JP2004524044A - 制限部位タグ付きマイクロアレイを用いたハイスループットゲノム解析方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、複雑な微生物系を含めた複雑な生物系に由来するゲノム材料の新規で独特なハイスループット解析用技術を提供する。本発明は、制限部位タグ付き（ＲＳＴ）マイクロアレイ及び配列パスポーティング技術（特に、ＮｏｔＩクローンを含むマイクロアレイ）を用いて、ゲノム材料における変化を検出する方法にも関する。本発明の方法を使用して、特定の対立遺伝子のメチル化又はサイレンシング、同型接合欠失及び半接合欠失、後成的因子、遺伝的素因など、癌疾患の診断及び治療に特に有用な情報を検出することができる。本発明によるＲＳＴマイクロアレイ及びパスポーティングは、複雑な微生物系の定性的解析及び定量的解析に使用することもできる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の対立遺伝子のメチル化又はサイレンシング、同型接合欠失、半接合欠失、後成的因子、遺伝的素因など、癌疾患の診断及び治療に特に有用な情報の検出に使用できる、制限部位タグ付き（ＲＳＴ）マイクロアレイ及びパスポーティング（Ｐａｓｓｐｏｒｔｉｎｇ）技術を用いたゲノム材料の変化を検出する方法に関する。本発明によるＲＳＴマイクロアレイ及びパスポーティングは、複雑な微生物系の定性的解析及び定量的解析に使用することもできる。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムのサブトラクティブ法は、基本的に、腫瘍抑制遺伝子を含めた疾患遺伝子の同定に極めて有用である。しかし、提案された多数の技術のうち発現差解析法（Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＤＡ、Ｌｉｓｉｔｓｙｎ等、１９９３）及びＲＦＬＰサブトラクション（制限酵素断片長多型）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等、１９９４）と称するゲノムサブトラクションの変法のみが、欠失配列を再現性良くクローニングするのに成功した。３つの主要な欠点により、これら関係する方法の広範な使用が制限された。すなわち、どちらの方法も極めて複雑かつ面倒で微量の不純物に極めて敏感であり、実験はわずか数個の欠失配列をクローニングするだけに終わる。ＣｐＧ島と無関係な酵素でのみこれらの方法が良好に働くことに留意することが重要である。メチル化に感受性がある発現差解析（ＭＳ−ＲＤＡ、Ｕｓｈｉｊｉｍａ等、１９９７）は、より具体的な目的を有し、すなわち、これはＣｐＧ島で働くが、元のＲＤＡの制限からは依然として逃れることができない。また、示差的にクローン化した産物は、通常、遺伝子とは何の関係もない。機能的でない領域の欠失はヒトゲノムでは頻繁に起こり、このようなセグメントのクローニングが貴重な情報を生み出すことはない（Ｌｉｓｉｔｓｙｎ等、１９９５）。ＲＤＡは、点突然変異、少量の欠失又は挿入による差異を、これらが特定の制限酵素認識部位に影響を及ぼさない限り、検出することもできない。別なアーチファクト源は、最初のハイブリダイゼーション段階後でヌクレアーゼ処置前のＰＣＲ増幅である。ドライバーＤＮＡが過剰に存在すると、残余のドライバー：ドライバー及びドライバー：テスター二重鎖が競合相手として作用する可能性があるため、テスター：テスター二重鎖の増幅効率が低下する結果となる可能性がある。ＲＤＡは、主として所望の産物の特異的ＰＣＲ増幅に基づき、多数のサイクル（９５〜１１０）を要するので、増幅産物の指数関数的な蓄積速度の低下を特徴とする「平坦効果」を受ける（Ｉｎｎｉｎｓ及びＧｅｌｆａｎｄ、１９９０）。しかし、主要な問題は、この方法で使用される複数の制限消化及び連結反応が非能率的であることに起因し、偽陽性の発生をもたらす。
【０００３】
腫瘍において遺伝子の変化が存在することは現在一般に受け入れられており、腫瘍の非可逆的な性質を説明している。しかし、組織分化についての観察から、それが発癌、すなわち「後成的な」変化と何か共有するものがあることが示された。現在、ＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化は、組織分化において正確に調節されていることが知られており、哺乳動物細胞における遺伝子発現の制御に鍵となる役割を演じていると考えられている。このプロセスに関与する酵素はＤＮＡメチルトランスフェラーゼであり、これはＳ−アデノシルメチオニンからシトシン残基へのメチル基の転移を触媒して、ほとんどがゲノムのＣｐＧ部位に見られる修飾塩基である５−メチルシトシンを形成する。遺伝子のプロモーター領域にメチル化されたＣｐＧ島が存在すると、それらの発現を抑制することができる。このプロセスは、転写因子又は他のＤＮＡ結合タンパク質の結合を外見上妨害して転写を阻止する５−メチルシトシンが存在するためかもしれない。ＤＮＡのメチル化は、ヒストンの脱アセチル化及びクロマチン構造に関係し、ＤＮＡメチル化の調節酵素がクローン化されている。
【０００４】
様々なタイプの腫瘍では、プロモーター領域中のＣｐＧ島の異常な又は偶発的なメチル化は、癌に関係する多数の遺伝子で観測され、それらの発現をサイレンシングすることになる。関与する遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子、転移及び血管形成を抑制する遺伝子、ＤＮＡを修復する遺伝子などであり、後成学が腫瘍形成に重要な役割を果たしていることが示唆される。ＤＮＡメチル化の強力で特異的なインヒビターである５−アザ−２−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）は、ヒト腫瘍細胞系中のこれらほとんどの悪性抑制遺伝子の発現を再活性化することが示された。これらの遺伝子は癌患者においてＤＮＡメチル化のインヒビターを用いた化学療法の興味深い標的となり、腫瘍形成におけるこの後成的な機序の重要性を明らかにするのに役立つ可能性がある。悪性腫瘍の自発的な退行は研究者をひきつけたものであったが、高メチル化によって不活化された遺伝子が、自発的な退行を比較的頻繁にみせる腫瘍に関与することが多いことが現在認められている。いくつかの発癌物質の発癌機序は、後成的なスイッチの変更を伴うと考えられ、いくつかの食餌性因子もスイッチを変更させる可能性がある。
【０００５】
総説論文によれば、哺乳動物細胞においてメチル化は基本的で極めて重要な特徴／機序であることが明らかである。これは、遺伝性の体細胞の癌、遺伝性の体細胞の疾患、アポトーシス、複製、組換え、温度制御、免疫応答、突然変異率（すなわち、ｐ５３における）に関与している。食物はメチル化を通して癌などを誘発することがあり、メチル化は、癌の診断、予後、予測、及び直接の治療にさえも使用できると考えられる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの不活化はマウスでは致命的である。ＤＮＡメチル化の役割に対する理解が進み、それをもとに、ＤＮＡメチル化の変化をゲノム全体にわたって探索するいくつかの新しい方法が開発された。
【０００６】
ヒトゲノムにおけるメチル化を試験するために、主に４つのゲノム全体にわたるスクリーニング方法がある（Ｓｕｇｉｍｕｒａ Ｔ、Ｕｓｈｉｊｉｍａ Ｔ、２０００参照）。すなわち、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＲＬＧＳ、Ｃｏｓｔｅｌｌｏ等、２０００）、メチル化感受性発現差解析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭＳ−ＲＤＡ）、メチル化特異的ＡＰ−ＰＣＲ（ＭＳ−ＡＰ−ＰＣＲ）及びメチルＣｐＧ結合ドメインカラム／部分融解分子の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔｌｙ ｍｅｌｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）（ＭＢＤ／ＳＰＭ）である。これらはそれぞれそれ自体の利点を有するが、４つの方法ともやや非効率的で複雑であるので、大規模なスクリーニングには適さず、単に数個の試料を試験するのに使用できるだけである。例えば、ＭＢＤ／ＳＰＭにより単離された１０００個のクローンを解析すると、９つのＤＮＡ断片がＣｐＧ島として同定され、腫瘍ＤＮＡ中で特異的にメチル化されたのはわずか１つであった。
【０００７】
最近開発された固定化ＤＮＡのマイクロアレイは、分子生物学に新たな可能性をもたらした。ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかを含むこれらのＤＮＡアレイは、高速ロボティクスによってガラス基板上で組み立てられる。異なる色で標識されたプローブがハイブリダイズされる。１回のそのようなハイブリダイゼーションで、数千の遺伝子又はゲノムＤＮＡ断片を解析することができ、大量の並行した遺伝子発現及び遺伝子発見の研究が可能になる。パイロット実験では、固定化Ｐ１及びＢＡＣクローンＤＮＡを含むマイクロアレイが、ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション）を用いたＤＮＡコピー数の変化の高分解能解析に使用できることが示された。クローニングベクターへのヒトＤＮＡの挿入断片が５０ｋｂよりも大きい場合、この手法が機能することが示唆された。将来、ヒトゲノム全体を網羅するＰ１及びＢＡＣクローンを含むマイクロアレイが作製されたときに、この手法が従来のＣＧＨに置き換わる可能性が極めて高い。マップされたＰ１及びＢＡＣクローンを含むこのようなマイクロアレイを構築することは、極めて高価で、労力と時間がかかることは明らかである。このようなマイクロアレイを構築することは、単一の研究室では実施不可能である。小さな挿入断片のＮｏｔＩリンキングクローンが同じ機能を果たすことができれば、単一の研究グループ及び多数の組織がこのようなＣＧＨ解析用のマイクロアレイを構築する道を開くことになる。ヒトゲノム全体を網羅するＰＡＣ及びＢＡＣはまだ利用できない。
【０００８】
Ｐｏｌｌａｃｋ等、１９９９は、ゲノムＤＮＡコピー数の変化に対してｃＤＮＡマイクロアレイを使用することを提案したが、ｃＤＮＡクローンのサイズが小さいこと及びバックグラウンドのハイブリダイゼーションと実際の信号との比が高いことからこの提案は問題をはらんだものとなった。
【０００９】
２０００年の秋にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘは、ＧｅｎｅＣｈｉｐＨｕＳＮＰ Ｍａｐｐｉｎｇ Ａｓｓａｙの販売に乗り出した。これらのマイクロアレイは、１，４９４個のＳＮＰ座を含んでいる。宣伝資料には、このマイクロアレイが、異型接合性の喪失（ＬＯＨ）を検出するために使用できることが示されていた。しかし、大多数の試料でＳＮＰの１３％が失敗に終わり、特定の一実験で情報価値があったのはわずかに３５４個のＳＮＰであった。
【００１０】
Ｌｕｃｉｔｏ等（２０００）は、腫瘍細胞におけるコピー数の変動を検出するためにＲＤＡ技術の変法を用いた。この方法では、ＤＮＡマイクロアレイとともにＢｇｌＩＩレプリゼンテーション（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ）が使用された。ヒトゲノムには多数（１５０，０００）の小さなＢｇｌＩＩクローンが存在するので、ヒトゲノム全体を網羅する一義的なクローンを含む包括的なマイクロアレイを作製することは容易でも安価でもない。
【００１１】
現在、複雑な微生物混合物を解析するのに有用ないくつかの方法、例えば、体外でのコロニーの増殖が必要な酵素分析（Ｋａｔｏｕｌｉ等、１９９４）、又は正常なフローラの組成を大雑把に示す糞便中の脂肪酸組成物の分析（参考文献）があるが、これらはすべて明らかに限界がある。
【００１２】
培養に依存しない技術を適用するには、従来の培養方法のいくつかの欠点を克服できる分子生物学的方法がもとになる。近年では１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅に基づく手法が最も良く知られている。この手法の一変法は、例えば１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅断片を含む変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて、腸内のすべての種のフィンガープリントを利用した。別の適用例では、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅断片を直接クローン化して配列を決定した。これらの試験は重要な情報をもたらしたが、手法固有の欠点がその応用を制限している。問題は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子が高度に保存され、したがって同じ配列の断片が異なる種に属する可能性があることである。フィンガープリント実験では、類似した断片が異なる種を示し、異なる断片が同じ種を示し得ることに留意することも重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
複雑な生物系に由来するゲノム材料を解析するための従来法に付随する欠点に鑑み、簡単、迅速で信頼できるゲノム解析方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明の一目的は、複雑な微生物系を含めた複雑な生物系に由来するゲノム材料を解析するための新規で独特な技術を提供することである。本発明の主な目的は以下のとおりである。
【００１５】
本発明の一目的は、発癌遺伝子の診断、予後、同定のために、真核生物のゲノムのメチル化及び／又はコピー数の変化を調べるためのＮｏｔＩクローン（一般にＰＣＲ断片、オリゴヌクレオチドなど）マイクロアレイを調製し使用することである。ＮｏｔＩマイクロアレイは、コピー数の変化とメチル化を同時に検出することが可能な唯一の既存のマイクロアレイである。これには、正常細胞と悪性細胞をゲノム及び／又はＲＮＡのレベルで比較すること、原発腫瘍と転移の比較、癌を含めた遺伝性疾患に罹った家族の解析、並びに診断及び疾患の予測が含まれる。
【００１６】
正常細胞と腫瘍細胞の違いを確認できることは、発癌遺伝子のクローン化、癌の初期診断及び予防に役立つ。これは、分化、発生及び進化の研究にとっても極めて重要である。
【００１７】
本発明の別の目的は、腸の正常フローラなどの複雑な微生物系の定性的解析及び定量的解析を可能にする技術を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ＮｏｔＩ配列決定パスポート（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐａｓｐｏｒｔｓ）（「ＮｏｔＩパスポート」）（ＮｏｔＩタグすなわち、ゲノムＮｏｔＩ部位を囲む短い配列のコレクション）を調製すること、及び上述したＮｏｔＩマイクロアレイの場合と同じ問題を検討するためにそれらを使用することである。
【００１９】
ＲＳＴを用いたゲノム材料の広範なスクリーニングは、例えば、ヒトゲノム／微生物混合物のサイズ及び繰返し配列の数など、多くの問題に直面している。本発明者らは、ゲノムＤＮＡを標識するための新しい方法を開発してこれらの問題を解決した。この方法では、ＮｏｔＩ（又は他の任意の制限酵素）部位を囲む配列のみが標識され（タグが付けられ）、本明細書ではＮｏｔＩレプリゼンテーション（ＮＲ）と称する。
【００２０】
本発明では、制限部位タグ（ＲＳＴ）を、数千の微生物又はヒトゲノムから生成し、個々のヒト細胞／生物体又は菌種だけでなく、例えば腸内の微生物フローラの大部分又はすべての微生物を一義的に記述するＮｏｔＩ ＲＳＴマイクロアレイパスポートを作成するために使用する。
【００２１】
本発明によるＮｏｔＩ又はＲＳＴゲノムスキャンニング法を用いて、微生物ゲノムの定量的及び定性的な大規模スキャンニングが可能である。
【００２２】
本発明者らの結果から、本発明者らは、ＮｏｔＩマイクロアレイパスポート、すなわちＮｏｔＩマイクロアレイイメージを含む大きなデータベースを作成できることを示した。結腸フローラの多数の試料を比較してそれらの正確な組成を決定した。
【００２３】
本発明の手順は汎用的なものであり、すなわち、本発明者らは他の任意の酵素を使用して「ＲＳＴマイクロアレイパスポート」を作成することができる。また、ＤＮＡ（ＲＮＡ）に沿って極めてまばらに分布する特異的な位置でＤＮＡ（ＲＮＡ）を切断する任意の生化学的又は化学的手法を使用することができる。例えば、これを、ｃｒｅリコンビナーゼのような酵素、又は三本鎖ＤＮＡを形成しＤＮＡの切断を開始する化学修飾されたオリゴヌクレオチドとすることができる。ＮｏｔＩレプリゼンテーションの多型は、ＢａｍＨＩに加えいくつかの酵素、例えばＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩなどを用いて増加させることができる。パイロット実験で、本発明者らはグラム陽性及びグラム陰性細菌由来のＮｏｔＩマイクロアレイを作製し、極めて類似した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株でさえこの技術を用いて容易に識別できることを示した。上述の技術を用いて、本発明者らはヒト生体中の重要な病原菌を同定することができる。
【００２４】
これらの「ＮｏｔＩマイクロアレイパスポート」を、各個体、正常／腫瘍ペア、様々な細胞のＮｏｔＩレプリゼンテーション（ＮＲ）に対して作成することができる。ＮＲプローブを用いたパイロット実験によって、この方法の能力が実証され、本発明者らはＡＣＣ−ＬＣ５及びＭＣＨ９３９．２細胞系において欠失した３番染色体のＮｏｔＩクローンを検出することに成功した。
【００２５】
このようなＮｏｔＩ ＲＳＴマイクロアレイは、他の手段では検出することができない特定の疾患を検出するために、あらゆるヒト又は例えば同じ特定の疾患に罹っているヒトの任意のグループに対して調製することができる。ＮｏｔＩ ＲＳＴマイクロアレイは、（ウシ又はイヌのような）あらゆる哺乳動物又は微生物に対しても調製することができる。
【００２６】
ＮｏｔＩアレイは、癌の研究を著しく促進し、ＣＧＨ、ＬＯＨ及び多数の細胞遺伝学的な研究に取って代わる可能性がある。
【００２７】
ＮｏｔＩスキャンニング手法は、主として欠失、増幅又はメチル化された遺伝子を発見するものであるが、多型及び突然変異のＮｏｔＩ部位も見分ける。これらのＮｏｔＩパスポートを比較することによって、多数の疾患及び他の基本的な生物学的プロセスを理解する手がかりを得ることができる。
【００２８】
ＲＳＴマイクロアレイを作製する本発明の方法を使用して、制限酵素タグ付き（ＲＳＴ）マイクロアレイを任意の酵素に対して作製することができる。本発明によるマイクロアレイは、新規なタイプのマイクロアレイであり、既存のもの（オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、ゲノムＢＡＣ／ＰＡＣクローン）とは全く異なる。
【００２９】
正常な腸フローラの個々の組成物間の違いを確定できることは、食餌、特別な食物、地理的位置（ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｌｏｃａｔｉｏｎ）、結腸、卵巣などの癌及び他の疾患によって正常フローラの組成がどのように影響されるかを将来解析するのに役立つ。これは癌の研究には特に広範に適用される。
【００３０】
本発明の方法は、おそらく、基礎科学、ヒト及び動物の健康、農業、医薬、薬理などに多大な影響を及ぼすはずである。
【００３１】
本発明者らは、ヒトゲノム全体を網羅するＰ１及びＢＡＣクローンに基づくマイクロアレイを補完するものとして本発明者らのＮｏｔＩクローンを使用することを提案する。小さな挿入断片のＮｏｔＩリンキングクローンに基づくマイクロアレイが開発され、類似の機能を有することができる。ヒトゲノム全体を網羅し全遺伝子の１０％〜２０％（それらの４０％〜５０％は、ＥＳＴマイクロアレイには存在しない）を含む約１０，０００〜２０，０００個のＮｏｔＩクローンがすでに入手可能である。
【００３２】
上述したことを達成するために、本発明は以下の実施形態を含む。
【００３３】
本発明の一実施形態では、固相に結合された核酸及び／又は修飾核酸標準材料を調製するための方法が提供される。この方法は、
核酸及び／又は修飾核酸標準材料を生化学的及び／又は化学的手法を用いて消化して、特定の認識部位を囲む配列断片を得ること、
特定の認識部位に関連する前記核酸及び／又は修飾核酸配列断片を選択することの各ステップを含む。
【００３４】
前記標準材料を、第１の制限酵素及び／又は１種若しくは複数の第２の制限酵素、例えばｃｒｅリコンビナーゼなどのエンドヌクレアーゼで消化する。
【００３５】
本発明の実施形態では、第１のエンドヌクレアーゼの認識部位は、前記ゲノム材料に沿って極めてまばらに分布し、かつ遺伝子配列に隣接して位置し、前記１種又は複数の第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位は、前記ゲノム材料に沿って第１のエンドヌクレアーゼの部位よりも多く存在する。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、第１及び第２の制限エンドヌクレアーゼによる消化が同時に行われ、第１及び第２の制限エンドヌクレアーゼによって切断されて生じた末端それぞれに異なるリンカーが連結される。これらのリンカーは、ＰＣＲ反応を起こすためにプライマーが添加されたときに、第１の制限エンドヌクレアーゼによって切断されて生じる末端を含む断片のみが増幅されるように設計されている。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態では、まず標準材料が１種又は複数の第２の制限エンドヌクレアーゼによって消化され、こうして得られた断片の各末端が環状の核酸及び／又は修飾核酸分子の型の中に自己連結し、第１の制限エンドヌクレアーゼによる消化の前に自己連結後に残った線状の断片が不活化され、それによって、第１のエンドヌクレアーゼによって消化されて生じる線状断片がＰＣＲ増幅にかけられる。
【００３８】
これらの実施形態では、第１の制限エンドヌクレアーゼはＮｏｔＩ、又は他の任意の制限エンドヌクレアーゼであり、その制限部位はゲノム材料中のＣｐＧ島の近辺にある。
【００３９】
第１の制限エンドヌクレアーゼは、ＮｏｔＩ、ＰｍｅＩ又はＳｂｆＩ、或いは２つ以上の前記エンドヌクレアーゼの組合せとすることもでき、第２のエンドヌクレアーゼをＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ又はＳａｕ３Ａ、或いは２つ以上の前記エンドヌクレアーゼの組合せとすることができる。
【００４０】
前記核酸及び／又は修飾核酸標準材料は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は改変されたオリゴヌクレオチド、或いは２つ以上の前記材料の組合せから選択することができる。
【００４１】
本発明では、核酸及び／又は修飾核酸は、マイクロアレイの形をした固体のガラス担体に結合されている。しかし、本発明はガラス製マイクロアレイを使用することのみに限定されるものではない。フィルター、例えばナイロンフィルター、コードされたビーズ（ｃｏｄｅｄ ｂｅａｄｓ）、ニトロセルロースなどのセルロース、又は他の固体担体などの固相も、核酸及び／又は修飾核酸を結合するのに使用することができる。一般に、固相に結合されたＤＮＡ、オリゴヌクレオチドなどを使用することができる。
【００４２】
本発明に従って使用できるゲノム材料は、１人又は複数のヒトから、体内の異なる部位から、同一又は異なる時刻に採取することができる。前記ゲノム材料は、腸、皮膚又はヒトの体の他の部分の細菌から採取することができる。しかし、これは、任意の生物体、細菌、動物又は植物、或いはこれらから産生される産物、或いはゲノム材料が含まれる任意の物質、特に空気及び水からも得られる。
【００４３】
本発明は、本発明を用いて得ることができる断片、これらの断片を含む核酸及び／又は修飾核酸マイクロアレイにも関する。
【００４４】
さらに、本発明は、生物体のゲノム又はその一部のレプリゼンテーションにも関し、本発明の方法によって得られる核酸及び／又は修飾核酸断片の複数のコピー、又はそれらから選択されたものを含む。
【００４５】
これらのレプリゼンテーションを液状で、前記固相の形で存在する核酸及び／又は修飾核酸断片にハイブリダイズする。
【００４６】
前記レプリゼンテーションは、異なるゲノムを識別するために使用することができ、同一個体から異なる時点で得られたゲノム材料内のメチル化、欠失、突然変異及び他の変化を検出するために、或いは少なくとも１つの他の個体から得られる標準のレプリゼンテーションと比較して一個体から得られるゲノム材料におけるメチル化、欠失、突然変異及び他の変化を検出するために使用することができ、又はそれらの組合せに使用することができる。
【００４７】
上述の適用例に加え、これらのレプリゼンテーションは、以下のために使用することができる。すなわち、
発癌遺伝子などの診断、予後、同定のために真核生物のゲノムのメチル化及びコピー数の変化を研究すること、
様々な微生物（ウイルス、原核生物、真核生物）の遺伝形質を決めること、
複雑な生物系、すなわち、ヒトの腸、或いは水、食物、空気資源中の細菌フローラのバイオコンプレキシティー（ｂｉｏｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）及び多様性を研究すること、
複雑な生物混合物を含めた様々な資源中の病原体を同定すること、
様々な目的、すなわち、様々な条件、すなわち様々な年齢、疾患／健康、感染／非感染などで生物体を記述するために、パスポート（マイクロアレイハイブリダイゼーションのイメージ、タグ配列を含むデータベース）を作成すること、
新しい生物体、例えば細菌種を同定すること、
（ＤＮＡ及びオリゴベースの）マイクロアレイを作製して上述のすべての特徴を研究すること、
大きな生物コレクション／バンクの検証及び維持、すなわち高等生物に対する細胞系及び個々の生物体を検証し、微生物種に対して特定の菌株の純度を確認すること、
マイクロアレイを用いた標識化及びハイブリダイゼーションのためのキットを製造すること、
配列のタギング（パスポーティング）を作製するためのキットを製造すること、及び、
オリゴマイクロアレイを製造して配列タグを解析することである。
【００４８】
最後に、本発明は上述の断片の使用に基づくＮｏｔＩ ＣＯＤＥゲノムサブトラクション法にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
文献では、ＮｏｔＩ部位が実際にＣｐＧ島だけに位置し、機能遺伝子と密接に関連していることが示唆され実証された。したがって、ＮｏｔＩ部位は、物理地図だけでなく遺伝子地図作成にとっても極めて有用なマーカーである。
【００５０】
本発明者らは、６個の代表的なＮｏｔＩリンキングライブラリーから生じる５０，０００個のＮｏｔＩクローンを含む高密度グリッドを作製し、１７Ｍｂの情報を含む２２，０００個を超える独特なＮｏｔＩ配列（厳密な基準で１６，０００）を生成した。これらの配列の解析から、ＮｏｔＩ部位を囲む短い配列でさえ、新しい遺伝子の効率的な単離及び発癌の研究を可能にする重要な情報源であることが示された。
【００５１】
本発明者らは、λファージ及びプラスミドの形の代表的なＮｏｔＩリンキングライブラリー（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ等、１９９４ａ）を作成可能なＮｏｔＩリンキングライブラリー（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ等、１９９０）を構築するための新しい手法を開発した。この手順は極めて簡単で再現性があるので、多数の資源からライブラリーを構築することが可能である。
【００５２】
本発明のＮｏｔＩ（ＲＳＴ）マイクロアレイを用いて、ＮｏｔＩ部位を囲む短い配列又は一般に制限部位タグ付き配列（ＲＳＴＳ）に基づいて、複雑な微生物混合物を含めた複雑な生物系を定性的及び定量的に解析することが可能である。
【００５３】
本発明の研究では、ヒト３番染色体用ＮｏｔＩマイクロアレイ（１５０クローン）を確立し、使用して、３番染色体を腎臓癌、肺癌、乳癌及び鼻咽腔癌と比較した。
【００５４】
ゲノムワイドスキャンニング用ＮｏｔＩマイクロアレイ
近年、本発明者らは２５，０００個のＮｏｔＩクローンの配列を決定し、その中の１６，０００個の独特なクローンを同定した。ヒトゲノム全体を網羅し全遺伝子の１０％〜２０％（その４０％〜５０％はＥＳＴマイクロアレイには存在しない）を含むこれらのクローンはすでに利用可能である。
【００５５】
ＮｏｔＩマイクロアレイは、（例えば、欠失／増幅の研究のために）ゲノムワイドＮｏｔＩスキャンニングで腫瘍ゲノムＤＮＡを試験するために使用することができる。このようなアレイは、癌研究を著しく促進し、ＬＯＨ（異型接合性の喪失）、ＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション）及び他の細胞遺伝学的な研究に取って代わる可能性がある。
【００５６】
ＮｏｔＩクローンを用いたゲノムワイドスクリーニングの基本的な問題は、
（ｉ）ヒトゲノムのサイズ及び複雑さ、
（ｉｉ）繰り返し配列の数、
（ｉｉｉ）ＮｏｔＩクローン中の挿入断片のサイズが比較的小さいこと（平均６〜８ｋｂ）である。
【００５７】
この問題を解決するために、特別なプライマーを設計し、ＮｏｔＩ部位を囲む領域のみを増幅する、いわゆるＮｏｔＩレプリゼンテーション（ＮＲ）のための特別な手順を開発した。他のＤＮＡ断片は増幅されなかった。本発明者らは、ＮｏｔＩ部位を囲む配列のみを標識するこのゲノムＤＮＡの新しい標識方法とゲノムスクリーニング用のＮｏｔＩマイクロアレイを併用することを提案した。
【００５８】
ＮｏｔＩマイクロアレイイメージは、特定の細胞、腫瘍及び個体に対して作成することができる。正常細胞及び腫瘍細胞からのイメージを比較することによって、これらの違いが明確になる。この情報を使用して、２つ（又はそれ以上）のＤＮＡ間で異なるＮｏｔＩリンキングクローンを同定する。これらのクローンは、さらに進んだ解析に使用することができ、完全な遺伝子を単離するために使用することができる。ＮｏｔＩ部位の多型は極めて頻繁に起こり、文献によればＮｏｔＩ部位の４３．５％が異なってメチル化され、すなわち多型である。
【００５９】
１６，０００個の一義的なＮｏｔＩ配列（２つの配列は同じＮｏｔＩクローンに属し得る）からなる本発明者らのデータベースの解析から、実際にこれらすべてが遺伝子と関連し、遺伝子の５’末端に位置することが示された。完全に配列が決定された２１番及び２２番染色体との比較から、興味深い知見が明らかになった。２１番染色体は、１２２個の（メチル化及び非メチル化）ＮｏｔＩ部位を含み、Ｉｃｈｉｋａｗａ等、１９９３は４０個のＮｏｔＩ部位をクローン化して４３個のＮｏｔＩ断片を含む完全なＮｏｔＩ制限酵素地図を作成した。これらの４０個のクローンのうち、本発明者らのデータベースは３８個（９５％）及び追加の１３個のＮｏｔＩクローン（１１％）を含んでいた。したがって、ランダムシークエンシング（ｒａｎｄｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により、本発明者らは、２１番染色体のみからのＮｏｔＩクローンのクローニングに注力していたＩｃｈｉｋａｗａ等、１９９３の研究におけるよりも２７．５％多いＮｏｔＩクローンを単離することができた。要するに、２１番及び２２番染色体中に予想される３９０個のＮｏｔＩ部位のうち、本発明者らのデータベースは１６３個（４２％）のクローンを含む。また、本発明者らの研究で同定された１８個のクローン（５％）は、公開配列には存在しなかった。これらのクローンは多型ＮｏｔＩ部位を含んでいた。したがって、本発明者らのデータから、非メチル化（本発明者らのデータベースは非メチル化ＮｏｔＩ部位のみを含む）ＮｏｔＩ部位が、予想されるすべてのＮｏｔＩ部位の約４２％を占め、多型が５％を占めると本発明者らは結論することができる。本発明者らの推定では、ヒトゲノムは１５，０００〜２０，０００個のＮｏｔＩ部位を含み、その６，０００〜９，０００は個々の細胞中で非メチル化されている。したがって、ＮｏｔＩマイクロアレイを用いたスクリーニングは、６，０００〜９，０００個の遺伝子に関連した一塩基多型（ＳＮＰ）を用いたスクリーニングと等価である。
【００６０】
従来技術のゲノムチップを本発明のＮｏｔＩマイクロアレイと比較すると、ＮｏｔＩマイクロアレイは欠失マッピングに追加の情報を提供することが容易にわかる。すなわち、遺伝子発現プロファイリング及びメチル化の研究にＮｏｔＩマイクロアレイを使用することができる（表１参照）。
【００６１】
ＳＮＰチップ用のプローブを調製するためには、３，０００個のＰＣＲプライマー及び２４回の分離反応が必要であり、ＮｏｔＩマイクロアレイ用プローブは１〜２個のプライマーを用いて１個の反応管中で調製される。同じＮｏｔＩクローンを用いて、本発明者らは
（ｉ）欠失／増幅、
（ｉｉ）メチル化、
（ｉｉｉ）遺伝子発現プロファイル
についての情報を同時に得ることができる。
【００６２】
ＮｏｔＩマイクロアレイのこれらの特徴はすべて大規模実験に極めて重要である。
【００６３】
ＮｏｔＩマイクロアレイに対するＮＲのハイブリダイゼーションパターンは、ＮＲを調製するために使用したＤＮＡに対するマイクロアレイパスポートである。
【００６４】
本発明者らが現時点で見出した最も関連する従来技術であるＣｐＧ島マイクロアレイ（以下ＣＧＩと略記する。Ｙａｎ等、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）６１：８３７５〜８３８０参照）と、本発明のＲＳＴマイクロアレイ（以下ＲＳＴと略記する。表２参照）との違いをここで要約する。
【００６５】
本発明では、同じ制限部位を囲む配列をクローン化し、一方、ＣＧＩでは配列は２つの制限部位間の配列に由来する。
【００６６】
原則として、本発明の技術を用いれば、ＲＳＴでは任意の制限酵素を使用することができるが、ＣＧＩでは限られた数の制限酵素しか使用できない。
【００６７】
ＣＧＩはメチル化を検出できるが、（一般に）（異型又は同型接合）欠失又は非メチル化配列の増幅を検出できない。ＲＳＴはコピー数の変化とメチル化の両方を検出することができる。ＣＧＩは、正常ゲノム材料中でそれがメチル化されており、かつ腫瘍材料中でそれが欠失（非メチル化）していれば、対立遺伝子の欠失を検出することができる。しかし、重要な遺伝子の大部分は正常ゲノム材料中で非メチル化されており、正常ゲノム材料中のメチル化された遺伝子の大部分は、様々な種類の繰返し要素、例えば長散在ヌクレオチド要素（又は配列又はリピート）（ＬＩＮＥ）であるので、このプロセスは非効率的である。
【００６８】
ＣＧＩでは、ヒトＤＮＡ全体が標識されており、ＲＳＴでは０．１〜０．５％が標識されているにすぎず、このＤＮＡが含むリピートはヒトＤＮＡ全体の１／１０である。
【００６９】
ＣＧＩの多数のクローンはリピート及びリボソームＤＮＡを含むが、ＲＳＴは一義的なヒト配列を含む遺伝子を含むにすぎない。この極めて重要な違いは、全く異なるマイクロアレイ作製技術の結果である（Ｙａｎ等は本発明では使用しないメチル−ＣＧ結合カラム（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ）を使用する）。
【００７０】
ＲＳＴマイクロアレイでは、短いＯＬＩＧＯＳ（オリゴヌクレオチド２０〜１００ｂｐ）を使用できるが、ＣＧＩでは使用できない。
【００７１】
不完全な消化はＲＳＴでは問題にならないが、ＣＧＩでは人為的な信号（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ）を発生する。
【００７２】
ＲＳＴを用いると、部位がメチル化されていないときにハイブリダイゼーションが得られるのに対し、ＣＧＩでは部位がメチル化されているときにのみハイブリダイゼーションが起こる。
【００７３】
ＣＧＩマイクロアレイは、高等脊椎動物のメチル化を研究するためにのみ使用することができる。これはＲＳＴでも可能であり、ＲＳＴは、それに加えて、任意の生物体の遺伝形質を決める（パスポーティング）ためにも使用することができる。このことは、ＲＳＴマイクロアレイを使って例えば細菌及びウイルスの遺伝形質を決めることができるが、ＣＧＩではそれができないことを意味する。
【００７４】
本発明者らのＲＳＴの適用には、補足的な面、すなわち配列決定によるＮｏｔＩ（ＲＳＴ）タグ（パスポート）の生成が含まれる。配列決定は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによる配列決定を含めて、様々な技術を用いて実施することができる。このような補足的な手法は、ＣＧＩでは不可能である。
【００７５】
ＮｏｔＩ−ＣＯＤＥ（又は一般にＲＳＴ−ＣＯＤＥ）は、ＲＳＴマイクロアレイとともに使用して汚染配列（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を１段階で除去することができる。このような技術はＣＧＩでは使用できない。ＲＤＡのような既存のサブトラクティブ法は、ヒトゲノムＤＮＡ全体の高度な複雑さを扱うほどには効率的ではないので、使用することができない。
【００７６】
ＲＳＴマイクロアレイを用いると、欠失／増幅配列とメチル化配列を識別することができる。この目的を達成するために、非メチル化されているＤＮＡを用いてＮＲを作製すべきである（これは、制限酵素でまず消化したのちに限定的な（ｌｉｍｉｔｅｄ）ＰＣＲ増幅、酵素による脱メチル化など、異なる手法で実施可能である）。
【００７７】
ＮｏｔＩパスポーティング
この目的のために本発明者らは始めにＳＡＧＥ法を使用することを計画した。遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（ＳＡＧＥ）は、代表的及び包括的な差次的遺伝子発現プロファイルを可能にする（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ等、１９９５）。この手法の考え方は、ｍＲＮＡ分子のそれぞれに対して短い９ｂｐ（タギング酵素（ｔａｇｇｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）認識部位を含めると１３ｂｐ）の配列タグを作製することである。次いでこれらのタグをコンカテマー中に連結してクローン化する。１回の配列決定反応で数十のＲＮＡ分子に対する情報が作成される。したがって、数千のクローンの配列を決定することで、所与の細胞集団内において例えば推定で１０，０００〜５０，０００個の発現された遺伝子すべてを評価することができる。本発明者らは、ＮｏｔＩタグを作製するためにＳＡＧＥ法を試みたが、これは失敗に終わった。微生物混合物のゲノムＤＮＡの複雑さは、真核生物細胞のｍＲＮＡの複雑さよりも少なくとも１００倍複雑である。ＳＡＧＥではＲＮＡ分子すべてにタグを付けなければならないが、本発明者らの場合、約２５０分子のうちの１分子にタグを付けなくてはならない。本発明者らは１００〜１，０００ｋｂそれぞれに対して１個のタグを作製することを提案するが、ＳＡＧＥでは２５６ｂｐに対して１個のタグを作製する。加えて、ゲノムＤＮＡ中の配列を明快に同定するには１３ｂｐタグは不十分である。そのため、本発明者らは、Ｎｏｔパスポーティングと称する新しい手順を開発した。
【００７８】
この研究では、本発明者らは以下の変法を使用した。ゲノムＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩ付着末端でリンカーに連結した。このリンカーはＢｐｍＩ認識部位を含んでいた。この制限ヌクレアーゼは、認識部位から１６／１４ｂｐ離れたところで切断する。連結混合物をこの酵素で消化して、ＮｏｔＩ部位に隣接する１１／９ヌクレオチドタグを作製した。このＤＮＡ試料をＺＮＢｐｍリンカーに連結し、ａｎｔｉｕｎｉｖｅｒ及びＺ１ｕｎｉｖｅｒプライマーを用いてＰＣＲ増幅して８５ｂｐの二重鎖を生成した。最終のＰＣＲ増幅分子は１７ｂｐ配列タグを含み、これは元のＮｏｔＩ部位から２ｂｐが失われており、したがってＮｏｔＩタグ全体は１９ｂｐを含んでいる。ＮｏｔＩパスポートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２、Ｅ．ｃｌｏａｃｅａｅ Ｒ４及び肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）Ｂ４９５８に対して実験的に作成した。マウスから得た試料を用いた実験から、腸の糞便から単離したＤＮＡの品質は、ＮｏｔＩタグを得るのに十分であることが示された。ＮｏｔＩパスポートは、これらの種を一義的に同定し、９６個のタグのうちこれら３つの細菌種に共通するものはなかった。ジタグ（ｄｉｔａｇ）又はコンカテマーもこれら８５ｂｐの産物から作製できることは当然である。本発明者らは、ＭＰＳＳのような新しいハイスループット技術は単一タグの配列決定をコンカテマーの作製よりもより効率的な手法にするものと考えている。しかし、研究室が違えば実験の設計は異なり得る。上述したように、この制限部位タギング法は、制限ヌクレアーゼのあらゆる認識部位に適合することができる。フローラ組成物を包括的に解析する場合、異なる細菌はＣＧ含量が極めて異なっているので、いくつかのパスポートを使用することが有利である。このことは、ＮｏｔＩパスポートでは高ＣＧ含量の細菌（ＮｏｔＩ認識部位：ＧＣＧＧＣＣＧＣ）が優勢であるが、例えばＳｗａＩパスポート（ＳｗａＩ：ＡＴＴＴＡＡＡＴ）を使用すれば、高ＡＴ含量の細菌ゲノムがより慎重に分析されることを意味する。２〜３種の異なるパスポートを使用すれば、分析感度を著しく向上させることができ、様々な応用例、例えば発癌リスク、薬物療法、食餌療法などにも有利である。
【００７９】
本発明者らはパスポーティング手法の可能性を試験し、完全に配列決定された２５種の細菌種を分析した。これら細菌種のレアカット（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｉｎｇ）制限酵素の認識部位数を下記表３に示す。２５種の微生物種すべてが異なるＮｏｔＩ認識部位数を有し、したがってＮｏｔＩパスポーティングで識別できることが容易にわかる。また、表３からＰｍｅＩ及びＳｂｆＩ制限酵素がさらに情報価値のあることがわかる。
【００８０】
表４に、ＮｏｔＩ、ＰｍｅＩ及びＳｂｆＩ酵素に対して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）の異なる菌株を比較した結果を示した。これらの菌株のすべてがこれらの酵素のいずれによっても一義的に記述され、したがって本発明の方法は、異なる種及び菌株を実際に識別することができる。このことは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子による配列決定では不可能であった。
【００８１】
配列決定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株はすべて、これら３つの酵素に対して（ＮｏｔＩ認識部位の左右のタグを含めて）全部で１３１２個のタグを含み、そのうちわずか１３９が一義的ではなかった。２個のタグが同じＮｏｔＩ部位を記述し、１個のタグが同じでもう１個が異なれば、両方のタグが依然として一義的にＮｏｔＩ部位を表すと考えることが可能である。このような場合、わずかに８２個のタグが一義的ではなかった。これらの結果はこの手法の能力を示すものである。
【００８２】
本発明者らの比較実験では、（ＥＳＴ及びＥＭＢＬに入っているものを含めて）細菌ゲノム配列だけでなく全ヒトゲノム配列も使用した。このような実験では、ほとんどの場合、ＮｏｔＩタグは１〜２個の配列のミスマッチを許容しても一義的であった。
【００８３】
上述したように、ＮｏｔＩパスポーティングの極めて有利な特徴は、内部制御にある。特定の細菌種由来のＮｏｔＩ部位が例えばＮｏｔＩタグ１００及びＮｏｔＩタグ１０１を含む場合、両方のタグはほぼ同じ量得られるはずである。ＮｏｔＩタグ１００のみが存在する場合、ＮｏｔＩタグ１００は別の細菌種から発生した可能性が高いことを意味する。
【００８４】
上述したＣＯＤＥ法は、ＮｏｔＩフランキング配列に効率的に適用することができる（Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（２００２）、印刷中）。したがって、最も量の多い種をＣＯＤＥ法により除去することによって、パスポーティング法の能力及び感度をかなり増加させることができる（Ｌｉ等、２００１）。
【００８５】
複雑な微生物混合物を分析できることは、多くの応用分野で重要になる可能性がある。例えば、個々の正常フローラ組成の違いは、食餌、特別な食物、地理的位置、結腸疾患、自己免疫、結腸癌リスクに対する細菌の効果、抗生物質などの投薬及びプロバイオティックスの発生によって正常フローラ組成がどのように影響されるかを将来解析するのに役立つ。
【００８６】
この解析のため、本発明者らは、生成した制限部位タグ付き配列を使用することを提案する。数十万のタグを短時間で作製することができ、数千の細菌種／菌株を慎重に解析することができる（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｋｕ等、１９９５）。本発明者らは、このようなＮｏｔＩタグを効率的に作製することができ、このようなタグが高い特異性を有することを示した。この方法の能力は、ＣＯＤＥサブトラクティブ法を用いて増強することができる。本発明者らは、「ＮｏｔＩパスポート」（上述したようにこれは「ＲＳＴＳパスポート」と呼ぶのがより正確である）用のデータベースも提供する。このようなデータベースは、ＮｏｔＩ（ＲＳＴ）マイクロアレイデータベース（Ｌｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（２００２）、印刷中）とともに使用することができる。というのは、両方の手法は相互に補完し合うからである。これら２通りの手法が全く異なる生化学技術に基づき、しかし同じ問題を解決しようとすることから、この統合データベースは新しい知見を生み出すものである。
【００８７】
ＮｏｔＩ−ＣＯＤＥサブトラクション
本発明に先立ち、本発明者らは、ＲＤＡ及びＲＦＬＰサブトラクションのいくつかの制限を受けない、欠失配列のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｏｆ Ｄｅｌｅｔｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ＣＯＤＥ）と称する新しいゲノムサブトラクション法を開発した（Ｌｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（２００１）、３１：７８８〜７９３）。ＣＯＤＥは、単一のヌクレオチド多型をクローニングするための新しい方法であるＣＯＰ法（Ｌｉ，Ｊ．、Ｗａｎｇ，Ｆ．、Ｚａｂａｒｏｖｓｋａ，Ｖ．、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ．、Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ，Ｅ．Ｒ．、２０００、多型のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（ＣＯＰ）：複合ゲノム由来の多型配列の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）を修正したものをもとにしている。本発明者らの主な目的は、簡単で再現性の良い方法を開発し、サブトラクティブな濃縮を改良し、それによって小さなＤＮＡ産物を生成することが多い余分なＰＣＲ動力学的濃縮（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）ステップを回避することであった。
【００８８】
ＣＯＤＥ法では、制限酵素による消化、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）及び緑豆（ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる処理、ＰＣＲ増幅及びストレプトアビジン磁気ビーズによる精製を組み合わせて使用して、２つのヒト試料のゲノムから欠失配列を単離した。ＣＯＤＥは、かなり単純で効率的で堅牢な方法であることが証明された。
【００８９】
本発明では、２つの疑問点に答えねばならない。すなわち
ｉ）認識部位にＣＧを含む制限酵素に対してＣＯＤＥ法を使用することができるか、及び
（ｉｉ）欠失、増幅、メチル化ＮｏｔＩ部位に対してゲノムワイドスクリーニング用のＮｏｔＩクローンを使用することができるかどうかである。
【００９０】
ＣＯＤＥ法がＣｐＧ島の酵素切断に機能するならば、（おそらく偶然何の意味もなく欠失した）欠失配列だけでなく、疾患遺伝子候補と考えられる遺伝子もＣＯＤＥ法によりクローン化することができるであろう。
【００９１】
本発明者らは、ＮｏｔＩ部位を囲む領域のみを用いてサブトラクションすることを提案する。この手法の新規性は、環化（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）によりこれらの領域を濃縮し精製することである。本発明者らは、ＮｏｔＩレプリゼンテーション（ＮＲ）を得るための特別なプライマー及び手順を設計した。このサブトラクションの他の原理は、ＣＯＤＥ法におけるものと同じであるが、ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩで消化し、他のリンカーを用いてＮｏｔＩのみを含む断片のＰＣＲ増幅を可能にした。他のＤＮＡ断片は増幅されなかった。本明細書では、わずか２サイクルのサブトラクションを使用した。
【００９２】
この手法を有効なものにするために、本発明者らは０．７Ｍｂの同型接合的に欠失した領域を３ｐ２１〜ｐ２２に含む肺腫瘍細胞系ＡＣＣ−ＬＣ５を、正常リンパ球のコントロールＤＮＡと比較した。本発明者らは、この細胞系が他の染色体に同型接合欠失を含むかどうか知らなかった。この正常ＤＮＡは、別の個体から単離したものであったので、完全に適切なコントロールというわけではない。本発明者らは、多型配列並びに欠失配列がクローニングされると予測した。
【００９３】
サブトラクティブ法の概略を図１に示す。テスター及びドライバーＤＮＡをＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩで消化し、極めて低いＤＮＡ濃度で自己連結させて環を形成させた。これら連結された分子の大多数（９９．９９％）が次の段階ではＰＣＲ増幅されないので、分子間の連結は何ら問題を生じない。これら２つの連結された分子が近くに位置するＮｏｔＩ部位を含み、ＰＣＲ増幅され得るような極めて稀なケースは有用である。なぜならば、ＮｏｔＩを囲む様々な配列の代表（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｉｔｙ）を規格化するのにこれらが役立つからである。次いで、これらの環をＮｏｔＩで消化した。環の大多数（約９９．９％）は開環せず、したがってさらなる反応からは除外されるはずである。これは、ＢａｍＨＩ又はＢｇｌＩＩ接着末端での非正統的連結（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によるＮｏｔＩリンカーのＤＮＡ断片へのバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させるのにも役立つ。
【００９４】
正常ｄＮＴＰの存在下で、ドライバーＤＮＡをｄＵＴＰで増幅し、無修飾プライマー及びテスターＤＮＡをビオチン化プライマーで増幅した。ＤＮＡ増幅産物（平均０．５〜１．５ｋｂ）を変性し、テスターＤＮＡとドライバーＤＮＡが１：１００の比率でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションが完結した後、産物を（すべてのドライバーＤＮＡを破壊する）ＵＤＧ及び（単鎖ＤＮＡ及びすべての不完全なハイブリッドを消化する）緑豆ヌクレアーゼで処理した。得られたテスターホモハイブリッド（ｔｅｓｔｅｒ ｈｏｍｏｈｙｂｒｉｄｅｓ）を精製し、ストレプトアビジンビーズで濃縮し、もう１ラウンドのサブトラクションにかけた。最終ＰＣＲ産物を増幅し、適切なベクター、例えばｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でクローン化した。
【００９５】
本発明者らの以前の実験から、本発明者らは、ＮＬＪ−００３及びＮＬ１−４０１クローンがこの細胞系で欠失していたことを知っていた。本発明者らは、１０個のランダムなクローンからＤＮＡを単離し、それらの配列を決定した（これらの小さな挿入断片を用いてサザンブロッティングを行うことは、ＣＧ含量が高いために不可能であった）。この実験スキームでは、短いＤＮＡ配列（３００〜４００ｂｐ）のみが得られたが、それらのサイズは長距離ＰＣＲ（ｌｏｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ＰＣＲ）を用いて増大させることができる。これらのクローンのうち２つがＮＬＪ−００３ ＮｏｔＩ部位を含んでいた。
【００９６】
この実験により、１０，０００個のＮｏｔＩ部位のうちわずか２つの部位しか同型接合的に欠失した領域に位置せず、それらのうち１つはわずか１０クローンの解析後に見出されたことから、ＮｏｔＩを囲む配列を用いたサブトラクションが極めて効率的であることが示された。ＣＯＤＥ法を同じペアのドライバー／テスターに適用すると、情報価値のある大多数のクローン（１９のうち１１）はこのカテゴリに入ったことから、別のクローンは多型又は／及び半接合的に欠失する可能性がある。
【００９７】
したがって、本発明は、ＮｏｔＩ−ＣＯＤＥ法がＣｐＧ島の酵素切断に使用できることを示している。
【００９８】
ＮｏｔＩクローンマイクロアレイへのＮＲの使用
その後、本発明者らは、^３２Ｐで標識した後のＮＲを欠失ＮｏｔＩ部位の検出に直接使用できるかどうかを検討することにした。したがって、本発明者らは、ＮｏｔＩリンキングクローン由来の固定ＤＮＡを含むナイロンフィルターを調製した。これらのフィルターを、ＡＣＣ−ＬＣ５（ＮＲ−Ａ）及び正常リンパ球ＤＮＡ（ＮＲ−Ｂ）のＮＲにハイブリダイズした。
【００９９】
その結果、これら２つのＮＲは異なるハイブリダイゼーションパターンを示し、ＮＲ−ＢにハイブリダイズするいくつかのクローンはＮＲ−Ａにハイブリダイズしないことが示された。とりわけ、同型接合的に欠失したＮＬＪ−００３及びＮＬ１−４０１が容易に検出されたことは明らかである。他のクローンがＮＲ−Ａにハイブリダイズできなかった理由を理解するために、本発明者らは、４つのこのようなクローンを選択し、それらをサザンハイブリダイゼーションにより解析した。ＡＣＣ−ＬＣ５及び正常リンパ球由来のゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩ又はＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩ＋ＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル中で電気泳動して分離し、ナイロンフィルターに移し、ＮｏｔＩリンキングクローンの^３２Ｐ標識挿入断片にハイブリダイズした（図２：１〜４）。この実験から、これら４つのクローンすべてが、正常リンパ球由来のＤＮＡ中にＮｏｔＩ認識部位が明確に存在することを示し、ＡＣＣ−ＬＣ５ＤＮＡ中に対応するＮｏｔＩ部位が存在しないことを示すことが実証された。
【０１００】
次の段階として、本発明者らは、同様の実験を、ただしガラススライドに固定したＮｏｔＩリンキングクローン由来のＤＮＡのマイクロアレイを用いて実施した。この適用例の主な考え方を図３に示す。特定のＮｏｔＩ部位がＤＮＡ中に存在すれば、環はＮｏｔＩで開き、標識されるはずである。しかし、このＮｏｔＩ部位が欠失するかメチル化されていれば、ＮＲは対応するＤＮＡ配列を含まないことになる。
【０１０１】
第１の実験では、本発明者らは、ヒト−マウスマイクロセルハイブリッド細胞系ＭＣＨ９０３．１（ヒト３番染色体全部を含む）及びＭＣＨ９３９．２（３番染色体ｐ１４〜ｐ２２欠失）から単離したＤＮＡを用いた。ＭＣＨ９０３．１のＮＲを赤で標識し、ＭＣＨ９３９．３のＮＲを緑で標識した。したがって、ＭＣＨ９３９．２で欠失した配列は赤のはずである。その後、欠失を正確にマップした（図４Ａ）。本発明以前であれば、同じ結果を得るのに１年の研究が必要であったであろう。
【０１０２】
第２の実験では、ＡＣＣ−ＬＣ５由来のＤＮＡを再度使用してＮＲ−Ａを調製し、正常リンパ球ＤＮＡを使用してＮＲ−Ｂを作製した。ＮＲ−ＡをＣｙ３（緑）及びＮＲ−ＢをＣｙ５（赤）で標識した。両方の配列が両方のＮＲに存在すれば、組み合わせた色は黄色に近くなるはずであり、いくつかのクローンがＡＣＣ−ＬＣ５で欠失していればこれらのクローンの色はより赤くなるはずである（図４Ｂ）。図４に示すように、同型接合的に欠失したクローンＮＬＪ−００３及びＮＬ１−４０１を明瞭に検出することができる。より赤い色を示す他のクローンは、１００％のケースで３ｐのＳＣＬＣ欠失が実際に検出されるという事実を反映している可能性が最も高い。いくつかのクローンは、ＮＬＪ−００３及びＮＬ１−４０１と同じ不均衡を示した。これは、両方の対立遺伝子のメチル化又はＮｏｔＩ部位の１つの対立遺伝子の欠失及びもう一方のメチル化（又は多型）によって説明することができる。実際、図２：３〜４に示すように、クローンＮＬＭ−１３２及びＮＲ３−０７７は切断可能なＮｏｔＩ部位を含んでいない。やはり完全に赤であった他の２つの例（ＡＰ２０及びＮＲＬ１−１）では状況が異なる。１つの対立遺伝子はメチル化され、もう一方は欠失している（図２：５〜６及び表５）。
【０１０３】
このハイブリダイゼーションの結果をさらに検討するために、ＴａｑＭａｎプローブを５つのＮｏｔＩリンキングクローンに対して設計した。定量的リアルタイムＰＣＲを、これらのプライマー／プローブを用いＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｍｏｄｅｌ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ検出器を使用して実施した。定量的ＰＣＲの結果は、ＮｏｔＩマイクロアレイハイブリダイゼーションと良く一致した（下記表５参照）。
【０１０４】
正常ＤＮＡによる腫瘍ＤＮＡの汚染は、腫瘍抑制遺伝子の同定にとって重大な問題である。３０〜４０％の汚染正常細胞を含む２つのＲＣＣ生検試料を対照実験で使用して、ＮｏｔＩマイクロアレイの汚染に対する感応度を検査した。ハイブリダイゼーション前にＮｏｔＩ−ＣＯＤＥ法の１段階を用い、１つの色素だけでプローブを標識した。図４（Ｃ、Ｄ）に示すように、ハイブリダイゼーションにより、ＲＣＣにおいて最も頻繁に欠失する２つの領域、３ｐ２１テロメア（ＮＬＪ−００３の近く）及び３ｐ２１動原体（ＮＲＬ１−１の近く）が明確に同定された。したがって、腫瘍の生検試料で起こり得る不純物の問題は、ＮｏｔＩマイクロアレイでは容易に解決することができる。
【実施例】
【０１０５】
細胞系及び一般的方法
本発明では、小細胞肺癌細胞系ＡＣＣ−ＬＣ５から単離したＤＮＡを使用した。この細胞系は、３ｐ２１．３〜ｐ２２に同型接合の６８５ｋｂの欠失を含み、ＤＮＡ Ａ、ドライバーの資源として使用された。正常ヒトリンパ球から単離したＤＮＡをコントロールＤＮＡ（ＤＮＡ Ｂ、テスター）とした。
【０１０６】
ＤＮＡの単離、サザントランスファー、ハイブリダイゼーションなどは、文献に記載された標準法に従った。ＮｏｔＩリンキングライブラリーを上述のようにして構築した。
【０１０７】
標準的な手順を用いて、格子状にしたＮｏｔＩリンキングクローンのナイロンフィルターレプリカを調製した。ナイロンフィルターは、１００個のマップされた３番染色体に特異的なＮｏｔＩリンキングクローン及び１５個のランダムなマップされていないヒトＮｏｔＩリンキングクローンを含んでいた。格子状のＮｏｔＩクローンのナイロンフィルターレプリカにハイブリダイゼーションするために、ＰＣＲによってＮＲプローブを^３２Ｐ標識した。
【０１０８】
ＡＢＩ ３１０自動シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に製造者の手順に従って配列決定用ゲルをかけた。
【０１０９】
細菌の増殖、他の微生物学的操作、ＤＮＡの単離、配列決定を標準法に従って実施した。
【０１１０】
修正ＮｏｔＩ−ＣＯＤＥ法
２つのオリゴヌクレオチド：ＮｏｔＸ５’−ＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＧＣ−３’及びＮｏｔＹ：３’−ＡＡＡＣＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＧＣＣＧＧ−３’を使用してＮｏｔＩリンカーを作製した。１００μＭ ＮｏｔＸ２０μｌ、１００μＭ ＮｏｔＹ２０μｌ、１０×Ｍ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１０μｌ及びＨ_２０５０μｌを含む最終体積１００μｌでアニーリングを実施した。反応混合物を８分間煮沸し、室温（ｒ．ｔ．）で徐冷した。
【０１１１】
ＤＮＡ濃度５０μｇ／ｍｌのＡＣＣ−ＬＣ５細胞系（ＤＮＡ Ａ）及び正常リンパ球（ＤＮＡ Ｂ）由来のＤＮＡ２ｍｇをＢａｍＨＩ ２０Ｕ及びＢｇｌＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２０Ｕにより３７℃で５時間消化し、その後６５℃で２０分間加熱して不活化した。次いで、消化されたＤＮＡ０．４μｇを、反応混合物１ｍｌ中適切な緩衝液で希釈したＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とともに終夜循環させた。
【０１１２】
ＤＮＡをエタノール中で沈殿させて濃縮し、例えばクレノー断片で部分的に充填（ｆｕｌｌ ｉｎ）し、ＮｏｔＩ １０Ｕを用いて３７℃で３時間消化した。消化後、ＮｏｔＩを加熱不活化し、５０Ｍ過剰のＮｏｔＩリンカーの存在下室温で終夜ＤＮＡを連結した。
【０１１３】
６７ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．１、１６．６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、２００μＭ ｄＮＴＰ、テスターアンプリコンＤＮＡ １００ｎｇ、４００ｎＭビオチン化プライマーＮｏｔＸ及びＴａｑポリメラーゼ５Ｕを含む溶液１００μｌ中でテスターアンプリコン（ＮｏｔＩリンカーを含むＤＮＡ Ｂ）のＰＣＲを実施した。
【０１１４】
ＮｏｔＸプライマーを用い以下の修正条件、すなわちｄＴＴｐの代わりにｄＵＴＰ（３００μＭ）を使用し、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２ではなく２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を使用して、２０本の管の中でドライバーアンプリコン（ＮｏｔＩリンカーを含むＤＮＡ Ａ）のＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクル条件は、７２℃５分、その後９５℃１分、７２℃２．５分及び最後の７２℃５分の伸張期間を２５サイクルであった。これらのＰＣＲ増幅したテスター及びドライバーアンプリコンを本発明者らはＮｏｔＩレプリゼンテーション（ＮＲ）と称する。
【０１１５】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡ Ａ試料のすべてをプールし（２０００μｌ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ Ｂ２０μｌと混合した（サブトラクションのため、本発明者らは１：１００のＤＮＡ ＢとＤＮＡ Ａの比を採用した）。プールした試料をエタノール中で沈殿させて濃縮し、ＪＥＴｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＧＥＮＯＭＥＤ Ｉｎｃ．）を用いて精製し、Ｈ_２Ｏ１００μｌに溶解した。このＤＮＡ混合物をさらに濃縮して６μｌとし、鉱油のもとで１０分間煮沸した。
【０１１６】
０．４Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液９μｌ中で４０時間サブトラクティブハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリダイゼーション後、混合物を２００μｌに希釈し、等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出して鉱油を除去した。
【０１１７】
ＵＤＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）による処理を、７０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び１ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液中ＵＤＧ ３０Ｕとともに３７℃で４時間実施した。次いで、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液２５μｌに溶解した。これに、３μｌの１０×ＭＢＮ緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．６、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ酢酸亜鉛及び０．００１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）及び緑豆ヌクレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）２０Ｕを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを添加して反応を停止して、最終濃度を１ｍＭとした。
【０１１８】
サブトラクトしたＤＮＡを、ストレプトアビジンの結合したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０（Ｄｙｎａｌ Ａ．Ｓ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）で製造者の指示に従って精製し、ＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。増幅したＤＮＡを第２ラウンドのハイブリダイゼーションにかける前に、ＤＮＡ Ｂに対して上述したように、ただし８サイクルのみでこのＤＮＡ調製物約０．５μｌをＰＣＲ増幅した。
【０１１９】
最終のサブトラクション産物をＰＣＲ増幅し、ＪＥＴｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＧＥＮＯＭＥＤ Ｉｎｃ．）で精製し、ＮｏｔＩで消化した。このＤＮＡ調製物をｐＢＣ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に挿入し、ＮｏｔＩで消化し、アルカリホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で脱リン酸化した。
【０１２０】
マイクロアレイ調製、ハイブリダイゼーション及びスキャンニング
マイクロアレイを基本的にＳｃｈｅｎａ Ｍ．等、１９９６に記述されたように構築した。簡潔に述べると、ＮｏｔＩリンキングクローンのＤＮＡを、３−アミノプロピルトリメトキシシランをコートした顕微鏡ガラススライド上にスポットした。ＮｏｔＩクローンの大部分は、挿入断片２〜１２ｋｂを含んでいた（ベクター部分は３．８又は４．５ｋｂであった。Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ等、１９９０参照）。Ｑｉａｇｅｎの精製ＤＮＡをＴＥに溶解し、ＧＭＳ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を用いてスポット密度３７５μｍで並べた。次いでアレイを風乾し、７０％ＥｔＯＨに３０分間室温で浸し、再び風乾し、暗所に−２０℃で貯蔵した。本明細書に記載したマイクロアレイは、１５０個の配列の決定されたヒト３番染色体特異的ＳＴＳを６反復含み、６１個の既知及び４９個の未知の発現配列タグを示した。
【０１２１】
ＮｏｔＸプライマーを用いたＰＣＲ反応でＮＲプローブを標識した。ＰＣＲ ＤＩＧ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）又はＢｉｏｔｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（ＭＩＣＲＯＭＡＸ、ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いてジゴキシゲニン又はビオチンを組み入れた。ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｓａｖｅｅｎ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、メンブレンベースの化学発光分析（ＭＩＣＲＯＭＡＸ、ＮＥＮ）により標識化効率を決定した。
【０１２２】
低品質ＤＮＡを用いてＮＲを調製するための別法も使用した。この方法によれば、ゲノムＤＮＡを、ＮｏｔＩと別の酵素又は認識部位にＣｐＧペアをもたない酵素の組合せ（例えばＳａｕ３Ａ又はＢａｍＨＩ＋ＢｇｌＩＩ）で同時に消化した。
【０１２３】
２つの酵素を不活化した後、特異的なアダプターＳａｕ００Ｎ及びＮＢＳｇｔ９９をこれらに連結した。
Ｓａｕ００Ｎ

ＮＢＳｇｔ９９

【０１２４】
その後、Ｚｕｎｉｖ及びＺｇｔプライマーの存在下でＰＣＲによりＮＲを調製した。ＰＣＲサイクル条件を、９５℃２分、その後９５℃４５秒、６５℃３０秒及び７２℃１．５分を２５サイクルとした。一般に、これらのＮＲはハイブリダイゼーション実験で同じ結果を示したが、通常、バックグラウンドはより高かった。
【０１２５】
条件を満たしたＤｉｇ標識プローブ及びＢｉｏ標識プローブを結合させて９９℃で２分間変性し、変性した（０．１Ｍ ＮａＯＨ、２分、室温）マイクロアレイとＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＩＣＲＯＭＡＸ、ＮＥＮ）中６５℃で５時間ハイブリダイズした。
【０１２６】
このアレイを室温で５分間低ストリンジェンシーの緩衝液（０．０６×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳ）で洗浄し、ＴＳＡシステム（ＭＩＣＲＯＭＡＸ、ＮＥＮ）を用いて製造者の手順に従って展開（ｄｅｖｅｌｏｐ）した。簡潔に述べると、本発明者らは、マイクロアレイをホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と複合された抗ＤＩＧ抗体とともに、次いでシアニン−３−チラミド溶液とともにインキュベートした。この第１層中のパーオキシダーゼを不活化した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅを塗布し、ビオチン残基をシアニン−５−チラミドで可視化した。
【０１２７】
このアレイをＧＭＳ ４１８ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇｅｎｅｔｉｃ ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）でスキャンし、解析し、ＩｍａＧｅｎｅ ３．０５ソフトウェア（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により表示させた。６回のスポット繰り返しすべての比の平均をとってＣｙ３／Ｃｙ５蛍光比の正確な測定値を得た。
【０１２８】
ＴａｑＭａｎプローブを用いた定量的リアルタイムＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを、５個のＮｏｔＩリンキングクローン、すなわち、ＮＲＬ１−１（３ｐ２１．２）、ＮＬ３−００１（３ｐ２１．２〜２１．３２）、ＮＬ１−２０５（３ｐ２１．２〜２１．３２）、ＮＬｊ３（３ｐ２１．３３）、９２４−０２１（３ｐｌ２．３）を増幅するように設計した。ｈｕＢＡ−ベータ−アクチン遺伝子を基準配列（内部コントロール）として使用した。ｈｕＢＡを除いたプライマー配列及びプローブ配列の最終的な選択を、ＡＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ１．５（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて製造者の指示に従って実施した。ＴａｑＭａｎプローブ及びプライマーをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから入手した。ＴａｑＭａｎプローブは、５’−蛍光性レポーター色素及び３’−クエンチャー色素を含むオリゴヌクレオチドからなる。５’末端に位置するレポーター色素として、ＮＬｊ３、ＮＲＬ１−１及びｈｕＢＡプローブはＦＡＭ（６−カルボキシフルオロセイン）を含み、ＮＬ３−００１、ＮＬ１−２０５及び９２４−０２１ＲプローブはＪＯＥ（２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシ−フルオロセイン）を含んでいた。レポーターすべてを、３’末端ヌクレオチドに複合化したＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）でクエンチした。得られた配列を下記表６に示す。
【０１２９】
１×ＰＣＲ緩衝液Ａ：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＫＣｌ、６０ｎＭパッシブリファレンス（ｐａｓｓｉｖｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）Ａ、室温でｐＨ８．３；３．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、４００μＭ ｄＵＴＰ、１００ｎＭ ＴａｑＭａｎプローブ、適切な濃度の順方向及び逆方向プライマー、０．０２５単位／μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、０．０１単位／μｌのＡｍｐＥｒａｓｅ及び適切な希釈ＤＮＡテンプレート５μｌからなる体積２５μｌでＰＣＲ反応を実施した。Ｈ_２Ｏを総体積２５μｌに添加した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを用いてＰＣＲを実施した。同じ又は別の管中の試料に対してそれぞれ３回ＰＣＲ反応を実施した。
【０１３０】
同じ管中の２対以上のプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲでプライマーリミテーション（ｐｒｉｍｅｒ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）実験を実施した（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．ユーザーニュース２号 遺伝子発現の比較定量（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｎｏ．２．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９９７）。熱サイクル条件を、５０℃２分、９５℃１０分、その後９５℃１５秒と６０℃１分の４０サイクルで構成した。
【０１３１】
サイクル閾値（Ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｃ_Ｔ）の決定（すなわち、ＰＣＲ産物の合成から得られるレポーター色素の蛍光がバックグラウンドの蛍光レベルよりも有意に高くなるのに必要なサイクル数の計算）は、各反応装置によって自動的に行われた。
【０１３２】
標的配列を定量的に評価するための比較Ｃ_Ｔ法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ_Ｔ ｍｅｔｈｏｄ）（ΔΔＣ_Ｔ法）の理論及び誘導に関する詳細は公表されている（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．ユーザーニュース２号 遺伝子発現の比較定量（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｎｏ．２．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９９７）。この方法は、反応の標的配列コピー開始量（数）とＡＢＩ７７００システムによる対応するＣＴ決定値との間に存在する逆指数関係に依存し、すなわち、コピー数が多いほどＣＴ値が小さくなる（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．ユーザーニュース２号 遺伝子発現の比較定量（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｎｏ．２．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９９７）。本発明者らは、比較サイクル閾値（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｙｃｌｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｃ_Ｔ）法と称する手法を用いて、両方の試料で、比較用試料−正常ＤＮＡ（較正物質）に対する腫瘍試料−ＡＣＣＬＣ５（標的）の標的配列量を決定し、内部コントロール配列−ベータ−アクチン（標準）と比較した。ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの指針に従って設計され最適化されたアンプリコンの場合、効率は１００％に近い。この場合、内部標準及び比較較正物質に対して規格化された標的の量（コピー数）は、Ｎ_{ＡＣＣ−ＬＣ５}／Ｎ_{較正物 質}＝２^{−ΔΔＣＴ}で与えられる。ΔΔＣ_Ｔの計算には、ＡＣＣ−ＬＣ５及びＣＢＭＩに対する平均標的配列Ｃ_Ｔから平均標準配列Ｃ_Ｔ値を引いて、ΔＣ_Ｔ ^{ＡＣＣ−ＬＣ５}＝Ｃ_Ｔ ^標的−Ｃ_Ｔ ^アクチン及びΔＣ_Ｔ ^ｎｏｒｍ＝Ｃ_Ｔ ^標的−Ｃ_Ｔ ^アクチン値を得る必要がある。次いで、ΔＣ_Ｔ ^{ＡＣＣ−ＬＣ５}からΔＣ_Ｔ ^ｎｏｒｍを引いてΔΔＣ_Ｔが得られる。β−アクチンに対する全プローブに与えられた範囲は、２^{−ΔΔＣＴ}とΔΔＣ_Ｔ＋ｓ及びΔΔＣ_Ｔ−ｓ（２^{−ΔΔＣＴ} ｗｉｔｈ ΔΔＣ_Ｔ＋ｓ ａｎｄ ΔΔＣ_Ｔ−ｓ）（式中、ｓはΔΔＣ_Ｔ値の標準偏差）で決定される。
【０１３３】
ΔΔＣ_Ｔの計算を有効にするためには、標的の増幅効率及び標準の増幅効率をほぼ同じにしなければならない。ΔΔＣＴ法を定量評価に使用する前に、確認実験を実施した（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ．ユーザーニュース２号 遺伝子発現の比較定量（Ｕｓｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｎｏ．２．Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）．ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、１９９７）。実施した確認実験から、これら標的及び標準の効率は、選択した希釈液でほぼ等しいことが示された。この場合、本発明者らは、標準曲線を用いずにΔΔＣＴ計算法を用いて標的を相対的に定量することができる。
【０１３４】
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＤＳ）ソフトウェア（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータ解析を行った。
【０１３５】
ＮｏｔＩ−パスポーティング手順
２つのオリゴヌクレオチド、ＢｆｏｃＩＩ：５’−ｇｇａｔｇａａａａｃｔｇｇａ−３’及びＺ９８ＮＯＴ：３’−ｇｔｃｇｔｇａｃｔｇｇｇａａａａｃｃｃｔｇｇｃｃｔａｃｔｔｔｔｇａｃｃｔｃｃｇｇ−５’を使用してＮｏｔＩリンカーを作製した。
【０１３６】
濃度５０μｇ／ｍｌの細菌ＤＮＡ２μｇをＮｏｔＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）２０Ｕを用いて３７℃で２時間消化し、８５℃で２０分間加熱して不活化した。次いで、反応混合物１００μｌ中適切な緩衝液に希釈したＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて（５０Ｍ過剰の）消化したＤＮＡ０．４μｇをＮｏｔＩリンカーに終夜連結した。次いで、このＤＮＡをエタノール中で沈殿させて濃縮し、３７℃で３時間ＢｐｍＩ１０Ｕで消化した。
【０１３７】
消化後、ＢｐｍＩを加熱不活化し、５０Ｍ過剰のＺＮＢｐｍリンカーの存在下室温で終夜ＤＮＡを連結した。２つのヌクレオチド、Ｚａｍｉｎｅ：５’−ｃｔｃａａａｃｃｇｔ−３’及びＺ２＿ｕｎｉｖｅｒ：３’−Ｎｎｇａｇｔｔｔｇｇｃａｃａｇｃａｃｔｇａｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇａｃｃ−５’を用いてＺＮＢｐｍリンカーを作製した。
【０１３８】
次いで、この試料を、ＪＥＴｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＧＥＮＯＭＥＤ Ｉｎｃ．）を用いて精製し、ＴＥ１００μｌに溶解した。この試料１μｌをＺｌ ｕｎｉｖｅｒ（３’−ｇａｇｔｔｔｇｇｃａｃａｇｃａｃｔｇａｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇａｃｃ−５’）プライマー及びａｎｔｉｕｎｉｖｅｒ（５’−ｃａｇｃａｃｔｇａｃｃｃｔｔｔｔｇｇｇａｃｃ−３’）プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。
【０１３９】
６７ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）、１６．６ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２．０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、２００μＭ ｄＮＴＰ、ＰＣＲプール３μｌ、各プライマー４００ｎＭ及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕを含有する溶液４０μｌでＰＣＲを実施した。ＰＣＲサイクル条件を、９５℃１．５分、その後９５℃１分、６０℃１分、７２℃０．５分及び最後の７２℃３分の伸張期間を２５サイクルとした。
【０１４０】
最終産物をＪＥＴｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ ＧｍｂＨ）で精製し、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）でクローン化した。配列決定用ゲルを、標準プライマーを用いて、製造者の手順に従いＡＢＩ３７７自動シークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にかけた。
【０１４１】
複雑なフローラ組成物を分析する場合、本発明者らは、そのゲノムのいくつかの特定の断片（例えばＮｏｔＩレプリゼンテーション、ＮｏｔＩタグ、ＮｏｔＩリンキングクローンなど）のみを使用することを勧める。したがって、本発明者らは、ゲノムすべての配列を決定すること又は遺伝子すべてを研究することを目的としない。本発明者らは、特定の微生物体／遺伝子のために特別なサインを付け、様々な結腸フローラ試料中のこれらのサインを解析する。本発明の研究では、本発明者らは、ＮｏｔＩ又は他の制限酵素認識部位に付けた短い配列タグの使用について調べた。ＮｏｔＩタグのコレクションは、ＮｏｔＩ配列パスポートであり、すなわち簡潔に述べると、ＮｏｔＩパスポート及びＮｏｔＩパスポーティングはＮｏｔＩタグ／パスポートの作成を意味する。その命名は、最初に使用した酵素に基づくが、この方法は他の制限酵素にも同様に適合させることができる。
【０１４２】
一般的な実験設計は以下のとおりである（図５）。糞便試料及び外科試料から作製したＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、ＢｐｍＩ認識部位を含む特別なリンカーに連結する。次いで、ＤＮＡをＢｐｍＩで消化し、特別なリンカーに連結し、ＰＣＲ増幅する。本発明者らは、これらの条件下で、特定の８５ｂｐ ＮｏｔＩ−ＢｐｍＩ断片のみが増幅されることを証明した（図６）。ＢｐｍＩ及びＦｏｋＩで消化された後、この断片は、特定のＮｏｔＩ部位を示す２４ｂｐ断片を生成するはずである。ここからは、２つの方向性で研究することが可能である。
ａ）コンカテマーストラテジー
この２４ｂｐユニットを、約１，０００ｂｐのサイズのコンカテマーに連結し、クローン化し、配列を決定する。各配列決定反応は、約２０〜５０個のＮｏｔＩ部位の情報を与えるはずである。
ｂ）オリゴマーストラテジー。
【０１４３】
パイロシークエンシング（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又は大規模並列シグネチャーシークエンシング（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの新しいハイスループット配列決定技術が最近開発されている。これらによって、１人で１日に何千もの配列を作製することができる。しかし、これらの配列は極めて短く２０〜４０ｂｐであり、本発明者らの要求に良く適合しており、それによって特定の試料に対するＮｏｔＩパスポートを作成することができる。例えば異なる個体又は薬物治療前後の同じ個体から得たこれらのパスポートを比較して、本発明者らは、それらに違いがあることを見出した。この情報は、いくつかの例ではそのまま使用して結論を下すことができる。別の例では、これらの配列を使用して、本発明者らは２つの試料間で異なるＮｏｔＩリンキングクローンを同定することができる。これらのクローンは、さらに進んだ解析、例えば特定の健康状態（例えば癌、老化など）の原因である遺伝子を見つけることや必須の微生物体の配列決定／単離に使用することができる。
【０１４４】
【表１−１】

【０１４５】
【表１−２】

【０１４６】
【表２】

【０１４７】
【表３】

【０１４８】
【表４】

【０１４９】
【表５】

【０１５０】
【表６】

【０１５１】
（参考文献）

【０１５２】

【０１５３】

【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＮｏｔＩ−ＣＯＤＥサブトラクション操作の一般的なスキームを示す図である。
【図２】様々なハイブリダイゼーションを示すＮｏｔＩクローンのサザンハイブリダイゼーションを示す図である。クローンの名前を下部に示す。Ｎは正常ＤＮＡ、Ｌは肺癌細胞系ＡＣＣ−ＬＣ５から単離したＤＮＡである。
【図３】ＮｏｔＩマイクロアレイ用ＮＲを用いる一般的な原理を示す図である。
【図４】マイクロセルハイブリッドＭＣＨ９３９．２（Ａ）、細胞系ＡＣＣ−ＬＣ５（Ｂ）、並びに原発性ＲＣＣ腫瘍＃１９６（Ｃ）及び＃３０１（Ｄ）中の欠失／メチル化のＮｏｔＩマイクロアレイプロファイリングを示す図である。 マイクロアレイ（１）の代表的なイメージを３番染色体の物理地図に従って整列させている。１次元クラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）（２）は、蛍光データを規格化した平均赤／緑比（赤、Ｒ＞３；緑、Ｒ＜０．３）に基づいている。（Ａ）及び（Ｂ）では、正常ＤＮＡと試験ＤＮＡをハイブリダイズした。ＭＣＨ９０３．１（染色体全体）のＮＲを赤で標識し、ＭＣＨ９３９．２（３ｐ．１４〜ｐ２２欠失）のＮＲを緑で標識した。同様に、正常リンパ球ＤＮＡのＮＲを赤、小細胞肺癌系ＡＣＣ ＬＣ５を緑で標識した。赤のクラスターは、完全な３番染色体又は正常ＤＮＡの著しい過剰発現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す。緑のクラスターは、正常ＤＮＡの過少発現（ｕｎｄｅｒ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す。（Ｃ）及び（Ｄ）では、１段階のＮｏｔＩ−ＣＯＤＥサブトラクション操作を実施し、単一のカラーハイブリダイゼーション（ｃｏｌｏｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。緑のクラスターは、正常ＤＮＡの著しい過剰発現を示している。灰色は、コントロールである。
【図５】実験の一般的なスキームを示す図である。（微生物フローラ）
【図６】約１９ｂｐのＮｏｔＩタグ情報を含む８５ｂｐオリゴヌクレオチドの生成を説明するフローチャートである。

Claims (20)

1. 固相に結合された核酸及び／又は修飾核酸標準材料を調製するための方法であって、
   核酸及び／又は修飾核酸標準材料を生化学的及び／又は化学的手法で消化して、特定の認識部位を囲む配列断片を得るステップと、
   特定の認識部位に関連した前記核酸及び／又は修飾核酸配列断片を選択するステップ
   を含む上記方法。
2. 前記標準材料を第１の制限酵素及び／又は１種若しくは複数の第２の制限酵素で消化する請求項１記載の方法。
3. 制限酵素がエンドヌクレアーゼである請求項２記載の方法。
4. 第１のエンドヌクレアーゼの認識部位が、前記ゲノム材料に沿って極めてまばらに分布し、かつ遺伝子配列に隣接して位置し、前記１種又は複数の第２の制限エンドヌクレアーゼの認識部位が、前記ゲノム材料に沿って第１のエンドヌクレアーゼの部位よりも多く存在する請求項３記載の方法。
5. 第１及び第２の制限エンドヌクレアーゼによる消化が同時に行われ、第１及び第２の制限エンドヌクレアーゼによって切断されて生じた末端それぞれに異なるリンカーが連結され、これらのリンカーが、ＰＣＲ反応を起こすためにプライマーが添加されたときに、第１の制限エンドヌクレアーゼによって切断されて生じる末端を含む断片のみが増幅されるように設計されている請求項４記載の方法。
6. 標準材料が１種又は複数の第２の制限エンドヌクレアーゼによってまず消化され、こうして得られた断片の各末端が環状の核酸及び／又は修飾核酸分子の型の中に自己連結し、第１の制限エンドヌクレアーゼによる消化の前に自己連結後に残った線状の断片が不活化され、それによって第１のエンドヌクレアーゼによって消化されて生じる線状断片がＰＣＲ増幅にかけられる請求項４記載の方法。
7. 第１の制限エンドヌクレアーゼがＮｏｔＩ又は他の任意の制限エンドヌクレアーゼであり、その制限部位がゲノム材料中のＣｐＧ島の近辺にある請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 第１の制限エンドヌクレアーゼが、ＮｏｔＩ、ＰｍｅＩ又はＳｂｆＩ、或いは２つ以上の前記エンドヌクレアーゼの組合せであり、第２のエンドヌクレアーゼがＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、ＢｇｌＩＩ又はＳａｕ３Ａ、或いは２つ以上の前記エンドヌクレアーゼの組合せである請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記核酸及び／又は修飾核酸標準材料を、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド又は改変されたオリゴヌクレオチド、或いは２つ以上の前記材料の組合せから選択する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 固相がガラススライド、コードされたビーズ、ニトロセルロースなどのセルロース又はフィルターである請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ゲノム材料を１人又は複数のヒトから、体内の異なる部位から、同一又は異なる時刻に採取する請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ゲノム材料を腸、皮膚又はヒトの体の他の部分の細菌から採取する請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ゲノム材料を任意の生物体、細菌、動物又は植物、或いはこれらから産生される産物、或いはゲノム材料が含まれうる任意の物質、特に空気及び水から採取する請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる断片。
15. 請求項１４記載の断片を含む核酸及び／又は修飾核酸のマイクロアレイ。
16. 生物体のゲノム又はその一部のレプリゼンテーションであって、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得られる核酸及び／又は修飾核酸断片の複数のコピー又はそれらから選択されるものを含むレプリゼンテーション。
17. 前記固相の形で存在する核酸及び／又は修飾核酸断片に液状のレプリゼンテーションをハイブリダイズする請求項１６記載のレプリゼンテーション。
18. 異なるゲノムを識別すること、同一個体から異なる時点で得られたゲノム材料内のメチル化、欠失、突然変異及び他の変化を検出すること、又は一個体から得られたゲノム材料におけるメチル化、欠失、突然変異及び他の変化を少なくとも１つの他の個体から得られる標準のレプリゼンテーションと比較して検出すること、或いはそれらの組合せにおける請求項１６又は１７に記載のレプリゼンテーションの使用。
19. 発癌遺伝子などの診断、予後、同定のために真核生物のゲノムのメチル化及びコピー数の変化を研究すること、
    様々な微生物（ウイルス、原核生物、真核生物）の遺伝形質を決めること、
    複雑な生物系、すなわち、ヒトの腸、或いは水、食物、空気資源中の細菌フローラのバイオコンプレキシティー及び多様性を研究すること、
    複雑な生物混合物を含めた様々な資源中の病原体を同定すること、
    様々な目的、すなわち、様々な条件、すなわち様々な年齢、疾患／健康、感染／非感染などで生物体を記述するために、パスポート（マイクロアレイハイブリダイゼーションのイメージ、タグ配列を含むデータベース）を作成すること、
    新しい生物体、例えば細菌種を同定すること、
    （ＤＮＡ及びオリゴベースの）マイクロアレイを作製して上述のすべての特徴を研究すること、
    大きな生物コレクション／バンクの検証及び維持、すなわち高等生物に対して細胞系及び個々の生物体を検証し、微生物種に対して特定の菌株の純度を確認すること、
    マイクロアレイを用いた標識化及びハイブリダイゼーションのためのキットを作製すること、
    配列のタギング（パスポーティング）を作製するためのキットを製造すること、及び、
    オリゴマイクロアレイを製造して配列タグを解析することのための請求項１６又は１７に記載のレプリゼンテーションの使用。
20. 請求項１４記載の断片の使用に基づくＮｏｔＩ ＣＯＤＥゲノムサブトラクション方法。

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