JP2002112799A - 癌疾患の予後判定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサン
プルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か
否かを診断することのできる技術を確立する。 【解決手段】癌部または非癌部組織検体より得られたＤ
ＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測
定し、その割合に基づいて癌疾患の予後が良好か否かを
判断する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌患者の手術の予
後が良好か否か、具体的には癌再発の危険性を判定する
のに有用な方法に関する。さらに本発明は当該方法に用
いられるＤＮＡマーカー配列、及びオリゴヌクレオチド
に関する。本発明の方法によれば、治療前に予め被験者
（患者）の癌再発の確率が予測できるので、これを参考
にして個々の患者に適した治療方法並びに治療後のアフ
ターケアを検討することが可能となる。

【０００２】

【従来の技術】癌患者の治療（手術）後の癌再発の有無
を予想することは臨床的に大変重要なことである。この
ため従来より、癌患者の遺伝子異常を中心に種々の因子
について研究されており、食道癌や乳癌ではc-erb Ｂ癌
遺伝子及びint-２癌遺伝子の増幅が癌の再発・転移など
の臨床特性と相関するという知見から、当該癌遺伝子が
マーカーとして癌患者の治療予後の判定に利用されてい
る。例えば、食道癌では、ｃ-erbＢ癌遺伝子増幅症例及
びint-２癌遺伝子増幅症例では術後累積生存率が低く、
さらにint-２癌遺伝子増幅症例では、高い確率で術後遠
隔臓器への転移が認められている。しかしながら、肝細
胞癌症例においては既知の癌遺伝子の増幅と再発・転移
や術後累積生存率などの臨床特性との間に密接な相関関
係は見出されておらず、従来報告されている遺伝子異常
だけでは、正しく患者の手術後の予後を判断することが
出来ない。

【０００３】ところで、ミワらによって、ＲＬＧＳ法
（Hatada, I., et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA,
88, 9523-9527 (1991)）を用いて、ヒト癌細胞株からＤ
ＮＡを検出し、染色体8q21に局在する200コピーの13ｋ
ｂの核酸中の繰り返し配列の一部分が明らかにされ、該
繰り返し配列中に生じるＮｏｔＩ制限酵素の認識部位に
おける脱メチル化現象が幾つかのタイプの癌の発生また
は進展に関連しているという可能性が報告されている
（Miwa,W.,et al. Electrophoresis, 16 (2) 227-232(1
995))。

【０００４】また、ナガイらによって、同じくＲＬＧＳ
法を用いて、ヒト肝細胞癌(HCC)患者の癌組織検体から
ＮｏｔＩ制限酵素認識部位を有する1.4ｋｂのＤＮＡ繰
り返し配列を有する新規遺伝子（ＤＥ−１）が単離され
た。該DE-1遺伝子は、健常なヒト肝細胞においてはメチ
ル化されていたが、ヒト肝細胞癌においては高い頻度を
持ってＣｐＧジヌクレオチドのシトシン残基で脱メチル
化されており、この遺伝子領域のＤＮＡ低メチル化が細
胞の分子量化と肝癌発生の両方において何らかの役割を
演じているという可能性が報告されている(Nagai, H.,e
t al.，Gene, 237 (1) 15-20 (1999))。

【０００５】そして、本発明者らもまた、同じくＲＬＧ
Ｓ法により、肝癌患者のＤＮＡを制限酵素NotI−PvuII
で切断し、更にPstIでイン・サィツゥ(in situ)に切断
した断片をポリアクリルアミドゲルにて分離して得られ
るスポットの変化数が肝癌患者の術後の予後と相関して
いることを報告している(Itano, O., et al., Oncogen
e, 19, 1676-1683 (2000))。

【０００６】一方、遺伝子断片を大量に増幅する方法で
あるＰＣＲ法は、組織中ＲＮＡの発現量やウイルスＤＮ
Ａ量などを定量測定する方法としても応用され、鋳型依
存性核酸ポリメラーゼプローブを用いてＰＣＲ反応をリ
アルタイムでモニターしたカイネティックス分析によ
り、２倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量ＰＣ
Ｒ法が開発されている(均質検定システム：特許登録番
号第2825976号、ABI PRISM 7700 Sequence Detection S
ystem User's Manual: 5.10.5.13(1996))。

【０００７】当該定量ＰＣＲ法は、定量的リアルタイム
ＰＣＲ検出法（TaqManＰＣＲ法）と呼ばれ、各種ウイル
ス遺伝子の測定に応用されている(ＥＢウイルス遺伝
子：特開平11-137300号、ＨＣＶウイルス遺伝子：特開
平11-103899号、ＨＢＶウイルス遺伝子：特開平11-1038
97号)。さらに該方法は、男女のＸ染色体の差や癌抑制
遺伝子の欠失の判定に応用され(Boulay, J.L., et al.,
Biotechniques, 27, 228-230 (1999))、また末梢血か
ら抽出したＤＮＡによって癌家系内の保因者同定が、Ｌ
ＯＨ法やＦＩＳＨ法より簡便に行えることも報告されて
いる(Laurendaeau,I., et al., Clin. Chem., 45(7) 98
2-986 (1999))。

【０００８】ヒト癌領域においては、このTaqManＰＣＲ
法を用いることにより、サンプル中のＤＮＡの非メチル
化、メチル化を簡単に測定できることが報告されている
(Eads, CA. et al., Nucleic Acids Res.,28(8) E32 (2
000): MethyLight : a high-throughput assay to meas
ure ＤＮＡ methylation.)。

【０００９】しかしながら、癌患者、特に肝癌患者の術
後の予後の判定には、上記ＲＬＧＳ法は、２度の制限酵
素消化、ゲル電気泳動並びに放射線標識したｄＮＴＰｓ
或いはハイブリダイゼーション・プローブなど、手間の
かかる操作が必要であるため、簡便な方法とは言い難
い。

【００１０】また、従来メチル化または脱メチル化の程
度の検出は、例えば癌部と非癌部の２種類の組織を対象
として両者のメチル化または脱メチル化の程度を比較す
ることによって行っていた。しかしこの方法は、用いる
組織によってＤＮＡ増幅に違いがあるため（例えば、癌
部ではメチル化または脱メチル化部位が増幅しているの
に対し、非癌部では増幅していない等の相違）、単純な
方法で、メチル化または脱メチル化の程度を比較するこ
とができないという問題があった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、癌疾患に関
して上記従来の問題を解決し、少量のＤＮＡサンプルを
用いて短時間で簡便な操作で癌患者の治療予後の診断を
可能とする方法を提供することを目的とする。具体的に
は、本発明は癌組織中のＤＮＡのメチル化または脱メチ
ル化の程度を簡便な方法で精度良く測定することによ
り、癌の予後を診断する方法を提供することを目的とす
る。さらに本発明は、癌患者の手術後の治療方針を判断
したり決定するのに役立つ臨床上重要な情報を取得する
のに有用な診断・判定方法を提供することを目的とす
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために鋭意研究した結果、癌部組織より得られ
るＤＮＡくり返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの
数と癌治療の予後（癌再発の確率）との間に一定の相関
関係があることを見いだし、当該脱メチル化ＤＮＡの数
を指標にすることによって癌患者の手術の予後が良好か
否かを、手術前に予め診断できることを確認した。そし
て、本発明者は、当該方法を実施することによって得ら
れる情報は、癌患者、特に肝癌患者の手術方法並びに手
術後の治療方針（アフターケア）を判断し、かつ決定す
ることに有効に役立つことを確信して、本発明を完成す
るにいたった。

【００１３】即ち本発明は下記（１）〜（１４）に掲げ
る、癌患者の予後を診断する方法である： （１）癌部または非癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返
し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、該Ｄ
ＮＡ数に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。 （２）ＤＮＡ繰り返し配列がセントロメリック・クラス
ター領域、またはタンデムリピート領域に由来するもの
である、（１）記載の癌疾患の予後を診断する方法。 （３）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存
在する脱メチル化ＤＮＡ数をＴａｑＭａｎＰＣＲ法を用
いて検出・測定することを特徴とする、（１）又は
（２）に記載の癌疾患の予後を診断する方法。 （４）ＤＮＡ繰り返し配列がメチル化感受性制限酵素認
識部位を有するものであることを特徴とする（１）乃至
（３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方
法。 （５）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ
、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ及びＳｆｉＩよりなる群から
選択されるいずれかの制限酵素から選択されるものであ
る、（４）記載の癌疾患の予後を診断する方法。 （６）メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩであることを
特徴とする、（４）に記載の癌疾患の予後を診断する方
法。 （７）ＤＮＡ繰り返し配列が配列番号１〜４に示される
ＤＮＡ配列のいずれか少なくとも１つのＤＮＡ配列であ
ることを特徴とする（１）乃至（６）のいずれかに記載
の癌疾患の予後を診断する方法。 （８）癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチ
ル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にア
ダプターをライゲーションし、このアダプターのＤＮＡ
配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル化感受
性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増幅する
ことのできるリバース・プライマーを用いて、メチル化
感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に増幅
し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プライ
マーの間に設定したプローブにより増幅したＤＮＡを定
量することによって、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル
化ＤＮＡの数(NC-1)を定量する工程ａ：ＤＮＡ繰り返し
配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない部
分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プラ
イマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量す
ることによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)を
定量する工程ｂ：並びに工程ａで定量した脱メチル化し
たＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し配
列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-
2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃからなり、工程ｃに
よって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ10
0(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。 （９）配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドをフォ
ワード・プライマーとして、配列番号６で示されるオリ
ゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号７で示
されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとし
て用いて工程ａを行い、また配列番号８で示されるオリ
ゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとして、配列
番号９で示されるオリゴヌクレオチドをプローブとし
て、また配列番号１０で示されるオリゴヌクレオチドを
リバース・プライマーとして用いて工程ｂを行うことを
特徴とする、（８）に記載の癌疾患の予後を診断する方
法。 （１０）脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100
(％)〕が１％未満の場合を癌患者の予後が良好とし、１
％以上を予後不良として判断することからなる、（８）
または（９）に記載の癌疾患の手術の予後を診断する方
法。 （１１）癌が非上皮系癌細胞に起因する癌である（１）
乃至（７）のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する
方法。 （１２）癌が肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵
臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、乳
癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病よりなる群
から選択されるいずれかである、（１）乃至（１０）の
いずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。 （１３）癌が肝細胞癌である（１）乃至（１０）のいず
れかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。 （１４）癌治療の手術前に実施することを特徴とする、
（１）乃至（１３）のいずれかに記載の癌疾患の予後を
診断する方法。

【００１４】また本発明は、癌疾患の予後を診断するた
めに用いられるＤＮＡマーカー配列であり、これらとし
ては配列番号１〜４に記載されるオリゴヌクレオチドを
例示することができる。

【００１５】さらに本発明は、上記（８）に記載の癌疾
患の予後を診断する方法に用いられるヌクレオチドのセ
ットであって、かかるヌクレオチドとして下記のものを
例示することができる： ＜工程ａ＞ フォワードプライマー：配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド、 プローブ ：配列番号６で示されるオリゴヌクレオチド、 リバースプライマー ：配列番号７で示されるオリゴヌクレオチド、 ＜工程ｂ＞ フォワードプライマー：配列番号８で示されるオリゴヌクレオチド、 プローブ ：配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド、 リバースプライマー ：配列番号10で示されるオリゴヌクレオチド。

【００１６】本発明によれば、同一組織（癌組織）を対
象として、これから得られるＤＮＡの繰り返し配列中の
メチル化部位又は脱メチル化部位の数と、ＤＮＡ繰り返
し配列の数を比較することによって得られる情報に基づ
いて、癌患者の治療後（手術後）の予後が良好か否か、
再発がないか否かを、簡単に且つ高い信頼性をもって判
断することができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明の方法において、検出用に
用いられるＤＮＡは、ヒト癌患者より得られる癌組織ま
たは非癌組織から常法により取得でき、例えば組織をプ
ロティナーゼＫにより溶解し、フェノール−クロロホル
ムにより分離しエタノールにより抽出されたＤＮＡを用
いることができる。該ＤＮＡの抽出は、癌患者の癌診断
後の治療開始前或いは手術前に患者の生検組織から抽出
されたＤＮＡ、或いは手術中に摘出された癌部または非
癌部の組織から抽出されたＤＮＡ、或いは末梢血液から
単離されたＤＮＡを用いることができる。後記実施例に
示されるＴａｑＭａｎＰＣＲを用いる場合、例えば肝細
胞癌の患者の場合は手術前に予め生検組織から所望のＤ
ＮＡが取得できるため、本発明の方法から得られる情報
が手術後の予後の治療方針の決定には勿論、手術そのも
のの方針の決定に重要な情報となり得る。

【００１８】本発明において、検出するＤＮＡ繰り返し
配列中の脱メチル化ＤＮＡは、上記ヒト組織から得られ
たＤＮＡを脱メチル化ＤＮＡの配列を認識するメチル化
感受性認識制限酵素を用いて消化することによって取得
できる。ここでメチル化感受性認識制限酵素としては、
制限酵素ＮｏｔＩ、ＢｇｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ
及びＳｆｉＩなどが例示できるが、特に制限酵素Ｎｏ
ｔＩが好適に例示される。

【００１９】また、本発明の診断方法において、ＤＮＡ
繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定する領域
は、検体中のＤＮＡ配列中で数百塩基から数千塩基から
なるＤＮＡ配列が繰り返されてなる領域、すなわちＤＮ
Ａ繰り返し配列断片の領域である。本発明の方法は、こ
のＤＮＡ繰り返し配列に存在する脱メチル化ＤＮＡの数
を検出することを含むため、本発明が対象とするＤＮＡ
繰り返し配列は、数百塩基から数千塩基のＤＮＡ配列が
繰り返されるＤＮＡ配列であれば、何れのＤＮＡ繰り返
し配列領域であってもよく、例えば、セントロメリック
・クラスター領域、またはタンデムリピート領域などが
例示できる。より具体的には、例えば前記ＤＮＡ繰り返
し配列として配列番号１〜配列番号４に示されるＤＮＡ
配列が例示できる。また本診断方法で用いられる検出方
法は、前記ＤＮＡ繰り返し配列中に含まれる脱メチル化
ＤＮＡの数が測定できる方法であるかぎり、特に制限さ
れない。

【００２０】例えば検出方法として、サザンハイブリダ
イゼーション法、ＴａｑＭａｎプローブを用いる定量的
リアルタイムＰＣＲ検出法などが例示できる。ここで、
サザンハイブリダイゼーション法においては、例えば患
者の癌部及び非癌部組織からＤＮＡを取得した後、Ｎｏ
ｔＩ等のメチル化感受性認識制限酵素で消化してＤＮＡ
断片を得、電気泳動した後、得られた脱メチル化ＤＮＡ
配列（ＧＣリッチＤＮＡ配列）を標識してプローブとし
て、これをハイブリダイズさせて目的のＤＮＡ断片を検
出する方法を用いることができる。

【００２１】また、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法に
よれば、癌部組織のみを用いて目的のＤＮＡ繰り返し配
列中の脱メチル化ＤＮＡの数を測定することにより、本
発明の診断方法を実施することができる。定量的リアル
タイムＰＣＲ検出法は本質的には、公知の方法、例えば
特許第2825976号公報に記載の方法に従うか、ＰＥバイ
オシステムズ社製のABI PRISM 7700配列決定システム・
ユーザーマニュアルに従い実施できる。

【００２２】かかる定量的リアルタイムＰＣＲ検出法に
おいて用いられる、プライマーとしては特に制限されな
いが、例えばフォワード・プライマーとして、配列番号
５に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを挙
げることができる。該プライマー配列は、癌患者の組織
検体から制限酵素で切断され単離されたＤＮＡ繰り返し
配列に含まれる脱メチル化ＤＮＡの近傍配列を認識でき
る配列であれば、特に制限されず、例えばメチル化感受
性制限酵素が認識するＧＣリッチなＤＮＡ配列を認識す
るプライマー配列からなる、連続する約１５〜４０塩基
から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが例示で
きる。

【００２３】より具体的にはメチル化感受性制限酵素、
例えばＮｏｔＩ(GCGGCCGC配列を認識)などの制限酵素に
より切断されるＧＣリッチな領域(ＤＮＡ配列中、シト
シン(C)とグアニン(G)の含量が多い領域)であって、Ｄ
ＮＡの脱メチル化が生じているかを知り得る配列を挙げ
ることができる。尚、本発明においては、メチル化感受
性制限酵素として上記ＮｏｔＩのほか、ＢｇｌＩ、Ｆｓ
ｅＩ、ＰｓｈＡＩ、ＳｆｉＩなどの８塩基の配列を認識
する制限酵素が好ましく例示される。

【００２４】上記のようにフォワード・プライマーとし
ては、好ましくは、例えばＤＮＡ繰り返し配列を有する
セントロメリック・クラスター(Centromeric Not I clu
ster)領域、タンデムリピート領域中に存在するメチル
化感受性制限酵素認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌク
レオチドが挙げられ、具体的には配列番号１〜４に示さ
れるＤＮＡ配列の中に存在するメチル化感受性制限酵素
認識ＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレオチドを例示す
ることができる。

【００２５】本発明においては、具体的には後記実施例
に示すように手術によって摘出された癌部組織より抽出
されたＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切断した後、得られ
たＤＮＡ断片に大腸菌リガーゼを用いてアダプターをラ
イゲーションするが、フォワード・プライマーとしては
該アダプター部位のＤＮＡ配列に相応するオリゴヌクレ
オチドを例示できる。かくしてＤＮＡ繰り返し配列中の
脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列が検出可能なフォワード
・プライマーを作成することができる。

【００２６】一方、リバース・プライマーは、前記フォ
ワード・プライマーを５’側に結合するプライマーとし
て用いて、上記ＤＮＡの繰り返し配列を含めてＰＣＲ反
応によりＤＮＡの繰り返し配列が増幅できるプライマー
配列を有するものであれば特に制限されない。この限り
においてそのＤＮＡ配列は制限されないが、例えばセン
トロメリック・クラスター領域の３’側に相同する配列
からなる連続する約１５〜４０塩基から成る塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドが好適であり、具体的には配
列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドが例示できる。

【００２７】プローブは、ＤＮＡ繰り返し配列において
フォワード・プライマーとリバース・プライマーの両者
で挟まれる、いわゆるこれらのプライマーが結合する位
置の内側に位置するＤＮＡ配列に対応するオリゴヌクレ
オチドであれば限定されない。一例として本発明の実施
例において示すようには、ＧＣリッチな領域であって、
ＤＮＡの脱メチル化が生じていると考えられているセン
トロメリック・クラスター領域内に存在するＤＮＡ配列
に相応するオリゴヌクレオチドからなる連続する約１５
〜４７塩基から成る塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを好ましく例示できる。

【００２８】ＴａｑＭａｎＰＣＲ法においては、増幅さ
れるＤＮＡ配列は、癌の手術前の生検時に得られた癌部
組織、または手術後の癌患者の癌部またはび非癌部組
織、好ましくは、特に肝癌の患者の手術によって摘出さ
れた癌部の組織より、常法により抽出されたＤＮＡを制
限酵素ＮｏｔＩで切断後、該ＤＮＡ断片に大腸菌リガー
ゼ等のリガーゼを用いてアダプターをライゲーションし
たＤＮＡ配列がその対象ＤＮＡ配列として好ましく例示
できる。

【００２９】本発明においてプローブとして、例えば配
列番号６で示される塩基配列のうち連続する１５〜４７
塩基から成るオリゴヌクレオチドに、レポーター蛍光色
素と、クエンチャー蛍光色素とが結合されてなるものを
使用することもできる。ここでレポーター蛍光色素は、
レポーター蛍光色素がクエンチャー蛍光色素と同一のプ
ローブに結合されている場合には蛍光共鳴エネルギー転
移によりその蛍光強度が抑制され、前記クエンチャー蛍
光色素と同一のプローブに結合されていない状態では蛍
光強度が抑制されないものである。すなわち、上記プロ
ーブは、定量的リアルタイム検出ＰＣＲ法において、癌
患者のＤＮＡのＤＮＡ繰り返し配列中に、脱メチル化が
どの程度生じているかを知る、脱メチル化ＤＮＡ配列の
測定用プローブである。

【００３０】本発明は、具体的には下記の工程を有する
癌疾患の予後を診断する方法を提供する：癌患者の癌部
組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列をメチル化感受性
制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断片にアダプターを
ライゲーションし、これを鋳型として、上記アダプター
に対して相補的なＤＮＡ配列を含むフォワード・プライ
マーと上記メチル化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ
断片を特異的に増幅することのできるリバース・プライ
マーを用いて、メチル化感受性制限酵素認識部位を含む
ＤＮＡを特異的に増幅し、次いでフォワード・プライマ
ーとリバース・プライマーの間に設定したプローブによ
り増幅されたＤＮＡを定量することによって、脱メチル
化したＤＮＡ数(NC-1)を定量する工程ａ：ＤＮＡ繰り返
し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含まない
部分に特異的なフォワード・プライマー、リバース・プ
ライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡを定量
することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数(NC-2)
を定量する工程ｂ：並びに工程ａで定量した脱メチル化
したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰り返し
配列の数(NC-2)の比から脱メチル化の割合〔(NC-1)／(N
C-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃ、工程ｃによって
得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ100
(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断する方法。

【００３１】上記の診断方法において、例えば工程ａに
おいては前述するフォワード・プライマー、リバース・
プライマー及びプローブとを用い、測定すべき癌組織、
特に肝癌患者の当該癌部組織から得られるＤＮＡを制限
酵素ＮｏｔＩ消化して得られるＤＮＡ繰り返し配列を鋳
型としてＰＣＲを行ない、反応液からの蛍光をリアルタ
イムに測定することによって被検サンプル中のＤＮＡ繰
り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数が定量され、また
工程ｂにおいては、前記ＤＮＡ繰り返し配列のうち、制
限酵素ＮｏｔＩ認識配列と一致しないＤＮＡ配列に対応
する配列を有するオリゴヌクレオチドをフォワード・プ
ライマー並びにリバース・プライマーとし、両者に挟ま
れるＤＮＡ繰り返し配列の内側のＤＮＡ配列に相応する
オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＴａｑＭ
ａｎＰＣＲ法によりＤＮＡ繰り返し配列を増幅すること
によって検体中のＤＮＡ繰り返し配列が定量される尚、
ＤＮＡ繰り返し配列に結合するフォワード・プライマー
とリバース・プライマーの距離は、ＤＮＡ繰り返し配列
中の脱メチル化ＤＮＡの数とＤＮＡ繰り返しＤＮＡ配列
の数とが検出できる範囲のＤＮＡ断片の増幅が出来る限
り、限定されない。

【００３２】工程ａにおいて用いられるフォワード・プ
ライマーとしては配列番号５に示されるオリゴヌクレオ
チド、プローブとしては配列番号６に示されるオリゴヌ
クレオチド、リバース・プライマーとしては配列番号７
に示されるオリゴヌクレオチドが好適に例示され、また
工程ｂにおいて用いられるフォワード・プライマーとし
ては配列番号８に示されるオリゴヌクレオチド、プロー
ブとしては配列番号９に示されるオリゴヌクレオチド、
リバース・プライマーとしては配列番号１０に示される
オリゴヌクレオチドが好適に例示される。

【００３３】本発明においては工程ａで得られる脱メチ
ル化したＤＮＡ数と工程ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配
列の数の比に基づいて、癌患者の予後が良好か否かを容
易に診断することができる。具体的には、工程ａで得ら
れる脱メチル化したＤＮＡ数を（ＮＣ−１）とし、工程
ｂで得られるＤＮＡ繰り返し配列の数を（ＮＣ−２）と
した場合、 式：（ＮＣ−１）／（ＮＣ−２）×１００（％） で脱メチル化の割合を算出し、かかる脱メチル化の程度
を示す客観的な値に基づいて癌患者の予後を診断するこ
とができる。

【００３４】例えば、実施例において例証するように、
上記式で得られる脱メチル化の割合が１％未満の場合を
癌治療の予後が良好であるとし、１％以上の場合を癌治
療の予後が不良であるとして判定することが可能であ
る。

【００３５】よって当該判定は、臨床上の癌診断の後、
癌患者に対する治療開始前、または手術前後に行うこと
が好ましく、得られた判定結果に基づいて癌治療の方針
や手術後の治療やアフターケアの方法が検討され決定で
きる。

【００３６】本発明が対象とする癌は、特に制限されな
いが、例えば非上皮系癌細胞に起因する癌、肝細胞癌、
神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、
肺細胞癌、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌
及び白血病等を挙げることができる。好ましくは非上皮
系癌細胞に起因する癌、及び肝細胞癌である。

【００３７】本発明においては、プローブのオリゴヌク
レオチド部分がハイブリダイズするセントロメリック・
クラスター領域は、上記５’側プライマーがハイブリダ
イズする領域と近接して一部重複しているが、実際に反
応を行なう場合には、５’側プライマーとプローブのハ
イブリダイズする領域が互いに重複することがない組み
合わせを選択する必要がある。

【００３８】レポーター蛍光色素としては、ＦＡＭ（６
−カルボキシ−フルオレッセイン）のようなフルオレッ
セイン系蛍光色素が好ましく、クエンチャー蛍光色素と
しては、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−
ローダミン）のようなローダミン系蛍光色素が好まし
い。これらの蛍光色素は公知であり、市販されているも
のを用いることができる。レポーター蛍光色素及びクエ
ンチャー蛍光色素の結合位置は特に限定されないが、通
常、プローブのオリゴヌクレオチド部の一端（好ましく
は５’末端）にレポーター蛍光色素が、他端にクエンチ
ャー蛍光色素が結合される。なお、オリゴヌクレオチド
に蛍光色素を結合する方法は公知であり、例えばNoble
et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:3387-3403及びIye
r et al.,(1990) J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 に
記載されている。

【００３９】本発明の方法では、好適にはフォワード・
プライマー（５’側プライマー）とリバース・プライマ
ー（３’側プライマー）と上記蛍光標識されたプローブ
とを用い、被検体中のメチル化感受性制限酵素にて切断
されたＤＮＡ断片中の測定すべきＤＮＡ配列中のＤＮＡ
繰り返し配列を鋳型としてＰＣＲを行ない、反応液から
のプローブに起因する蛍光をリアルタイムに測定する方
法が好適に採用される。このリアルタイム検出ＰＣＲ法
自体は公知であり、そのための装置及びキットも市販さ
れているので、このような市販の装置及びキットを用い
て行なうことができる。

【００４０】ＰＣＲ反応は、例えば患者の癌部組織また
は非癌部組織から抽出し得られたＤＮＡまたはｃＤＮＡ
を上記フォワード・プライマー、リバース・プライマー
及び上記プローブ並びに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを含む溶液を調
製して行なう。反応の具体的な条件は下記実施例に詳述
されている。なお、被検試料としては、所望の遺伝子を
含有する疑いのあるいずれのものであってもよく、例え
ば血清等の体液である。検体のＤＮＡの調製は、従来法
に用いられるＰＣＲの場合と同様に行なうことができ
る。

【００４１】ＰＣＲ反応では、例えば、癌患者の末梢血
検体、或いは癌患者から摘出した癌部若しくは非癌部組
織から市販のＤＮＡ抽出用キットなどで抽出されたゲノ
ムＤＮＡを調製しそのまま増幅用ＤＮＡとするか、或い
は検体から得られた組織をプロティンキナーゼＫにより
分解し、フェノール−クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿により所望のＤＮＡを得ることができる。また、ｍ
ＲＮＡの場合は、ｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡが合成
され、次いで、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより
ＤＮＡの増幅が起きる。

【００４２】増幅ＤＮＡは、上記プローブと相補的な領
域を含んでいるので、プローブは一本鎖状態の増幅ＤＮ
Ａにハイブリダイズする。プローブが完全にハイブリダ
イズした状態で、プローブがハイブリダイズしている一
本鎖ＤＮＡを鋳型とする伸長が起きると、ＴａｇＤＮＡ
ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプローブ
が５’末端側から加水分解される。この分解の結果、プ
ローブに結合し、レポーター蛍光色素とクエンチャー蛍
光色素とが離れ、クエンチャー蛍光色素に起因する蛍光
共鳴エネルギー転移により抑制されていたレポーター蛍
光色素からの蛍光強度が増加する。一方、被検試料中に
ＤＮＡ配列中繰り返し配列を有するＤＮＡ領域中の脱メ
チル化ＤＮＡが存在しない場合には、ＤＮＡの増幅が起
きないので、プローブはＤＮＡにハイブリダイズせず、
従ってＤＮＡポリメラーゼによって加水分解されること
もない。このため、レポーター蛍光色素からの蛍光は、
クエンチャー蛍光色素により抑制されたままであり、蛍
光強度は増加しない。従って、蛍光強度を測定すること
により、被検試料中にＤＮＡ繰り返し配列領域内にある
脱メチル化ＤＮＡの数を検出することが可能である。

【００４３】本発明の方法では、蛍光強度をリアルタイ
ムに測定する。すなわち、蛍光強度を測定しながらＰＣ
Ｒ反応を行なう。測定される蛍光強度は、あるサイクル
数を過ぎると検出限界を超え、急激に増加する。そし
て、被検試料中のＤＮＡ繰り返し配列領域内にある脱メ
チル化ＤＮＡ数が多いほど、少ないサイクル数で蛍光強
度が急に増加する。従って、何サイクルを過ぎた時に蛍
光強度の急激な増加が始まるかを調べることにより、被
検試料中のＤＮＡの定量測定を行なうことができる。

【００４４】より具体的には、例えば、被検試料中のセ
ントロメリックＮｏｔＩクラスター領域内に存在するＤ
ＮＡ配列中にある脱メチル化ＤＮＡのＤＮＡ配列を含ま
ないネガティブコントロールにおける各サイクル（例え
ば３〜１５サイクル）の蛍光強度の標準偏差の１０倍で
よいかを閾値として設定し、蛍光強度がこの閾値を超え
るサイクル数を調べることにより、正確に被検試料中の
セントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡを定
量測定することができる。すなわち、既知濃度のセント
ロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡ標準物質の
常用対数を横軸に、上記閾値を超えた時のサイクル数を
縦軸にとると、標準物質を用いた測定結果はほぼ完全に
直線上にのるので、検量線を作成しておけば、何サイク
ルで閾値を超えるかを調べることにより被検試料中のセ
ントロメリックＮｏｔＩクラスター領域のＤＮＡの数を
定量測定することができる。従って、本発明の方法によ
れば、従来のＲＬＧＳ法のように、複数の制限酵素処理
やＲＩの使用が不要で、また通常のＰＣＲのように電気
泳動を行なって増幅を調べる操作が不要であり、非常に
簡便である。

【００４５】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。実施例１ １）１９９１年８月から１９９７年１２月までに肝細胞
癌と診断された肝切除を施行された患者３４例を対象と
し、切除した肝臓から肝細胞癌組織とそれに隣接した非
癌様組織(非癌部組織)をＤＮＡ出抽用サンプルとして取
得し、ＤＮＡ調製まで−７０℃にて凍結保存した。

【００４６】患者は３ヶ月ごとに外来にて、フォローア
ップし、癌の再発は再手術、剖検、及び/またはルーチ
ンの全身のコンピュータ断層撮影、核磁気共鳴イメー
ジ、及び超音波造影を含むイメージ診断による発見に基
づいて診断された。最大経過観察期間は、５０ヶ月で平
均観察期間は、３２ヶ月であった。

【００４７】ａ）ゲノムＤＮＡの調製 上記ＤＮＡ調製用凍結サンプルからスタフードらの方法
に順じて単離した（Blln, ｎ.and Stafford,Ｄ.Ｗ., Nu
cleic Acids Res., 3, 2903-2308 (1976) )。即ち、上
記で得られたＤＮＡ調製用凍結サンプル１ｇに対して
（組織１ｇ）に氷冷したＴＮＭ溶液（20mM トリス−塩
酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1.5mM MgCl₂)を１０〜２０ｍ
ｌ加えてホモゲナイズした後、試料を適当なチューブに
移して、冷却遠心機で１５００ｒｐｍ、５分間遠心した
後、粗画分画のペレットを得、氷冷したＴＮＥ溶液（10
mM トリス−塩酸 (pH7.5)、0.1M NaCl、1mM EDTA）を２
０ｍｌ加え混合した後、１／２０容(1ml)の１０％ＳＤ
Ｓを加えて穏やかに混和した後、１／１００容(200μl)
の１０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加えて５０℃で
４時間から一晩インキュベートさせた後、等量のフェノ
ールを加え、さらに４時間から一晩にかけて穏やかに振
盪した。３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、等
量のフェノール-クロロホルム(1:1)を加え、３０分間程
度振盪した後、水層を回収し、１／５０量の５Ｍ Ｎａ
Ｃｌを加えた。次いで２〜２．５倍量の１００％エタノ
ールを加えて穏やかに混合した後、−２０℃で１〜１５
時間、または−７０℃で１０〜２０分間、ＤＮＡの収量
を増やす為に冷却した。３０００ｒｐｍ、１０分間冷却
遠心した後、上清を捨てて、所望のＤＮＡペレットを回
収し、風乾などで乾燥した後、少量(1ml)のＴＥ液（10m
M トリス−塩酸 (pH7.5)、1mM EDTA）に溶解し４℃で保
存した。

【００４８】また、ＤＮＡの調製は、組織を溶解した
後、QIAampDNA MiniKit（QIAGEN社製)等を用いて、ゲノ
ムＤＮＡを抽出することによっても行うことができる。

【００４９】ｂ）脱メチル化ＤＮＡを含むＤＮＡ繰り返
し配列のクローニング 本発明者は、先に肝癌患者から、ＲＬＧＳ法(Hatada,
I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9523-9527 (1
991))を用いてＤＮＡサンプルを得て制限酵素ＮｏｔＩ
−ＰｖｕＩＩ断片で切断し、ＮｏｔＩの５’末端をＰ３
２で標識し、大きさで分離した後、ＰｓｔＩで更にイン
・サイテゥ(in situ)に切断して、断片をポリアクリル
アミドゲルにて分離し、変化の見られたスポットの数を
分析し、癌部と非癌部のスポット数、スポットのパター
ンを複数症例を比較し、スポットの相違数と術後再発、
累積生存率との相関関係を調査し、その数から患者を２
層に分けて（16>=、15<）予後との相関検討し報告して
いる（Oncogene, 19, 1676-1683 (2000)）。

【００５０】更に共通して癌部に出現し、スポットの相
違数とスポットの濃度に相関があるスポットがあるかど
うかを以下の方法で検討した。

【００５１】まず上記ａ）で得られた１００μｇのＤＮ
Ａを制限酵素ＮｏｔＩで切断後、フェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出した後、遠
心分離し、得られた沈澱物を蒸留水に再懸濁させた。

【００５２】次いでＮｏｔＩで誘導された５’末端を³²
Ｐで標識した。続いて制限酵素ＰｕＶＩＩでＤＮＡ断片
を切断し、得られたＮｏｔＩ−ＰｖｕＩＩ／ＤＮＡ断片
をアガロース電気泳動にかけ、さらにゲル中に分離され
たＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行ない、標識ＤＮＡ断片は、多
数のスポットとして二次元電気泳動図上に展開され、オ
ートラジオグラフィーによって視覚的に検出できた。

【００５３】その結果、多数のスポットの中からスポッ
トの強度(濃度)の濃い興味ある部位が４箇所、３１例中
１２例(38.7%)に見出された。

【００５４】そして、スポットの強度比(癌部の濃度と
非癌部の濃度)と累積生存率との相関関係をみると、強
度比が１以下(17症例)と１以上(14症例)で累積生存率を
見るとスポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が低
下した。

【００５５】また、癌部と非癌部間の変化したＲＬＧＳ
スポット数とスポットの強度(濃度)の濃い興味ある４つ
のスポット(スポットＡからスポットＤ)の強度の相関
は、それぞれのケースにおけるスポットＡからスポット
Ｄの４つスポットの２倍レベルの相対的密度で比較した
(検定法:Spearman rank correlation coefficient)。そ
の結果、これらのスポットの強度は、変化したＲＬＧＳ
スポット数と有意に相関していた(Spearman rank corre
lation coefficient：スホ゜ットA：0.650, p<0.0001：スホ゜ット
B：0.712, p<0.0001 スホ゜ットC： 0.745, p<0.0001スホ゜ット
D：0.704, p<0.0001)。さらにこれら４つのスポットの
強度比(癌部の濃度と非癌部の濃度)と累積生存率との相
関関係をみると、術後の再発が低いグループ(スポット
の強度が２倍レベルより未満)と術後の再発が高いグル
ープ(スポットの強度が２倍レベルより同等以上)で累積
生存率を見るとこれら４つのすべてのスポットにおい
て、スポットの濃度が高くなるに従い累積生存率が有意
に低下した(p<0.05)。

【００５６】このように４つのスポットの変化の数およ
びスポットの強度(癌部の濃度と非癌部の濃度の比)と累
積生存率が相関することから、これら４つのスポットに
おけるＤＮＡの脱メチル化に関連する特徴的なＤＮＡ配
列が存在するかどうかを検討することにした。

【００５７】興味ある４つのスポットのＮｏｔＩ−Ｐｓ
ｔＩのＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片をゲルから切り出
し、スポットＡ−Ｄとし、それぞれフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール混合溶媒で抽出し、Ｎｏ
ｔＩ−ＰｓｔＩ／ＤＮＡ増幅の為にＮｏｔＩ−ＰｓｔＩ
ＤＮＡ断片末端にＤＮＡアダプターをライゲートし、該
ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。

【００５８】そして得られた４つのスポットからのＰＣ
Ｒ産物を、ベクターpBluescriptIIを用いてクローニン
グを行なった。

【００５９】クローンされた断片の核酸配列は、アプラ
イド・バイオシステムズ・モデル３７７ＤＮＡシーケンサ
ー(アプライド・バイオシステムズ社製)で配列決定し
た。

【００６０】４つのクローンからの配列決定された核酸
配列は、ジーンワークス・ソフトウェア(GENEWORKS sof
tware)を用いて分析し、相同性検索は、ＮＣＢＩ(the N
ational Center of Biotechnology Information)のＢＬ
ＡＳＴネットワーク・サービス(Altachul, S.F., et a
l., J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990))を用いて実
施した。

【００６１】２つの核酸配列の間の相同性の調査は、Ge
ntyx-Mac Version 10.1（SOFTWAREDEVELOPMENT CO., LT
D., Tokyo, Japan）を使用して行なった。

【００６２】上記で得られた４つのスポットＡ−Ｄの核
酸配列情報から、配列番号１に示されるスポットＡに相
当するクローンされた核酸配列は、１９９３年にウォン
グら(S. Wong, M.J. Wagner and D. Wells )によって
ヒト・タンデム繰り返し配列(Human tandem repeat seq
uence: HTRS )として、アクセッション番号Ｌ０９５５
２としてＧｅｎｂａｎｋに登録されている１３キロ塩基
対の繰り返しのあるユニットの一部分のそれと完全に一
致していた。該ユニットは、ヒト染色体８ｑ２１上にあ
るタンデムにおいておよそ２００回繰り返されていると
報告され、この断片はＲＬＧＳ法を用いた他のヒト癌に
おいて同定されていた(Miwa, W., et al., Electropho
resis, 16, 227-232 (1995): Thoraval, D., et al.,
Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-244 (1996) )。

【００６３】次いで配列番号２に示されるスポットＢに
相当するクローンされた核酸配列は、セントロメトリッ
クＮｏｔＩクラスター(Centromeric Not I cluster: CN
IC)として、アクセッション番号Ｙ１０７５２としてＧ
ｅｎｂａｎｋに登録されている１４１５塩基対のＮｏｔ
Ｉ−ＮｏｔＩ断片の繰り返しのあるユニットの一部分の
それと完全に一致しており、この断片はＲＬＧＳ法を用
いて肝細胞癌において既に特定されている(Nagai, H.,
et al., Gene, 237 (1) 15-20 (1999): Nagai, H., et
al., DNA Res., 6 (4) 219-225 (1999) )。

【００６４】相同性検索によれば、この断片はソラバル
(Thoraval)らがＲＬＧＳ法を用いて神経膠芽腫から単離
し、クローニングした断片の相補配列である(Thoraval,
D.,et al., Gene. Chromosones & Cancer, 17, 234-2
44 (1996))。また、該核酸配列は、染色体９、１３、１
４、および２１のセントロメアの近傍のヒト１．４キロ
塩基タンデムに繰り返された配列として、Genbankにア
クセッション番号U59100として登録されていて、ＦＩＳ
Ｈ(Fluorescence in situ hybridization)を使用するこ
とによってアクロセントリックacrocentric染色体９、
１３、１４、および２１のセントロメリックな領域上に
あることが明らかになった。

【００６５】また、配列番号３で示されるスポットＣに
相当するクローンされた核酸配列は、スポットＢのそれ
と同一であった。該核酸配列は、ナガイらによってｃｏ
ｓＤＥ−１としてコスミドクローンから単離された２．
８キロ塩基対のＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ断片のタンデム繰り
返しされているアレイの一部分であった(Nagai, H.,et
al., Gene, 237(1) 15-20(1999))。該配列は、メチル
化されたＮｏｔＩ配列間にある２つのセントロメトリッ
クＮｏｔＩクラスター(2CNIC)の連結であることが考え
られた。

【００６６】一方、配列番号４で示されるスポットＤに
相当するクローンされた核酸配列は、新規な配列で相同
性ある配列はなかった。

【００６７】上記のことから、ＨＴＲＳスポット、ＣＮ
ＩＣスポット、および２ＣＮＩＣスポットの増大したシ
グナルは、対応している断片のＮｏｔＩの認識配列にお
ける脱メチル化に負わされることが明らかにされ、ＲＬ
ＧＳプロファイルにおけるこれらのスポットの強度は、
脱メチル化の量（数）を提供していることが確認され
た。

【００６８】従って、配列番号１〜４に示されるそれぞ
れスポットＡ〜Ｄに対応するＤＮＡ繰り返し配列のいず
れかの配列中のＮｏｔＩの認識部位における脱メチル化
の量がこれらのスポットの強度に対応しており、即ち、
術後の予後とスポットの強度の相関関係は、術後の予後
とＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡの数との相
関関係に置き換えることが可能となる。

【００６９】このことから、上記４つのスポットのいず
れかにあるＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化され
たＤＮＡの割合を定量することで、所望の癌患者の術後
の予後を判定することが可能となる。

【００７０】実施例２ 癌疾患の予後の診断方法 癌患者の癌治療後（手術後）の予後を判定する上で、考
慮される診断方法としては、少量の臨床サンプルを基に
短時間で簡便な患者の予後診断が可能な方法、具体的に
は癌患者の手術前の生検検体や手術中に得られた癌部組
織より得られた検体から癌患者、特に肝癌患者の手術後
の予後の治療方針の決定に役立つ患者の予後予測を可能
とする方法が望まれる。従って、本発明者は上記実施例
１より得られた結果から、癌患者より得られたＤＮＡ繰
り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡの数に着目
し、該ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測
定し、癌患者の予後が良好か否かを診断する方法に適し
た方法を、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を利用して
行った。

【００７１】ＴａｑＭａｎＰＣＲ法は公知の方法を用い
て実施されるが、癌患者の癌部組織および非癌部組織か
ら抽出されたＤＮＡをメチル化感受性制限酵素、本実施
例においては制限酵素ＮｏｔＩで切断し、さらにその切
断部位にアダプターをライゲートしたものを増幅するた
めに、アダプター部位配列に相補するフォワードプライ
マー、上記実施例１で得られた４つのスポットのいずれ
かにあるＤＮＡ繰り返し配列を考慮して設計したリバー
スプライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを設定す
る。

【００７２】上記フォワードプライマー、リバースプラ
イマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いるＴａｑＭ
ａｎＰＣＲ法を実施する。これにより、例えばスポット
ＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリックＮｏ
ｔＩクラスターのＮｏｔＩサイトのうちどのくらいのＤ
ＮＡが脱メチル化しているかを定量する（ＮＣ−１）。
癌部および非癌部組織についてＮＣ−１を測定し、当該
測定値の癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することに
より、癌化することでどのくらいＤＮＡの脱メチル化の
頻度が増加するかを癌患者毎に検討することが可能とな
る。

【００７３】ＮＣ−２は、上記実施例１で得られた４つ
のスポットのいずれかにあるＤＮＡ繰り返し配列の数を
指す。より具体的には例えばスポットＢまたはスポット
Ｃに対応するセントロメトリックＮｏｔＩクラスターの
中のＤＮＡ配列となる。これは制限酵素ＮｏｔＩ認識配
列とは無関係(制限酵素ＮｏｔＩ認識配列とは異なるオ
リゴヌクレオチド)の配列部位に相補するフォワードプ
ライマー、リバースプライマー、およびＴａｑＭａｎプ
ローブを設定し、上記フォワードプライマー、リバース
プライマー、およびＴａｑＭａｎプローブを用いてＴａ
ｑＭａｎＰＣＲ法を実施することによって、例えばスポ
ットＢまたはスポットＣに対応するセントロメトリック
ＮｏｔＩクラスターの数を定量することができる(ＮＣ
−２)。

【００７４】癌部および非癌部組織についてＮＣ−２を
測定し、癌部／非癌部（Ｔ／Ｎ）の比を測定することに
より、また上記の結果とあわせて（ＮＣ−１／ＮＣ−
２）×１００を求めることにより、セントロメトリック
ＮｏｔＩクラスターのうち何％のＤＮＡが脱メチル化し
ているかを測定することが可能となる。

【００７５】実施例３ ａ）診断用ＤＮＡ繰り返し配列の取得及びアダプターの
ライゲーション 実施例１（ａ）で得られた癌部の１０μｇのゲノムＤＮ
Ａに１０×緩衝液［500mM トリス-塩酸(pH7.5), 100mM
MgCl₂, 10mM DTT, 1000mM NaCl, 0.01 % BSA, 0.01 % T
ritonX-100］、１.５μｌ(15単位)の制限酵素Ｎｏｔ
Ｉ、及び蒸留水を適当量加えて全量を１００μｌとし、
３７℃で一晩インキュベーションを行なった後、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶媒
（２５／２４／１）で２回抽出処理を繰り返した後、１
００％エタノールを加えて穏やかに混合した後、15000r
pm、１０分間冷却遠心した後、上清を捨てて、所望のＤ
ＮＡペレットを回収し、風乾などで乾燥した後、少量(1
ml)のＴＥ液(10mMトリス−塩酸(pH7.5)、1mM EDTA)に
溶解し、ＤＮＡの濃度を測定した後４℃で保存した。

【００７６】次いで、上記で得られたＮｏｔＩ切断ＤＮ
Ａ（１μｌ）、１μｌ（10μM溶液）のＮｏｔＩ切断末
端接合アダプター（下線領域：ＮｏｔＩ認識部位）： 5'-ACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGC :配列番号１１ TGCGGTCCCAAAAGGGTCAGTGCTGCGCCGG-5' ：配列番号１２ 及び０.５μｌの大腸菌リガーゼ（Takara製)、１μｌの
リガーゼ緩衝液［660mMトリス-塩酸, 66mM MgCl₂, 100m
M DTT］、及び蒸留水を加えて全量を１０μｌとし、１
６℃で一晩インキュベーションを行なった後、３０μｌ
のＴＥ溶液を追加し、全量を４０μｌとした。次いでス
ピンカラム(Ｓ−３００：アマシャムファルアｍシアバ
イオテク社製)にて精製し、アダプターが連結されたＤ
ＮＡ濃度を測定した。

【００７７】ｂ）プローブ、プライマーの調製 以下のＮＣ−１検出用として、フォワードプライマー用
に配列番号５で示される１７ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ド、リバースプライマー用に配列番号７で示される２３
ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ−１用ＴａｑＭ
ａｎプローブ用に配列番号６に示される２１ｍｅｒのオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。

【００７８】また、ＮＣ−２検出用として、フォワード
プライマー用に配列番号８で示される２２ｍｅｒのオリ
ゴヌクレオチド、リバースプライマー用に配列番号１０
で示される２２ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、及びＮＣ
−１用ＴａｑＭａｎプローブ用に配列番号９に示される
２７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを化学合成した。上記
プローブについては、２つとも５’末端にＦＡＭを３’
末端にＴＡＭＲＡを上記文献記載の方法により結合し、
標識プローブとした。

【００７９】ｃ）ＴａｑＭａｎＰＣＲ 上記各プライマー及びプローブを用いたリアルタイム定
量ＰＣＲは、ABI PRISM7700Sequence Detection System
(ＰＥバイオシステムズ社製)を用いて、該装置の取り扱
いマニュアルに従い、以下の条件で実施した。

【００８０】上記(a)で得られたＮＣ−１測定用検体Ｄ
ＮＡの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−１用フォワ
ードプライマー及びリバースプライマーを各々３００ｎ
Ｍ(10μM 溶液で1.5μl)、ＮＣ−１用ＴａｑＭａｎプロ
ーブを２００ｎＭ(10μM 溶液で1μl)に調製した後、２
５μｌのTaqMan Universal PCR Mastermix (PEバイオシ
ステムズ社製)及び蒸留水を適量加えて、全反応容量５
０μｌに調製した。

【００８１】ついで、(a)で得られたＮＣ−２測定用検
体として、アダプターの付いていないＮｏｔＩ切断ＤＮ
Ａの５０ｎｇ、上記化学合成した各ＮＣ−２用フォワー
ド、リバース・プライマー各々３００ｎＭ(10μM溶液で
1.5μl)、ＮＣ−２用ＴａｑＭａｎプローブを２００ｎ
Ｍ(10μM溶液で1μl)に調製した後、２５μｌのTaqMan
Universal PCR Mastermix (PEバイオシステムズ社製)及
び蒸留水を適量加えて、全反応容量５０μｌに調製し
た。

【００８２】反応条件は、５℃で２分プレインキュベー
ション、９５℃で１０分の変性に続いて、９５℃で１５
秒、６０℃で１分の反応を５０サイクル行なった。検量
線用ＤＮＡ(１０ｎｇ／μｌ)は、１００倍ずつ原液から
１０⁸倍の５段階希釈した。

【００８３】(a)得られた測定用検体とともに１サンプ
ルについて、ＮＣ−１用、ＮＣ−２用に調製された反応
溶液［５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ
ｄＡＴＰ、１μｌの１０ｍＭ ｄＧＴＰ、１μｌの１０
ｍＭ ｄＣＴＰ、１．２５μｌの２０ｍＭ ｄＵＴＰ、
０．５μｌのＤＮＡポリメラーゼ(AmpliTaqGold:５Ｕ／
μｌ)、０．５μｌのAmpEraseM：商品名 UNG(１Ｕ／ｍ
ｌ)、及び５μｌの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２３．４３μ
ｌの滅菌蒸留水］を加えて同時に測定した。

【００８４】ＰＣＲの各サイクル毎に蛍光強度を測定
し、蛍光強度の変化を縦軸に、サイクル数を横軸にとっ
てプロットした。試料中のＤＮＡのコピー数の常用対数
と蛍光強度の急激な増加が始まる閾値を越えたサイクル
数との間には直線関係があり、このサイクル数を測定す
ることにより、被検試料中の所望のＤＮＡを定量測定で
きる。これらＰＣＲ反応により得られた結果の解析は、
上記装置に付属の解析用ソフトウェア(Sequence Detect
or)で解析を行なった。

【００８５】その結果、各々のサンプルにおける所望の
初期ＤＮＡ量は、検量線用ＤＮＡ標準物質を用いた検量
線より算出される。かくして得られた癌部組織の検体中
の脱メチル化ＤＮＡ数(NC-1)の値及び検体中のＤＮＡ繰
り返し配列の数(NC-2)の値を下式に当てはめて、検体中
のＤＮＡ繰り返し配列における脱メチル化ＤＮＡ数の比
率を算出した。

【００８６】 式： （ＮＣ−１／ＮＣ−２）ｘ１００（％） 術後癌患者３４例の式（１）で得られた値のうち、該値
が１％未満の患者８例と値が１％以上の患者２６例の患
者の２群に分けて、術後の累積無再発生存率を比較検討
した。有意差検定は、スチューデントのＴ−テスト(Stu
dent's t-test)を用いて群間比較を行なった。

【００８７】その結果である癌部に関するＮＣ−１／Ｎ
Ｃ−２（％）の術後無再発曲線を図１に示す。該図のう
ち、縦軸は各群の累積無再発生存率を、横軸は無再発期
間(ヶ月)を示す。図１に示されるように、値が１％以上
の患者群は、値が１％未満の患者群と比較すると有意に
術後の累積無再発生存率が低いことが分かる(p=0.01
2)。

【００８８】上記の結果から、癌部抽出されたＤＮＡ検
体から、少量のＤＮＡで短時間に簡便に癌患者の予後の
診断が可能となり、手術前後の患者の治療方針を立てる
うえで臨床上有用な情報を得ることができることがわか
る。

【００８９】

【発明の効果】本発明により、癌患者の手術前の生検検
体や手術中に得られた癌部組織より得られた検体から癌
患者、特に肝癌患者の手術後の予後の治療方針の決定に
役立つ患者の予後予測を可能とした診断方法が提供され
る。

【００９０】本発明者により、癌患者より得られたＤＮ
Ａ中の繰り返し配列中の脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、
癌患者の予後が良好か否かを診断する方法が提供され
る。癌患者、特に肝癌患者より抽出したＤＮＡサンプル
を定量的リアルタイムＰＣＲ検出法を用いて短時間に簡
便な方法で癌患者の術後の予後の診断を可能とする方法
を提供され。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例３の結果であって、術後癌患者の累積
無再発生存率を、（NC-1／NC-2)×100（％）の値が１％
未満のケースと１％以上のケースとを比較して示す図面
である。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co. Ltd. <120> Method for cancer prognosis <130> 31300JP <160> 12 <210> 1 <211> 1088 <212> DNA <213> Human <220> <223> Human tandem repeat sequence <300> <308> Genbank No.L09552 <400> 1 gaattcatgt tgctctgatg ggagtccttt tcagtggatg tctcatcctt cttagtgcct 60 caaactagat ctagttcaga aaggttatca gaagttagga caagtttatt ttagtgcaaa 120 ccagtggaaa tccatgcatc gtttcttcac catgtgcatt ttctatgaac ctttggaaga 180 ccacctgtgt tgaacattgc ccaagtcctg ggagagaagt gggtgcggtc cgcttcctgt 240 cctcaatttg ccgcagcggc ggagtgcaca gagcagggaa aggcagccca gagggatccc 300 gccctccagc atgcagcaga ctgctggccc agtcctggct ccaaggggtg ctgtgtgggc 360 ccaagcaagt tgaccaacct ccctgaacct taatttcatc ctaggtagcc caattccagt 420 agccattata ggactgccct gcagggacag ttacttaact caggaaaagc aacctagctc 480 caagtttagc aaccgggagt tccagttgat tccattagcg caccccctga ggcattccca 540 agctggagtc tggtggaaga tgaggctcag tgtgattgga ctgaagcacc aacctatcaa 600 ggagaagtcc cacccagtct gccctgtgcc tatataaagg cgacaagtgg cggccgcagc 660 actcattgaa gccgccagtt gggagaggag cagagccagg ccggtgctcc cgaagcagca 720 agatgttgcg agccacagct ccctgctggt tcccccctgg atacccagaa gctaagaagg 780 tggccgagga ggcggccctg gaggcaagcc gccatttggg aggggagcag agccaggccg 840 gtgctcccga agcagcaaga tgttgcgagc cacagctccc tgctggttcc gccctggata 900 cccagaagct aagaaggtgg ccaaggaggc ggccccggag caagccgcca tttgggagcg 960 gagcagagcc cggccggtgc tcccgaaggc agcaagatgt tgcgagccac agctccctgc 1020 tggttcccac ctggataccc agaagctaag aaggtgccga ggaggcggcc ctcgaggctc 1080 cagaattc 1088 <210> 2 <211> 1415 <212> DNA <213> Human <220> <223> Centromeric Not I cluster <300> <308> Genbank No.Y10752 <400> 2 gcggccgccg cgcgcggtgg cgatatttaa aggggacgca gcctatctgt caggagtgga 60 gcgtgagtcg gctcagccgg tgcgcatgcg cgaggcccca gcggtttctc cggtcacagt 120 ggttcccacg gttgtcttag aaaccagtcc ccgaggcttt gcagagcagg agccctcctg 180 tggcagtgct tgggtatcga ggctctgagg ctccggtctc acctccccac gggctcgaag 240 ggaaactctc ctgatgccag cagtcgcaaa gggccgacta tgaagatgaa accccaggcg 300 gagacggggg aagcagcacg ggatcccagc ctcaggcctg cacggacggt gttggttagg 360 gtgagtctcg ccaaaagtgg cgctgcggtc agtgatctcg aggacgggtc ggcctgcgtg 420 cccctgggct gctctctcac ccgagggtcg ttctcctcca gagcagaacc ccggggcctc 480 aggggttgcc tgggggtgtg tgtttcaatg cctctgctgt atgactctgc gtgtgtgtgt 540 gtgtgtctgt gtgtttgtct cccattctct cttctccctc tgtctctcag tctctgtgtg 600 tttctttccc actctttgtg ggtttgtgcc agccgaagtt gcttcagggc tacgaggtcg 660 gtggaggatt gggggtgttg cgaaattggc agaaacatct ttgttcctct ggtaggcatt 720 tgaaaacgtg gcttgggtca ggcacagacg tcccccacac cctccgggtc ccaggtgttg 780 tttgattttc cttggcattg acggaaaggt cacccgtttc ccccttccac cggcacgtgc 840 atggacccca cccttcgttt cgccgtcgcc cgtttacctc cggtgtcaca cgttaacacc 900 aactgctgtg ggattggcca gtgccacgcg tggtcacatg gtctccccct ggatttcgcc 960 tctcttcctc tttgcagttg tcctgttaag cacggtcggc tttccggaac ccctgggctt 1020 ttacaagcgg ggtaggccca ctgctctttc aaaggaggag ggaggcagag ggctgatgga 1080 tgagtgaatt tgctctgaca ctaggccttg agacctatgg gatcattttg tgctgcagcg 1140 aggccctgcc ggcctgacca cgtgtggtga gcccatccta tgtcacacgg agggggccag 1200 aatgggatct caacgggagt ccagagaaca cagcaggcgt cctgaagctc cccctccctt 1260 ggtggaagtc ggctgaagca ggtcctgagg acaggaggcc tgggggtttg ggcctggaac 1320 aggaccagac acccgtggcc ccctctccca cgccgcctga aacaggaccc aagacacagg 1380 cgctgccggg gcggcagcag gagcatcgcg gccgc 1415 <210> 3 <211> 1401 <212> DNA <213> Human <220> <223> Centromeric Not I cluster <300> <308> Genbank No.U59100 <400> 3 gcggccgcat gctcctgctg ccgccgccgg ctgtgtcctg ggtcctgttt ggggcggcat 60 gggagagtgg accgcgggtg tctcgcctgt cccaggccca aacccccagg ctcctgtcct 120 caggacctgc ttgagccgac ttccaccaag ggagggggag cttcaggacg cctgctgtgt 180 tctctggact cctgttcaga tcccattctg gccccctccg tgtgacatag gatgggctca 240 ccacatgtgg tcaggcggca gggcctcgct gcagcacaca atgaccccat agttctcaag 300 gcctagtgtc agagaaaatt caccgatcca tcagccctct gcctccctcc tcctttgaaa 360 gagcagtggc ctgccccgct tgtaaaagcc cacgggttcc ggaaagccaa acgcgcatta 420 caggacaact gcaaagacga acagaggcga aacccagggg aagaccatgt gaccacgcgt 480 ggcactggtc aatcccacag cagttggtgt taatgtgtgt caccggaggc atacggggcg 540 acggcgaaac gaagggtggg gtccaggcat atgccggttg aagggggaaa cgggtgacat 600 ttccgtcaac gccaaggaaa aacaaacaac acctgggaac cgtggggtag gggggcctcc 660 tgtgcctgac ccaagccacg ttttcaaatg cctaccagag gagcaaagag gtttctgcca 720 atttcgcaac acccccaatc ctccaccgac ctggtagccc tgacgcaact tcggctggta 780 caaacccaca gagagtggga aagaaacaca cagagagtga gagacagaga gagaagagag 840 aatgggagac acacacacag acacacacgc acacacacgc agagtcatac agcagaggca 900 ttgaaacaca cacccccagg caaaccctga ggatccgggg ttctgctctg gaggagaacg 960 accctcgggt gagagagcag ccgaggggca cgcaggccga cccgtcctcg agatcacgga 1020 cggcggcacg acttttggtg agactcaccc caaccaacac cgtccgtgca ggcctgaggc 1080 tgggatcccg tgctgcttcc cccgtctccg cctggggttt catcatcatg ggtcggccct 1140 ttgcgactgc tgtcatcagg agaggttccc ttcgaccccg tggaaaggtg aggccggagc 1200 ctcagagcct ggatacccaa gcactgccac ggagggctcc tgctctgcca agcctcgggg 1260 actagtgtct aagacaaccg tgggaaccac tgtgacggga gaaaccgctg gcgcctagcg 1320 catgcgcatt ggctgagccg actcacgctc cactcctgac agataggctg cgtccccttt 1380 aaatatcgcc accgccgcgc g 1401 <210> 4 <211> 271 <212> DNA <213> Human <220> <223> Repeat sequence <400> 4 gctgncantg ngtggacatt ggagcntaca gcgtcttgcg acnttgaaat gcnggattnn 60 gagtgacatg gacagaacac ttgggcaagt gaatctctgt ctgtctgtct gtctgtctgt 120 cccattggtt ggttgatttc catttcctta aggggcccat acctacaccg acacacacaa 180 acacacacac acacacgcac acgcacacac gcacacacac tccttccttc tgcgagttag 240 aacattagtg gggggcccct gggagctgca g 271 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NC-1 <400> 5 tcccagtcac gacgcgg 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan prove for NC-1 <400> 6 cgcgcggtgg cgatatttaa a 21 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NC-1 <400> 7 tccactcctg acagataggc tgc 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NC-2 <400> 8 tgcagttgtc ctgttaagca cg 22 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan prove for NC-2 <400> 9 taggcccact gctctttcaa aggagga 27 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NC-2 <400> 10 tcactcatcc atcagccctc tg 22 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor <400> 11 acgccagggt tttcccagt cacgacgc 28 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adaptor（complement sequence） <400> 12 tgcggtccca aaagggtca gtgctgcgcc gg 32

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】癌部または非癌部組織より得られたＤＮＡ
   くり返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定
   し、該ＤＮＡ数に基づいて癌疾患の予後を診断する方
   法。
2. 【請求項２】ＤＮＡくり返し配列がセントロメリック・
   クラスター領域、またはタンデムリピート領域に由来す
   るものである、請求項１記載の癌疾患の予後を診断する
   方法。
3. 【請求項３】癌部組織より得られたＤＮＡくり返し配列
   中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数をＴａｑＭａｎＰＣＲ
   法を用いて検出・測定することを特徴とする、請求項１
   又は２に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
4. 【請求項４】ＤＮＡくり返し配列がメチル化感受性制限
   酵素認識部位を有するものであることを特徴とする請求
   項１乃至３のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する
   方法。
5. 【請求項５】メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩ、Ｂｇ
   ｌＩ 、ＦｓｅＩ 、ＰｓｈＡＩ及びＳｆｉＩよりなる群
   から選択されるいずれかの制限酵素から選択されるもの
   である、請求項４記載の癌疾患の予後を診断する方法。
6. 【請求項６】メチル化感受性制限酵素がＮｏｔＩである
   ことを特徴とする、請求項４に記載の癌疾患の予後を診
   断する方法。
7. 【請求項７】ＤＮＡくり返し配列が配列番号１〜４に示
   されるＤＮＡ配列のいずれか少なくとも１つのＤＮＡ配
   列であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに
   記載の癌疾患の予後を診断する方法。
8. 【請求項８】癌部組織より得られたＤＮＡ繰り返し配列
   をメチル化感受性制限酵素で切断し、得られたＤＮＡ断
   片にアダプターをライゲーションし、このアダプターの
   ＤＮＡ配列を含むフォワード・プライマーと上記メチル
   化感受性制限酵素で切断されたＤＮＡ断片を特異的に増
   幅することのできるリバース・プライマーを用いて、メ
   チル化感受性制限酵素認識部位を含むＤＮＡを特異的に
   増幅し、次いでフォワード・プライマーとリバース・プ
   ライマーの間に設定したプローブにより増幅したＤＮＡ
   を定量することによって、ＤＮＡ繰り返し配列中の脱メ
   チル化したＤＮＡの数(NC-1)を定量する工程ａ：ＤＮＡ
   繰り返し配列中のメチル化感受性制限酵素認識部位を含
   まない部分に特異的なフォワード・プライマー、リバー
   ス・プライマー及びプローブを用いて、増幅したＤＮＡ
   を定量することによって、上記ＤＮＡ繰り返し配列の数
   (NC-2)を定量する工程ｂ：並びに工程ａで定量した脱メ
   チル化したＤＮＡ数(NC-1)と工程ｂで定量したＤＮＡ繰
   り返し配列の数(NC-2)との比から脱メチル化の割合〔(N
   C-1)／(NC-2)ｘ100（％）〕を算出する工程ｃからな
   り、工程ｃによって得られた脱メチル化の割合〔(NC-1)
   ／(NC-2)ｘ100(％)〕に基づいて癌疾患の予後を診断す
   る方法。
9. 【請求項９】配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド
   をフォワード・プライマーとして、配列番号６で示され
   るオリゴヌクレオチドをプローブとして、また配列番号
   ７で示されるオリゴヌクレオチドをリバース・プライマ
   ーとして用いて工程ａを行い、また配列番号８で示され
   るオリゴヌクレオチドをフォワード・プライマーとし
   て、配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドをプロー
   ブとして、また配列番号１０で示されるオリゴヌクレオ
   チドをリバース・プライマーとして用いて工程ｂを行う
   ことを特徴とする、請求項８に記載の癌疾患の予後を診
   断する方法。
10. 【請求項１０】脱メチル化の割合〔(NC-1)／(NC-2)ｘ10
    0(％)〕が１％未満の場合を癌疾患の予後が良好とし、
    １％以上を予後不良として判断することからなる、請求
    項８または９に記載の癌疾患の予後を診断する方法。
11. 【請求項１１】癌が非上皮系癌細胞に起因する癌である
    請求項１乃至７のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断
    する方法。
12. 【請求項１２】癌が肝細胞癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃
    癌、膵臓癌、脳腫瘍、大腸癌、肺細胞癌、腎癌、膀胱
    癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病より
    なる群から選択されるいずれかである、請求項１乃至１
    ０のいずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
13. 【請求項１３】癌が肝細胞癌である請求項１乃至１０の
    いずれかに記載の癌疾患の予後を診断する方法。
14. 【請求項１４】癌治療の手術前に実施することを特徴と
    する、請求項１乃至１３のいずれかに記載の癌疾患の予
    後を診断する方法。
15. 【請求項１５】配列番号１〜４に示されるいずれかのＤ
    ＮＡ配列からなる、癌疾患の予後を診断するために用い
    られるＤＮＡマーカー配列。
16. 【請求項１６】請求項８に記載の癌疾患の予後を診断す
    る方法に用いられるヌクレオチドのセットであって、 工程ａにおいて、フォワード・プライマーとして用いら
    れる配列番号５で示されるオリゴヌクレオチド、プロー
    ブとして用いられる配列番号６で示されるオリゴヌクレ
    オチド、リバース・プライマーとして用いられる配列番
    号７で示されるオリゴヌクレオチド、並びに工程ｂにお
    いて、フォワード・プライマーとして用いられる配列番
    号８で示されるオリゴヌクレオチド、プローブとして用
    いられる配列番号９で示されるオリゴヌクレオチド、リ
    バース・プライマーとして用いられる配列番号１０で示
    されるオリゴヌクレオチドからなるものである、肝癌疾
    患の予後を診断するための診断用オリゴヌクレオチド。