JP2002543855A - Ｂａｔ−２６遺伝子座における変異を検出するアッセイを実施することによって結腸直腸疾患を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明の方法は、癌、前癌、および他の疾患または障害の指標マーカーについてのアッセイを含む。本発明のアッセイは、非侵襲性の方法または最少の侵襲性の方法によって、患者から得られた不均一なサンプルに対して実施される。そのようなアッセイは、単独でか、または他の疾患スクリーニング技術と組み合わせて使用され得る。本発明は、患者における結腸疾患または障害の存在を検出するための方法であって、その方法は、患者の組織または体液のサンプル中に存在する核酸のＢＡＴ−２６遺伝子座における変異を検出するアッセイを実施する工程および該変異についてのポジティブアッセイとして結腸疾患または障害を検出する工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （関連出願） 本願は、米国特許出願第６０／１３４，７１１号の利点を特許請求する。

【０００２】 （発明の分野） 本発明は、癌、前癌、または他の疾患もしくは障害を検出する方法に関し、そ
の方法は、使用のために有効な１つ以上の核酸マーカーを、単独でか、または他
の試験技術と組み合わせて検出するためのアッセイを実施する工程を包含する。

【０００３】 （発明の背景） 癌は、非制御化細胞増殖へ導く複数の遺伝子変異を代表的に含む多段階プロセ
スから起こるものと考えられる。多数の癌は、その発症が早期に検出された場合
、治癒可能である。例えば、結腸直腸癌は、代表的に結腸上皮において起こり、
そして発症の初期段階の間、広範に血管化されない（従って、侵襲性ではない）
。高度に血管化され、侵襲性となり、そして最終的な転移性癌への移行は、一般
的に１０年以上かかる。癌の存在が広範な血管新生の前に検出される場合、代表
的には外科的除去が効果的な治療である。しかし、結腸直腸癌は、しばしば臨床
的症状の発現（例えば、痛みおよび血便）においてのみ検出される。一般的に、
そのような症状は、その疾患が十分に確立されて、そしてしばしば転移が発生し
た後の場合においてのみ示される。同様に、前悪性の頸部病変の検出のためのＰ
ａｐ塗沫標本の例外について、癌の他の型についての診断スクリーニング方法が
、確立された疾患を検出する際に最良である。

【０００４】 癌についてのほとんどの診断アッセイは、侵襲性であるか、または少なくとも
不快感をともなう。侵襲性手順は、組織生検の実施から手術までの範囲にわたる
。癌スクリーニング手順は、著しい患者の不快感を頻繁に生じる。例えば、磁気
共鳴映像法は、その患者の拘束を必要とし、そして結腸鏡検査法は、鎮静を必要
とする。代表的な侵襲性スクリーニング方法に関連する不快感は、慣用的なスク
リーニング手順についての患者のコンプライアンスを減少させる。

【０００５】 代表的に、結腸直腸癌の有意な家族歴を有する患者（例えば、遺伝性非ポリー
プ症結腸直腸癌（「ＨＮＰＣＣ」）を有する患者）は、公知のアッセイを使用す
る、遺伝子検査を経験する。次いで検査が陽性である患者は、代表的に結腸鏡検
査法を経験する。しかし、検査が陰性である患者は、彼らが「危険にある」グル
ープの中にあるという事実が少しもなくとも、一般的にさらなる検査（すなわち
、結腸鏡検査法）を経験する。代表的な試験レジメンは、「危険にある」被験体
に対する結腸鏡検査法試験の間４年までが可能である。さらに、結腸鏡検査法検
査に関連する費用および不快感に起因して、結局試験を避ける非コンプライアン
ト患者集団が存在する。

【０００６】 侵襲性の試験を経験する患者に対してさえも、癌の効果的な検出が依然として
しばしば問題を提示する。例えば、可撓性Ｓ状結腸鏡検査法を使用して、結腸の
左側（遠位または低部末端）における癌のみを検出することが可能である。結腸
の右側（近位または上部末端）において発症した癌は、一般的にこの技術によっ
て検出されない。

【０００７】 感度および特異性の問題は、癌の早期検出のためのアッセイにおいて強調され
る。なぜなら、そのような早期の検出が実施される患者サンプルは、非癌性細胞
材料に対して代表的に比較的少量の癌性細胞材料を含むからである。多くの場合
において、患者サンプルは、多量の正常細胞および少量の癌性細胞の不均一な混
合物である。そのような不均一なサンプルの良い例は、糞便である。代表的な糞
便サンプルは、結腸上皮から脱落した細胞および細胞破片、消化の副産物および
細菌を含む。その初期の段階において、結腸直腸癌は、結腸上皮細胞のわずか約
１％に影響を及ぼすと考えられる。糞便サンプルの不均一なバックグランドにお
いて影響を受けた細胞の１％に由来する核酸を検出する任意の試みが、非常に低
い感度を生じ得る。他の不均一なサンプル（例えば、痰、膿、尿、乳頭または吸
引液）における癌の指標（ｉｎｄｉｃｉａ）の存在を同定する試みは、類似の問
題を示す。

【０００８】 最近、多数の遺伝子変異が、結腸の疾患または障害に関連している。例えば、
ＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋｒａｓオンコジーンおよびａ
ｐｃ腫瘍抑制遺伝子のＢＡＴ−２６セグメントにおける変化は、癌へともたらす
多段階経路に関与すると考えられる。それらの遺伝子における変異は、特定の型
の癌の初期段階についての分子スクリーニングアッセイのための基礎であるとい
うことが示唆されている。例えば、Ｓｉｄｒａｎｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
５６：１０２〜１０５（１９９２）を参照のこと。癌の指標である核酸マーカー
を同定および使用するための試みがなされてきた。しかし、そのようなマーカー
が見出されている場合でさえも、患者サンプル（特に、不均一なサンプル）をス
クリーニングするためにそのマーカーを使用することは、十分なサンプル材料を
入手することができないか、またはわずか１つのマーカーを測定することから生
じる低い感度のいずれかに起因して、失敗していることが証明されている。例え
ば、ある型の不均一なサンプル（糞便）から適切なヒトＤＮＡを簡単に入手する
ことが難しいことが証明されている。Ｖｉｌｌａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏ
ｌ．，１１０：１３４６−１３５３（１９９６）（全ての糞便標本わずか４４．
７％、および健康な個体に由来するわずか３２．６％の糞便が、変異分析のため
の十分なＤＮＡを産生したということを報告している）を参照のこと。適切なＤ
ＮＡが得られたという他の報告は、たった１つの癌関連変異に基づく患者の疾患
状態を同定する際の低い感度を報告してきた。Ｅｇｕｃｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ，
７７；１７０７−１７１０（１９９６）（癌に対するマーカーとしてｐ５３変異
を使用している）を参照のこと。

【０００９】 従って、特に不均一なサンプルにおいて、癌、前癌、および他の疾患または障
害の分子指標の検出のための、高い感度で高い特異性のアッセイの必要性が当該
分野において存在する。

【００１０】 （発明の要旨） 本発明の方法は、不均一なサンプルにおいて、癌、前癌、または他の疾患また
は障害の指標についてのアッセイにおいて、正確な結果を得るという問題に取り
組む。これらの方法は、他の侵襲性または非侵襲性検出技術と組み合わせて使用
される場合、増強された検出技術をさらに提供する。

【００１１】 本発明の方法は、ＭＳＨ２ミスマッチ修復遺伝子のＢＡＴ−２６セグメントに
おける変異が遺伝性癌（および前癌病変）と密接に関連しているという発見を活
用する。詳細には、ＢＡＴ−２６変異は、ＨＮＰＣＣと非常に関連しており（す
なわち、９０％よりの多くの患者において）、ＢＡＴ−２６を、この結腸直腸癌
または癌に発達し得るか、または発達し得ない結腸直腸腺腫を検出するためのス
クリーニングアッセイのための理想的なマーカーにしている。

【００１２】 本発明の目的のために、変異は、核酸における欠失、付加、置換、再配列また
は転座である。ヘテロ接合性の欠損は、ある対立遺伝子の全てまたは一部が欠失
している変異の１つの形態である。また、本発明の目的のために、用語「マーカ
ー」、「標的」および「変異」は、核酸（特にＤＮＡ）変異（置換、付加、再配
列、転座、欠失、一塩基多型など）、ならびに本発明の方法において有用な他の
核酸指標を含む。そのような指標としては、サンプル中の増幅可能な核酸の量、
サンプルにおける核酸の長さ、短核酸（およそ２００塩基対未満）に対する長核
酸の比率（およそ２００塩基対よりも大きい）、および癌を有する患者と疾患の
ない患者との間で異なる任意の他の核酸バリエーションが挙げられる。また、本
発明の目的のために、用語「健常な」または「疾患のない」とは、癌、前癌、ま
たは他の関連疾患もしくは障害を有しない患者を意味することが意図される。

【００１３】 １つの実施形態において、本発明は、患者における癌性病変または前癌性病変
の存在についてスクリーニングするためにＤＮＡマーカー、好ましくはＢＡＴ−
２６を利用することに関する。この患者は、彼らが「危険にある」グループ（特
に結腸直腸癌（詳細には、ＨＮＰＣＣ）の遺伝形態について）の一部であると考
えられる症状または病歴を有し得る。

【００１４】 さらに、ＢＡＴ−２６変異は、結腸の右手側（近位）に位置する癌に関連する
ことが見出されている。従って、本発明の方法は、患者をスクリーニングする組
み合わせ試験アプローチを利用することを意図し、ここでＢＡＴ−２６試験を使
用して結腸の右側をスクリーニングし、そして可撓性Ｓ状結腸鏡検査法を利用し
て結腸の左手側（遠位／低部）をスクリーニングする。そのような試験方法論は
、当該分野において実施された試験を使用して、以前に可能であったスクリーニ
ングよりも、癌性病変および／または前癌病変についてまたさらに徹底的なスク
リーニングを可能にする。従って、別の実施形態において、本発明は、結腸直腸
癌性病変または結腸直腸前癌性病変の存在を検出するための方法を提供し、その
方法は、（ｉ）患者から、非侵襲的または最少侵襲的に得られたサンプルにおい
て、サンプルにおけるＢＡＴ−２６マーカーを同定するアッセイを実施する工程
、および（ｉｉ）患者に対して可撓性Ｓ状結腸鏡検査法を実施する工程を包含す
る。

【００１５】 本発明の方法は、癌、前癌および他の疾患または障害（例えば、腺腫、ポリー
プ、炎症性腸障害、炎症性腸症候群、限局性腸炎、肉芽腫性回腸炎、肉芽腫性回
結腸炎、クローン病、回腸炎、回結腸炎、空回腸炎、肉芽腫性結腸炎、Ｙｅｒｓ
ｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ腸炎、潰瘍性大腸炎、偽膜大腸炎、過
敏性腸症候群、憩室症、憩室炎、腸管寄生生物、感染性胃腸炎、毒性胃腸炎、お
よび細菌性胃腸炎）を含むが、これらに限定されない結腸に関連する疾患または
障害を検出するために有用である。

【００１６】 本発明の方法はまた、不均一サンプル（例えば、糞便）の分析による癌性病変
および前癌性病変の検出に対するマーカーとしてＢＡＴ−２６の使用を提供する
。そのような方法は、患者から排出された糞便の代表的サンプルを得る工程およ
びサンプル中のＢＡＴ−２６マーカーを同定するためにそのサンプルに対してア
ッセイを実施する工程を包含する。

【００１７】 糞便は、本発明の方法が特に有用である不均一なサンプルの良い例である。代
表的な糞便サンプルは、患者の核酸を含むが、結腸内に見出される種々のヌクレ
アーゼおよびプロテイナーゼの溶解機能と一致する異種核酸、タンパク質および
他の細胞破片も含む。正常な環境下において、近位結腸から遠位結腸まで進むに
つれて糞便は固まる。結腸を通過して糞便が固まるにつれて、結腸上皮細胞は糞
便上に脱落する。患者が発達中の新生物形成を有する場合、新生物形成に由来す
る細胞もまた、糞便に脱落し、そしてそれらは（またはそれらの破片）は、疾患
の分子指標（例えば、ヘテロ接合性の変異または欠損）を含む。発症の初期段階
において、新生物形成の核酸指標は、排出された糞便中の核酸のうちわずか約１
％を含む。患者が未処置のままである場合、時間に比例して、より多くの疾患関
連核酸が糞便中に見出される。本発明の方法は、不均一なサンプル（例えば、糞
便）における初期段階の病変を検出するために有用である。本発明の方法は、初
期段階の疾患の検出のための高度の感度および特異性を生じる。本発明の方法は
、例えば、結腸における腺腫を検出する際に特に有用である。腺腫は、癌になる
可能性を頻繁に有する非転移性の病変である。患者における全ての腺腫が検出さ
れ、そして除去される場合、結腸直腸癌を発症している患者における完全治療の
可能性は、実質上ゼロである。

【００１８】 別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の事象を組み合わ
せた情報が、予め決定されたか、または所望されたレベルの情報を満たすか、ま
たは超えるように、癌、前癌、または他の疾患もしくは障害の指標である１つ以
上の変異事象を選択する工程を包含する。任意の変異または変異の組み合わせの
情報は、承認された侵襲性スクリーニング技術により確認され得る。例えば、結
腸直腸癌を検出するための方法において、分子アッセイの情報が、結腸鏡検査法
を使用する病変の同定によって決定され得る。

【００１９】 本発明の特定の好ましい実施形態の詳細な説明が以下に提供される。本発明の
他の実施形態は、以下の詳細な説明の概要に対して明らかである。

【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明の方法は、初期の段階の癌、前癌、または他の疾患もしくは障害の検出
のための、非侵襲性または最小侵襲性のアッセイを提供する。本発明の方法は、
不均一な生物学的サンプルにおける、癌または前癌の検出において、特に有用で
ある。好ましい方法は、患者サンプルにおいて、癌または前癌の指標の検出に対
して高い感度および高い特異性を提供する、１つ以上の核酸変異を同定する工程
を包含する。本発明の方法は、癌もしくは前癌に関する既知の情報を有する変異
を同定する工程を包含するか、あるいは癌の標準的なアッセイに関して選択した
変異、またはその変異を検出するためのアッセイを確認することに基づき得る。
好ましい方法は、ＢＡＴ−２６変異の検出を利用するアッセイを包含する。癌ま
たは前癌の存在の検出に対して高い感度／特異性を有する、癌または前癌のマー
カーを利用することによって、本発明の方法は、非侵襲性または最小侵襲性の分
子スクリーニングアッセイにおける改善を提供する。本発明の目的のために、非
侵襲性または最小侵襲性は、分析のための標本がいずれかの体液（例えば、糞便
、膿、痰、血液吸引液、またはリンパ）から得られることを示す。

【００２１】 本発明は、患者の糞便標本から調製したサンプルにおける、結腸直腸癌または
前癌の指標の存在を検出するための実験により、例示される。しかし、本発明の
方法が、種々の癌、前癌、ならびに他の疾患および障害を検出するために、種々
の異なるサンプルを使用して実施され得ることを、当業者は理解する。

【００２２】 結腸直腸癌または前癌（例えば、腺腫）の検出が例示される理由は、糞便標本
が、本発明の方法が特に有用である不均一な環境の良好な例であることである（
上記を参照のこと）。さらに、結腸鏡検査法（およびＳ状結腸鏡検査法、関連の
技術）は、高い感度および高い特異性を有する（が、高い費用および低い患者の
コンプライアンスを有する）周知の侵襲性の標準であり、これに対して、本発明
の方法が比較され得、そして確認され得る。

【００２３】 本発明の方法は、糞便標本から調製されたもののようなサンプルを、癌、前癌
、または他の疾患もしくは障害（例えば、結腸直腸の腫瘍または腺腫）の１つ以
上のマーカーの存在に関して、サンプルをスクリーニングする工程を包含し、そ
の結果、検出の感度が約５０％と約１００％との間であり、そして検出の特異性
が、約８５％と約１００％との間である。好ましい実施形態において、本発明の
方法は、感度および特異性の全体的な増加を達成するために、異なる型のアッセ
イを組み合わせる。従って、本発明の方法は、癌、前癌または別の疾患もしくは
障害と関連することが公知である変異に関するアッセイ、ならびに癌、前癌、ま
たは他の疾患もしくは障害と結び付いて生じることが予測されるＤＮＡの量およ
び／または長さに関するアッセイを実施することを包含して、両方のアッセイの
感度および特異性の組み合わせられた利点を得る。さらに、疾患または障害を検
出するために、複数の核酸分析を利用することの概念には、感度および特異性を
さらに増加させるために、各アッセイにおいて複数のゲノム標的を使用すること
が含まれる。しかし、以下に示すように、本発明の実施のためには、単一マーカ
ーのアッセイで十分である。

【００２４】 本発明に従って使用されるゲノム標的およびアッセイ方法は、感度および特異
性の所望されるレベル、ならびに検出が所望される疾患または障害の型に依存し
て、変動し得る。ゲノム標的（例えば、変異）が、それらの既知の感度または特
異性に基づいて、あるいはベースラインの感度および特異性を決定することによ
って、選択される。好ましい実施形態において、本発明の方法は、単一の有益な
遺伝子座における変異の検出を包含する。他の実施形態においては、有益な遺伝
子座に関するアッセイが、侵襲性技術に対して検出の改善された感度および特異
性を達成するために、組み合わせられる。従って、本発明の方法は、複数変異検
出、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（すなわち、サンプル中の増幅可能なＤＮＡの
量を決定するため）、配列特異的ハイブリッド捕捉、オリゴ連結、増幅難治性変
異系、一本鎖コンホメーション多型検出、配列決定、ミスマッチ検出、および一
塩基伸長から選択されるアッセイの組合せを意図する。代表的なアッセイは、共
有にかかる同時係属中の米国出願番号０９／３７１，９９１（本明細書中に参考
として援用される）に見出され得る。標的遺伝子座としては、染色体１、５、８
、１７、および１８、特に染色体５ｑ、染色体１７ｐ、染色体８ｐ、染色体１ｑ
、および染色体１８ｑが挙げられる。本発明の方法において使用するために好ま
しい遺伝子座としては、ｐ５３、ａｐｃ、ＢＡＴ−２６、および特定の疾患また
は障害を予測可能であることが疑われる他のものが挙げられる。本発明の方法に
おいて使用するために最も好ましい遺伝子座は、ＢＡＴ−２６である。

【００２５】 他の遺伝子が、直腸結腸癌に関連することが公知であり、そしてこれらの感度
および特異性が、文献により公知でない場合に、変異を有する腫瘍の百分率、お
よび十分に大きな種々の集団由来の、変異を有する健常な標本の百分率を決定す
ることにより、決定される。これは、実験的になされ得るか、または変異の存在
を、癌、前癌または別の疾患もしくは障害の存在に関連付けるデータに基づいて
、偽陽性および偽陰性のスクリーニング結果の尤度を予測するアルゴリズムを使
用して、数学的になされ得る。直腸結腸癌の場合には、患者の臨床状態の確認は
、結腸鏡検査法（これは、９５％の代表的感度および１００％の代表的特異性を
有する）のような標準的な試験により、達成され得る。

【００２６】 糞便サンプルの分析のために、本発明の好ましい方法は、米国特許第５，７４
１，６５０号および同第５，９５２，１７８号（これらの両方が、本明細書中に
参考として援用される）に教示されるように、排泄される糞便の少なくとも断面
または周囲部分を得る工程を包含する。糞便の断面または周囲部分が所望される
が、本明細書中に提供される方法は、排泄された糞便から得られるランダムなサ
ンプル（これは、スミアまたは掻き取り物（ｓｃｒａｐｉｎｇ）を含む）におい
て、実施される。一旦得られると、糞便標本が均一化される。均一化のための好
ましい緩衝液は、少なくとも１６ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を
含むものである。しかし、同時係属中の共有にかかる米国特許出願番号６０／１
２２，１７７（本明細書中に参考として援用される）に教示されるように、少な
くとも１５０ｍＭのＥＤＴＡの使用が、糞便からの核酸の収率を大きく改善する
ことが、発見された。従って、糞便の均一化のために好ましい緩衝液は、リン酸
緩衝化生理食塩水、２０〜１００ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌ、少なくとも１５
０ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに必要に応じて、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）およ
びプロテイナーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を含有する。

【００２７】 均一化の後に、核酸は、好ましくは、糞便サンプルから単離される。核酸の単
離または抽出は、本発明のすべての方法において必要とされるわけではない。な
ぜなら、特定の検出技術は、核酸を単離することなく、均一化した糞便において
十分に実施され得るからである。しかし、好ましい実施形態において、均一化し
た糞便は、核酸、タンパク質、脂質、および他の細胞破片を含む上清を作製する
ために、遠心分離される。この上清は、界面活性剤およびプロテイナーゼで処理
されて、タンパク質を分解され、そして核酸が、フェノール−クロロホルムで抽
出される。次いで、この抽出された核酸は、アルコールで沈殿される。他の技術
を使用して、核酸をサンプルから単離し得る。このような技術としては、ハイブ
リッド捕捉、および均一化された糞便からの直接の増幅が挙げられる。核酸は、
使用されるスクリーニングアッセイにより要求される程度まで、精製および／ま
たは単離され得る。

【００２８】 分析される核酸は、特定の変異と、癌、前癌、または他の疾患または障害との
間の既知かまたは疑われる関係に基づいて、選択される。所望であれば、配列特
異的ハイブリッド捕捉を使用して、特定の核酸をサンプルから単離する。標的核
酸が、当該分野の任意の方法により分析され得る。好ましい方法の例としては、
米国特許第５，６７０，３２５号（本明細書中に参考として援用される）に教示
されるような、ヘテロ接合性の損失の可算的分析が挙げられる。可算的方法は、
変異核酸の配列の知識を必要としない。むしろ、このような方法は、変更（欠失
、置換、付加、再配置、または他の変異）が野生型核酸中に存在したことを決定
する。調査される遺伝子座は、癌、前癌、または別の疾患もしくは障害に関連す
る変更の尤度に基づいて、選択される。可算的方法は、特定の疾患もしくは障害
において変更されないことが公知である野生型核酸のサンプルの数を、特定の疾
患もしくは障害において変更されることが公知であるかまたは疑われる野生型核
酸の数と、比較する。これら２つの数における統計学的に有意な差異は、陽性ス
クリーンを示す。

【００２９】 標的核酸における変異はまた、癌または前癌を示す一塩基改変体を同定するた
めに、一塩基伸長技術により測定され得る。好ましくは、一塩基伸長アッセイが
、共有にかかる同時係属中の米国出願番号０９／０６７，２１２（本明細書中に
参考として援用される）に教示されるように、サイクルされる。手短には、サイ
クルされる一塩基伸長反応は、検出されるべき単一の塩基を含む領域に対してす
ぐ５’側の核酸プライマーをアニーリングする工程を包含する。検出されるべき
単一の塩基は、変異に対するマーカーを提示する。変異は、単一の点変異であり
得るか、またはその単一の塩基がマーカーであるさらに大きな変異であり得る。
２つの別個の反応が、実施される。第一の反応において、プライマーが標的にア
ニーリングされ、そして検出されるべき単一の塩基において非野生型（例えば、
疾患を示す変異）改変体に相補的な標識された（好ましくは³²Ｐ）核酸、および
野生型塩基に相補的な標識されていないジデオキシ核酸が、合わせられる。プラ
イマー伸長は、野生型（ジデオキシ）塩基がプライマーに付加されると初めて、
停止する。伸長されたプライマーにおける標識の存在は、変異の存在の指標であ
る。第二の試験管である、陽性コントロールは、プライマーの存在下で、野生型
塩基に相補的な標識された核酸を含む。ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ^TM）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）が、プライマー伸長のために使用される。
好ましい実施形態において、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑまたは温熱
シークエナーゼ（ｔｈｅｒｍａｌ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ））が使用されて、より
効率的なサイクリングを可能にする。一旦、伸長反応が完了すると、標的核酸に
結合した第一および第二のプローブが、この反応混合物をそのハイブリッドの融
点より高い温度に加熱することにより、解離される。次いで、この反応混合物を
、このハイブリッドの融点より低温に冷却し、そしてさらなるプライマーを、別
の回の伸長反応のために、標的核酸と会合させる。好ましい実施形態において、
１０〜５０サイクルの伸長反応が実施される。最も好ましい実施形態において、
３０サイクルの伸長反応が実施される。全てのサイクルが完了した後に、伸長産
物が単離され、そして検出される。代替の実施形態において、ジデオキシヌクレ
オチド以外の連鎖停止方法が、使用され得る。例えば、連鎖停止は、プライマー
の、次に利用可能なヌクレオチドに組み込まれるために、さらなる塩基が利用可
能ではない場合に、起こる。

【００３０】 本発明の方法はまた、癌または線腫の指標である、集団サンプルにおける特徴
を同定するために、患者の集団をスクリーニングするために、有用である。例え
ば、本発明の方法は、患者サンプルのサブセットに存在する核酸変異体または多
型改変体を、これらの患者における疾患の存在と相関付けるために、患者の集団
の高感度な高特異的なスクリーニングを包含する。従って、本発明の方法は、患
者サンプルにおいてゲノムバリエーションを検出する工程、これらのバリエーシ
ョンを、確認した疾患と相関付ける工程、および確認した疾患と関連するバリエ
ーションを、引き続く患者サンプルにおける疾患についての診断スクリーンとし
て使用する工程を包含する。このような方法は、好ましくは、患者の同定した集
団（例えば、疾患、健常）由来の、プールしたサンプル（例えば、糞便サンプル
）において実施される。このような方法は、好ましくは、一塩基多型遺伝子座の
バリエーションに基づく。疾患の関数としての、これらの遺伝子座における改変
体の検出の感度および特異性が、決定される。規定のレベルの感度および特異性
において疾患を予測する遺伝子座が、未知の患者サンプルについてのスクリーニ
ングアッセイにおいて使用するために、選択される。

【００３１】 本発明の方法は、癌または前癌を検出するためのみでなく、特定の核酸マーカ
ーに関連し得る他の結腸の疾患または障害（腺腫、ポリープ、炎症性腸障害、炎
症性腸症候群、限局性腸炎、肉芽腫性回腸炎、肉芽腫性回結腸炎、クローン病、
回腸炎、回結腸炎、空回腸炎、肉芽腫性結腸炎、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒ
ｏｃｏｌｉｔｉｃａ腸炎、潰瘍性大腸炎、偽膜大腸炎、過敏性腸症候群、憩室症
、憩室炎、腸管寄生生物、感染性胃腸炎、毒性胃腸炎、および細菌性胃腸炎が挙
げられるがこれらに限定されない）を検出するためにもまた、有用である。

【００３２】 以下の実施例は、上記概念の特定の例示を提供する。以下に例示するアッセイ
は、説明の目的である。

【００３３】 （実施例１ − ＢＡＴ−２６マーカーを使用する癌検出の臨床試験） 糞便標本を、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ）において
結腸鏡検査法を実施するべきであることを示す症状または病歴を提示した、４０
の個体から収集した。各糞便サンプルを凍結させた。糞便サンプルを提供した直
後に、疾患状態を決定するために、全ての個体に結腸鏡検査法を実施した。結腸
鏡検査法は、患者の鎮静を必要とする侵襲性の試験であり、結腸新生物形成の診
断について、９５％に近い感度およびほぼ１００％の特異性を有する。結腸鏡検
査法の結果、および引き続く結腸鏡検査法の間に取った生検サンプルの組織学的
分析に基づいて、個体を以下の３つの群の１つに分類した：正常、癌、および腺
腫。腺腫、すなわちポリープは、それが１ｃｍ以上の直径を有するか否かに関し
て臨床的に考慮する。従って、腺腫の群の全ての個体は、直径が少なくとも１ｃ
ｍのポリープを有した。癌の群の患者は、癌として診断された腫瘍を有し、そし
て疾患のない個体は、結腸鏡検査法が癌の兆候も腺腫の兆候も示さなかった個体
であった。結腸鏡検査結果に基づいて、２１の患者が癌を有すると診断され、９
の患者が１ｃｍより大きな腺腫を有すると診断され、そして１０の患者には癌も
腺腫もなかった。

【００３４】 次いで、盲検の基礎で（すなわち、アッセイを行う科学者は結腸鏡検査結果も
組織学の結果も知らなかった）、各サンプルに対して複数変異分析を実施した。
７〜３３グラムの重量の各凍結した糞便標本を、解凍し、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ
、１６ｍＬ ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９．０）中で、容量対
重量の比約３：１でホモジナイズした。次いで、サンプルを同じ緩衝液中で再度
ホモジナイズして、最終的な容量対質量の比を２０：１とし、そしてガラスマク
ロビーズ中で２３５６×ｇで遠心分離した。上清を回収し、そしてＳＤＳおよび
プロテイナーゼｋで処理した。次いで、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽
出し、そしてアルコールで沈殿させた。この沈殿を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび
１ｍＭ ＥＤＴＡ（１×ＴＥ）（ｐＨ７．４）に懸濁させた。最後に、ＤＮＡを
Ｒｎａｓｅで処理した。

【００３５】 ヒトＤＮＡを、配列特異的ハイブリッド捕捉により、この沈殿物から単離した
。ｐ５３、Ｋ−ｒａｓ、およびａｐｃ遺伝子の部分に対するビオチニル化プロー
ブを使用した。

【００３６】 各プローブの１０μｌのアリコート（２０ｐｍｏｌ／捕捉）を、３１０μｌの
６Ｍ ＧＩＴＣ緩衝液の存在下、２時間、室温で、３００μｌ ＤＮＡを含む懸
濁液に添加した。ハイブリッド複合体を、ストレプトアビジンコーティングした
ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用して単離した。洗浄後、プローブ−ビーズ複合体を
、２５℃で１時間、０．１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させた。次いで、
この懸濁液を８５℃で４分間加熱し、そしてビーズを除去した。

【００３７】 次いで、捕捉したＤＮＡを、ＰＣＲを用いて、本質的に米国特許第４，６８３
，２０２号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、増幅し
た。

【００３８】 サンプルを、９４℃に５分間加熱し、次いで９４℃、６０℃、および７２℃の
間で（各１分間）４０サイクルを続け、続いて７２℃で５分間の１サイクルを行
った。

【００３９】 次いで、増幅した核酸サンプルを、電気泳動ゲル上で泳動し、そして増幅した
ＰＣＲ産物の大きさの差異を観察して、変異サンプルを検出した。

【００４０】 図１に示すように、９のうちの４の癌が、ＢＡＴ−２６変異を有することがわ
かった。

【００４１】 図２に示すように、９つ全ての癌が、右側の癌のみがＢＡＴ−２６変異を有し
たことを除いて、結腸の種々の部分において見出された。

【００４２】 （実施例２ − ＢＡＴ−２６を使用する診断アッセイ） ＢＡＴ−２６ミスマッチ修復遺伝子座（図５）を使用して、上記と同じ４０の
サンプルを評価した。ＢＡＴ−２６における欠失を、結腸直腸癌または腺腫に関
連付けた。サンプルを、上記のように調製した。プライマーを、ポリ−Ａトラク
ト（ｔｒａｃｔ）のすぐ上流のＢＡＴ−２６遺伝子座の部分（これは、２６のア
デノシン（ヌクレオチド１９５〜２２１）からなる）にハイブリダイズした。標
識していないデオキシチミジン、標識したデオキシシトシンと標識していないデ
オキシシトシンとの混合物、および標識していないジデオキシアデニンを、ポリ
メラーゼとともに添加した。プライマーを、ポリ−Ａ領域を通して伸長させた。
標識したシトシンおよび標識していないシトシンを、次の３つの塩基（ヌクレオ
チド２２２〜２２４、インタクトな配列における全てのグアニンまで伸長し、そ
の結果、標識が、各伸長したプライマーに組み込まれた。ポリ−Ａトラクトおよ
び３つのグアニンの後に、インタクトな配列における２つのチミジンが存在する
。従って、ジデオキシアデノシンは、ポリ−Ａ領域およびトリグアニン領域を通
して伸長したプライマーの末端に付加することによって、プライマー伸長を停止
させる。鎖を分離し、そしてこれらの鎖の長さを、ポリアクリルアミドゲル上で
観察して、ポリ−Ａトラクトにおける欠失を検出した。その結果を以下の表Ａに
示す：

【００４３】

【表１】 上に示すように、ＢＡＴ−２６単独では、複数変異または定量単独を使用して
達成される高い感度を提供せず、他の単一遺伝子座検出アッセイとの比較におけ
る高い感度を示した。さらに、以下に示すように、上記他の技術との組合せでの
ＢＡＴ−２６は、感度および特異性の全体的な増加を生じた。

【００４４】 （実施例３ − Ｋｒａｓ、複数変異、定量、およびＢＡＴ−２６の累積効果
） Ｋｒａｓ、複数変異分析、定量、およびＢＡＴ−２６に関して上で得た結果を
合わせて、癌または前癌についての非侵襲性アッセイの増加した感度および特異
性を提供するための、これらの技術の組合せを使用することの累積効果を決定し
た。その結果を以下の表Ｂに要約する：

【００４５】

【表２】 上記要約に示すように、複数変異分析、定量ＰＣＲ、およびＢＡＴ−２６の組
み合わせは、結腸鏡分析法の感度に近づく感度を生じた。複数変異分析と定量単
独との組合せもまた、非常に高い感度を生じる。全てのアッセイは、１００％の
特異性を生じ（偽陽性結果なし）、これは、結腸鏡検査法に匹敵する。

【００４６】 前述の実験は、単一の高感度／高特異性の非侵襲性または最小侵襲性のアッセ
イさえも、当該分野の非侵襲性／最小侵襲性の技術に勝る診断結果、および認識
された標準的な侵襲性診断手順（結腸鏡検査法）を用いて観察されるアプローチ
結果を生じることを示す。さらに、１つより多い高感度／高特異性の技術を利用
する、非侵襲性アッセイは、１００％に近付く診断の正確さを生じる。それ自体
で、本発明の方法は、癌の正確な非侵襲性診断を実施する能力の有意な改善を提
供する。

【００４７】 （実施例４ − ＢＡＴ−２６マーカーを使用する癌検出の臨床試験） 結腸鏡検査法を実施するべきであることを示す症状または病歴を有する、Ｍａ
ｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＮ）における２８の個体から収集
した糞便標本を使用して、実施例１において上に記載した方法を追跡した。その
結果を、図３および図４に示す。この結果は、この試験が、ＢＡＴ−２６変異を
有する８の癌のうちの２を見出すことを実証した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、種々のマーカー（ＢＡＴ−２６を含む）を使用する、４０被験体に対
して実施されるスクリーニングアッセイの臨床試験の結果を示す表である。

【図２】 図２は、図１に記載される研究において位置付けられる９つの癌の位置の絵表
示である。

【図３】 図３および４は、種々のマーカー（ＢＡＴ−２６を含む）を使用する、２８被
験体に対して実施されるスクリーニングアッセイの臨床試験の結果を示す表であ
る。

【図４】 図３および４は、種々のマーカー（ＢＡＴ−２６を含む）を使用する、２８被
験体に対して実施されるスクリーニングアッセイの臨床試験の結果を示す表であ
る。

【図５】 図５は、ＢＡＴ−２６遺伝子座のＤＮＡ配列を示し、ここで各「ｎ」は、未知
のヌクレオチド同一性に対応する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 患者における結腸疾患または障害の存在を検出するための方
   法であって、該方法は、以下： 患者の組織または体液のサンプル中に存在する核酸のＢＡＴ−２６遺伝子座に
   おける変異を検出するアッセイを実施する工程；および 該変異についてのポジティブアッセイとして結腸疾患または障害を検出する工
   程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記アッセイは、以
   下の工程： （ａ）前記サンプルを、前記ＢＡＴ−２６遺伝子座にてポリＡトラクトのすぐ
   上流にあるＢＡＴ−２６遺伝子座の一部と相補的であるオリゴヌクレオチドプラ
   イマーと接触させる工程； （ｂ）ｄＴＴＰの存在下で該プライマーを伸長させて、それによりプライマー
   伸長産物を形成する工程； （ｃ）ＢＡＴ−２６遺伝子座にて該ポリＡトラクトから下流のヌクレオチド塩
   基に対して相補的な標識ヌクレオチドの存在下で該プライマー伸長産物を伸長さ
   せる工程であって、ここで該標識ヌクレオチドがｄＴＴＰでない、工程；および （ｄ）工程（ｃ）にて得られた標識伸長産物のサイズを標準と比較する工程で
   あって、ここで、該標準よりも小さいかまたは大きい標識伸長産物が該ＢＡＴ−
   ２６遺伝子座における変異の指標である、工程、 を包含する、方法。
3. 【請求項３】 前記サンプルが糞便サンプルである、請求項１に記載の方法
   。
4. 【請求項４】 前記疾患または障害が癌である、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記癌が結腸直腸癌である、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記結腸直腸癌が遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌である、請
   求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 請求項３に記載の方法であって、ここで前記疾患または障害
   が、以下： 前癌、腺腫、ポリープ、炎症性腸障害、炎症性腸症候群、限局性腸炎、肉芽腫性
   回腸炎、肉芽腫性回結腸炎、クローン病、回腸炎、回結腸炎、空回腸炎、肉芽腫
   性結腸炎、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ腸炎、潰瘍性大腸
   炎、偽膜大腸炎、過敏性腸症候群、憩室症、憩室炎、腸管寄生生物、感染性胃腸
   炎、毒性胃腸炎、および細菌性胃腸炎、 からなる群から選択される、方法。
8. 【請求項８】 前記糞便サンプルがホモジナイズされる、請求項３に記載の
   方法。
9. 【請求項９】 前記サンプルが、尿、血液、痰、脳脊髄液、膿、および吸引
   液からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
10. 【請求項１０】 患者における結腸疾患または障害の部位を決定する方法で
    あって、該方法は以下の工程： ＢＡＴ−２６遺伝子座における変異を患者の組織または体液のサンプルにおい
    て同定するアッセイを実施する工程；および 該アッセイが変異についてポジティブである場合、該疾患または障害が近位の
    結腸に存在することを決定する工程、 を包含する、方法。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の方法であって、以下の工程： 結腸病変またはポリープを同定するために、前記患者に対する可撓性Ｓ状結腸
    鏡検査法を実施する工程；および 結腸病変またはポリープが同定されてる場合、前記疾患または障害が遠位の結
    腸に存在することを決定する工程、 をさらに包含する、方法。
12. 【請求項１２】 前記疾患および障害が癌である、請求項１０に記載の方法
    。
13. 【請求項１３】 前記癌が、結腸直腸癌である、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記結腸直腸が、遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌である、
    請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 請求項１０に記載の方法であって、ここで前記疾患または
    障害が、以下： 前癌、腺腫、ポリープ、炎症性腸障害、炎症性腸症候群、限局性腸炎、肉芽腫性
    回腸炎、肉芽腫性回結腸炎、クローン病、回腸炎、回結腸炎、空回腸炎、肉芽腫
    性結腸炎、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ腸炎、潰瘍性大腸
    炎、偽膜大腸炎、過敏性腸症候群、憩室症、憩室炎、腸管寄生生物、感染性胃腸
    炎、毒性胃腸炎、および細菌性胃腸炎、 からなる群から選択される、方法。
16. 【請求項１６】 前記サンプルが糞便である、請求項１０に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記糞便サンプルがホモジナイズされる、請求項１６に記
    載の方法。
18. 【請求項１８】 前記サンプルが、尿、血液、痰、脳脊髄液、膿、および吸
    引液からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
19. 【請求項１９】 患者における結腸疾患または障害の存在を検出する方法で
    あって、該方法は以下の工程： 患者の組織または体液のサンプルに存在する核酸におけるＢＡＴ−２６遺伝子
    座における変異を検出する第１のアッセイを実施する工程； 該核酸における第２の遺伝子座における変異を同定する第２のアッセイを実施
    する工程であって、該第２の遺伝子座が、ｐ５３遺伝子座、ａｐｃ遺伝子座、お
    よびＫｒａｓ遺伝子座からなる群から選択される、工程；ならびに ポジティブな第１のアッセイまたは第２のアッセイとして結腸疾患または障害
    を検出する工程、 を包含する、方法。
20. 【請求項２０】 患者における結腸疾患または障害の存在を確認するための
    方法であって、該方法は以下の工程： 請求項１の方法に従って結腸疾患または障害の存在を決定する工程； 該患者に対して結腸鏡検査法を実施する工程；および 結腸鏡検査によって検出可能な病変またはポリープとして結腸疾患または障害
    を確認する工程、 を包含する、方法。
21. 【請求項２１】 遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌が発症する危険にある患者
    を決定する方法であって、該方法は、以下の工程： 請求項３に記載の方法に従って該患者における結腸疾患または障害の存在を検
    出する工程であって、該結腸疾患または障害が腺腫である、工程；および 遺伝性非ポリープ症結腸直腸癌が発症する危険にある患者を腺腫を有する患者
    として決定する工程、 を包含する、方法。