JP4698008B2 - 癌疾患の予後判定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌患者の手術の予後が良好か否か、具体的には癌再発の危険性を判定するのに有用な方法に関する。さらに本発明は当該方法に用いられるＤＮＡマーカー配列、及びオリゴヌクレオチドに関する。本発明の方法によれば、治療前に予め被験者（患者）の癌再発の確率が予測できるので、これを参考にして個々の患者に適した治療方法並びに治療後のアフターケアを検討することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
癌患者の治療（手術）後の癌再発の有無を予想することは臨床的に大変重要なことである。このため従来より、癌患者の遺伝子異常を中心に種々の因子について研究されており、食道癌や乳癌ではc-erb Ｂ癌遺伝子及びint-２癌遺伝子の増幅が癌の再発・転移などの臨床特性と相関するという知見から、当該癌遺伝子がマーカーとして癌患者の治療予後の判定に利用されている。例えば、食道癌では、ｃ-erbＢ癌遺伝子増幅症例及びint-２癌遺伝子増幅症例では術後累積生存率が低く、さらにint-２癌遺伝子増幅症例では、高い確率で術後遠隔臓器への転移が認められている。しかしながら、肝細胞癌症例においては既知の癌遺伝子の増幅と再発・転移や術後累積生存率などの臨床特性との間に密接な相関関係は見出されておらず、従来報告されている遺伝子異常だけでは、正しく患者の手術後の予後を判断することが出来ない。
【０００３】
ところで、ミワらによって、ＲＬＧＳ法（Hatada, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9523-9527 (1991)）を用いて、ヒト癌細胞株からＤＮＡを検出し、染色体8q21に局在する200コピーの13ｋｂの核酸中の繰り返し配列の一部分が明らかにされ、該繰り返し配列中に生じるＮｏｔＩ制限酵素の認識部位における脱メチル化現象が幾つかのタイプの癌の発生または進展に関連しているという可能性が報告されている（Miwa,W.,et al. Electrophoresis, 16 (2) 227-232(1995))。
【０００４】
また、ナガイらによって、同じくＲＬＧＳ法を用いて、ヒト肝細胞癌(HCC)患者の癌組織検体からＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有する1.4ｋｂのＤＮＡ繰り返し配列を有する新規遺伝子（ＤＥ−１）が単離された。該DE-1遺伝子は、健常なヒト肝細胞においてはメチル化されていたが、ヒト肝細胞癌においては高い頻度を持ってＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基で脱メチル化されており、この遺伝子領域のＤＮＡ低メチル化が細胞の分子量化と肝癌発生の両方において何らかの役割を演じているという可能性が報告されている(Nagai, H.,et al.，Gene, 237 (1) 15-20 (1999))。
【０００５】
そして、本発明者らもまた、同じくＲＬＧＳ法により、肝癌患者のＤＮＡを制限酵素NotI−PvuIIで切断し、更にPstIでイン・サィツゥ(in situ)に切断した断片をポリアクリルアミドゲルにて分離して得られるスポットの変化数が肝癌患者の術後の予後と相関していることを報告している(Itano, O., et al., Oncogene, 19, 1676-1683 (2000))。
【０００６】
一方、遺伝子断片を大量に増幅する方法であるＰＣＲ法は、組織中ＲＮＡの発現量やウイルスＤＮＡ量などを定量測定する方法としても応用され、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブを用いてＰＣＲ反応をリアルタイムでモニターしたカイネティックス分析により、２倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量ＰＣＲ法が開発されている(均質検定システム：特許登録番号第2825976号、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User's Manual: 5.10.5.13(1996))。
【０００７】
当該定量ＰＣＲ法は、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（TaqManＰＣＲ法）と呼ばれ、各種ウイルス遺伝子の測定に応用されている(ＥＢウイルス遺伝子：特開平11-137300号、ＨＣＶウイルス遺伝子：特開平11-103899号、ＨＢＶウイルス遺伝子：特開平11-103897号)。さらに該方法は、男女のＸ染色体の差や癌抑制遺伝子の欠失の判定に応用され(Boulay, J.L., et al., Biotechniques, 27, 228-230 (1999))、また末梢血から抽出したＤＮＡによって癌家系内の保因者同定が、ＬＯＨ法やＦＩＳＨ法より簡便に行えることも報告されている(Laurendaeau, I., et al., Clin. Chem., 45(7) 982-986 (1999))。
【０００８】
ヒト癌領域においては、このTaqManＰＣＲ法を用いることにより、サンプル中のＤＮＡの非メチル化、メチル化を簡単に測定できることが報告されている(Eads, CA. et al., Nucleic Acids Res.,28(8) E32 (2000): MethyLight : a high-throughput assay to measure ＤＮＡ methylation.)。
【０００９】
しかしながら、癌患者、特に肝癌患者の術後の予後の判定には、上記ＲＬＧＳ法は、２度の制限酵素消化、ゲル電気泳動並びに放射線標識したｄＮＴＰｓ或いはハイブリダイゼーション・プローブなど、手間のかかる操作が必要であるため、簡便な方法とは言い難い。
【００１０】
また、従来メチル化または脱メチル化の程度の検出は、例えば癌部と非癌部の２種類の組織を対象として両者のメチル化または脱メチル化の程度を比較することによって行っていた。しかしこの方法は、用いる組織によってＤＮＡ増幅に違いがあるため（例えば、癌部ではメチル化または脱メチル化部位が増幅しているのに対し、非癌部では増幅していない等の相違）、単純な方法で、メチル化または脱メチル化の程度を比較することができないという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、癌疾患に関して上記従来の問題を解決し、少量のＤＮＡサンプルを用いて短時間で簡便な操作で癌患者の治療予後の診断を可能とする方法を提供することを目的とする。具体的には、本発明は癌組織中のＤＮＡのメチル化または脱メチル化の程度を簡便な方法で精度良く測定することにより、癌の予後を診断する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、癌患者の手術後の治療方針を判断したり決定するのに役立つ臨床上重要な情報を取得するのに有用な診断・判定方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、癌部組織より得られるＤＮＡくり返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの数と癌治療の予後（癌再発の確率）との間に一定の相関関係があることを見いだし、当該脱メチル化ＤＮＡの数を指標にすることによって癌患者の手術の予後が良好か否かを、手術前に予め診断できることを確認した。そして、本発明者は、当該方法を実施することによって得られる情報は、癌患者、特に肝癌患者の手術方法並びに手術後の治療方針（アフターケア）を判断し、かつ決定することに有効に役立つことを確信して、本発明を完成するにいたった。
【００１３】
即ち本発明は下記（１）〜（１４）に掲げる、癌患者の予後を診断する方法である：
（１）癌部または非癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、該ＤＮＡ数に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
（２）ＤＮＡ繰り返し配列がセントロメリック・クラスター領域、またはタンデムリピート領域に由来するものである、（１）記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（３）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数をＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用いて検出・測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（４）ＤＮＡ繰り返し配列がメチル化感受性制限酵素認識部位を有するものであることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（５）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ及びＳｆｉＩよりなる群から選択されるいずれかの制限酵素から選択されるものである、（４）記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（６）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩであることを特徴とする、（４）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（７）ＤＮＡ繰り返し配列が配列番号１〜４に示されるＤＮＡ配列のいずれか少なくとも１つのＤＮＡ配列であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（８）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターをライゲーションし、このアダプターのＤＮＡ配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできるリバース・プライマーを用いて、メチル化感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定したプローブにより増幅したＤＮＡを定量することによって、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数(NC-1)を定量する工程ａ：
ＤＮＡ繰り返し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない部分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を定量する工程ｂ：並びに
工程ａで定量した脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃからなり、
工程ｃによって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
（９）配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとして、配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとして用いて工程ａを行い、また配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとして、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとして用いて工程ｂを行うことを特徴とする、（８）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１０）脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕が１％未満の場合を癌患者の予後が良好とし、１％以上を予後不良として判断することからなる、（８）または（９）に記載の癌疾患の手術の予後を診断する方法。
（１１）癌が非上皮系癌細胞に起因する癌である（１）乃至（７）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１２）癌が肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病よりなる群から選択されるいずれかである、（１）乃至（１０）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１３）癌が肝細胞癌である（１）乃至（１０）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１４）癌治療の手術前に実施することを特徴とする、（１）乃至（１３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
【００１４】
また本発明は、癌疾患の予後を診断するために用いられるＤＮＡマーカー配列であり、これらとしては配列番号１〜４に記載されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００１５】
さらに本発明は、上記（８）に記載の癌疾患の予後を診断する方法に用いられるヌクレオチドのセットであって、かかるヌクレオチドとして下記のものを例示することができる：
＜工程ａ＞
フォワードプライマー：配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド、
プローブ ：配列番号６で示されるオリゴヌクレオチド、
リバースプライマー ：配列番号７で示されるオリゴヌクレオチド、
＜工程ｂ＞
フォワードプライマー：配列番号８で示されるオリゴヌクレオチド、
プローブ ：配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド、
リバースプライマー ：配列番号10で示されるオリゴヌクレオチド。
【００１６】
本発明によれば、同一組織（癌組織）を対象として、これから得られるＤＮＡの繰り返し配列中のメチル化部位又は脱メチル化部位の数と、ＤＮＡ繰り返し配列の数を比較することによって得られる情報に基づいて、癌患者の治療後（手術後）の予後が良好か否か、再発がないか否かを、簡単に且つ高い信頼性をもって判断することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において、検出用に用いられるＤＮＡは、ヒト癌患者より得られる癌組織または非癌組織から常法により取得でき、例えば組織をプロティナーゼＫにより溶解し、フェノール−クロロホルムにより分離しエタノールにより抽出されたＤＮＡを用いることができる。該ＤＮＡの抽出は、癌患者の癌診断後の治療開始前或いは手術前に患者の生検組織から抽出されたＤＮＡ、或いは手術中に摘出された癌部または非癌部の組織から抽出されたＤＮＡ、或いは末梢血液から単離されたＤＮＡを用いることができる。後記実施例に示されるＴａｑＭａｎＰＣＲを用いる場合、例えば肝細胞癌の患者の場合は手術前に予め生検組織から所望のＤＮＡが取得できるため、本発明の方法から得られる情報が手術後の予後の治療方針の決定には勿論、手術そのものの方針の決定に重要な情報となり得る。
【００１８】
本発明において、検出するＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡは、上記ヒト組織から得られたＤＮＡを脱メチル化ＤＮＡの配列を認識するメチル化感受性認識制限酵素を用いて消化することによって取得できる。ここでメチル化感受性認識制限酵素としては、制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ 及びＳｆｉＩなどが例示できるが、特に制限酵素ＮｏｔＩが好適に例示される。
【００１９】
また、本発明の診断方法において、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定する領域は、検体中のＤＮＡ配列中で数百塩基から数千塩基からなるＤＮＡ配列が繰り返されてなる領域、すなわちＤＮＡ繰り返し配列断片の領域である。本発明の方法は、このＤＮＡ繰り返し配列に存在する脱メチル化ＤＮＡの数を検出することを含むため、本発明が対象とするＤＮＡ繰り返し配列は、数百塩基から数千塩基のＤＮＡ配列が繰り返されるＤＮＡ配列であれば、何れのＤＮＡ繰り返し配列領域であってもよく、例えば、セントロメリック・クラスター領域、またはタンデムリピート領域などが例示できる。より具体的には、例えば前記ＤＮＡ繰り返し配列として配列番号１〜配列番号４に示されるＤＮＡ配列が例示できる。また本診断方法で用いられる検出方法は、前記ＤＮＡ繰り返し配列中に含まれる脱メチル化ＤＮＡの数が測定できる方法であるかぎり、特に制限されない。
【００２０】
例えば検出方法として、サザンハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲ検出法などが例示できる。ここで、サザンハイブリダイゼーション法においては、例えば患者の癌部及び非癌部組織からＤＮＡを取得した後、ＮｏｔＩ等のメチル化感受性認識制限酵素で消化してＤＮＡ断片を得、電気泳動した後、得られた脱メチル化ＤＮＡ配列（ＧＣリッチＤＮＡ配列）を標識してプローブとして、これをハイブリダイズさせて目的のＤＮＡ断片を検出する方法を用いることができる。
【００２１】
また、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法によれば、癌部組織のみを用いて目的のＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定することにより、本発明の診断方法を実施することができる。定量的リアルタイムＰＣＲ検出法は本質的には、公知の方法、例えば特許第2825976号公報に記載の方法に従うか、ＰＥバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決定システム・ユーザーマニュアルに従い実施できる。
【００２２】
かかる定量的リアルタイムＰＣＲ検出法において用いられる、プライマーとしては特に制限されないが、例えばフォワード・プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。該プライマー配列は、癌患者の組織検体から制限酵素で切断され単離されたＤＮＡ繰り返し配列に含まれる脱メチル化ＤＮＡの近傍配列を認識できる配列であれば、特に制限されず、例えばメチル化感受性制限酵素が認識するＧＣリッチなＤＮＡ配列を認識するプライマー配列からなる、連続する約１５〜４０塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２３】
より具体的にはメチル化感受性制限酵素、例えばＮｏｔＩ(GCGGCCGC配列を認識)などの制限酵素により切断されるＧＣリッチな領域(ＤＮＡ配列中、シトシン(C)とグアニン(G)の含量が多い領域)であって、ＤＮＡの脱メチル化が生じているかを知り得る配列を挙げることができる。尚、本発明においては、メチル化感受性制限酵素として上記ＮｏｔＩのほか、ＢｇｌＩ、ＦｓｅＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｆｉＩなどの８塩基の配列を認識する制限酵素が好ましく例示される。
【００２４】
上記のようにフォワード・プライマーとしては、好ましくは、例えばＤＮＡ繰り返し配列を有するセントロメリック・クラスター(Centromeric Not I cluster )領域、タンデムリピート領域中に存在するメチル化感受性制限酵素認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドが挙げられ、具体的には配列番号１〜４に示されるＤＮＡ配列の中に存在するメチル化感受性制限酵素認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００２５】
本発明においては、具体的には後記実施例に示すように手術によって摘出された癌部組織より抽出されたＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、得られたＤＮＡ断片に大腸菌リガーゼを用いてアダプターをライゲーションするが、フォワード・プライマーとしては該アダプター部位のＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドを例示できる。かくしてＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列が検出可能なフォワード・プライマーを作成することができる。
【００２６】
一方、リバース・プライマーは、前記フォワード・プライマーを５’側に結合するプライマーとして用いて、上記ＤＮＡの繰り返し配列を含めてＰＣＲ反応によりＤＮＡの繰り返し配列が増幅できるプライマー配列を有するものであれば特に制限されない。この限りにおいてそのＤＮＡ配列は制限されないが、例えばセントロメリック・クラスター領域の３’側に相同する配列からなる連続する約１５〜４０塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが好適であり、具体的には配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２７】
プローブは、ＤＮＡ繰り返し配列においてフォワード・プライマーとリバース・プライマーの両者で挟まれる、いわゆるこれらのプライマーが結合する位置の内側に位置するＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドであれば限定されない。一例として本発明の実施例において示すようには、ＧＣリッチな領域であって、ＤＮＡの脱メチル化が生じていると考えられているセントロメリック・クラスター領域内に存在するＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドからなる連続する約１５〜４７塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。
【００２８】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法においては、増幅されるＤＮＡ配列は、癌の手術前の生検時に得られた癌部組織、または手術後の癌患者の癌部またはび非癌部組織、好ましくは、特に肝癌の患者の手術によって摘出された癌部の組織より、常法により抽出されたＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、該ＤＮＡ断片に大腸菌リガーゼ等のリガーゼを用いてアダプターをライゲーションしたＤＮＡ配列がその対象ＤＮＡ配列として好ましく例示できる。
【００２９】
本発明においてプローブとして、例えば配列番号６で示される塩基配列のうち連続する１５〜４７塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されてなるものを使用することもできる。ここでレポーター蛍光色素は、レポーター蛍光色素がクエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。すなわち、上記プローブは、定量的リアルタイム検出ＰＣＲ法において、癌患者のＤＮＡのＤＮＡ繰り返し配列中に、脱メチル化がどの程度生じているかを知る、脱メチル化ＤＮＡ配列の測定用プローブである。
【００３０】
本発明は、具体的には下記の工程を有する癌疾患の予後を診断する方法を提供する：
癌患者の癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターをライゲーションし、これを鋳型として、上記アダプターに対して相補的なＤＮＡ配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできるリバース・プライマーを用いて、メチル化感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定したプローブにより増幅されたＤＮＡを定量することによって、脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)を定量する工程ａ：
ＤＮＡ繰り返し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない部分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を定量する工程ｂ：並びに
工程ａで定量した脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃ、
工程ｃによって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
【００３１】
上記の診断方法において、例えば工程ａにおいては前述するフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブとを用い、測定すべき癌組織、特に肝癌患者の当該癌部組織から得られるＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩ消化して得られるＤＮＡ繰り返し配列を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することによって被検サンプル中のＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数が定量され、また工程ｂにおいては、前記ＤＮＡ繰り返し配列のうち、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列と一致しないＤＮＡ配列に対応する配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマー並びにリバース・プライマーとし、両者に挟まれるＤＮＡ繰り返し配列の内側のＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によりＤＮＡ繰り返し配列を増幅することによって検体中のＤＮＡ繰り返し配列が定量される
尚、ＤＮＡ繰り返し配列に結合するフォワード・プライマーとリバース・プライマーの距離は、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数とＤＮＡ繰り返しＤＮＡ配列の数とが検出できる範囲のＤＮＡ断片の増幅が出来る限り、限定されない。
【００３２】
工程ａにおいて用いられるフォワード・プライマーとしては配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、プローブとしては配列番号６に示されるオリゴヌクレオチド、リバース・プライマーとしては配列番号７に示されるオリゴヌクレオチドが好適に例示され、また工程ｂにおいて用いられるフォワード・プライマーとしては配列番号８に示されるオリゴヌクレオチド、プローブとしては配列番号９に示されるオリゴヌクレオチド、リバース・プライマーとしては配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドが好適に例示される。
【００３３】
本発明においては工程ａで得られる脱メチル化したＤＮＡ数と工程ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配列の数の比に基づいて、癌患者の予後が良好か否かを容易に診断することができる。具体的には、工程ａで得られる脱メチル化したＤＮＡ数を（ＮＣ−１）とし、工程ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配列の数を（ＮＣ−２）とした場合、
式：（ＮＣ−１）／（ＮＣ−２）×１００（％）
で脱メチル化の割合を算出し、かかる脱メチル化の程度を示す客観的な値に基づいて癌患者の予後を診断することができる。
【００３４】
例えば、実施例において例証するように、上記式で得られる脱メチル化の割合が１％未満の場合を癌治療の予後が良好であるとし、１％以上の場合を癌治療の予後が不良であるとして判定することが可能である。
【００３５】
よって当該判定は、臨床上の癌診断の後、癌患者に対する治療開始前、または手術前後に行うことが好ましく、得られた判定結果に基づいて癌治療の方針や手術後の治療やアフターケアの方法が検討され決定できる。
【００３６】
本発明が対象とする癌は、特に制限されないが、例えば非上皮系癌細胞に起因する癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等を挙げることができる。好ましくは非上皮系癌細胞に起因する癌、及び肝細胞癌である。
【００３７】
本発明においては、プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズするセントロメリック・クラスター領域は、上記５’側プライマーがハイブリダイズする領域と近接して一部重複しているが、実際に反応を行なう場合には、５’側プライマーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複することがない組み合わせを選択する必要がある。
【００３８】
レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販されているものを用いることができる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に記載されている。
【００３９】
本発明の方法では、好適にはフォワード・プライマー（５’側プライマー）とリバース・プライマー（３’側プライマー）と上記蛍光標識されたプローブとを用い、被検体中のメチル化感受性制限酵素にて切断されたＤＮＡ断片中の測定すべきＤＮＡ配列中のＤＮＡ繰り返し配列を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からのプローブに起因する蛍光をリアルタイムに測定する方法が好適に採用される。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００４０】
ＰＣＲ反応は、例えば患者の癌部組織または非癌部組織から抽出し得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡを上記フォワード・プライマー、リバース・プライマー及び上記プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む溶液を調製して行なう。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、所望の遺伝子を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例えば血清等の体液である。検体のＤＮＡの調製は、従来法に用いられるＰＣＲの場合と同様に行なうことができる。
【００４１】
ＰＣＲ反応では、例えば、癌患者の末梢血検体、或いは癌患者から摘出した癌部若しくは非癌部組織から市販のＤＮＡ抽出用キットなどで抽出されたゲノムＤＮＡを調製しそのまま増幅用ＤＮＡとするか、或いは検体から得られた組織をプロティンキナーゼＫにより分解し、フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により所望のＤＮＡを得ることができる。また、ｍＲＮＡの場合は、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。
【００４２】
増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブに結合し、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが離れ、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にＤＮＡ配列中繰り返し配列を有するＤＮＡ領域中の脱メチル化ＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中にＤＮＡ繰り返し配列領域内にある脱メチル化ＤＮＡの数を検出することが可能である。
【００４３】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のＤＮＡ繰り返し配列領域内にある脱メチル化ＤＮＡ数が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被検試料中のＤＮＡの定量測定を行なうことができる。
【００４４】
より具体的には、例えば、被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域内に存在するＤＮＡ配列中にある脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列を含まないネガティブコントロールにおける各サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍でよいかを閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡを定量測定することができる。すなわち、既知濃度のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡ標準物質の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、標準物質を用いた測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡの数を定量測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲＬＧＳ法のように、複数の制限酵素処理やＲＩの使用が不要で、また通常のＰＣＲのように電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
１）１９９１年８月から１９９７年１２月までに肝細胞癌と診断された肝切除を施行された患者３４例を対象とし、切除した肝臓から肝細胞癌組織とそれに隣接した非癌様組織(非癌部組織)をＤＮＡ出抽用サンプルとして取得し、ＤＮＡ調製まで−７０℃にて凍結保存した。
【００４６】
患者は３ヶ月ごとに外来にて、フォローアップし、癌の再発は再手術、剖検、及び/またはルーチンの全身のコンピュータ断層撮影、核磁気共鳴イメージ、及び超音波造影を含むイメージ診断による発見に基づいて診断された。最大経過観察期間は、５０ヶ月で平均観察期間は、３２ヶ月であった。
【００４７】
ａ）ゲノムＤＮＡの調製
上記ＤＮＡ調製用凍結サンプルからスタフードらの方法に順じて単離した（Blln, ｎ.and Stafford,Ｄ.Ｗ., Nucleic Acids Res., 3, 2903-2308 (1976) )。即ち、上記で得られたＤＮＡ調製用凍結サンプル１ｇに対して（組織１ｇ）に氷冷したＴＮＭ溶液（20mM トリス−塩酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1.5mM MgCl2)を１０〜２０ｍｌ加えてホモゲナイズした後、試料を適当なチューブに移して、冷却遠心機で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した後、粗画分画のペレットを得、氷冷したＴＮＥ溶液（10mM トリス−塩酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1mM EDTA）を２０ｍｌ加え混合した後、１／２０容(1ml)の１０％ＳＤＳを加えて穏やかに混和した後、１／１００容(200μl)の１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加えて５０℃で４時間から一晩インキュベートさせた後、等量のフェノールを加え、さらに４時間から一晩にかけて穏やかに振盪した。３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、等量のフェノール-クロロホルム(1:1)を加え、３０分間程度振盪した後、水層を回収し、１／５０量の５Ｍ ＮａＣｌを加えた。次いで２〜２．５倍量の１００％エタノールを加えて穏やかに混合した後、−２０℃で１〜１５時間、または−７０℃で１０〜２０分間、ＤＮＡの収量を増やす為に冷却した。３０００ｒｐｍ、１０分間冷却遠心した後、上清を捨てて、所望のＤＮＡペレットを回収し、風乾などで乾燥した後、少量(1ml)のＴＥ液（10mM トリス−塩酸 (pH7.5)、1mM EDTA）に溶解し４℃で保存した。
【００４８】
また、ＤＮＡの調製は、組織を溶解した後、QIAampDNA MiniKit（QIAGEN社製)等を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出することによっても行うことができる。
【００４９】
ｂ）脱メチル化ＤＮＡを含むＤＮＡ繰り返し配列のクローニング
本発明者は、先に肝癌患者から、ＲＬＧＳ法(Hatada, I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9523-9527 (1991))を用いてＤＮＡサンプルを得て制限酵素ＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩ断片で切断し、ＮｏｔＩの５’末端をＰ３２で標識し、大きさで分離した後、ＰｓｔＩで更にイン・サイテゥ(in situ)に切断して、断片をポリアクリルアミドゲルにて分離し、変化の見られたスポットの数を分析し、癌部と非癌部のスポット数、スポットのパターンを複数症例を比較し、スポットの相違数と術後再発、累積生存率との相関関係を調査し、その数から患者を２層に分けて（16>=、15<）予後との相関検討し報告している（Oncogene, 19, 1676-1683 (2000)）。
【００５０】
更に共通して癌部に出現し、スポットの相違数とスポットの濃度に相関があるスポットがあるかどうかを以下の方法で検討した。
【００５１】
まず上記ａ）で得られた１００μｇのＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出した後、遠心分離し、得られた沈澱物を蒸留水に再懸濁させた。
【００５２】
次いでＮｏｔＩで誘導された５’末端を32Ｐで標識した。続いて制限酵素ＰｕＶＩＩでＤＮＡ断片を切断し、得られたＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩ／ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にかけ、さらにゲル中に分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、標識ＤＮＡ断片は、多数のスポットとして二次元電気泳動図上に展開され、オートラジオグラフィーによって視覚的に検出できた。
【００５３】
その結果、多数のスポットの中からスポットの強度(濃度)の濃い興味ある部位が４箇所、３１例中１２例(38.7%)に見出された。
【００５４】
そして、スポットの強度比(癌部の濃度と非癌部の濃度)と累積生存率との相関関係をみると、強度比が１以下(17症例)と１以上(14症例)で累積生存率を見るとスポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が低下した。
【００５５】
また、癌部と非癌部間の変化したＲＬＧＳスポット数とスポットの強度(濃度)の濃い興味ある４つのスポット(スポットＡからスポットＤ)の強度の相関は、それぞれのケースにおけるスポットＡからスポットＤの４つスポットの２倍レベルの相対的密度で比較した(検定法:Spearman rank correlation coefficient)。その結果、これらのスポットの強度は、変化したＲＬＧＳスポット数と有意に相関していた(Spearman rank correlation coefficient：スポットA：0.650, p<0.0001：スポットB：0.712, p<0.0001 スポットC： 0.745, p<0.0001スポットD：0.704, p<0.0001)。さらにこれら４つのスポットの強度比(癌部の濃度と非癌部の濃度)と累積生存率との相関関係をみると、術後の再発が低いグループ(スポットの強度が２倍レベルより未満)と術後の再発が高いグループ(スポットの強度が２倍レベルより同等以上)で累積生存率を見るとこれら４つのすべてのスポットにおいて、スポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が有意に低下した(p<0.05)。
【００５６】
このように４つのスポットの変化の数およびスポットの強度(癌部の濃度と非癌部の濃度の比)と累積生存率が相関することから、これら４つのスポットにおけるＤＮＡの脱メチル化に関連する特徴的なＤＮＡ配列が存在するかどうかを検討することにした。
【００５７】
興味ある４つのスポットのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩのＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片をゲルから切り出し、スポットＡ−Ｄとし、それぞれフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出し、ＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ／ＤＮＡ増幅の為にＮｏｔＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片末端にＤＮＡアダプターをライゲートし、該ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。
【００５８】
そして得られた４つのスポットからのＰＣＲ産物を、ベクターpBluescriptIIを用いてクローニングを行なった。
【００５９】
クローンされた断片の核酸配列は、アプライド・バイオシステムズ・モデル３７７ＤＮＡシーケンサー(アプライド・バイオシステムズ社製)で配列決定した。
【００６０】
４つのクローンからの配列決定された核酸配列は、ジーンワークス・ソフトウェア(GENEWORKS software)を用いて分析し、相同性検索は、ＮＣＢＩ(the National Center of Biotechnology Information)のＢＬＡＳＴネットワーク・サービス(Altachul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990))を用いて実施した。
【００６１】
２つの核酸配列の間の相同性の調査は、Gentyx-Mac Version 10.1（SOFTWARE DEVELOPMENT CO., LTD., Tokyo, Japan）を使用して行なった。
【００６２】
上記で得られた４つのスポットＡ−Ｄの核酸配列情報から、配列番号１に示されるスポットＡに相当するクローンされた核酸配列は、１９９３年にウォングら(S. Wong, M.J. Wagner and D. Wells )によってヒト・タンデム繰り返し配列(Human tandem repeat sequence: HTRS )として、アクセッション番号Ｌ０９５５２としてＧｅｎｂａｎｋに登録されている１３キロ塩基対の繰り返しのあるユニットの一部分のそれと完全に一致していた。該ユニットは、ヒト染色体８ｑ２１上にあるタンデムにおいておよそ２００回繰り返されていると報告され、この断片はＲＬＧＳ法を用いた他のヒト癌において同定されていた(Miwa, W., et al., Electrophoresis, 16, 227-232 (1995): Thoraval, D., et al., Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-244 (1996) )。
【００６３】
次いで配列番号２に示されるスポットＢに相当するクローンされた核酸配列は、セントロメトリックＮｏｔＩクラスター(Centromeric Not I cluster: CNIC)として、アクセッション番号Ｙ１０７５２としてＧｅｎｂａｎｋに登録されている１４１５塩基対のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片の繰り返しのあるユニットの一部分のそれと完全に一致しており、この断片はＲＬＧＳ法を用いて肝細胞癌において既に特定されている(Nagai, H., et al., Gene, 237 (1) 15-20 (1999): Nagai, H., et al., DNA Res., 6 (4) 219-225 (1999) )。
【００６４】
相同性検索によれば、この断片はソラバル(Thoraval)らがＲＬＧＳ法を用いて神経膠芽腫から単離し、クローニングした断片の相補配列である(Thoraval, D., et al., Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-244 (1996))。また、該核酸配列は、染色体９、１３、１４、および２１のセントロメアの近傍のヒト１．４キロ塩基タンデムに繰り返された配列として、Genbankにアクセッション番号U59100として登録されていて、ＦＩＳＨ(Fluorescence in situ hybridization)を使用することによってアクロセントリックacrocentric染色体９、１３、１４、および２１のセントロメリックな領域上にあることが明らかになった。
【００６５】
また、配列番号３で示されるスポットＣに相当するクローンされた核酸配列は、スポットＢのそれと同一であった。該核酸配列は、ナガイらによってｃｏｓＤＥ−１としてコスミドクローンから単離された２．８キロ塩基対のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片のタンデム繰り返しされているアレイの一部分であった(Nagai, H., et al., Gene, 237(1) 15-20(1999))。該配列は、メチル化されたＮｏｔＩ配列間にある２つのセントロメトリックＮｏｔＩクラスター(2CNIC)の連結であることが考えられた。
【００６６】
一方、配列番号４で示されるスポットＤに相当するクローンされた核酸配列は、新規な配列で相同性ある配列はなかった。
【００６７】
上記のことから、ＨＴＲＳスポット、ＣＮＩＣスポット、および２ＣＮＩＣスポットの増大したシグナルは、対応している断片のＮｏｔＩの認識配列における脱メチル化に負わされることが明らかにされ、ＲＬＧＳプロファイルにおけるこれらのスポットの強度は、脱メチル化の量（数）を提供していることが確認された。
【００６８】
従って、配列番号１〜４に示されるそれぞれスポットＡ〜Ｄに対応するＤＮＡ繰り返し配列のいずれかの配列中のＮｏｔＩの認識部位における脱メチル化の量がこれらのスポットの強度に対応しており、即ち、術後の予後とスポットの強度の相関関係は、術後の予後とＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数との相関関係に置き換えることが可能となる。
【００６９】
このことから、上記４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化されたＤＮＡの割合を定量することで、所望の癌患者の術後の予後を判定することが可能となる。
【００７０】
実施例２ 癌疾患の予後の診断方法
癌患者の癌治療後（手術後）の予後を判定する上で、考慮される診断方法としては、少量の臨床サンプルを基に短時間で簡便な患者の予後診断が可能な方法、具体的には癌患者の手術前の生検検体や手術中に得られた癌部組織より得られた検体から癌患者、特に肝癌患者の手術後の予後の治療方針の決定に役立つ患者の予後予測を可能とする方法が望まれる。従って、本発明者は上記実施例１より得られた結果から、癌患者より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの数に着目し、該ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、癌患者の予後が良好か否かを診断する方法に適した方法を、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を利用して行った。
【００７１】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は公知の方法を用いて実施されるが、癌患者の癌部組織および非癌部組織から抽出されたＤＮＡをメチル化感受性制限酵素、本実施例においては制限酵素ＮｏｔＩで切断し、さらにその切断部位にアダプターをライゲートしたものを増幅するために、アダプター部位配列に相補するフォワードプライマー、上記実施例１で得られた４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列を考慮して設計したリバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを設定する。
【００７２】
上記フォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いるＴａｑＭａｎＰＣＲ法を実施する。これにより、例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターのＮｏｔＩサイトのうちどのくらいのＤＮＡが脱メチル化しているかを定量する（ＮＣ−１）。癌部および非癌部組織についてＮＣ−１を測定し、当該測定値の癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することにより、癌化することでどのくらいＤＮＡの脱メチル化の頻度が増加するかを癌患者毎に検討することが可能となる。
【００７３】
ＮＣ−２は、上記実施例１で得られた４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列の数を指す。より具体的には例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターの中のＤＮＡ配列となる。これは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列とは無関係(制限酵素ＮｏｔＩ認識配列とは異なるオリゴヌクレオチド)の配列部位に相補するフォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを設定し、上記フォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いてＴａｑＭａｎＰＣＲ法を実施することによって、例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターの数を定量することができる(ＮＣ−２)。
【００７４】
癌部および非癌部組織についてＮＣ−２を測定し、癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することにより、また上記の結果とあわせて（ＮＣ−１／ＮＣ−２）×１００を求めることにより、セントロメトリックＮｏｔＩクラスターのうち何％のＤＮＡが脱メチル化しているかを測定することが可能となる。
【００７５】
実施例３
ａ）診断用ＤＮＡ繰り返し配列の取得及びアダプターのライゲーション
実施例１（ａ）で得られた癌部の１０μｇのゲノムＤＮＡに１０×緩衝液［500mM トリス-塩酸(pH7.5), 100mM MgCl2, 10mM DTT, 1000mM NaCl, 0.01 % BSA, 0.01 % TritonX-100］、１.５μｌ(15単位)の制限酵素ＮｏｔＩ、及び蒸留水を適当量加えて全量を１００μｌとし、３７℃で一晩インキュベーションを行なった後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒（２５／２４／１）で２回抽出処理を繰り返した後、１００％エタノールを加えて穏やかに混合した後、15000rpm、１０分間冷却遠心した後、上清を捨てて、所望のＤＮＡペレットを回収し、風乾などで乾燥した後、少量(1ml)のＴＥ液(10mMトリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTA)に溶解し、ＤＮＡの濃度を測定した後４℃で保存した。
【００７６】
次いで、上記で得られたＮｏｔＩ切断ＤＮＡ（１μｌ）、１μｌ（10μM溶液）のＮｏｔＩ切断末端接合アダプター（下線領域：ＮｏｔＩ認識部位）：
5'-ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGC :配列番号１１
TGCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCGCCGG-5' ：配列番号１２
及び０.５μｌの大腸菌リガーゼ（Takara製)、１μｌのリガーゼ緩衝液［660mM トリス-塩酸, 66mM MgCl2, 100mM DTT］、及び蒸留水を加えて全量を１０μｌとし、１６℃で一晩インキュベーションを行なった後、３０μｌのＴＥ溶液を追加し、全量を４０μｌとした。次いでスピンカラム(Ｓ−３００：アマシャムファルアｍシアバイオテク社製)にて精製し、アダプターが連結されたＤＮＡ濃度を測定した。
【００７７】
ｂ）プローブ、プライマーの調製
以下のＮＣ−１検出用として、フォワードプライマー用に配列番号５で示される１７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、リバースプライマー用に配列番号７で示される２３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブ用に配列番号６に示される２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを化学合成した。
【００７８】
また、ＮＣ−２検出用として、フォワードプライマー用に配列番号８で示される２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、リバースプライマー用に配列番号１０で示される２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブ用に配列番号９に示される２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを化学合成した。上記プローブについては、２つとも５’末端にＦＡＭを３’末端にＴＡＭＲＡを上記文献記載の方法により結合し、標識プローブとした。
【００７９】
ｃ）ＴａｑＭａｎＰＣＲ
上記各プライマー及びプローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲは、ABI PRISM7700Sequence Detection System(ＰＥバイオシステムズ社製)を用いて、該装置の取り扱いマニュアルに従い、以下の条件で実施した。
【００８０】
上記(a)で得られたＮＣ−１測定用検体ＤＮＡの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−１用フォワードプライマー及びリバースプライマーを各々３００ｎＭ(10μM 溶液で1.5μl)、ＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブを２００ｎＭ(10μM 溶液で1μl)に調製した後、２５μｌのTaqMan Universal PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)及び蒸留水を適量加えて、全反応容量５０μｌに調製した。
【００８１】
ついで、(a)で得られたＮＣ−２測定用検体として、アダプターの付いていないＮｏｔＩ切断ＤＮＡの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−２用フォワード、リバース・プライマー各々３００ｎＭ(10μM溶液で1.5μl)、ＮＣ−２用ＴａｑＭａｎプローブを２００ｎＭ(10μM溶液で1μl)に調製した後、２５μｌのTaqMan Universal PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)及び蒸留水を適量加えて、全反応容量５０μｌに調製した。
【００８２】
反応条件は、５℃で２分プレインキュベーション、９５℃で１０分の変性に続いて、９５℃で１５秒、６０℃で１分の反応を５０サイクル行なった。検量線用ＤＮＡ(１０ｎｇ／μｌ)は、１００倍ずつ原液から１０8倍の５段階希釈した。
【００８３】
(a)得られた測定用検体とともに１サンプルについて、ＮＣ−１用、ＮＣ−２用に調製された反応溶液［５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１μｌの１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１μｌの１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１．２５μｌの２０ｍＭ ｄＵＴＰ、０．５μｌのＤＮＡポリメラーゼ(AmpliTaqGold:５Ｕ／μｌ)、０．５μｌのAmpEraseM：商品名 UNG(１Ｕ／ｍｌ)、及び５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２３．４３μｌの滅菌蒸留水］を加えて同時に測定した。
【００８４】
ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定し、蛍光強度の変化を縦軸に、サイクル数を横軸にとってプロットした。試料中のＤＮＡのコピー数の常用対数と蛍光強度の急激な増加が始まる閾値を越えたサイクル数との間には直線関係があり、このサイクル数を測定することにより、被検試料中の所望のＤＮＡを定量測定できる。これらＰＣＲ反応により得られた結果の解析は、上記装置に付属の解析用ソフトウェア(Sequence Detector)で解析を行なった。
【００８５】
その結果、各々のサンプルにおける所望の初期ＤＮＡ量は、検量線用ＤＮＡ標準物質を用いた検量線より算出される。かくして得られた癌部組織の検体中の脱メチル化ＤＮＡ数(NC-1)の値及び検体中のＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の値を下式に当てはめて、検体中のＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化ＤＮＡ数の比率を算出した。
【００８６】
式： （ＮＣ−１／ＮＣ−２）ｘ１００（％）
術後癌患者３４例の式（１）で得られた値のうち、該値が１％未満の患者８例と値が１％以上の患者２６例の患者の２群に分けて、術後の累積無再発生存率を比較検討した。有意差検定は、スチューデントのＴ−テスト(Student's t-test)を用いて群間比較を行なった。
【００８７】
その結果である癌部に関するＮＣ−１／ＮＣ−２（％）の術後無再発曲線を図１に示す。該図のうち、縦軸は各群の累積無再発生存率を、横軸は無再発期間(ヶ月)を示す。図１に示されるように、値が１％以上の患者群は、値が１％未満の患者群と比較すると有意に術後の累積無再発生存率が低いことが分かる(p=0.012)。
【００８８】
上記の結果から、癌部抽出されたＤＮＡ検体から、少量のＤＮＡで短時間に簡便に癌患者の予後の診断が可能となり、手術前後の患者の治療方針を立てるうえで臨床上有用な情報を得ることができることがわかる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、癌患者の手術前の生検検体や手術中に得られた癌部組織より得られた検体から癌患者、特に肝癌患者の手術後の予後の治療方針の決定に役立つ患者の予後予測を可能とした診断方法が提供される。
【００９０】
本発明者により、癌患者より得られたＤＮＡ中の繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、癌患者の予後が良好か否かを診断する方法が提供される。癌患者、特に肝癌患者より抽出したＤＮＡサンプルを定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を用いて短時間に簡便な方法で癌患者の術後の予後の診断を可能とする方法を提供され。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例３の結果であって、術後癌患者の累積無再発生存率を、（NC-1／NC-2)×100（％）の値が１％未満のケースと１％以上のケースとを比較して示す図面である。
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌患者の手術の予後が良好か否か、具体的には癌再発の危険性を判定するのに有用な方法に関する。さらに本発明は当該方法に用いられるＤＮＡマーカー配列、及びオリゴヌクレオチドに関する。本発明の方法によれば、治療前に予め被験者（患者）の癌再発の確率が予測できるので、これを参考にして個々の患者に適した治療方法並びに治療後のアフターケアを検討することが可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
癌患者の治療（手術）後の癌再発の有無を予想することは臨床的に大変重要なことである。このため従来より、癌患者の遺伝子異常を中心に種々の因子について研究されており、食道癌や乳癌ではc-erb Ｂ癌遺伝子及びint-２癌遺伝子の増幅が癌の再発・転移などの臨床特性と相関するという知見から、当該癌遺伝子がマーカーとして癌患者の治療予後の判定に利用されている。例えば、食道癌では、ｃ-erbＢ癌遺伝子増幅症例及びint-２癌遺伝子増幅症例では術後累積生存率が低く、さらにint-２癌遺伝子増幅症例では、高い確率で術後遠隔臓器への転移が認められている。しかしながら、肝細胞癌症例においては既知の癌遺伝子の増幅と再発・転移や術後累積生存率などの臨床特性との間に密接な相関関係は見出されておらず、従来報告されている遺伝子異常だけでは、正しく患者の手術後の予後を判断することが出来ない。
【０００３】
ところで、ミワらによって、ＲＬＧＳ法（Hatada, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9523-9527 (1991)）を用いて、ヒト癌細胞株からＤＮＡを検出し、染色体8q21に局在する200コピーの13ｋｂの核酸中の繰り返し配列の一部分が明らかにされ、該繰り返し配列中に生じるＮｏｔＩ制限酵素の認識部位における脱メチル化現象が幾つかのタイプの癌の発生または進展に関連しているという可能性が報告されている（Miwa,W.,et al. Electrophoresis, 16 (2) 227-232(1995))。
【０００４】
また、ナガイらによって、同じくＲＬＧＳ法を用いて、ヒト肝細胞癌(HCC)患者の癌組織検体からＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有する1.4ｋｂのＤＮＡ繰り返し配列を有する新規遺伝子（ＤＥ−１）が単離された。該DE-1遺伝子は、健常なヒト肝細胞においてはメチル化されていたが、ヒト肝細胞癌においては高い頻度を持ってＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基で脱メチル化されており、この遺伝子領域のＤＮＡ低メチル化が細胞の分子量化と肝癌発生の両方において何らかの役割を演じているという可能性が報告されている(Nagai, H.,et al.，Gene, 237 (1) 15-20 (1999))。
【０００５】
そして、本発明者らもまた、同じくＲＬＧＳ法により、肝癌患者のＤＮＡを制限酵素NotI−PvuIIで切断し、更にPstIでイン・サィツゥ(in situ)に切断した断片をポリアクリルアミドゲルにて分離して得られるスポットの変化数が肝癌患者の術後の予後と相関していることを報告している(Itano, O., et al., Oncogene, 19, 1676-1683 (2000))。
【０００６】
一方、遺伝子断片を大量に増幅する方法であるＰＣＲ法は、組織中ＲＮＡの発現量やウイルスＤＮＡ量などを定量測定する方法としても応用され、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブを用いてＰＣＲ反応をリアルタイムでモニターしたカイネティックス分析により、２倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量ＰＣＲ法が開発されている(均質検定システム：特許登録番号第2825976号、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User's Manual: 5.10.5.13(1996))。
【０００７】
当該定量ＰＣＲ法は、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（TaqManＰＣＲ法）と呼ばれ、各種ウイルス遺伝子の測定に応用されている(ＥＢウイルス遺伝子：特開平11-137300号、ＨＣＶウイルス遺伝子：特開平11-103899号、ＨＢＶウイルス遺伝子：特開平11-103897号)。さらに該方法は、男女のＸ染色体の差や癌抑制遺伝子の欠失の判定に応用され(Boulay, J.L., et al., Biotechniques, 27, 228-230 (1999))、また末梢血から抽出したＤＮＡによって癌家系内の保因者同定が、ＬＯＨ法やＦＩＳＨ法より簡便に行えることも報告されている(Laurendaeau, I., et al., Clin. Chem., 45(7) 982-986 (1999))。
【０００８】
ヒト癌領域においては、このTaqManＰＣＲ法を用いることにより、サンプル中のＤＮＡの非メチル化、メチル化を簡単に測定できることが報告されている(Eads, CA. et al., Nucleic Acids Res.,28(8) E32 (2000): MethyLight : a high-throughput assay to measure ＤＮＡ methylation.)。
【０００９】
しかしながら、癌患者、特に肝癌患者の術後の予後の判定には、上記ＲＬＧＳ法は、２度の制限酵素消化、ゲル電気泳動並びに放射線標識したｄＮＴＰｓ或いはハイブリダイゼーション・プローブなど、手間のかかる操作が必要であるため、簡便な方法とは言い難い。
【００１０】
また、従来メチル化または脱メチル化の程度の検出は、例えば癌部と非癌部の２種類の組織を対象として両者のメチル化または脱メチル化の程度を比較することによって行っていた。しかしこの方法は、用いる組織によってＤＮＡ増幅に違いがあるため（例えば、癌部ではメチル化または脱メチル化部位が増幅しているのに対し、非癌部では増幅していない等の相違）、単純な方法で、メチル化または脱メチル化の程度を比較することができないという問題があった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、癌疾患に関して上記従来の問題を解決し、少量のＤＮＡサンプルを用いて短時間で簡便な操作で癌患者の治療予後の診断を可能とする方法を提供することを目的とする。具体的には、本発明は癌組織中のＤＮＡのメチル化または脱メチル化の程度を簡便な方法で精度良く測定することにより、癌の予後を診断する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、癌患者の手術後の治療方針を判断したり決定するのに役立つ臨床上重要な情報を取得するのに有用な診断・判定方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意研究した結果、癌部組織より得られるＤＮＡくり返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの数と癌治療の予後（癌再発の確率）との間に一定の相関関係があることを見いだし、当該脱メチル化ＤＮＡの数を指標にすることによって癌患者の手術の予後が良好か否かを、手術前に予め診断できることを確認した。そして、本発明者は、当該方法を実施することによって得られる情報は、癌患者、特に肝癌患者の手術方法並びに手術後の治療方針（アフターケア）を判断し、かつ決定することに有効に役立つことを確信して、本発明を完成するにいたった。
【００１３】
即ち本発明は下記（１）〜（１４）に掲げる、癌患者の予後を診断する方法である：
（１）癌部または非癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、該ＤＮＡ数に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
（２）ＤＮＡ繰り返し配列がセントロメリック・クラスター領域、またはタンデムリピート領域に由来するものである、（１）記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（３）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数をＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用いて検出・測定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（４）ＤＮＡ繰り返し配列がメチル化感受性制限酵素認識部位を有するものであることを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（５）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ及びＳｆｉＩよりなる群から選択されるいずれかの制限酵素から選択されるものである、（４）記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（６）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩであることを特徴とする、（４）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（７）ＤＮＡ繰り返し配列が配列番号１〜４に示されるＤＮＡ配列のいずれか少なくとも１つのＤＮＡ配列であることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（８）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターをライゲーションし、このアダプターのＤＮＡ配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできるリバース・プライマーを用いて、メチル化感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定したプローブにより増幅したＤＮＡを定量することによって、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数(NC-1)を定量する工程ａ：
ＤＮＡ繰り返し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない部分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を定量する工程ｂ：並びに
工程ａで定量した脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃからなり、
工程ｃによって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
（９）配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとして、配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとして用いて工程ａを行い、また配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとして、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとして用いて工程ｂを行うことを特徴とする、（８）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１０）脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕が１％未満の場合を癌患者の予後が良好とし、１％以上を予後不良として判断することからなる、（８）または（９）に記載の癌疾患の手術の予後を診断する方法。
（１１）癌が非上皮系癌細胞に起因する癌である（１）乃至（７）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１２）癌が肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病よりなる群から選択されるいずれかである、（１）乃至（１０）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１３）癌が肝細胞癌である（１）乃至（１０）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
（１４）癌治療の手術前に実施することを特徴とする、（１）乃至（１３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
【００１４】
また本発明は、癌疾患の予後を診断するために用いられるＤＮＡマーカー配列であり、これらとしては配列番号１〜４に記載されるオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００１５】
さらに本発明は、上記（８）に記載の癌疾患の予後を診断する方法に用いられるヌクレオチドのセットであって、かかるヌクレオチドとして下記のものを例示することができる：
＜工程ａ＞
フォワードプライマー：配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド、
プローブ ：配列番号６で示されるオリゴヌクレオチド、
リバースプライマー ：配列番号７で示されるオリゴヌクレオチド、
＜工程ｂ＞
フォワードプライマー：配列番号８で示されるオリゴヌクレオチド、
プローブ ：配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド、
リバースプライマー ：配列番号10で示されるオリゴヌクレオチド。
【００１６】
本発明によれば、同一組織（癌組織）を対象として、これから得られるＤＮＡの繰り返し配列中のメチル化部位又は脱メチル化部位の数と、ＤＮＡ繰り返し配列の数を比較することによって得られる情報に基づいて、癌患者の治療後（手術後）の予後が良好か否か、再発がないか否かを、簡単に且つ高い信頼性をもって判断することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明の方法において、検出用に用いられるＤＮＡは、ヒト癌患者より得られる癌組織または非癌組織から常法により取得でき、例えば組織をプロティナーゼＫにより溶解し、フェノール−クロロホルムにより分離しエタノールにより抽出されたＤＮＡを用いることができる。該ＤＮＡの抽出は、癌患者の癌診断後の治療開始前或いは手術前に患者の生検組織から抽出されたＤＮＡ、或いは手術中に摘出された癌部または非癌部の組織から抽出されたＤＮＡ、或いは末梢血液から単離されたＤＮＡを用いることができる。後記実施例に示されるＴａｑＭａｎＰＣＲを用いる場合、例えば肝細胞癌の患者の場合は手術前に予め生検組織から所望のＤＮＡが取得できるため、本発明の方法から得られる情報が手術後の予後の治療方針の決定には勿論、手術そのものの方針の決定に重要な情報となり得る。
【００１８】
本発明において、検出するＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡは、上記ヒト組織から得られたＤＮＡを脱メチル化ＤＮＡの配列を認識するメチル化感受性認識制限酵素を用いて消化することによって取得できる。ここでメチル化感受性認識制限酵素としては、制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ 及びＳｆｉＩなどが例示できるが、特に制限酵素ＮｏｔＩが好適に例示される。
【００１９】
また、本発明の診断方法において、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定する領域は、検体中のＤＮＡ配列中で数百塩基から数千塩基からなるＤＮＡ配列が繰り返されてなる領域、すなわちＤＮＡ繰り返し配列断片の領域である。本発明の方法は、このＤＮＡ繰り返し配列に存在する脱メチル化ＤＮＡの数を検出することを含むため、本発明が対象とするＤＮＡ繰り返し配列は、数百塩基から数千塩基のＤＮＡ配列が繰り返されるＤＮＡ配列であれば、何れのＤＮＡ繰り返し配列領域であってもよく、例えば、セントロメリック・クラスター領域、またはタンデムリピート領域などが例示できる。より具体的には、例えば前記ＤＮＡ繰り返し配列として配列番号１〜配列番号４に示されるＤＮＡ配列が例示できる。また本診断方法で用いられる検出方法は、前記ＤＮＡ繰り返し配列中に含まれる脱メチル化ＤＮＡの数が測定できる方法であるかぎり、特に制限されない。
【００２０】
例えば検出方法として、サザンハイブリダイゼーション法、ＴａｑＭａｎプローブを用いる定量的リアルタイムＰＣＲ検出法などが例示できる。ここで、サザンハイブリダイゼーション法においては、例えば患者の癌部及び非癌部組織からＤＮＡを取得した後、ＮｏｔＩ等のメチル化感受性認識制限酵素で消化してＤＮＡ断片を得、電気泳動した後、得られた脱メチル化ＤＮＡ配列（ＧＣリッチＤＮＡ配列）を標識してプローブとして、これをハイブリダイズさせて目的のＤＮＡ断片を検出する方法を用いることができる。
【００２１】
また、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法によれば、癌部組織のみを用いて目的のＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定することにより、本発明の診断方法を実施することができる。定量的リアルタイムＰＣＲ検出法は本質的には、公知の方法、例えば特許第2825976号公報に記載の方法に従うか、ＰＥバイオシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決定システム・ユーザーマニュアルに従い実施できる。
【００２２】
かかる定量的リアルタイムＰＣＲ検出法において用いられる、プライマーとしては特に制限されないが、例えばフォワード・プライマーとして、配列番号５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙げることができる。該プライマー配列は、癌患者の組織検体から制限酵素で切断され単離されたＤＮＡ繰り返し配列に含まれる脱メチル化ＤＮＡの近傍配列を認識できる配列であれば、特に制限されず、例えばメチル化感受性制限酵素が認識するＧＣリッチなＤＮＡ配列を認識するプライマー配列からなる、連続する約１５〜４０塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２３】
より具体的にはメチル化感受性制限酵素、例えばＮｏｔＩ(GCGGCCGC配列を認識)などの制限酵素により切断されるＧＣリッチな領域(ＤＮＡ配列中、シトシン(C)とグアニン(G)の含量が多い領域)であって、ＤＮＡの脱メチル化が生じているかを知り得る配列を挙げることができる。尚、本発明においては、メチル化感受性制限酵素として上記ＮｏｔＩのほか、ＢｇｌＩ、ＦｓｅＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｆｉＩなどの８塩基の配列を認識する制限酵素が好ましく例示される。
【００２４】
上記のようにフォワード・プライマーとしては、好ましくは、例えばＤＮＡ繰り返し配列を有するセントロメリック・クラスター(Centromeric Not I cluster )領域、タンデムリピート領域中に存在するメチル化感受性制限酵素認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドが挙げられ、具体的には配列番号１〜４に示されるＤＮＡ配列の中に存在するメチル化感受性制限酵素認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドを例示することができる。
【００２５】
本発明においては、具体的には後記実施例に示すように手術によって摘出された癌部組織より抽出されたＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、得られたＤＮＡ断片に大腸菌リガーゼを用いてアダプターをライゲーションするが、フォワード・プライマーとしては該アダプター部位のＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドを例示できる。かくしてＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列が検出可能なフォワード・プライマーを作成することができる。
【００２６】
一方、リバース・プライマーは、前記フォワード・プライマーを５’側に結合するプライマーとして用いて、上記ＤＮＡの繰り返し配列を含めてＰＣＲ反応によりＤＮＡの繰り返し配列が増幅できるプライマー配列を有するものであれば特に制限されない。この限りにおいてそのＤＮＡ配列は制限されないが、例えばセントロメリック・クラスター領域の３’側に相同する配列からなる連続する約１５〜４０塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが好適であり、具体的には配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが例示できる。
【００２７】
プローブは、ＤＮＡ繰り返し配列においてフォワード・プライマーとリバース・プライマーの両者で挟まれる、いわゆるこれらのプライマーが結合する位置の内側に位置するＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレオチドであれば限定されない。一例として本発明の実施例において示すようには、ＧＣリッチな領域であって、ＤＮＡの脱メチル化が生じていると考えられているセントロメリック・クラスター領域内に存在するＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドからなる連続する約１５〜４７塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを好ましく例示できる。
【００２８】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法においては、増幅されるＤＮＡ配列は、癌の手術前の生検時に得られた癌部組織、または手術後の癌患者の癌部またはび非癌部組織、好ましくは、特に肝癌の患者の手術によって摘出された癌部の組織より、常法により抽出されたＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、該ＤＮＡ断片に大腸菌リガーゼ等のリガーゼを用いてアダプターをライゲーションしたＤＮＡ配列がその対象ＤＮＡ配列として好ましく例示できる。
【００２９】
本発明においてプローブとして、例えば配列番号６で示される塩基配列のうち連続する１５〜４７塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されてなるものを使用することもできる。ここでレポーター蛍光色素は、レポーター蛍光色素がクエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍光強度が抑制されないものである。すなわち、上記プローブは、定量的リアルタイム検出ＰＣＲ法において、癌患者のＤＮＡのＤＮＡ繰り返し配列中に、脱メチル化がどの程度生じているかを知る、脱メチル化ＤＮＡ配列の測定用プローブである。
【００３０】
本発明は、具体的には下記の工程を有する癌疾患の予後を診断する方法を提供する：
癌患者の癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターをライゲーションし、これを鋳型として、上記アダプターに対して相補的なＤＮＡ配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできるリバース・プライマーを用いて、メチル化感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定したプローブにより増幅されたＤＮＡを定量することによって、脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)を定量する工程ａ：
ＤＮＡ繰り返し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない部分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を定量する工程ｂ：並びに
工程ａで定量した脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃ、
工程ｃによって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。
【００３１】
上記の診断方法において、例えば工程ａにおいては前述するフォワード・プライマー、リバース・プライマー及びプローブとを用い、測定すべき癌組織、特に肝癌患者の当該癌部組織から得られるＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩ消化して得られるＤＮＡ繰り返し配列を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタイムに測定することによって被検サンプル中のＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数が定量され、また工程ｂにおいては、前記ＤＮＡ繰り返し配列のうち、制限酵素ＮｏｔＩ認識配列と一致しないＤＮＡ配列に対応する配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマー並びにリバース・プライマーとし、両者に挟まれるＤＮＡ繰り返し配列の内側のＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によりＤＮＡ繰り返し配列を増幅することによって検体中のＤＮＡ繰り返し配列が定量される
尚、ＤＮＡ繰り返し配列に結合するフォワード・プライマーとリバース・プライマーの距離は、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数とＤＮＡ繰り返しＤＮＡ配列の数とが検出できる範囲のＤＮＡ断片の増幅が出来る限り、限定されない。
【００３２】
工程ａにおいて用いられるフォワード・プライマーとしては配列番号５に示されるオリゴヌクレオチド、プローブとしては配列番号６に示されるオリゴヌクレオチド、リバース・プライマーとしては配列番号７に示されるオリゴヌクレオチドが好適に例示され、また工程ｂにおいて用いられるフォワード・プライマーとしては配列番号８に示されるオリゴヌクレオチド、プローブとしては配列番号９に示されるオリゴヌクレオチド、リバース・プライマーとしては配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドが好適に例示される。
【００３３】
本発明においては工程ａで得られる脱メチル化したＤＮＡ数と工程ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配列の数の比に基づいて、癌患者の予後が良好か否かを容易に診断することができる。具体的には、工程ａで得られる脱メチル化したＤＮＡ数を（ＮＣ−１）とし、工程ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配列の数を（ＮＣ−２）とした場合、
式：（ＮＣ−１）／（ＮＣ−２）×１００（％）
で脱メチル化の割合を算出し、かかる脱メチル化の程度を示す客観的な値に基づいて癌患者の予後を診断することができる。
【００３４】
例えば、実施例において例証するように、上記式で得られる脱メチル化の割合が１％未満の場合を癌治療の予後が良好であるとし、１％以上の場合を癌治療の予後が不良であるとして判定することが可能である。
【００３５】
よって当該判定は、臨床上の癌診断の後、癌患者に対する治療開始前、または手術前後に行うことが好ましく、得られた判定結果に基づいて癌治療の方針や手術後の治療やアフターケアの方法が検討され決定できる。
【００３６】
本発明が対象とする癌は、特に制限されないが、例えば非上皮系癌細胞に起因する癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等を挙げることができる。好ましくは非上皮系癌細胞に起因する癌、及び肝細胞癌である。
【００３７】
本発明においては、プローブのオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズするセントロメリック・クラスター領域は、上記５’側プライマーがハイブリダイズする領域と近接して一部重複しているが、実際に反応を行なう場合には、５’側プライマーとプローブのハイブリダイズする領域が互いに重複することがない組み合わせを選択する必要がある。
【００３８】
レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッセイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素としては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好ましい。これらの蛍光色素は公知であり、市販されているものを用いることができる。レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIyer et al., (1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に記載されている。
【００３９】
本発明の方法では、好適にはフォワード・プライマー（５’側プライマー）とリバース・プライマー（３’側プライマー）と上記蛍光標識されたプローブとを用い、被検体中のメチル化感受性制限酵素にて切断されたＤＮＡ断片中の測定すべきＤＮＡ配列中のＤＮＡ繰り返し配列を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液からのプローブに起因する蛍光をリアルタイムに測定する方法が好適に採用される。このリアルタイム検出ＰＣＲ法自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販されているので、このような市販の装置及びキットを用いて行なうことができる。
【００４０】
ＰＣＲ反応は、例えば患者の癌部組織または非癌部組織から抽出し得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡを上記フォワード・プライマー、リバース・プライマー及び上記プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む溶液を調製して行なう。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述されている。なお、被検試料としては、所望の遺伝子を含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例えば血清等の体液である。検体のＤＮＡの調製は、従来法に用いられるＰＣＲの場合と同様に行なうことができる。
【００４１】
ＰＣＲ反応では、例えば、癌患者の末梢血検体、或いは癌患者から摘出した癌部若しくは非癌部組織から市販のＤＮＡ抽出用キットなどで抽出されたゲノムＤＮＡを調製しそのまま増幅用ＤＮＡとするか、或いは検体から得られた組織をプロティンキナーゼＫにより分解し、フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により所望のＤＮＡを得ることができる。また、ｍＲＮＡの場合は、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが合成され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡの増幅が起きる。
【００４２】
増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮＡにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダイズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＴａｇＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブが５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プローブに結合し、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍光色素とが離れ、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中にＤＮＡ配列中繰り返し配列を有するＤＮＡ領域中の脱メチル化ＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されることもない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定することにより、被検試料中にＤＮＡ繰り返し配列領域内にある脱メチル化ＤＮＡの数を検出することが可能である。
【００４３】
本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣＲ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そして、被検試料中のＤＮＡ繰り返し配列領域内にある脱メチル化ＤＮＡ数が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被検試料中のＤＮＡの定量測定を行なうことができる。
【００４４】
より具体的には、例えば、被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域内に存在するＤＮＡ配列中にある脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列を含まないネガティブコントロールにおける各サイクル（例えば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍でよいかを閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超えるサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡを定量測定することができる。すなわち、既知濃度のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡ標準物質の常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を縦軸にとると、標準物質を用いた測定結果はほぼ完全に直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイクルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のセントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡの数を定量測定することができる。従って、本発明の方法によれば、従来のＲＬＧＳ法のように、複数の制限酵素処理やＲＩの使用が不要で、また通常のＰＣＲのように電気泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に簡便である。
【００４５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
１）１９９１年８月から１９９７年１２月までに肝細胞癌と診断された肝切除を施行された患者３４例を対象とし、切除した肝臓から肝細胞癌組織とそれに隣接した非癌様組織(非癌部組織)をＤＮＡ出抽用サンプルとして取得し、ＤＮＡ調製まで−７０℃にて凍結保存した。
【００４６】
患者は３ヶ月ごとに外来にて、フォローアップし、癌の再発は再手術、剖検、及び/またはルーチンの全身のコンピュータ断層撮影、核磁気共鳴イメージ、及び超音波造影を含むイメージ診断による発見に基づいて診断された。最大経過観察期間は、５０ヶ月で平均観察期間は、３２ヶ月であった。
【００４７】
ａ）ゲノムＤＮＡの調製
上記ＤＮＡ調製用凍結サンプルからスタフードらの方法に順じて単離した（Blln, ｎ.and Stafford,Ｄ.Ｗ., Nucleic Acids Res., 3, 2903-2308 (1976) )。即ち、上記で得られたＤＮＡ調製用凍結サンプル１ｇに対して（組織１ｇ）に氷冷したＴＮＭ溶液（20mM トリス−塩酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1.5mM MgCl2)を１０〜２０ｍｌ加えてホモゲナイズした後、試料を適当なチューブに移して、冷却遠心機で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した後、粗画分画のペレットを得、氷冷したＴＮＥ溶液（10mM トリス−塩酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1mM EDTA）を２０ｍｌ加え混合した後、１／２０容(1ml)の１０％ＳＤＳを加えて穏やかに混和した後、１／１００容(200μl)の１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加えて５０℃で４時間から一晩インキュベートさせた後、等量のフェノールを加え、さらに４時間から一晩にかけて穏やかに振盪した。３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、等量のフェノール-クロロホルム(1:1)を加え、３０分間程度振盪した後、水層を回収し、１／５０量の５Ｍ ＮａＣｌを加えた。次いで２〜２．５倍量の１００％エタノールを加えて穏やかに混合した後、−２０℃で１〜１５時間、または−７０℃で１０〜２０分間、ＤＮＡの収量を増やす為に冷却した。３０００ｒｐｍ、１０分間冷却遠心した後、上清を捨てて、所望のＤＮＡペレットを回収し、風乾などで乾燥した後、少量(1ml)のＴＥ液（10mM トリス−塩酸 (pH7.5)、1mM EDTA）に溶解し４℃で保存した。
【００４８】
また、ＤＮＡの調製は、組織を溶解した後、QIAampDNA MiniKit（QIAGEN社製)等を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出することによっても行うことができる。
【００４９】
ｂ）脱メチル化ＤＮＡを含むＤＮＡ繰り返し配列のクローニング
本発明者は、先に肝癌患者から、ＲＬＧＳ法(Hatada, I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9523-9527 (1991))を用いてＤＮＡサンプルを得て制限酵素ＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩ断片で切断し、ＮｏｔＩの５’末端をＰ３２で標識し、大きさで分離した後、ＰｓｔＩで更にイン・サイテゥ(in situ)に切断して、断片をポリアクリルアミドゲルにて分離し、変化の見られたスポットの数を分析し、癌部と非癌部のスポット数、スポットのパターンを複数症例を比較し、スポットの相違数と術後再発、累積生存率との相関関係を調査し、その数から患者を２層に分けて（16>=、15<）予後との相関検討し報告している（Oncogene, 19, 1676-1683 (2000)）。
【００５０】
更に共通して癌部に出現し、スポットの相違数とスポットの濃度に相関があるスポットがあるかどうかを以下の方法で検討した。
【００５１】
まず上記ａ）で得られた１００μｇのＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出した後、遠心分離し、得られた沈澱物を蒸留水に再懸濁させた。
【００５２】
次いでＮｏｔＩで誘導された５’末端を32Ｐで標識した。続いて制限酵素ＰｕＶＩＩでＤＮＡ断片を切断し、得られたＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩ／ＤＮＡ断片をアガロース電気泳動にかけ、さらにゲル中に分離されたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、標識ＤＮＡ断片は、多数のスポットとして二次元電気泳動図上に展開され、オートラジオグラフィーによって視覚的に検出できた。
【００５３】
その結果、多数のスポットの中からスポットの強度(濃度)の濃い興味ある部位が４箇所、３１例中１２例(38.7%)に見出された。
【００５４】
そして、スポットの強度比(癌部の濃度と非癌部の濃度)と累積生存率との相関関係をみると、強度比が１以下(17症例)と１以上(14症例)で累積生存率を見るとスポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が低下した。
【００５５】
また、癌部と非癌部間の変化したＲＬＧＳスポット数とスポットの強度(濃度)の濃い興味ある４つのスポット(スポットＡからスポットＤ)の強度の相関は、それぞれのケースにおけるスポットＡからスポットＤの４つスポットの２倍レベルの相対的密度で比較した(検定法:Spearman rank correlation coefficient)。その結果、これらのスポットの強度は、変化したＲＬＧＳスポット数と有意に相関していた(Spearman rank correlation coefficient：スポットA：0.650, p<0.0001：スポットB：0.712, p<0.0001 スポットC： 0.745, p<0.0001スポットD：0.704, p<0.0001)。さらにこれら４つのスポットの強度比(癌部の濃度と非癌部の濃度)と累積生存率との相関関係をみると、術後の再発が低いグループ(スポットの強度が２倍レベルより未満)と術後の再発が高いグループ(スポットの強度が２倍レベルより同等以上)で累積生存率を見るとこれら４つのすべてのスポットにおいて、スポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が有意に低下した(p<0.05)。
【００５６】
このように４つのスポットの変化の数およびスポットの強度(癌部の濃度と非癌部の濃度の比)と累積生存率が相関することから、これら４つのスポットにおけるＤＮＡの脱メチル化に関連する特徴的なＤＮＡ配列が存在するかどうかを検討することにした。
【００５７】
興味ある４つのスポットのＮｏｔＩ−ＰｓｔＩのＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片をゲルから切り出し、スポットＡ−Ｄとし、それぞれフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出し、ＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ／ＤＮＡ増幅の為にＮｏｔＩ−ＰｓｔＩＤＮＡ断片末端にＤＮＡアダプターをライゲートし、該ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。
【００５８】
そして得られた４つのスポットからのＰＣＲ産物を、ベクターpBluescriptIIを用いてクローニングを行なった。
【００５９】
クローンされた断片の核酸配列は、アプライド・バイオシステムズ・モデル３７７ＤＮＡシーケンサー(アプライド・バイオシステムズ社製)で配列決定した。
【００６０】
４つのクローンからの配列決定された核酸配列は、ジーンワークス・ソフトウェア(GENEWORKS software)を用いて分析し、相同性検索は、ＮＣＢＩ(the National Center of Biotechnology Information)のＢＬＡＳＴネットワーク・サービス(Altachul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990))を用いて実施した。
【００６１】
２つの核酸配列の間の相同性の調査は、Gentyx-Mac Version 10.1（SOFTWARE DEVELOPMENT CO., LTD., Tokyo, Japan）を使用して行なった。
【００６２】
上記で得られた４つのスポットＡ−Ｄの核酸配列情報から、配列番号１に示されるスポットＡに相当するクローンされた核酸配列は、１９９３年にウォングら(S. Wong, M.J. Wagner and D. Wells )によってヒト・タンデム繰り返し配列(Human tandem repeat sequence: HTRS )として、アクセッション番号Ｌ０９５５２としてＧｅｎｂａｎｋに登録されている１３キロ塩基対の繰り返しのあるユニットの一部分のそれと完全に一致していた。該ユニットは、ヒト染色体８ｑ２１上にあるタンデムにおいておよそ２００回繰り返されていると報告され、この断片はＲＬＧＳ法を用いた他のヒト癌において同定されていた(Miwa, W., et al., Electrophoresis, 16, 227-232 (1995): Thoraval, D., et al., Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-244 (1996) )。
【００６３】
次いで配列番号２に示されるスポットＢに相当するクローンされた核酸配列は、セントロメトリックＮｏｔＩクラスター(Centromeric Not I cluster: CNIC)として、アクセッション番号Ｙ１０７５２としてＧｅｎｂａｎｋに登録されている１４１５塩基対のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片の繰り返しのあるユニットの一部分のそれと完全に一致しており、この断片はＲＬＧＳ法を用いて肝細胞癌において既に特定されている(Nagai, H., et al., Gene, 237 (1) 15-20 (1999): Nagai, H., et al., DNA Res., 6 (4) 219-225 (1999) )。
【００６４】
相同性検索によれば、この断片はソラバル(Thoraval)らがＲＬＧＳ法を用いて神経膠芽腫から単離し、クローニングした断片の相補配列である(Thoraval, D., et al., Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-244 (1996))。また、該核酸配列は、染色体９、１３、１４、および２１のセントロメアの近傍のヒト１．４キロ塩基タンデムに繰り返された配列として、Genbankにアクセッション番号U59100として登録されていて、ＦＩＳＨ(Fluorescence in situ hybridization)を使用することによってアクロセントリックacrocentric染色体９、１３、１４、および２１のセントロメリックな領域上にあることが明らかになった。
【００６５】
また、配列番号３で示されるスポットＣに相当するクローンされた核酸配列は、スポットＢのそれと同一であった。該核酸配列は、ナガイらによってｃｏｓＤＥ−１としてコスミドクローンから単離された２．８キロ塩基対のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片のタンデム繰り返しされているアレイの一部分であった(Nagai, H., et al., Gene, 237(1) 15-20(1999))。該配列は、メチル化されたＮｏｔＩ配列間にある２つのセントロメトリックＮｏｔＩクラスター(2CNIC)の連結であることが考えられた。
【００６６】
一方、配列番号４で示されるスポットＤに相当するクローンされた核酸配列は、新規な配列で相同性ある配列はなかった。
【００６７】
上記のことから、ＨＴＲＳスポット、ＣＮＩＣスポット、および２ＣＮＩＣスポットの増大したシグナルは、対応している断片のＮｏｔＩの認識配列における脱メチル化に負わされることが明らかにされ、ＲＬＧＳプロファイルにおけるこれらのスポットの強度は、脱メチル化の量（数）を提供していることが確認された。
【００６８】
従って、配列番号１〜４に示されるそれぞれスポットＡ〜Ｄに対応するＤＮＡ繰り返し配列のいずれかの配列中のＮｏｔＩの認識部位における脱メチル化の量がこれらのスポットの強度に対応しており、即ち、術後の予後とスポットの強度の相関関係は、術後の予後とＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数との相関関係に置き換えることが可能となる。
【００６９】
このことから、上記４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化されたＤＮＡの割合を定量することで、所望の癌患者の術後の予後を判定することが可能となる。
【００７０】
実施例２ 癌疾患の予後の診断方法
癌患者の癌治療後（手術後）の予後を判定する上で、考慮される診断方法としては、少量の臨床サンプルを基に短時間で簡便な患者の予後診断が可能な方法、具体的には癌患者の手術前の生検検体や手術中に得られた癌部組織より得られた検体から癌患者、特に肝癌患者の手術後の予後の治療方針の決定に役立つ患者の予後予測を可能とする方法が望まれる。従って、本発明者は上記実施例１より得られた結果から、癌患者より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの数に着目し、該ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、癌患者の予後が良好か否かを診断する方法に適した方法を、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を利用して行った。
【００７１】
ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は公知の方法を用いて実施されるが、癌患者の癌部組織および非癌部組織から抽出されたＤＮＡをメチル化感受性制限酵素、本実施例においては制限酵素ＮｏｔＩで切断し、さらにその切断部位にアダプターをライゲートしたものを増幅するために、アダプター部位配列に相補するフォワードプライマー、上記実施例１で得られた４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列を考慮して設計したリバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを設定する。
【００７２】
上記フォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いるＴａｑＭａｎＰＣＲ法を実施する。これにより、例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターのＮｏｔＩサイトのうちどのくらいのＤＮＡが脱メチル化しているかを定量する（ＮＣ−１）。癌部および非癌部組織についてＮＣ−１を測定し、当該測定値の癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することにより、癌化することでどのくらいＤＮＡの脱メチル化の頻度が増加するかを癌患者毎に検討することが可能となる。
【００７３】
ＮＣ−２は、上記実施例１で得られた４つのスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列の数を指す。より具体的には例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターの中のＤＮＡ配列となる。これは制限酵素ＮｏｔＩ認識配列とは無関係(制限酵素ＮｏｔＩ認識配列とは異なるオリゴヌクレオチド)の配列部位に相補するフォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを設定し、上記フォワードプライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いてＴａｑＭａｎＰＣＲ法を実施することによって、例えばスポットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターの数を定量することができる(ＮＣ−２)。
【００７４】
癌部および非癌部組織についてＮＣ−２を測定し、癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することにより、また上記の結果とあわせて（ＮＣ−１／ＮＣ−２）×１００を求めることにより、セントロメトリックＮｏｔＩクラスターのうち何％のＤＮＡが脱メチル化しているかを測定することが可能となる。
【００７５】
実施例３
ａ）診断用ＤＮＡ繰り返し配列の取得及びアダプターのライゲーション
実施例１（ａ）で得られた癌部の１０μｇのゲノムＤＮＡに１０×緩衝液［500mM トリス-塩酸(pH7.5), 100mM MgCl2, 10mM DTT, 1000mM NaCl, 0.01 % BSA, 0.01 % TritonX-100］、１.５μｌ(15単位)の制限酵素ＮｏｔＩ、及び蒸留水を適当量加えて全量を１００μｌとし、３７℃で一晩インキュベーションを行なった後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒（２５／２４／１）で２回抽出処理を繰り返した後、１００％エタノールを加えて穏やかに混合した後、15000rpm、１０分間冷却遠心した後、上清を捨てて、所望のＤＮＡペレットを回収し、風乾などで乾燥した後、少量(1ml)のＴＥ液(10mMトリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTA)に溶解し、ＤＮＡの濃度を測定した後４℃で保存した。
【００７６】
次いで、上記で得られたＮｏｔＩ切断ＤＮＡ（１μｌ）、１μｌ（10μM溶液）のＮｏｔＩ切断末端接合アダプター（下線領域：ＮｏｔＩ認識部位）：
5'-ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGC :配列番号１１
TGCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCGCCGG-5' ：配列番号１２
及び０.５μｌの大腸菌リガーゼ（Takara製)、１μｌのリガーゼ緩衝液［660mM トリス-塩酸, 66mM MgCl2, 100mM DTT］、及び蒸留水を加えて全量を１０μｌとし、１６℃で一晩インキュベーションを行なった後、３０μｌのＴＥ溶液を追加し、全量を４０μｌとした。次いでスピンカラム(Ｓ−３００：アマシャムファルアｍシアバイオテク社製)にて精製し、アダプターが連結されたＤＮＡ濃度を測定した。
【００７７】
ｂ）プローブ、プライマーの調製
以下のＮＣ−１検出用として、フォワードプライマー用に配列番号５で示される１７ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、リバースプライマー用に配列番号７で示される２３ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブ用に配列番号６に示される２１ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを化学合成した。
【００７８】
また、ＮＣ−２検出用として、フォワードプライマー用に配列番号８で示される２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、リバースプライマー用に配列番号１０で示される２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブ用に配列番号９に示される２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを化学合成した。上記プローブについては、２つとも５’末端にＦＡＭを３’末端にＴＡＭＲＡを上記文献記載の方法により結合し、標識プローブとした。
【００７９】
ｃ）ＴａｑＭａｎＰＣＲ
上記各プライマー及びプローブを用いたリアルタイム定量ＰＣＲは、ABI PRISM7700Sequence Detection System(ＰＥバイオシステムズ社製)を用いて、該装置の取り扱いマニュアルに従い、以下の条件で実施した。
【００８０】
上記(a)で得られたＮＣ−１測定用検体ＤＮＡの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−１用フォワードプライマー及びリバースプライマーを各々３００ｎＭ(10μM 溶液で1.5μl)、ＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプローブを２００ｎＭ(10μM 溶液で1μl)に調製した後、２５μｌのTaqMan Universal PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)及び蒸留水を適量加えて、全反応容量５０μｌに調製した。
【００８１】
ついで、(a)で得られたＮＣ−２測定用検体として、アダプターの付いていないＮｏｔＩ切断ＤＮＡの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−２用フォワード、リバース・プライマー各々３００ｎＭ(10μM溶液で1.5μl)、ＮＣ−２用ＴａｑＭａｎプローブを２００ｎＭ(10μM溶液で1μl)に調製した後、２５μｌのTaqMan Universal PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)及び蒸留水を適量加えて、全反応容量５０μｌに調製した。
【００８２】
反応条件は、５℃で２分プレインキュベーション、９５℃で１０分の変性に続いて、９５℃で１５秒、６０℃で１分の反応を５０サイクル行なった。検量線用ＤＮＡ(１０ｎｇ／μｌ)は、１００倍ずつ原液から１０8倍の５段階希釈した。
【００８３】
(a)得られた測定用検体とともに１サンプルについて、ＮＣ−１用、ＮＣ−２用に調製された反応溶液［５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ ｄＡＴＰ、１μｌの１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１μｌの１０ｍＭ ｄＣＴＰ、１．２５μｌの２０ｍＭ ｄＵＴＰ、０．５μｌのＤＮＡポリメラーゼ(AmpliTaqGold:５Ｕ／μｌ)、０．５μｌのAmpEraseM：商品名 UNG(１Ｕ／ｍｌ)、及び５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２３．４３μｌの滅菌蒸留水］を加えて同時に測定した。
【００８４】
ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定し、蛍光強度の変化を縦軸に、サイクル数を横軸にとってプロットした。試料中のＤＮＡのコピー数の常用対数と蛍光強度の急激な増加が始まる閾値を越えたサイクル数との間には直線関係があり、このサイクル数を測定することにより、被検試料中の所望のＤＮＡを定量測定できる。これらＰＣＲ反応により得られた結果の解析は、上記装置に付属の解析用ソフトウェア(Sequence Detector)で解析を行なった。
【００８５】
その結果、各々のサンプルにおける所望の初期ＤＮＡ量は、検量線用ＤＮＡ標準物質を用いた検量線より算出される。かくして得られた癌部組織の検体中の脱メチル化ＤＮＡ数(NC-1)の値及び検体中のＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)の値を下式に当てはめて、検体中のＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化ＤＮＡ数の比率を算出した。
【００８６】
式： （ＮＣ−１／ＮＣ−２）ｘ１００（％）
術後癌患者３４例の式（１）で得られた値のうち、該値が１％未満の患者８例と値が１％以上の患者２６例の患者の２群に分けて、術後の累積無再発生存率を比較検討した。有意差検定は、スチューデントのＴ−テスト(Student's t-test)を用いて群間比較を行なった。
【００８７】
その結果である癌部に関するＮＣ−１／ＮＣ−２（％）の術後無再発曲線を図１に示す。該図のうち、縦軸は各群の累積無再発生存率を、横軸は無再発期間(ヶ月)を示す。図１に示されるように、値が１％以上の患者群は、値が１％未満の患者群と比較すると有意に術後の累積無再発生存率が低いことが分かる(p=0.012)。
【００８８】
上記の結果から、癌部抽出されたＤＮＡ検体から、少量のＤＮＡで短時間に簡便に癌患者の予後の診断が可能となり、手術前後の患者の治療方針を立てるうえで臨床上有用な情報を得ることができることがわかる。
【００８９】
【発明の効果】
本発明により、癌患者の手術前の生検検体や手術中に得られた癌部組織より得られた検体から癌患者、特に肝癌患者の手術後の予後の治療方針の決定に役立つ患者の予後予測を可能とした診断方法が提供される。
【００９０】
本発明者により、癌患者より得られたＤＮＡ中の繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、癌患者の予後が良好か否かを診断する方法が提供される。癌患者、特に肝癌患者より抽出したＤＮＡサンプルを定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を用いて短時間に簡便な方法で癌患者の術後の予後の診断を可能とする方法を提供され。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例３の結果であって、術後癌患者の累積無再発生存率を、（NC-1／NC-2)×100（％）の値が１％未満のケースと１％以上のケースとを比較して示す図面である。
【配列表】
Claims (2)
- 肝細胞癌疾患の予後を試験する方法であって：
肝細胞癌部組織より得られたゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ繰り返し配列をＮｏｔＩで切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターをライゲーションし、このアダプターのＤＮＡ配列を含む配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなるフォワード・プライマーと前記ＮｏｔＩで切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできる配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドからなるリバース・プライマーを用いて、ＮｏｔＩ認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定した配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブにより増幅したＤＮＡを定量することによって、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化したＤＮＡの数(NC-1)を定量する工程ａ；
ＤＮＡ繰り返し配列中のＮｏｔＩ認識部位を含まない部分に特異的な配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドからなるフォワード・プライマー、配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドからなるリバース・プライマー及び配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を定量する工程ｂ；並びに
工程ａで定量した脱メチル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)との比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃからなり、
脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100(％)〕が１％未満の場合には肝細胞癌疾患の予後が良好であり、１％以上の場合には予後不良であるという基準と比較することにより試験することを特徴とする方法。 - 前記工程ａのために用いられる前記アダプター、このアダプターのＤＮＡ配列を含む配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドからなるフォワード・プライマー、ＮｏｔＩで切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅することのできる配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドからなるリバース・プライマー、及びフォワード・プライマーとリバース・プライマーの間に設定した配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブ；並びに
前記工程ｂのために用いられるＤＮＡ繰り返し配列中のＮｏｔＩ認識部位を含まない部分に特異的な配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドからなるフォワード・プライマー、配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドからなるリバース・プライマー及び配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブを含む、
請求項１に記載の肝細胞癌疾患の予後を試験する方法のために用いられるキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000305246A JP4698008B2 (ja) | 2000-10-04 | 2000-10-04 | 癌疾患の予後判定法 |
Applications Claiming Priority (1)
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