KR20110089577A

KR20110089577A - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｂｒａｆ 돌연변이 검출 방법 및 키트

Info

Publication number: KR20110089577A
Application number: KR1020100009041A
Authority: KR
Inventors: 박희경; 최재진; 조민혜
Original assignee: 주식회사 파나진
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2011-08-09
Also published as: WO2011093606A2; KR101825117B1; WO2011093606A3

Abstract

본 발명은 BRAF유전자의 코돈 600의 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법을 사용하기 위한 키트에 관한 것으로, 갑상선암을 비롯하여 악성 흑색종, 난소암, 대장암 등의 종양을 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있어, 조기 암 진단으로 인한 효율적인 치료를 가능하게 할 것이다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＢＲＡＦ 돌연변이 검출 방법 및 키트{Methods and kits for the BRAF mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping}

본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 돌연변이 검출 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브에 의해 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

갑상선 암(Thyroid cancer)은 최근 한국인에서 발병률이 급증하고 있으며, 한국여성에게 가장 높은 빈도로 발생되는 것으로 보고되고 있다[National Cancer Center, 2003; National Health Insurance Corporation, 2007]. 대부분 갑상선 암의 초기 증상으로 갑상선 결절(Thyroid nodule)의 증상이 나타나며, 약 5-20% 가 촉진 가능한 갑상선 결절을 가지고 있다고 보고되었다[Ezzat et al., Arch Intern Med. 154:1838-1840, 1994; Meier et al., Baillieres Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 14:559-575, 2000; Kang et al., Thyroid. 14:29-33, 2004]. 갑상선암은 조직학적으로 갑상선 상피세포에서 기원하여 다양한 조직학적 표현형을 지닌 유두암, 여포암 그리고 미분화암이 있고 칼시토닌을 분비하는 갑상선 부여세포에서 유래한 갑상선 수질암이 있다[Rapp et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:4218-4222, 1983; Jansen et al., EMBO J 2:1969-1975, 1983]. 한국에서 보고되는 갑상선 암은 약 90~95%가 갑상선 유두암으로 분류 된다[National Cancer Center, 2003; Rapp et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:4218-4222, 1983].

갑상선 결절을 고해상도 초음파진단법으로 검사했을 때, 약 35%가 갑상선 우연종으로 진단되고, 이러한 갑상선 우연종의 약 10%가 악성으로 밝혀질 확률이 높다고 보고되었다[Lee et al., Yonsei Med J. 44:1040-1044, 2003]. 고해상도 초음파진단법으로 밝혀진 갑상선 우연종은 세침흡인 세포검사에서 갑상선암과 양성결절로 분류되고 있다 [National Cancer Center, 2003]. 갑상선 결절 검사의 가장 중요한 목적은 세포의 악성 여부를 확인하는 것이다. 세포의 악성여부를 검사하기 위한 여러 검사법들 중, 특히 세침흡인 세포검사는 임상소견이나 영상소견에 비하여 높은 예측도로 검출이 가능하며, 간편하고 안전한 검사법으로 보고되어있다 [Oertel et al., Diag Cytopatol. 27:120-122, 2002]. 그러나 세침흡인 세포검사법은 악성종양을 진단하는데 매우 중요한 정보를 제공하지만, 10 내지 30%는 갑상선암과 양성 결절성 증식에 대한 정확한 감별이 어려워 임상 의사들이 치료방침을 결정하는 데 혼동을 일으킬 가능성이 있다[Kim et al., Clin Endocrinol. 65:364-368, 2006].

이러한 문제해결을 위하여 갑상선 암 진단에 대한 다양한 분자유전자학적인 연구가 진행되고 있다[Jarry et al., Mol Cell Probes. 18:349-352, 2004]. 갑상선암의 유전자 변형 RET/PTC 재배열을 비롯하여, RAS 돌연변이, BRAF 돌연변이, PAX8/PPARγ 재배열, p53 돌연변이, CTNNB1 돌연변이 및 RET 돌연변이 등이 주로 연구되고 있다[Peyssonnaux et al., Biol cell. 93:53-62, 2001]. 이들 유전자 중, BRAF V600E 돌연변이 유전자는 갑상선에서 발생하는 종양 중에서 유두암, 특히 유두암 중에서도 분화가 나쁜 암종에 국한되어 관찰되며, 양성 결절이나 소포형에서는 관찰되지 않으므로 갑상선 유두암 진단에 유용한 유전자로 알려져 있다[Jarry et al., Mol Cell Probes. 18:349-352, 2004; Kim et al., Diagn Mol Pathol . 17:118-125, 2008].

BRAF(B-type Raf Kinase)는 세포의 성장과 분화, 사멸에 관여하는 RAS-RAF-MEK-ERK-MAP kinase 신호 경로에 중요한 역할을 한다[Davies H. et al., Nature. 417:949-954, 2002]. BRAF의 카이네이즈 도메인에서 BRAF 활성화 점 돌연변이는 유전자의 엑손 11 및 15에 밀집되어 있으며, 전체 돌연변이의 80% 이상이 엑손 15의 T1799A 돌연변이로 알려져 있다[Peyssonnaux et al., Biol cell. 93:53-62, 2001]. BRAF V600E 돌연변이는 BRAF kinase를 계속적으로 활성화 시켜 갑상성 유두암종의 발암화(tumorigenesis) 개시에 중요한 역할을 할 것이다[Marais et al., Cancer Surv 27:101-125, 1996; Wan et al., Cell 116:855-867, 2004].

모든 BRAF 유전자 변이 중 80% 가 V600E이며, 갑상선 유두암에서 29-69% 정도의 빈도로 발생된다고 보고되어 있다[Xing et al., Endocr Relat Cancer. 12:245-262, 2005]. BRAF 유전자 변이는 갑상선 유두암, 갑상선 미분화암 외 흑색종(melanoma), 결장암 (colon cancer), 신경교종(gliomas), 폐암 등에서도 발견되고 있다. BRAF V600E 돌연변이의 검출은 갑상선 유두암의 진단 표지자로 사용가능하며, 전통적인 세침흡인 세포 검사와 BRAF V600E 돌연변이의 분자진단법의 병행이 필요하다고 보고 되어 있다[Chung et al., Clin Endocrinol. 65:660-666, 2006].

이러한 BRAF 돌연변이의 검출 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 야생형을 인식해 절단하는 제한효소 XbaI을 사용하여 절단된 야생형과 절단되지 않은 돌연변이형 증폭산물의 크기를 통해 검출하는 방법(Restriction enzyme digestion of wild-type DNA)[Chung et al., Clin Endocrinol. 65:660-666, 2006], 야생형과 돌연변이 유전자의 3차원적인 구조(conformation) 차이에 따른 전기영동상 이동 거리의 변화를 통해 검출하는 방법인 중합효소연쇄반응-단일쇄 형태구조 다형성(Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism; PCR-SSCP) 방법[Trovisco et al., J Pathol. 202:247-251, 2004] 등이 사용되어 왔다. 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다. 또한 임상 시료는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많기 때문에, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이의 검출이 어렵다[Chung et al., Clin Endocrinol. 65:660-666, 2006; Trovisco et al., J Pathol. 202:247-251, 2004].

민감도를 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머로 돌연변이를 선택적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법[Rhodes et al., 1997], 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, T_c)를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법[Zuo et al., Modern Pathol. 22:1023-1031, 2009] 등이 사용되고 있다. 또한, 스코피언(scorpion) 프로브를 이용하여 돌연변이를 선택적으로 검출하는 스코피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR)(DxS' scorpions and ARMS) 방법이 사용되고 있다[Cross, Pharmacogenomics 9(4): 463-467, 2008]. 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다[Bernard et al., Clinical Chemistry 48(8):1178-1185, 2002]. 그러나 상기한 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야 하기 때문에 하나의 돌연변이를 검출하기 위하여 여러 반응이 요구되는 번거로움이 있다[Rhodes et al., Diagn mol pathol . 6(1):49-57, 1997, Zuo et al., Modern Pathol . 22:1023-1031, 2009].

파이로씨퀸싱(Pyrosequencing) 분석법은 프라이머-디렉티드 피씨알 (primer-directed PCR)과정에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 파이로포스페이트, ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키게 되며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 신호 피크는 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 나타내게 된다. 파이로씨퀸싱 분석법은 96 시료를 분석하는데 중합효소연쇄반응 단계를 포함하여 4시간 정도의 시간으로 분석이 가능하며 직접염기서열 분석법에서 필요한 형광결합 증폭단계 없이, 정제와 소식자 결합 단계만으로 간단하게 분석이 가능하며, 정확한 염기서열을 확인하는데 있어서 반 정량적으로 분석하므로 내재된 돌연변이체의 양을 확인할 수 있는 장점을 가진 분석법이라고 보고되어있다[Agaton et al., Gene . 289:3-39, 2002; Kim et al., Diagn Mol Pathol . 17:118-125, 2008]. 그러나 파이로씨퀸싱 분석법은 고가의 장비가 필요하므로 고가의 분석비용이 소요되는 단점이 있다.

최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다[Nielsen et al., Science, 254:1497-1500, 1991]. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화 (hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소 (Nuclease)나 단백질분해효소 (protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.

PNA 클램핑의 대표적인 기술로는 야생형에 특이적으로 결합하는 18mer의 PNA 프로브(서열번호 41: ATCGAGATTTCACTGTAG)와 LNA 프로브를 이용하여 BRAF 돌연변이형을 검출하는 기술이 있다[US 2008/0268449 A1, Oct. 30, 2008]. 그러나 상기 기술은 증폭반응의 사이클 수가 아닌 용융곡선의 차이로 돌연변이형을 구별하는 것이며 또한, 야생형을 검출하기 위한 PNA 클램핑 프로브 이외에 돌연변이를 검출하기 위한 LNA 프로브가 더 필요하게 된다. 따라서 변이형 분석을 위해 동일 반응기에 PNA 프로브와 LNA 프로브를 포함하여 반응하므로 실험상 다소 번거롭고 복잡할 뿐 아니라 분석 비용이 높아지는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 종래의 18mer 보다 길이가 긴 PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써, 용융곡선의 차이를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 돌연변이 검출 기술을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 돌연변이를 검출하는 방법에 사용하기 위한 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 제1면은

(1) BRAF(B-type Raf Kinase) 유전자의 엑손 15 코돈 600번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 BRAF 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 야생형 BRAF 유전자의 엑손 15 코돈 600번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, BRAF 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;

(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BRAF 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:

단계를 포함하는, BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제2면은

서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 본 발명에 따른 BRAF유전자의 V600E 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 PNA 프로브는 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 돌연변이 검출이 이루어지므로 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 BRAF 유전자의 돌연변이 검출 방법은 실시간으로 결과 확인이 가능하여 갑상선암을 비롯하여 악성 흑색종, 난소암, 대장암 등의 종양을 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있어, 조기 암 진단으로 인한 효율적인 치료를 가능하게 할 것이다.

도 1은 BRAF 엑손 15 코돈 600의 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 2는 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 야생형 및 돌연변이 세포주의 농도에 따른 검출 민감도(증폭 사이클 수)를 비교한 그래프이며;
도 3은 본 발명에 따른 서열번호 1 또는 2의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 돌연변이 포함 농도에 따른 검출 민감도(ΔC_t)를 비교한 그래프이고;
도 4는 BRAF 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 본 발명에서 따른 서열번호 1 또는 2 또는 7의 PNA와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 BRAF 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(증폭 사이클 수 및 ΔC_t)를 비교한 그래프이며;
도 5는 BRAF 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 본 발명에 따른 서열번호 2의 PNA와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 BRAF 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(ΔC_t)를 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 갑상선 BRAF 유전자의 돌연변이를 검출하는 것이다.

1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작

본 발명의 PNA 프로브는 BRAF 엑손 15의 코돈 600 야생형 유전자의 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서 19개 이상, 바람직하게는 19 내지 30개, 보다 바람직하게는 20 내지 25개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 PNA 프로브는 BRAF 엑손 15의 코돈 600 야생형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 1에 기재한 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인 바, 19mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서 본 발명에 따른 PNA 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 BRAF 엑손 15 코돈 600의 돌연변이를 효과적으로 검출해낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.

구체적으로는, 서열번호 1 및 2는 BRAF 엑손 15의 코돈 600번 뉴클레오티드를 포함하는 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브로서 BRAF 엑손 15의 코돈 600을 포함하는 1786 내지 1810번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다.

상기 프로브들 중 대표적으로 서열번호 1 내지 2 및 7의 프로브를 적용하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 서열번호 1 내지 2 및 7의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 4 참조).

본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal) 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 친수성 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다(J Chem Technol Biotechnol 81: 892-899, 2006; Tetrahedron Lett 39:7255-7258, 1998; Proc Natl Acad Sci USA 99:5953-5958, 2002; Anal Chem 69:5200-5202, 1997). 구체적인 예로서, N-말단에 라이신이 1개 부착된 PNA 프로브를 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Dueholm et al., J Org chem . 59(19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1(3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51(22): 6179-6194, 1995).

2. BRAF 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작

본 발명에서 "BRAF 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 미스매치가 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다.

본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 T_m을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 T_m 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다.

구체적인 예로써, 서열번호 1 내지 9의 PNA 프로브의 3' 부위의 9 내지 12개의 염기서열이 포함되도록 클램핑 프라이머를 설계하였다. 본 발명에서 예시된 서열번호 20의 정방향 프라이머는 서열번호 1의 BRAF 유전자 엑손 15의 코돈 600의 상류 부분 1776 내지 1798번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다.

본 발명에서 예시된 서열번호 20의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 17의 역방향 프라이머는 BRAF 유전자 인트론 15 부위의 35 내지 55번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며 또한, 서열번호 20의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 19의 역방향 프라이머는 BRAF 유전자 인트론 15 부위의 422 내지 443번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 프라이머의 길이는 각각 프라이머 조합의 증폭산물의 크기가 100bp 내지 600bp가 되도록 고안되었다.

한편, BRAF 유전자의 염기서열분석을 위하여 본 발명에서 제공되는 서열번호 16의 정방향 프라이머는 BRAF 유전자 인트론 15 부위의 -58 내지 -35번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 서열번호 18의 정방향 프라이머는 BRAF 유전자 인트론 14 부위의 542 내지 562번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며 프라이머의 길이는 17mer에서 30mer 사이로 고안되었다. 이들 프라이머는 서열번호 17 및 19의 역방향 프라이머와 조합되어 증폭산물의 크기가 200bp 내지 900bp가 되도록 고안되었다. 각각의 프라이머의 특성은 하기 표 2에 나타내었다.

3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 돌연변이 검출

본 발명에 따른 BRAF 유전자 V600E 돌연변이 검출방법은

(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BRAF 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:단계를 포함한다.

본 발명의 BRAF 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비한다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액 또는 종양 표본으로부터 DNA를 추출하여 준비한다.

본 발명의 실시간 PCR 클램핑 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클 수(Cycle threshold, 이하 'C_t'라 함)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 상기 방법은 전기영동 후 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화 및 수치화시켜 신속·간편하게 진단할 수 있는 방법이다.

본 발명에 있어서, PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 19mer 이상 길이의 염기서열로 이루어지며, 바람직하게는19 내지 30mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 인터컬레이터(intercalator) 방법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 결합해 형광을 발하게 되는데 이때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다.

본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 사이버 그린 (SYBR Green) I 외에도 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX Orange 등을 사용할 수 있다(Gudnason et al ., Nucleic Acids Res. 35(19):e127, 2007; Bengtsson et al ., Nucleic Acids Res . 31(8):e45; Wittwer et al ., Clinical Chemistry 49(6):853-860, 2003).

본 발명에서는 실시간 PCR 클램핑에 의한 유전자 증폭을 분석하여, BRAF 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 바, 증폭된 C_t값을 비교하여 BRAF 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 BRAF 야생형 유전자에 혼성화되어 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 높은 C_t값이 나타나게 된다.

돌연변이 유무 및 그 농도는 하기 식 1에 의해 얻어지는 △C_t값으로부터 확인한다.

돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 C_t 값이 낮게 나타나므로, △C_t 값은 큰 값을 나타내게 된다.

본 발명은 Real-Time PCR 및 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 갑상선 유두암의 진단 표지인자인 BRAF 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있다. 보다 상세하게는 본 발명은 갑상선암을 비롯하여 악성 흑색종, 난소암, 대장암 등의 종양을 검사하는데 이용할 수 있으며, 종양 연구뿐만 아니라 BRAF 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: BRAF 엑손 15 코돈 600 야생형의 PNA 프로브 합성

BRAF 유전자의 엑손 15 코돈 600의 야생형과 완벽하게 결합하는 14개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다[Lee et al ., Org Lett , 9:3291-3293, 2007].

실시예 2: BRAF 엑손 15 코돈 600 야생형의 돌연변이 세포주( cell line )로부터의 핵산 추출

BRAF 엑손 15 코돈 600의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 BRAF 엑손 15 코돈 600의 야생형 세포주인 Hela(genomic DNA) 인간 자궁암 세포주[KCLB10002, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국] 및 돌연변이 세포주 2종을 한국세포주 은행으로부터 분양 받았다.

상기 분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1X 페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 Labopass^TM 티슈 미니 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 상기 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃에 보관하여 사용하였다.

상기 분양받은 인간 세포주들로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 16 및 17의 프라이머 조합과 서열번호 18 및 19의 프라이머 조합을 사용하여 증폭한 후, PCR 산물을 Labopass^TM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 다음, 염기서열을 분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 및 변이형 세포주를 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법의 검체로 사용하였다.

실시예 3: BRAF 엑손 15 코돈 600의 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성

BRAF 엑손 15 코돈 600의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 BRAF 유전자의 엑손 15 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 16 및 17으로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 한 세트 그리고 서열번호 20의 BRAF 코돈 600의 클램핑 프라이머를 합성하였으며, 엑손 15 코돈 600의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 BRAF 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 17의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.

실시예 4: PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법 및 최적의 PNA 프로브 선정

상기 실시예 2의 세포주로부터 추출된 DNA를 이용하여 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법을 확립하고 최적의 PNA 프로브를 선정하였다.

주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타난 1개의 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 상기 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 ㎕, 2X IQ 사이버 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후, 95℃ 30초, 70℃ 20초, 63℃ 30초, 72℃ 30초로 이루어진 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.

실시예 5: PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BRAF 유전자의 돌연변이 검출한계 측정

상기 실시예 4에서 확립된 실시간 PCR 클램핑 방법을 사용하여 야생형 유전자에 돌연변이 유전자를 각각 50 ng, 10 ng, 5 ng, 1 ng이 포함하도록 제작하여 돌연변이 유전자의 농도에 따른 C_t값 사이의 상관관계를 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하고자 하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 용액 내 상대적인 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 C_t값이 일정하게 감소하여 용액 내 돌연변이 유전자의 농도와 C_t값 사이에 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.

비교예 1: BRAF 엑손 15 코돈 600의 야생형 검출을 위한 종래기술과의 비교

미국공개특허 US2008/0268449에 개시된 PNA 프로브와 본 발명에 따른 PNA 프로브를 비교하기 위하여, 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 상기 미국공개특허의 BRAF 엑손 15 코돈 600의 야생형에 대한 PNA 프로브를 제작하였다.

상기 미국공개특허의 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 실시하여 돌연변이 검출여부를 확인하였다.

그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 도 4 및 도 5로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 미국공개특허의 프로브 사용 시에는 돌연변이형의 존재나 농도 증가에 따라 C_t값에 별다른 차이가 없어(즉 ΔC_t값이 작아) 돌연변이의 검출이 어려웠던 것에 비해, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 돌연변이형의 존재에 의해 C_t값이 크게 감소할(즉, ΔC_t값이 클) 뿐만 아니라, 돌연변이형의 농도 증가에 따라 C_t값이 일정하게 감소하여 돌연변이형을 효과적으로 검출해낼 수 있었다. 또한, 도 4 내지 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 1%의 비율로 섞여있는 돌연변이의 유무도 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for the BRAF mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS23-2 <400> 1 tcgagatttc actgtagcta gac 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS24-1 <400> 2 atcgagattt cactgtagct agac 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS24-2 <400> 3 tcgagatttc actgtagcta gacc 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS25 <400> 4 atcgagattt cactgtagct agacc 25 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS23 <400> 5 atcgagattt cactgtagct aga 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS22-1 <400> 6 atcgagattt cactgtagct ag 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS22-2 <400> 7 tcgagatttc actgtagcta ga 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS21 <400> 8 tcgagatttc actgtagcta g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CAS20 <400> 9 cgagatttca ctgtagctag 20 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CS23 <400> 10 tctagctaca gtgaaatctc gat 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CS22-1 <400> 11 tctagctaca gtgaaatctc ga 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CS22-2 <400> 12 ctagctacag tgaaatctcg at 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CS21 <400> 13 ctagctacag tgaaatctcg a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-CS20 <400> 14 tagctacagt gaaatctcga 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA 18 primer <400> 15 atcgagattt cactgtag 18 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-230F <400> 16 atgcttgctc tgataggaaa atga 24 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-230R <400> 17 agcagcatct cagggcca 18 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-810F <400> 18 aggaaagcat ctcacctcat c 21 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-810R <400> 19 gatcacacct gccttaaatt gc 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF-clamping F <400> 20 aggtgatttt ggtctagcta cag 23

Claims

(1) BRAF(B-type Raf Kinase) 유전자의 엑손 15 코돈 600번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 BRAF 유전자 클램핑 프라이머 세트와, 야생형 BRAF 유전자의 엑손 15 코돈 600번 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, BRAF 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BRAF 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
단계를 포함하는, BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항에 있어서,
상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 실시간 PCR의 C_t(cycle threshold)값을 측정하여 BRAF 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 19 내지 30mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 14로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 BRAF 유전자 클램핑 프라이머 세트는 BRAF 유전자 코돈 600 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 5항에 있어서,
상기 BRAF 유전자 클램핑 프라이머 세트는 정방향 프라이머로서 서열번호 20을 포함하는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 6항에 있어서,
상기 BRAF 유전자 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 17 또는 서열번호 19의 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 (1) 단계의 PNA 클램핑 프로브는 실시간 PCR의 반응물 중 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 DNA 삽입(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 9항에 있어서,
상기 DNA 삽입(intercalating) 형광물질은 사이버 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 BRAF 유전자의 돌연변이 검출은 악성 흑색종, 갑상선암, 대장암, 또는 난소암을 진단하는데 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출 방법.
서열번호 1 내지 14로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 제 4항에 따른 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.