JP5366039B2 - 悪性腫瘍の予想、診断のための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞遺伝学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、肺癌における染色体領域６ｐ２１．３、胃癌における染色体領域１６ｐ１３．３での増幅の同定に関する。さらに、本発明は６ｐ２１．３，１６ｐ１３．３アンプリコンに対して特異的なプローブを提供する。
染色体異常はしばしば、遺伝的障害、変性疾患及び癌に関連している。特に、完全な染色体又は染色体断片のコピーの欠失又は増加、及びゲノムの特定領域の高レベル増幅が癌において共通に発生する。増幅される領域及び欠失される領域の同定並びに関与する遺伝子のクローニングは、腫瘍形成の研究及び癌診断の開発の両者に対して重大である。
より最近には、クローン化されたプローブが、サザンブロットにより染色体における一定のＤＮＡ配列の量を評価するために使用されている。この方法は、たとえゲノムが核型情報を排除するように厳しく再配列されても、効果的ではある。しかしながら、サザンブロットのみではＤＮＡ配列のコピー数の大まかな評価をもたらし、そして染色体内の配列の位置についての何の情報ももたらさない。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（非特許文献１参照）は、全染色体を対象にしてゲノムＤＮＡの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出するためのより最近のアプローチである。ＣＧＨはゲノム再配列に関係なく、増幅及び欠失を表す。さらにまた正常染色体における増幅された又は欠失された配列の位置の情報を提供する。
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：８１８−８２１，１９９２
より最近には、クローン化されたプローブが、サザンブロットにより染色体における一定のＤＮＡ配列の量を評価するために使用されている。この方法は、たとえゲノムが核型情報を排除するように厳しく再配列されても、効果的ではある。しかしながら、サザンブロットのみではＤＮＡ配列のコピー数の大まかな評価をもたらし、そして染色体内の配列の位置についての何の情報ももたらさない。
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）（非特許文献１参照）は、全染色体を対象にしてゲノムＤＮＡの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を検出するためのより最近のアプローチである。ＣＧＨはゲノム再配列に関係なく、増幅及び欠失を表す。さらにまた正常染色体における増幅された又は欠失された配列の位置の情報を提供する。
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：８１８−８２１，１９９２
しかしながら、以上の技術は病理切片を使用している一般の病理検査業務とは異なるので、病理切片を用いた染色体異常の検出方法の標準化が課題になっている。
そこで、本発明は、病理切片を用いた、種々の疾病に関連する新規染色体異常性の同定のためのｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法に関するものである。特に、肺癌における染色体領域６ｐ２１．３、胃癌における染色体領域１６ｐ１３．３の増幅の領域に対して特異的であるプローブを提供する。
染色体６ｐ２１．３上の１Ｍｂの同定
本発明は、肺癌において増幅される染色体６ｐ２１．３に位置する1Ｍｂのアンプリコン内の狭い領域（６００ｋｂ）の同定に関する。さらに、本発明は、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）（このアンプリコンを隣接して含む一連のクローン）についての配列情報を提供する。コンティグまたはその成分は、アンプリコンに対して特異的なプローブを調製するために使用され得る。
従って、１つの態様においては、本発明は、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での染色体異常（例えば、増幅又は欠失）の検出方法を提供する。この方法は、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に個々に結合する１又は複数のラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出することを包含する。前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するための段階は、前記標的配列のコピー数を決定することを包含することができる。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を含んで成る。さらにより好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸である。プローブは好ましくは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。１つの態様において、ハイブリダイゼーション複合体は、サンプルにおける間期の（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）核に検出される。検出は好ましくは、蛍光ラベル（たとえば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン又はローダミン）を検出することによって実施される。前期方法は、さらに、染色体６セントロメアに選択的に結合する参照プローブとサンプルとを接触せしめることを包含する。
本発明は、肺癌において増幅される染色体６ｐ２１．３に位置する1Ｍｂのアンプリコン内の狭い領域（６００ｋｂ）の同定に関する。さらに、本発明は、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）（このアンプリコンを隣接して含む一連のクローン）についての配列情報を提供する。コンティグまたはその成分は、アンプリコンに対して特異的なプローブを調製するために使用され得る。
従って、１つの態様においては、本発明は、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での染色体異常（例えば、増幅又は欠失）の検出方法を提供する。この方法は、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に個々に結合する１又は複数のラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出することを包含する。前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するための段階は、前記標的配列のコピー数を決定することを包含することができる。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を含んで成る。さらにより好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸である。プローブは好ましくは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。１つの態様において、ハイブリダイゼーション複合体は、サンプルにおける間期の（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）核に検出される。検出は好ましくは、蛍光ラベル（たとえば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン又はローダミン）を検出することによって実施される。前期方法は、さらに、染色体６セントロメアに選択的に結合する参照プローブとサンプルとを接触せしめることを包含する。
もう１つの態様において、本発明は６ｐ２１．３アンプリコンに特異的に結合するプローブを提供する。従って、本発明は、ヒト染色体６上のおよそ６ｐ２１．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含んで成る組成物を提供する。プローブは図１に列挙されるBACクローンから成る群から選択された１又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブはジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。
本発明はまた、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での染色体異常の検出のためのキットを提供する。キットは、ヒト染色体６上のおよそ６ｐ２１．３で標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含む。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を包含する。さらに、より好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された1又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。キットはさらに、染色体６のセントロメアにおける配列に対して特異的な参照プローブを包含することができる。
本発明はまた、ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３での染色体異常の検出のためのキットを提供する。キットは、ヒト染色体６上のおよそ６ｐ２１．３で標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含む。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を包含する。さらに、より好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された1又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。キットはさらに、染色体６のセントロメアにおける配列に対して特異的な参照プローブを包含することができる。
染色体領域６ｐ２１．３に位置する図１に記載したＢＡＣクローンとの蛍光現場ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、患者からの一次肺癌における染色体領域６ｐ２１．３増幅を評価した。プローブはＢＡＣクローンを蛍光標識ラベルして作製した。ＲＰ１−７１Ｉ１７の増幅は２０９例の一次肺癌の２３（１１％）、ＲＰ１−３４Ｆ７の増幅は２８（１３．４％）、ＲＰ１１−３４６Ｊ１９の増幅は１９（９．１％）に見出された。増幅レベル（６ｐ対照プローブに対するシグナルの平均数）は１．５倍〜３倍であった。また、６ｐ２１．３増幅があった症例の臨床病理学的特徴を図２に記載した。
染色体１６ｐ１３．３上の1Ｍｂの同定
本発明は、胃癌において増幅される染色体１６ｐ１３．３に位置する1Ｍｂのアンプリコン内の狭い領域（３００ｋｂ）の同定に関する。さらに、本発明は、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）（このアンプリコンを隣接して含む一連のクローン）についての配列情報を提供する。コンティグまたはその成分は、アンプリコンに対して特異的なプローブを調製するために使用され得る。
従って、１つの態様においては、本発明は、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での染色体異常（例えば、増幅又は欠失）の検出方法を提供する。この方法は、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に個々に結合する１又は複数のラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出することを包含する。前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するための段階は、前記標的配列のコピー数を決定することを包含することができる。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を含んで成る。さらにより好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸である。プローブは好ましくは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。１つの態様において、ハイブリダイゼーション複合体は、サンプルにおける間期の（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）核に検出される。検出は好ましくは、蛍光ラベル（たとえば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン又はローダミン）を検出することによって実施される。前期方法は、さらに、染色体１６セントロメアに選択的に結合する参照プローブとサンプルとを接触せしめることを包含する。
本発明は、胃癌において増幅される染色体１６ｐ１３．３に位置する1Ｍｂのアンプリコン内の狭い領域（３００ｋｂ）の同定に関する。さらに、本発明は、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）（このアンプリコンを隣接して含む一連のクローン）についての配列情報を提供する。コンティグまたはその成分は、アンプリコンに対して特異的なプローブを調製するために使用され得る。
従って、１つの態様においては、本発明は、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での染色体異常（例えば、増幅又は欠失）の検出方法を提供する。この方法は、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に個々に結合する１又は複数のラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出することを包含する。前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するための段階は、前記標的配列のコピー数を決定することを包含することができる。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする核酸を含んで成る。さらにより好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸である。プローブは好ましくは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。１つの態様において、ハイブリダイゼーション複合体は、サンプルにおける間期の（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ）核に検出される。検出は好ましくは、蛍光ラベル（たとえば、ＦＩＴＣ、フルオレセイン又はローダミン）を検出することによって実施される。前期方法は、さらに、染色体１６セントロメアに選択的に結合する参照プローブとサンプルとを接触せしめることを包含する。
もう１つの態様において、本発明は１６ｐ１３．３アンプリコンに特異的に結合するプローブを提供する。従って、本発明は、ヒト染色体１６上のおよそ１６ｐ１３．３での標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含んで成る組成物を提供する。プローブは図１に列挙されるＢＡＣクローンから成る群から選択された１又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブはジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。
本発明はまた、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での染色体異常の検出のためのキットを提供する。キットは、ヒト染色体１６上のおよそ１６ｐ１３．３で標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含む。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を包含する。さらに、より好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。キットはさらに、染色体１６のセントロメアにおける配列に対して特異的な参照プローブを包含することができる。
本発明はまた、ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３での染色体異常の検出のためのキットを提供する。キットは、ヒト染色体１６上のおよそ１６ｐ１３．３で標的ポリヌクレオチド配列に選択的に結合するラベルされた核酸プローブを含む。プローブは好ましくは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの核酸を包含する。さらに、より好ましくは、プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された１又は複数の核酸を含んで成る。好ましい態様においては、プローブは、ジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎでラベルされる。キットはさらに、染色体１６のセントロメアにおける配列に対して特異的な参照プローブを包含することができる。
染色体領域１６ｐ１３．３に位置する図１に記載したＢＡＣクローンとの蛍光現場ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって、患者からの一次胃癌における染色体領域１６ｐ１３．３増幅を評価した。プローブはＢＡＣクローンを蛍光標識ラベルして作製した。ＲＰ１１−７１５Ｊ２２の増幅は９９例の一次胃癌の４（４．０％）、ＲＰ１１―２０Ｉ２３の増幅は８（８．１％）に見出された。増幅レベル（１６ｐ対照プローブに対するシグナルの平均数）は１．５倍〜３倍であった。また、１６ｐ１３．３増幅があった症例の臨床病理学的特徴を図３に記載した。
上記による本発明は、肺癌における染色体領域６ｐ２１．３、胃癌における染色体領域１６ｐ１３．３での増幅の同定を可能としている。
ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション）法による増幅領域の検出
その手順は▲１▼プローブの作製▲２▼染色体へのプローブの付与▲３▼プローブの検出である。
その手順は▲１▼プローブの作製▲２▼染色体へのプローブの付与▲３▼プローブの検出である。
プローブは、図１に列挙されるＢＡＣクローンから選択された核酸から選択され、ニックトランスレーション等により蛍光ラベルされる。患者から患部組織を採取し常法に従いホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を作製する。以下の方法で組織切片の前処理、ハイブリダイゼーション、洗浄を行い蛍光顕微鏡で観察する。
（１）脱パラフィン
（２）熱処理（０．０１Ｍクエン酸緩衝液,ｐＨ６．０）
９５℃２０分間→室温冷却２０分間
（３）ＤＷ洗浄
（４）酵素処理（０．０３ｇプロテアーゼ／５０ｍＬ ｐＨ２．０緩衝液) ３７℃１０分間
（５）ＤＷ洗浄→脱水、乾燥
（６）プローブ溶液の染色体サンプルへの添加
（７）プローブ溶液と染色体サンプルとの同時変性、ハイブリダイゼーション ８５℃５分間
（８）３７℃一晩インキュベート
（９）２×ＳＳＣ／０．３%ＮＰ４０ ７２℃２分間
（１０）２×ＳＳＣ 室温５分間
（１１）対比染色→蛍光顕微鏡観察
（１）脱パラフィン
（２）熱処理（０．０１Ｍクエン酸緩衝液,ｐＨ６．０）
９５℃２０分間→室温冷却２０分間
（３）ＤＷ洗浄
（４）酵素処理（０．０３ｇプロテアーゼ／５０ｍＬ ｐＨ２．０緩衝液) ３７℃１０分間
（５）ＤＷ洗浄→脱水、乾燥
（６）プローブ溶液の染色体サンプルへの添加
（７）プローブ溶液と染色体サンプルとの同時変性、ハイブリダイゼーション ８５℃５分間
（８）３７℃一晩インキュベート
（９）２×ＳＳＣ／０．３%ＮＰ４０ ７２℃２分間
（１０）２×ＳＳＣ 室温５分間
（１１）対比染色→蛍光顕微鏡観察
Claims (4)
- ヒト染色体６上のおよその位置６ｐ２１．３にある３種類のＢＡＣクローン、ＲＰ１−７１Ｉ１７、ＲＰ１−３４Ｆ７、ＲＰ１１−３４６Ｊ１９、から選択され、ラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、肺癌患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出して、染色体中の増幅を検出する方法。
- ヒト染色体１６上のおよその位置１６ｐ１３．３にある２種類のＢＡＣクローン、ＲＰ１１−７１５Ｊ２２、ＲＰ１１―２０Ｉ２３、から選択され、ラベルされた核酸プローブから実質的になる組成物と、胃癌患者からの染色体サンプルとを、前記プローブが前記標的配列と安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で接触せしめ；そして前記ハイブリダイゼーション複合体を検出して、染色体中の増幅を検出する方法。
- 前記プローブがジゴキシゲニン又はビオチン又はローダミン又はｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎによりラベルされる請求項１または２記載の方法。
- 前記ハイブリダイゼーション複合体を検出して、染色体中の増幅を検出する段階が、サンプルにおける間期の核において検出される請求項１または２記載の方法。
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