCCTTC 311
TCAAACCCAGCTTTGACTCC
RM53 GTCTTCAAAACGCTTTCCTG 333
TGGTTTGCATAATGGTGATG
RM60 TACACTACTCTGCAGCACAC 94
TCTGAGTCAATCACATGTCC
RM69 CTCCCCAGATGATCTCTTTC 236
C GGTAGGAAATAAAGGAGAG
RM72 TATTTACTAGCTGGCCTTGG 101
CATCTCAGGCACACACAATG
RM76 . ATTCAGAGAAGTGGCCAAGT 496 • · _ - . GGGATAGGTCTTCTGCAATC ··
RM85 TCCAACAATACTGAGTGACC 435
TCCATTTCACTGTAGCACTG
RM86 GTAATCAACCATTCCCCTGA 203
AAAATAGCTGGTATGGTGGC
RM90 ACTGCTCTAGTTTTCAAGGA 257
AATTTACCTGACAGTTTCCT
RM93 GCATTTGACGTCCAATATTG 347
Ttemp.
(°C)
ATTCCATTGGCTAACACAAG
TABULKA II (pokračování)
PCR primery
STS označení (STS 12-)
Nukleotidová sekvence
5'-3'
Velikost Temp. (°C) produktu (bp) -......- .......
RM98
RM99
RM103
RM108..
RM110
RM111
RM130
RM131
RM132
RM133
EST01096
IFNG
Rapl3
GCAAAACTTTGACTGAAACG
CACAGAGTATCGCACTGCAT
AAGAGATTTCCCATGTTGTG
CTAGTGCCTTCACAAGAACC aattcttgaggggttcactg
TCCACACTGAGAGCTTTTCA
GTGGTTCTGTACAGCAGTGG
T GAGAAAATG TC T G CCAAAT GCTCTACCAGGCATACAGTG
ATTCCTAGCATCTTTTCACG
ATATGCATTAGGCTCAACCC
ATCCCACAGGTCAACATGAC
ATCCTTACATTTCCAGTGGCATTCA
CCCAGAAGACCCACATTCCTCAT
TTTTAAGTTTCTCCAGGGAGGAGAC
AATAGGCTCTTTGGAAAGCTGGAGT
TCTCAGCTTAATCCAAGAAGGACTTC
GGCATATTCCTCAACAATTTATGCTT
TGGAGAAGCTATGGTGCTTCCTATG
TGACAAATAGGTGAGGGAAAGTTGTTAT
T C AC AC G C T GAAT CAAT C T T
C AGCAGCTGATACAAGCT TT . .
TGTTTTCTTTCCCGATAGGT
CTGGGATGCTCTTCGACCTC
CCATCCAACATCTTAAATGGAC
CAGCTGCAAACTCTAGGACTATT
356
240
199
439
328
312
336
226
376
225
188
150
149
STS vzorky se izolovaly způsobem popsaným v části, nazvané Materiály a metody nebo se vzaly z knihoven EST01096, IFNG a RaplB.
• ·
TABULKA 4
FISH mapování zlomových bodů chromozomu 12 v primárních benigních pevných nádorech do podoblasti MAR
Typ nádoru Zlomový bod uvnitř MAR Frakce nádoru se zlomovými body uvnitř hlavní oblasti zlomových bodů*
Lipom 6/6 6/6
Pleomořfní adenom slinných žláz 7/7 5/7
Děložní leiomyom 7/8 7/8
Plicní hemartom 1/1 1/1
Plicní fibroadeom 1/1 1/1
Žaludeční hemartom 8/9 8/9
Angiomyxom 1/1 1/1
* Nádorové vzorky se shromáždily a analyzovaly v
histopatologickém a cytogenetickém zařízení „University of Břemen. Jako molekulární sonda FISH analýzy se použila směs kosmidových klonů 27E12 a 142H1.
·· •O
Ul α>
ε
Μ ο,
Ό I
ΙΊ5 I
V) σ· σ· ι
CQ £2 CQ £0 CQ CQ <<<<<<
I I I I I I
I σ>(ΝΠ*τΟ3·ϋΊΟΟ i cor-r-r-T-icocDco
Ό 4-1 co > υ cd co r(\J Ν Η
Γ·«
Ο1 οο r- σι γ- co _ Η Η (Π ΓΊ Η 1 ' rocNcninaiciCMCMr-co
HHHMCMeNCMMΓ) Π 'Τ τ η η cm cm η cm co -α· cm ur> Ν Ν (\ Μ Η Η ο ο m c\j γ- οο ω η Μ Η ΓΊ Η Ν Μ
Γ· . Ο Φ η η CM «β· «—t r— «—I ·—I , ;g;
• ’ - - . ... - . . - - ťí rti eí Ω Ω
Ε- ř- E- ‘ E— 6- £- E- H 16-9-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-6-9-9-6-9-6-6-6-9-6-6-6- 6-6-9-6-6- · ·
SSŠ ggggg 2ggggggggggg5Sggggggggggggggg ggggg22 r- C > ň N η Ol (N CJ OJ N Ol <\ - Η Ol Γ4 N OJ H σ σ σ σ ο. σ σ ο’ σ nmmm οο co cd οο η· σ· ο· ο· ο· ζ “Ί
Ο Ο Ο Ο Ο Ο OOO<<<UUOHHUO (5<5Ε-Ε-00<(5<Ε-0<^-«. cj u Uřηηί->ί-ΐΜί-^^^ϋϋϋβ;4:<9·ί-<<<<Η6-<<ϋ<6-υυϋ6'ϋ6ιϋυ6................. - - * BfťUOUBUBUUPUU
Ο V> k.> ο
ΟΟϋϋυΗ^ΗΗυυυβ.α,κ.ί-Γ'Η,β,.ν^ΐ'^^-,' E-E-E-9-t-E-t-9-6-6-E-E-O(JO<<O(J9-6-*C<9-9-« UUUUU<<<<UOOOUOHBOGOOUUUU Ε- ε- Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— 6- *-* *-1 c-* 1 π f π 1 η 1 η { * 1 1 *— *—
UUUUUUUUU <<<<<<<<<
Ε-Ε-Ε-Ε-Ε-Ε-Ε-6— Εggggg
K.t-CJkJC^t-C^t-CJCJt-e.tOOOHOHOUE-OOOO ΗΕ-Ε-Η9-Ε-<ΟΟΕ-Ε-<Ε..... ' O O E- < oo < o
Α.Α,ο,«,υυυυυυί-ί-·υυϋθυυυυςΗΗΕ-Ε-ΗΕ-'<ϋϋΗΗ< εμ^ηε-ηη<ε-<<<<<ο οο ο υ υ η ε-0 η υ < υ < ο υ ε-< υυ < ωυουοοοουυ<<<<<<οο<<<<Ε-Ε-<Ε-<<υουΕ-υ t^. C-. t—. C-. ι \ f \ t i C— t—, m t m ι r, r, r. t \ r \ ^· t r\ uuuu(_;ss'SSk<t>CJCj»Jhrw,M,rirK,c«R,iJ,u'jUt-|UN,fCBOx. <řťřťřť<{-E-<<OOOO<<OOOOUE-OOOOE-2<J<0e-E-O <pcOuue-e-ooooe-e-uu<o<e-cc<o<<e-ue-e-3oo<' OO<C<<f-E-<ř£<<;O(_7<<E-OUo0E-<<E-C)E-ř-OOE-<^ O0ít<»ÍOO<<E-B'0OOO0OOE-<<OB*FUOE-<OO^O
SB U U U U U υ f- b h < <
SOUOOE-E< 9- Ε- E- < < o O O O O ' '
6 5b'
E- O O O O O O Ε- Ε- Η Ε- Ευ < < < E- B<
OOOUOOOOOOOOOOOOOOOOOOUOUJUUUOOOOOO
OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO
E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-E-Eoooooocooooooooooooouooouooooooooou
Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— Ε— E—E— Ε— Ε— ř- Ε— Ε— E—E— Ε— Ε— Ε— E—E— E—
E—E— Ε— E-E— Ε— Ε— E-E-E-E-E— E-E-E-E-E-EO O O O O (50 O O O Ε- Ε- Ε- Ε— EO ϋ 13 15 U O (5 O O O Ε- Ε- E-
nnronnnnnoinniOnronnnniOnroiOnrooioinnmroronmoinnronnroromnnmnnn
QOQQOQOClQOQPQQQQQQQClOQQQQDQQQQQQQQQClQQQQOOQClOQQD affimtocDCQCDcocifflcoaifficDCQDCQCQcQmaocDCĎffliDmcDmcíifflcQcoiaQffiCotaíaiafflCQcocQQfflia
QGQQQQQQQQGQQQQGQQQQGGQQOOQQQQQQQQOQGDQQOQQQQQQQ
O 3·
Σ' >
> σι o
I
LO
Π3 λ;
i—I
X) fO
H o o o o
V g· VT g· > > > >
> ť) W M W > >. -S. \ \
CZ) ' c· c· i >? v oj ω co 1 > co m o co co i ; oj οι - in in .i : 4C 3t 3E 5C :
( r- f-J O O I CM CM O O ι η η η h I Η H Ol Ol o r~ r— un CM Π CM r- r~- o ΓΊ f) r— CO CO CM
CM Ή Ή Ή ·— 1 SK _J ►J J G • co σ, o co cr> m r-CDCO^CDCOCDCTi CO ΟΟ (M CM <7\ J CO CO O, CO I I I CM I I σι Cl I 0-~(·-ΗΓ-Ι!00<-(σιΟΟΙ I Γ~ j m ίγ *3· <r «a· m r-oocnmoococor-t ι O σι Οι σι Ol | OOOC*(T— ^inOr— I-ICOCOCO ι οι oi oj oi oj Σ >. >>cojomUDojiDinoJ zznarararar.jyXEKiiinatarsratarrrrr co co co CM CM CM at ar — ain^oiOOTinr-HrMciffliooioir-HOHonf-ioivuir-moioiowo-TďiQooir-oiQficDrtOcooiHOfJ ΟΗηιΠΌ'Τ'^’τΦΗΗοίΗοίΓΊΓ'σ'ΗΗΠΠΗ — Η HvLOcor-ňr-HWw^Of-iHOjojoiDg-g-^ininm — H Ol OJ (N Γ-lOJOJCMOJOJOJOJfMOJHHCMCMOJOJHH HH — HHHH — HHnHOJOJOtOlOJOlOJOJOJOJOJOJOJ ZXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXZDXtCXXXXXXXXXXSCXXXXXXXS ' ' ’ ' ' , '>-)UUUUUC>(JU(JUU(JUCIUUUUUUU(JOU(JU(J ’ Q. O. Ω. Ω. Ω. Ω. Ω. Ω. Ω. O. Ω. O. O. η Π Γ> Ω Ω Ω. Λ Λ
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXZDXtCXXXXXXXXXXSCXXXXXXXS uuuuuuuouuuuuuouuuuouuuuuuouuuaoouuuuuououuuuuuu 0.0,0,0,0.0.0.0.0.0.0,0.0,0.0.0.0,0,0.0.0.0.0.0,0.0.0.0.0,0,0.0,0.0.0.00.0.0.0.0.0, O. O.O. O- Q-Q.
·□ u
o
Li a
fO
T3
Π5 ω
CQ CQ 03 < < < < lili CT) <T> Ολ CD o o o o r~ r- r~ r*
CQ < < I I »X> vr <—i co aiďl^^iOÍOCSIDOOOďJďia).
l—Ir—<r—ti—ii—(i—i»—i»—(r—li—l*Ti—Ir—JO]
CO MT OJ Ol
OJ O) OJ 04
OJ OJ OJ Ol 04 04 Oi Oi OJ OJ OJ OJ OJ Ol OJ OJ OJ CM OJ 04 cj o cj o E-E-E-te- í- h fcj cj cj cj e- e- e- eI š s I u o u o E- E- E— E— CJ CJ O CJ
CJ U U O < <
O u o u < < Ě— £-< CJ o o o
6- E- E-ι E- E- I
6— E— C— < < U (J CJ H < < U CJ U U E- E- <
CJ CJ CJ o E— EE- 6- i
E-<<CJE-E-«£UU UU^E-UU<Pf< ΒΗϋΗΗΗυί.“ U CJ E- CJ CJ U E- < CJ CJ < CJ E- CJ CJ ¢- CJ < <(JU<<<E^<«J Ε-Ε-Ε-<Ε-Ε-Ε^^Η E— CJt-CJř— HE-E-CJ <<<E-*ť<UE-Z rt;CJE-<J<<<JCJCJ ·· ·· ·· · ·· ·· ···· · · · · · · · ··· · · · · · · ·· • · · · · · 9999 9 999 9 9 » 9 9 9 9 » 9 9 9 cn ca < < CQ 03
I I < < lO ďl I I Ci Ch if) ď) i—' ι—I 0\ 0\ rr- v n oi m oi 'T <
I ro
Oi
t- E- e- EOJ Oi i <x> co
Q) <D JJ JJ σ cr i i OJ OJ OJ OJ σ cr
CO CO CD 00
E- OJ • CL •Z «-i
OJ OJ OJ OJ OJ 04 OJ OJ OJ
< ř- CJ < CJ U < < CJ < <2<E-6<<CJ<E< CJ CJ CJ <
< E- CJ CJ CJ
E- U E- CJ <
E- E- < < CJ
E— < E- CJ <
E- < < E- ECJ CJ CJ CJ < < < < CJ CJ CJ CJ t- E- ř- H CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ E- E- H ECJ CJ CJ CJ O CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ
CJ (J
5S
E- Ευ CJ CJ (J E— Ευ U U U CJ CJ
CJ CJ < < O u E— Ευ U CJ CJ E- Ευ U U U CJ CJ
CJ (J (J
5SS
E- E- Ευ U U CJ CJ CJ E- E- Ευ U U CJ O CJ CJ CJ CJ
CJ (J (J < < < u u u E- E- Ευ U U CJ CJ CJ E- E- Ευ U U U CJ CJ CJ CJ CJ
O (J < < u u E- Ευ u CJ CJ E- Ευ u CJ cj CJ CJ
CJ CJ CJ CJ < < < < DUDU E- E- E- Ευ CJ u u CJ CJ CJ CJ E- E- Ě- Ευ U U U CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ (J cj u cj cj E- E- E- EE- E- E- H E- E- E- ΕΟ CJ CJ u O U CJ u {- E- E- E< < < < E- E- E- E— < E- U E— CJ E— E- cj <ς U E~ CJ < < Ευ CJ Ευ U E< CJ U e- e- <
< E- CJ < U E- CJ O <
CJ CJ
ŠS
E- CJ < Z cr cr cr rr » 6— E— E— E—
D U O Ώ cr cr cr cr E- í- t- EO D O O
CM cn rtf
Λί
I—1
Λ ω Η . η η n o m r- «r > «-< r~ r- -! i-i i σ\ o σ' σι ΟΊ co cn co · co co cd cr> σ· σ.
• ι ι ι i uo lTí ld i i i -x. m ι ιαοι ι ω > co oj <0 ao r~ r- ο- r- o ·ν -v ^o o o i oj oj i ir-wr-rjiOďiďiLriHrTTr-(<—<vr^rr—<0L0n r-r-ι r-incjcjcjr-^oinm ι o ω ω η η η ω : oj oj oj oj CJ u U oj oj oj oj -h os oi oj cd oj oj »-i
CTxoo^^rmchoj^Dmr-r-o^vDrcrcD^rr-i^omr' omrsrínocnoior-mofnr-icooojon^roi .-iojojojoi»-iojoir-ioiojoj.-i«-ioic-joioioioi xxxxxxccxccxxxxorxxxxxx
UUUUUUUUUUUUUUUUUUUU
CLCLCLCLCLCLCLQ-CLG.CLCLCLCLCLaQ.CLCLCL
Ol OJ co co σ* σ> V) tT) r—i r—l >
co m oi o \ cr· cn cn 04 I I I r-l O· co co n r-t O OJ i ko ι/i in Ό OJ i—l OJ c; 5t 5C s:
EKT0PICKÁ SEKVENCE JE TVOŘENA REPETIČNlMI SEKVENCEMI
X X X X X CJ U U U U o. a o. a, o.
r~ η o i-< m KD rr- OJ OJ OJ X X X X · U U U U CL G. Q. a
DODATEK 1
Genes, Chromosome & Cancer 12:296-303 (1995)
Molecular characterization of MAR, a Multiple Aberration Region on Human Chromosome Segment 12ql3-ql5 Implicated in Various Solid Tumors
Wim J.M. Van de Ven, Eric F.P.M. Schoenmakers, Sylke Wanschura, Bernard Kazmierczak, Patrick F.J. Kools, Jan M.W. Geurts, Sabině Bartnitzke, Herman Van den Berghe, and Jórn Bullerdiek
Center for Human Genetics, University of Leuven, Belgium (W.J.M.V.D.V., E.F.P.M.S., P.F.J.K., J.W.M.G., H.V.D.B.);
Center for Human Genetics, University of Břemen, Germany (S.W., B.K., S.B., J.B.).
Zlomové body chromozomového ramene 12q v sedmi buněčných liniích, odvozených z primárních pleomorfních adenomů slinnýeh žláz, byly zmapovány pomocí analýzy FISH, za použití devíti DNA sond. Všechny tyto sondy leží v 2,8 Mb genomové DNA oblasti chromozomového segmentu 12ql3-ql5 a odpovídají již publikovaným místům se sekvenční adresou (ŠTS). Jejich relativní pozice” byly stanoveny na základě YAC klonování a širokorozsahových fyzikálních map a map obsahu STS. Ukázalo se, že 12q zlomové body pěti buněčných linií jsou zmapovány uvnitř tří různých podoblastí 445 kb DNA intervalu, který byl nedávno
Received September 27, 1994; accepted November 7, 1994; Address reptint requests to Dr. Wim J.M. van de Ven, Center for Human Genetics, University of Leuven, Herestraat 49, B-3000 Leuven, Belgium.
·· »· • · · · • · · · ··· · · • · · ···· ·· ·· * definován jako shluková oblast zlomových bodů chromozomu 12 děložního leiomyomu (ULCR12) mezi STS RM33 a RM98. Všech sedm zlomových bodů bylo, jak se zdá, zmapováno uvnitř 1,7 Mb DNA oblasti mezi STS RM36 a RM103. Kromě toho, - jak se ukázalo, byly zlomové body chromozomu 12 tří primárních pleomorfních adenomů slinných žláz zmapovány mezi RM36 a RM103. Konečně, analýza FISH dvou lipomových buněčných linií s 12ql3-ql5 abnormalitami přesně vymezuje zlomové body těchto linií vzhledem k relativně malým a sousedícím DNA segmentům, které, jak se zdá, jsou uspořádány, stejně jako zlomové body dvou primárních lipomů, mezi RM36 a RM103. Z pozorovaného shlukování 12q zlomových bodů tří různých typů pevných nádorů jsme usoudili, že 1,7 Mb DNA oblast dlouhého ramene chromozomu 12 mezi RM36 a RM103 je oblastí mnohočetných odchylek, která byla označena jako MAR. (Genes Chromosom Cancer 12:296-303 (1995). 1995 Wil.eyLiss, lne..
ÚVOD
Chromozomové translokace, zahrnující ql3-ql5 chromozomu 12 ' se objevily u různých pevných nádorů (Mitelman F (1991): Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. 4. vyd., New York, Alan R. Liss.). V podskupinách cytogeneticky abnormálních děložních leiomyomů (Nilbert M, Heim S (1990) Uterine leiomyoma cytogenetics. Genes Chromosom Cancer 2:3-13.; Pandis N, Heim S, Bardi G, Flodérus U-M, Willén H, Mandahl N, Mitelman F (1991) Chromosome analysis of 96uterine leiomyomas. Cancer Genet Cytogenet 55:11-18.), pleomorfních adenomů slinných žláz (Sandros J, Stenman G, Mark J (1990) : Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary ·· 4· ·* ·· »·«· · »··· ·· gland tumours. Cancer Genet Cytogenet 44: 153-167.;
Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R, Haubrich J, Thode B, Bartnitzke S (1993): Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic . adenomas: .... correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet Cytogenet 65: 27-31.) a benigních nádorů tukové tkáně (Sreekantaiah C, Leong SLP, Karakousis CP, McGee DL, Rappaport WD, Villar HV, Neal D, Fleming S, Wankel A, Herrington PN, Carmona R, Sandberg AA, (1991) Cytogenetic profile of 109 lipomas. Cancer Res 51: 422433.) jsou často pozorovány abnormality 12ql3-ql5. V nedávné studii (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.) se molekulárně charakterizovala ULCR12, zlomových bodů chromozomu 12 děložního leiomyomu. Tato studie se zaměřuje na zlomové body chromozomového ramene 12q v pleomorfním adenomu slinných žláz, benigním epitelovém nádoru pocházejícím z hlavních nebo minoritních slinných žláz. Jedná se o nejběžnější typ nádoru slinných žláz a představuje většinou 50 % všech novotvarů v těchto orgánech. Přibližně 85 % nádorů bylo nalezeno v příušnici, identifikovala a shluková oblast % ve vedlejších slinných žlázách a 5 % v submandibulární žláze (Seifert G, Miehlke A, Haubrich J, Chilla R (1986): Diseases of the salivary glands. Pathology. Diagnosis. Treatment. Facial nerve surgery. Translated by.P.M. Stell. Thieme, Stuttgart, New York, pp 182-194.). Ačkoliv se zdá, že mnoho těchto adenomů má normální karyotyp, cytogenetické studie rovněž ukázaly opakující se chromozomové anomálie »· ·· ·» · ·· ·· ···· · · · · · · · • · · ···· ···« • · · 9 · · ···· · ··· « · • · · · · · >·· ···· ·· ·· * ·· *·
100 (Sandros J, Stenman G, Mark J (1990) : Cytogenetic and molecular observations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet Cytogenet 44: 153-167.; Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R, Haubrich J, Thode B, Bartnitzke S (1993) : Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet Cytogenet 65: 27-31.). Kromě odchylek chromozomu 8 jsou nejběžnější abnormalitou rovněž časté translokace se zlomovým bodem v 8ql2 s t (3;8) (p21;ql2) abnormalitami chromozomu 12, přičemž časté jsou zpravidla translokace zahrnující 12ql3-ql5. Neopakující klonové abnormality byly rovněž popsány. Časté zařazení oblasti 12ql3-ql5 v distinktních typech pevného nádoru navrhuje, tuto chromozomovou oblast jako oblast výskytu genu (genů), které by se mohly podílet na vývoji těchto nádorů. Molekulové klonování zlomových bodů chromozomu 12 těchto nádorů a charakteristika spojovacích fragmentů mohou vést k identifikaci zmíněného genu (genů).
Na základě FISH dat jsme již uvedli, že zlomové body chromozomu 12 v celé řadě buněčných linií, odvozených z primárních pleomorfních adenomů slinných žláz.(Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990) : In vitro transformation by the SV40 early region of cells from a human benign salivary gland......tumour with a 12ql3—>q±5 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.; Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a) Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.) je umístěna na dlouhém rameni
101 chromozomu 12 v intervalu mezi místem D12S19 a D12S8 (Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a) Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.). Stanovená délka tohoto DNA intervalu byla přibližně 7 cM (Keats B, Ott J, Conneally M (1989) Report of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.; Craig IW, Gedde-Dahl T, Gemmill R, Kucherlapati R (1993) Report of the committee on the genetic constitution of chromosome 12. Genome Prior Rep 1: 402-418.). Tento interval, obsahující zlomové body chromozomu 12 těchto nádorových buněk, se dále zúžil tím, že byly všechny zlomové body zmapovány daleko od CHOP genu, který je přímo ovlivněn charakteristickou t(12;16) translokací v myxoidních liposarkomech (Aman P, Ron D, Mandahl N, Fioretos T, Heim S, Arheden K, Willen H, Rydholm A, Mitelman F (1992) Rearrangement of the transription factor gene CHOP in myoxid liposarcomas with t(12;16) (gl3;pll). Genes Chromosom Cancer 5: 278-285.; Crozat A, Aman P, Mandahl N, Ron D (1993) Fusion of CHOP to a novel RNA-binding protein in human myxoid liposarcoma. Nátuře 363: 640-644.; Rabbitts TH, Forster A, Larson R, Nathan P ____ JJ.993) Fusion of the dominant negative transcription regulátor CHOP with a novel gene FUS by translocation t(l2;16) in malignant liposarcoma. Nátuře Genet 4: 175180.) a nachází se mezi D12S19 a D12S8. V nedávných studiích (Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van de Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary • ·
102 gland adenoma with t(l;12)(p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.) byl zlomový bod chromozomu 12 pleomorfní adenomové buněčné linie slinných žláz Ad-312/SV40 přiřazen do DNA oblasti mezi místa se sekvenční adresou (STS) RM110 a RM111, která je menší než 165 kb. FISH evoluce zlomových bodů chromozomu 12 dalších pleomorfních adenomových buněčných linií slinných žláz naznačuje, že Ad-312/SV40 se musí nacházet v blízkosti této oblasti, ve vzdálenosti větší než 800 kb (Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van de Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12)(p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.). Získané výsledky ukazují na možnou disperzi zlomových bodů chromozomu 12 v relativně velké genomové oblasti na dlouhém rameni chromozomu 12.
Přihláška vynálezu popisuje fyzikální mapování zlomových bodů chromozomu 12 v pleomorfních adenomových buňkách slinných žláz z primárních nádorů, stejně jako stanovené nádorové buněčné linie. Karyotypické anomálie, pozorované ve všech buňkách, byly rovněž rozdílné, ale vždy zahrnovaly oblast ql3-ql5 chromozomu 12. Experimenty FISH, k t e r é přesněji' definova1y h2 avní sh1ukovcu ob1asL z1ómovýčh bodů chromozomu 12 u pleomorfního adenomu slinných žláz za použití DNA sond mezi D12S8 a CHOP, které odpovídaly místům se sekvenční adresou (STS) širokorozsahové fyzikální mapy 6 Mb DNA oblasti., a které se získaly v průběhu procházení chromozomů, se provedly. Zdá se, že shluková oblast tohoto zlomového bodu se překrývá s ULCR12. Navíc se zjišťovalo, zda by mohly být 12ql3-ql5 zlomové body lipomů rovněž • ·
103 zmapovány ve stejné oblasti jako zlomové body pleomorfního adenomu slinných žláz·a děložního leiomyomu.
MATERIÁLY A METODY
Primární pevné nádory a odvozené buněčné linie
Primární pevné nádory, zahrnující pleomořfní adenomy slinných žláz, lipomy a děložní leiomyomy, se získaly z Univerzitních klinik v Leuvenu, (Belgie, Dr. I. De Wever); v Břemenu (Německo, Dr. R. Chille); v Krefeldu (Německo, Dr. J. Haubrich); a z institutu patologie v Goteborgu (Švédsko, Dr. G. Stenman). Nádorové vzorky, určené pro buněčnou kultivaci a následnou analýzu FISH, se jemně nakrájely, ošetřovaly 4 až 6 hodin 0,8% kolagenázou (Boehringer, Mannheim, FRG) a dále zpracovaly pro potřeby analýzy FISH rutinními postupy.
Lidské nádorové buněčné linie, použité v této studii, zahrnovaly již popsané buněčné linie pleomorfních adenomů slinných žláz Ad-211/SV40, Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40, Ad-366/SV40 a Ad-386/SV40 (Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990): In vitro trans formát ion by the SV40 early region of cells from a human benign salivary gland tumour with a 12ql3—>ql5 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.;' Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a). Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.) a lipomových buněčných linií Li• · ·· ··· ·· ·· ···· ··· ···· • · · · ··· · ··· • · ··· ······ ···· · ······ ··· ······ · · · ·· · ·
104
14/SV40 (Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a) Physical mapping of chromosomel2q breakpoints in lipoma,. .pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.) a nedávno vyvinutou LÍ-538/SV40.
Seznam odchylek chromozomu 12, které se vyskytují v těchto buněčných liniích je uveden v tabulce 1. Buňky se propagovaly v TC199 živném médiu s Earleovými solemi, doplněném 20% fetálním bovinním sérem.
TABULKA 1. Abnormality chromozomu 12 v primárních lidských pevných nádorech a buněčných liniích *
Odchylka
Buněčné linie
Ad-211/SV40 t (8;12) (q21;ql3-ql5)
Ad-248/SV40 ins(12;6)(ql5;ql6q21)
Ad-263/SV40 INV(12)(Q15Q24.1)
Ad-295/SV40 t(8;12;18)(pl2;ql4;pil.2)
Ad-302/SV40 t (7;12) (q31;ql4)
Ad-366/SV40 inv(12)(pl3ql5)
Ad-386/SV40 t(12;14)(ql3-q!5;ql3-ql5)
LÍ-14/SV40 t(3;12)(q28;ql3)
LÍ-538/SV40 t(3;12) (q27;ql4)
LM-5.1/SV40 t(12;15)(ql5;q24)
LM- 30.1/ S V 4 0. ...... . ...... t.(12.;fL,4.),..( q.l.5.;,q2 4 ) , ,. ..
LM-65/SV40 t(12;14) (ql5;q24)
LM-67/SV40 t(12;14)(ql3-ql5;q24)
Lm-100/SV40 t(12;14)(ql5;q24)
LM-605/SV40 ins(12;ll)(ql4;q21qter)
LM-608/SV40 t(12;14)(ql5;q24)
LM-609/SV40 t(12;14)(ql5;q24)
• · • · ·
105
TABULKA. 1-pokračování
Abnormality chromozomu 12 v primárních lidských pevných nádorech a buněčných liniích *
Odchylka
Primární nádory
Ad-386 t(12;14)(ql5;qll.2)
Ad-396 t(3;12)
Ad-400 t(12;16)
Li-166 t <12;12)
Li-167 t(3;12)(q28;ql4-ql5)
LM-163.1 t(12;14)(ql4;q24)
LM-163.2 . t(12;14)(ql4-q24)
LM-168.3 t(X;12)(q22;ql5)
LM-192 t(2;3;12)(q35;p21;ql4)
LM-196.4 t(12;14)(ql4;q24)
* Ad - pleomorfní adenom slinných žláz; Li - lipom; LM - děložní leiomyom
DNA sondy
V rámci lidského genomového projektu, který se zaměřoval na dlouhé rameno chromozomu 12, se z testované kosmidové knihovny LLNL12NC01 (Montgomery KT, LeBlanc JM, Tsai P, McNinch JS, Ward ĎC, De Jong PJ, Kucherlapati R, Krauter KS (1993) Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from coosmids mapped by FISH. Genomics 1: 682-693.) izolovaly kosmidové klony CRM33, CRM36, cRM51, cRM69, cRM72, cRM76, cRM98, cRM103 a cRM133. Další detaily, týkající se těchto kosmidových klonů, byly zveřejněny na „Second International Chromosome 12 Workshop, New Haven, CT, USA, June 20-22, 1994 a jsou rovněž popsány v publikaci, jejímiž autory jsou (Kucherlapati R, Craig I, Marynen P (1994) Report of • ·
106 the second International workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet Cell Genet 67: 245-276.). Úvodní průzkum se prováděl za použití průzkumové strategie, založené na PCR (Green ED, Olson MV (1990) Systematic screening of yeast artificial-chromosome libraries using the polymerase chain reaction. Proč Nati Acad Sci USA 87: 1213-1217.) a následovala filtrační hybridizační analýza, která představovala konečný průzkumový krok (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW,
Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Kosmidové klony se izolovaly pomocí STS, odvozených z YAC klonů. STS se získaly po zachycení YAC inzertních konců Způsobem, zahrnujícím „vectorette-PCR a následně přímé fluorescenční sekvencování pevné fáze PCR produktu (Geurts JMW, Schoenmakers HFPM, Mols R, Van de Ven WJM (1994) An improved proceduře to quickly isolate and sequence the termini of DNA inserts of yeast artificial chromosomes. Meth Mol Cell Biol 4: 257-265.) nebo pomocí inter-Alu PCR (Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, Victoria MF, Ramirez-Solis R, Webster TD, Ledbetter HD, Caskey CT (1989) Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific sequences from complex DNA sources. Proč Nati Acad Sci USA 86: 6686-6690.) . Kosmidové klony se nechaly vyrůst a následně se s nimi zacházelo podle standardních postupů (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual. Cold Sprinq Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ) .
• · • · • · · · · · ···· · ··· · · ······ ··· ···· ·· ·· · ·· ··
107
Kosmidový klon cPK12qter, který byl zmapován v telomerické oblasti dlouhého ramene chromozomu 12 (Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van de Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translooation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12) (p.22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.) se použil jako referenční signální znak (markér).
Příprava chromozomu a fluorescenční hybridizace in sítu
Metafázové nárůstové frakce buněčných linií pleomorfního adenomu slinnýeh žláz nebo normálních lidských lymfocytů se připravily již popsaným způsobem (Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993) Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16)(ql3;pll.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.). K přesnému stanovení identity chromozomu při experimentech FISH se po GTG-pásmování stejných metafázových nárůstových frakcí provedla analýza FISH. GTG-pásmování se provádělo v podstatě způsobem, který popsal Smít VTHBM, Wessels JW, Šchrier Pl, Raap ÁK, Beverstóck GČ, (1990) Combined GTG-banding and in šitu hybridization improves
Cytogenet Cell
Mollevanger P,
Cornelisse CJ nonradioactive characterization of complex karyotypes Genet 54: 20-23. In šitu hybridizace se prováděly za použití postupu, který popsal Kievits T, Dauwerse JG, Wiegant J, Devilee P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Ommen G, Pearson PL (1990) Rapid subchromosomal localization of
·. 9 • 9 9 9 999 9 999
9 99« 99999 * 9 9 9.9 9
99999« 999
9999 99 99 9 «9 99
108 cosmids by nonradioactive in šitu hybridization. Cytogenet Cell Genet 53: 134-136 s některými malými modifikacemi (Kools PFJ, Roebroek AJM, Van de Velde HJK, Marynen P, Bullerdiek J, Van de Ven WJM (1993) : Regional mapping of the human NSP gene to chromosome 14q21-q22 by fluorescence in šitu hybridization. Cytogenet Cell Genet 66: 48-50.;
Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region · of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Kosmid a YAC DNA se označily pomocí biotinu-11dUTP (Boehringer Mannheim) nebo biotinu-14-dATP (BRL, Gaithersburg), které již byly popsány (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Vzorky se analyzovaly pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss Axiophot a filtru FITC (Zeiss). Výsledky se zaznamenaly na film Scotch (3M) 640 asa.
VÝSLEDKY
FISH mapování 12q zlomových bodů v buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz
V dřívějších studiích (Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994a) Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, • · • · ·· · • ·
109 pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myxoid liposarcoma. Genomics 20: 210-222.) se zmapovaly zlomové body chromozomu 12 v celé řadě pleomorfních adenomů slinných žláz vzhledem k různým DNA signálním znakům a zjistilo se, že se všechny tyto zlomové body vyskytují v blízkosti místa D12S8 a daleko od CHOP genu. Tato oblast je o něco menší, než 7 cM oblast vymezená vazebnými místy D12S8 a D12S19 (Keats B, Ott J, Conneally M (1989) Report of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.). Za použití YAC klonování se sestavila širokorozsahová fyzikální/STS mapa, pokrývající většinu této 7 cM oblasti, jak nedávno popsal Kucherlapati R, Craig I, Marynen P (1994) Report of the second international workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet Cell Genet 67: 245-276. Navíc se izolovala celá řada genomových klonů (kosmidových klonů) a stanovila se jejich relativní poloha ve zmíněné mapě (Kucherlapati R, Craig I, Marynen P (1994) Report of the second international workshop on human chromosome 12 mapping 1994. Cytogenet Cell Genet 67: 245-276.). Devět těchto kosmidů cRM33, CRM36, CRM51, cRM69, cRM72, cRM76, cRM98, CRM103 a cRM133 se izolovalo v rámci studií FISH za účelem stanovení poloh zlomových bodů chromozomu 12 sedmi buněčných linií, odvozených z pleomorfních adenomů slinných žláz (tabulka 1) . Relativní mapovací pořádek těchto devíti kosmidových klonů, které pokrývají genomovou oblast na dlouhém rameni chromozomu 12, jejíž velikost je přibližně 2,8 Mb, je naznačen na obrázku 1 a výsledky FISH studií s různými kosmidovými sondami jsou schematicky shrnuty na stejném obrázku. Pro názornost jsou FISH výsledky, získané za použití metafázových buněk buněčné linie Ad-295/SV40 a cRM76 a cRM103 jako sond, znázorněny na obrázku 2. Je třeba • · • ·
110 uvést, že pro identifikaci chromozomů se běžně použilo pre-FISH GTG-pásmování. Na základě tohoto pásmování mohly být hybridizační signály následně přiřazeny ke chromozomům, jejichž identita byla známa, což bylo zvláště důležité v případech s křížovými hybridizačními signály nebo hybridizačními signály pozadí, které byly v těchto případech pozorovány. V případě, že GTG-pásmování v kombinaci s analýzou FISH poskytlo nejasné výsledky buď z důvodu slabých hybridizačních signálů nebo z důvodu nepřesného pásmování se použily FISH experimenty s kosmidovým klonem cPKlžqter (Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van de Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t(l;12)(p22;ql5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.) jako referenční sondou.
Analýza FISH metafázových chromozomů každé ze sedmi buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz, prováděná pomocí kosmidů cRM103 ukázala, že tento kosmid se nachází daleko od zlomových bodů chromozomu 12 všech sedmi zde studovaných buněčných linií. Metafázové chromozomy šesti ze sedmi buněčných linií se rovněž testovaly za použiti sondy cRM69 a ve' dvou případech cRM51. Výsledky posledních experimentů ve všech případech odpovídaly výsledkům, získaným pomocí cRM103. Podobně analýza FISH, využívající jako sondu cRM36 naznačila, že tato sonda byla zmapována v blízkosti všech zlomových bodů. Tyto výsledky opět ve všech případech odpovídaly výsledkům, získaným pro pět ze sedmi buněčných linií při experimentech, používajících cRM72. Výsledky zmíněných FISH studií • · ·· « · · 4 • · • · · φ φ φφ • · ·· · · φ φ · · φ
9 9 4 9
94 44
111 dohromady ukazují, že zlomové body chromozomu 12 všech sedmi buněčných linií byly zmapovány mezi cRM36 a CRM103, což představuje genomovou oblast o velikosti 1,7 Mb.
Podrobné mapováni 12q zlomových bodů v buněčných liniích, odvozených z pleomorfních adenomů slinných žláz
Při následném podrobném mapování zlomových bodů chromozomu 12 sedmi buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz se provedly další studie FISH, které jsou schematicky znázorněny na obrázku 1. Zlomové body buněčných linií Ad-211/SV40, Ad-295/SV40 a Ad-366/SV40 se, jak se zdá, vyskytují v DNA oblasti mezi cRM76 a CRM133, jejíž velikost je přibližně 75 kb. Zlomové body čtyř dalších buněčných linií se nacházely v různých oblastech zmíněné 1,7 Mb oblasti mezi cRM36 a CRM103. Zlomové body buněčné linie Ad-248/SV40 se nacházejí v přibližně 270 kb DNA segmentu mezi cRM33 a cRM76, Ad-263/SV40 se nacházejí v přibližně 1 Mb DNA segmentu cRM98 a CRM103, Ad-302/SV40 se nacházejí v přibližně 240 kb DMA segmentu mezi cRM33 a cRM36, a Ad-386/SV40 se nacházejí v přibližně 100 kb DNA segmentu mezi cRM98 a cRM.133. Tyto výsledky ukazují, že zlomové body chromozomu 12 většiny (pěti ze sedmi) buněčných linií jsou dispergovány na 445 kb genomové oblasti na dlouhém rameni chromozomu 12 mezi cRM33a cRM98. Je důležité zde zmínit, že se nedávno ukázalo, že konkrétně tato oblast obsahuje zlomové body chromozomu 12 v buněčných liniích, odvozených z primárních děložních leiomyomů (viz obr. 3) a byla proto označena jako ULCR12 (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and • · φφ ..
φ φ φ • φ φ φφ φ
112 characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Protože se tento segment dlouhého ramene chromozomu 12 vyskytuje alespoň ve dvou typech pevných nádorů (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.; tato studie) a, jak bude ukázáno níže, rovněž ve třetím typu pevného nádoru, bude tato DNA oblast mezi cRM36 a CRM103 od tohoto okamžiku označována jako MAR (oblast mnohočetných odchylek).
Mapování FISH 12q zlomových bodů v primárních pleomorfních adenomech slinných žláz
FISH studie na metafázových chromozomech pleomorfních adenomů slinných žláz, prezentovaných dále, se omezily na buněčné linie, odvozené z primárních nádorů. Ačkoliv je rozumné předpokládat, že zlomové body chromozomu 12 v buněčných liniích budou podobné, pokud nebudou přímo identické se zlomovými body chromozomu 1.2 primárních nádorů, nelze zcela vyloučit rozdíly ve výsledku založení buněčných linií_nebo při následné buněčné kultivaci. Úkolem tohoto testu tedy bylo zjistit, zda jsou zlomové body chromozomu 12 ve třech primárních adenomech slinných žláz rovněž zmapovány v oblasti MAR. Ve všech třech případech tato kosmidová banka zřejmě pokrývala zlomové body chromozomu 12 (data nejsou uvedena), což naznačuje, že tyto zlomové body se ve skutečnosti nacházely uvnitř MAR. V nedávné studii (Wanschura S, Belge G, Stenman G, Kools P,, «· ·· · ·· ·· · «·· · · · · · · · · «··· • · · · · · ···· · ··· · · ····«· ··· ···· ·· ·· · ·« ··
113
Dal Chin P, Schoenmakers E, Huysmans C, Bartnizke S, Van de Ven W, and Bullerdiek J (připraveno pro publikaci). Mapping of the translocation breakpoints of primary pleomorphic adenomas and lipomas within a common region of chromosome 12.,) je uvedeno, že zlomové body chromozomu 12 pěti primárních děložních leiomyomů s 12ql4-15 odchylkami se všechny nacházely ve shluku v 1,5 Mb DNA fragmentu (mezi cRM33 a cRM103) , o kterém se ví, že je místem výskytu zlomových bodů různých buněčných linií, odvozených z primárních děložních leiomyomů (schematicky znázorněno na obr. 3). V souladu s výsledky studií, mapujících zlomové body buněčných linií, ukázaly výsledky mapování zlomových bodů nádorů dvou typů primárních pevných nádorů, že se zlomové body primárních nádorových buněk nacházejí v MAR.
Zlomové body chromozomového segmentu 12ql3-ql5 lipomů zmapovaných uvnitř MAR
Zjišťování, zda se zlomové body chromozomu 12 dalších pevných nádorů s 12ql3-ql5 odchylkami rovněž nacházejí uvnitř MAR se provádělo pomocí analýzy FISH v lipomových buněčných liniích LÍ-14/SV40 a LÍ-538/SV40. Odchylky chromozomu 12 těchto dvou lipomových buněčných linií jsou uvedeny v tabulce 1. Jako molekulové sondy se použily kosmidové klony cRM33, cRM53, cRM72, cRM76, cRM99, cRMlO3 a CRM133. Zlomový bod LÍ-14/SV40 se zmapoval v 75 kb DNA intervalu mezi RM76 a RM133 a LÍ-538/SV40 se zmapoval v 90 kbp intervalu mezi RM7.6 a RM99 (údaje nejsou uvedeny), což je schematicky znázorněno na obr. 3. Podobná analýza FISH dvou primárních lipomů, používající směs cRM36 a CRM103 jako molekulovou sondu, poskytla hybridizační vzor naznačující, že směs sond detekovala sekvence na druhé ·· ··
114 • * · • ···· « ·· ·· • · · · • · ·· « · · · * ·· ·· straně zlomových bodů. Získané výsledky jsou prvním důkazem toho, že zlomové body chromozomu 12ql3-ql5 v lipomu jsou rovněž zmapovány v MAR. Aby bylo možné správně interpretovat získané výsledky testu, je třeba provést více testů zaměřených na lipomy.
DISKUSE
V popsané studii byly zmapovány zlomové body chromozomu 12 tří primárních pleomorfních adenomů slinných žláz a sedmi založených buněčných linií, odvozených z těchto pleomorfních nádorů. Zdá se, že se všechny zlomové body nacházejí v již molekulově klonovaném a charakterizovaném chromozómovém DNA segmentu na dlouhém rameni chromozomu 12, jehož velikost je přibližně 1,7 Mb, přičemž pět z nich se shlukuje v DNA intervalu menším než 500 kb. 1,7 Mb DNA oblast zřejmě obsahuje hlavní shlukovou oblast zlomových bodů pro tento typ nádoru. V předcházející studii byla popsána charakteristika zlomového bodu chromozomu 12 pleomorfní adenomové buněčné linie slinných žláz Ad-312/SV40 (Kools PFJ, Wanschura S, Schoenmakers EFPM, Geurts JWM, Mols R, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Van de Berghe H, Van de Ven WJM (1995) Identification of the chromosome 12 translocation breakpoint region of a pleomorphic salivary gland adenoma with t (1;12) (p22;g!5) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet, In press, 1995.). Nyní se zjistilo, že zlomový bod této buněčné linie je zmapován ve vzdálenosti více než 2 Mb od. této, zde uvedené, hlavní shlukové oblasti zlomových bodů. Je možné, že Ad-312/SV40 zlomový bod zahrnuje další patogeneticky relevantní genetické sekvence kromě těch, které jsou ovlivněny shlukem zlomových bodů. Nicméně nelze »· ·· ·» * ·« 99 • · · · ··· · 9 9 · • · · · · · · · ··« • · 9 » · 9 ···· · 9·· 9 9 ······ 9 9 9 ···« ·« ·· 9 99 99
115 vyloučit ani možnost, že všechny 12ql3-ql5 zlomové body v pleomorfních adenomech slinných žláz, které jsou zmapovány takto daleko, spadají do stejné kategorie a jsou dispergovány v . relativně velké DNA oblasti tohoto chromozomu a připomínají llql3 zlomové body v B-buněčných malignancích (Raynaud SD, Bekri S, Leroux D, Grosgeorge J, Klein B, Bastard C, Gaudray P, Simon MP (1993) Expanded range of llql3 breakpoints with differing patterns of cyclin Dl expression in B-cell malignancies. Genes Chromosom Cancer 8: 80-87.). Přesnější identifikace různých zlomových bodů by mohla vnést do těchto studií více světla.
Důležité je zjištění, že se zdá, že DNA segment, ve kterém se vyskytují shluky 12q zlomových bodů pleomorfních adenomů slinných žláz, je shodný s DNA oblastí, která byla nedávno definována jako děložní leiomyomová shluková oblast zlomových bodů chromozomu 12, a je známa jako ULCR12 (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloníng and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Dále je zajímavá skutečnost, že tato oblast chromozomu 12 je rovněž místem výskytu zlomových bodů primárních lipomů a lipomových buněčných linií, odvozených z pr imá r n i ch nádor ů : s 12 q 13 -q 15 o dč h y1kami. VýsTe d k y všech' těchto studií nyní jasně ukazují, že zlomové body chromozomu 12 tří různých typů pevných nádorů jsou zmapovány ve stejné 1,7 Mb genomové oblasti na dlouhém rameni chromozomu 12, což činí z této oblasti oblast mnohočetných odchylek. Na základě těchto zjištění byl tento DNA segment označen jako MAR.
♦ · ·♦ ·* « ·· »<
• · » · 4 · · ···· ··· ···« ···· • · · · · · ···* · ··· · · ··»·· * · · ••••»· ·· · ·· · ·
116
Genetické odchylky, zahrnující chromozomovou oblast 12ql3-ql5, byly zjištěny při mnoha dalších cytogenetických studiích i v celé řadě různých jiných pevných nádorů, než jen ve třech výše zmíněných nádorech. Výskyt 12ql3-ql5 byl rovněž zjištěn u endometrických pol.ypů (Walter TA, Xuan Fan S, Medchill MT, Berger CS, Decker H-JH, Sandberg AÁ (1989) Inv(12)(pll.2ql3) in an endometrial polyp. Cancer Genet Cytogenet 41: 99-103.; Vanni R, Dal Cin P, Marras S, Moerman Ph, Andria M, Valdes E, Deprest J, and Van den Berghe H (1993) Endometrial polyp: Another benign tumor characterized by 12ql3-15 changes. Cancer Genet Cytogenet 68: 32-33.), v čirých buněčných sarkomech charakterizovaných opakující se t(12;22)(ql3;ql3) (Fletcher JA (1992) Translocation (12;22) (ql3-14;ql2) is a nonrandom aberration in soft-tissue clear-cell sarcoma. Genes Chromosom Cancer 5: 184.; Reeves BR, Fletcher CDM, Gusterson BA (1992) Translocation t(12;22)(ql3;ql3) is a nonrandom rearrangement in clear cell sarcoma. Cancer Genet Cytogenet 64: 101-103.; Rodriguez E, Sreekantaiah C, Reuter VE, Motzer RJ, Chaganti RSK (1992) t(12;22)(ql3;ql3) and trisomy 8 are nonrandom aberrations in clear-cell sarcoma. Cancer Genet Cytogenet 64: 107-110.) podskupinou rabdomyosarkomu (Roberts P, Browne CF, Lewis IJ, Bailey CC, Špice RD, Williams J, Batcup G (1992) 12ql3 Abnormality in rhabdomyosarcoma. A nonrandom Occurrence, Cancer Genet Cytogenet 60: 135-140.) a hemangiopericytomu (Mandahl N, Orndal C, Heim S, Willen H, Rydholm A, Bauer HCF, Mitelman F (1993a) Aberrations of chromosome segment 12ql3-15 characterize a subgroup of hemangiopericytomas. Cancer 71: 3009-3013.), v chondromatózních nádorech (Mandahl N, Heim S, Arheden K, Rydholm A, Willen H, Mitelman F (1989) Chromosomal rearrangements in chondromatous tumors. Cancer • ·
117
65: 242-248.; Bridge JA, Persons DL, Neff JR, Bhatia P (1992) Clonal karyotypic aberrations in enchondroma. Cancer Detect Prev 16: 215-219.; Hirabayashi Y, Yoshida MA, Ikeuchi T, IshidaT, Kojima T, Higaki S, Machinami R, Tonomura A (1992) Chromosome rearrangements at 12ql3 in two cases of chondrosarcomas. Cancer Genet Cytogenet 60: 3540.; Mandahl N, Wilien H, Rydholm A, Mitelman F (1993b) Rearrangement of band ql3 on both chromosomes 12 in a periosteal chondroma. Genes Chrom Cancer 6: 121-123.) a hemartomů plic (Dal Cin P, Kools P, De Jonge I, Moerman Ph, Van de' Ven W, Van den Berghe H (1993) Rearrangement of 12ql4-15 in pulmonary chondroid hamartoma. Genes Chromosom Cancer 8: 131-133.). Konečně, bylo publikováno i několik zpráv týkajících se pevných nádorů s výskytem chromozomové oblasti 12ql3-ql5, například v nádorech prsu (Birdsal SH, MacLennan KA, Gusterson, BA (1992) t(6;12) (q23;ql3) and t(10;16)(q22;pll) in a phyllodes tumor of the breast. Cancer Genet Cytogenet 60: 74-77.; Rohen C, Bonk U, Staats B, Bartnizke S, Bullerdiek J (1993) Two human breast tumors with translocations involving 12ql3-15 as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet 69: 6871.), difúzních astrocytomech (Jenkins RB, Kimmell DW, Moertel CA, Schulz CA, Menezes RM, Scheihauer B, Kelly PJ, Dewald GW (1989) Recurrent cytogenetic abnormalities in 80 gliomas._Cytogenet Cell Genet 51: 1019.) a v obřím-buněčném nádoru kosti (Noguera R, Llombart-Bosch A, Lopez-Gines C, Carda C, Fernandez Cl (1989) Giant-cell tumor of bone, stage II, displaying translocation t(12;19)(ql3;ql3). Ichrows . Archiv A Pathol Anat 415: 377-382.). Na základě výsledků cytogenetických studií nemohl být vytvořen žádný předpoklad, který by se týkal distribuce zlomových bodů těchto typů nádorů. Ve světle dosažených výsledků • · ······ ·· · · · ··
118 předložené studie by bylo zajímavé vědět, zda zlomové body libovolného výše popsaného nádoru lze rovněž zmapovat uvnitř MAR nebo v její blízkosti. To lze snadno určit pomocí, testů, využívajících různé, v současnosti dostupné, kosmidové klony.
Zjištění, že se 12q zlomové body alespoň tří odlišných typů pevných nádorů nachází ve stejné DNA oblasti, je zavádějící, protože by mohlo směřovat k možnému závěru, podle kterého by se stejné genetické sekvence v MAR patogenicky týkaly vývoje nádoru v různých tkáních. Pokud ano, potom by bylo možné spekulativně tvrdit, že gen(y) ovlivněný genetickými odchylkami by se měl podílet na regulaci růstu. Na druhé straně nelze vyloučit možnost, že genetické sekvence v MAR nejsou patogenicky relevantní, protože zjištěné shlukování genetických odchylek v MAR by mohlo jednoduše odrážet genetickou nestabilitu této oblasti. Za účelem získání většího množství materiálu v této oblasti by se mělo provést identifikování a charakterizování genů vyskytujících se v MAR, což lze provést pomocí různých přístupů, využívajících celou řadu technik (Parrish JE, Nelson DL (1993) Methods for finding genes a major rate-limiting, step in posítional cloning. GAT 10: 29-41.).
Stručný popis obrázků k dodatku 1
Obrázek 1
Schematicky znázorňuje data FISH mapování, získaná pro sedm buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz testovaných v této studii. Kosmidové klony, které se • · ·· · · · · · · ΦΦΦ φ · φ φ φ · φφφφ φ ΦΦΦ φ φφφφφφ φφ φφφφ φφ φφ φ φφ φφ
119 použily jako sondy při mapování FISH na STS získaných ze vzájemně se překrývajících YAC klonů, jsou pojmenovány po akronymech STS, které jsou znázorněny v rámečcích a jejich relativní pořadí odpovídá prezentovanému pořadí. Zjištěná velikost DNA intervalu mezi RM69 a RM72 byla 2,8 Mb. Pevné linie naznačují DNA intervaly, ve kterých se vyskytují zlomové body různých buněčných linií. Tečky označují experimenty FISH, které se prováděly na metafázových chromozomech různých buněčných linií za použití kosmidového klonu odpovídajícího STS, naznačeného nad těmito liniemi, jako molekulární sondy. Relativní pozice MAR a ULCR12 jsou naznačeny ve spodní části obrázku.
Ad - pleomorfní adenom slinných žláz; MAR - oblast
mnohočetných odchylek; ULCR12 - shluková oblast bodů chromozomu 12 děložního leiomyomu. zlomových
Obrázek 2
a: znázorňuje parciální karyotyp Ad-295/SV40 ukazuj ici
der(8), der(12), chromozomy; der(18) a odpovídající normální
b: znázorňuje FISH analýzu metafázových chromozomů
Ad-295/SV40 buněk za použití DNA kosmidového klonu cRM76
jako molekulové sondy (hybridizační signály na normálním chromozomu 12 (šipka) a der(12) (kótová špička));
c: GTG-pásmovací vzor metafázových chromozomů Ad-295/SV40 znázorněných v'b;
d: FISH analýza metafázových chromozomů Ad-295/SV40 buněk, používající DNA kosmidového klonu CRM103 jako • ·
120 molekulové sondy (hybridizační signály na chromozomu 12 (Šipka) a der(18) (kótová špička).
normálním
Obrázek 3
Schematicky znázorňuje data, získaná mapováním zlomových bodů chromozomu 12, pro primární pleomorfní adenomy slinných žláz, děložní leiomyomy a lipomy a rovněž pro buněčné linie, odvozené z těchto pevných nádorů. Výsledky jsou srovnatelné s daty získanými pro primární děložní leiomyomy (Wanschura S, Belge G, Stenman G, Kools P, Dal Chin P, Schoenmakers E, Huysmans C, Bartnizke S, Van de Ven W, and Bullerdiek J (předložena pro publikaci). Mapping of the translocation breakpoints of primary pleomorphic adenomas and lipomas within a common region of chromosome 12.) a buněčné linie odvozené z těchto nádorů (Schoenmakers HFPM, Mols R, Wanschura S, Kools PFJ, Geurts JMW, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1994b) Identification, molecular cloning and characterization of the chromosome 12 breakpoint cluster region of uterine leiomyomas. Genes Chromosom Cancer 11: 106-118.). Kosmidové klony, které se použily jako sondy ve FISH mapujících studiích, odpovídají STS, získaným ze vzájemně se překrývajících YAC klonů. Kosmidové klony se - poj měno va 1 y -po . a kr onyme ch STS, = a kt er é j s ou znázorněny v rámečcích a jejichž relativní pořadí odpovídá znázorněnému pořadí. Určila se velikost DNA intervalů mezi STS.
Ad - pleomorfní adenom slinných žláz; Li - lipom; LM - děložní leiomyom.
• ·
121
DODATEK 2
Identification of the Chromozome 12 Translooation Breakpoint Region of a Pleomorphic Salivary Gland Adenoma with t(l;12)(p22;ql5) as the Sole Cytogenetic Abnormality
Patrick F.J. Kools, Sylke Wanschura, Eric F.P.M. Schoenmakers, Jan W.M. Geurts, Raf Mols, Bernd Kazmierczak, Jórn Bullerdiek, Herman Van den Berghe and Wim J.M. Van de Ven
Buněčná line Ad-312/SV40, která se odvodila z primárního pleomorfního adenomu slinnýeh žláz s t(l;12)(p22;ql5), se použila při fluorescenční in šitu hybridizační (FISH) analýze, jejímž úkolem bylo charakterizovat její oblast translokačních zlomových bodů na chromozomu 12. Výsledky předcházejících studií naznačily, že zlomový bod chromozomu 12 v Ad-312/SV40 se vyskytuje v blízkosti místa D12S8 a daleko od CHOP genu. Byly popsány dva částečně se vzájemně překrývající klony kvasinkového umělého chromozomu (YAC) Y4854 (500 kbp) a Y9091 (460 kbp), které se izolovaly v rámci projektu procházení chromozomy, při kterém byly jako výchozí body použity body D12S8 a CHOP. Následně se izolovaly kosmidové klony odpovídají různým místům se sekvenční adresou (STS) , zmapovaným uvnitř inzertů těchto YAC klonů. Tyto kosmidové klony zahrnovaly cRM51, cRM69, cRM85,‘ CRM90, cRM91, cRMllO a cRMlll. ' .....
From the Center for Human Genetics (P.F.J.K., E.F.P.M.S., J.W.M.G.,
R.M., H.V.D.B., W.J.M.V.D.V.), University of Leuven, Leuven, Belgium and Center for Human Genetics (S.W., B.K., J.B.), University of
Břemen, Břemen, Germany.
P.F.J. Kools and Sylke Wanschura contributed equally to this study and must be considered joint first authors.
Address reprint requests to Dr. Wim J.M. Van de Ven, Center for Human Genetics, University of Leuven, Herestraat 49, B-3000, Leuven,
Belgium.
Received Apríl 13, 1994; accepted July 6, 1994.
122
Byla předložena širokórozsahová restrikční mapa, vymezující inserty těchto dvou YAC klonů a analýza FISH ukázala, že oba YAC pokrývají zlomový bod chromozomu 12, který je přítomen v Ad-312/SV40 buňkách. U studií FISH se zdá, že jsou kosmidové klony cRM85, cRM90 a cRMlll zmapovány daleko od zlomového bodu chromozomu 12, zatímco kosmidové klony CRM51, cRM69, cRM91 a cRMllO se nalézají na mapě v blízkosti tohoto zlomového bodu. Tyto výsledky potvrzují, že se zlomový bod chromozomu 12 v Ad-312/SV40 vyskytuje ve vzdálenosti menší než 165 kbp od DNA oblasti. Vyhodnocení FISH zlomových bodů chromozomu 12 v pěti dalších buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz naznačuje, že se nacházejí v jeho blízkosti v Ad-312/SV40, ve vzdálenosti větší než 0,9 Mb od STS RM91. Tyto výsledky kromě toho, že ukazují potenciálně kritickou oblast na chromozomu 12, rovněž představují evidenci možného začlenění sekvencí chromozomu 12ql3-ql5, lokalizovaných na jiném místě.
ÚVOD
Pleomorfní adenom slinných žláz tvoří menigní epitelový nádor, který pochází z hlavních a vedlejších slinných žláz. Je nejčastějším typem nádoru slinných žláz a tvoří většinou 50 % všech neoplasmů v těchto orgánech; 85 % těchto nádorů se nachází v příušní žláze, 10 % ve vedlejších slinných žlázách a 5 % v submandibulární žláze [Seifert G,. Miehlke A, Haubrich J, Chilla R (1986): Diseases of the salivary glands. Pathology. Diagnosis. Treatment. Facial nerve surgery. Transalated by P.M. Stell. Thieme, Stuttgart, New York, pp 1820194.]. Zdá se, že přibližně 50 % těchto adenomu má normální karyotyp, ale • · ···· ·· ·· · ·· ··
123 cytogenetické studie rovněž ukázaly opakující se specifické chromozomové anomálie[Sandros J, Stenman G, Mark J (1990): Cytogenetic and molecular obsarvations in human and experimental salivary gland tumours. Cancer Genet Cytogenet 44: 153-167; Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R. , Haubrich J, Thode B, Bartnizke S (1993): Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to occurrence, histological subtype, and in vitro cellurarbehavior. Cancer Genet Cytogenet 65: 27-31.]. Často byl pozorovány anomálie, které zahrnují odchylky chromozomu 8, zpravidla zahrnující oblast 8ql2-ql3 s nejběžnější odchylkou t (3;8) (p21;ql2), a odchylky chromozomu 12, zpravidla translokace, zahrnující oblast 12ql3-ql5. Rovněž byly zaznamenány neopakující se klonové chromozomové abnormality. Vysoce specifický vzor chromozómových přeuspořádání s pevnými zlomovými body v 8ql2-ql3 a 12ql3-ql5 dává tušit, že tyto chromozomové oblasti jsou místem výskytu genů, které by se mohly podílet na vývoji těchto nádorů. Molekulové klonování chromozómových zlomových bodů a charakterizace jejich spojovacích fragmentů může vést k identifikaci patogeneticky relevantních genů. Do současné doby zatím nebyla tato data pro zmíněné nádory popsána.
Na základě výsledků fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) se nedávno zjistilo, žě zlomové body chromozomu 12 v šesti buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz mapují oblast 12ql3-ql5, konkrétněji genomový interval mezi místem D12S19 a D12S8 [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van den Ven WJM (1993) : Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16) (ql3;pll.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet • · · · « · • · · ·
124
Cytogenet 62: 159-161; Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993) : Physical mapping of .... chromosome 12q breakpoints in...... lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.]. Průměrná genetická oblast tohoto genomového DNA intervalu, zaznamenaná v HGM10, byla 7 cM [Keats B, Ott J, Conneally M (1989): Reports of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.]. Rovněž bylo zaznamenáno, že zlomové body chromozomu 12 adenomů slinných žláz jsou zmapovány daleko od CHOP genu [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.], což je oporou pro dřívější studii, která naznačila, že 12ql3-ql5 translokační zlomové body v pleomorfních adenomech slinných žláz jsou odlišné od zlomových bodů v myxoidním liposarkomu [Stenman G, Sahlin P, Mark J, Chaganti RKS, Kindblom LS, Aman P (1993): The 12ql3-ql5 translocation breakpoints in pleomorphic adenoma and clearcell sarcoma of tendons and aponeuroses are different from that ,in_myxoid liposarcoma _ Genep_ Chrom_. Cancer__17 8180.]. Zde se uvádí, že fyzikální mapování zlomových bodů chromozomu 12 v buněčné linii Ad-312/SV40 pleomorfního adenomů slinných žláz nese t (1;12) (p22;ql5) jako jedinou cytogenetickou abnormalitu.
125
MATERIÁLY A METODY
Nádorové buněčné linie
Buněčné linie lidského nádoru, použité v této studii, zahrnují již popsané buněčné linie Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40, Ad-312/SV40 a
Ad-366/SV40 pleomorfního adenomu slinných žláz [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe , H, Van de Ven WJM (1993) : Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.; Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990): In vitro transformation by the SV40 early region” of cells from a human benign salivary gland tumour with a 12ql3—»ql5 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.]. Buňky se kultivovaly v TC199 kultivačním médiu s Earleovými solemi, doplněném 20% fetálním bovinním sérera. Další buněčné linie, použité v této studii, zahrnují somatický buněčný hybrid PK69-12, který obsahuje chromozom 12, jako celý lidský chromozom v křeččím genetickém pozadí [Warburton D, Gersen S, Yu M-T, Jackson C, Handelin B, Housman D (1990): Monochromosomal rodent-human hybrids from microcell fusion of human lymphoblastoid cells containing an inserted dominant selectable markér. Genomics 6: 358366.] a somatický buněčný hybrid LIS-3/SV40/A9-B4 [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van den Ven WJM (1993): Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16)(ql3;pll.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Gell Genet Cytogenet 62: 159-161.]. Poslední buněčná linie se získala po fúzi myxoidní liposarkomové buněčné
126 linie LIS-3/SV40, která nese specifickou t(12;16)(ql3;pll.2), s myšími A9 buňkami. Tento somatický buněčný hybrid, jak již bylo ukázáno, obsahuje der(16), ale neobsahuje der(12) ani normální chromozom 12 [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van den Ven WJM (1993) : Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16)(ql3;pll.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.]. PK89-12 a LIS-3/SV40/A9-B4 buňky se nechaly růst v DME-F12 médiu, doplněném 10% fetálním bovinním sérem. Buněčné linie se v pravidelných intervalech analyzovaly standardními cytogenetickými technikami.
Izolace YAC a kosmidové klony
V rámci lidských genomových mapovacích studií, které budou popsány podrobněji na jiném místě (Schoenmakers a kol., v přípravě), se izolovaly z první generace CEPH YAC knihovny [Albertsen HM, Abderrahim H, Cann HM, Dausset J, Le Paslier D, Cohen D (1990) : Construction and characterization of a yeast artificial chromosome library containing seven haploid human genome eguivalents. Proč Nati Acad Sci USA 87: 4256-4260,] YAC klony Y4854 a Y9091 a z testované kosmidové knihovny LLNLNC01 'specifické pró chromozom 12 [Montgomery KT, Le Blanc JM, Tsai P, McNinch JS, Ward DC, De Jong PJ, Kucherlapati R, Krauter KS (1993): Characterization of two chromosome 12 cosmid libraries and development of STSs from cosmids mapped by FISH. Genomics 17: 682-693.] kosmidové klony cRM51, cRM69, cRM85, cRM90, cRM91, cRM103, cRMUO a cRMlll. YAC kosmidové klony se izolovaly již popsaným způsobem [Schoenmakers HFPM, Kools • · 4 4 • 4
44 · 44 4 • · · · · * · · • · · 4 4 4 4 4 • · · ♦ · 444444
4 4 4 · e
4444 44 44 ·
127
PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cín P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.]. Počáteční průzkum (screenování) YAC, a rovněž kosmidové knihovny, se prováděl za použití průzkumové (screenovací) strategie, zahrnující reakci polymerázového řetězce (PCR) [Green ED, Olson MV (1990): Systematic screening of yeast artificialchromosome libraries using the polymerase chain reaction. Proč Nati Acad Sci USA 87: 1213-1217.]. Filtrová hybridizační analýza se použila, jak již bylo popsáno, jako konečný průzkumový (screenovací) krok [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993):. Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.]. Kosmidové klony se izolovaly za použití STS a ty kosmidové klony, odpovídající STS uvnitř inzertů YAC klonů Y4854 a Y9091, jsou naznačeny na obrázku 1. STS se získaly zachráněním YAC inzertních koncových sekvencí pomocí „vectorette-PCR postupu [Geurts JMW, Schoenmakers HFPM, Mols R, Van de Ven WJM (1994): Improved proceduře for rapid isolation and sequencing of DNAS termini in yeast artificial chromosomes. Meth Mol Cell Biol, In Press.] nebo Alu-PCR [Nelson DL, Ledbetter SA, Corbo L, Victoria MF, Ramirez-Solis R, Webster TD, Ledbetter DH, Caskey CT (1989): Alu polymerase chain reaction. A method for rapid isolation of human-specific sequences from. complex DNA sources. Proč Nati Acad Sci USA 86: 6686-6690; Breukel C,
Wijnen J, Trops C, Van de Klift H, Dauwerse H, Meera Khan P ·· ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · 9 Ο • · · · · · · · ···
128 (1990): Vector-Alu PCR: a rapid step in mapping cosmids and YACs. Nucl Acids Res 18: 3097.]. PCR produkty se sekvencovaly přímo, přes fluorescenční sekvencování pevné fáze. Kosmidové klony se nechaly růst a následně se s nimi zacházelo podle standardních postupů [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989): Molecular Cloning: A Laboratory Menual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ] . YAC klony se charakterizovaly pomocí gelové pulzní elektroforézy [Chu G, Vollrath D, Davis RW (1986): Separation of large DNA molecules by contour-clamped homogeneous electric fields. Science 234: 1582-1585.], restrikčního mapování a hybridizace, které již byly popsány [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cín P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993) : Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.].
Chromozomové přípravky a fluorescenční hybridizace in šitu
Buňky z nádorových buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz se ošetřily během 30 minut Colcemidem (0,04 pg/ml) a následně sklidily běžným způsobem. Metafázové nárůsty nádorových buněk se připravily již popsaným způsobem [Schoenmakers' HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van den . Ven WJM (1993) : Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16)(ql3;pil.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.]. Za účelem • · · · ··· · · ·
I» l»« » · · I ► · · ·
129
Cornelisse CJ nonradipactive stanovení identity chromozomů ve FISH experimentech, se FISH analýza prováděla až po G-pásmování totožných metafázových nárůstů. G-pásmování se provádělo v podstatě způsobem, který popsal Smít a kol. [Smít VTHBM, Wessels JW, Mollevanger P, Schrier PI, Raap EK, Beverstock GC, (1990): Combined GTG-banding and in sítu hybridization inproves characterization of complex karyotypes. Cytogenet Cell Genet 54: 20-23.]. In šitu hybridizace se prováděly podle postupu, který popsal Kievits a kol. [Kievits T, Dauwerse JG, Wiegant J, , Deville P, Breuning MH, Cornelisse CJ, van Ommen G, Pearson PL (1990): Rapid subchromosomal localization of cosmids by nonradioactive in šitu hybridization. Cytogenet Cell Genet 53: 134-136.], s použitím některých drobných modifikací [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.; Kools PFJ, Roebroek AJM, Van de Velde HJK, Marynen P, Bullderiek J, Van de Ven WJM (1993): Regional mapping of the human NSP gene to chromosome 14q21-q22 by fluorescence in šitu hybridization. Cytogenet Cell Genet 66: 48-50.].
Kosmidová a YAC DNA' se označila pomocí biotinu-ll-dUTP (Boehringer Mannheim) nebo biotinu-14-dATP (BRL, Gaithersburg), jak již bylo uvedeno dříve [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20:
·· • ·
130 • · · • · · · • · 449· ·
4 9 • 4 4 9
210-222.]. Chromozomy se opatřily protibarvivem pomocí propidiumjodidu a analyzovaly na fluorescenčním mikroskopu Zeiss Axiophot, za použití filtru FITC (Zeiss). Výsledky se zaznamenaly na film Scotch (3M) 640 asa.
VÝSLEDKY
Izolace a charakterizace YAC klonů překrývajících zlomový bod chromozomu 12 buněčné linie Ad-312/SV40 pleomorfního adenomu slinných žláz
V předcházejících studiích [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cín P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.] se zmapovaly zlomové body chromozomu 12 šesti buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz v blízkosti místa D12S8 a daleko od CHOP. DNA interval mezi těmito místy je o něco menší než 7 cM (stanovená vzdálenost mezi místem D12S8 a D12S19 [Keats B, Ott J, Conneally M (1989): Reports of the committee on linkage and gene order. Cytogenet Cell Genet 51: 459-502.]), ale stále dost velká. Pro molekulární definici _ translpkačního . zlomového bodu Adg31_2/_SV4 0 _ se, provedlo mapování lidského genomu na DNA intervalu mezi místem D12S8 a CHOP genem. Při směrovém procházení chromozomem, kdy se jako výchozí bod vzalo místo D12S8 a CHOP gen, se získaly vzájemně se překrývající YAC kolony Y9091 a Y4854. DNA inzert Y9091, jak se zdá, měl velikost 460 kbp a Y4854 měl velikost 500 kbp. Kromě toho, jak bude naznačeno níže, DNA inzert každého YAC klonu překrývá
Γ'· • · · · · • · · ·· ··
131 zlomový bod chromozomu 12 Ad-312/SV40. Širokorozsahová restrikční mapa inzertů těchto YAC klonů se získala pomocí elektroforézy pulzního pole a hybridizační analýzy (obr. 1) . Na základě mapování obsahu STS a analýzy Southernova přenosu se zjistilo, že inzerty YAC klonů Y9091 a Y4854 se překrývají způsobem, naznačeným na obrázku 1. Testované STS odpovídají koncovým sekvencím dalších vzájemně se překrývajících YAC klonů, které zde nejsou znázorněny, nebo sekvencím, získaným pomocí inter-Alu-PCR. Z nich RM90 a RM91 reprezentují tyto STS koncových klonů YAC Y9091 a RM48 a RM54 Y4854, zatímco RM110 a RM111 reprezentují STS odvozené z inter-Alu-PCR. Pro celou řadu STS, zmapovaných uvnitř inzertů YAC klonů Y4854 a Y9091 se izolovaly odpovídající kosmidové klony pro analýzu FISH, např. CRM51, cRM69, cRM85, cRM90, cRM91, cRMUO a cRMlll.
Inzerty dvou vzájemně se překrývajících YAC klonů nejsou pravděpodobně chimérické, jak bylo odvozeno z následujících pozorování. FISH analýza metafázových chromozomů normálních lidských lymfocytů, prováděná za použití Y4854 nebo Y9091 DNA jako molekulové sondy, poskytla hybridizační signály pouze v chromozomové oblasti 12ql3-ql5. To pro Y9091 potvrdila další pozorování, prováděná v rámci FISH studií, ve kterých se jako molekulová sonda použil kosmidový klon cRM90 nebo cRM91. DNA inzert každého z= i těchto dvou kosmá dů odpovídá alternativním koncovým sekvencím YAC klonu Y9091. Konečně STS koncové sekvence Y9091 jsou zmapovány v chromozomu 12 a daleko od CHOP genu, který se určil pomocí PCR analýzy na PK89-12 DNA, která obsahuje lidský chromozom 12, jako celý lidský chromozom v křeččím genetickém pozadí a která, jak již bylo naznačeno, specifické t(12;16)
LIS-3/SV40/A9-B4 DNA, obsahuje der(16) ze myxoidního • · ··· · · · · · · • · · · · · ···· · ··· · · ······ ··· ······ · · · ·· ··
132 liposarkomu, ale neobsahuje ani der(12), ani normální chromozom 12 [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Kazmierczak B, Bullerdiek J, Claussen U, Horsthemke B, Van den Berghe H, Van den Ven WJM (1993): Isolation of a somatic cell hybrid retaining the der(16)t(12;16)(ql3;pll.2) from a myxoid liposarcoma cell line. Cell Genet Cytogenet 62: 159-161.]. Ze studií procházení chromozomem se odvodilo, že vzájemně se překrývající inzerty dvou DNA klonů reprezentují DNA oblast o velikosti přibližně 640 kbp, která se nachází na chromozomu 12q mezi D12S8 a CHOP. Protože byla 640 kbp kompozitní širokorozsahová restrikční mapa YAC kontigu konstruovaná alespoň s dvojím překrytím celé oblasti, je nerozumné se domnívat, že 640 kbp oblast sousedí s chromozomovou DNA, ačkoliv mikrodeletace nelze v tomto ohledu vynechat.
Procházení chromozomy se rutinně vyhodnotilo FISH mapováním YAC klonů a/nebo kosmidových klonů, odpovídajících YAC inzertním sekvencím. Je třeba zmínit, že pro identifikaci chromozomů se ve většině případů použilo G-pásmování. Na základě tohoto G-pásmování mohly být hybridizační signály posléze přiřazeny chromozomům o známé identitě, což bylo rovněž důležité v případech, ve kterých byly případně pozorovány křížové hybridizační signály a hybridizační signály pozadí. G-pásmování, prováděné před _FISH. analýzou, ~é v některých případech za následek slabší hybridizační signály nebo neurčité pásmovací vzory. Z tohoto důvodu se provedly FISH experimenty, při kterých se YAC a kosmidové klony, které se měly hodnotit, použily v kombinaci s referenční sondou. Kosmidový klon cPK12qter, který se náhodně získal během screenování kosmidové knihovny, se zvolil jako referenční signální znak (markér) . FISH analýza metafázových chromozomů normálních lymfocytů φ φ • Φ φ φ · · φ φφ • •φφ φφφ φ φφ φ φ φφφ φ · φ · φ φ φφφ «φφφφφ φ · φ φ « • φφφφφ φφφ φφφφφφ φφ φ φφ φφ
133 (obr. 2Α) poskytla cPK12qter mapy v telomerické oblasti dlouhého ramene chromozomu 12. Za účelem identifikace chromozomu 12 v tomto experimentu, se použila sonda pocl2H8, specifická pro centromer 12 [Looijenga LHJ,. Smit VTHBM, Wessels JW, Mollevanger P, Oosterhuis JW, Cornelisse CJ (1990): Localization and polymorphism of a chromosome 12specific a satellite DNA sequence. Cytogenet Cell Genet 53: 216-218.]. FISH analýza metafázových chromozomů Ad-312/SV40 buněk, používající YAC klon Y4854 (obr. 2B) nebo Y9091 (obr. 2C) v kombinaci s referenční sondou cPK12qret, poskytla v obou případech hybridizační signály YAC inzertu na der(l) a rovněž na der(12). Z těchto výsledků se usoudilo, že inzert DNA každého YAC klonu může překrývat zlomový bod chromozomu 12 v této buněčné linii. Je třeba uvést, že G-pásmování poskytlo telomerní společenství, zahrnující krátké rameno chromozomu 12, znázorněné na obrázku 2C. Pozorování toho, že YAC klon Y9091 překrývá v Ad-312/SV40 zlomový bod chromozomu 12 se nezávisle potvrdilo při studiích FISH, při kterých se použil kosmidový klon cRM90 nebo cRM91 jako molekulová sonda, a které ukázaly výskyt alternativních koncových sekvencí Y9091 inzertu. Zdá se, že cRM90 je zmapován daleko od zlomového bodu chromozomu 12, zatímco cRM91 se nachází v blízkosti tohoto zlomového bodu (data nejsou znázorněna).
Tyto výsledky rovněž zakládají chromosomovou orientaci YAC kontigu, znázorněnou na obrázku 1. V souhrnu z těchto studií FISH vyplývá, že translokační zlomový bod chromozomu 12 v Ad-312/SV40 musí být umístěn v DNA intervalu, odpovídajícímu vzájemně se překrývajícím sekvencím (přibližně 300 kbp), dvou YAC klonů.
• · • 9 · · ·· · ♦ 9 9 · · · · • · · · ··· · · · · • · · · · · ···· 9 ··· 9 · ······ · · ·
9 9 9·· · · · « · ··
134
Podrobné mapování traslokačního zlomového bodu chromozomu 12 Ad-312/SV40
Při dalším zúžení oblasti translokačního bodu chromozomu 12 Ad-312/SV40 se uvnitř YAC klonu Y9091 izolovaly kosmidové klony s různými mapovacími polohami. Tyto klony zahrnovaly cRM69, cRM85, cRMUO a cRMlll. Na základě STS sekvencí YAC klonů se izolovaly cRM69 a cRM85, které zde nejsou znázorněny. Klony cRMUO a cRMlll se získaly pomocí inter-Alu-PCR. Analýza Southernova přenosu ukázala, že RM110 hybridizuje na koncový Mlul fragment Y9091 a nikoliv na DNA inzert vzájemně se překrývajícího YAC klonu s RM69 jako telomerní koncovou sekvencí. Oblast RM110 je naznačena na obrázku 1. Ukázalo se, že RM111 hybridizuje na BssHII, Mlul, Pvul a Sfil fragmentu Y9091 a je tedy lokalizován v Pvul-Sfil fragmentu Y9091, ve kterém byl rovněž zmapován STS RM48 (obr. 1). FISH analýza metafázových chromozomů Ad-312/SV40 za použití cRM69 nebo cRMUO jako sondy naznačila, že DNA inzert těchto kosmidů je zmapován v blízkosti translokačního zlomového bodu chromozomu 12 v této linii, jak ukazuje obrázek 3A pro cRM69. Následná FISH analýza Ad-312/SV40, využívající jako sondu cRM85 nebo cRMlll, poskytla hybridizační signály daleko od translokačního zlomového bodu, jak ukazuje obrázek 3B pro cRMlll. Výsledky, získané pro cRM85 a ' cRMí11, se shodují s rozpětím zlomového bodu, získaného pomocí YAC klonu Y4854 jako cRM85 mapy daleko od cRMlll a blízko k STS RM48, které označuje telomerní konec YAC klonu Y4854. Závěrem je možné říci, že translokační bod chromozomu 12 v Ad-312/SV40 musí být lokalizován v DNA intervalu mezi cRMUO a cRMlll, jak schematicky znázorňuje obrázek 4.
• · 9 9 · · 9 ·· 9 9
9 9 9 · · · 9 9 9 9 • · · · · · * · · 9 9
9 9 9 «99999 9 9 9 9 9
999999 999
9999 99 ·· 9 «« 99
135
Vyhodnocení FISH zlomových bodů chromozomu 12 v dalších buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz
Pro stanovení relativní polohy zlomových bodů chromozomu 12, vzhledem ke zlomovým bodům Ad-312/SV40, se pomocí analýzy FISH prozkoumaly další dvě buněčné linie pleomorfního adenomu slinných žláz, jak schematicky znázorňuje obrázek 4. Tyto buněčné linie, které se vyvinuly z primárních nádorů [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993) : Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.; Kazmierczak B, Bartnitzke S, Hartl M, Bullerdiek J (1990) : In vitro transformation by the SV40 early region of cells from a human benign salivary gland tumour with a 12ql3-»ql5 rearrangement. Cytogenet Cell Genet 53: 37-39.], zahrnující Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40, Ad-302/SV40 a
Ad-366/SV40. Odchylky chromozomu 12 těchto buněčných linií jsou shrnuty na obrázku 4. Analýza FISH metafázových chromozomů těchto buněčných linií využívající cRM91 ukázala, že zlomové body všech těchto buněčných linií jsou zmapovány v blízkosti tohoto kosmidového klonu (data nejsou uvedena) . Podobná analýza FISH se rovněž provedla za ''použití ' kosmidového klonu, odpovídá j i čího STS, RM103 j ako sondy. RM103 byly zmapovány v blízkosti RM91, přesněji ve vzdálenosti přibližně 0,9 Mbp. Ve všech případech se ukázalo, že CRM103 se nachází daleko od translokačních zlomových bodů chromozomu 12 což naznačuje, že zlomové body chromozomu 12 v těchto pěti buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz jsou lokalizovány v relativně velké vzdálenosti od zlomových bodů Ad-312/SV40 buněk.
• · • ·
136
DISKUSE
Ve zde prezentovaných studiích se identifikovala, molekulárně klonovala a charakterizovala chromozomová oblast na dlouhém rameni chromozomu— 12, ve které byl zmapován translokační zlomový bod buněčné linie Ad-312/SV40 pleomorfního adenomů slinných žláz. Ve dřívějších studiích [Schoenmakers HFPM, Kools PFJ, Mols R, Kazmierczak B, Bartnitzke S, Bullerdiek J, Dal Cin P, De Jong PJ, Van den Berghe H, Van de Ven WJM (1993): Physical mapping of chromosome 12q breakpoints in lipoma, pleomorphic salivary gland adenoma, uterine leiomyoma, and myoxid liposarcoma. Genomics, 20: 210-222.] byl již poskytnut důkaz o tom, že se zlomový bod chromozomu 12 této buněčné linie nachází mezi místem D12S8 a CHOP. Vzhledem k tomu, že zmíněné dva zlomové body překrývají popsané YAC klony, zmapovaly experimenty směrového procházení chromozomy, které použily D12S8 a CHOP gen jako výchozí body, zlomové body chromozomu 12 a potvrdily tak dřívější tvrzení. FISH výsledky, získané pomocí kompletního YAC inzertu Y9091 jako molekulární sondy, se potvrdily nezávisle ve studiích FISH, používajících kosmidové klony obsahující sekvence, odpovídající různým oblastem zmíněného inzertu tohoto YAC klonu. Tento fakt je velmi důležitý, protože nezávislé potvrzující výsledky činí nepravděpodobným to, že signály dělení zj ištěné za použití kompletního inzertu Y9091, by bylo množné vysvětlit jinak, než skutečným dělením sekvencí, reprezentovaných v YAC. Například přítomnost velmi blízkých genetických sekvencí na obou stranách zlomového bodu chromozomu by mohla snadno vést k chybnému závěru, pokud by se vycházelo pouze z FISH výsledků YAC inzertu. Konečně předložené mapovací studie umožnily následně stanovit chromozomovou orientaci širokorozsahové «·· ·
137 restrikční mapy. Tuto orientaci již bylo možné předpokládat na základě dvoubarevných FISH studií (nepublikovaná pozorování).
Zde popsané FISH studie umožnily zmapování zlomového bodu chromozomu 12 v Ad-312/SV40 buňkách v 190 kbp DNA intervalu mezi stanovenými STS RM48 a RM69. Nicméně oblast zlomového bodu lze na základě následujících skutečností ještě o něco zúžit. Fakt, že Y4854, jak se ukázalo, překrývá zlomový bod, naznačuje, že alespoň podstatná část telomerní poloviny tohoto YAC klonu musí být zmapována daleko od zmíněného zlomového bodu. Je třeba určit kolik přesně zbývá. Na druhé straně se zdá, že se STS RM69 nachází přibližně ve středu DNA inzertu kosmidového klonu'. cRM69, což dává tušit, že zlomový bod bude lokalizován ve vzdálenosti 25 kbp od RM69. Kromě toho cRM69 postrádá RM110 (data nejsou uvedena), a protože se cRMllO nachází v blízkosti zlomového bodu chromozomu 12 v Ad-312/SV40 buňkách, měl by se tento zlomový bod nacházet ještě ve větší vzdálenosti od RM69 než je dříve zmíněných 25 kbp.
Tyto skutečnosti dohromady zužují oblast zlomového bodu chromozomu 12 na DNA interval, který musí být podstatně menší než 165 kbp. Další konkretizování zlomového bodu umožní molekulární klonování zlomového bodu chromozomu 12 a charakterizování genových sekvencí ve spojovací oblasti ’ - zlomových bodů, které mohou vést k identifikováni patogeneticky relevantních sekvencí. Identifikace genů, přítomných v DNA inzertech YAC klonů Y4854 a Y9091 pomocí sekvencování, přímé hybridizace, přímé selekce nebo záchytu exonů, by mohla tvořit užitečný alternativní přístup pro identifikaci genu v této oblasti dlouhého ramene chromozomu 12, která by mohla být patogeneticky kritická pro vývoj pleomorfního adenomu slinných žláz.
φφφ ♦
138
Pozorování, která ukázala, že se zlomové body chromozomu 12 v dalších pleomorfních adenomech slinných žláz nacházejí ve vzdálené a bližší oblasti na dlouhém rameni chromozomu 12, jsou zajímavá. To by mohlo vést k závěru, že jsou zlomové body chromozomu 12 v pleomorfních adenomech slinných žláz dispergovány v relativně velké DNA oblasti dlouhého ramene chromozomu 12, což připomíná llql3 zlomové body B-buněčných malignancí [Raynaud SD, Bekri S, Leroux D, Grosgeorge J, Klein B, Bastard C, Gaudray P, Simon MP (1993) : Expanded range of llql3 breakpoints with differing patterns of cyclin Dl expression in B-cell malignancies. Genes Chrom Cancer 8: 80-87.]. Objasnění přesného umístění zlomových bodů chromozomu 12 v dalších buněčných liniích pleomorfního adenomu slinných žláz by mohlo vnést více světla do této problematiky. Na druhé straně by se mohla pozornost zaměřit na alternativní sekvence na dlouhém rameni chromozomu 12 mezi D12S8 a CHOP genem, které by mohly být, jak lze předpokládat, důležité pro růstovou regulaci v pleomorfním adenomu slinných žláz. Vzhledem ke skutečnosti, že zde popsaná oblast zlomového bodu chromozomu 12 má sofar byla zjištěna pouze v Ad-312/SV40 buněčné linii, je nutné provést analýzu většího počtu adenomů slinných žláz s chromozómovými 12ql3-ql5 odchylkami, která by poskytla obrázek o potenciální relevanci sekvencí chromozomu 12 ve studované buněčné linii pro vývoj nádoru. Pokud by bylo v této konkrétní oblasti chromozomu 12 nalezeno více případů s odchylkami, bylo by zajímavé zjistit, zda tyto nádory tvoří klinickou podskupinu. Konečně chromozomové translokace, zahrnující oblast ql3-ql5 lidského chromozomu 12, byly zaznamenány v celé řadě dalších pevných nádorů: v benigních adiposových tkáňových nádorech, v děložním leiomyomů, v rabdomy• · • · • ···· ·
139 osarkomu, v hemangiopericytomu, v sarkomu čiré buňky, v chondromatózních nádorech a v hemartomů plic. Zbývá tedy zjistit, zdali jsou zlomové body chromozomu 12 v některém z těchto nádorů mapovány ve stejné oblasti jako v případě Ad-312/SV40. Popsané YAC a kosmidové klony v této zprávě představují užitečné nástroje pro toto zjištění.
Stručný popis obrázků k dodatku 2
Obrázek 1
Znázorňuje kompozitní fyzikální mapu vzájemně se překrývajících DNA inzertů YAC klonů Y4854 a Y9091. Velikosti DNA inzertů jsou naznačeny. Relativní polohy YAC klonů jsou naznačeny pomocí čar pod širokorozsahovou fyzikální mapou. Místa se sekvenční adresou (STS), odpovídající koncovým klonům YAC, které zde nejsou znázorněny, jsou označeny pomocí zarámovaných RM kódů nad restrikční mapou. STS, získané z inter-Alu-PCR produktů, jsou uvedeny pod restrikční mapou a DNA oblasti, ve kterých se mapovalo, jsou vyznačeny pomocí šipek.
B: BssHII; M: Mlul; P: Pvul; Sf: Sfil.
Polymorfní Mlul místo je označeno hvězdičkou.
Obrázek 2
A) mapuje kosmidový klon cPK12qter do telomerní oblasti dlouhého ramene chromozomu 12. Sonda pal2H8, specifická pro centromer 12, se použila pro stanovení identity chromozomu 12. Analýza FISH se provedla na metafázových chromozomech kontrolních lidských lymfocytů.
140
Hybridizační signály cPK12qter jsou označeny pomocí malých kótových šipek a signály sondy, specifické pro centromer 12, hvězdičkami.
B), Cj znázorňují FISH analýzy metafázových chromozomů Ad-312/SV40 buněk, používající DNA YAC klonu Y4854 (B) nebo Y9091 (C) jako molekulární sondu v kombinaci s kosmidovým klonem cPK12qter jako . referenčním signálním znakem (markrem). Hybridizační signály YAC klonů na chromozomu 12 jsou označeny pomocí velkých kótových šipek; přičemž signály na der(l) pomocí velkých šipek, resp. signály na der(12) pomocí malých šipek. Hybridizační signály kosmidového klonu cPK12qter jsou označeny malými kótovými šipkami.
Obrázek 3
Znázorňuje FISH analýzu metafázových chromozomů Ad312/SV40 buněk, používající DNA kosmidový klon cRM69 (A) nebo cRMlll (B) jako molekulovou sondu v kombinaci s kosmidovým klonem cPKl2qter jako referenčním signálním znakem (markérem). Pozice hybridizačních signálů cPK12qter jsou označeny 'malými kótovými šipkami. Na (A) je poloha hybridizačního signálu cRM69 na normálním chromozomu 12 naznačena velkou kótovou šipkou a hybridizační signál na der(12) malou šipkou. Na (B) je poloha hybridizačního signálu cRMlll na normálním chromozomu 12 naznačena velkou kótovou šipkou a hybridizační signál na der(l) malou šipkou.
···· ·· ·· · ·· ··
141
Obrázek 4
Schematicky znázorňuje data, získaná pomocí mapování FISH, šesti buněčných linií pleomorfního adenomu slinných žláz, testovaných v této studii. Získaly seodchylky J specifické pro chromozom 12 v různých buněčných liniích. Kosmidové klony, které se použily jako sondy ve FISH mapovacích studiích odpovídají STS, získaným ze vzájemně se překrývajících YAC klonů. Jednotlivé FISH experimenty se označily tečkami. Kosmidové klony se nazvaly podle akronymů STS, které jsou uvedeny v rámečcích, a jejichž relativní pořadí odpovídá prezentovanému pořadí. Zjistilo se, že DNA interval mezi RM90 a RM103 představuje přibližně 1,3 Mb. Inzert: schematická reprezentace G-pásmovaných odvozených chromozomů der(l) a der(12) Ad-312/SV40 buněčné linie, která nese t(1;12)(p22;ql5). Pozice zlomových bodů chromozomu 12 Ad-248/SV40, Ad-263/SV40, Ad-295/SV40,
Ad-302/SV40 a Ad-366/SV40 jsou daleko od RM103, jak naznačuje šipka.

Claims (33)

  1. PATENTOVÉ
    142 • · · · · · · · · ·« • · · · « · ···· · ··· · ·
    NÁROKY
    1. Gen vícenádorového odchylného růstu (MAG) mající nukleotidovou sekvenci některého z řetězců některého ze členů genů vysoce mobilní skupiny proteinů nebo genů LIM proteinu včetně jeho modifikovaných verzí.
  2. 2. Gen podle nároku 1, vyznačený tím, že má v podstatě nukleotidovou sekvenci HMGI-C genu, znázorněnou na obrázku 7, nebo jeho komplementární řetězec včetně modifikovaných nebo prodloužených verzí obou řetězců.
  3. 3. Gen podle nároku 1, vyznačený tím, že má v podstatě nukleotidovou sekvenci LPP genu, znázorněnou na obrázku 5, nebo jeho komplementární řetězec včetně modifikovaných nebo prodloužených verzí obou řetězců.
  4. 4. Gen podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačený tím, že je použitelný jako výchozí bod pro navržení vhodných sloučenin modulujících expresi nebo pro techniky ošetření nefyziologického proliferačního jevu u člověka nebo zvířete.
    143 • · · · · · ···· ·····* ···· ·· ·» ·
  5. 5. Gen podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačený tím, že je použitelný jako výchozí bod pro navržení vhodných nukleotidových sond pro (klinické/lékařské) diagnostikování buněk, majících nefyziologicky proliferační kapacitu v porovnání se standardními buňkami.
  6. 6. Protein kódovaný genem mnohonádorového odchylného růstového (MAG) genu podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačený tím, že je použitelný jako výchozí bod pro navržení vhodných nukleotidových sond pro (klinické/lékařské) diagnostikování nefyziologicky proliferační kapacitu standardními buňkami.
    buněk, majících v porovnání se
  7. 7. Deriváty MAG genu podle nároku 1, 2 jejich bezprostřední okolí, že jsou použitelné pro vyznačené diagnostikování a nebo 3 nebo tím, přípravu terapeutických kompozic, v nichž jsou zmíněné deriváty zvoleny ze skupiny zahrnující smyslnou a protismyslnou cDNA nebo její fragmenty, transkripty genu nebo jeho prakticky použitelné fragmenty, protismyslnou RNA, fragmenty, genu nebo jeho komplementárního řetězce, proteiny kódované genem nebo jeho fragmenty, protilátky namířené proti genu, cDNA, transkript, protein nebo jeho fragmenty a rovněž fragmenty protilátky.
  8. 8. In šitu diagnostický způsob diagnostikování buněk majících nefyziologickou proliferační kapacitu, o Φ φφ ·· φφφ ·· • · · φ φφφ φ •Φ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φφφ φφφφφφ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφφ ·· ΦΦ φ φφ ΦΦ
    144 vyznačený tím, že zahrnuje alespoň některé z následujících kroků:
    a) navržení sady nukleotidových sond na základě informace, kterou je možné získat z nukleotidové sekvence MAG genu podle nároku 1 nebo 2, přičemž jedna ze sond je hybridizovatelná do oblasti odchylného genu, která je zmapována v podstatě ve stejném místě jako odpovídající oblast standardního genu, a druhá sonda je hybridizovatelná do oblasti odchylného genu, která je zmapována v jiném místě než odpovídající oblasti standardního genu;
    b) inkubování jednoho nebo více interfázových nebo metafázových chromozomů nebo buněk majících nefyziologickou proliferační kapacitu sondou za hybridizačních podmínek; a
    c) vizualizace hybridizace mezi sondou a genem.
  9. 9. Způsob diagnostikování buněk majících nefyziologickou proliferační kapacitu, vyznačený tím, že obsahuje alespoň některé z následujících kroků:
    a) odběr biopsie buněk, které mají být diagnostikovány;
    b) izolování vhodné makromolekuly příbuzné s MAR z těchto buněk;
    c) analyzování takto získané makromolekuly porovnáním se standardním typem referenční molekuly, výhodně ze
    stejného j edince. 10. Způsob podle nároku 9, v y z n a č e n ý tím, že zahrnuje alespoň některé z následuj ících kroků: a) odběr biopsie buněk, které mají být
    diagnostikovány;
    • · · • · · · • · · ·· • · · «· ·
    145
    b) extrahování jeho celé RNA;
    c) přípravu alespoň jedné první řetězové cDNA mRNA druhů v celkovém RNA extraktu, ve kterém cDNA obsahuje vhodný konec;
    d) provedení PCR a/nebo RT-PCR za použití primeru specifického pro MAG gen a primeru specifického pro konec a/nebo specifického pro partnera/uhnízděného primeru za účelem amplifikace cDNA specifického pro MAG gen;
    e) separování PCR produktů na gelu a získání vzoru pásem;
    f) vyhodnocení přítomnosti odchylných pásů porovnáním se standardními typy pásem, výhodně pocházejičími ze stejného jedince.
  10. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačen ý tím, že zahrnuje alespoň některé z následujících kroků:
    a) odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány;
    b) izolování celého proteinu z těchto buněk;
    c) separování celkového proteinu na gelu a získání v podstatě individuálních pásem a případně přenesení těchto pásem na Westernovu membránu;
    d) hybridizaci takto získaných pásů pomocí protilátek namířených proti části proteinu kódovaného zbývající částí MAG genu a proti části proteinu kódovaného substituovanou částí MAG genu;
    e) vizualizace reakcí antigenu a protilátky a stanovení přítomnosti odchylných pásem porovnáním s pásmy ze standardních proteinů, výhodně pocházejícími ze stejného j edince.
    44 ·· · ·· ··
    4 4 4 · 4 4 4 4
    4 «444 4 4 44 • 4 4 4 4 4 4444 * ··· 4 · • 4 4 4 4 4 444 • 44444 44 4 ·· 44
    14 6
  11. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že zahrnuje alespoň některé z následujících kroků:
    a) odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány;
    b) izolování celé DNA z těchto buněk;
    c) digerování DNA pomocí jednoho nebo více tzv. „vzácně štěpících restrikčních enzymů;
    d) separování takto připraveného digestu na gelu a získání separačního vzoru;
    e) případný přenos separačního vzoru na Southernovu membránu;
    f) hybridizace separačního vzoru v gelu nebo na membráně pomocí jedné nebo více informativních sond za hybridizačnich podmínek;
    g) vizualizace hybridizací a stanovení přítomnosti odchylných pásem porovnáním se standardním typem pásem, výhodně pocházejících ze stejného jedince.
  12. 13. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že zahrnuje alespoň některé z následujících kroků:
    a) odebrání biopsie buněk, které mají být diagnostikovány; '
    b) extrahování mRNA z těchto buněk;
    c) stanovení přítomnosti nebo (relativního) množství mRNA odvozené z MAG genu; a
    d) porovnání výsledků z kroku c) s výsledkem podobného experimentu prováděného se standardním typem buněk, výhodně pocházejících ze stejného jedince.
    Φ · φ φ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφφ φ
    147
  13. 14. Způsob podle některého z nároků 8 až. 13, vyznačený tím, že uvedené buňky, mající nefyziologickou proliferační kapacitu, se zvolí ze skupiny zahrnující hemartomy mesenchymálních nádorů (např. prsu a plic), adipózové tkáňové nádory (např. lipomy), pleomorfní adenomy slinných žláz, děložní leiomyomy, angiomyxomy, fibroadenomy prsu, polypy endometria, aterosklerotické plaky a další benigní nádory a rovněž různé maligní nádory, například včetně sarkomů (např. rabdomyosarkomu, osteosarkomu) a karcinomů (např. prsu, plic, kůže, štítné žlázy) a hematologických zhoubných nádorů, např. leukemiů a lymfomů.
  14. 15. Protismyslné molekuly MAG genu podle nároku 1,2 nebo 3, vyznačené tím, že jsou použitelné při léčení chorob, zahrnujících buňky mající nefyziologickou proliferační kapacitu, modulací exprese tohoto genu.
  15. 16. Expresní modulátory, například inhibitory nebo zesilovače, včetně ribozymů MAG genu podle nároku 1, 2 nebo 3, v y z n a č e n é t ím, že jsou použitelné při léčení chorob, zahrnujících buňky mající nefyziologické proliferační kapacity.
  16. 17. Protismyslné RNA molekuly komplementární k mRNA molekulám MAG genu a/nebo protilátky, namířené protigenovému produktu MAG genu podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačené tím, že jsou použitelné při léčení »9
    9 9 9 9 4
    9 9 41
    99 99
    148
    99 99 99 9
    9 9 9 9 9 9 9
    9 9 « <9·9 • 9 999 999#9
    9 9 9 9 9 9 • 999 99 9 9 9 chorob, zahrnujících proliferační kapacity.
    buňky mající nefyziologické
  17. 18. Diagnostická souprava pro provádění způsobu podle nároku 8, vyznačená tím, že zahrnuje vhodnou sadu označených nukleotidových sond.
  18. 19. Diagnostická souprava pro provádění způsobu podle nároku 10, vyznačená tím, že zahrnuje vhodnou sadu označených sond.
  19. 20. Diagnostická souprava pro provádění způsobu podle nároku 11, vyznačená t ím, že zahrnuje vhodnou sadu označených PCR primerů, specifických pro MAG gen a specifických pro konec.
  20. 21. Diagnostická souprava pro provádění způsobu podle nároku 11, vyznačená tím, že obsahuje vhodnou sadu označených sond a vhodné vzácně štěpící restrikční enzymy.
  21. 22. Farmaceutická kompozice pro snižování úrovně exprese MAG genu v buňkách majících nefyziologickou proliferační kapacitu, vyznačená tím, že obsahuje jeden nebo více derivátů podle nároku 7 a/nebo jeden nebo více modulátorů exprese podle nároku 16.
    ·· ·· 99 9 99 99 • · · · ··· 4 « · · ·· 9 9 9 9 9 9 9 99
    9 9 9 9 9 9 9999 * ·4· · 4
    9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9999 99 99 9 99 99
    149
  22. 23. Farmaceutická kompozice podle nároku 22, vyznačená tím, že uvedené buňky, mající nefyziologickou proliferační kapacitu, se zvolí ze skupiny zahrnující hemartomy mesenchymálních nádorů (např. prsu a plic), adipózové tkáňové nádory (např. lipomy), pleomorfní adenomy slinných žláz, děložní leiomyomy, angiomyxomy, fibroadenomy prsu, polypy endometria, aterosklerotické plaky a další benigní nádory a rovněž různé maligní nádory, například včetně sarkomů (např. rabdomyosarkomu, osteosarkomu) a karcinomů (např. prsu, plic, kůže, štítné žlázy) a hematologických zhoubných nádorů, např. leukemiů a lymfomů.
  23. 24. Použití derivátů podle nároku 7 pro přípravu diagnostické soupravy nebo farmaceutické kompozice pro diagnostikování nebo léčení chorob nebo poruch zahrnujících buňky mající nefyziologickou proliferační kapacitu.
  24. 25. Použití modulátorů exprese podle nároku 16 pro přípravu farmaceutické kompozice pro diagnostikování nebo léčení chorob nebo poruch zahrnujících buňky mající nefyziologickou proliferační kapacitu.
  25. 26. Použití podle nároku 24 nebo 25, vyznačené tím, že uvedené buňky, mající nefyziologickou proliferační kapacitu, se zvolí ze skupiny zahrnující hemartomy mesenchymálních nádorů (např. prsu a plic), • · φ · · φ
    150 adipózové tkáňové nádory (např. lipomy), pleomorfní adenomy slinných žláz, děložní leiomyomy, angiomyxomy, fibroadenomy prsu, polypy endometria, aterosklerotické plaky a další benigní nádory a rovněž různé maligní nádory, například včetně sarkomů (např. rabdomyosarkomu, osteosarkomu) a karcinomů (např. prsu, plic, kůže, štítné žlázy) a hematologických zhoubných nádorů, např. leukemiů a lymfomů.
  26. 27. Způsob izolace dalších MAG genů na základě existence fúzních genů, fúzního transkriptu nebo fúzního proteinu v nádorové buňce, vyznačený tím, že používá alespoň části MAG genu pro navržení molekulových nástrojů (sond, primeru atd.).
  27. 28. MAG geny získané způsobem podle nároku 27.
  28. 29. MAG geny podle nároku 28, vy zna čené tím, že jsou použitelné při diagnostických nebo terapeutických metodách.
    ““3 07' Z v i ř e c i ' mo de 1 pro tes továnípou ž i tel no s t- i - sloučenin nebo kompozic při léčení chorob nebo poruch zahrnujících buňky mající nefyziologickou proliferační kapacitu, vyznačený tím, že uvedeným zvířetem je transgenové zvíře, v jehož genomu se vyskytuje MAG gen.
    ft · • · · · · · · • · · · · · · *··· ·· 9 9 9 9 · · ··· • · · · · ······ ···· · • 99 9 9-9 9 9 9
    9 99 9 9 9 9.9 9 ·'· · ·
    151
  29. 31. Zvířecí model podle nároku 30, vyznačený tím, že MAG genem je odchylný MAG gen, například fúzní produkt zbývající části genu a substituční části jeho translokačního partnera.........
  30. 32. Zvířecí model podle nároku 30, vyznačený tím, že MAG gen vykazuje nefyziologickou úroveň exprese.
  31. 33. Zvířecí model pro testování použitelnosti sloučenin nebo kompozic při léčení chorob nebo poruch zahrnujících buňky mající nefyziologickou proliferační kapacitu, vyznačený tím, že zvíře má v genomu alespoň části svých buněk specifickou genetickou odchylku, ovlivňující MAG gen podle nároku 1, 2 nebo 3, přičemž tato odchylka je indukována homologickou rekombinací v zárodečných kmenových buňkách.
  32. 34. Zvířecí model podle některého z nároků 30 až 33, vyznačený tím, že uvedeným zvířetem je savec, zejména myš, krysa, pes, prase nebo vyšší primát, například
  33. 35. Polynukleotidové nebo oligonukleotidové sondy a primery, které jsou popsány v popisu a obrázcích.
CZ972475A 1995-02-17 1996-02-19 Mnohočetné nádorové odchylné růstové geny CZ247597A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP95200390 1995-02-17
EP95201951A EP0727487A1 (en) 1995-02-17 1995-07-14 Multiple-tumor aberrant growth genes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ247597A3 true CZ247597A3 (cs) 1998-07-15

Family

ID=8220025

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ972475A CZ247597A3 (cs) 1995-02-17 1996-02-19 Mnohočetné nádorové odchylné růstové geny

Country Status (14)

Country Link
US (3) US6544784B1 (cs)
EP (3) EP0727487A1 (cs)
JP (4) JPH11500614A (cs)
KR (1) KR19980702276A (cs)
AT (1) ATE338114T1 (cs)
AU (1) AU4879096A (cs)
CA (1) CA2213237A1 (cs)
CZ (1) CZ247597A3 (cs)
DE (2) DE69636495T2 (cs)
FI (1) FI973354A (cs)
HU (1) HUP9800028A3 (cs)
NO (1) NO973685L (cs)
PL (1) PL321831A1 (cs)
WO (1) WO1996025493A1 (cs)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19548122A1 (de) * 1995-12-21 1997-06-26 Joern Prof Dr Bullerdiek Nukleinsäuresequenzen von Genen der High Mobility Group Proteine sowie Verwendungen derselben
US6323329B1 (en) 1995-12-21 2001-11-27 Jorn Bullerdiek Nucleic acid sequences of genes encoding high mobility group proteins
US6171779B1 (en) 1996-07-12 2001-01-09 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer
US6720472B2 (en) 1996-07-12 2004-04-13 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer and obesity
WO1998050536A1 (en) * 1997-05-07 1998-11-12 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Hmgi proteins in tumors and obesity
EP0878552A1 (en) * 1997-05-13 1998-11-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Molecular detection of chromosome aberrations
US7923250B2 (en) 1997-07-30 2011-04-12 Warsaw Orthopedic, Inc. Methods of expressing LIM mineralization protein in non-osseous cells
JP4302877B2 (ja) 1997-07-30 2009-07-29 エモリー・ユニバーシテイ 新規な骨鉱化蛋白質、ｄｎａ、ベクター及び発現系
CA2327542C (en) * 1998-05-04 2011-11-22 Dako A/S Method and probes for the detection of chromosome aberrations
WO1999057012A2 (de) 1998-05-05 1999-11-11 Elau Elektronik Automations Ag Verpackungsmaschine
IT1299583B1 (it) * 1998-05-19 2000-03-16 Vander Way Limited Uso di proteine hmg-i per la preparazione di medicamenti ad attivita' citotossica
DE19904514A1 (de) * 1999-02-04 2000-08-10 Joern Bullerdiek Mittel zur Prävention und/oder Behandlung von Leiomyomen
US6303321B1 (en) † 1999-02-11 2001-10-16 North Shore-Long Island Jewish Research Institute Methods for diagnosing sepsis
US7151082B2 (en) 1999-02-11 2006-12-19 The Feinstein Institute For Medical Research Antagonists of HMG1 for treating inflammatory conditions
US7304034B2 (en) 2001-05-15 2007-12-04 The Feinstein Institute For Medical Research Use of HMGB fragments as anti-inflammatory agents
CA2452202A1 (en) * 2001-06-27 2003-01-09 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Diagnostic methods and agents
DE50212280D1 (de) * 2001-12-19 2008-06-26 Alcedo Biotech Gmbh Verwendung von hmgb-proteinen und dafür codierenden nukleinsäuren
US20030219742A1 (en) * 2002-03-29 2003-11-27 Sanjay Bhanot Antisense modulation of HMGI-C expression
CA2481339A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 Cyternex, Inc. Methods for targeting quadruplex dna
AU2003262778A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-11 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods for regulating transcription by targeting quadruplex dna
US7696169B2 (en) 2003-06-06 2010-04-13 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
JP4792392B2 (ja) 2003-09-11 2011-10-12 コーナーストーン セラピューティクス インコーポレイテッド Ｈｍｇｂ１に対するモノクローナル抗体
US8415315B2 (en) 2004-05-06 2013-04-09 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for inhibiting the proliferation of cancer cells
US8129130B2 (en) 2004-10-22 2012-03-06 The Feinstein Institute For Medical Research High affinity antibodies against HMGB1 and methods of use thereof
AU2005333602B2 (en) 2004-10-22 2012-04-12 Medimmune, Llc High affinity antibodies against HMGB1 and methods of use thereof
WO2007076200A2 (en) 2005-11-28 2007-07-05 Medimmune, Inc. Antagonists of hmgb1 and/or rage and methods of use thereof
WO2008099913A1 (ja) 2007-02-15 2008-08-21 Kumamoto University ヒトhmgb-1に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する治療剤
JP5366039B2 (ja) * 2008-03-18 2013-12-11 株式会社常光 悪性腫瘍の予想、診断のための方法および組成物
US20100297649A1 (en) * 2009-04-22 2010-11-25 Oliveira Andre M Methods and materials for detecting gene amplification
US20140248294A1 (en) 2011-10-05 2014-09-04 University Of Bremen Wnt4 and med12 for use in the diagnosis and treatment of tumor diseases
US20180127831A1 (en) * 2015-05-21 2018-05-10 Université de Montréal Prognostic markers of acute myeloid leukemia survival

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62166897A (ja) * 1986-01-20 1987-07-23 Toyo Soda Mfg Co Ltd 核内非ヒストン蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体
US5389526A (en) * 1989-11-02 1995-02-14 Slade; Martin B. Plasmid vectors for cellular slime moulds of the genus dictyostelium
US5756307A (en) * 1991-09-20 1998-05-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Sequence of human dopamine transporter cDNA
US6171779B1 (en) * 1996-07-12 2001-01-09 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey HMGI proteins in cancer

Also Published As

Publication number Publication date
AU4879096A (en) 1996-09-04
JP2007082549A (ja) 2007-04-05
JP2009254378A (ja) 2009-11-05
JP2008099698A (ja) 2008-05-01
NO973685D0 (no) 1997-08-11
NO973685L (no) 1997-10-17
PL321831A1 (en) 1997-12-22
HUP9800028A2 (hu) 1998-04-28
EP0811061A1 (en) 1997-12-10
WO1996025493A1 (en) 1996-08-22
ATE338114T1 (de) 2006-09-15
EP0811061B1 (en) 2006-08-30
EP0811061B2 (en) 2010-07-21
JPH11500614A (ja) 1999-01-19
HUP9800028A3 (en) 2001-02-28
FI973354A (fi) 1997-10-16
CA2213237A1 (en) 1996-08-22
DE69636495D1 (de) 2006-10-12
FI973354A0 (fi) 1997-08-15
DE69636495T2 (de) 2007-05-24
EP1762619A3 (en) 2007-05-09
EP1762619A2 (en) 2007-03-14
US20030190285A1 (en) 2003-10-09
EP0727487A1 (en) 1996-08-21
DE811061T1 (de) 2002-10-17
US6544784B1 (en) 2003-04-08
US20110318834A1 (en) 2011-12-29
EP1762619B1 (en) 2013-06-26
KR19980702276A (ko) 1998-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1762619B1 (en) Multiple-tumor aberrant growth genes
US6740523B2 (en) 14-3-3σ arrests the cell cycle
US7060811B2 (en) WWOX: a tumor suppressor gene mutated in multiple cancers
JPH10507343A (ja) 網膜芽細胞腫タンパク質相互作用性ジンクフィンガータンパク質
EP0837935B1 (en) 3&#39; utr of the human prohibitin gene
US6077685A (en) Tumor suppressor merlin and antibodies thereof
JPH08501691A (ja) 腫瘍形成の診断におけるインターフェロン調節因子１および２
WO1996002641A2 (en) Materials and methods relating to the diagnosis and prophylactic and therapeutic treatment of synovial sarcoma
Kas et al. A 2-Mb YAC contig and physical map covering the chromosome 8q12 breakpoint cluster region in pleomorphic adenomas of the salivary glands
US6323335B1 (en) Retinoblastoma protein-interacting zinc finger proteins
Thielen et al. Deletion mapping in Alport syndrome and Alport syndrome‐diffuse leiomyomatosis reveals potential mechanisms of visceral smooth muscle overgrowth
US20020009720A1 (en) Plag gene family and tumorigenesis
AU759752B2 (en) Multiple-tumor aberrant growth genes
US6177410B1 (en) Therapeutic methods for prostate cancer
JPH07289297A (ja) 癌抑制遺伝子
AU2007200451A1 (en) Multiple-tumor aberrant growth genes
WO1997038083A2 (en) New member of the multiple-tumor aberrant growth gene family
JP2000512133A (ja) 多発性骨髄腫で変化した遺伝子の同定

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic