WO2005116254A1 - Ｄｎａのメチル化を定量的に評価する方法 - Google Patents

Ｄｎａのメチル化を定量的に評価する方法 Download PDF

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WO2005116254A1
WO2005116254A1 PCT/JP2005/004460 JP2005004460W WO2005116254A1 WO 2005116254 A1 WO2005116254 A1 WO 2005116254A1 JP 2005004460 W JP2005004460 W JP 2005004460W WO 2005116254 A1 WO2005116254 A1 WO 2005116254A1
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target
restriction enzyme
genome
dna
genomic dna
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PCT/JP2005/004460
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Hirohiko Hohjoh
Yoshiko Tamura
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Japan Health Sciences Foundation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantitatively evaluating the state of DNA methylation.
  • Methylation of genomic DNA is one of the epigenetic genomic modifications. Such methylation of genomic DNA is considered to act as an important genomic regulatory factor (element) for higher organisms. For example, tissue-specific regulation of gene expression, maintenance of chromatin structure, X chromosome dysfunction, etc. It is known to be involved in activation, genome imprinting, etc. (En Li, Nat. Rev. Genet. 3, 662-673, 2002) 0
  • genomic DNA is treated with a methyl-sensitive restriction enzyme and then subjected to Southern blot analysis (Huang TH et al., Hum. Mol. Genet. 8, 459-470, 1999). This method makes it possible to quantitatively detect the degree of methylation on DNA, but requires a large amount of sample, takes a long time to analyze, and has a sufficiently high detection sensitivity. Absent.
  • the present inventors have now digested genomic DNA with a restriction enzyme that inhibits the cleavage action at a specific breakpoint on the genome by methylation of the target nucleotide residue, and obtained the digested product.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed using a primer capable of amplifying a region containing the breakpoint on the genome, and the amount of the amplification product obtained by this reaction is reduced to a proximal region not containing the breakpoint. It has been found that the state of methylation of the nucleotide residue can be quantitatively evaluated by comparing the amount of the amplification product with the primer capable of amplifying the nucleotide. The present invention is based on this finding.
  • an object of the present invention is to provide a method for quantitatively evaluating the methylation state of DNA on a genome.
  • the method according to the present invention is a method for quantitatively evaluating the state of methylidation of nucleotide residues on a genome, which inhibits cleavage of genomic DNA by a restriction enzyme, wherein (a) the genome Digest the DNA in the sample containing the DNA with at least one restriction enzyme whose methylation of the nucleotide residue of interest inhibits the cleavage at the target cleavage site on the genome.
  • cleaves the genomic DNA at the 5 ′ and 3 ′ sides and (b) the step located on the genome closest to the 5 ′ and 3 ′ sides from the target cleavage site (a) Exist between two cleavage points and target cleavage Using a primer that can amplify the target region on the genome including the site, perform a nucleic acid amplification reaction using the digestion product obtained in step (a) as type I, and measure the amount of the obtained amplification product.
  • Step (c) which is located on the genome at the position closest to the 5 ′ side and 3 ′ side from the target cleavage site, between the two cleavage points according to (a), and the target cleavage site
  • a nucleic acid amplification reaction is performed using the digestion product obtained in step (a) as a type I, and the amount of the obtained amplification product is measured.
  • (d) comparing the measured value obtained in step (b) with the measured value obtained in step (c).
  • the present invention it is possible to quantitatively evaluate the methylation state of nucleotide residues on a genome by a simple procedure.
  • the method according to the present invention has wide utility in basic research and applied research for analyzing epigenetic genomic changes. Further, the method according to the present invention can be used in the medical field, for example, when methylation of a specific nucleotide residue on the genome is associated with a specific disease (eg, cancer, tumor, and mental illness). Can be used for diagnosis of the disease.
  • a specific disease eg, cancer, tumor, and mental illness
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the steps of a method according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram in which (measured value in target PCR) Z (measured value in internal control PCR) is plotted on a logarithmic graph for methylation at a specific site in the reelin gene promoter.
  • Fig. 3 is a diagram plotting (measured value in target PCR) Z (measured value in internal control PCR) on methylation at a specific site in the DRD2 gene promoter on a logarithmic graph.
  • FIG. 4 is a diagram showing the structure of a plasmid pRELN-Luc expressing firefly luciferase under the control of a Reelin gene promoter.
  • FIG. 5 is a graph showing the degree of methylation in the promoter region of each plasmid and the amount of luciferase expressed by each plasmid.
  • FIG. 6A shows the age at death and the mediation of Reelin gene promoter in patients with manic depression.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the specific part and the degree of methylation.
  • FIG. 6B is a diagram showing the relationship between the age at death in schizophrenia patients and the degree of methylation at a specific site in the Reelin gene promoter.
  • FIG. 6C is a diagram showing the relationship between the age at death in healthy subjects and the degree of methylation at a specific site in the reelin gene promoter.
  • the method according to the present invention utilizes the phenomenon that when a specific nucleotide residue on a genome is excised, the cleavage action of a specific restriction enzyme at a specific position on the genome is inhibited. I have. Therefore, the nucleotide residues to be evaluated in the present invention are those whose methylation inhibits the cleavage action of any restriction enzyme at any position on the genomic DNA.
  • the DNA in the sample containing genomic DNA is digested by a restriction enzyme whose methylation of a target nucleotide residue inhibits the cleavage action at a specific breakpoint (target breakpoint) on the genome. .
  • the genomic DNA is not cleaved at the target cleavage point, it indicates that the target nucleotide residue is S methylated, and if the genomic DNA is cleaved at the target cleavage point, This indicates that the target nucleotide residue has not been modified.
  • the presence or absence of enzymatic cleavage at a target breakpoint is indicated by whether or not an amplification product is obtained by a nucleic acid amplification reaction using a primer capable of amplifying a target region including the target breakpoint on the genome. It is.
  • the target region since the genomic DNA is reliably cleaved on the 5 ′ side and 3 ′ side of the target cleavage point, the target region also has a target cleavage point force of 5 ′ and 3 ′. It is chosen to be between the two most proximate cutting points.
  • the copy number of the amplification product obtained by the nucleic acid amplification reaction is an index indicating the ratio of the target nucleotide residue copied to the genomic DNA having a large number of copies present in the sample. Become.
  • a nucleic acid amplification reaction is further carried out using a primer present between the two cleavage points and not containing the target cleavage point and capable of amplifying a control region, and is obtained.
  • a primer present between the two cleavage points and not containing the target cleavage point and capable of amplifying a control region
  • the method according to the present invention comprises a DNA cleavage treatment step, a target region amplification step, and a control region amplification step.
  • DNA in a sample containing genomic DNA is digested with at least one restriction enzyme that inhibits a cleavage action at a target cleavage site on the genome by methylation of a target nucleotide residue. Is done.
  • target nucleotide residue means a nucleotide residue on the genome to be subjected to the quantitative evaluation of methylidani.
  • a nucleotide residue may be any one as long as its cleavage by a specific restriction enzyme at a specific position on the genome is inhibited by methylation, and is appropriately selected by those skilled in the art.
  • any one of a plurality of different nucleotide residues may inhibit the cleavage action at the same site. In the method according to the present invention, these multiple nucleotide residues can be used as target nucleotide residues.
  • the methylation quantitatively evaluated by the method according to the present invention is methylidation at any of the plurality of nucleotide residues.
  • a methyl iridide of a plurality of nucleotide residues that inhibit cleavage by a restriction enzyme at a plurality of target cleavage points can be evaluated.
  • the target nucleotide residue is often included in the recognition sequence of the restriction enzyme. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the target nucleotide residue is included in the recognition sequence of the restriction enzyme used in the above-mentioned DNA digestion treatment.
  • target cleavage point refers to a specific position on genomic DNA cleaved by any restriction enzyme, which is cleaved by a restriction enzyme by methylation of a target nucleotide residue. Means the position where is inhibited.
  • target cleavage site refers to a single target cleavage point when a single target cleavage point is used in the method according to the present invention, and when a plurality of target cleavage points are used. In these multiple target cleavage Of the points, it means the area on the genome sandwiched between the one located at the 5 'end and the one located at the 3' end.
  • the restriction enzyme used in the above-mentioned DNA digestion treatment inhibits the cleavage action at a specific breakpoint (target breakpoint) on the genome by methylation of a target nucleotide residue.
  • target breakpoint a specific breakpoint
  • Such restriction enzymes are appropriately selected by those skilled in the art depending on the nucleotide residue of interest or the sequence around it.
  • restriction enzymes are often inhibited by methylation of nucleotide residues contained in the recognition sequence. Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the restriction enzyme used in the above-mentioned DNA digestion treatment is inhibited by methylation of nucleotide residues contained in the recognition sequence.
  • restriction enzymes are well-known in the art as methylation-sensitive restriction enzymes, along with methylation sites and other properties that inhibit their activity (cleaving action) (eg, Nelson M et al, Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 13, 3139-3154, 1993). Therefore, those skilled in the art can easily select a restriction enzyme according to the purpose.
  • a plurality of types of restriction enzymes can be used as the restriction enzymes used in the above-mentioned DNA digestion treatment.
  • the DNA is cleaved on the 5 ′ side and 3 ′ side of the target cleavage site on the genome.
  • DNA cleavage can be easily performed by those skilled in the art. For example, if the genomic DNA can be reliably cleaved on the 5 'side and 3' side of the target cleavage site used in the above-mentioned DNA digestion treatment, At the same time.
  • this DNA cleavage can be performed, if necessary, using a reagent capable of cleaving genomic DNA on the 5 ′ side and 3 ′ side of the target cleavage site on the genome.
  • a reagent capable of cleaving genomic DNA on the 5 ′ side and 3 ′ side of the target cleavage site on the genome.
  • examples of such a reagent include a restriction enzyme. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the DNA cleavage treatment step cleaves the DNA in the sample containing the genomic DNA at 5 ′ and 3 ′ sides of the target cleavage site. And digestion with restriction enzymes that can be used.
  • the DNA cleavage treatment step comprises reducing DNA in the sample containing genomic DNA by 5, Digesting with a restriction enzyme capable of cleaving genomic DNA on its side and a restriction enzyme capable of cleaving genomic DNA at 3 'of the target cleavage site.
  • the restriction enzyme used for these DNA cleavages is appropriately selected by those skilled in the art so that the genomic DNA can be reliably cleaved at a target position on the genome.
  • these restriction enzymes may be methylation-sensitive restriction enzymes. In this case, there is no or no methyl iodide nucleotide residue that inhibits the activity (cleavage action) of these restriction enzymes. It is necessary that the activity of the restriction enzyme is hardly inhibited by the methylated nucleotide residue.
  • the DNA digestion treatment with the restriction enzyme and the DNA cleavage on the 5 'and 3' sides of the target cleavage site may be performed separately or may be performed simultaneously.
  • a restriction enzyme composition containing the necessary restriction enzymes and the restriction enzyme used for the DNA digestion treatment By digesting the DNA with, the DNA cleavage step can be performed in one step.
  • a sample containing genomic DNA is appropriately prepared by a person skilled in the art from a sample collected from a target organism, for example, a human, so as to be suitable for general restriction enzyme treatment.
  • digestion of DNA with a restriction enzyme is appropriately performed by those skilled in the art according to reaction conditions known as general conditions for restriction enzyme treatment.
  • a nucleic acid amplification reaction is performed in which the digestion product obtained in the DNA cleavage step is type III, and further obtained. The amount of amplification product obtained is measured. In this nucleic acid amplification reaction, an amplification product can be obtained only when the genomic DNA is not cleaved even if the target cleavage point contained in the target cleavage site is not shifted.
  • nucleotide residues or, if there are multiple target nucleotide residues corresponding to one target cleavage point,! / Or any one of them are converted into methyl! /, Only the amplification product is obtained.
  • any target cleavage point contained in the target cleavage site In this case, the genomic DNA is cleaved, and in some cases, an amplification product cannot be obtained. Therefore, the target nucleotide residue corresponding to each target breakpoint (the purpose corresponding to one target breakpoint) When there are a plurality of the above nucleotide residues, an amplification product cannot be obtained if any of them is not methylated.
  • the amount of this amplification product is determined by the target nucleotide residue corresponding to each of the target cleavage points included in the target cleavage site (when there are a plurality of target nucleotide residues corresponding to one target cleavage point, All of the! /, One of them) are S-methylated and correspond to the copy number of the genomic DNA, and thus serve as an index indicating the amount of methylation at the target nucleotide residue (group).
  • the amount of the amplification product is determined by the target nucleotide residue corresponding to the target cleavage point (the target nucleotide residue corresponding to the target cleavage point is If there is more than one, one of them corresponds to the copy number of the genomic DNA that is methylated, so that an index indicating the amount of methylidani in the target nucleotide residue (group) is used as an index. Become.
  • the control region amplification step between the two cleavage points in the DNA cleavage treatment step located closest to the 5 'side and 3' side from the target cleavage site on the genome, Using a primer that can amplify a control region on the genome that is present and does not contain the target cleavage site, a nucleic acid amplification reaction is performed in which the digestion product obtained by the DNA cleavage step is type II, and The amount of amplification product obtained is measured. In this nucleic acid amplification reaction, a certain number of copies of the amplification product is obtained irrespective of whether or not the target nucleotide residue is ligated. Therefore, the amount of this amplification product serves as an internal control for quantitatively evaluating the state of methylation at the target nucleotide residue.
  • the nucleic acid amplification reaction is appropriately performed by those skilled in the art according to a method capable of amplifying a specific region in a DNA sequence to be type III.
  • Many such methods are known in the art, such as polymerase chain reaction (PCR: U.S. Pat.No. 4,683,195), ligase chain reaction (LCR: European patent application). Publication No. 0 320308). These methods have the advantage that the theoretical copy number of the amplification product can be controlled by the number of temperature cycles including multiple temperature conditions.
  • the nucleic acid is amplified at a certain temperature.
  • Such methods include, for example, the SDA method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-192195), the LAMP method (WO 00Z28082 pamphlet), and the ICAN method (WO 02Z16639 pamphlet). ) And the like.
  • a person skilled in the art can easily design a primer capable of amplifying the target region or the control region according to the selected mechanism of the nucleic acid amplification reaction.
  • a primer comprises a first primer comprising at least a sequence that specifically and specifically hybridizes at the 3′-terminal portion of the first strand of the region to be amplified, and a second primer of the second strand of the region. And a second primer comprising at least a sequence that specifically hybridizes to the 3'-terminal portion.
  • “specifically hybridizes” means that the primer hybridizes under stringent conditions to the 3 'end of any strand of the region to be amplified, and It means that it does not hybridize to other nucleotide molecules or a part thereof present in the reaction solution used for the nucleic acid amplification reaction.
  • Stringent conditions can be determined depending on the melting temperature Tm (° C) of the duplex formed by hybridization of the two nucleotide molecules, the salt concentration of the hybridization solution, and the like.
  • Tm melting temperature
  • a primer that specifically hybridizes to a region comprises a nucleotide sequence complementary to that region.
  • the digestion product obtained in the DNA cutting step may be used as it is, or a solution containing the digestion product may be used for nucleic acid amplification.
  • a solution modified to be a solution suitable for the reaction may be used.
  • the digestion product obtained by the DNA cleavage step is isolated by a standard method such as an ethanol precipitation method, and is then dissolved in a solution for a nucleic acid amplification reaction.
  • the nucleic acid amplification reaction in one or both of the step of amplifying the target region and the step of amplifying the control region is detectable in response to an increase in the amplification product during the reaction. It is performed by a method in which the intensity of the signal is increased, and more preferably real-time PCR. By such a method, it becomes possible to measure the amount of the amplification product at the same time as the termination of the nucleic acid amplification reaction without requiring any more complicated steps. Such a method can be performed, for example, by adding a signal generating substance that generates a signal having an intensity corresponding to the amount of the amplification product to a reaction solution for nucleic acid amplification reaction in advance.
  • Examples of the signal generating substance include an intercalator. Therefore, according to one embodiment of the present invention, the measurement of the amount of amplification product in one or both of the step of amplifying the target region and the step of amplifying the control region is performed by measuring the signal intensity of the intercalator force.
  • the term “intercalator” refers to a substance that emits fluorescence by invading between two DNA chains forming a double-stranded DNA.
  • Various substances are known as the intercalator, and examples thereof include bromide thidium, an ataridine dye, and SYBR Green (“SYBR” is a registered trademark of Molecular Probes).
  • Examples of the signal generating substance include a TaqMan probe. Therefore, according to another embodiment of the present invention, the measurement of the amount of amplification product in one or both of the step of amplifying the target region and the step of amplifying the control region is performed by measuring the fluorescence intensity caused by the TaqMan probe. .
  • PCR using TaqMan probes is well known in the art as TaqMan PCR. Thus, TaqMan probes for use in the present invention are readily designed and prepared by those skilled in the art.
  • the measured values obtained by the amplification step of the target region described above are compared with the measured values obtained by the amplification step of the control region.
  • the measured value obtained in the step of amplifying the target region is standardized by the internal control, and a quantitative index of methylation of the target nucleotide residue (group) can be obtained.
  • the target nucleotide residue (group) in the sample obtained by dividing the measurement value obtained by the amplification step of the target region by the measurement value obtained by the amplification step of the control region is obtained.
  • Methyl It is used as a quantitative indicator of chemical conversion.
  • BssHII is used as a restriction enzyme used in the above-mentioned DNA digestion treatment, and the methylation status of cytosine residues present in the recognition sequence is quantitatively evaluated.
  • EcoRI is used as a restriction enzyme for DNA cleavage at the 5 'and 3' sides of the target cleavage site.
  • EcoR I sites and BssH II sites are alternately present on the genomic DNA contained in the sample, and the desired cytosine residue is located in the left BssH II site (target BssH II site). Included (Fig. 1, top).
  • this genomic DNA is digested with a restriction enzyme composition containing BssHII and EcoRI, the restriction enzyme site is not cleaved when cytosine is present at the BssHII site, and If cytosine is not present, the restriction enzyme site is cleaved.
  • the digestion product contains EcoRI-EcoRI fragments derived from genomic DNA copies where the desired cytosine residue is methylated, and EcoRI fragments derived from genomic DNA copies where the desired cytosine residue is not methylated.
  • EcoR I—BssH II fragment and BssH II—EcoR I fragment coexist (Fig. 1, middle).
  • a similar reaction occurs at non-target BssH II sites that do not contain the desired cytosine residue. Therefore, the digestion product also contains EcoR I-EcoR I fragment, EcoR I BssH II fragment and BssH II-EcoR I fragment derived from the non-target BssH II site and its surrounding region (the right side of the middle part of Fig. 1). ).
  • the digestion product is converted into type II using a primer capable of amplifying the target region including the target BssH II site.
  • Real-time PCR is performed. In this PCR, amplification products can be obtained from EcoR I—EcoR I fragments containing the target BssH II site, whereas amplification products cannot be obtained from EcoR I BssH II and BssH II EcoR I fragments (Fig. 1, lower left column). Amplification). Since the primer has a sequence specific to the target region, no amplification product can be obtained from the EcoRI-EcoRI fragment derived from the non-target BssHII site and the surrounding region.
  • the digestion product is converted into type III using a primer capable of amplifying a control region not containing the target BssH II site.
  • Real-time PCR is performed.
  • the target BssH II A RI-EcoRI fragment, one of the EcoRI-BssHII fragment and the BssHII-EcoRI fragment, and a strong amplification product are obtained (amplification on the right side in the lower part of Fig. 1). Therefore, according to this PCR, a certain amount of amplification product is obtained regardless of the presence or absence of DNA cleavage at the target BssHII site.
  • kits for quantitatively evaluating the state of methylation of a nucleotide residue on a genome which inhibits cleavage of genomic DNA by a restriction enzyme.
  • At least one restriction enzyme whose cleavage action at the target cleavage site on the genome is inhibited by the methylidation of an oxidized residue; (b) cleavage of genomic DNA 5 'and 3' to the target cleavage site on the genome (C) present between the two cleavage points of the restriction enzyme or the reagent located closest to the 5 ′ side and 3 ′ side from the target cleavage site on the genome, and A primer capable of amplifying a target region on the genome containing the target cleavage site, and (d) the above-mentioned restriction enzyme or the preceding enzyme located closest to the 5 ′ side and 3 ′ side from the target cleavage site on the genome. It exists between the two cutting points with reagents, and kits are provided comprising a primer, which can amplify the control region on the genome that does not include the target cleavage site.
  • kit according to the present invention depends on the specific method to be carried out thereby and the mechanism of action, and for example, it can be designed according to the above description of the method according to the present invention.
  • the target nucleotide residue is preferably included in the recognition sequence of the restriction enzyme.
  • the restriction enzyme is inhibited by methylation of a nucleotide residue contained in the recognition sequence.
  • the reagent comprises a restriction enzyme capable of cleaving genomic DNA 5 ′ and 3 ′ from the target cleavage site. Is done.
  • the reagent comprises a restriction enzyme capable of cleaving genomic DNA 5 ′ to the target cleavage site and a restriction enzyme 3 ′ to the target cleavage site. It is supposed to comprise a restriction enzyme capable of cutting genomic DNA.
  • the kit according to the present invention is preferably a signal generating substance that generates a signal having an intensity corresponding to the amount of an amplification product in a nucleic acid amplification reaction using one or both of the primers (c) and (d). Is further included.
  • the signal generating substance include the above-described intercalator and TaqMan probe.
  • the kit according to the present invention includes other reagents used for treating a double-stranded DNA with a restriction enzyme, other reagents used for a nucleic acid amplification reaction, a reaction container, and specific procedures of the method according to the present invention. Includes written instructions!
  • Other reagents used for the restriction enzyme treatment include, for example, buffers.
  • Other reagents used for the nucleic acid amplification reaction include, for example, catalysts such as magnesium chloride, magnesium acetate, and magnesium sulfate, substrates such as dNTP mix, and buffers.
  • Genomic DNA samples were also collected from 111 human subjects, and each sample was quantitatively evaluated for the methylated state at a specific BssHII site in the Reelin gene promoter region. Specific procedures and results are as shown below.
  • Genomic DNA was digested with two restriction enzymes.
  • one restriction enzyme is a methylation-sensitive restriction enzyme BssHII whose recognition sequence includes a target methylation site
  • the other restriction enzyme is a recognition sequence whose recognition sequence is on the 5 ′ side of the methylation site.
  • the restriction enzyme EcoRI present on the 3 'side was used. Specifically, 50 ⁇ l of a reaction solution containing 500 ng of genomic DNA, 6 U of BssH II, 6 U of EcoRI, 51 of 10 XH buffer, and distilled water was prepared, and the obtained reaction solution was prepared. Incubate overnight at 37 ° C under aeration.
  • the cleaved DNA fragment was recovered by ethanol precipitation, and this was dissolved in a TE solution. Specifically, 100 1 of ethanol (100%) and 51 of 3M sodium acetate were added to the reaction solution obtained as described above, and the mixture was placed at 20 ° C for 20 minutes. This solution was centrifuged (17,800 ⁇ g, 4 ° C., 15 minutes), and the supernatant was removed. To this solution, 200 1 of 70% ethanol was added, and after centrifugation (17,800 ⁇ g, 4.C, 5 minutes), ethanol was completely evaporated. The resulting residue was dissolved in 501 TE solution. The DNA concentration in this solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm (Dilution Facter: X20
  • PCR internal control PCR
  • SYBR Green was used as a signal generating means indicating the amount of the amplification product.
  • target PCR a primer pair capable of amplifying a region (target region) containing the target methylated site in the EcoRI-EcoRI region was used.
  • target PCR a TaqMan probe was used as a signal generating means indicating the amount of the amplification product.
  • the nucleotide sequences of primers and probes used in these PCRs are as follows.
  • the reaction solution for the internal control PCR was 60ng of type II DNA, A total of 25 ⁇ l of a solution containing each primer of M, 12.5 ⁇ l of 2 ⁇ Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems), and distilled water was prepared.
  • the reaction solution for target PCR consisted of 60 ng of type II DNA, 200 nM of each primer, ⁇ Ta TaqMan probe, 12.5 ⁇ l of 2X Master Mix (TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems), and distilled water. A total of 25 ⁇ l of the solution was prepared.
  • the temperature conditions were as follows: the reaction solution was treated at 50 ° C for 2 minutes, further treated at 95 ° C for 10 minutes, and then treated at 95 ° C for 20 seconds and at 60 ° C for 1 minute for 48 cycles.
  • Example 2 Determination of methylation at the BssH II site in the DRD2 gene promoter region
  • Genomic DNA samples were collected from 111 human subjects, and each sample was quantitatively evaluated for the methylated state at a specific BssHII site in the DRD2 gene promoter region. Specific procedures and results are as shown below.
  • Genomic DNA was digested with two restriction enzymes.
  • one restriction enzyme is a methylation-sensitive restriction enzyme BssHII whose recognition sequence includes a target methylation site
  • the other restriction enzyme is a recognition sequence whose recognition sequence is on the 5 ′ side of the methylation site.
  • the restriction enzyme EcoRI present on the 3 'side was used. Specifically, 500 ng of genomic DNA, 6 U of BssH II, 6 U A 50 ⁇ l reaction solution containing U EcoRI, 51 10 XH buffer, and distilled water was prepared, and the resulting reaction solution was incubated overnight at 37 ° C under aeration.
  • the cleaved DNA fragment was recovered by ethanol precipitation, and this was dissolved in a TE solution. Specifically, 100 1 of ethanol (100%) and 51 of 3M sodium acetate were added to the reaction solution obtained as described above, and the mixture was placed at 20 ° C for 20 minutes. This solution was centrifuged (17,800 ⁇ g, 4 ° C., 15 minutes), and the supernatant was removed. To this solution, 200 1 of 70% ethanol was added, and after centrifugation (17,800 ⁇ g, 4.C, 5 minutes), ethanol was completely evaporated. The resulting residue was dissolved in 501 TE solution. The DNA concentration in this solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm (Dilution Facter: X20
  • PCR internal control PCR
  • target PCR a primer pair capable of amplifying a region containing the target methylation site (target region) in the EcoRI region was used.
  • SYBR Green was used as a signal generating means indicating the amount of the amplification product.
  • the nucleotide sequences of the primers used in these PCRs are as follows.
  • D2-5FABconR2 5'-CATGGCTGAGTGGATTTCATGCT-3 '(SEQ ID NO: 7).
  • D2-5FABmetF2 5 AGGTACAGCTCCTTTGGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 8); Reverse (DRD2-5FABmetRl): 5 CAGCAGCTCGGCCGGCTCT-3 '(SEQ ID NO: 9).
  • the reaction solution for PCR was 60 ng of type I DNA, and 200 nM of each primer.
  • the temperature conditions were as follows: the reaction solution was treated at 50 ° C for 2 minutes, further treated at 95 ° C for 10 minutes, and then treated at 95 ° C for 20 seconds and at 60 ° C for 1 minute for 48 cycles.
  • a plasmid expressing firefly luciferase by the action of the reelin gene (RELN) promoter was prepared, and the relationship between the degree of methylation in the RELN promoter region and the expression efficiency of firefly luciferase was examined. Specific procedures and results are as follows.
  • the promoter region and the reelin gene (RELN) region including the first exon were amplified by PCR using human genomic DNA as type III and oligonucleotides having the following sequences as primers.
  • RELN-532F 5'-GTTCTAGATCTTCCCAGGAAAAACAGGGCACACTG-3 '(sequence Number 10);
  • FIG. 4 shows the structure of the obtained luciferase expression cassette contained in pRELN Luc.
  • the RE LN gene promoter is linked to the firefly luciferase coding sequence instead of the SV40 promoter contained in the pGL3-control vector.
  • the obtained pRELN-Luc was introduced into a competent cell, Escherichia coli JM109 strain, and cultured, and then a plasmid was extracted from the culture using a HiSpeed Plasmid Midi Kit (manufactured by QIAGEN).
  • pRELN—Luc was partially methylated using the CpG methylase, M. Sssl. Specifically, 5. Prepare a 100 1 reaction mixture containing 10 NE X of 10 X NEB Buffer 2, 4 U of M. Sssl, 10 ng of pRELN-Luc, 10 X SAM substrate, and distilled water, and mix them at 37 ° C. Incubated with C.
  • the final concentrations of the SAM substrate were set to 2X, IX, and 0.2X, and the reaction times were 6, 3, and 2 hours, respectively.
  • the plasmid was purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) and eluted with 501 distilled water.
  • HM methylation degree
  • Each methylidani pRELN-Luc was digested with two types of restriction enzymes.
  • one restriction enzyme is a methylation-sensitive restriction enzyme BssHII whose recognition sequence includes a target methylation site
  • the other restriction enzyme is a recognition sequence whose recognition sequence is 5 ′ side of the methylation site.
  • the restriction enzyme BamHI present on the 3 'side. Specifically, 50 ⁇ l of a reaction solution containing 25 ng of plasmid, 6 U of BssH II, 6 U of BamHI, 5 ⁇ l of 10 XH buffer, and distilled water A solution was prepared, and the obtained reaction solution was incubated overnight at 37 ° C under aeration.
  • the cleaved DNA fragment was recovered by ethanol precipitation, and this was dissolved in a TE solution. Specifically, 100 1 of ethanol (100%) and 51 of 3M sodium acetate were added to the reaction solution obtained as described above, and the mixture was placed at 20 ° C for 20 minutes. This solution was centrifuged (17,800 ⁇ g, 4 ° C., 15 minutes), and the supernatant was removed. To this solution, 200 1 of 70% ethanol was added, and after centrifugation (17,800 ⁇ g, 4.C, 5 minutes), ethanol was completely evaporated. The resulting residue was dissolved in 501 TE solution. The DNA concentration in this solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm (Dilution Facter: X20
  • target PCR a primer pair capable of amplifying a region (target region: 275 bp) containing the target methylation site in the BamHI-BamHI region was used.
  • target PCR a TaqMan probe was used as a signal generating means indicating the amount of the amplification product.
  • the nucleotide sequences of the primers and probes used for these PCRs are as follows.
  • the reaction solution for the internal control PCR was lng of type II DNA, 200 nM each. Of each primer, 12.5 ⁇ l of 2X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems), and 25 ⁇ l of distilled water.
  • the reaction solution for the target PCR was 1 ng of type II DNA, 200 nM of each primer, ⁇ TaqMan probe, and 12.5 ⁇ l of 2X Master Mix (TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG: Applied Biosystems). And a total of 25 ⁇ l of a solution containing distilled water.
  • the temperature conditions were as follows: the reaction solution was treated at 50 ° C for 2 minutes, further treated at 95 ° C for 10 minutes, and then treated at 95 ° C for 20 seconds and at 60 ° C for 1 minute for 48 cycles.
  • each human NTera2Dl cell treated with retinoic acid (RA) for 3 weeks each methylated pRELN—Luc (0.2 / z gZtest) and phRL—TK (Promega) expressing Miscita luciferase (0. 05 gZtest). Forty-eight hours after the transfection, the luciferase activity was examined using a Dua Luciferase Reporter Assay System (Promega).
  • pRELN—Luc (no M) unmethylated pRELN—Luc
  • pGL3—promoter expressing firefly luciferase under the control of the SV40 promoter promega
  • pGL3-basic Promega
  • the results of the quantitative evaluation of Methylidani and the results of Luciferase Atsushi are shown in FIG.
  • the bar graph shown on the left side of Fig. 5 calculates (measured value in target PCR) Z (measured value in internal control PCR) from the measured values of signal intensity in the above two kinds of real-time PCR, and calculates the value. This is shown as a bar graph.
  • the bar graph shown on the right side of FIG. 5 standardizes the measured value of the fluorescence in the dual luciferase atsie by calculating (measured value of firefly luciferase) / (measured value of m. Luciferase).
  • the values are shown as bar graphs. According to FIG. 5, as the degree of methylation in one region of the promoter increases, the effect of the promoter decreases. It was confirmed that the expression efficiency was reduced.
  • Example 4 Quantitative evaluation of methylation at the BssH II site in the Reelin gene promoter region from depression patients, schizophrenia patients and healthy subjects
  • Genomic DNA samples were collected from the brain frontal lobe at the age of death: 31 to 60 years, average death age: 45 years. For each sample, the methylation state at a specific BssHII site in the reelin gene promoter region was determined. Was quantitatively evaluated. Specific procedures and results are as shown below.
  • Genomic DNA was digested with two restriction enzymes.
  • one restriction enzyme is a methylation-sensitive restriction enzyme BssHII whose recognition sequence includes a target methylation site
  • the other restriction enzyme is a recognition sequence whose recognition sequence is on the 5 ′ side of the methylation site.
  • the restriction enzyme EcoRI present on the 3 'side was used. Specifically, 50 ⁇ l of a reaction solution containing 500 ng of genomic DNA, 6 U of BssH II, 6 U of EcoRI, 51 of 10 XH buffer, and distilled water was prepared, and the obtained reaction solution was prepared. Incubate overnight at 37 ° C under aeration.
  • the cleaved DNA fragment was recovered by ethanol precipitation, and this was dissolved in a TE solution. Specifically, 100 1 of ethanol (100%) and 51 of 3M sodium acetate were added to the reaction solution obtained as described above, and the mixture was placed at 20 ° C for 20 minutes. This solution was centrifuged (17,800 ⁇ g, 4 ° C., 15 minutes), and the supernatant was removed. To this solution, 200 1 of 70% ethanol was added, and after centrifugation (17,800 ⁇ g, 4.C, 5 minutes), ethanol was completely evaporated. The resulting residue was dissolved in 501 TE solution. The DNA concentration in this solution was determined by measuring the absorbance at 260 nm (Dilution Facter: X20
  • the reaction solution for the internal control PCR was 60 ng of type I DNA, 200 ⁇ of each primer, 12.5 ⁇ l of 2X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems), and distilled water. A total of 25 ⁇ l of the solution was prepared.
  • the reaction solution for the target PCR was 60 ng of type II DNA, 200 nM of each primer, ⁇ Man TaqMan probe, 12.5 ⁇ l of 2X Master Mix (TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems), and distilled water. A total of 25 ⁇ l of the solution was prepared.
  • the temperature conditions were as follows: the reaction solution was treated at 50 ° C for 2 minutes, further treated at 95 ° C for 10 minutes, and then treated at 95 ° C for 20 seconds and at 60 ° C for 1 minute for 48 cycles.
  • FIG. 6A shows the relationship between the degree of methylation and the age at death in patients with manic depression.
  • FIG. 6B shows the relationship between the degree of methylation and age at death in schizophrenia patients.
  • FIG. 6C shows the relationship between the degree of methylation and the age at death in healthy volunteers.
  • the distribution images are different between the disease group (manic depressive patients and schizophrenia patients) and healthy subjects, and there is a significant difference between age and methylation level in healthy subjects. A correlation was found, but no such correlation was found in the patient group.
  • the disease group there are samples showing a high degree of methylation at a relatively young age.

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Abstract

　本発明は、ゲノム上のＤＮＡのメチル化の状態を定量的に評価する方法に関する。本発明による方法によれば、目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の切断点における切断作用が阻害される制限酵素を用いてゲノムＤＮＡを消化し、得られた消化産物を鋳型として、ゲノム上の前記切断点を含む領域を増幅しうるプライマーを用いる核酸増幅反応を行ない、これにより得られる増幅産物の量を、前記切断点を含まない近位の領域を増幅しうるプライマーによる増幅産物の量と比較することにより、前記ヌクレオチド残基のメチル化の状態が定量的に評価される。

Description

明 細 書
DNAのメチル化を定量的に評価する方法
関連出願の参照
[0001] 本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願 2004— 1545 58号（出願日： 2004年 5月 25日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の 特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。 発明の背景
[0002] 術分野
本発明は、 DNAのメチルイ匕の状態を定量的に評価する方法に関する。
[0003] 普晋 術
ゲノム DNAのメチル化は、ェピジェネティックなゲノム修飾の一つである。このような ゲノム DNAのメチルイ匕は、高等生物にとって重要なゲノム調節因子（要素）として働 くものと考えられており、例えば、組織特異的な遺伝子発現制御、クロマチン構造の 維持、 X染色体の不活性化、ゲノムインプリンティング等に関与することが知られてい る（En Li, Nat. Rev. Genet. 3, 662-673, 2002) 0
[0004] ゲノム DNAの異常なメチルイ匕は、様々な疾患と関連することが知られており、特に 、細胞の癌化と関連することがよく知られている（Esteller M. et al.， J. Pathol. 196, 1-7, 2002) o最近では、ゲノム DNAの異常なメチルイ匕が精神疾患と関連している可 能性も指摘されている（Popendikyte V. et al, Neuroreport. 10, 1249-1255, 1999 ; Chen Y. et al., Nucleic Acids Res. 30, 2930—2939, 2002) 0
[0005] 従って、ゲノム DNA上のメチルイ匕 DNAを定性的または定量的に評価することは、 上述のゲノム調節機構の理解、 DNAのメチル化と疾患との新たな関連の調査等に おいて、極めて有用である。
[0006] 現在までに、ゲノム上のメチルイ匕 DNAを検出するための様々な方法が開発されて いる。このような方法としては、例えば、 DNAを重亜硫酸塩 (bisulfite)処理すると、シ トシンはゥラシルに変換されるのに対し、メチルイ匕されたシトシン（5 ' -メチルシトシン） はゥラシルに変換されないという現象を利用した方法がある（Takeo Kubota et al, Hum. Genet. 104, 49—55, 1999 ; Clark S.J. et al, Nucleic Acids Res. 22, 2990—2997, 1994) oこの方法では、重亜硫酸塩によって処理したゲノム DNAを铸型として PCR を行い、その PCR産物を適当なプラスミドベクターにクローユングし、その後、塩基配 列決定によってシトシン残基のメチルイ匕パターンを検出する。この方法は、 DNAのメ チル化パターンを定性的に解析する上で優れて ヽるが、メチル化程度を定量的に評 価する上では適して ヽな 、。
[0007] さらに、ゲノム DNA上のメチル化 DNAを検出する方法として、ゲノム DNAをメチル 感受性の制限酵素で処理した後にサザンプロット解析を行なう方法がある（Huang T. H. et al., Hum. Mol. Genet. 8, 459-470, 1999)。この方法では、 DNA上のメチル化 の程度を定量的に検出することが可能となるが、大量のサンプルが必要とされ、解析 に時間がかかり、また、その検出感度も十分に高いとはいえない。
発明の概要
[0008] 本発明者らは、今般、 目的のヌクレオチド残基のメチルイ匕によってゲノム上の特定 の切断点における切断作用が阻害される制限酵素を用いてゲノム DNAを消化し、 得られた消化産物を铸型として、ゲノム上の前記切断点を含む領域を増幅しうるブラ イマ一を用いる核酸増幅反応を行ない、これにより得られる増幅産物の量を、前記切 断点を含まない近位の領域を増幅しうるプライマーによる増幅産物の量と比較するこ とにより、前記ヌクレオチド残基のメチルイ匕の状態を定量的に評価できることを見出し た。本発明はこの知見に基づくものである。
[0009] 従って、本発明の目的は、ゲノム上の DNAのメチルイ匕の状態を定量的に評価する 方法を提供することにある。
[0010] そして、本発明による方法は、制限酵素によるゲノム DNAの切断を阻害する、ゲノ ム上のヌクレオチド残基のメチルイ匕の状態を定量的に評価する方法であって、（a)ゲ ノム DNAを含むサンプル中の DNAを、 目的のヌクレオチド残基のメチル化によって ゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも 1種の制限酵素 で消化し、かつ、ゲノム上の標的切断部位よりも 5 '側および 3'側においてゲノム DN Aを切断する工程、（b)ゲノム上において、標的切断部位から 5'側および 3'側に向 けて最も近位に位置する工程 (a)による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断 部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程 (a)によって 得られる消化産物を铸型とする核酸増幅反応を行な!ヽ、得られる増幅産物の量を測 定する工程、（c)ゲノム上において、標的切断部位から 5'側および 3'側に向けて最 も近位に位置する工程 (a)による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を 含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程 (a)によって得ら れる消化産物を铸型とする核酸増幅反応を行な!ヽ、得られる増幅産物の量を測定す る工程、ならびに (d)工程 (b)によって得られる測定値と、工程 (c)によって得られる 測定値とを比較する工程、を含んでなるものである。
[0011] 本発明によれば、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチルイ匕の状態を、簡便な手順に よって定量的に評価することが可能となる。本発明による方法は、ェピジェネティック なゲノム変化を解析するための基礎的研究および応用研究などにおいて、幅広い有 用性を有する。さらに、本発明による方法は医療分野において利用することができ、 例えば、ゲノム上の特定のヌクレオチド残基のメチルイ匕が特定の疾患 (例えば、癌、 腫瘍、および精神疾患）に関連している場合には、その疾患の診断等に利用すること ができる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]図 1は、本発明の一つの態様による方法の工程を模式的に示す図である。
[図 2]図 2は、リーリン遺伝子プロモーター中の特定の部位におけるメチルイ匕について 、（ターゲット PCRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRにおける測定値)を対 数グラフ上にプロットした図である。
[図 3]図 3は、 DRD2遺伝子プロモーター中の特定の部位におけるメチル化について 、（ターゲット PCRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRにおける測定値)を対 数グラフ上にプロットした図である。
[図 4]図 4は、リーリン遺伝子プロモーターの制御下においてホタルルシフェラーゼを 発現するプラスミド pRELN— Lucの構造を示す図である。
[図 5]図 5は、各プラスミドのプロモーター領域におけるメチルイ匕度と、各プラスミドによ るルシフェラーゼの発現量とを示すグラフである。
[図 6A]図 6Aは、躁うつ病患者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター中 の特定部位のメチルイ匕度との関係を示す図である。
[図 6B]図 6Bは、統合失調症患者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター 中の特定部位のメチルイ匕度との関係を示す図である。
[図 6C]図 6Cは、健常者における死亡時年齢とリーリン遺伝子プロモーター中の特定 部位のメチルイ匕度との関係を示す図である。
発明の具体的説明
[0013] 本発明による方法では、ゲノム上の特定のヌクレオチド残基カ チルイ匕されたときに 、ゲノム上の特定の位置における特定の制限酵素の切断作用が阻害されるという現 象を利用している。よって、本発明において評価の対象となるヌクレオチド残基は、そ のメチル化によってゲノム DNA上のいずれかの位置におけるいずれかの制限酵素 の切断作用が阻害されるものである。本発明による方法では、ゲノム DNAを含むサ ンプル中の DNA力 目的のヌクレオチド残基のメチル化によってゲノム上の特定の 切断点 (標的切断点）における切断作用が阻害される制限酵素によって消化される。 その結果、標的切断点においてゲノム DNAが切断されていない場合には、 目的の ヌクレオチド残基力 Sメチルイ匕されていることが示され、標的切断点においてゲノム DN Aが切断された場合には、 目的のヌクレオチド残基カ^チルイ匕されていないことが示 される。
[0014] 標的切断点における酵素的切断の有無は、ゲノム上における標的切断点を含む標 的領域を増幅しうるプライマーを用いた核酸増幅反応にぉ 、て増幅産物が得られる か否かによって示される。ここで、本発明による方法では、標的切断点の 5'側および 3'側においてゲノム DNAが確実に切断されるため、前記標的領域は、標的切断点 力も 5 '側および 3 '側に向けて最も近位に位置する 2つの切断点の間〖こ存在するよう に選択される。前記核酸増幅反応によって得られる増幅産物のコピー数は、前記サ ンプル中に存在する数多くのコピー数のゲノム DNAのうちの、 目的のヌクレオチド残 基カ チルイ匕されているコピーの比率を示す指標となる。
[0015] 本発明による方法では、さらに、前記 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断 点を含まな 、対照領域を増幅しうるプライマーを用いた核酸増幅反応が行なわれ、 得られる増幅産物のコピー数を内部コントロールとすることにより、 目的のヌクレオチド 残基におけるメチルイ匕を定量的に評価することが可能となる。
[0016] さらに、上述の原理を利用することにより、複数のヌクレオチド残基または複数の標 的切断点についてメチルイ匕の定量的評価を行なうことも可能であり、そのような方法 も本発明に包含される。
[0017] 以上のように、本発明による方法は、 DNA切断処理工程、標的領域の増幅工程、 および対照領域の増幅工程を含んでなる。
[0018] DNA切断処理工程では、ゲノム DNAを含むサンプル中の DNAが、 目的のヌクレ ォチド残基のメチルイ匕によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害さ れる少なくとも 1種の制限酵素で消化される。
[0019] 本明細書にぉ 、て「目的のヌクレオチド残基」とは、メチルイ匕の定量的評価の対象 とするゲノム上のヌクレオチド残基を意味する。このようなヌクレオチド残基は、そのメ チルイ匕によってゲノム上の特定の位置における特定の制限酵素による切断作用が阻 害されるものであればよく、当業者により適宜選択される。また、選択される制限酵素 によっては、複数の異なるヌクレオチド残基のいずれかのメチルイ匕によって、同一箇 所におけるその切断作用が阻害される場合もある。本発明による方法では、これら複 数のヌクレオチド残基を目的のヌクレオチド残基とすることもできる。その場合には、 本発明による方法によって定量評価されるメチル化は、前記複数のヌクレオチド残基 のうちのいずれかにおけるメチルイ匕である。さらに、本発明による方法では、複数の 標的切断点における制限酵素による切断を阻害する複数のヌクレオチド残基のメチ ルイ匕を評価の対象とすることもできる。 目的のヌクレオチド残基は、前記制限酵素の 認識配列中に含まれることが多い。従って、本発明の好ましい実施態様によれば、 目 的のヌクレオチド残基は、上述の DNA消化処理に用いられる制限酵素の認識配列 中に含まれるものとされる。
[0020] 本明細書において「標的切断点」とは、いずれかの制限酵素によって切断されるゲ ノム DNA上の特定の位置であって、 目的のヌクレオチド残基のメチル化によって制 限酵素による切断が阻害される位置を意味する。さらに、「標的切断部位」とは、本発 明による方法において単一の標的切断点が利用される場合にはその標的切断点そ のものを意味し、複数の標的切断点が利用される場合には、これら複数の標的切断 点のうち、最も 5'側に存在するものと最も 3'側に存在するものとによって挟まれるゲノ ム上の領域を意味する。
[0021] 上述の DNA消化処理に用いられる制限酵素は、目的のヌクレオチド残基のメチル 化によってゲノム上の特定の切断点 (標的切断点）における切断作用が阻害されるも のである。このような制限酵素は、目的のヌクレオチド残基またはその周辺の配列に 応じて、当業者によって適宜選択される。また、このような制限酵素は、その認識配列 に含まれるヌクレオチド残基のメチルイ匕によって阻害されることが多い。従って、本発 明の好ましい実施態様によれば、上述の DNA消化処理に用いられる制限酵素は、 その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチルイ匕によって阻害されるものとされる 。このような多くの制限酵素が、メチル化感受性制限酵素として、その活性 (切断作用 )を阻害するメチルイ匕部位およびその他の性質とともに当技術分野にぉ 、てよく知ら れている（例えば、 Nelson M. et al, Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 13, 3139-3154, 1993)。従って、当業者であれば、目的に応じて制限酵素を容易に選択 することができる。また、上述の DNA消化処理に用いられる制限酵素として、複数種 の制限酵素を用いることもできる。
[0022] さらに、 DNA切断処理工程では、ゲノム上の標的切断部位よりも 5'側および 3 '側 において前記 DNAが切断される。これにより、後に行なわれる核酸増幅反応におい て铸型として用いるのに好適な DNA断片を得ることが可能となる。このような DNAの 切断は、当業者であれば容易に行なうことができる。例えば、上述の DNA消化処理 に用いられる制限酵素力 標的切断部位の 5 '側および 3 '側にぉ 、てゲノム DNAを 確実に切断しうる場合には、この DNA切断は、上述の DNA消化処理において同時 に行なうことができる。また、この DNA切断は、必要に応じて、ゲノム上の標的切断 部位よりも 5 '側および 3 '側にぉ 、てゲノム DNAを切断しうる試薬を用いて行なうこと もできる。このような試薬としては、例えば、制限酵素が挙げられる。よって、本発明の 一つの実施態様によれば、 DNA切断処理工程は、ゲノム DN Aを含むサンプル中の DNAを、標的切断部位よりも 5 '側および 3 '側にお 、てゲノム DNAを切断しうる制 限酵素で消化することを含んでなる。また、本発明の他の実施態様によれば、 DNA 切断処理工程は、ゲノム DNAを含むサンプル中の DNAを、標的切断部位よりも 5， 側にお ヽてゲノム DNAを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも 3 '側にお V、てゲノム DNAを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる。これらの DNA 切断に用いられる制限酵素は、ゲノム上の目的の位置において確実にゲノム DNA を切断しうるように、当業者によって適宜選択される。また、これらの制限酵素はメチ ル化感受性制限酵素であってもよぐこの場合には、これらの制限酵素の活性 (切断 作用）を阻害するメチルイ匕ヌクレオチド残基が存在しないか、または存在するメチル 化ヌクレオチド残基によって前記制限酵素の活性がほとんど阻害されないことが必要 となる。
[0023] DNA切断処理工程では、制限酵素による DNA消化処理と、標的切断部位の 5' 側および 3'側における DNA切断とを別々に行なってもよいし、あるいは、同時に行 なってもょ 、。特に、標的切断部位の 5 '側および 3 '側における DNA切断が制限酵 素によって行なわれる場合には、これに必要な制限酵素と DNA消化処理に用いら れる制限酵素とを含む制限酵素組成物を用いて DNAを消化することにより、 DNA 切断処理工程を一工程で行なうことが可能である。
[0024] ゲノム DNAを含むサンプルは、対象となる生物、例えばヒトから採取したサンプル から、一般的な制限酵素処理に好適なものとなるように、当業者によって適宜調製さ れる。また、制限酵素による DNAの消化は、一般的な制限酵素処理の条件として知 られる反応条件に従って、当業者により適宜実行される。
[0025] 標的領域の増幅工程では、ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側 に向けて最も近位に位置する前記 DNA切断処理工程による 2つの切断点の間に存 在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマーを用い て、前記 DNA切断処理工程によって得られる消化産物を铸型とする核酸増幅反応 が行なわれ、さらに、得られる増幅産物の量が測定される。この核酸増幅反応では、 標的切断部位に含まれる 、ずれの標的切断点にぉ 、てもゲノム DNAが切断されて いない場合にのみ増幅産物が得られるため、それぞれの標的切断点に対応する目 的のヌクレオチド残基 (一の標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数 存在する場合には、そのうちの!/、ずれか一つ）の全てカ^チル化されて!/、る場合にの み、増幅産物が得られる。一方で、標的切断部位に含まれるいずれかの標的切断点 にお 、てゲノム DNAが切断されて 、る場合には増幅産物が得られな 、ため、それぞ れの標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基 (一の標的切断点に対応する目 的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、その全て）のいずれかがメチルイ匕さ れていない場合には、増幅産物が得られない。従って、この増幅産物の量は、標的 切断部位に含まれる標的切断点のそれぞれに対応する目的のヌクレオチド残基 (一 の標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基が複数存在する場合には、そのう ちの!/、ずれか一つ）の全て力 Sメチル化されて 、るゲノム DNAのコピー数に対応する ため、 目的のヌクレオチド残基 (群）におけるメチルイ匕の量を示す指標となる。例えば 、標的切断部位に一つの標的切断点が含まれる場合には、増幅産物の量は、その 標的切断点に対応する目的のヌクレオチド残基 (その標的切断点に対応する目的の ヌクレオチド残基が複数存在する場合には、そのうちのいずれか一つ）がメチル化さ れているゲノム DNAのコピー数に対応するため、 目的のヌクレオチド残基 (群）にお けるメチルイ匕の量を示す指標となる。
[0026] 対照領域の増幅工程では、ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側 に向けて最も近位に位置する前記 DNA切断処理工程による 2つの切断点の間に存 在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマーを 用いて、前記 DNA切断処理工程によって得られる消化産物を铸型とする核酸増幅 反応が行なわれ、さらに、得られる増幅産物の量が測定される。この核酸増幅反応で は、 目的のヌクレオチド残基カ チルイ匕されている力否かにかかわらず、一定のコピ 一数の増幅産物が得られる。従って、この増幅産物の量は、 目的のヌクレオチド残基 におけるメチルイ匕の状態を定量的に評価するための内部コントロールとなる。
[0027] 前記核酸増幅反応は、铸型となる DNA配列中の特定の領域を増幅することのでき る方法に従って、当業者により適宜実行される。このような方法としては、当技術分野 において多くの方法が知られており、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法 (PCR法:米国 特許第 4683195号明細書)、リガーゼ連鎖反応法 (LCR法:欧州特許出願公開第 0 320308号明細書)等が挙げられる。これらの方法は、複数の温度条件を含む温度 サイクルの数によって増幅産物の理論上のコピー数を制御することができるという利 点を有する。また、前記核酸増幅反応としては、一定の温度において核酸を増幅す る方法を用いることもでき、このような方法としては、例えば、 SDA法 (特開平 5— 192 195号公報）、 LAMP法（国際公開第 00Z28082号パンフレット）、 ICAN法（国際 公開第 02Z16639号パンフレット）等が挙げられる。
[0028] 前記標的領域または前記対照領域を増幅しうるプライマーは、選択された核酸増 幅反応の作用機序に応じて、当業者であれば容易に設計することができる。例えば、 このようなプライマーは、増幅の対象とする領域の第一鎖の 3'末端部分に特異的に ノ、イブリダィズする配列を少なくとも含んでなる第一のプライマーと、前記領域の第二 鎖の 3'末端部分に特異的にハイブリダィズする配列を少なくとも含んでなる第二の プライマーとを少なくとも含んでなるものとすることができる。
[0029] 本明細書において「特異的にハイブリダィズする」とは、前記プライマーがストリンジ ヱントな条件下で増幅の対象とする領域のいずれかの鎖の 3'末端部分にハイブリダ ィズし、かつ、核酸増幅反応に用いられる反応溶液中に存在する他のヌクレオチド分 子またはその一部にはハイブリダィズしないことを意味する。ストリンジェントな条件は 、 2つのヌクレオチド分子のハイブリダィズにより形成される二重鎖の融解温度 Tm ( °C)およびハイブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度などに依存して決定することができ、 例 ば、 J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecularし loning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照することができる。例えば、プライマ 一として用いられるヌクレオチド分子の融解温度よりわずかに低い温度下でハイプリ ダイゼーシヨンを行なうと、前記プライマーを所定の領域に特異的にノ、イブリダィズさ せることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、ある領域 (配列部分）に特異 的にハイブリダィズするプライマーは、その領域に相補的なヌクレオチド配列を含ん でなるものとされる。
[0030] 前記核酸増幅反応において铸型として用いられる消化産物としては、前記 DNA切 断処理工程によって得られる消化産物をそのままの形で用いてもよいし、該消化産 物を含む溶液を核酸増幅反応に好適な溶液となるように改変した溶液を用いてもよ い。また、前記 DNA切断処理工程によって得られる消化産物を、エタノール沈澱法 などの標準的な方法によって単離し、これを核酸増幅反応のための溶液中に溶解さ せることちでさる。 [0031] 本発明の好ましい実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増 幅工程の一方または両方における核酸増幅反応は、その反応中において増幅産物 の増加に対応して検出可能なシグナルの強度が増加する方法によって行なわれ、よ り好ましくはリアルタイム PCRとされる。このような方法により、核酸増幅反応の終了と 同時に、さらなる複雑な工程を要することなぐ増幅産物の量を測定することが可能と なる。このような方法は、例えば、増幅産物の量に対応する強度のシグナルを発生す るシグナル発生物質を予め核酸増幅反応のための反応溶液の中に添加しておくこと によって行なうことができる。
[0032] 前記シグナル発生物質としては、例えば、インターカレーターが挙げられる。従って 、本発明の一つの実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増幅 工程の一方または両方における増幅産物量の測定は、インターカレーター力 のシ グナル強度の測定によって行なわれる。本明細書にぉ 、て「インターカレーター」と は、二本鎖 DN Aを形成している二本の DN A鎖の間に侵入して蛍光を発する物質を 意味する。インターカレーターとしては様々な物質が知られており、例えば、臭化工 チジゥム、アタリジン色素、 SYBR Green (「SYBR」は Molecular Probes社の登録商 標である)等が挙げられる。
[0033] また、前記シグナル発生物質としては、 TaqManプローブを挙げることができる。従 つて、本発明の他の実施態様によれば、標的領域の増幅工程および対照領域の増 幅工程の一方または両方における増幅産物量の測定は、 TaqManプローブに起因 する蛍光強度の測定によって行なわれる。 TaqManプローブを用いた PCR法は、 Ta qManPCR法として当技術分野においてよく知られている。従って、本発明に用いる ための TaqManプローブは、当業者によって容易に設計され、調製される。
[0034] 上述の標的領域の増幅工程によって得られる測定値は、対照領域の増幅工程によ つて得られる測定値と比較される。これにより、標的領域の増幅工程によって得られる 測定値が内部コントロールによって標準化され、 目的のヌクレオチド残基 (群）のメチ ルイ匕の量的な指標を得ることができる。本発明の好ましい実施態様によれば、標的領 域の増幅工程によって得られる測定値を、対照領域の増幅工程によって得られる測 定値で除して得られる値力 サンプルにおける目的のヌクレオチド残基 (群）のメチル 化の量的な指標とされる。
[0035] 本発明の一つの好ましい実施態様による方法を、図 1に従って説明する。図 1に示 す方法では、上述の DNA消化処理に用いられる制限酵素として BssH IIが用いら れ、その認識配列中に存在するシトシン残基のメチル化の状態が定量的に評価され る。標的切断部位の 5'側および 3'側における DNA切断には、制限酵素として Eco R Iが用いられる。
[0036] まず、サンプル中に含まれるゲノム DNA上には、 EcoR I部位と BssH II部位とが 交互に存在しており、左側の BssH II部位 (標的 BssH II部位）に目的のシトシン残 基が含まれている（図 1上段）。このゲノム DNAを、 BssH IIと EcoR Iとを含む制限酵 素組成物で消化すると、 BssH II部位にメチルイ匕シトシンが存在する場合にはその 制限酵素部位は切断されず、 BssH II部位にメチルイ匕シトシンが存在しない場合に はその制限酵素部位は切断される。よって、消化産物中には、目的のシトシン残基が メチル化されているゲノム DNAコピーに由来する EcoR I— EcoR I断片と、目的のシ トシン残基がメチル化されていないゲノム DNAコピーに由来する EcoR I— BssH II 断片および BssH II— EcoR I断片とが混在する（図 1中段)。また、目的のシトシン残 基を含まない非標的 BssH II部位においても同様の反応が起こる。よって、消化産物 中には、非標的 BssH II部位とその周辺の領域に由来する EcoR I— EcoR I断片、 E coR I BssH II断片および BssH II— EcoR I断片も存在する（図 1中段の右側）。
[0037] 次 、で、標的 BssH II部位を含む EcoR I— EcoR I断片を铸型とした場合に該標的 BssH II部位を含む標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、消化産物を铸型とす るリアルタイム PCRが行なわれる。この PCRでは、標的 BssH II部位を含む EcoR I— EcoR I断片から増幅産物が得られるのに対し、 EcoR I BssH II断片および BssH II EcoR I断片から増幅産物は得られない（図 1下段の左側の増幅)。なお、前記プ ライマーは、前記標的領域に特異的な配列を有するため、非標的 BssH II部位とそ の周辺の領域に由来する EcoR I— EcoR I断片から増幅産物が得られることはない。
[0038] さらに、標的 BssH II部位を含む EcoR I— EcoR I断片を铸型とした場合に該標的 BssH II部位を含まない対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、消化産物を铸型 とするリアルタイム PCRが行なわれる。この PCRでは、標的 BssH II部位を含む Eco R I-EcoR I断片と、 EcoR I— BssH II断片および BssH II— EcoR I断片のいずれ か一方と力 増幅産物が得られる（図 1下段の右側の増幅)。よって、この PCRによれ ば、標的 BssH II部位における DNA切断の有無にかかわらず、一定量の増幅産物 が得られる。
[0039] 最後に、前記標的領域における PCR増幅量を前記対照領域における PCR増幅量 で除することによって、目的のシトシン残基におけるメチルイ匕の状態についての定量 的な評価値が得られる。
[0040] 本発明による方法によって目的のヌクレオチド残基におけるメチルイ匕の状態を定量 的に評価するために、必要な試薬をまとめてキットとすることができる。従って、本発 明によれば、制限酵素によるゲノム DNAの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド 残基のメチルイ匕の状態を定量的に評価するためのキットであって、（a)目的のヌクレ ォチド残基のメチルイ匕によってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害さ れる少なくとも 1種の制限酵素、（b)ゲノム上の標的切断部位よりも 5 '側および 3 '側 においてゲノム DNAを切断しうる試薬、（c)ゲノム上において、標的切断部位から 5' 側および 3 '側に向けて最も近位に位置する前記制限酵素または前記試薬による 2 つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅し うるプライマー、ならびに（d)ゲノム上において、標的切断部位から 5'側および 3 '側 に向けて最も近位に位置する、前記制限酵素または前記試薬による 2つの切断点の 間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライ マー、を含んでなるキットが提供される。
[0041] 本発明によるキットの具体的な構成は、これにより実施しょうとする具体的な方法お よびその作用機序によって異なり、例えば、本発明による方法について上述した説明 に従って設計することができる。
[0042] 従って、目的のヌクレオチド残基は、好ましくは前記制限酵素の認識配列中に含ま れるものとされる。また、前記制限酵素は、好ましくは、その認識配列に含まれるヌク レオチド残基のメチルイ匕によって阻害されるものとされる。
[0043] さらに、本発明の一つの実施態様によれば、前記試薬は、標的切断部位よりも 5' 側および 3 '側にお 、てゲノム DNAを切断しうる制限酵素を含んでなるものとされる。 また、本発明の他の実施態様によれば、前記試薬は、標的切断部位よりも 5'側にお Vヽてゲノム DNAを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも 3 '側にぉ ヽてゲ ノム DNAを切断しうる制限酵素を含んでなるものとされる。
[0044] また、本発明によるキットは、好ましくは、前記 (c)および (d)の一方または両方のプ ライマーによる核酸増幅反応において増幅産物の量に対応する強度のシグナルを 発生するシグナル発生物質をさらに含んでなるものとされる。前記シグナル発生物質 としては、例えば、上述のインターカレーター、 TaqManプローブ等が挙げられる。
[0045] さらに、本発明によるキットは、二本鎖 DNAの制限酵素処理に用いられる他の試薬 類、核酸増幅反応に用いられる他の試薬類、反応容器、本発明による方法の具体的 手順を記載した説明書等を含んで!/ヽてもよ ヽ。制限酵素処理に用いられる他の試薬 類としては、例えば緩衝液等が挙げられる。核酸増幅反応に用いられる他の試薬類 としては、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の触媒 、 dNTPミックス等の基質、緩衝液などが挙げられる。
実施例
[0046] 以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これら実施例は本発 明を限定するものではな 、。
[0047] 実施例 1：リーリン遣伝子プロモーター領城内の BssH II部位におけるメチル化の定
111名のヒト被験者力もゲノム DNAサンプルを採取し、各サンプルについて、リーリ ン遺伝子プロモーター領域内の特定の BssH II部位におけるメチルイ匕状態を定量的 に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。
[0048] (l) DNAの制限酵素消化
ゲノム DNAを、 2種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、そ の認識配列が目的のメチルイ匕部位を包含するメチル化感受性制限酵素 BssH IIとし 、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチルイ匕部位の 5'側および 3'側に存在 する制限酵素 EcoR Iとした。具体的には、 500ngのゲノム DNA、 6Uの BssH II、 6 Uの EcoR I、 5 1の 10 X H緩衝液、および蒸留水を含む 50 μ 1の反応溶液を調製 し、得られた反応溶液を、通気下、 37°Cで一晩インキュベートした。 [0049] 次いで、切断された DNA断片をエタノール沈澱によって回収し、これを TE溶液に 溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に 100 1のエタノール（ 100%)および 5 1の 3M酢酸ナトリウムを添カ卩し、これを 20°Cに 20分間置いた。こ の溶液を遠心分離（17, 800 X g、 4°C、 15分間）した後に上清を除去した。この溶液 に 200 1の 70%エタノールを添加し、遠心分離（17, 800 X g、 4。C、 5分間）した後 に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を 50 1の TE溶液に溶解させた。 この溶液中の DNA濃度は、 260nmでの吸光度測定（Dilution Facter: X20
(4:76ddw))により決定した。
[0050] (2)リアルタイム PCR
上述のようにして得られた DNA断片を铸型として、 2通りのリアルタイム PCRを行な つた。一方の PCR (内部コントロール PCR)では、ゲノム DNA上において上述の Bss H II部位から 5'側および 3'側に向力つて最初に存在する 2つの EcoR Iにより挟ま れた EcoR I— EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含まな 、領域 (対照領域)を 増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロール PCRでは、増幅産物の量を示 すシグナル発生手段として、 SYBR Greenを用いた。他方の PCR (ターゲット PCR) では、前記 EcoR I— EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含む領域 (標的領域） を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲット PCRでは、増幅産物の量を示すシ グナル発生手段として、 TaqManプローブを用いた。これらの PCRに用いたプライマ 一およびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
[0051] 内部コントロール PCR:
フォワード (RC- Fl) : 5，- GAACAGTCCGGCGAAGAGAG- 3' (配列番号 1)； リバース (RC- R1)： 5 ' -C AGAGCCTC ATCTGTAGAGGATTT-3 ' (配列番号 2)。
ターゲット PCR:
フォワード (RC- F3) : 5，- CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA- 3' (配列番号 3)； リバース (RC- R3) : 5，- GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG- 3' (配列番号 4)； TaqManプローブ：
5し FAM- CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG- TAMRA- 3' (配列番号 5)。
[0052] 内部コントロール PCRのための反応溶液は、 60ngの铸型 DNA、それぞれ 200η Mの各プライマー、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。ターゲット PCRの ための反応溶液は、 60ngの铸型 DNA、それぞれ 200nMの各プライマー、 ΙΟΟηΜ の TaqManプローブ、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix(TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。
[0053] リアルタイム PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7000 Sequence Detection System (
Applied Biosystems)を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を 50°Cで 2分間処理 し、さらに 95°Cで 10分間処理した後に、 95°Cで 20秒間および 60°Cで 1分間の処理 を 48サイクノレとした。
[0054] また、標準サンプルとして、 10倍、 100倍および 1000倍に希釈した標準 DNAを用 いた。
[0055] (3)結果
上述の 2通りのリアルタイム PCRにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲット P CRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRにおける測定値)を算出し、その値を 対数グラフ上にプロットした。その結果を図 2に示す。図 2において、各データは、 3回 の独立した実験の平均値を示している。図 2によれば、リーリン遺伝子プロモーター 中の上述の部位におけるメチルイ匕の程度は、被験者の間で大幅に異なることが明ら カゝとなった。
[0056] 実施例 2： DRD2遣伝子プロモーター領城内の BssH II部位におけるメチル化の定
111名のヒト被験者からゲノム DNAサンプルを採取し、各サンプルについて、 DR D2遺伝子プロモーター領域内の特定の BssH II部位におけるメチルイ匕状態を定量 的に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。
[0057] (l) DNAの制限酵素消化
ゲノム DNAを、 2種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、そ の認識配列が目的のメチルイ匕部位を包含するメチル化感受性制限酵素 BssH IIとし 、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチルイ匕部位の 5'側および 3'側に存在 する制限酵素 EcoR Iとした。具体的には、 500ngのゲノム DNA、 6Uの BssH II、 6 Uの EcoR I、 5 1の 10 X H緩衝液、および蒸留水を含む 50 μ 1の反応溶液を調製 し、得られた反応溶液を、通気下、 37°Cで一晩インキュベートした。
[0058] 次いで、切断された DNA断片をエタノール沈澱によって回収し、これを TE溶液に 溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に 100 1のエタノール（ 100%)および 5 1の 3M酢酸ナトリウムを添カ卩し、これを 20°Cに 20分間置いた。こ の溶液を遠心分離（17, 800 X g、 4°C、 15分間）した後に上清を除去した。この溶液 に 200 1の 70%エタノールを添加し、遠心分離（17, 800 X g、 4。C、 5分間）した後 に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を 50 1の TE溶液に溶解させた。 この溶液中の DNA濃度は、 260nmでの吸光度測定（Dilution Facter: X20
(4:76ddw))により決定した。
[0059] (2)リアルタイム PCR
上述のようにして得られた DNA断片を铸型として、 2通りのリアルタイム PCRを行な つた。一方の PCR (内部コントロール PCR)では、ゲノム DNA上において上述の Bss H II部位から 5'側および 3'側に向力つて最初に存在する 2つの EcoR Iにより挟ま れた EcoR I— EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含まな 、領域 (対照領域)を 増幅しうるプライマーペアを用いた。他方の PCR (ターゲット PCR)では、前記 EcoR I EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含む領域 (標的領域)を増幅しうるプライ マーペアを用いた。これらの PCRでは、増幅産物の量を示すシグナル発生手段とし て、 SYBR Greenを用いた。これらの PCRに用いたプライマーのヌクレオチド配列は 、以下のとおりである。
[0060] 内部コントロール PCR:
フォワード (DRD2-5FABconF2)： 5'- CCTGTCATCAATCACACAGTGC- 3' (配列番 号 6) ;
リバース (DRD2- 5FABconR2)： 5'- CATGGCTGAGTGGATTTCATGCT- 3' (配列番 号 7)。
ターゲット PCR:
フォワード (DRD2-5FABmetF2)： 5し AGGTACAGCTCCTTTGGTGG- 3' (配列番号 8 )； リバース (DRD2- 5FABmetRl)： 5し CAGCAGCTCGGCCGGCTCT- 3' (配列番号 9)。
[0061] PCRのための反応溶液は、 60ngの铸型 DNA、それぞれ 200nMの各プライマー
、 12. 5 1の 2 X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems)
、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。
[0062] リアルタイム PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7000 Sequence Detection System (
Applied Biosystems)を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を 50°Cで 2分間処理 し、さらに 95°Cで 10分間処理した後に、 95°Cで 20秒間および 60°Cで 1分間の処理 を 48サイクノレとした。
[0063] また、標準サンプルとして、 10倍、 100倍および 1000倍に希釈した標準 DNAを用 いた。
[0064] (3)結果
上述の 2通りのリアルタイム PCRにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲット P CRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRにおける測定値)を算出し、その値を 対数グラフ上にプロットした。その結果を図 3に示す。図 3において、各データは、 3回 の独立した実験の平均値を示している。図 3によれば、 DRD2遺伝子プロモーター中 の上述の部位におけるメチルイ匕の程度は、被験者の間でほぼ同様であることが明ら カゝとなった。
[0065] 実施例 3：リーリン遺伝子プロモーター領城内の BssH II部位におけるメチル化の定 龍
リーリン遺伝子 (RELN)プロモーターの作用によりホタルルシフェラーゼを発現す るプラスミドを作製し、 RELNプロモーター領域におけるメチルイ匕の程度とホタルルシ フェラーゼの発現効率との関係を調べた。具体的な手順および結果は、以下に示す とおりである。
[0066] (1)プラスミドの作製
プロモーター領域および第一ェクソンを含むリーリン遺伝子 (RELN)領域を、ヒトゲ ノム DNAを铸型とし、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い る PCRによって増幅した。
RELN-532F： 5'- GTTCTAGATCTTCCCAGGAAAAACAGGGCACACTG- 3' (配列 番号 10)；
RELN+misR: 5 '-AATATCCATGGTGGCGAGCACCTCGCCCTGC-3' (配列番号 11
) o
[0067] 次!、で、得られた増幅産物を Bgl IIおよび Nco Iで消化し、同じく Bgl IIおよび Nco
Iで消化した pGL3— controlベクター（Promega社製）に挿入した。得られる pRELN Lucに含まれるルシフェラーゼ発現カセットの構造を、図 4に示す。 pRELN— Luc では、 pGL3— controlベクター中に含まれていた SV40プロモーターに代えて、 RE LN遺伝子プロモーターがホタルルシフェラーゼのコード配列に連結されている。
[0068] 得られた pRELN— Lucをコンビテント細胞である大腸菌 JM109株に導入してこれ を培養した後、 HiSpeed Plasmid Midi Kit (QIAGEN社製）を用いて該培養物からプラ スミドを抽出した。
[0069] (2)プラスミドの部分メチルイ匕
pRELN— Lucを、 CpGメチラーゼである M. Ssslを用いて部分的にメチル化した。 具体的には、 5. Ο ΐの 10 X NEB Buffer2、 4Uの M. Sssl, 10ngの pRELN—Luc、 10 X SAM基質、および蒸留水を含む 100 1の反応液を調製し、これを 37°Cでイン キュペートした。ここで、異なるメチルイ匕度を有する 3種の pRELN— Lucを作製するた め、 SAM基質の終濃度を 2 X、 I Xおよび 0. 2 Xとし、反応時間をそれぞれ 6時間、 3時間および 2時間とした。反応後のプラスミドの精製は Wizard SV Gel and PCR Clean- Up System (Promega社製）を用いて行ない、 50 1の蒸留水で溶出した。この ようにして、メチルイ匕度の異なる 3種のプラスミドを得た (メチルイ匕度の高い順に、「pR ELN-Luc (H M)」、「pRELN— Luc (M M)」、および「pRELN— Luc (L M)」とい う)。
[0070] (3)メチル化の定量的評価
各メチルイ匕 pRELN— Lucを、 2種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制 限酵素は、その認識配列が目的のメチルイ匕部位を包含するメチル化感受性制限酵 素 BssH IIとし、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチルイ匕部位の 5'側およ び 3'側に存在する制限酵素 BamHIとした。具体的には、 25ngのプラスミド、 6Uの B ssH II、 6Uの BamHI、 5 μ 1の 10 X H緩衝液、および蒸留水を含む 50 μ 1の反応溶 液を調製し、得られた反応溶液を、通気下、 37°Cで一晩インキュベートした。
[0071] 次いで、切断された DNA断片をエタノール沈澱によって回収し、これを TE溶液に 溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に 100 1のエタノール（ 100%)および 5 1の 3M酢酸ナトリウムを添カ卩し、これを 20°Cに 20分間置いた。こ の溶液を遠心分離（17, 800 X g、 4°C、 15分間）した後に上清を除去した。この溶液 に 200 1の 70%エタノールを添加し、遠心分離（17, 800 X g、 4。C、 5分間）した後 に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を 50 1の TE溶液に溶解させた。 この溶液中の DNA濃度は、 260nmでの吸光度測定（Dilution Facter: X20
(4:76ddw))により決定した。
[0072] 上述のようにして得られた DNA断片を铸型として、 2通りのリアルタイム PCRを行な つた。一方の PCR (内部コントロール PCR)では、プラスミド上において上述の BssH II部位から 5'側および 3'側に向力つて最初に存在する 2つの BamHIにより挟まれた BamHI— BamHI領域中の、 目的のメチル化部位を含まない領域（対照領域： 150b P)を増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロール PCRでは、増幅産物の量 を示すシグナル発生手段として、 SYBR Greenを用いた。他方の PCR (ターゲット P CR)では、前記 BamHI— BamHI領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含む領域 (標的 領域： 275bp)を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲット PCRでは、増幅産物 の量を示すシグナル発生手段として、 TaqManプローブを用いた。これらの PCRに 用いたプライマーおよびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
[0073] 内部コントロール PCR:
フォワード (pGL3ssl044) : 5，- TTTGATATGTGGATTTCGAG- 3' (配列番号 12)； リバース (pGL3asl 194)： 5し ATCGTATTTGTCAATCAGAG- 3' (配列番号 13)。 ターゲット PCR:
フォワード (RC- F3) : 5，- CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA- 3' (配列番号 3)； リバース (RC- R3) : 5，- GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG- 3' (配列番号 4)； TaqManプローブ：
5し FAM- CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG- TAMRA- 3' (配列番号 5)。
[0074] 内部コントロール PCRのための反応溶液は、 lngの铸型 DNA、それぞれ 200nM の各プライマー、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。ターゲット PCRの ための反応溶液は、 lngの铸型 DNA、それぞれ 200nMの各プライマー、 ΙΟΟηΜ の TaqManプローブ、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix (TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶 液とした。
[0075] リアルタイム PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7000 Sequence Detection System (
Applied Biosystems)を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を 50°Cで 2分間処理 し、さらに 95°Cで 10分間処理した後に、 95°Cで 20秒間および 60°Cで 1分間の処理 を 48サイクノレとした。
[0076] (4)デュアルルシフェラーゼレポーターアツセィ
レチノイン酸 (RA)で 3週間処理したヒト NTera2Dl細胞に、各メチル化 pRELN— Luc (0. 2 /z gZtest)を、ゥミシィタケルシフェラーゼを発現する phRL— TK ( Promega社製） (0. 05 gZtest)とともに共トランスフエクシヨンした。トランスフエクシ ヨンの 48時間後、 Dua卜 Luciferase Reporter Assay System (Promega社製）を用いて ルシフェラーゼの活性を調べた。対照として、非メチル化 pRELN— Luc (「pRELN— Luc (no M)」）、 SV40プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する pG L3— promoter (Promega社製）、およびプロモーターにもェンハンサーにも連結され て ヽな 、ホタルルシフェラーゼ配列を有する pGL3— basic (Promega社製）を用いた。
[0077] (5)結果
メチルイ匕の定量的評価の結果およびルシフェラーゼアツセィの結果を、図 5に示す 。図 5の左側に示される棒グラフは、上述の 2通りのリアルタイム PCRにおけるシグナ ル強度の測定値から、（ターゲット PCRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRに おける測定値)を算出し、その値を棒グラフとして示したものである。図 5の右側に示 される棒グラフは、デュアルルシフェラーゼアツセィにおける蛍光の測定値を、（ホタ ルルシフェラーゼの測定値) / (ゥミシィタケルシフェラーゼの測定値)を算出すること により標準化し、その値を棒グラフとして示したものである。図 5によれば、プロモータ 一領域におけるメチルイ匕度が高くなるにつれて、そのプロモーターの作用が弱くなり 、発現効率が低下することが確認された。
[0078] 実施例 4 :跺うつ病患者、統合失調症患者および健常者からのリーリン遺伝子プロモ 一ター領城内の BssH II部位におけるメチル化の定量的評価
死亡した 35名の躁うつ病（bipolar disorder)患者（男性： 17名、女性： 18名、死亡年 齢： 19一 64歳、平均死亡年齢: 46歳）、死亡した 35名の統合失調症（schizophrenia )患者 (男性: 26名、女性 : 9名、死亡年齢：19一 59歳、平均死亡年齢 :43歳）、およ び死亡した 35名の健常者 (男性： 26名、女性： 9名、死亡年齢： 31— 60歳、平均死 亡年齢： 45歳）の脳前頭葉力もゲノム DNAサンプルを採取し、各サンプルにつ 、て 、リーリン遺伝子プロモーター領域内の特定の BssH II部位におけるメチルイ匕状態を 定量的に評価した。具体的な手順および結果は、以下に示すとおりである。
[0079] (l) DNAの制限酵素消化
ゲノム DNAを、 2種の制限酵素を用いて消化した。ここで、一方の制限酵素は、そ の認識配列が目的のメチルイ匕部位を包含するメチル化感受性制限酵素 BssH IIとし 、他方の制限酵素は、その認識配列が前記メチルイ匕部位の 5'側および 3'側に存在 する制限酵素 EcoR Iとした。具体的には、 500ngのゲノム DNA、 6Uの BssH II、 6 Uの EcoR I、 5 1の 10 X H緩衝液、および蒸留水を含む 50 μ 1の反応溶液を調製 し、得られた反応溶液を、通気下、 37°Cで一晩インキュベートした。
[0080] 次いで、切断された DNA断片をエタノール沈澱によって回収し、これを TE溶液に 溶解した。具体的には、上述のようにして得られた反応溶液に 100 1のエタノール（ 100%)および 5 1の 3M酢酸ナトリウムを添カ卩し、これを 20°Cに 20分間置いた。こ の溶液を遠心分離（17, 800 X g、 4°C、 15分間）した後に上清を除去した。この溶液 に 200 1の 70%エタノールを添加し、遠心分離（17, 800 X g、 4。C、 5分間）した後 に、エタノールを完全に蒸発させた。得られた残渣を 50 1の TE溶液に溶解させた。 この溶液中の DNA濃度は、 260nmでの吸光度測定（Dilution Facter: X20
(4:76ddw))により決定した。
[0081] (2)リアルタイム PCR
上述のようにして得られた DNA断片を铸型として、 2通りのリアルタイム PCRを行な つた。一方の PCR (内部コントロール PCR)では、ゲノム DNA上において上述の Bss H II部位から 5'側および 3'側に向力つて最初に存在する 2つの EcoR Iにより挟ま れた EcoR I— EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含まな 、領域 (対照領域)を 増幅しうるプライマーペアを用いた。内部コントロール PCRでは、増幅産物の量を示 すシグナル発生手段として、 SYBR Greenを用いた。他方の PCR (ターゲット PCR) では、前記 EcoR I— EcoR I領域中の、 目的のメチルイ匕部位を含む領域 (標的領域） を増幅しうるプライマーペアを用いた。ターゲット PCRでは、増幅産物の量を示すシ グナル発生手段として、 TaqManプローブを用いた。これらの PCRに用いたプライマ 一およびプローブのヌクレオチド配列は、以下のとおりである。
[0082] 内部コントロール PCR:
フォワード (RC- Fl) : 5，- GAACAGTCCGGCGAAGAGAG- 3' (配列番号 1)； リバース (RC- R1)： 5 ' -C AGAGCCTC ATCTGTAGAGGATTT-3 ' (配列番号 2)。
ターゲット PCR:
フォワード (RC- F3) : 5，- CGGCGTCTCCAAAACTGAATGA- 3' (配列番号 3)； リバース (RC- R3) : 5，- GTGGGGTTGCCCGCAATATGCAG- 3' (配列番号 4)； TaqManプローブ：
5し FAM- CTAGCGCTGTTGCTGGGGGCGACGCTG- TAMRA- 3' (配列番号 5)。
[0083] 内部コントロール PCRのための反応溶液は、 60ngの铸型 DNA、それぞれ 200η Μの各プライマー、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix (SYBR Green PCR Master Mix: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。ターゲット PCRの ための反応溶液は、 60ngの铸型 DNA、それぞれ 200nMの各プライマー、 ΙΟΟηΜ の TaqManプローブ、 12. 5 μ 1の 2 X Master Mix (TaqMan Universal PCR Master Mix: Applied Biosystems)、および蒸留水を含む計 25 μ 1の溶液とした。
[0084] リアルタイム PCRは、 ABI PRISM (登録商標） 7000 Sequence Detection System (
Applied Biosystems)を用いて行なった。温度条件は、反応溶液を 50°Cで 2分間処理 し、さらに 95°Cで 10分間処理した後に、 95°Cで 20秒間および 60°Cで 1分間の処理 を 48サイクノレとした。
[0085] (3)結果
上述の 2通りのリアルタイム PCRにおけるシグナル強度の測定値から、（ターゲット P CRにおける測定値) Z (内部コントロール PCRにおける測定値)を算出し、その値を 対数グラフ上にプロットした。その結果を図 6に示す。図 6において、縦軸はメチルイ匕 度を示し、横軸は被験者の死亡時の年齢を示している。また、各データは、 3回の独 立した実験の平均値を示して!/ヽる。
図 6Aは、躁うつ病患者におけるメチルイ匕度と死亡時年齢との関係を示す。図 6Bは 、統合失調症患者におけるメチル化度と死亡時年齢との関係を示す。図 6Cは、健常 者におけるメチルイ匕度と死亡時年齢との関係を示す。図 6A、 Bおよび Cによれば、疾 患群 (躁うつ病患者および統合失調症患者)と健常者とでは分布像が異なっており、 健常者では年齢とメチルイ匕度との間に有意な相関が見られたのに対し、患者群では このような相関は見られない。また、疾患群では、比較的若い年代に高メチルイ匕度を 示すサンプルが存在する。

Claims

請求の範囲
[1] 制限酵素によるゲノム DNAの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチ ルイ匕の状態を定量的に評価する方法であって、
(a)ゲノム DNAを含むサンプル中の DNAを、 目的のヌクレオチド残基のメチル化に よってゲノム上の標的切断部位における切断作用が阻害される少なくとも 1種の制限 酵素で消化し、かつ、ゲノム上の標的切断部位よりも 5 '側および 3'側において前記 DN Aを切断する工程、
(b)ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側に向けて最も近位に位置 する工程 (a)による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含むゲノム上 の標的領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程 (a)によって得られる消化産物を 铸型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、
(c)ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側に向けて最も近位に位置 する工程 (a)による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切断部位を含まないゲノ ム上の対照領域を増幅しうるプライマーを用いて、工程 (a)によって得られる消化産 物を铸型とする核酸増幅反応を行ない、得られる増幅産物の量を測定する工程、な らびに
(d)工程 (b)によって得られる測定値と、工程 (c)によって得られる測定値とを比較す る工程
を含んでなる、方法。
[2] 目的のヌクレオチド残基が、前記制限酵素の認識配列中に含まれるものである、請 求項 1に記載の方法。
[3] 前記制限酵素が、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチルイ匕によって阻 害されるものである、請求項 1に記載の方法。
[4] 工程 (a)力 ゲノム DNAを含むサンプル中の DNAを、標的切断部位よりも 5，側お よび 3'側においてゲノム DNAを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる、 請求項 1に記載の方法。
[5] 工程 (a)力 ゲノム DNAを含むサンプル中の DNAを、標的切断部位よりも 5，側に お!、てゲノム DNAを切断しうる制限酵素、および標的切断部位よりも 3 '側にぉ 、て ゲノム DNAを切断しうる制限酵素で消化することを含んでなる、請求項 1に記載の方 法。
[6] 工程 (b)および工程 (c)の一方または両方における核酸増幅反応が、リアルタイム
PCRである、請求項 1に記載の方法。
[7] 工程 (b)および工程 (c)の一方または両方における増幅産物量の測定が、インター カレーターからのシグナル強度の測定によって行なわれる、請求項 1に記載の方法。
[8] 工程 (b)および工程（c)の一方または両方における増幅産物量の測定が、 TaqMa nプローブに起因する蛍光強度の測定によって行なわれる、請求項 1に記載の方法。
[9] 工程 (b)によって得られる測定値を、工程 (c)によって得られる測定値で除して得ら れる値が、前記サンプルにおける目的のヌクレオチド残基のメチルイ匕の量的な指標と される、請求項 1に記載の方法。
[10] 制限酵素によるゲノム DNAの切断を阻害する、ゲノム上のヌクレオチド残基のメチ ルイ匕の状態を定量的に評価するためのキットであって、
(a)目的のヌクレオチド残基のメチルイ匕によってゲノム上の標的切断部位における切 断作用が阻害される少なくとも 1種の制限酵素、
(b)ゲノム上の標的切断部位よりも 5 '側および 3 '側にぉ 、てゲノム DNAを切断しう る S¾薬、
(c)ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側に向けて最も近位に位置 する前記制限酵素または前記試薬による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的切 断部位を含むゲノム上の標的領域を増幅しうるプライマー、ならびに
(d)ゲノム上にぉ 、て、標的切断部位から 5 '側および 3 '側に向けて最も近位に位置 する、前記制限酵素または前記試薬による 2つの切断点の間に存在し、かつ、標的 切断部位を含まないゲノム上の対照領域を増幅しうるプライマー
を含んでなる、キット。
[11] 目的のヌクレオチド残基が、前記制限酵素の認識配列中に含まれるものである、請 求項 10に記載のキット。
[12] 前記制限酵素が、その認識配列に含まれるヌクレオチド残基のメチルイ匕によって阻 害されるものである、請求項 10に記載のキット。
[13] 前記試薬が、標的切断部位よりも 5 '側および 3'側においてゲノム DNAを切断しう る制限酵素を含んでなるものである、請求項 10に記載のキット。
[14] 前記試薬が、標的切断部位よりも 5 '側においてゲノム DNAを切断しうる制限酵素
、および標的切断部位よりも 3'側においてゲノム DNAを切断しうる制限酵素を含ん でなるものである、請求項 10に記載のキット。
[15] 前記 (c)および (d)の一方または両方のプライマーによる核酸増幅反応にぉ 、て増 幅産物の量に対応する強度のシグナルを発生するシグナル発生物質をさらに含ん でなる、請求項 10に記載のキット。
[16] 前記シグナル発生物質力インターカレーターである、請求項 15に記載のキット。
[17] 前記シグナル発生物質が TaqManプローブである、請求項 15に記載のキット。
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