JP2015521862A - 非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 - Google Patents

非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 Download PDF

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Abstract

母親とその胎児との間で差次的にメチル化されたゲノム領域を利用して、母体サンプルから胎児核酸を分離するか、単離するか、または富化する、組成物およびプロセスが提供される。本明細書に記載される組成物およびプロセスは、染色体の異数性の検出を含む非侵襲性の出生前診断にとって特に有用である。本明細書における技術は、とりわけ、胎児の遺伝形質の非侵襲的検出に有用なヒトエピジェネティックバイオマーカーを提供し、その遺伝形質としては、胎児核酸の有無、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常が挙げられるが、それらに限定されない。

Description

関連出願
本出願は、２０１２年７月１３日に出願され、非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物というタイトルであり、発明者がＪｏｈｎ Ａｌｌｅｎ ＴＹＮＡＮおよびＭｅｎｇｊｉａ ＴＡＮＧであり、代理人番号ＳＥＱ−６０２２−ＰＶ２が割り当てられている、米国仮特許出願第６１／６７１，６２８号の優先権の利益を請求し、そして、２０１２年１１月２日に出願され、非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物というタイトルであり、発明者がＪｏｈｎ Ａｌｌｅｎ ＴＹＮＡＮおよびＧｒａｎｔ ＨＯＧＧであり、代理人番号ＳＥＱ−６０２２−ＰＶ３が割り当てられている、米国仮特許出願第６１／７２１，９２９号の優先権の利益を請求する。前述の出願の全ての内容は、全ての文章、表および図面を含め、参照によって、本開示に組み込まれる。
本技術は、出生前診断法および富化方法に部分的に関する。
背景
非侵襲性の出生前検査は、急速に関心が寄せられている分野になっている。妊娠関連の症状（妊娠中の合併症および胎児の遺伝的欠陥を含む）が早期発見されると、母体と胎児の両方の安全にとって必要な早期の医学的介入が可能になるので、その早期発見は、非常に重要である。出生前診断は、絨毛生検（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｕｓ ｓａｍｐｌｉｎｇ）（ＣＶＳ）または羊水穿刺などの手法によって胎児から単離された細胞を用いて行われてきた。しかしながら、これらの従来法は、侵襲性であり、母体と胎児の両方に対してかなりのリスクをもたらす。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅは、現在、侵襲性の羊水穿刺検査後および絨毛生検（ＣＶＳ）検査後の１〜２パーセントの流産率を言及している。
循環無細胞胎児核酸が母体の血漿中および血清中で検出され得るという発見（Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５０：４８５−４８７，１９９７；および米国特許第６，２５８，５４０号）の後、これらの侵襲性アプローチに代わるものが、例えば、胎児の異常を検出する出生前スクリーニングのために開発されてきた。循環無細胞胎児核酸（ｃｆｆＮＡ）は、それを非侵襲性の出生前検査に適用可能にするいくつかの利点を有する。例えば、無細胞核酸は、胎児の細胞よりも高いレベルで、かつ遺伝子分析にとって十分な濃度で、存在する。また、ｃｆｆＮＡは、分娩後、数時間以内に母体の血流から取り除かれ、これにより、前回の妊娠からの混入が予防される。
母体の血漿中または血清中の胎児ＤＮＡを検出することによって行われる出生前検査の例としては、胎児のｒｈｅｓｕｓ Ｄ（ＲｈＤ）ジェノタイピング（Ｌｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１７３４−１７３８，１９９８）、胎児の性別判定（Ｃｏｓｔａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５０２，２００２）およびいくつかの胎児の障害の診断（Ａｍｉｃｕｃｃｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：３０１−３０２，２０００；Ｓａｉｔｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１１７０，２０００；およびＣｈｉｕら、Ｌａｎｃｅｔ ３６０：９９８−１０００，２００２）が挙げられる。さらに、母体の血漿／血清中の胎児ＤＮＡの量的異常は、子癇前症（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８４−１８８，１９９９およびＺｈｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８４：４１４−４１９，２００１）、胎児のトリソミー２１（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１７４７−１７５１，１９９９およびＺｈｏｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０：７９５−７９８，２０００）および妊娠悪阻（Ｓｅｋｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：２１６４−２１６５，２００１）において報告されている。
米国特許第６，２５８，５４０号明細書
Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５０：４８５−４８７，１９９７ Ｌｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９：１７３４−１７３８，１９９８ Ｃｏｓｔａら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１５０２，２００２ Ａｍｉｃｕｃｃｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：３０１−３０２，２０００；Ｓａｉｔｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１１７０，２０００ Ｓａｉｔｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５６：１１７０，２０００ Ｃｈｉｕら、Ｌａｎｃｅｔ ３６０：９９８−１０００，２００２ Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８４−１８８，１９９９ Ｚｈｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８４：４１４−４１９，２００１ Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１７４７−１７５１，１９９９ Ｚｈｏｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０：７９５−７９８，２０００ Ｓｅｋｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：２１６４−２１６５，２００１
要旨
本明細書における技術は、とりわけ、胎児の遺伝形質の非侵襲的検出に有用なヒトエピジェネティックバイオマーカーを提供し、その遺伝形質としては、胎児核酸の有無、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書における技術のヒトエピジェネティックバイオマーカーは、胎児と母体との間で差次的なＣｐＧメチル化パターンを示すゲノムＤＮＡである。本明細書における技術の組成物およびプロセスは、母体サンプル中の胎児核酸のメチル化状態に基づいて前記サンプル中の胎児核酸の検出および定量化を可能にする。より詳細には、母体サンプル由来の胎児核酸の量が、存在する核酸の合計量に対して測定され、それにより、そのサンプル中の胎児核酸のパーセンテージが提供され得る。さらに、胎児核酸の量は、配列特異的（または遺伝子座特異的）様式で、かつ正確な染色体量決定（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｄｏｓａｇｅ）分析（例えば、胎児の異数性の有無の検出）が可能であるのに十分な感度で、測定され得る。
本明細書における技術の第１の態様において、胎児核酸と母体核酸との間の差次的なメチル化に基づいて母体の生物学的サンプルから胎児核酸を富化する方法が提供され、その方法は：（ａ）サンプル由来の標的核酸およびサンプル由来のコントロール核酸をメチル化特異的結合タンパク質に結合するステップ；および（ｂ）メチル化の状態に基づいて、結合した核酸を溶出するステップ（ここで、差次的にメチル化された核酸は、少なくとも部分的に別個の画分に溶出される）を含む。ある実施形態において、その核酸配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む。配列番号１〜２６１は、表４Ａ〜４Ｃに提供されている。本明細書における技術は、配列番号１〜２６１の配列およびそれに対するバリエーションを含む。ある実施形態では、コントロール核酸をステップ（ａ）に含めない。
関連実施形態において、母体サンプルから胎児核酸を富化する方法が提供され、その方法は、以下のステップ：（ａ）女性から生物学的サンプルを得るステップ；（ｂ）そのサンプル中のＣｐＧ含有ゲノム配列のメチル化の状態に基づいて、胎児核酸および母体核酸を分離するステップ（ここで、胎児由来のゲノム配列と女性由来ゲノム配列とは、差次的にメチル化されており、それにより、サンプル中の女性由来のゲノム配列と胎児由来のゲノム配列とが区別される）を含む。ある実施形態において、そのゲノム配列は、少なくとも１つのシトシンを含む少なくとも１５ヌクレオチド長であり、さらに、その領域は、（１）表１Ａ〜１Ｃから選択されるゲノム遺伝子座；ならびに（２）その遺伝子座から１０ｋｂ以下だけ上流および／または下流のＤＮＡ配列からなる。本明細書における技術のこの態様および全ての態様について、女性から生物学的サンプルを得るステップは、本明細書における技術の範囲を限定するように意味されない。前記得るステップは、女性からサンプルを実際に採取すること（例えば、採血）または他の場所（例えば、クリニックまたは病院）からサンプルを受け取ること、およびその方法の残りのステップを行うことを指し得る。
関連実施形態において、母体サンプルから胎児核酸を富化する方法が提供され、その方法は、以下のステップ：（ａ）女性から生物学的サンプルを得るステップ；（ｂ）そのサンプル中のＣｐＧ含有ゲノム配列のメチル化の状態に基づいて、母体核酸を消化するかまたは除去するステップ（ここで、胎児由来のゲノム配列と女性由来のゲノム配列とは、差次的にメチル化されており、それにより、サンプル中の胎児由来のゲノム配列が富化される）を含む。母体核酸は、メチル化の状態に基づいて母体核酸を選択的に消化するかまたは切断する１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を用いて消化され得る。ある実施形態において、そのゲノム配列は、少なくとも１つのシトシンを含む少なくとも１５ヌクレオチド長であり、さらに、その領域は、（１）表１Ａ〜１Ｃから選択されるゲノム遺伝子座；ならびに（２）その遺伝子座から１０ｋｂ以下だけ上流および／または下流のＤＮＡ配列からなる。
本明細書における技術の第２の態様において、胎児核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を調製する方法が提供され、その方法は、以下のステップ：（ａ）妊娠女性からサンプルを得るステップ；（ｂ）胎児核酸と母体核酸対応物との間の異なるメチル化の状態に従って、その妊娠女性のサンプル由来の母体核酸から胎児核酸を分離するステップ（ここで、胎児核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含む遺伝子または遺伝子座由来のポリヌクレオチド配列内に配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数に由来する１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む）；および（ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用する増幅プロセスによって胎児核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を調製するステップを含む。ある実施形態において、胎児核酸のヌクレオチド配列を有する核酸を調製する方法が提供され、その方法は、以下のステップ：（ａ）妊娠女性からサンプルを得るステップ；（ｂ）胎児核酸と母体核酸対応物との間の異なるメチル化の状況に従って、妊娠女性のサンプルから母体核酸を消化するかまたは除去するステップ（ここで、胎児核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含む遺伝子由来のポリヌクレオチド配列内に配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数に由来する１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む）；および（ｃ）胎児核酸のヌクレオチド配列を含む核酸を調製するステップを含む。ステップ（ｃ）の調製プロセスは、パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用する、ハイブリダイゼーションプロセス、捕捉プロセスまたは増幅プロセスであり得る。また、母体核酸を消化する上記の実施形態において、その母体核酸は、メチル化の状態に基づいて母体核酸を選択的に消化するかまたは切断する１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を用いて消化され得る。いずれかの実施形態において、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含むＣｐＧアイランド由来のポリヌクレオチド配列内に存在し得る。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、さらに、配列番号１〜２６１に提供されているポリヌクレオチド配列とオーバーラップするＣｐＧアイランドの同定を含む特徴づけが本明細書における表１〜３において行われている。ある実施形態において、パート（ｃ）によって調製された核酸は、溶液中に存在する。なおもある実施形態において、この方法は、ステップ（ｃ）の増幅プロセス由来の胎児核酸を定量化するステップをさらに含む。
本明細書における技術の第３の態様において、母体核酸に関して、妊娠女性由来のサンプルから胎児核酸を富化する方法が提供され、その方法は、以下のステップ：（ａ）妊娠女性からサンプルを得るステップ；および（ｂ）胎児核酸と母体核酸との間で異なるメチル化の状況に従って、その妊娠女性のサンプル由来の母体核酸から胎児核酸を分離するかまたは捕捉するステップ（ここで、胎児核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含む遺伝子由来のポリヌクレオチド配列内に配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数に由来する１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む）を含む。ある実施形態において、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含むＣｐＧアイランド由来のポリヌクレオチド配列内に存在し得る。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、本明細書における表１Ａ〜１Ｃにおいて特徴づけられている。ある実施形態において、パート（ｂ）によって分離された核酸は、溶液中に存在する。なおもある実施形態において、その方法は、さらに、ステップ（ｂ）の分離プロセス由来の胎児核酸を増幅するおよび／または定量化するステップを含む。
本明細書における技術の第４の態様において、妊娠女性の胎児由来の単離された核酸を含む組成物が提供され、ここで、その核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む。１つの実施形態において、そのヌクレオチド配列は、遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部から本質的になる。ある実施形態において、そのヌクレオチド配列は、ＣｐＧアイランドのヌクレオチド配列またはその一部から本質的になる。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、表１Ａ〜１Ｃにおいてさらに特徴づけられている。ある実施形態において、その核酸は、溶液中に存在する。ある実施形態において、胎児由来の核酸は、母体核酸と比べて富化される。ある実施形態において、その組成物は、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用物質をさらに含む。例えば、その作用物質は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）またはそのフラグメントであり得る。
本明細書における技術の第５の態様において、妊娠女性の胎児由来の単離された核酸を含む組成物が提供され、ここで、その核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含む遺伝子由来のポリヌクレオチド配列内またはその一部内に配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数に由来する１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む。ある実施形態において、その核酸のヌクレオチド配列は、配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つを含むＣｐＧアイランド由来のポリヌクレオチド配列内またはその一部内に配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数に由来する１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む。配列番号１〜２６１のポリヌクレオチド配列は、表１Ａ〜１Ｃにおいてさらに特徴づけられている。ある実施形態において、その核酸は、溶液中に存在する。ある実施形態において、胎児由来の核酸は、母体核酸と比べて富化される。本明細書における技術の高メチル化されたおよび低メチル化された核酸配列は、表１Ａ〜１Ｃにおいて特定されている。ある実施形態において、その組成物は、さらに、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用物質を含む。例えば、その作用物質は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）またはそのフラグメントであり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書における技術のヌクレオチド配列は、３つ以上のＣｐＧ部位を含む。ある実施形態において、本ヌクレオチド配列は、５つ以上のＣｐＧ部位を含む。ある実施形態において、本ヌクレオチド配列は、ＰＲＣ２ドメインを含む遺伝子領域由来である（表３を参照のこと）。ある実施形態において、本ヌクレオチド配列は、発生に関わる遺伝子領域由来である。例えば、ＳＯＸ１４（本技術のエピジェネティックマーカーである（表１Ａを参照のこと））は、胚発生の制御および細胞運命の決定に関与する転写因子のＳＯＸ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）ファミリーのメンバーである。
いくつかの実施形態において、女性由来のゲノム配列は、メチル化されており、胎児由来のゲノム配列は、メチル化されていない。他の実施形態において、女性由来のゲノム配列は、メチル化されておらず、胎児由来のゲノム配列が、メチル化されている。ある実施形態において、胎児由来のゲノム配列は、母体由来のゲノム配列と比べて高メチル化されている。母体のゲノム配列と比べて高メチル化されていると見出された胎児のゲノム配列は、配列番号１〜５９、９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および２６１に提供されている。あるいは、胎児由来のゲノム配列は、母体由来のゲノム配列と比べて低メチル化されている。母体のゲノム配列と比べて低メチル化されていると見出された胎児のゲノム配列は、配列番号６０〜８５、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１７８、１８１、１８２、１８３、１８５、１８６、１８７、１９２、１９４、１９６、１９７、２０４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２２、２２４、２２７、２２８、２２９、２３０、２３４、２３６、２３７、２３８、２４０、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６および２６０に提供されている。本明細書における技術のメチル化感受性制限酵素は、低メチル化されたまたは高メチル化された核酸に感受性であり得る。
ある実施形態において、胎児核酸は、細胞外の核酸である。一般に、細胞外の胎児核酸は、約５００、４００、３００、２５０、２００または１５０（またはこの間に存在する任意の数の）ヌクレオチド塩基以下である。ある実施形態において、消化された母体核酸は、約９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０塩基対未満である。関連実施形態において、胎児核酸は、サイズに基づいて、消化された母体核酸からまたは消化された母体核酸に対して選択的に増幅されるか、捕捉されるか、または分離される。例えば、ＰＣＲプライマーは、約７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０（またはこの間に存在する任意の数の）塩基対より大きい核酸を増幅するように設計され得、それにより、胎児核酸および未消化の母体核酸が増幅される。ある実施形態において、核酸は、本明細書における技術の方法の前に、断片化に供される。核酸をフラグメント化する方法の例としては、超音波処理および制限酵素消化が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、胎児核酸は、胎盤から得られる。他の実施形態において、胎児核酸は、アポトーシスにおけるものである。
いくつかの実施形態において、本技術は、サンプルが、以下：母体の全血、母体の血漿または血清、羊水、絨毛サンプル、着床前の胚由来の生検材料、母体の血液から単離された胎児の有核細胞または胎児の細胞レムナント（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｍｎａｎｔｓ）、母体の尿、母体の唾液、雌性生殖輸管の洗液、および体腔穿刺（ｃｅｌｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）または肺洗浄によって得られたサンプルから選択されるメンバーである方法を提供する。特定の実施形態において、生物学的サンプルは、母体の血液である。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、絨毛サンプルである。特定の実施形態において、母体サンプルは、本技術の方法の前に胎児核酸について富化される。胎児の富化方法の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７１４０４１７Ａ２、ＷＯ２００９／０３２７８１Ａ２およびＵＳ公開番号２００５０１６４２４１に提供されている。
いくつかの実施形態において、本明細書における技術の方法を実施する前に、有核細胞および無核細胞の集団の全てをサンプルから取り出す。いくつかの実施形態において、サンプルは、そのサンプル中に存在する胎児核酸の品質の低下（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ）を最小にするために、当業者に公知の様式で、回収されるか、保存されるか、または輸送される。
そのサンプルは、任意の動物に由来し得、それらとしては、ヒト、非ヒト、哺乳類動物、爬虫類、ウシ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ブタ（ｐｉｇ）、サル、類人猿、ゴリラ、雄ウシ、ウシ、クマ、ウマ、ヒツジ、家禽類、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラおよびサメ、または検出可能な妊娠関連障害もしくは染色体異常を有し得る任意の動物もしくは生物が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態において、サンプルを、メチル化されたＤＮＡとメチル化されていないＤＮＡとを差次的に改変する試薬で処理する。例えば、その試薬は、亜硫酸水素塩を含み得るか；またはその試薬は、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断する１つまたは複数の酵素を含み得るか；または、その試薬は、メチル化されていないＤＮＡを優先的に切断する１つまたは複数の酵素を含み得る。メチル化感受性制限酵素の例としては、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩが挙げられるが、それらに限定されない。
１つの実施形態において、胎児核酸は、胎児核酸中のメチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用物質によって母体核酸から分離される。ある実施形態において、胎児核酸は、母体核酸対応物中のメチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用物質によって母体核酸から分離されるかまたは除去される。ある実施形態において、メチル化されたヌクレオチドに結合する作用物質は、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）またはそのフラグメントである。
本明細書における技術の第６の態様において、差次的にメチル化された母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含む母体サンプル中の胎児ＤＮＡの量またはコピー数を測定する方法が提供される。その方法は、ａ）差次的なメチル化の状態に基づいて、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとを区別するステップ；およびｂ）ステップａ）の胎児ＤＮＡを定量化するステップによって行われる。特定の実施形態において、その方法は、ａ）１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の母体ＤＮＡを消化し、それにより、胎児ＤＮＡを富化するステップ；およびｂ）ステップａ）からの胎児ＤＮＡの量を測定するステップを含む。胎児ＤＮＡの量は、とりわけ、胎児核酸の有無を確認するため、胎児の性別を判定するため、胎児の疾患もしくは妊娠関連障害を診断するために使用され得るか、または感度もしくは特異性を改善するために他の胎児診断法と合わせて使用され得る。１つの実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、アレル比を用いずに、ステップｂ）において胎児ＤＮＡが定量化される。ある実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、シトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理を必要としない。亜硫酸水素塩は、ＤＮＡを分解することにより、母体サンプル中に存在する、すでに限られた胎児核酸をさらに減少させると知られている。１つの実施形態において、ステップｂ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、既知濃度の１つまたは複数の競合因子を導入することによって行われる。ある実施形態において、ステップｂ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸長、シークエンシングまたはカウントによって行われる。関連実施形態において、核酸の量は、米国特許公開番号ＵＳ２００７００６５８２３に記載されているようなＢＥＡＭｉｎｇ技術を用いて測定される。別の関連実施形態において、核酸の量は、米国特許公開番号ＵＳ２００９００２９３７７（米国出願番号１２／１７８，１８１）に記載のショットガンシークエンシング技術またはその変法を使用して測定される。ある実施形態において、制限効率（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が、測定され、その効率比（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒａｔｅ）を用いて、さらに胎児ＤＮＡの量が測定される。差次的にメチル化された例示的な核酸は、配列番号１〜２６１に提供されている。
本明細書における技術の第７の態様において、母体サンプル中の胎児ＤＮＡの濃度を測定する方法が提供され（ここで、母体サンプルは、差次的にメチル化された母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡを含む）、その方法は、ａ）母体サンプル中に存在するＤＮＡの合計量を測定するステップ；ｂ）１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の母体ＤＮＡを選択的に消化することにより、胎児ＤＮＡを富化するステップ；ｃ）ステップｂ）からの胎児ＤＮＡの量を測定するステップ；およびｄ）ステップｃ）からの胎児ＤＮＡの量をステップａ）からのＤＮＡの合計量と比較することにより、母体サンプル中の胎児ＤＮＡの濃度を決定するステップを含む。胎児ＤＮＡの濃度は、とりわけ、感度または特異性を改善するために他の胎児診断法と合わせて使用され得る。１つの実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、アレル比を用いずに、ステップｂ）において胎児ＤＮＡが定量化される。ある実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、シトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理を必要としない。１つの実施形態において、ステップｂ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、既知濃度の１つまたは複数の競合因子を導入することによって行われる。ある実施形態において、ステップｂ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシングまたはカウントによって行われる。ある実施形態において、制限効率が測定され、それを用いて、さらに全ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡの量が測定される。差次的にメチル化された例示的な核酸は、配列番号１〜２６１に提供されている。
本明細書における技術の第８の態様において、母体サンプル由来の胎児ＤＮＡを用いて胎児の異数性の有無を判定する方法が提供され（ここで、母体サンプルは、差次的にメチル化された母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとを含む）、その方法は、ａ）１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を用いて母体サンプル中の母体ＤＮＡを選択的に消化することにより、胎児ＤＮＡを富化するステップ；ｂ）標的染色体由来の胎児ＤＮＡの量を測定するステップ；ｃ）参照染色体由来の胎児ＤＮＡの量を測定するステップ；およびｄ）ステップｂ）からの胎児ＤＮＡの量をステップｃ）からの胎児ＤＮＡの量と比較するステップ（ここで、標的胎児ＤＮＡの量と参照胎児ＤＮＡの量との間の生物学的または統計学的に有意な差は、胎児の異数性の存在を示唆する）を含む。１つの実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、多型配列の使用を必要としない。例えば、アレル比を用いずに、ステップｂ）において胎児ＤＮＡが定量化される。ある実施形態において、胎児ＤＮＡの量を測定する方法は、シトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理を必要としない。１つの実施形態において、ステップｂ）およびｃ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、既知濃度の１つまたは複数の競合因子を導入することによって行われる。ある実施形態において、ステップｂ）およびｃ）において胎児ＤＮＡの量を測定することは、ＲＴ−ＰＣＲ、シークエンシングまたはカウントによって行われる。ある実施形態において、ステップｂ）において測定された標的染色体由来の胎児ＤＮＡの量は、標準コントロール、例えば、正倍数性の妊娠からの標的染色体由来の胎児ＤＮＡの量と比較される。ある実施形態において、制限効率が測定され、それを用いてさらに標的染色体由来および参照染色体由来の胎児ＤＮＡの量が測定される。差次的にメチル化された例示的な核酸は、配列番号１〜２６１に提供されている。
本明細書における技術の第９の態様において、差次的にメチル化された核酸のサンプル由来の標的核酸およびコントロール核酸の量またはコピー数を分析することによって染色体異常の有無を検出する方法が提供され、その方法は：（ａ）メチル化の状況に基づいて、サンプルから標的核酸およびサンプルからコントロール核酸を富化するステップ；（ｂ）少なくとも１つの画分中の富化された標的核酸のコピー数の分析を行うステップ；（ｃ）少なくとも１つの画分中の富化されたコントロール核酸のコピー数の分析を行うステップ；（ｄ）ステップ（ｂ）からのコピー数をステップ（ｃ）からのコピー数と比較するステップ；および（ｅ）ステップ（ｄ）における比較に基づいて染色体異常が存在するか否かを判定するステップ（ここで、標的核酸およびコントロール核酸は、同じまたは実質的に同じメチル化の状態を有する）を含む。関連実施形態において、差次的にメチル化された核酸のサンプル由来の標的核酸およびコントロール核酸の量またはコピー数を分析することによって染色体異常の有無を検出する方法が提供され、その方法は：（ａ）サンプル由来の標的核酸およびサンプル由来のコントロール核酸を結合剤に結合するステップ；（ｂ）メチル化の状態に基づいて、結合した核酸を溶出するステップ（ここで、差次的にメチル化された核酸は、少なくとも部分的に別個の画分に溶出される）；（ｃ）少なくとも１つの画分中の溶出された標的核酸のコピー数の分析を行うステップ；（ｄ）少なくとも１つの画分中の溶出されたコントロール核酸のコピー数の分析を行うステップ；（ｅ）ステップ（ｃ）からのコピー数をステップ（ｄ）からのコピー数と比較するステップ；および（ｆ）ステップ（ｅ）における比較に基づいて染色体異常が存在するか否かを判定するステップ（ここで、標的核酸およびコントロール核酸は、同じまたは実質的に同じメチル化の状態を有する）を含む。差次的にメチル化された核酸は、配列番号１〜２６１に提供されている。
本明細書における技術の第１０の態様において、差次的にメチル化された核酸のサンプル由来の標的核酸およびコントロール核酸のアレル比を分析することによって染色体異常の有無を検出する方法が提供され、その方法は：（ａ）サンプル由来の標的核酸およびサンプル由来のコントロール核酸を結合剤に結合するステップ；（ｂ）メチル化の状態に基づいて、結合した核酸を溶出するステップ（ここで、差次的にメチル化された核酸は、少なくとも部分的に別個の画分に溶出される）；（ｃ）少なくとも１つの画分中の溶出された標的核酸のアレル比の分析を行うステップ；（ｄ）少なくとも１つの画分中の溶出されたコントロール核酸のアレル比の分析を行うステップ；（ｅ）ステップｃからのアレル比をステップｄからの全てと比較するステップ；および（ｆ）ステップ（ｅ）における比較に基づいて染色体異常が存在するか否かを判定するステップ（ここで、標的核酸およびコントロール核酸は、同じまたは実質的に同じメチル化の状態を有する）を含む。差次的にメチル化された核酸は、配列番号１〜２６１に提供されており、差次的にメチル化された核酸内のＳＮＰは、表２に提供されている。この方法は、妊娠関連障害を検出するためにも有用であり得る。
本明細書における技術の第１１の態様において、母体核酸の量は、本明細書における技術のメチル化に基づく方法を用いて測定される。例えば、胎児核酸が、サンプル中の母体核酸から分離され得（例えば、メチル化感受性酵素を用いて消化され得）、母体核酸が、本明細書における技術の方法を用いて定量化され得る。母体核酸の量が測定されると、その量をサンプル中の核酸の合計量から減算することにより、胎児核酸の量が決定され得る。胎児核酸の量は、本明細書に記載されるような、胎児の異数性を含む胎児の形質を検出するために使用され得る。
本明細書に記載される技術の全ての態様および実施形態について、上記方法は、妊娠関連障害を検出するためにも有用であり得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、胎児核酸、または胎児核酸および母体核酸を含む。サンプルが、胎児核酸および母体核酸を含む場合、その胎児核酸および母体核酸は、異なるメチル化の状態を有し得る。異なるメチル化の状態を有する核酸種は、当技術分野において公知の任意の方法によって判別され得る。ある実施形態において、胎児核酸は、メチル化感受性制限酵素による母体核酸の選択的消化によって富化される。ある実施形態において、胎児核酸は、同じアッセイにおいて２つ以上のメチル化感受性制限酵素を用いる母体核酸の選択的消化によって富化される。ある実施形態において、標的核酸とコントロール核酸の両方が、胎児由来である。ある実施形態において、胎児核酸の平均サイズは、約１００塩基長〜約５００塩基長である。ある実施形態において、染色体異常は、トリソミー２１などの異数性である。いくつかの実施形態において、標的核酸は、異常であり得る染色体の少なくとも一部であり、コントロール核酸は、非常にまれにしか異常でない染色体の少なくとも一部である。例えば、標的核酸が、２１番染色体に由来するとき、コントロール核酸は、２１番染色体以外の染色体、好ましくは、別の常染色体由来である。ある実施形態において、結合剤は、ＭＢＤ−Ｆｃなどのメチル化特異的結合タンパク質である。また、富化された核酸または溶出された核酸は、当技術分野において公知の任意の方法によって増幅および／または定量化される。ある実施形態において、胎児ＤＮＡは、多型配列の使用を必要としない方法を用いて定量化される。例えば、アレル比を用いずに、胎児ＤＮＡが定量化される。ある実施形態において、胎児ＤＮＡの量を定量化する方法は、シトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理を必要としない。
いくつかの実施形態において、本明細書における技術の方法は、サンプル中の１つまたは複数のＹ染色体特異的配列の量を測定する追加ステップを含む。関連実施形態では、本明細書における技術のメチル化に基づく方法を用いることによって測定されるサンプル中の胎児核酸の量が、存在するＹ染色体核酸の量と比較される。
メチル化の状態に基づいて核酸を判別する方法としては、メチル化感受性捕捉、例えば、ＭＢＤ２−Ｆｃフラグメントを用いるもの；亜硫酸水素塩変換法、例えば、ＭＳＰ（メチル化感受性ＰＣＲ）、ＣＯＢＲＡ、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）またはＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）技術；およびメチル化感受性制限酵素の使用が挙げられるが、それらに限定されない。明示的に述べられる場合を除いて、メチル化の状態に基づいて核酸を判別する任意の方法が、本明細書における技術の組成物および方法とともに用いられ得る。
いくつかの実施形態において、本明細書における技術の方法は、増幅ステップをさらに含み得る。増幅ステップは、メチル化特異的ＰＣＲなどのＰＣＲによって行われ得る。ある実施形態において、増幅反応は、例えば、米国特許第６，１４３，４９６号および同第６，４４０，７０６号（両方が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに説明されているデジタルＰＣＲによって、単一分子に対して行われる。他の実施形態において、本方法は、増幅を必要としない。例えば、富化された胎児ＤＮＡの量は、フローサイトメーターを用いて胎児ＤＮＡ（またはそれに付着された配列タグ）をカウントすることによって、または増幅を必要としないシークエンシング手段によって、測定され得る。ある実施形態において、胎児ＤＮＡの量は、消化された母体核酸より大きいアンプリコンを生成する増幅反応によって胎児核酸をさらに富化することによって、測定される。
いくつかの実施形態において、胎児核酸（単独でまたは母体核酸と組み合わせて）は、１つまたは複数の検出部分を含む。１つの実施形態において、検出部分は、コンポマー（ｃｏｍｐｏｍｅｒ）、糖、ペプチド、タンパク質、抗体、化学物質（例えば、ビオチン）、質量タグ（例えば、金属イオンまたは化学基）、蛍光タグ、電荷タグ（例えば、ポリアミンまたは荷電色素）および疎水性タグのうちのいずれか１つまたは複数であり得る。関連実施形態において、検出部分は、質量分析によって検出される、質量で識別可能である生成物（ＭＤＰ）またはＭＤＰの一部である。特定の実施形態において、検出部分は、質量分析によって検出される蛍光タグまたは標識である。いくつかの実施形態において、検出部分は、検出オリゴヌクレオチドの５’末端に存在するか、検出部分は、検出オリゴヌクレオチドの非相補的領域に付着されているか、または検出部分は、非相補的配列の５’末端に存在する。特定の実施形態において、検出部分は、検出オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドまたは３’末端のヌクレオチドに組み込まれるかまたは連結される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の検出部分が、単独でまたは組み合わせて使用される。例えば、米国特許出願ＵＳ２００８０３０５４７９およびＵＳ２００９０１１１７１２を参照のこと。特定の実施形態において、検出部分は、例えば、米国出願番号１２／７２６，２４６に記載されているように、制限エンドヌクレアーゼによって切断される。いくつかの実施形態において、特定の標的染色体は、特定の検出部分で標識され、１つまたは複数の非標的染色体は、異なる検出部分で標識され、それにより、標的染色体の量（ａｍｏｕｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｃｈｒｏｍｓｏｍｅ）が、非標的染色体の量と比較され得る。
配列分析を必要とする実施形態の場合、以下のシークエンシング技術：プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（登録商標）；Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．）、ダイレクトＤＮＡシークエンシング、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ分析）、例えば、「ＳＴＡＲ」（スケーラブル転写分析ルーチン（Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｏｕｔｉｎｅ））技術（米国特許第７，０８１，３３９号を参照のこと）またはその変法を使用するリアルタイムＰＣＲ、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、パイロシークエンシング分析、アシクロプライム（ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ）分析、リバースドットブロット、遺伝子チップマイクロアレイ、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブおよびロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレート色素、ＦＲＥＴプライマー、蛍光タグ付けｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝的ビット（ｇｅｎｅｔｉｃ ｂｉｔ）分析（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシークエンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ化プライマー伸長（ａｒｒａｙｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア（Ｃｏｄｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、鋳型特異的取り込み（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＴＤＩ）、蛍光偏光、比色オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロックプローブ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ、少なくとも１つのプローブを用いるハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識プローブを用いるハイブリダイゼーション、電気泳動、例えば、４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、２００５ Ｎａｔｕｒｅ ４３７，３７６−３８０）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（またはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）またはＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行われるような、クローニングおよびシークエンシング、またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡシークエンシング技術（Ｈａｒｒｉｓ Ｔ Ｄら、２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０，１０６−１０９）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ．ＴＭ．）技術、または例えば、ＤＮＡの個々の各塩基がサンプルウェルの底部の微小ポアを通過するときに、各塩基に関連する電荷を測定する、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔイオンセンサー、もしくはＤＮＡの個々の各単位に関連する電荷を測定するためにナノポアを使用する、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅデバイスを使用する、ナノポアに基づくシークエンシング（Ｓｏｎｉ ＧＶ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．２００７ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：１９９６−２００１）のうちのいずれか１つおよびそれらの組み合わせが使用され得る。ナノポアに基づく方法は、ナノポアを用いて核酸をシークエンシングするステップ、またはナノポアを用いて、例えば、サイズに基づいて核酸分子をカウントするステップ（ここで、配列情報は決定されない）を含み得る。
１つまたは複数の核酸の絶対コピー数は、例えば、絶対コピー数測定のための競合的ＰＣＲ法を用いる系である質量分析を用いて測定され得る。例えば、Ｄｉｎｇ Ｃ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ（２００３）Ａ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ＭＳ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：３０５９−３０６４および米国特許公開番号２００４００８１９９３として公開された米国特許出願番号１０／６５５７６２（この両方が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
いくつかの実施形態において、ゲノム配列の量は、標準コントロールと比較され、ここで、標準コントロールからの増加または減少が、妊娠関連障害の存在または進行を示唆する。例えば、胎児核酸の量は、サンプル中に存在するＤＮＡの合計量と比較され得る。または、胎児の異数性の有無を検出するとき、標的染色体由来の胎児核酸の量は、参照染色体由来の胎児核酸の量と比較され得る。好ましくは、参照染色体は、異数性の割合の低い別の常染色体である。標的胎児核酸と参照胎児核酸との比は、正常な正倍数性の妊娠からの同じ比と比較され得る。例えば、コントロール比は、染色体異常を有しない健常な胎児を有する女性から得られたＤＮＡサンプルから決定され得る。好ましくは、コントロールサンプルのパネルが使用される。特定の染色体異常が既知である場合、特定の疾患または症状を示唆する基準も存在し得る。したがって、例えば、妊娠女性の母体血漿中の３つの異なる染色体異数性についてスクリーニングするために、好ましくは、例えば、１３番、１８番または２１番染色体のトリソミーを有する胎児を有すると判明している母体および染色体異常を有しない胎児を妊娠している母体から単離されたコントロールＤＮＡのパネルが使用される。
いくつかの実施形態において、本技術は、標的核酸由来およびコントロール核酸由来のアレルが配列変異（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）によって判別される方法を提供する。その配列変異は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または挿入／欠失多型であり得る。いくつかの実施形態において、胎児核酸は、染色体異常の有無を評価するために、核酸のアレル比の決定を可能にする少なくとも１つの高頻度のヘテロ接合性多型を含むべきである（例えば、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％以上の頻度率）。ＳＮＰの例のリストは、表２、表９および表１０に提供されているが、しかしながら、これらは、本明細書における技術の一部として使用され得る多型アレルの完全なリストを表しているわけではない。いくつかの実施形態において、例えば、以下の基準を満たす任意のＳＮＰもまた考慮に入れられ得る：（ａ）ＳＮＰは、約２％より高いヘテロ接合性頻度を有する（好ましくは、一連の異なる集団にわたって）、（ｂ）ＳＮＰは、ヘテロ接合性の遺伝子座である；および（ｃ）（ｉ）ＳＮＰは、本明細書に記載される核酸配列内に存在するか、または（ｃ）（ｉｉｉ）ＳＮＰは、本明細書に記載されるＳＮＰの約５〜約２０００塩基対以内（例えば、本明細書に記載されるＳＮＰの約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０または２０００塩基対以内）に存在する。いくつかの例において、ＳＮＰは、本明細書にさらに詳細に記載される他の基準によって選択される。
他の実施形態において、配列変異は、短いタンデム反復（ＳＴＲ）多型である。いくつかの実施形態において、配列変異は、制限酵素認識部位内に含まれ、ここで、１つのアレルは、制限酵素による消化を受けやすく、他の１つまたは複数のアレルは、そうではない。いくつかの実施形態において、配列変異は、メチル化部位である。
いくつかの実施形態において、アレル比の分析の実施は、妊婦から核酸含有生物学的サンプルを得ることによって、その妊婦の胎児由来の標的核酸およびコントロール核酸のアレル比を測定するステップ（ここで、その生物学的サンプルは、胎児核酸を含む）、差次的なメチル化に基づいて母体核酸から胎児核酸を部分的または全体的に分離するステップ、アレルを標的核酸およびコントロール核酸と識別した後、アレル比を測定するステップ、およびアレル比に基づいて胎児の染色体障害の有無を検出するステップ（ここで、正常な正倍数性の比よりも高いまたは低い比は、染色体障害を示唆する）を含む。１つの実施形態において、標的核酸は、疑いのある異数性染色体（例えば、２１番染色体）由来のものであり、コントロール核酸は、同じ胎児の正倍数性染色体由来のものである。
いくつかの実施形態において、本技術は、複数の染色体異常の有無を検出するために、他の胎児マーカーと併用され、ここで、その染色体異常は、以下：トリソミー２１、トリソミー１８およびトリソミー１３またはそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態において、染色体障害は、Ｘ染色体またはＹ染色体が関与する。
いくつかの実施形態において、本組成物またはプロセスは、単一反応において多重化され得る。例えば、胎児核酸の量は、ゲノム全体にわたる複数の遺伝子座において測定され得る。または、胎児の異数性の有無を検出するとき、胎児核酸の量は、１本以上の標的染色体（例えば、１３、１８または２１番染色体）上および１本以上の参照染色体上の複数の遺伝子座において測定され得る。アレル比が用いられる場合、表２、表９および／または表１０の１つまたは複数のアレルが、同時に検出され、識別され得る。アレル比を測定する際、多重化実施形態は、多型遺伝子座における遺伝子型が不明であるときに特に重要である。いくつかの例において、例えば、母および子が、多型遺伝子座においてホモ接合性であるとき、そのアッセイは、情報的に有益でないかもしれない。１つの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、２００、３００または５００を超えるレベルおよび任意の中間のレベルに、本明細書における技術のポリヌクレオチド配列が、本技術の方法に従って富化され、分離され、そして／または調べられる。標的核酸およびコントロール核酸のコピー数を分析することによって染色体異常を検出するとき、染色体異常の有無を正確に検出するためには、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個未満のポリヌクレオチド配列が分析される必要があり得る。ある実施形態において、本明細書における技術の組成物またはプロセスは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００もしくはそれ以上の複製物または単一分子等価物に分けられたサンプルをアッセイするために使用され得る。単一分子分析を含む、複製物中の母体サンプル由来の胎児核酸を分析する方法は、米国特許公開番号ＵＳ２００７−０２０７４６６Ａ１として公開された米国出願番号１１／３６４，２９４（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。
さらなる実施形態において、本技術は、比較ステップが、アレル比または標的核酸の絶対コピー数が標準コントロール配列から１標準偏差高いまたは低い場合に、染色体障害を有するリスクが高い胎児を示す方法を提供する。いくつかの実施形態において、比較ステップは、アレル比または標的核酸の絶対コピー数が、標準コントロール配列から２標準偏差高いまたは低い場合に、染色体障害を有するリスクが高い胎児を示す。他のいくつかの実施形態において、比較ステップは、アレル比または標的核酸の絶対コピー数が、標準コントロール配列から３標準偏差高いまたは低い場合に、染色体障害を有するリスクが高い胎児を示す。いくつかの実施形態において、比較ステップは、アレル比または標的核酸の絶対コピー数が、コントロールから統計学的に有意な標準偏差よりも高いまたは低い場合に、染色体障害を有するリスクが高い胎児を示す。１つの実施形態において、標準コントロールは、母体の参照であり、ある実施形態において、標準コントロールは、胎児の参照染色体（例えば、トリソミーでない常染色体）である。
いくつかの実施形態において、本明細書における技術の方法は、染色体異常を診断する他の方法と併用され得る。例えば、ある非侵襲性の診断法は、女児胎児についての性別検査またはＲｈＤ陰性母体におけるＲｈＤ陰性の女児胎児を確認するためなど、胎児核酸の有無の確認を必要とし得る。ある実施形態において、胎児核酸のパーセンテージが既知であることが必要である別の診断法を可能にするために、本明細書における技術の組成物および方法を用いることにより、母体サンプル中の胎児核酸のパーセンテージが決定され得る。例えば、サンプルが特定の閾値濃度の必要条件を満たしているか？アレル比を決定することにより母体サンプルから胎児の異数性を診断するとき、胎児核酸の量または濃度が、所与の感度および特異性で診断するために必要とされ得る。他の実施形態において、染色体異常を検出するための本明細書における技術の組成物および方法は、他の公知の方法と併用されることにより、その検出方法の全体的な感度および特異性が改善され得る。例えば、数学的モデルは、侵襲性の検査では、ダウン症候群を有する胎児の検出が５％という比率であるのに対して、母体年齢（ＭＡ）、項部浮腫（ＮＴ）の厚さ、無血清ベータ−ｈＣＧおよび血清中ＰＡＰＰ−Ａを利用する妊娠第一期スクリーニングプログラムの併用では、８０％を超えることを示唆している（Ｗａｌｄ ａｎｄ Ｈａｃｋｓｈａｗ，Ｐｒｅｎａｔ Ｄｉａｇｎ １７（９）：９２１−９（１９９７））。しかしながら、本明細書に記載される非侵襲性の遊離胎児核酸に基づく方法と組み合わされる通常使用される異数性検出方法の併用は、より低い偽陽性率で精度を改善し得る。併用される診断法の例は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８１５７２６４Ａ２（本出願人に譲渡）に提供されている。いくつかの実施形態において、本明細書における技術の方法は、細胞ベースの方法と併用され得、ここで、胎児の細胞は、侵襲的または非侵襲的に獲得され得る。
特定の実施形態において、染色体異常に対する高リスクは、本明細書に提供される組成物または方法からもたらされたアウトカムまたは結果に基づく。アウトカムの例は、正倍数性の絶対コピー数またはアレル比からのずれであり、それは、染色体異数性の存在を示唆する。この標準コントロールからの絶対コピー数または比の増加または減少は、染色体異常（例えば、トリソミー２１）を有する胎児を有する高リスクを示唆する。本明細書に記載される方法に関係する情報（例えば、トリソミーまたは異数性のアウトカム、結果またはリスク）は、例えば、任意の適切な媒体に焼き付けられ（ｔｒａｎｓｆｉｘｅｄ）得、解釈表現され得、記録され得、および／または表示され得る。例えば、アウトカムは、そのアウトカムを保存するか、格納するか、共有するか、通信するか、または別途分析するために媒体に焼き付けられ得る。媒体は、有形（例えば、紙）または無形（例えば、電子媒体）であり得、媒体の例としては、コンピュータ媒体、データベース、カルテ、患者カルテ、記録、患者記録、グラフおよび表ならびに他の任意の表現媒体が挙げられるが、それらに限定されない。その情報は、コンピュータ読み取り可能な形態で保存および／または解釈表現されることもあり、データベース内に保存され、整理されることもある。特定の実施形態において、その情報は、物理的媒体（例えば、紙）またはコンピュータ可読媒体（例えば、光学的記憶装置および／もしくは磁気記憶装置または伝送媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、コンピュータプロセシングユニット、ファクシミリ信号、衛星信号、インターネットを利用した伝送もしくはワールドワイドウェブを利用した伝送）を用いて、１つの場所から別の場所に移され得る。
上で述べられた全ての態様内で本技術を実施する際、ＣｐＧアイランドは、いくつかの例においてＣｐＧ含有ゲノム配列として使用され得る一方、他の例では、ＣｐＧ含有ゲノム配列は、ＣｐＧアイランドでないかもしれない。
いくつかの実施形態において、本技術は、本技術の方法を行うためのキットを提供する。そのキットの１つの構成要素は、メチル化感受性結合剤である。
いくつかの態様において、サンプル中の胎児核酸の量を測定する方法も提供され、その方法は、（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を：（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および（ｉｉ）サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセットと増幅条件下で接触させ（ここで、その第１領域および第２領域は、異なっている）、それにより、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物が生成される、ステップ；（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児核酸の量を測定するステップを含む。
いくつかの態様において、サンプル中の胎児核酸の量を測定する方法も提供され、その方法は、（ａ）サンプル核酸を１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に消化されたサンプル核酸が生成される、ステップ；（ｂ）その消化されたサンプル核酸を：（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および（ｉｉ）サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセットと増幅条件下で接触させ（ここで、その第１領域および第２領域は、異なっている）、それにより、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物が生成される、ステップ；（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児核酸の量を測定するステップを含む。
いくつかの態様において、サンプル中の胎児核酸のコピー数を測定する方法も提供され、その方法は、（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させる（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を：（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および（ｉｉ）第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第１領域と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと増幅条件下で接触させ、それにより、胎児核酸増幅産物および競合因子増幅産物が生成される、ステップ；（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化および使用された競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づいて、サンプル中の胎児核酸のコピー数を測定するステップを含む。
いくつかの態様において、サンプル中の胎児の異数性の有無を検出する方法も提供され、その方法は、（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を、（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および（ｉｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を特異的に増幅する第２増幅プライマーセットと増幅条件下で接触させ、それにより、標的染色体増幅産物および参照染色体増幅産物が生成されるステップ；（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児の異数性の有無を検出するステップを含む。
いくつかの実施形態において、第１領域は、各々がメチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む１つまたは複数の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質は、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を含む。いくつかの実施形態において、第２領域は、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含まない１つまたは複数の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質は、亜硫酸水素塩を含む。いくつかの実施形態において、標的染色体は、各々がメチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む１つまたは複数の遺伝子座を含む。いくつかの実施形態において、参照染色体は、各々がメチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む１つまたは複数の遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、ライゲーションによって増幅産物に組み込まれる。いくつかの例において、そのライゲーションは、一方向のライゲーションである。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、アダプターオリゴヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを使用して増幅産物に組み込まれる。いくつかの実施形態において、アダプターオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のインデックス配列を含む。いくつかの例において、１つまたは複数のインデックス配列は、サンプル特異的インデックスを含む。いくつかの例において、１つまたは複数のインデックス配列は、アリコート特異的インデックスを含む。
いくつかの実施形態において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む。いくつかの例において、参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つは、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、合成方法によるシークエンシングである。いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、リバーシブルターミネーターに基づくシークエンシング方法である。
いくつかの実施形態において、測定される胎児核酸の量は、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物の各々の量に基づく、サンプル中の胎児核酸の画分である。いくつかの例において、胎児核酸の画分は、胎児核酸増幅産物量と全核酸増幅産物量との比である。
いくつかの実施形態において、ある方法は、サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含み、ここで、第１領域と第２領域とは、異なる。いくつかの例において、第２領域は、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含まない１つまたは複数の遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、胎児特異的核酸の有無の判定を可能にする、サンプル核酸中の第３の領域を増幅する第３増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。いくつかの例において、その胎児特異的核酸は、Ｙ染色体核酸である。いくつかの例において、第３の領域は、Ｙ染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、消化効率の指標としての、消化された核酸または消化されていない核酸の量の測定を可能にする、サンプル核酸中の第４の領域を増幅する第４増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。いくつかの例において、第４の領域は、胎児核酸と母体核酸の両方に存在し、かつ胎児核酸と母体核酸の両方においてメチル化されていない、１つまたは複数の遺伝子座を含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第１領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ある方法は、第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて標的染色体と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第２領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、ある方法は、第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて参照染色体と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、第３増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第３の領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第３競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、ある方法は、第４増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第４の領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第４競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む。
いくつかの実施形態において、測定される胎児核酸の量は、使用される競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づく胎児核酸のコピー数である。いくつかの実施形態において、測定される胎児核酸の量は、配列リードの定量化に基づく胎児核酸のコピー数である。
いくつかの実施形態において、サンプル核酸は、細胞外核酸である。いくつかの例において、核酸サンプルは、妊娠女性被験体から得られる。いくつかの例において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、サンプル核酸は、血漿または血清由来である。
いくつかの実施形態において、第１領域内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる。いくつかの実施形態において、標的染色体内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる。いくつかの実施形態において、参照染色体内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる。いくつかの実施形態において、標的染色体は、１３番染色体である。いくつかの実施形態において、標的染色体は、１８番染色体である。いくつかの実施形態において、標的染色体は、２１番染色体である。
いくつかの実施形態において、胎児核酸の量は、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と実質的に等しい。いくつかの実施形態において、胎児核酸の量は、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と比較されるとき、０．９７以上のＲ２値で測定される。いくつかの実施形態において、胎児核酸のコピー数は、質量分析法を用いて測定される胎児核酸のコピー数と実質的に等しい。いくつかの実施形態において、胎児核酸のコピー数は、質量分析法を用いて測定される胎児核酸のコピー数と比較されるとき、０．９７以上のＲ２値で測定される。
いくつかの態様において、サンプル中の胎児画分（ｆｅｔａｌ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を測定する方法も提供され、その方法は、（ａ）サンプル核酸を複数の多型核酸標的について富化するステップ（そのサンプル核酸は、胎児核酸および母体核酸を含む）；（ｂ）シークエンシングプロセスによって核酸標的の一部または全部に対するヌクレオチド配列を得るステップ；（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列を分析するステップ；および（ｄ）（ｃ）の分析に基づいて胎児画分を測定するステップを含み、ここで、その多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。
いくつかの実施形態において、上記富化ステップは、複数の多型核酸標的を増幅するステップを含む。いくつかの例において、上記富化ステップは、増幅反応において増幅産物を生成するステップを含み、その増幅反応は、単一容器において行われることもある。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的の各々における母親の遺伝子型および父親の遺伝子型は、（ａ）の前は不明である。いくつかの実施形態において、約４０％以上のマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が、選択される。
いくつかの実施形態において、ある方法は、多型核酸標的の各々についてサンプル中のアレル頻度を測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップは、各アレル頻度を１つまたは複数の固定されたカットオフ頻度と比較することによって、情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む。いくつかの例において、情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約２％以上のアレル頻度のシフトであり、１％以上のアレル頻度のシフトであることもある。いくつかの例において、情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約５０％以上のアレル頻度のシフトであり、２５％以上のアレル頻度のシフトであることもある。いくつかの実施形態において、どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップは、各アレル頻度を１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度と比較することによって情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む。いくつかの例において、１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度が、各多型核酸標的について決定される。いくつかの例において、各標的特異的なカットオフ頻度は、対応する多型核酸標的に対するアレル頻度の変動に基づいて決定される。
いくつかの実施形態において、ある方法は、アレル頻度平均値を測定するステップを含む。いくつかの例において、胎児画分は、アレル頻度平均値に部分的に基づいて測定される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型は、ヘテロ接合である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型は、ホモ接合である。いくつかの実施形態において、胎児画分は、０．２０以下の変動係数（ＣＶ）で測定される。いくつかの例において、胎児画分は、０．１０以下の変動係数（ＣＶ）で測定され、胎児画分は、０．０５以下の変動係数（ＣＶ）で測定されることもある。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的の各々は、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む。いくつかの例において、そのＳＮＰは：ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２、ｒｓ９８５４６２、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される。
いくつかの例において、ＳＮＰは：ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２およびｒｓ９８５４６２から選択される。
いくつかの例において、ＳＮＰは：ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される。
いくつかの例において、ＳＮＰは：ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１０８３９５９８、ｒｓ１０８７５２９５、ｒｓ１２１０２７６０、ｒｓ１２３３５０００、ｒｓ１２３４６７２５、ｒｓ１２５７９０４２、ｒｓ１２５８２５１８、ｒｓ１７１６７５８２、ｒｓ１８５７６７１、ｒｓ２０２７９６３、ｒｓ２０３７９２１、ｒｓ２０７４２９２、ｒｓ２６６２８００、ｒｓ２６８２９２０、ｒｓ２６９５５７２、ｒｓ２７１３５９４、ｒｓ２８３８３６１、ｒｓ３１５１１３、ｒｓ３７３５１１４、ｒｓ３７８４６０７、ｒｓ３８１７、ｒｓ３８５０８９０、ｒｓ３９３４５９１、ｒｓ４０２７３８４、ｒｓ４０５６６７、ｒｓ４２６３６６７、ｒｓ４３２８０３６、ｒｓ４３９９５６５、ｒｓ４７３９２７２、ｒｓ４７５０４９４、ｒｓ４７９０５１９、ｒｓ４８０５４０６、ｒｓ４８１５５３３、ｒｓ４８３０８１、ｒｓ４９４０７９１、ｒｓ４９４８１９６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５８２１１１、ｒｓ５９６８６８、ｒｓ６０１００６３、ｒｓ６０１４６０１、ｒｓ６０５０７９８、ｒｓ６１３１０３０、ｒｓ６３１６９１、ｒｓ６４３９５６３、ｒｓ６５５４１９９、ｒｓ６５８５６７７、ｒｓ６６８２７１７、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７２０１３５、ｒｓ６７２７０５５、ｒｓ６７４４２１９、ｒｓ６７６８２８１、ｒｓ６８１８３６、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４０１４１、ｒｓ６９７４８３４、ｒｓ７１８４６４、ｒｓ７２２２８２９、ｒｓ７３１０９３１、ｒｓ７３２４７８、ｒｓ７４２２５７３、ｒｓ７６３９１４５、ｒｓ７７３８０７３、ｒｓ７８４４９００、ｒｓ７９９７６５６、ｒｓ８０６９６９９、ｒｓ８０７８２２３、ｒｓ８０８０１６７、ｒｓ８１０３７７８、ｒｓ８１２８、ｒｓ８１９１２８８、ｒｓ８８６９８４、ｒｓ８９６５１１、ｒｓ９３１８８５、ｒｓ９４２６８４０、ｒｓ９９２０７１４、ｒｓ９９７６１２３、ｒｓ９９９５５７およびｒｓ９９９７６７４から選択される。
多型標的は、上に列挙された任意の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含み得る。ＳＮＰパネルのＳＮＰのサブセットは、他の１つまたは複数のＳＮＰパネルからのＳＮＰの全部もしくはサブセットと組み合され得る。例えば、ある組み合わせは、ＳＮＰパネル１、２および３の各々からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；ＳＮＰパネル１および２からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；ＳＮＰパネル１および３からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；またはＳＮＰパネル２および３からのＳＮＰの全部もしくはサブセットを含み得る。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。１０個以上の多型核酸標的が、富化されることもあり、５０個以上の多型核酸標的が、富化されることもあり、１００個以上の多型核酸標的が、富化されることもあり、５００個以上の多型核酸標的が、富化されることもある。約４０〜約１００個の多型核酸標的が、富化されることもある。
いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、合成方法によるシークエンシングを含む。いくつかの例において、合成方法によるシークエンシングは、複数の合成サイクルを含む。合成方法によるシークエンシングは、約３６サイクルを含むこともあり、合成方法によるシークエンシングは、約２７サイクルを含むこともある。いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、ライゲーション方法によるシークエンシングを含む。いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、単一分子シークエンシング方法を含む。
いくつかの実施形態において、シークエンシングプロセスは、単一のコンパートメントにおいて複数のサンプルをシークエンシングするステップを含む。いくつかの例において、胎児画分は、１０個以上のサンプルについて測定される。いくつかの例において、胎児画分は、１００個以上のサンプルについて測定される。いくつかの例において、胎児画分は、１０００個以上のサンプルについて測定される。
いくつかの実施形態において、サンプル核酸は、無細胞ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、サンプル核酸は、妊娠女性被験体から得られる。いくつかの例において、被験体は、ヒトである。いくつかの例において、サンプル核酸は、血漿または血清由来である。
特定の実施形態が、以下の説明、実施例、請求項および図面においてさらに説明される。
図面は、本明細書における技術の実施形態を例証するものであって、限定するものではない。図示を明確にするためおよび容易にするために、図面は、一定の縮尺で作成されておらず、いくつかの例において、様々な態様が、特定の実施形態の理解を促すために、誇張されてまたは拡大されて示され得る。
図１は、差次的にメチル化されたＤＮＡを分離するために使用される組換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質の設計を示している。
図２は、メチル−ＣｐＧに結合する抗体様タンパク質が、その「抗原」に対して高親和性かつ高アビディティを有することを示しており、その抗原は、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドにおいてメチル化されたＤＮＡである。
図３は、ＭＢＤ−ＦＣのメチル結合ドメインが、メチル化状態に関係なく、全てのＤＮＡ分子に結合することを示している。このタンパク質／ＤＮＡ相互作用の強度は、ＤＮＡのメチル化レベルによって定義される。ゲノムＤＮＡに結合した後、溶出液を、塩濃度を高めて使用することにより、メチル化されていないＤＮＡとメチル化されたＤＮＡとを分画することができ、制御された分離が可能になる。
図４は、組換えＭＢＤ−Ｆｃタンパク質およびマイクロアレイを使用して、胎児由来および母親由来の差次的にメチル化されたＤＮＡを識別するために用いられる実験を示している。
図５は、図４に図示された実験からもたらされた結果を検証するために使用されたＳｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）法によってもたらされた典型的な結果を示している。
図６は、マイクロアレイ分析から得られたｌｏｇ比（ｘ軸）とＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）分析によって得られたメチル化の差異（ｙ軸）との相関関係を示している。各データポイントは、測定された全てのサンプルにわたる、１つの領域に対する平均である。母体ＤＮＡの高度にメチル化された画分が、胎盤ＤＮＡの高度にメチル化された画分とハイブリダイズするので、マイクロアレイ分析は、相対的な性質である。正の値は、胎盤サンプルのより高いメチル化を示す。質量分析では、各サンプルが個々に測定される。母体のメチル化値を胎盤のメチル化値から減算することによって、メチル化の差異を計算した。その結果をマイクロアレイデータと比較するために、全ての母体／胎盤ＤＮＡ対に対する差異の平均を計算した。
図７は、マイクロアレイの結果とＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）の結果との相関関係を示している。
図８は、予想されたｇＤＮＡ分子数と、質量分析と組み合わせて競合的ＰＣＲによって測定された分子数との相関関係を示している。この実験では、全血から得られたＤＮＡ（黒色のプラス記号）を使用し、市販の完全にメチル化されたＤＮＡ（赤色の十字記号）を９０対１０の比で使用した。メチル化されていないＤＮＡ画分およびメチル化されたＤＮＡ画分を分離するために、ＭＢＤ−ＦＣ融合タンパク質を使用した。各画分を、質量分析の読み出しとともに競合的ＰＣＲ分析に供した。その方法は、コピー数のばらつきの分析について以前に報告されており、遺伝子発現分析のために市販されている。そのアプローチは、既知濃度の合成オリゴヌクレオチドの助けにより、ＤＮＡ分子の絶対的定量化を可能にする。この実験では、ここで使用された全血サンプル中ではメチル化されていなかったＭＧＭＴ遺伝子座を標的化した。３００コピーという総ｇＤＮＡの投入量を使用したとき、２７０コピーのメチル化されていないＤＮＡおよび３０コピーのメチル化されたＤＮＡが予想された。測定されたコピー数は、大部分は、それらの期待値と一致する。６００コピーの投入ＤＮＡにおけるデータポイントは、その反応における偏りを示唆し、このアッセイが使用され得る前に、この最初の概念証明実験が、より発展的研究を用いて追跡される必要があることを示している。しかしながら、この最初のデータは、過剰量のメチル化されていないＤＮＡ種の存在下において、数コピーのメチル化されたＤＮＡを捕捉するためおよび定量化するためのアプローチの実施可能性を示唆している。
図９Ａ〜９Ｌは、マイクロアレイ分析（濃いバー）および質量分析（薄灰色のバー）から得られたメチル化の差異の棒グラフのプロットを、ゲノム位置に関して示している。マイクロアレイによって差次的にメチル化されたと同定された８５個の各領域に対して、個々のプロットが提供されている。各プロットに対するｘ軸は、その領域の染色体の位置を示している。ｙ軸は、ｌｏｇの割り当て（マイクロアレイの場合）およびメチル化の差異（質量分析の結果の場合）を示している。マイクロアレイの場合、その範囲における各ハイブリダイゼーションプローブは、単一の黒色（または濃い灰色）のバーとして示されている。質量分析の結果の場合、各ＣｐＧ部位は、薄灰色のバーとして示されている。０より大きい値を示しているバーは、母体ＤＮＡと比べて、胎盤サンプル中のより高いＤＮＡメチル化を示唆している。いくつかの遺伝子の場合、その差異は小さい（すなわち、ＲＢ１またはＤＳＣＲ６）が、なおも統計学的に有意である。それらの領域は、胎児ＤＮＡの富化ストラテジーにとってそれほど適切でない可能性がある。
図１０は、胎児数量法（Ｆｅｔａｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ Ｍｅｔｈｏｄ）の１つの実施形態を示している。母体核酸を選択的に消化し、残りの胎児核酸を、既知濃度の競合因子を使用して定量化する。この模式図では、被分析物を分離し、質量分析計によって定量化する。
図１１は、メチル化に基づく胎児診断法の１つの実施形態を示している。母体核酸を選択的に消化し、残りの胎児核酸を３つの異なる染色体（１３、１８および２１番）について定量化する。この図のパート２および３は、消化の前および後のサンプル中の核酸のサイズ分布を図示している。この増幅反応は、サイズ特異的（例えば、１００塩基対超のアンプリコン）であり得、その反応は、消化された母体核酸よりもより長い消化されていない胎児核酸を好み、それにより、胎児核酸がさらに富化される。この図の最後のスペクトルは、トリソミー２１を示唆する、増加した量の２１番染色体の胎児核酸を示している。
図１２は、非妊婦の血液から単離された４つの異なるＤＮＡサンプルからの増幅可能なゲノムの総コピー数を示している。１反応あたりおよそ２５００、１２５０、６２５または３１３コピーを含むように各サンプルを希釈した。２つの総コピー数アッセイから得られたＤＮＡ／競合因子比の平均値を取ることによって、各測定値を得た（表ＸにおけるＡＬＢおよびＲＮＡｓｅＰ）。図１２が示すように、総コピー数は、異なるサンプルにわたって正確かつ安定であるので、競合因子に基づくアプローチの有用性が検証される。
図１３Ａおよび１３Ｂは、様々な量の男児のメチル化された胎盤ＤＮＡが混合され、一定数のメチル化されていない母体ＤＮＡを含むように作製されたモデルシステムを示している。そのサンプルは、メチル化されていない母体ＤＮＡに対しておよそ０〜２５％の範囲の男児胎盤量と混合されていた。総コピー数アッセイと比較して、メチル化アッセイ（図１３Ａ）およびＹ染色体マーカー（図１３Ｂ）から得られた比を用いて、胎盤ＤＮＡの画分を計算した。メチル化マーカーおよびＹ染色体マーカーは、表Ｘに提供されている。 図１３Ａおよび１３Ｂは、様々な量の男児のメチル化された胎盤ＤＮＡが混合され、一定数のメチル化されていない母体ＤＮＡを含むように作製されたモデルシステムを示している。そのサンプルは、メチル化されていない母体ＤＮＡに対しておよそ０〜２５％の範囲の男児胎盤量と混合されていた。総コピー数アッセイと比較して、メチル化アッセイ（図１３Ａ）およびＹ染色体マーカー（図１３Ｂ）から得られた比を用いて、胎盤ＤＮＡの画分を計算した。メチル化マーカーおよびＹ染色体マーカーは、表Ｘに提供されている。
図１４Ａおよび１４Ｂは、血漿サンプルの総コピー数アッセイの結果を示している。図１４Ａでは、各サンプルに対するコピー数が示されている。２つのサンプル（２５および２６番）が、他の全てのサンプルよりも有意に多い総コピー数を有する。およそ１３００の増幅可能なコピー／ｍｌ血漿という平均値が得られた（７６６〜２０５５の範囲）。図１４Ｂは、結果を要約している、所与の値の箱ひげ図を示している。
図１５Ａおよび１５Ｂは、プロットされた男児胎児を有する妊婦から採取された３３個の異なる血漿サンプル由来の胎児核酸の量（またはコピー数）を示している。得られたコピー数は、表Ｘに提供されたアッセイを用いて、メチル化マーカーおよびＹ染色体特異的マーカーを使用して計算された。図１５Ｂに見られるように、所与の値の箱ひげ図は、２つの異なる測定の間の最小の差を示しており、ゆえに、この方法の精度および安定性が検証された。
図１６は、図１５Ａからのメチル化マーカーを使用して得られた結果とＹ染色体マーカーを使用して得られた結果との対の相関関係を示している。
図１７は、コントロール対競合因子に対する消化の比を使用し、この値を総コピー数アッセイの平均値と比較したときの、制限酵素の消化効率を示している。サンプル２６は別として、全ての反応が、約９９％より高い効率を示している。
図１８は、男児妊娠に対してはＹ染色体特異的マーカーを使用し、全ての妊娠（胎児の性別に関係なく）に対してはメチル化された画分の平均値を使用して、サンプル中の胎児ＤＮＡの画分（または濃度）を計算するための具体的な方法を提供している。
図１９は、Ｙ染色体特異的マーカーを使用せずに、サンプル中の胎児ＤＮＡの画分（または濃度）を計算するための特定の方法を提供している。代わりに、メチル化定量化のためのアッセイだけを使用して、胎児ＤＮＡの濃度を測定した。
図２０は、本明細書における技術の方法を使用して、シミュレートされたトリソミー２１の診断に対する検出力計算ｔ検定を示している。この図は、ｘ軸の変動係数（ＣＶ）と、単純なｔ検定を使用してアッセイ集団を識別する検出力（ｙ軸）との間の関係を示している。このデータから、全ての場合の９９％において、０．００１の有意水準で５％以下のＣＶを提供する２つの集団（正倍数性 対 異数性）が識別され得ることが示唆される。
図２１は、ＰＣＲアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターとライゲートするためのスキームを示している。
図２２は、改変されたライゲーションスキームを示している。
図２３は、ＭＰＳＳを使用する胎児数量アッセイによって測定された個々のマーカーのコピー数（ＦＱＡシークエンシング；ｘ軸）と、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹを使用する胎児数量アッセイによって得られたもの（ＦＱＡ ＭＡ；ｙ軸）との比較を示している。両方の方法の結果が、高度に相関した（Ｒ２＞０．９７）。いくつかの例において、プラットフォーム特異的アレルの偏りが、わずかなコピー数の差および１から逸脱した直線の当てはめの傾きをもたらした。
図２４は、ＭＰＳＳを使用する胎児数量アッセイによって測定されたマーカー群の各々に対する平均コピー数（ＦＱＡシークエンシング；ｘ軸）と、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹを使用する胎児数量アッセイによって得られたもの（ＦＱＡ ＭＡ；ｙ軸）との比較を示している。
図２５は、ＭＰＳＳを使用する胎児数量アッセイによって測定されたメチル化マーカー（左）またはＹ染色体マーカーから得られた胎児画分（ＦＱＡシークエンシング；ｘ軸）と、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹを使用する胎児数量アッセイによって得られたもの（ＦＱＡ ＭＡ；ｙ軸）との比較を示している。
図２６は、情報的に有益な胎児／母親の遺伝子型の組み合わせに対する尤度の図表の例を示している。
図２７は、母親および父親のアレルの、可能性がある分布を例証している。
図２８は、ＭＰＳＳによって胎児画分を計算する方法を図示している。
図２９は、多重化されたアンプリコンライブラリの作製およびシークエンシングに対するスキームを図示している。
図３０は、具体的なサンプルに対する１ＳＮＰあたりのアレル頻度を示している。
図３１は、具体的なサンプルに対する１ＳＮＰあたりのアレル頻度を示している。
図３２は、４６個のサンプルのコレクションに対する１サンプルあたりのアレル頻度を示している。
図３３は、４６個のサンプルのコレクションに対する１サンプルあたりのアレル頻度（０．５で折り畳まれた）を示している。
図３４は、各サンプルに対する情報的に有益な遺伝子型から計算された胎児画分の値を示している。
図３５は、メチル化に基づく胎児画分の推定値に対する、ＳＮＰに基づく胎児画分の推定値の相関関係のプロットを示している。
図３６は、様々なシークエンシングカバー率での情報的に有益な遺伝子型の測定値の比較を示している。
図３７は、アッセイされる総ＳＮＰ数を増加させたときの、選択された各閾値に対する情報的に有益なＳＮＰ数（１〜６個の情報的に有益なＳＮＰ）の確率を示している。
定義
用語「妊娠関連障害」は、本願において使用されるとき、妊婦、胎児または妊婦と胎児の両方に影響し得る任意の症状または疾患のことを指す。そのような症状または疾患は、限られた期間中、例えば、妊娠中もしくは分娩中にその症候を顕わし得るか、または出生後の胎児の全生涯期間にわたって継続し得る。妊娠関連障害のいくつかの例としては、子宮外妊娠、子癇前症、早産、ＲｈＤ不適合、トリソミー２１などの胎児の染色体異常、および遺伝学的に遺伝する胎児の障害（例えば、嚢胞性線維症、ベータ−サラセミアまたは他の単一遺伝子障害）が挙げられる。本明細書に記載される組成物およびプロセスは、子癇前症（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１８４−１８８，１９９９およびＺｈｏｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８４：４１４−４１９，２００１）、胎児トリソミー（Ｌｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：１７４７−１７５１，１９９９およびＺｈｏｎｇら、Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．２０：７９５−７９８，２０００）および妊娠悪阻（Ｓｅｋｉｚａｗａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：２１６４−２１６５，２００１）を含むがそれらに限定されない、母体の血漿／血清中の胎児ＤＮＡの量的異常に関連する妊娠関連障害の診断、予後診断およびモニタリングに特に有用である。例えば、母体の血液中の高レベルの胎児核酸（正常妊娠と比較して）は、子癇前症妊娠を示唆し得る。さらに、母体サンプルから胎児核酸（ｆｅｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ）を富化できることは、母体血漿に基づく非トリソミー出生前診断にとって難題として以前は認識されていた存在である、母親と父親とが同一の疾患原因変異を共有する場合などの常染色体劣性遺伝病の非侵襲性出生前診断にとって特に有用であり得る。
用語「染色体異常」または「異数性」は、本明細書において使用される場合、対象染色体の構造と正常な相同染色体の構造との間のずれのことを指す。用語「正常」とは、具体的な種の健常個体に見られる優勢の核型またはバンディングパターン、例えば、正倍数性のゲノム（ヒトでは、４６ＸＸまたは４６ＸＹ）のことを指す。染色体異常は、数的または構造的であり得、それらとしては、異数性、倍数性、逆位、トリソミー、モノソミー、重複、欠失、染色体の一部の欠失、付加、染色体の一部の付加、挿入、染色体のフラグメント、染色体の領域、染色体再編成および転座が挙げられるが、それらに限定されない。染色体異常は、１本以上の染色体の一部が、例えば、染色体転座に起因して通常の半数体の数の正確な倍数でない染色体異常の状況のことも指し得る。染色体転座（例えば、１４番染色体の一部が余分な２１番染色体によって置き換えられる、２１番染色体と１４番染色体との間の転座）は、部分的トリソミー２１を引き起こし得る。染色体異常は、病的症状の存在または病的症状を発症する素因と相関し得る。染色体異常は、核酸の定量的分析によって検出され得る。
用語「核酸」および「核酸分子」は、本開示全体にわたって交換可能に使用され得る。これらの用語は、ＤＮＡ（例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性（ｓｈｏｒｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤によって高度に発現されるＲＮＡなど）および／またはＤＮＡアナログもしくはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非天然の骨格を含むものなど）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドならびにポリアミド核酸（ＰＮＡ）などに由来する任意の組成の核酸のことを指し、これらの全ては、一本鎖または二本鎖の形態であり得、別段限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で機能し得る天然のヌクレオチドの公知のアナログを含み得る。例えば、配列番号１〜２６１に提供される核酸（表４Ａ〜４Ｃを参照のこと）は、本明細書におけるプロセスを行うために有用な任意の形態（例えば、線状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であり得るか、または本技術の一部としてその有用性を変化させない変異（例えば、挿入、欠失または置換）を含み得る。核酸は、特定の実施形態において、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、あるいはインビトロまたは宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質において複製することができるかまたは複製されることができる他の核酸であり得るか、またはそれらに由来し得る。鋳型核酸は、いくつかの実施形態において、単一染色体に由来し得る（例えば、核酸サンプルは、二倍体生物から得られたサンプルの１本の染色体に由来し得る）。明確に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を含む。別段示されない限り、具体的な核酸配列は、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）および相補的配列ならびに明示的に示された配列も暗黙的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡおよびある遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。この用語は、ヌクレオチドアナログから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの等価物、誘導体、バリアントおよびアナログとして、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」読み枠または「リバース」読み枠）および二本鎖ポリヌクレオチドも含み得る。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡの場合、塩基シトシンは、ウラシルで置き換えられる。鋳型核酸は、被験体から得られた核酸を鋳型として用いて調製され得る。
「１つまたは複数のＣｐＧ部位を含む核酸」または「ＣｐＧ含有ゲノム配列」は、本明細書において使用される場合、ヒト胎児または妊婦などの個体のゲノム内の規定の位置におけるＤＮＡ配列の断片のことを指す。典型的には、「ＣｐＧ含有ゲノム配列」は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、少なくとも１つのシトシンを含む。好ましくは、ＣｐＧ含有ゲノム配列は、少なくとも３０、５０、８０、１００、１５０、２００、２５０または３００ヌクレオチド長であり得、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５または３０個のシトシンを含む。所与の位置における、例えば、所与の遺伝子座を中心にした領域内におけるいずれか１つの「ＣｐＧ含有ゲノム配列」（表１Ａ〜１Ｃを参照のこと）について、ヌクレオチド配列変異は、個体ごとに、および同じ個体であってもアレルごとに存在し得る。典型的には、規定の遺伝子座を中心にしたそのような領域（例えば、ＣｐＧアイランド）は、その遺伝子座ならびに上流および／または下流の配列を含む。上流または下流の配列の各々（それぞれ、遺伝子座の５’または３’境界線から数えて）は、１０ｋｂもの長さであり得、他の場合では、５ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、５００ｂｐ、２００ｂｐまたは１００ｂｐの長さであり得る。さらに、「ＣｐＧ含有ゲノム配列」は、タンパク質生成のために転写されるかまたは転写されないヌクレオチド配列を含み得、そのヌクレオチド配列は、遺伝子間配列、遺伝子内配列、タンパク質コード配列、非タンパク質コード配列（例えば、転写プロモーター）またはそれらの組み合わせであり得る。
本明細書において使用される場合、「メチル化されたヌクレオチド」または「メチル化されたヌクレオチド塩基」とは、ヌクレオチド塩基上におけるメチル部分の存在のことを指し、ここで、そのメチル部分は、認められている典型的なヌクレオチド塩基には存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含まないが、５−メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含む。ゆえに、シトシンは、メチル化されたヌクレオチドではなく、５−メチルシトシンが、メチル化されたヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含むが、しかしながら、本明細書における目的について、チミンは、ＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるので、ＤＮＡに存在しても、メチル化されたヌクレオチドであると見なされない。ＤＮＡに対する典型的なヌクレオシド塩基は、チミン、アデニン、シトシンおよびグアニンである。ＲＮＡに対する典型的な塩基は、ウラシル、アデニン、シトシンおよびグアニンである。それに対応して、「メチル化部位」は、メチル化が起きているかまたは起きる可能性のある標的遺伝子核酸領域における位置である。例えば、ＣｐＧを含む位置は、メチル化部位であり、ここで、そのシトシンは、メチル化されていてもよいし、されていなくてもよい。
本明細書において使用される場合、「ＣｐＧ部位」または「メチル化部位」は、インビボにおいて天然に生じる事象またはインビトロにおいてヌクレオチドを化学的にメチル化するように行われる事象によるメチル化を受けやすい核酸内のヌクレオチドである。
本明細書において使用される場合、「メチル化された核酸分子」とは、メチル化されている１つまたは複数のメチル化されたヌクレオチドを含む核酸分子のことを指す。
「ＣｐＧアイランド」は、本明細書において使用される場合、機能的または構造的に逸脱したＣｐＧ密度を含むＤＮＡ配列の断片のことを記載する。例えば、Ｙａｍａｄａら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：２４７−２６６，２００４）は、ＣｐＧアイランドを判定するための基準のセットを報告した：ＣｐＧアイランドは、少なくとも４００ヌクレオチド長でなければならず、５０％超のＧＣ含有率および０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する。その他の者（Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：３７４０−３７４５，２００２）は、少なくとも２００ヌクレオチド長、５０％超のＧＣ含有率、および０．６を超えるＯＣＦ／ＥＣＦ比を有する配列として、より厳密ではなくＣｐＧアイランドを定義した。
用語「エピジェネティック状況」または「エピジェネティック状態」は、本明細書において使用される場合、１次ヌクレオチド配列以外の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の分子レベルにおける任意の構造的特徴のことを指す。例えば、ゲノムＤＮＡのエピジェネティック状況は、例えば、そのメチル化パターンまたは細胞のタンパク質との会合によって決定されるかまたは影響されるその二次構造または三次構造を含み得る。
用語「メチル化プロファイル」「メチル化の状況」または「メチル化の状態」は、ゲノム配列のメチル化の状況を記載するために本明細書において使用される場合、具体的なゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ断片の、メチル化に関する特性のことを指す。そのような特性としては、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のいずれかがメチル化されているか否か、メチル化されたＣ残基の位置、任意の具体的な長さの残基におけるメチル化されたＣのパーセンテージ、および例えば、アレルの起源の差に起因する、アレルのメチル化の差が挙げられるが、それらに限定されない。用語「メチル化プロファイル」または「メチル化の状態」は、生物学的サンプル中の任意の具体的な長さの残基におけるメチル化されたＣまたはメチル化されていないＣの相対的濃度または絶対的濃度のことも指す。例えば、あるＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、メチル化されている場合、その残基は、「高メチル化されている」と言及され得る；一方、あるＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、メチル化されていない場合、その残基は、「低メチル化されている」と言及され得る。同様に、あるＤＮＡ配列（例えば、胎児核酸）内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域由来または異なる個体由来の別の配列と比べて（例えば、母体核酸と比べて）メチル化されている場合、その配列は、その他の配列と比べて高メチル化されていると見なされる。あるいは、あるＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、異なる領域由来または異なる個体（例えば、母体）由来の別の配列と比べてメチル化されていない場合、その配列は、その他の配列と比べて低メチル化されていると見なされる。これらの配列は、「差次的にメチル化されている」と言われ、より詳細には、メチル化の状態が、母体と胎児との間で異なるとき、それらの配列は、「差次的にメチル化された母体核酸および胎児核酸」と見なされる。
用語「メチル化されたヌクレオチドに結合する作用物質」は、本明細書において使用される場合、メチル化された核酸に結合することができる物質のことを指す。その作用物質は、天然に存在するものであっても合成のものであってもよく、改変されていてもよいし、改変されていなくてもよい。１つの実施形態において、その作用物質は、異なる核酸種の分離をそれぞれのメチル化の状況に従って可能にする。メチル化されたヌクレオチドに結合する作用物質の例は、ＷＯ０６０５６４８０Ａ２として公開され、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１２７０７に記載されている。その記載された作用物質は、メチルＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）のファミリーに属するタンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび抗体のＦｃ部分を含む二機能性ポリペプチドである（図１を参照のこと）。その組換えメチルＣｐＧ結合抗体様タンパク質は、好ましくは、ＣｐＧメチル化されたＤＮＡに抗体様の様式で結合し得る。それは、そのメチルＣｐＧ結合抗体様タンパク質が、その「抗原」（好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドにおいてメチル化されているＤＮＡである）に対して高親和性かつ高アビディティを有することを意味する。その作用物質は、多価ＭＢＤでもあり得る（図２を参照のこと）。
用語「多型」または「多型核酸標的」は、本明細書において使用される場合、同じゲノム配列の様々なアレル内の配列変異のことを指す。多型を含む配列は、「多型配列」と見なされる。１つまたは複数の多型の検出は、単一ゲノム配列の異なるアレルの判別または２つ以上の個体の判別を可能にする。本明細書において使用される場合、用語「多型マーカー」または「多型配列」とは、個体間のＤＮＡ配列における遺伝的変異を示すゲノムＤＮＡの断片のことを指す。そのようなマーカーとしては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、ジ−、トリ−またはテトラ−ヌクレオチドリピートなどの短いタンデム反復（ＳＴＲ）、欠失、重複などが挙げられるが、それらに限定されない。本技術に係る多型マーカーは、富化された胎児核酸サンプル中の母系アレルと父系アレルとを特異的に判別するために使用することができる。
用語「単一ヌクレオチド多型」または「ＳＮＰ」は、本明細書において使用される場合、同じゲノム配列の様々なアレル内の単一ヌクレオチド残基に存在するポリヌクレオチド配列変異のことを指す。この変異は、あるゲノム配列がタンパク質生成時に転写される場合、そのゲノム配列のコード領域または非コード領域（すなわち、プロモーターまたはイントロン領域）内に存在し得る。１つまたは複数のＳＮＰの検出により、単一ゲノム配列の様々なアレルの判別または２つ以上の個体の判別が可能になる。
用語「アレル」は、本明細書において使用される場合、染色体上の同じ位置を占めるＤＮＡの遺伝子または非コード領域のいくつかの代替の形態のうちの１つである。アレルという用語は、任意の生物（細菌、ウイルス、真菌、原生動物、カビ、酵母、植物、ヒト、非ヒト、動物および古細菌（ａｒｃｈｅａｂａｃｔｅｒｉａ）を含むがそれらに限定されない）由来のＤＮＡを記載するために使用され得る。
用語「アレルの比」または「アレル比」は、本明細書において使用される場合、サンプル中の一方のアレルの集団と他方のアレルの集団との比のことを指す。いくつかのトリソミーの例では、胎児が具体的な遺伝子座について３アレルであり得る可能性がある。そのような例において、用語「アレルの比」とは、他方のアレルのうちの１つに対するいずれか１つのアレルまたは他方の２つのアレルに対するいずれか１つのアレルの集団の比のことを指す。
用語「多型に基づかない定量化方法」は、本明細書において使用される場合、多型マーカーまたは多型配列の使用を必要としない、被分析物（例えば、全核酸、Ｙ染色体核酸または胎児核酸）の量を測定する方法のことを指す。多型が、配列内に存在し得るにもかかわらず、前記多型は、その配列を定量化するために必要ではない。多型に基づかない定量化方法の例としては、ＲＴ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、アレイに基づく方法、シークエンシング法、ナノポアに基づく方法、核酸に結合したビーズに基づくカウント方法および競合因子に基づく方法（ここで、１つまたは複数の競合因子が、既知濃度で導入されることにより、１つまたは複数の被分析物の量が測定される）が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記の例示的な方法のうちのいくつか（例えば、シークエンシング）は、１つまたは複数の多型を調べないように積極的に改変されるかまたは設計される必要があり得る。
本明細書において使用される場合、「競合因子オリゴヌクレオチド」または「競合オリゴヌクレオチド」または「競合因子」は、増幅プライマーのハイブリダイゼーションについて標的ヌクレオチド配列と競合する核酸ポリマーである。多くの場合、競合因子は、対応する標的ヌクレオチド配列と類似のヌクレオチド配列を有する。いくつかの例において、競合因子配列と対応する標的ヌクレオチド配列とは、１つまたは複数のヌクレオチドが異なる。いくつかの例において、競合因子配列と対応する標的ヌクレオチド配列とは、同じ長さである。いくつかの例において、競合因子は、標的ヌクレオチド配列とは異なるさらなる長さのヌクレオチド配列を場合により有する。いくつかの実施形態において、既知の量またはコピー数の競合因子が使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上の競合因子が使用される。いくつかの例において、２つ以上の競合因子は、類似の特性（例えば、配列、長さ、検出可能な標識）を有する。いくつかの例において、２つ以上の競合因子は、異なる特性（例えば、配列、長さ、検出可能な標識）を有する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の競合因子が、具体的な領域に対して使用される。いくつかの例において、競合因子は、所与の領域に対する各セットの競合因子に独自の特性を有する。多くの場合、異なる領域に対する競合因子は、異なる特性を有する。
競合因子オリゴヌクレオチドは、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、標識されたヌクレオチド）またはそれらの混合物から構成され得る。本明細書に記載される実施形態での使用に適した競合因子オリゴヌクレオチドは、公知の技術を用いて合成され得、標識され得る。競合因子オリゴヌクレオチドは、任意の適切な公知の方法、例えば、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８，１９８４に記載されているような自動合成装置を使用する、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９−１８６２，１９８１によって初めて報告された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成され得る。競合因子オリゴヌクレオチドの精製は、任意の適切な公知の方法、例えば、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、または例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７−１４９，１９８３に記載されているような陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実行され得る。
用語「絶対量」または「コピー数」は、本明細書において使用される場合、被分析物（例えば、全核酸または胎児核酸）の量または数のことを指す。本技術は、混合された母体サンプル中の胎児核酸の絶対量を測定するための組成物およびプロセスを提供する。絶対量または絶対コピー数は、検出に利用可能な分子の数のことであり、単位あたりのゲノム当量として表され得る。用語「濃度」とは、混合物中または溶液中の物質の量または比率（例えば、母体核酸と胎児核酸との混合物を含む母体サンプル中の胎児核酸の量）のことを指す。その濃度は、どれくらい大量／少量であるかを表すために用いられる、別の量に対する１００分率としてのパーセンテージとして表され得る。被分析物（例えば、標的核酸）の数または量を測定するためのプラットフォームとしては、質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ）、デジタルＰＣＲ、合成プラットフォームによるシークエンシング（例えば、パイロシークエンシング）、蛍光分光法およびフローサイトメトリーが挙げられるが、それらに限定されない。
用語「サンプル」は、本明細書において使用される場合、核酸を含む検体のことを指す。サンプルの例としては、組織、体液（例えば、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、腹膜液、腹水、膣分泌物、乳房液（ｂｒｅａｓｔ ｆｌｕｉｄ）、母乳、リンパ液、脳脊髄液または粘膜分泌物）、臍帯血、絨毛、羊水、胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、３２細胞期胚、６４細胞期胚、１２８細胞期胚、２５６細胞期胚、５１２細胞期胚、１０２４細胞期胚、胚組織、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物もしくは他の身体滲出物、糞便、個々の細胞、または当技術分野において十分に確立されたプロトコルを用いて、核酸を含むそのような起源およびミトコンドリアなどの細胞内構造物を抽出した物が挙げられるが、それらに限定されない。
胎児ＤＮＡは、母体の血液、母体の血清、母体の血漿、胎児の細胞、臍帯血、絨毛、羊水、尿、唾液、肺洗浄液、細胞または組織を含むがそれらに限定されない起源から得ることができる。
用語「血液」は、本明細書において使用される場合、妊婦由来または妊娠の可能性を検査されている女性由来の血液サンプルまたは血液調製物のことを指す。この用語は、全血または血液の任意の画分（例えば、慣習的に定義されるような血清および血漿）を含む。
用語「亜硫酸水素塩」は、本明細書において使用される場合、メチル化されたシトシンを化学的に改変せずにシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に化学的に変換することができる全てのタイプの亜硫酸水素塩（例えば、亜硫酸水素ナトリウム）を含み、ゆえに、ＤＮＡのメチル化の状態に基づいてＤＮＡ配列を差次的に改変するために使用され得る。
本明細書において使用される場合、メチル化されたＤＮＡまたはメチル化されていないＤＮＡを「差次的に改変する」試薬または作用物質は、識別可能である産物をメチル化されたＤＮＡおよびメチル化されていないＤＮＡから生じさせることによってＤＮＡのメチル化状態の識別を可能にするプロセスにおいて、メチル化されたＤＮＡおよび／またはメチル化されていないＤＮＡを改変する任意の試薬を含む。そのようなプロセスとしては、化学反応（例えば、亜硫酸水素塩によるＣ→Ｕへの変換）および酵素処理（例えば、メチル化依存性エンドヌクレアーゼによる切断）が挙げられ得るが、それらに限定されない。したがって、メチル化されたＤＮＡを優先的に切断するかまたは消化する酵素は、そのＤＮＡがメチル化されているときにより高効率でＤＮＡ分子を切断するかまたは消化することができる酵素であり、一方、メチル化されていないＤＮＡを優先的に切断するかまたは消化する酵素は、そのＤＮＡがメチル化されていないときに有意に高い効率を示す。
用語「亜硫酸水素塩に基づかない方法」および「亜硫酸水素塩に基づかない定量化方法」は、本明細書において使用される場合、亜硫酸水素塩の使用を必要としない、メチル化された核酸またはメチル化されていない核酸を定量化するための任意の方法のことを指す。これらの用語は、亜硫酸水素塩処理を必要としない、定量化される核酸を調製する方法のことも指す。亜硫酸水素塩に基づかない方法の例としては、１つまたは複数のメチル化感受性酵素を用いて核酸を消化する方法およびメチル化の状態に基づいて核酸に結合する作用物質を用いて核酸を分離する方法が挙げられるが、それらに限定されない。
用語「メチル感受性酵素」および「メチル化感受性制限酵素」は、活性がＤＮＡ認識部位のメチル化の状況に依存する、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼである。例えば、ＤＮＡ認識配列がメチル化されていない場合に限り、そのＤＮＡ認識配列において切断するかまたは消化するメチル感受性酵素が存在する。したがって、メチル化されていないＤＮＡサンプルは、メチル化されたＤＮＡサンプルよりも小さいフラグメントに切られる。同様に、高メチル化されたＤＮＡサンプルは、切断されない。対照的に、ＤＮＡ認識配列がメチル化されている場合に限り、そのＤＮＡ認識配列において切断するメチル感受性酵素が存在する。本明細書において使用される場合、用語「切断する」、「切る」および「消化する」は、交換可能に使用される。
用語「標的核酸」は、本明細書において使用される場合、その核酸が妊娠関連障害または染色体異常の一部であるか否かを判定する本明細書に開示される方法を用いて調べられる核酸のことを指す。例えば、２１番染色体由来の標的核酸は、ダウン症候群を検出する本明細書における技術の方法を用いて調べられ得る。
用語「コントロール核酸」は、本明細書において使用される場合、その核酸が染色体異常の一部であるか否かを判定する本明細書に開示される方法に従って、参照核酸として使用される核酸のことを指す。例えば、２１番染色体以外の染色体（本明細書において「参照染色体」と呼ばれる）由来のコントロール核酸は、ダウン症候群を検出するための参照配列であり得る。いくつかの実施形態において、コントロール配列は、既知または所定の量を有する。
用語「配列特異的」または「遺伝子座特異的方法」は、本明細書において使用される場合、配列組成に基づいてゲノム内の特定の位置（または遺伝子座）における核酸を調べる（例えば、定量化する）方法のことを指す。配列特異的方法または遺伝子座特異的方法は、特定の領域または染色体の定量化を可能にする。
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡの断片を意味する；これは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の制御に関与するコード領域の前および後の領域（リーダーおよびトレーラー（ｔｒａｉｌｅｒ））ならびに個々のコーディング断片（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
本願において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことを指すために本明細書において交換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書において使用される場合、これらの用語は、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、ここで、そのアミノ酸残基は、共有結合性のペプチド結合によって連結される。
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物のことを指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、．ガンマ．−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリンである。
アミノ酸は、本明細書においては、通常知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字の記号で言及され得る。同様に、ヌクレオチドも、通常認められている１文字コードによって言及され得る。
「プライマー」は、本明細書において使用される場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅方法において使用されることにより、様々なメチル化状態の具体的なゲノム配列（例えば、２１番染色体上のＣｐＧアイランドＣＧＩ１３７、ＰＤＥ９ＡまたはＣＧＩ００９内に位置する配列）に対応するポリヌクレオチド配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅し得るオリゴヌクレオチドのことを指す。ポリヌクレオチド配列を増幅するためのＰＣＲプライマーのうちの少なくとも１つは、その配列に対して配列特異的である。
用語「鋳型」とは、本明細書における技術における増幅に使用され得る任意の核酸分子のことを指す。天然には二本鎖ではないＲＮＡまたはＤＮＡは、鋳型ＤＮＡとして使用されるために、二本鎖ＤＮＡにされ得る。任意の二本鎖ＤＮＡ、または複数の様々な二本鎖ＤＮＡ分子を含む調製物が、鋳型ＤＮＡとして使用されることにより、その鋳型ＤＮＡに含まれる目的の遺伝子座が増幅され得る。
用語「増幅反応」は、本明細書において使用される場合、核酸を１回または複数回コピーするプロセスのことを指す。実施形態において、増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応、自家持続配列反応、リガーゼ連鎖反応、ＲＡＣＥ法（ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応、Ｑ−ベータファージ増幅、鎖置換増幅またはスプライスオーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、単一分子の核酸が、例えば、デジタルＰＣＲによって増幅される。
用語「感度」は、本明細書において使用される場合、真陽性の数値＋偽陰性の数値で除算された真陽性の数値のことを指し、ここで、感度（ｓｅｎｓ）は、０≦ｓｅｎｓ≦１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書における方法実施形態は、被験体が、実際は少なくとも１つの染色体異常または他の遺伝的障害を有するときに、少なくとも１つの染色体異常または他の遺伝的障害を有しないと誤って同定さないように、０に等しいかまたは０に近い偽陰性の数値を有する。逆に、評価は、多くの場合、感度に対する補完的な測定である予測アルゴリズムが正しく陰性を分類する能力から構成されている。用語「特異性」は、本明細書において使用される場合、真陰性の数値＋偽陽性の数値で除算された真陰性の数値のことを指し、ここで、感度（ｓｐｅｃ）は、０≦ｓｐｅｃ≦１の範囲内であり得る。理想的には、本明細書における方法実施形態は、被験体が、評価される染色体異常、他の遺伝的障害を有しないときに、少なくとも１つの染色体異常、他の遺伝的障害を有すると誤って同定さないように、０に等しいかまたは０に近い偽陽性の数値を有する。ゆえに、１、すなわち１００％に等しい感度および特異性を有する方法が、選択されることもある。
１つまたは複数の予測アルゴリズムが、有意性を判定するため、または互いから独立してもしくは互いに依存して重みづけられ得る変数条件下において収集された検出データに意味を与えるために、使用され得る。用語「変数」は、本明細書において使用される場合、値または値のセットを有するアルゴリズムの係数、数または関数のことを指す。例えば、変数は、増幅される核酸種のセットの設計、増幅される核酸種のセットの数、試験される胎児の遺伝的関与のパーセント、試験される母体の遺伝的関与のパーセント、アッセイされる染色体異常のタイプ、アッセイされる遺伝的障害のタイプ、アッセイされる伴性異常のタイプ、母体年齢などであり得る。用語「独立」は、本明細書において使用される場合、別のものによって影響を受けないことまたは別のものによって制御されないことを指す。用語「依存」は、本明細書において使用される場合、別のものによって影響を受けることまたは別のものによって制御されることを指す。例えば、具体的な染色体と、生存可能であることをもたらすその具体的な染色体について生じるトリソミー事象とは、互いに依存した変数である。
当業者は、許容され得る感度および／または特異性の範囲内で本技術のデータに対して有意性を与えるために任意のタイプの方法または予測アルゴリズムを使用し得る。例えば、予測アルゴリズム（例えば、カイ二乗検定、ｚ検定、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ（分散分析）、回帰分析、ニューラルネット、ファジー論理、隠れマルコフモデル、マルチプルモデル状態推定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｄｅｌ ｓｔａｔｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ）など）が、使用され得る。１つまたは複数の方法または予測アルゴリズムが、本技術の様々な独立変数および／または従属変数を有するデータに有意性を与えるように決定され得る。そして１つまたは複数の方法または予測アルゴリズムが、本技術の様々な独立変数および／または従属変数を有するデータに有意性を与えないように決定され得る。１つまたは複数の予測アルゴリズムの結果に基づいて本明細書に記載される方法の様々な変数のパラメータが設定され得るか、または変更され得る（例えば、各セットにおける、分析されるセットの数、ヌクレオチド種のタイプ）。例えば、カイ二乗検定を検出データに適用することにより、特定の範囲の母体年齢が、特定の染色体異常を有する出生児を有する可能性がより高いことと相関し、ゆえに、母体年齢という変数は、他の変数が重みづけられるのとは異なって重みづけられ得ることが示唆され得る。
特定の実施形態において、いくつかのアルゴリズムが選択されて、試験され得る。これらのアルゴリズムは、生データを用いて訓練され得る。新しい各々の生データサンプルについて、訓練されたアルゴリズムが、そのサンプルに対する分類（すなわち、トリソミーまたは正常）を割り当てる。その新しい生データサンプルの分類に基づいて、訓練されたアルゴリズムの性能が、感度および特異性に基づいて評価され得る。最終的には、最高の感度および／もしくは特異性またはそれらの組み合わせを有するアルゴリズムが、同定され得る。
詳細な説明
母体血漿中の胎児核酸の存在は、１９９７年に初めて報告され、単に母体の血液サンプルの分析による非侵襲性の出生前診断の可能性をもたらした（Ｌｏら、Ｌａｎｃｅｔ ３５０：４８５−４８７，１９９７）。現在までに、数多くの潜在的な臨床応用法が開発された。特に、母体血漿中の胎児核酸、例えば、ＤＮＡの濃度の量的異常が、子癇前症、早産、分娩前出血、侵襲性の胎盤形成、胎児のダウン症候群および他の胎児の染色体異数性を含むいくつかの妊娠関連障害と関連することが見出された。ゆえに、母体血漿中の胎児核酸分析は、母子の福祉をモニターするための強力なメカニズムである。
しかしながら、胎児ＤＮＡは、母体血漿中にバックグランドの母体ＤＮＡと共に存在する。ゆえに、Ｙ染色体配列が、母体ＤＮＡと最も都合良く識別可能であるので、報告されているほとんどの応用法が、Ｙ染色体配列の検出に依存してきた。そのようなアプローチでは、既存のアッセイが全妊娠の５０％にしか適用できない（すなわち、男児胎児の場合にしか適用できない）。したがって、母体サンプルから胎児核酸を富化し、分析するための、性別に依存しない組成物および方法の開発が大いに求められている。また、胎児核酸を定量化するために多型マーカーに依存する方法は、異なる民族的背景にわたる様々なヘテロ接合の割合に影響されやすい場合があり、それにより、適用性が限定される（例えば、必要とされるマーカーの数を増加させることによって）。
胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡが、メチル化の状態の差によって区別され得ることが以前に証明されている（米国特許第６，９２７，０２８号（参照により本明細書に組み込まれる））。メチル化は、エピジェネティックな現象であり、ＤＮＡ配列の変更を伴わずに表現型を変更するプロセスのことを指す。母体と胎児との間のＤＮＡのメチル化の状態の差を活用することによって、母体核酸のバックグランドにおける胎児核酸の検出および分析が成功し得る。
本発明者らは、胎児由来（例えば、胎盤由来）の胎児ＤＮＡと母体由来、例えば、末梢血細胞由来の母体ＤＮＡとの間で差次的にメチル化される新規ゲノムポリヌクレオチドを提供する。したがって、この発見は、非侵襲性の出生前診断のために使用され得る、胎児のゲノムＤＮＡと母体のゲノムＤＮＡとを区別するための新規アプローチおよび胎児核酸を正確に定量化するための新規方法を提供する。
方法
本明細書における技術の実施は、分子生物学の分野における日常的な技術を利用する。本明細書における技術において有用な一般的な方法を開示している基礎的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９９４））が挙げられる。
核酸について、サイズは、キロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）という単位で与えられる。これらは、アガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動、シークエンシングされた核酸、または公開されたＤＮＡ配列から得られる推定値である。タンパク質について、サイズは、キロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数という単位で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、シークエンシングされたタンパク質、得られたアミノ酸配列または公開されたタンパク質配列から推定される。
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されているように自動合成装置を用いて、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ＆ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２（１９８１）によって初めて報告された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、化学的に合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において認められた任意のストラテジー、例えば、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはＰｅａｒｓｏｎ ＆ Ｒｅａｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されているような陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用いて行われる。
サンプル
本明細書において、核酸を分析するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、核酸フラグメントの混合物中の核酸フラグメントを分析する。核酸の混合物は、異なるヌクレオチド配列、異なるフラグメント長、異なる起源（例えば、ゲノム起源、胎児対母体起源、細胞または組織起源、サンプル起源、被験体起源など）またはその組み合わせを有する２つ以上の核酸フラグメント種を含むことができる。
本明細書に記載の方法および装置に利用される核酸または核酸混合物は、多くの場合、被験体から得られたサンプルから単離される。被験体は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌または原生生物を含むがそれらに限定されない任意の生物または非生物であってよい。哺乳類動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反芻動物、ウシ類（ｂｏｖｉｎｅ）（例えば、ウシ）、ウマ類（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ）、ヤギ類（ｃａｐｒｉｎｅ）およびヒツジ類（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ、ヤギ）、ブタ類（ｓｗｉｎｅ）（例えば、ブタ）、ラクダ類（ｃａｍｅｌｉｄ）（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、シンパンジー）、クマ類（ｕｒｓｉｄ）（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚、イルカ、クジラおよびサメを含むがそれらに限定されない任意のヒトまたは非ヒト動物を、選択することができる。被験体は雄または雌（例えば、女性）であってよい。
核酸は、任意のタイプの適切な生物学的検体またはサンプルから単離され得る。検体の非限定的な例としては、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液（ｃｅｒｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ）、髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、腹膜洗浄液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡検査（ａｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ）洗浄液）、バイオプシーサンプル（例えば、着床前胚）、体腔穿刺サンプル、胎児の有核細胞または胎児の細胞レムナント、雌性生殖輸管の洗浄物、尿、便、痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙、汗、母乳、乳房液、胚細胞および胎児の細胞（例えば、胎盤細胞）を含むがそれらに限定されない、被験体の体液または組織が挙げられる。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、被験体の子宮頸部のスワブ標本である。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、血液であり得、血漿または血清であることもある。本明細書において使用される場合、用語「血液」は、全血または血液の任意の画分、例えば、慣習的に定義されているような、例えば、血清および血漿を含む。血漿とは、抗凝固薬で処理された血液の遠心分離に起因する全血の画分のことを指す。血清とは、血液サンプルが凝固した後に残る流体の液体部分のことを指す。体液または組織サンプルは、多くの場合、病院またはクリニックが通常従う標準的なプロトコルに従って回収される。血液については、多くの場合、適切な量の末梢血（例えば、３〜４０ミリリットル）が、回収され、さらなる調製の前に標準的な手法に従って保管され得る。核酸を抽出する体液または組織サンプルは、無細胞であり得る。いくつかの実施形態において、体液または組織サンプルは、細胞エレメントまたは細胞レムナントを含み得る。いくつかの実施形態において、胎児の細胞または癌細胞が、サンプル中に含まれ得る。
多くの場合、サンプルは、不均一であり、これは、２つ以上のタイプの核酸種がサンプル中に存在することを意味する。例えば、不均一な核酸は、（ｉ）胎児由来および母親由来の核酸、（ｉｉ）癌のおよび癌でない核酸、（ｉｉｉ）病原体および宿主の核酸、ならびにより一般的には、（ｉｖ）変異型および野生型の核酸を含み得るが、それらに限定されない。２つ以上の細胞型（例えば、胎児の細胞および母体の細胞、癌細胞および非癌細胞または病原性細胞および宿主細胞）が、存在するので、サンプルは、不均一であり得る。いくつかの実施形態において、少数の核酸種および多数の核酸種が存在する。
本明細書に記載される技術を出生前に適用する場合、体液または組織サンプルは、検査に適した在胎期間の女性または妊娠の可能性について検査されている女性から回収され得る。適切な在胎期間は、行われる出生前検査に応じて変動し得る。特定の実施形態において、妊娠女性被験体は、妊娠第１三半期であることもあるし、妊娠第２三半期であることもあるし、妊娠第３三半期であることもある。特定の実施形態において、体液または組織は、約１〜約４５週間の妊娠期間（例えば、１〜４、４〜８、８〜１２、１２〜１６、１６〜２０、２０〜２４、２４〜２８、２８〜３２、３２〜３６、３６〜４０または４０〜４４週間の妊娠期間）の妊娠女性から回収され、また、約５〜約２８週間の妊娠期間（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７週間の妊娠期間）の妊娠女性から回収されることもある。
血液サンプルの取得およびＤＮＡの抽出
本技術は、妊娠関連の症状もしくは障害の存在を検出するおよび／またはそれらの進行をモニターする非侵襲性の手段としての、母体の血液中に見られる胎児ＤＮＡの分離、富化および分析に関する。したがって、本明細書における技術を実施する第１ステップは、妊婦から血液サンプルを得て、そのサンプルからＤＮＡを抽出することである。
血液サンプルの取得
血液サンプルは、本技術の方法を用いる検査に適した在胎期間の妊婦から得られる。適切な在胎期間は、以下に考察されるような、検査される障害に応じて変動し得る。女性からの血液の回収は、病院またはクリニックが通常従う標準的なプロトコルに従って行われる。適切な量の末梢血、例えば、典型的には５〜５０ｍｌが回収され、さらなる調製の前に標準的な手法に従って保管され得る。血液サンプルは、サンプル中に存在する核酸の品質の低下を最小にするために、当業者に公知の様式で、回収され得るか、保管され得るか、または輸送され得る。
血液サンプルの調製
本技術に係る、母体の血液中に見られる胎児ＤＮＡの分析は、例えば、全血、血清または血漿を使用して行われ得る。母体の血液から血清または血漿を調製する方法は、当業者の間で周知である。例えば、妊婦の血液を、血液凝固を防ぐために、ＥＤＴＡを含むチューブまたは専用の市販の製品、例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＳＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）に入れ、次いで、遠心分離によって全血から血漿を得ることができる。他方で、血液凝固後の遠心分離ありまたはなしで、血清を得てもよい。遠心分離が使用される場合、その遠心分離は、もっぱらではないが典型的には、適切な速度、例えば、１，５００〜３，０００×ｇで行われる。血漿または血清は、さらなる遠心分離ステップに供された後、ＤＮＡ抽出用の新しいチューブに移され得る。
全血の無細胞部分に加えて、ＤＮＡは、女性の全血サンプルの遠心分離および血漿の除去の後に得ることができるバフィーコート部分に富化される細胞画分からも回収され得る。
ＤＮＡの抽出
血液を含む生物学的サンプルからＤＮＡを抽出する公知の方法が、数多く存在する。ＤＮＡ調製の一般的な方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｄ ｅｄ．，２００１によって記載されている）に従うことができる；様々な市販の試薬またはキット、例えば、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）およびＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）もまた、妊婦の血液サンプルからＤＮＡを得るために使用され得る。これらの方法の２つ以上の組み合わせもまた使用され得る。
いくつかの実施形態において、サンプルは、まず、１つまたは複数の方法によって胎児核酸について富化され得るかまたは相対的に富化され得る。例えば、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの識別は、本技術の組成物およびプロセスを単独でまたは他の識別因子と組み合わせて使用して行われ得る。これらの因子の例としては、Ｘ染色体とＹ染色体との間の単一ヌクレオチドの差異、Ｙ染色体特異的配列、ゲノムの他の箇所に位置する多型、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間のサイズの差異および母体の組織と胎児の組織との間のメチル化パターンの差異が挙げられるが、それらに限定されない。
具体的な核酸種についてサンプルを富化する他の方法は、２００７年５月３０日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０７／６９９９１、２００７年６月１５日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７１２３２、米国仮出願番号６０／９６８，８７６および６０／９６８，８７８（本出願人に譲渡）、（２００５年１１月２８日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ０５／０１２７０７）に記載されており、これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、母体核酸は、サンプルから選択的に除去される（部分的に、実質的に、ほぼ完全にまたは完全に）。
核酸の単離および処理
核酸は、当技術分野において公知の方法によって、１つまたは複数の起源（例えば、細胞、土壌など）から得られ得る。細胞溶解の手法および試薬は、当技術分野において公知であり、一般に、化学的、物理的または電気分解的な溶解方法によって行われ得る。例えば、化学的方法では、一般に、溶解剤を使用して細胞を破壊し、その細胞から核酸を抽出した後、カオトロピック塩で処理する。物理的方法、例えば、凍結／融解の後の粉砕、細胞プレス機（ｃｅｌｌ ｐｒｅｓｓｅｓ）の使用などもまた、有用である。高塩溶解法もまた、通常使用される。例えば、アルカリ溶解法が、利用され得る。後者の手法は、従来より、フェノール−クロロホルム溶液の使用を組み込んでいるが、フェノール−クロロホルムなしの３つの溶液が関わる代替の手法も利用できる。後者の手法では、１つの溶液は、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０；１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａを含み得；第２の溶液は、０．２Ｎ ＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを含み得；第３の溶液は、３Ｍ ＫＯＡｃ，ｐＨ５．５を含み得る。これらの手法は、その全体が本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９８９）に見られ得る。
用語「核酸」および「核酸分子」は、交換可能に使用される。これらの用語は、任意の組成の形態の核酸、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、リボ核酸（ＲＮＡ、例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、胎児または胎盤などによって高度に発現されるＲＮＡなど）、ならびに／またはＤＮＡアナログもしくはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログおよび／または非天然の骨格を含むものなど）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）のことを指し、これらの全てが、一本鎖または二本鎖の形態であり得る。別段限定されない限り、核酸は、天然のヌクレオチドの公知のアナログを含み得、それらのいくつかは、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で機能し得る。核酸は、本明細書におけるプロセスを行うために有用な任意の形態（例えば、線状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であり得る。核酸は、特定の実施形態において、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、あるいはインビトロまたは宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質において複製することができるかまたは複製されることができる他の核酸であり得るか、またはそれらに由来し得る。核酸は、いくつかの実施形態において、単一染色体に由来し得る（例えば、核酸サンプルは、二倍体生物から得られたサンプルの１本の染色体に由来し得る）。核酸には、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」読み枠または「リバース」読み枠）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたか、複製されたか、または増幅された、ＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、バリアントおよびアナログも含まれる。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡの場合、塩基シトシンは、ウラシルで置き換えられ、糖の２’位は、ヒドロキシル部分を含む。核酸は、被験体から得られた核酸を鋳型として用いて調製され得る。
各サンプルが、同じまたは異なる起源に由来する場合、核酸は、別の核酸と比べて異なる時点において単離され得る。核酸は、核酸ライブラリ、例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡライブラリ由来であり得る。核酸は、サンプルからの核酸の精製もしくは単離および／または核酸分子の増幅の結果であり得る。本明細書に記載されるプロセスのために提供される核酸は、１つのサンプルまたは２つ以上のサンプル（例えば、１つまたは複数、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、９つ以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上または２０個以上のサンプル）由来の核酸を含み得る。
特定の実施形態において、核酸は、細胞外核酸を含み得る。本明細書において使用される用語「細胞外核酸」は、細胞を実質的に有しない起源から単離された核酸のことを指し、「無細胞」核酸および／または「循環無細胞」核酸とも呼ばれる。多くの場合、細胞外核酸は、検出可能な細胞を含まず、細胞エレメントまたは細胞レムナントを含み得る。細胞外核酸に対する無細胞起源の非限定的な例は、血漿、血清および尿である。本明細書において使用される場合、用語「循環無細胞サンプル核酸を得る」は、サンプルを直接得ること（例えば、サンプルを回収すること）またはサンプルを回収した別の者からサンプルを得ることを含む。理論に限定されるものではないが、細胞外核酸は、細胞アポトーシスおよび細胞分解の生成物であり得、その生成物は、多くの場合、ある範囲にわたる一連の長さを有する細胞外核酸（例えば、「ラダー」）の基礎となる。
細胞外核酸は、様々な核酸種を含み得、ゆえに、特定の実施形態において、「不均一」と本明細書において呼ばれる。例えば、癌を有する人の血清または血漿は、癌細胞由来の核酸および非癌細胞由来の核酸を含み得る。別の例において、妊娠女性の血清または血漿は、母体核酸および胎児核酸を含み得る。いくつかの例において、胎児核酸は、全核酸の約５％〜約５０％であることもある（例えば、全核酸の約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８または４９％が、胎児核酸である）。いくつかの実施形態において、核酸における胎児核酸の大部分は、約５００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、約５００塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態において、核酸における胎児核酸の大部分は、約２５０塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、約２５０塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態において、核酸における胎児核酸の大部分は、約２００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、約２００塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態において、核酸における胎児核酸の大部分は、約１５０塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、約１５０塩基対以下の長さである）。いくつかの実施形態において、核酸における胎児核酸の大部分は、約１００塩基対以下の長さである（例えば、胎児核酸の約８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が、約１００塩基対以下の長さである）。
核酸は、特定の実施形態において、核酸を含むサンプルを処理することなく、本明細書に記載される方法を行うために提供され得る。いくつかの実施形態において、核酸は、核酸を含むサンプルを処理した後に、本明細書に記載される方法を行うために提供され得る。例えば、核酸は、サンプルから抽出され得るか、単離され得るか、精製され得るか、または増幅され得る。本明細書において使用される用語「単離される」とは、核酸がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境、または外因的に発現される場合、宿主細胞）から取り出されることを指し、ゆえに、その元の環境からヒトの介入によって（例えば、「人間の手を経て」）変更される。単離された核酸は、起源のサンプル中に存在する構成要素よりも非核酸構成要素（例えば、タンパク質、脂質）の量が少ない状態で提供される。単離された核酸を含む組成物は、非核酸構成要素を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超含まない可能性がある。本明細書において使用される用語「精製される」は、核酸が由来するサンプル起源中の核酸種よりも少ない核酸種を含む核酸が提供されることを指す。核酸を含む組成物は、他の核酸種を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超含まない可能性がある。本明細書において使用される用語「増幅される」は、サンプル中の核酸のヌクレオチド配列またはその一部と同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を有するアンプリコン核酸を直線的または指数関数的に生成するプロセスにそのサンプルの核酸を供することを指す。
特定の実施形態において、核酸はまた、本明細書に記載のプロセスに核酸を提供する前に、核酸に、核酸フラグメントを生成する方法を行うことにより処理され得る。いくつかの実施形態において、断片化または切断を行った核酸は、約５〜約１０，０００塩基対、約１００〜約１，０００塩基対、約１００〜約５００塩基対、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００または９０００塩基対の公称の、平均（ａｖｅｒａｇｅ）または平均（ｍｅａｎ）の長さを有し得る。フラグメントを、当技術分野において公知の任意の適切な方法により生成することができ、核酸フラグメントの平均、平均または公称の長さを、適切なフラグメント生成法を選択することにより制御することができる。特定の実施形態において、相対的に短い長さの核酸を利用し、配列の分散が小さく、かつ／または相対的に大量の公知のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析することができる。いくつかの実施形態において、相対的に長さのある核酸を利用し、配列の分散が大きく、かつ／または相対的に少量のヌクレオチド配列情報を含有する配列を分析することができる。
核酸フラグメントは、オーバーラップするヌクレオチド配列を含有することができ、このようなオーバーラップする配列は、非断片化された対応物の核酸またはその部分のヌクレオチド配列の構築を容易にすることができる。例えば、１つのフラグメントは、部分配列ｘおよびｙを有することができ、別のフラグメントは、部分配列ｙおよびｚを有することができ、この場合、ｘ、ｙおよびｚは、５ヌクレオチド長以上となり得るヌクレオチド配列である。特定の実施形態において、オーバーラップする配列ｙを利用し、サンプルから核酸内のｘ−ｙ−ｚヌクレオチド配列の構築を容易にすることができる。特定の実施形態において、核酸は、部分的に（例えば、不完全または終了した特異的な切断反応から）断片化され、または完全に断片化され得る。
核酸は、当技術分野において公知の種々の方法により断片化されることができ、これは、物理的、化学的および酵素によるプロセスを含むがそれに限定されない。このようなプロセスの非限定的な例は、米国特許出願公開第２００５０１１２５９０号（Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｏｏｍらによる、“Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，”と題して、２００５年５月２６日に公開）に記載されている。特定のプロセスを選択し、非特異的に切断されるフラグメントまたは特異的に切断されるフラグメントを生成することができる。非特異的に切断されるフラグメントの核酸を生成することができるプロセスの非限定的な例として、核酸を、せん断力に核酸を曝露する装置（例えば、核酸をシリンジ針に通過させること；フレンチプレスの使用）と接触させ、核酸を放射線にさらし（例えば、ガンマ、Ｘ線、ＵＶ照射、フラグメントのサイズを放射強度により制御することができる）、水中の核酸を煮沸し（例えば、約５００塩基対フラグメントを生成）、核酸を酸および塩基加水分解プロセスに曝露することを含むが限定されない。
本明細書において使用される場合、「断片化」または「切断」は、核酸鋳型遺伝分子またはその増幅された生成物などの核酸分子を、２つ以上の小さい核酸分子に切断しうる手法または状態を指す。このような断片化または切断は、配列特異的、塩基特定的、または非特異的であってよく、例えば、化学的、酵素による、物理的断片化を含む種々の方法、試薬または状態のいずれかにより成し遂げられ得る。
本明細書において使用される場合、「フラグメント」、「切断生成物」、「切断された生成物」またはその文法的変形例は、核酸鋳型遺伝分子またはその増幅された生成物の断片化または切断により得られた核酸分子を指す。このようなフラグメントまたは切断された生成物が、切断反応から得られた全ての核酸分子を指すことはできる一方で、典型的に、このようなフラグメントまたは切断された生成物は、核酸鋳型遺伝分子の断片化または切断により得られた核酸分子、または核酸鋳型遺伝分子の対応するヌクレオチド配列を含有するその増幅された生成物の部分のみを指す。例えば、増幅された生成物は、核酸鋳型配列の増幅されたヌクレオチド領域を超える１つまたはそれより多いヌクレオチドを含有することができる（例えば、プライマーは、転写開始配列などの「特別な」ヌクレオチド、さらに核酸鋳型遺伝分子に相補的なヌクレオチドを含有することができ、「特別な」ヌクレオチドまたは核酸鋳型遺伝分子の増幅されたヌクレオチド領域に対応しないヌクレオチドを含有する増幅された生成物を生じる）。それに応じて、フラグメントは、少なくとも部分的に、代表的な核酸鋳型分子から、またはそれに基づくヌクレオチド配列情報を含有する増幅された核酸分子の部分から生じるフラグメントを含むことができる。
本明細書において使用される場合、用語「相補的切断反応」は、同じ核酸に、異なる切断試薬を使用して、または同じ標的または参照核酸もしくはタンパク質の代替えの切断パターンを生じるような同じ切断試薬の切断特異性を変更することにより行われる切断反応を指す。特定の実施形態において、核酸は、１つまたはそれより多い反応容器で１つまたはそれより多い特異的切断剤（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種以上の特異的切断剤）で処理し得る（例えば、核酸を個別の容器において、各特異的切断試薬で処理する）。
核酸は、その核酸を１つまたは複数の特異的切断剤と接触させることによって、特異的に切断され得る。本明細書において使用される用語「特異的切断剤」は、１つまたは複数の特異的部位において核酸を切断し得る作用物質、時折、化学物質または酵素のことを指す。多くの場合、特異的切断剤は、具体的なヌクレオチド配列に従って、具体的な部位において特異的に切断する。
酵素によ特定の切断剤の例として、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅ（例えば、ＤＮａｓｅ Ｉ、ＩＩ）；ＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｐ）；Ｃｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素；Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび真核構造特異的エンドヌクレアーゼ；マウスＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ；Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、Ａｃｃ Ｉ、Ａｆｌ ＩＩＩ、Ａｌｕ Ｉ、Ａｌｗ４４ Ｉ、Ａｐａ Ｉ、Ａｓｎ Ｉ、Ａｖａ Ｉ、Ａｖａ ＩＩ、ＢａｍＨ Ｉ、Ｂａｎ ＩＩ、Ｂｃｌ Ｉ、Ｂｇｌ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｌｎ Ｉ、Ｂｓｍ Ｉ、ＢｓｓＨ ＩＩ、ＢｓｔＥ ＩＩ、Ｃｆｏ Ｉ、ＣＩａ Ｉ、Ｄｄｅ Ｉ、Ｄｐｎ Ｉ、Ｄｒａ Ｉ、ＥｃＩＸ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｉ、ＥｃｏＲ ＩＩ、ＥｃｏＲ Ｖ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈａｅ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｈｐａ Ｉ、Ｈｐａ ＩＩ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｋｓｐ Ｉ、Ｍｌｕ Ｉ、ＭＩｕＮ Ｉ、Ｍｓｐ Ｉ、Ｎｃｉ Ｉ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ、Ｎｄｅ ＩＩ、Ｎｈｅ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ、Ｎｒｕ Ｉ、Ｎｓｉ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｒｓａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ、Ｓａｕ３Ａ Ｉ、Ｓｃａ Ｉ、ＳｃｒＦ Ｉ、Ｓｆｉ Ｉ、Ｓｍａ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｐ Ｉ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｓｔｙ Ｉ、Ｓｗａ Ｉ、Ｔａｑ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ；グリコシラーゼ（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｇｌｙｃｏｌｓｙｌａｓｅ）（ＵＤＧ）、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼＩＩ、ピリミジン水和物−ＤＮＡグリコシラーゼ、ＦａＰｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ、チミンミスマッチ−ＤＮＡグリコシラーゼ、ヒポキサンチン−ＤＮＡグリコシラーゼ、５−ヒドロキシメチルウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＨｍＵＤＧ）、５−ヒドロキシメチルシトシンＤＮＡグリコシラーゼ、または１，Ｎ６−エテノ−アデニンＤＮＡグリコシラーゼ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）；リボザイム、およびＤＮＡｚｙｍｅを含むが限定されない。核酸を、化学剤で処理することができ、その修飾核酸を切断することができる。非限定的な例において、核酸を、（ｉ）Ｎ３−メチルアデニンおよびＮ３−メチルグアニン（アルキルプリンＤＮＡ−グリコシラーゼにより認識され、かつ切断される）を含むいくつかのアルキル化塩基を生成するメチルニトロウレアなどのアルキル化剤を用いて、（ｉｉ）亜硫酸水素ナトリウム（ＤＮＡのシトシン残基の脱アミノ化を生じ、ウラシルＮ−グリコシラーゼにより切断することができるウラシル残基を形成する）を用いて、および（ｉｉｉ）グアニンをその酸化形態である８−ヒドロキシグアニンに変換する化学剤（ホルムアミドピリミジンＤＮＡ Ｎ−グリコシラーゼにより切断することができる）を用いて処理することができる。化学的切断のプロセスの例は、アルキル化（例えば、ホスホロチオエート修飾核酸のアルキル化）、Ｐ３’−Ｎ５’−ホスホロアミデート含有核酸の酸不安定性の切断、および核酸の四酸化オスミウムおよびピペリジン処理を含むが限定されない。
核酸を、本明細書に記載の方法に核酸を提供する前に核酸内の特定のヌクレオチドを修飾するプロセスに曝露することもできる。例えば、核酸を、その中にあるヌクレオチドのメチル化状態に基づき、選択的に修飾するプロセスを、核酸に適用することができる。さらに、高温、紫外線照射、ｘ線照射などの条件は、核酸分子の配列の変化を誘導することができる。核酸は、本明細書に記載の配列分析または製造プロセスを行うのに有用な任意の形態、例えば、固体または液体形態などで提供され得る。特定の実施形態において、核酸を、１つまたはそれより多いバッファまたは塩を含むが限定されない、１つまたはそれより多い他の構成要素を必要に応じて含む液体形態で提供され得る。
核酸は、１本または２本鎖であってよい。例えば、１本鎖ＤＮＡを、例えば、加熱することによって、またはアルカリで処理することによって２本鎖ＤＮＡを変性させることにより生成することができる。いくつかの例において、核酸は、Ｄループ構造内にあり、つまりオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ様分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）により２本鎖ＤＮＡ分子の鎖の侵入により形成される。Ｄループ形成は、例えば、当技術分野において公知の方法を使用して、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質の添加によりおよび／または塩濃度の変更により促進することができる。
ゲノムＤＮＡ標的配列
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、１つまたは複数の核酸種、および時折、１つまたは複数のヌクレオチド配列種が、増幅および定量化のために標的化される。いくつかの実施形態において、標的化される核酸は、ゲノムＤＮＡ配列である。例えば、特定のゲノムＤＮＡ標的配列は、所与のアッセイに対する具体的な特徴の測定を可能にし得るので、それらが使用される。ゲノムＤＮＡ標的配列は、本明細書において、所与のアッセイに対するマーカーと呼ばれ得る。いくつかの例において、ゲノム標的配列は、本明細書に記載されるような多型である。いくつかの実施形態において、２つ以上のゲノムＤＮＡ標的配列またはマーカーは、所与のアッセイに対する具体的な特徴の測定を可能にし得る。そのようなゲノムＤＮＡ標的配列は、具体的な「領域」の配列であると見なされる。本明細書において使用される場合、「領域」は、ゲノムの位置、例えば、具体的な染色体、一続きの染色体ＤＮＡまたは遺伝子座の説明に限定されることを目的としていない。むしろ、用語「領域」は、具体的なアッセイを示唆し得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列またはマーカーのコレクションを同定するために本明細書において使用される。そのようなアッセイとしては、胎児核酸を検出および定量化するためのアッセイ、母体核酸を検出および定量化するためのアッセイ、全ＤＮＡを検出および定量化するためのアッセイ、メチル化されたＤＮＡを検出および定量化するためのアッセイ、胎児特異的核酸（例えば、Ｙ染色体ＤＮＡ）を検出および定量化するためのアッセイ、ならびに消化効率の指標として、消化されたおよび／または消化されていないＤＮＡを検出および定量化するためのアッセイが挙げられ得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、具体的なゲノム遺伝子座内に存在すると記載される。本明細書において使用される場合、ゲノム遺伝子座は、オープンリーディングフレームＤＮＡ、非転写ＤＮＡ、イントロン配列、エクストロン（ｅｘｔｒｏｎｉｃ）配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、フランキング配列、または所与のゲノム遺伝子座と関連すると当業者が見なす任意の配列のうちのいずれかまたは組み合わせを含み得る。
メチル化されたＤＮＡを測定するためのアッセイ
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、メチル化されたＤＮＡの測定を可能にし得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列が使用される。一般に、メチル化されたＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、胎児核酸と母体核酸とにおいて差次的にメチル化されており、ゆえに、メチル化感受性制限酵素に対する本明細書に提供される方法に従って、差次的に消化される。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、単一コピー遺伝子である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体上に位置する。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１３番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１８番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、２１番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｘ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｙ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、典型的には、１つのＤＮＡ種、例えば、胎盤ＤＮＡにおいてメチル化されている（すなわち、少なくとも約５０％以上のメチル化）。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、別のＤＮＡ種、例えば、母体ＤＮＡにおいて最小限にしかメチル化されていない（すなわち、約１％未満のメチル化）。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の変異も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の挿入または欠失も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、６５℃より低くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、７５℃より高くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、増幅される領域内に少なくとも２つの制限酵素認識部位を含む。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、約５０塩基対〜約２００塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、７０塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ｍｆｏｌｄ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３））を使用した完全なアンプリコン予測の二次構造に対して、いかなる負のΔＧ値も有しない。いくつかの実施形態において、メチル化されたＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＴＢＸ３遺伝子座内に存在する。いくつかの実施形態において、メチル化されたＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＳＯＸ１４遺伝子座内に存在する。メチル化されたＤＮＡの測定のために、本明細書に提供される方法と合わせて使用され得るさらなるゲノム標的は、実施例３に提供される。
全ＤＮＡを測定するためのアッセイ
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、全ＤＮＡの測定を可能にし得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列が使用される。一般に、全ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、全ゲノムコピーに存在する（例えば、胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡ、癌ＤＮＡおよび正常ＤＮＡ、病原体ＤＮＡおよび宿主ＤＮＡに存在する）。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、単一コピー遺伝子である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体またはＹ染色体上に位置する。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１３番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１８番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、２１番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｘ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｙ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の変異も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の挿入または欠失も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、６５℃より低くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、７５℃より高くない。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、約５０塩基対〜約２００塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、７０塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ｍｆｏｌｄ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３））を使用した完全なアンプリコン予測の二次構造に対して、いかなる負のΔＧ値も有しない。いくつかの実施形態において、全ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＡＬＢ遺伝子座内に存在する。いくつかの実施形態において、全ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＡＰＯＥまたはＲＮＡｓｅＰ遺伝子座内に存在する。
胎児ＤＮＡを測定するためのアッセイ
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、胎児ＤＮＡの測定を可能にし得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列が使用される。いくつかの実施形態において、胎児ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｙ染色体に特異的である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、単一コピー遺伝子である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の変異も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の挿入または欠失も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、６５℃より低くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、７５℃より高くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、増幅される領域内に制限酵素認識部位ＧＣＧＣを含まない。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、約５０塩基対〜約２００塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、７０塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ｍｆｏｌｄ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３））を使用した完全なアンプリコン予測の二次構造に対して、いかなる負のΔＧ値も有しない。いくつかの実施形態において、胎児ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＵＴＹ遺伝子座内に存在する。いくつかの実施形態において、胎児ＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＳＲＹ１またはＳＲＹ２遺伝子座内に存在する。
消化されたＤＮＡおよび／または消化されていないＤＮＡを測定するためのアッセイ
本明細書に提供される方法のいくつかの実施形態において、消化された核酸または消化されていない核酸の量の測定を可能にし得る１つまたは複数のゲノムＤＮＡ標的配列が、消化効率の指標として使用される。そのようなゲノムＤＮＡ標的配列は、サンプル中の全ゲノム（例えば、母体および胎児の種のゲノム）に存在する。一般に、消化されたＤＮＡまたは消化されていないＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、別のアッセイにおいて使用されるゲノムＤＮＡ標的配列に存在する少なくとも１つの制限酵素認識部位を含む。したがって、消化されたＤＮＡまたは消化されていないＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、差次的な消化を含むアッセイに対するコントロールとして機能する。一般に、ゲノムＤＮＡ標的配列は、検査される全ての核酸種においてメチル化されていない（例えば、母体と胎児の両方の種のゲノムにおいてメチル化されていない）。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、単一コピー遺伝子である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１３番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、１８番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、２１番染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｘ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、Ｙ染色体上に位置しない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の変異も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＣＲプライマーハイブリダイゼーション配列内にいかなる公知の挿入または欠失も含まない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、６５℃より低くない。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズし得るＰＣＲプライマーの融解温度は、７５℃より高くない。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、約５０塩基対〜約２００塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列の長さは、７０塩基対である。いくつかの例において、ゲノムＤＮＡ標的配列は、ｍｆｏｌｄ（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｆｏｌｄ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−１５，（２００３））を使用した完全なアンプリコン予測の二次構造に対して、いかなる負のΔＧ値も有しない。いくつかの実施形態において、消化されたＤＮＡまたは消化されていないＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＰＯＰ５遺伝子座内に存在する。いくつかの実施形態において、消化されたＤＮＡまたは消化されていないＤＮＡの測定のために使用されるゲノムＤＮＡ標的配列は、ＬＤＨＡ遺伝子座内に存在する。
核酸のメチル化特異的分離
本明細書に提供される方法は、差次的にメチル化されたＤＮＡのメチル化特異的分離に基づいて胎児ＤＮＡを富化するための代替アプローチを提供する。発生の制御に関与する多くの遺伝子は、胚性幹細胞におけるエピジェネティクスを通じて制御されることが最近発見された。その結果として、複数の遺伝子が、胎児起源の核酸と母体起源の核酸との間で差次的なＤＮＡメチル化を示すと予想され得る。これらの領域が同定されると、メチル化されたＤＮＡを捕捉する技術を使用することにより、胎児ＤＮＡを特異的に富化することができる。差次的にメチル化された領域を同定するために、メチル化されたＤＮＡを捕捉する新規アプローチを用いた。このアプローチは、ＭＢＤ２のメチル結合ドメインが抗体のＦｃフラグメントに融合されているタンパク質（ＭＢＤ−ＦＣ）を使用する（Ｇｅｂｈａｒｄ Ｃ，Ｓｃｈｗａｒｚｆｉｓｃｈｅｒ Ｌ，Ｐｈａｍ ＴＨ，Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ Ｅ，Ｋｌｕｇ Ｍ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒ，Ｒｅｈｌｉ Ｍ（２００６）Ｇｅｎｏｍｅ ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：６１１８−６１２８）。この融合タンパク質は、従来のメチル化特異的抗体に対していくつかの利点を有する。ＭＢＤ−ＦＣは、メチル化されたＤＮＡに対してより高い親和性を有し、二本鎖ＤＮＡに結合する。最も重要なことには、それらの２つのタンパク質は、ＤＮＡに結合する方法が異なる。メチル化特異的抗体は、確率論的にＤＮＡに結合し、これは、２つの答えだけしか得ることができないことを意味する。他方、ＭＢＤ−ＦＣのメチル結合ドメインは、メチル化状態に関係なく、全てのＤＮＡ分子に結合する。このタンパク質−ＤＮＡ相互作用の強度は、ＤＮＡのメチル化レベルによって定義される。ゲノムＤＮＡに結合した後、溶出液を、塩濃度を高めて使用することにより、メチル化されていないおよびメチル化されたＤＮＡを分画することができ、より制御された分離が可能になる（Ｇｅｂｈａｒｄ Ｃ，Ｓｃｈｗａｒｚｆｉｓｃｈｅｒ Ｌ，Ｐｈａｍ ＴＨ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ Ｒ，Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ Ａ，Ｒｅｈｌｉ Ｍ（２００６）Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ（ＭＢ）−ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ８２）。その結果として、メチル−ＣｐＧ免疫沈降（ＭＣＩＰ）と呼ばれるこの方法は、メチル化レベルに従ってゲノムＤＮＡを富化できるだけでなく分画することもでき、この方法は、メチル化されていないＤＮＡ画分も同様に調査されるべきであるとき、特に役立つ。
メチル化感受性制限酵素消化
本明細書における技術は、母体サンプル由来の胎児核酸の量を測定するための組成物およびプロセスも提供する。本明細書における技術は、母体核酸を選択的かつ完全または実質的に消化する酵素で、母体サンプル由来の核酸を選択的に消化することによって、前記母体サンプル中の胎児核酸領域の富化を可能にし、それにより、そのサンプルが少なくとも１つの胎児核酸領域について富化される。好ましくは、消化効率は、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超である。富化の後、胎児核酸の量は、多型配列または亜硫酸水素塩処理を必要としない定量的方法によって測定することができ、それにより、女児胎児に対してもおよび種々の民族にわたっても等しくうまく作用し、サンプル中に存在する低コピー数の胎児核酸が保存される、解決法が提供される。
例えば、ＤＮＡ認識配列がメチル化されていない場合に、そのＤＮＡ認識配列において優先的または実質的に切断するかまたは消化するメチル感受性酵素が存在する。したがって、メチル化されていないＤＮＡサンプルは、メチル化されたＤＮＡサンプルよりも小さいフラグメントに切断されることになる。同様に、高メチル化されたＤＮＡサンプルは、切断されないだろう。対照的に、ＤＮＡ認識配列がメチル化されている場合に限り、そのＤＮＡ認識配列において切断するメチル感受性酵素が存在する。
本明細書における技術の方法における使用に適したメチル化されていないＤＮＡを消化するメチル感受性酵素としては、ＨｐａＩＩ、ＨｈａＩ、ＭａｅＩＩ、ＢｓｔＵＩおよびＡｃｉＩが挙げられるが、それらに限定されない。使用され得る酵素は、メチル化されていない配列ＣＣＧＧだけを切断するＨｐａＩＩである。使用され得る別の酵素は、メチル化されていない配列ＧＣＧＣだけを切断するＨｈａＩである。両方の酵素が、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標），Ｉｎｃから入手可能である。メチル化されていないＤＮＡだけを消化する２つ以上のメチル感受性酵素の組み合わせもまた使用され得る。メチル化されたＤＮＡだけを消化する適切な酵素としては、認識配列ＧＡＴＣにおいて切断するＤｐｎＩ、およびＡＡＡ＋タンパク質のファミリーに属し、改変されたシトシンを含むＤＮＡを切断し、認識部位５’．．．ＰｕｍＣ（Ｎ４０−３０００）ＰｕｍＣ．．．３’ において切断するＭｃｒＢＣ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ）が挙げられるが、それらに限定されない。
特定の部位においてＤＮＡを切断するための選択された制限酵素に対する切断の方法および手法は、当業者に周知である。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｒｏ−Ｍｅｇａ Ｂｉｏｃｈｅｍｓ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍなどを含む多くの制限酵素の供給業者は、特定の制限酵素によって切断されるＤＮＡ配列の条件およびタイプに関する情報を提供している。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９を参照のこと）は、制限酵素および他の酵素を使用する方法の一般的な説明を提供している。多くの場合、酵素は、約９５％〜１００％の効率、好ましくは、約９８％〜１００％の効率で母体ＤＮＡの切断を可能にする条件下で使用される。
メチル化分析のための他の方法
様々なメチル化分析の手法が当技術分野において公知であり、本技術と合わせて使用することができる。これらのアッセイは、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧアイランドのメチル化状態の判定を可能にする。さらに、それらの方法は、メチル化された核酸を定量化するために使用され得る。そのようなアッセイは、他の技術の中でも、亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、ＰＣＲ（配列特異的増幅用）、サザンブロット分析およびメチル化感受性制限酵素の使用を含む。
ゲノムシークエンシングは、亜硫酸水素塩処理を使用することによってＤＮＡメチル化パターンおよび５−メチルシトシン分布を分析するために単純化された技術である（Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１，１９９２）。さらに、亜硫酸水素塩によって変換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物の制限酵素消化、例えば、Ｓａｄｒｉ ＆ Ｈｏｒｎｓｂｙ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８−５０５９，１９９６）によって記載されている方法またはＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４，１９９７）が、使用され得る。
ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡにおいて特定の遺伝子座におけるＤＮＡのメチル化レベルを測定するために有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４，１９９７）。簡潔には、制限酵素消化を用いて、亜硫酸水素ナトリウムで処理されたＤＮＡのＰＣＲ産物におけるメチル化依存的な配列差異を明らかにする。まず、メチル化依存的な配列差異を、Ｆｒｏｍｍｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７−１８３１，１９９２）が報告した手法に従って、標準的な亜硫酸水素塩処理によってゲノムＤＮＡに導入する。次いで、亜硫酸水素塩によって変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅を、関心があるＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して行った後、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、および標識された特異的なハイブリダイゼーションプローブを使用する検出を行う。元のＤＮＡサンプルにおけるメチル化レベルは、広範囲のＤＮＡメチル化レベルにわたって、消化されたおよび消化されていないＰＣＲ産物の相対量によって線形定量化様式で表される。さらに、この技術は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織サンプルから得られたＤＮＡに対して確実に適用され得る。ＣＯＢＲＡ分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡベースのキットにおいて見られ得るような）としては：特定の遺伝子（またはメチル化によって変更されたＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）に対するＰＣＲプライマー；制限酵素および適切な緩衝剤；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ；コントロールハイブリダイゼーションオリゴ；オリゴプローブ用のキナーゼ標識キット；および放射性ヌクレオチドが挙げられ得るが、それらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝剤；スルホン化緩衝剤；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝剤；およびＤＮＡ回収構成要素が挙げられ得る。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップの後にさらなる操作を必要としない蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．）法を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６，１９９９）。簡潔には、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスは、亜硫酸水素ナトリウム反応において、標準的な手法に従ってメチル化依存的な配列差異の混合プールに変換されたゲノムＤＮＡの混合サンプルから始める（その亜硫酸水素塩プロセスは、メチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、「偏りのない」（公知のＣｐＧメチル化部位とオーバーラップしないプライマーを用いる）ＰＣＲ反応または「偏った」（公知のＣｐＧジヌクレオチドとオーバーラップするＰＣＲプライマーを用いる）反応において、蛍光ベースのＰＣＲを行う。配列の識別は、増幅プロセスのレベルもしくは蛍光検出プロセスのレベルまたはその両方において生じ得る。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンに対する定量的検査として使用され得、ここで、配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルにおいて生じる。この定量的バージョンでは、ＰＣＲ反応は、具体的な推定メチル化部位とオーバーラップする蛍光プローブの存在下において、偏りのない増幅を提供する。投入ＤＮＡ量に対する偏りのないコントロールは、プライマーもプローブもいずれのＣｐＧジヌクレオチドにも存在しない反応によって提供される。あるいは、ゲノムのメチル化に対する定性的検査が、公知のメチル化部位を「カバー」しないコントロールオリゴヌクレオチド（「ＭＳＰ」法の蛍光に基づくバージョン）または潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドを用いる、偏ったＰＣＲプールのプロービングによって達成される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプロセスは、増幅プロセスにおいて「ＴａｑＭａｎ」プローブを用いて使用され得る。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブを使用して；例えば、偏ったプライマーおよびＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブ、または偏りのないプライマーおよびＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブを用いて、２セットのＰＣＲ反応のうちの１つに供する。そのＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブは、蛍光「レポーター」および「クエンチャー」分子で二重標識されており、ＰＣＲサイクルにおいて、フォワードまたはリバースプライマーより約１０℃高い温度において融解しきるように比較的高ＧＣ含有量の領域に特異的であるように設計されている。これにより、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に完全にハイブリダイズされたままになる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新しい鎖を酵素的に合成するので、最終的には、アニールされたＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブにまで達することになる。次いで、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’へのエンドヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブを消化することによってそのプローブを退去させ、それにより、クエンチされなくなった信号を、リアルタイム蛍光検出システムを使用して定量的に検出するための蛍光レポーター分子が放出される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ．ＴＭ．分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ．ＴＭ．ベースのキットにおいて見られ得るような）としては、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化によって変更されるＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）；ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝剤およびデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられ得るが、それらに限定されない。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の後の単一ヌクレオチドプライマー伸長に基づいて、特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の差異を評価するための定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９−２５３１，１９９７）。簡潔には、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させることにより、５−メチルシトシンは変化しないままで、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換する。次いで、亜硫酸水素塩によって変換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して、所望の標的配列の増幅を行い、得られた生成物を単離し、それを、目的のＣｐＧ部位におけるメチル化分析のための鋳型として使用する。少量のＤＮＡを解析することができ（例えば、顕微解剖された病変切片）、それは、ＣｐＧ部位におけるメチル化状態を測定するための制限酵素の利用を回避する。
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥベースのキットにおいて見られ得るような）は、特定の遺伝子に対するＰＣＲプライマー（またはメチル化によって変更されるＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）；最適化されたＰＣＲ緩衝剤およびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；ポジティブコントロールプライマー；特定の遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応緩衝剤（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応用）；および放射性ヌクレオチドが挙げられ得るが、それらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝剤；スルホン化緩衝剤；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティーカラム）；脱スルホン化緩衝剤；およびＤＮＡ回収構成要素が挙げられ得る。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）は、メチル化感受性制限酵素の使用に依存せずに、ＣｐＧアイランド内のＣｐＧ部位の実質的に任意の群のメチル化状態の評価を可能にする（Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１−９８２６，１９９６；米国特許第５，７８６，１４６号）。簡潔には、ＤＮＡを、メチル化されていない全てのシトシンをウラシルに変換するがメチル化されたシトシンは変換しない亜硫酸水素ナトリウムによって改変し、続いて、メチル化されていない（ｕｍｎｅｔｈｙｌａｔｅｄ）ＤＮＡと対比してメチル化されたＤＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅する。ＭＳＰは、少量のＤＮＡしか要求せず、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化されたアレルに感受性であり、パラフィン包埋サンプルから抽出されたＤＮＡに対して行うことができる。ＭＳＰ分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰベースのキットにおいて見られ得るような）としては、特定の遺伝子（またはメチル化によって変更されるＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）に対するメチル化されたおよびメチル化されていないＰＣＲプライマー、最適化されたＰＣＲ緩衝剤およびデオキシヌクレオチドならびに特定のプローブが挙げられ得るが、それらに限定されない。
ＭＣＡ法は、ゲノムＤＮＡ中の変更されたメチル化パターンについてスクリーニングするためおよびこれらの変化に関連する特定の配列を単離するために使用され得る方法である（Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７−１２，１９９９）。簡潔には、認識部位におけるシトシンのメチル化に対して異なる感度を有する制限酵素を使用することにより、原発腫瘍、細胞株および正常組織由来のゲノムＤＮＡを消化し、その後、任意プライマーで増幅されるＰＣＲ増幅を行う。そのＰＣＲ産物を高分解能ポリアクリルアミドゲルにおいて分割した後、差次的なメチル化を示すフラグメントをクローニングし、シークエンシングする。次いで、クローニングされたフラグメントをサザン分析用のプローブとして使用して、これらの領域の差次的なメチル化を確認する。ＭＣＡ分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭＣＡベースのキットにおいて見られ得るような）としては、ゲノムＤＮＡを任意プライマーで増幅するためのＰＣＲプライマー；ＰＣＲ緩衝剤およびヌクレオチド、制限酵素ならびに適切な緩衝剤；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブ；コントロールハイブリダイゼーションオリゴまたはプローブが挙げられ得るが、それらに限定されない。
メチル化部位を分析するための別の方法は、質量分析を使用するその後のプライマー伸長ジェノタイピング分析のために、増幅された標的を生成する最適化されたＰＣＲ増幅反応を含む、プライマー伸長アッセイである。そのアッセイは、多重でも行うことができる。この方法（特に、この方法が単一ヌクレオチド多型のジェノタイピングに関するとき）は、ＰＣＴ公開ＷＯ０５０１２５７８Ａ１および米国公開ＵＳ２００５００７９５２１Ａ１に詳細に説明されている。メチル化分析の場合、このアッセイは、亜硫酸水素塩によって導入されたメチル化依存的なＣからＴへの配列変化を検出するために採用され得る。これらの方法は、単一のウェルにおいて、多重化された増幅反応および多重化されたプライマー伸長反応（例えば、多重化された均一なプライマー質量伸長（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｒｉｍｅｒ ｍａｓｓ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ｈＭＥ）アッセイ）を行うために特に有用であり、それにより、処理能力はさらに高まり、プライマー伸長反応に対する１反応あたりのコストは下がる。
ＤＮＡメチル化を分析するためのさらなる４つの方法としては、制限ランドマークゲノムスキャニング法（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｌａｎｄｍａｒｋ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＲＬＧＳ，Ｃｏｓｔｅｌｌｏら、２０００）、メチル化感受性表示差異分析（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＭＳ−ＲＤＡ）、メチル化特異的ＡＰ−ＰＣＲ（ＭＳ−ＡＰ−ＰＣＲ）および部分的に融解された分子のメチル−ＣｐＧ結合ドメインカラム／分離（ＭＢＤ／ＳＰＭ）が挙げられる。
本技術と合わせて使用され得るさらなるメチル化分析方法は、以下の論文：Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ３，２５３−２６６（２００３）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｋ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２３：４０７２−４０７９（２００２）−ＰｙｒｏＭｅｔｈ；Ｃｏｌｅｌｌａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００３ Ｊｕｌ；３５（１）：１４６−５０；Ｄｕｐｏｎｔ ＪＭ，Ｔｏｓｔ Ｊ，Ｊａｍｍｅｓ Ｈ，ａｎｄ Ｇｕｔ ＩＧ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｏｃｔ ２００４；３３３（１）：１１９−２７；およびＴｏｏｋｅ Ｎ ａｎｄ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｍ．ＩＶＤＴ．Ｎｏｖ ２００４；４１に記載されている。
核酸の定量化
いくつかの実施形態において、サンプル中の胎児核酸の量が、測定される。いくつかの例において、胎児核酸の量は、本明細書に記載される配列リードカウントの定量化に基づいて測定される。定量化は、具体的なメチル化部位および／または標的部位をカバーする配列リードを直接カウントすることによって、または競合的ＰＣＲ（すなわち、本明細書に記載されるような、既知量の競合因子オリゴヌクレオチドの同時増幅）によって、達成され得る。核酸に関して本明細書において使用される用語「量」とは、絶対量（例えば、コピー数）、相対量（例えば、割合または比）、重量（例えば、グラム）および濃度（例えば、単位体積（例えば、ミリリットル）あたりのグラム；モル濃度単位）を含むがそれらに限定されない任意の適切な測定値のことを指す。
割合の測定
いくつかの実施形態において、割合または比は、別の核酸の量に対する１つの核酸の量として測定され得る。いくつかの実施形態において、サンプル中の核酸の合計量に対するサンプル中の胎児核酸の割合が、測定される。サンプル中の核酸の合計量に対するサンプル中の胎児核酸の割合を計算するために、以下の式が適用され得る：
胎児核酸の割合＝（胎児核酸の量）／［（核酸の合計量）］。
競合因子を使用したコピー数の測定
いくつかの実施形態において、胎児核酸の絶対量（例えば、コピー数）が、測定される。多くの場合、胎児核酸のコピー数は、使用される競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づいて測定される。いくつかの実施形態において、母体核酸のコピー数が、測定される。サンプル中の胎児核酸のコピー数を計算するために、以下の式が適用され得る：
コピー数（胎児核酸）＝［（胎児核酸の量）／（胎児競合因子の量）］×Ｃ
式中、Ｃは、反応に加えられる競合因子オリゴヌクレオチドの数である。いくつかの例において、胎児核酸および胎児競合因子の量は、シークエンシング反応によって生成される読み出し情報において得られる（例えば、配列リードカウント）。
胎児核酸の含有量を測定するさらなる方法
核酸における胎児核酸の量（例えば、濃度、相対量、絶対量、コピー数など）が、いくつかの実施形態において、測定される。いくつかの例において、サンプル中の胎児核酸の量は、「胎児画分」と呼ばれる。特定の実施形態において、胎児核酸の量は、男児胎児に特異的なマーカー（例えば、Ｙ染色体ＳＴＲマーカー（例えば、ＤＹＳ１９、ＤＹＳ３８５、ＤＹＳ３９２マーカー）；ＲｈＤ陰性女性におけるＲｈＤマーカー）、多型配列のアレル比、または胎児核酸に特異的であって母体核酸には特異的でない１つまたは複数のマーカー（例えば、母親と胎児との間で差次的なエピジェネティックな生物学的マーカー（例えば、メチル化；下記でさらに詳細に説明される）または母体血漿中の胎児のＲＮＡマーカー（例えば、Ｌｏ，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３（３）：２９３−２９６）を参照のこと）に従って測定される。
多型に基づく胎児数量アッセイ
胎児核酸の含有量（例えば、胎児画分）の測定は、本明細書に記載されるような多型に基づく胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を用いて行われることもある。このタイプのアッセイは、多型配列（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））のアレル比に基づいて、母体サンプル中の胎児核酸の検出および定量化を可能にする。いくつかの例において、ヌクレオチド配列リードを母体サンプルに対して得て、参照ゲノム中の情報的に有益な多型部位（例えば、ＳＮＰ）に、第１アレルをマッピングするヌクレオチド配列リードの総数と第２アレルをマッピングするヌクレオチド配列リードの総数とを比較することによって、胎児画分を測定する。いくつかの例において、胎児アレルは、例えば、サンプル中の胎児核酸と母体核酸との混合物に対する母体核酸による大きな寄与と比べて、その混合物に対する相対的に小さい寄与によって、同定される。いくつかの例において、胎児アレルは、下記に記載されるような予想されるアレル頻度からのアレル頻度のずれによって同定される。いくつかの例において、母体サンプル中の胎児核酸の相対存在量は、多型部位の２つのアレルの各々に対する、参照ゲノム上の標的核酸配列にマッピングされる独自の配列リードの総数のパラメータとして測定され得る。いくつかの例において、母体サンプル中の胎児核酸の相対存在量は、富化されたサンプルからの各アレルに対する配列リードの相対数のパラメータとして測定され得る。
いくつかの実施形態において、胎児画分の測定は、サンプル核酸を１つまたは複数の多型核酸標的について富化するステップを含む。いくつかの例において、複数の多型標的が、富化される。複数の多型核酸標的は、コレクションまたはパネル（例えば、標的パネル、ＳＮＰパネル、ＳＮＰコレクション）と呼ばれることもある。複数の多型標的は、２つ以上の標的を含み得る。例えば、複数の多型標的は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の標的を含み得る。いくつかの例において、１０個以上の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、５０個以上の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、１００個以上の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、５００個以上の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、約１０〜約５００個の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、約２０〜約４００個の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、約３０〜約２００個の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、約４０〜約１００個の多型核酸標的が、富化される。いくつかの例において、約６０〜約９０個の多型核酸標的が、富化される。例えば、特定の実施形態において、約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０個の多型核酸標的が、富化される。
いくつかの実施形態において、複数の多型核酸標的のうちの少なくとも１つの多型核酸標的が、所与のサンプル中の胎児画分の測定にとって情報的に有益である。胎児画分の測定にとって情報的に有益な多型核酸標的は、情報的に有益な標的、情報的に有益な多型または情報的に有益なＳＮＰと呼ばれることもあり、典型的には、ある態様において胎児と母親との間で異なる。例えば、情報的に有益な標的は、胎児に対して１つのアレルおよび母親に対して異なるアレルを有し得る（例えば、母親は、多型標的にアレルＡを有し、胎児は、多型標的部位にアレルＢを有する）。典型的には、母体アレルのいずれかと異なる胎児アレルは、父性遺伝されている（すなわち、父親由来である）。したがって、母体アレルと異なる父性遺伝されたアレルは、胎児核酸の同定および／または定量化（例えば、胎児画分の測定）にとって有用であり得る。
いくつかの例において、多型核酸標的は、特定の母体／胎児の遺伝子型の組み合わせの状況において情報的に有益である。両アレル多型標的（すなわち、可能性のある２つのアレル（例えば、ＡおよびＢ））について、あり得る母体／胎児の遺伝子型の組み合わせとしては：１）母親ＡＡ、胎児ＡＡ；２）母親ＡＡ、胎児ＡＢ；３）母親ＡＢ、胎児ＡＡ；４）母親ＡＢ、胎児ＡＢ；５）母親ＡＢ；胎児ＢＢ；６）母親ＢＢ、胎児ＡＢ；および７）母親ＢＢ、胎児ＢＢが挙げられる。遺伝子型ＡＡおよびＢＢは、ホモ接合遺伝子型と見なされ、遺伝子型ＡＢは、ヘテロ接合遺伝子型と見なされる。いくつかの例において、情報的に有益な遺伝子型の組み合わせ（すなわち、胎児画分の測定にとって情報的に有益であり得る多型核酸標的に対する遺伝子型の組み合わせ）には、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合である組み合わせ（例えば、母親ＡＡ、胎児ＡＢ；または母親ＢＢ、胎児ＡＢ）が含まれる。そのような遺伝子型の組み合わせは、タイプ１の情報的に有益な遺伝子型または情報的に有益なヘテロ接合体と呼ばれ得る。いくつかの例において、情報的に有益な遺伝子型の組み合わせ（すなわち、胎児画分の測定にとって情報的に有益であり得る多型核酸標的に対する遺伝子型の組み合わせ）には、母親がヘテロ接合であり、胎児がホモ接合である組み合わせ（例えば、母親ＡＢ、胎児ＡＡ；または母親ＡＢ、胎児ＢＢ）が含まれる。そのような遺伝子型の組み合わせは、タイプ２の情報的に有益な遺伝子型または情報的に有益なホモ接合体と呼ばれ得る。いくつかの例において、情報的に有益でない遺伝子型の組み合わせ（すなわち、胎児画分の測定にとって情報的に有益でない可能性がある多型核酸標的に対する遺伝子型の組み合わせ）には、母親がヘテロ接合であり、胎児もヘテロ接合である組み合わせ（例えば、母親ＡＢ、胎児ＡＢ）が含まれる。そのような遺伝子型の組み合わせは、情報的に有益でない遺伝子型または情報的に有益でないヘテロ接合体と呼ばれ得る。いくつかの例において、情報的に有益でない遺伝子型の組み合わせ（すなわち、胎児画分の測定にとって情報的に有益でない可能性がある多型核酸標的に対する遺伝子型の組み合わせ）には、母親がホモ接合であり、胎児もホモ接合である組み合わせ（例えば、母親ＡＡ、胎児ＡＡ；または母親ＢＢ、胎児ＢＢ）が含まれる。そのような遺伝子型の組み合わせは、情報的に有益でない遺伝子型または情報的に有益でないホモ接合体と呼ばれ得る。
いくつかの実施形態において、個々の多型核酸標的および／または多型核酸標的のパネルは、特定の基準、例えば、マイナーアレル集団頻度、変動、変動係数、ＭＡＤ値などに基づいて選択される。いくつかの例において、多型核酸標的は、多型標的のパネル内の少なくとも１つの多型核酸標的が、検査されるサンプルの大部分にとって情報的に有益である高い確率を有するように選択される。さらに、いくつかの例において、多型核酸標的の数（すなわち、パネル中の標的の数）は、少なくとも１つの多型核酸標的が、検査されるサンプルの大部分にとって情報的に有益である高い確率を有するように選択される。例えば、より多い数の多型標的の選択は、一般に、少なくとも１つの多型核酸標的が、検査されるサンプルの大部分にとって情報的に有益であり得る確率を上げる（例えば、図３７を参照のこと）。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数（例えば、富化のために選択される多型標的の数）は、少なくとも約８０％〜約１００％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益である少なくとも約２〜約５０個以上の多型核酸標的をもたらす。例えば、多型核酸標的およびその数は、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益である少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上の多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。いくつかの例において、多型核酸標的およびその数は、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす。
いくつかの実施形態において、個々の多型核酸標的は、マイナーアレル集団頻度に部分的に基づいて選択される。いくつかの例において、約１０％〜約５０％というマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が、選択される。例えば、約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％または４９％というマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が、選択される。いくつかの実施形態において、約４０％以上というマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が、選択される。
いくつかの実施形態において、個々の多型核酸標的および／または多型核酸標的のパネルは、個々の多型標的または多型標的のパネルに対する変動の程度に部分的に基づいて選択される。変動は、いくつかの例において（ｉｎ ｃｏｍｅ ｃａｓｅｓ）、特定の多型標的または多型標的のパネルに特異的であり得、体系的な、実験の、手順のおよびまたは固有のエラーまたは偏り（例えば、サンプリングエラー、シークエンシングエラー、ＰＣＲの偏りなど）に由来し得る。個々の多型標的または多型標的のパネルの変動は、変動を評価するための当技術分野において公知の任意の方法によって測定され得、例えば、変動の計算値、誤差、標準偏差、ｐ値、平均絶対偏差、中央絶対偏差、中央補正偏差（ｍｅｄｉａｎ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）（ＭＡＤスコア）、変動係数（ＣＶ）などで表現され得る。いくつかの実施形態において、特定のＳＮＰに対する測定されたアレル頻度の変動（すなわち、バックグランドアレル頻度）（例えば、ホモ接合のとき）は、約０．００１〜約０．０１（すなわち、０．１％〜約１．０％）であり得る。例えば、測定されたアレル頻度の変動は、約０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８または０．００９であり得る。いくつかの例において、測定されたアレル頻度の変動は、約０．００７である。
いくつかの例において、ノイズの多い（ｎｏｉｓｙ）多型標的は、胎児画分の測定のために選択される多型核酸標的のパネルから除外される。用語「ノイズの多い多型標的」または「ノイズの多いＳＮＰ」とは、（ａ）分析されたときまたはプロットされたとき、データポイント（例えば、測定された胎児画分、測定されたアレル頻度）間に有意な変動を有する標的またはＳＮＰ、（ｂ）有意な標準偏差（例えば、１、２または３標準偏差より大きい）を有する標的またはＳＮＰ、（ｃ）有意な平均値の標準誤差を有する標的またはＳＮＰ、同等物および前述の組み合わせのことを指す。特定の多型標的またはＳＮＰに対するノイズは、出発物質（例えば、核酸サンプル）の量および／または質に起因して生じることもあるし、配列リードを生成するために使用されるＤＮＡを調製するかまたは複製するプロセスの一部として生じることもあるし、シークエンシングプロセスの一部として生じることもある。特定の実施形態において、いくつかの多型標的またはＳＮＰに対するノイズは、ＰＣＲに基づく方法を用いて調製されたときに大きな比率を占める特定の配列に起因する。いくつかの例において、いくつかの多型標的またはＳＮＰに対するノイズは、その部位の１つまたは複数の固有の特性、例えば、多型標的もしくはＳＮＰの周囲のまたは多型標的もしくはＳＮＰに隣接する、特定のヌクレオチド配列および／または塩基組成に起因する。約０．００５以上という測定されたアレル頻度の変動（例えば、ホモ接合のとき）を有するＳＮＰは、ノイズが多いと見なされ得る。例えば、約０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１以上という測定されたアレル頻度の変動を有するＳＮＰは、ノイズが多いと見なされ得る。
いくつかの実施形態において、個々の多型標的または多型標的のパネルの変動は、変動係数（ＣＶ）を使用して表わされ得る。変動係数（すなわち、平均値で除算された標準偏差）は、例えば、母体核酸および胎児核酸を含む単一の母体サンプルのいくつかのアリコートに対して胎児画分を測定し、その胎児画分の平均値および標準偏差を計算することによって、決定され得る。いくつかの例において、個々の多型核酸標的および／または多型核酸標的のパネルは、胎児画分が０．３０以下という変動係数（ＣＶ）で測定されるように選択される。例えば、胎児画分は、いくつかの実施形態において、０．２５、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１以下という変動係数（ＣＶ）で測定され得る。いくつかの例において、胎児画分は、０．２０以下という変動係数（ＣＶ）で測定される。いくつかの例において、胎児画分は、０．１０以下という変動係数（ＣＶ）で測定される。いくつかの例において、胎児画分は、０．０５以下という変動係数（ＣＶ）で測定される。
いくつかの実施形態において、アレル頻度は、サンプル中の多型核酸標的の各々について測定される。これは、アレル頻度の実測値と呼ばれることもある。アレル頻度は、例えば、あるアレル（例えば、アレルＢ）に対する配列リードの数をカウントし、その遺伝子座に対する配列リードの総数（例えば、アレルＢ＋アレルＡ）で除算することによって、決定され得る。いくつかの例において、アレル頻度の平均、平均値または中央値が、決定される。胎児画分は、いくつかの例において、アレル頻度平均値に基づいて測定され得る（例えば、アレル頻度平均値に２を乗算する）。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的が情報的に有益であるか否かの判定は、そのアレル頻度の実測値を固定されたカットオフ頻度と比較することを含む。いくつかの例において、どの多型核酸標的が情報的に有益であるかの判定は、各アレル頻度を１つまたは複数の固定されたカットオフ頻度と比較することによって情報的に有益な遺伝子型を同定することを含む。固定されたカットオフ頻度は、例えば、１つまたは複数の適格データセットに基づく所定の閾値であり得る。いくつかの例において、情報的に有益でない遺伝子型から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、アレル頻度の期待値からのアレル頻度のパーセント（％）シフトとして表現される。一般に、所与のアレル（例えば、アレルＡ）に対するアレル頻度の期待値は、０（ＢＢ遺伝子型の場合）、０．５（ＡＢ遺伝子型の場合）および１．０（ＡＡ遺伝子型の場合）または任意の数値スケールにおける等価な値である。１つまたは複数の固定されたカットオフ頻度を超える、予想されるアレル頻度からのずれは、情報的に有益であると見なされ得る。ずれの程度は、一般に、胎児の画分に比例する（すなわち、アレル頻度の期待値からの大きなずれは、胎児の画分が多いサンプルにおいて観察され得る）。
いくつかの例において、情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約０．５％以上のアレル頻度のシフトである。例えば、固定されたカットオフは、約０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％以上のアレル頻度のシフトであり得る。いくつかの例において、情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約１％以上のアレル頻度のシフトである。いくつかの例において、情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約２％以上のアレル頻度のシフトである。いくつかの実施形態において、情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約１０％以上のアレル頻度のシフトである。例えば、固定されたカットオフは、約１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上のアレル頻度のシフトであり得る。いくつかの例において、情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約２５％以上のアレル頻度のシフトである。いくつかの例において、情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフは、約５０％以上のアレル頻度のシフトである。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的が情報的に有益であるか否かの判定は、その測定されたアレル頻度を標的特異的なカットオフ値と比較することを含む。いくつかの実施形態において、標的特異的なカットオフ頻度は、各多型核酸標的に対して決定される。典型的には、標的特異的なカットオフ頻度は、対応する多型核酸標的に対するアレル頻度の変動に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、個々の多型標的の変動は、例えば、中央絶対偏差（ＭＡＤ）によって表わされ得る。いくつかの例において、各多型核酸標的に対するＭＡＤ値の測定は、独自の（すなわち、標的特異的な）カットオフ値を生成し得る。中央絶対偏差を測定するために、例えば、母体だけの核酸サンプル（例えば、バフィーコートサンプル）の複数の複製物（例えば、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上の複製物）についてアレル頻度の実測値が測定され得る。各複製物における各多型標的は、典型的には、例えば、ＰＣＲエラーおよび／またはシークエンシングエラーに起因するわずかに異なるアレル頻度の実測値を有し得る。アレル頻度値の中央値は、各多型標的に対して同定され得る。残りの複製物に対する中央値からの偏差は、計算することができる（すなわち、アレル頻度の実測値とアレル頻度の中央値との差）。偏差の絶対値（すなわち、負の値は正になる）を得て、その中央絶対偏差を計算することにより、各多型核酸標的に対する中央絶対偏差（ＭＡＤ）が提供される。標的特異的なカットオフは、例えば、ＭＡＤの倍数（例えば、１×ＭＡＤ、２×ＭＡＤ、３×ＭＡＤ、４×ＭＡＤまたは５×ＭＡＤ）として割り当てられ得る。典型的には、より小さい変動を有する多型標的は、より低いＭＡＤを有し、ゆえに、より変動する標的よりも低いカットオフ値を有する。
いくつかの実施形態において、富化は、複数の多型核酸標的の増幅を含む。いくつかの例において、富化は、増幅反応における増幅産物の生成を含む。多型標的の増幅は、核酸を増幅するための、本明細書に記載されるまたは当技術分野において公知の任意の方法（例えば、ＰＣＲ）によって達成され得る。いくつかの例において、増幅反応は、単一の容器（例えば、チューブ、器、プレートのウェル）において行われ、これは、本明細書において、多重化増幅と呼ばれることもある。
いくつかの実施形態において、特定の親の遺伝子型は、多型核酸標的の富化の前に判明している。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する母親の遺伝子型は、富化の前に判明している。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する父親の遺伝子型は、富化の前に判明している。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する母親の遺伝子型および父親の遺伝子型は、富化の前に判明している。いくつかの実施形態において、特定の親の遺伝子型は、多型核酸標的の富化の前に判明していない。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する母親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する父親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。いくつかの例において、１つまたは複数の多型標的に対する母親の遺伝子型および父親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。いくつかの実施形態において、親の遺伝子型は、富化の前に、いずれの多型標的に対しても判明していない。いくつかの例において、各多型標的に対する母親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。いくつかの例において、各多型標的に対する父親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。いくつかの例において、各多型標的に対する母親の遺伝子型および父親の遺伝子型は、富化の前に判明していない。
いくつかの実施形態において、多型核酸標的の各々は、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む。いくつかの実施形態において、ＳＮＰは：ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２、ｒｓ９８５４６２、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される。
いくつかの実施形態において、ＳＮＰは：ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２およびｒｓ９８５４６２から選択される。
いくつかの実施形態において、ＳＮＰは：ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される。
いくつかの実施形態において、ＳＮＰは：ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１０８３９５９８、ｒｓ１０８７５２９５、ｒｓ１２１０２７６０、ｒｓ１２３３５０００、ｒｓ１２３４６７２５、ｒｓ１２５７９０４２、ｒｓ１２５８２５１８、ｒｓ１７１６７５８２、ｒｓ１８５７６７１、ｒｓ２０２７９６３、ｒｓ２０３７９２１、ｒｓ２０７４２９２、ｒｓ２６６２８００、ｒｓ２６８２９２０、ｒｓ２６９５５７２、ｒｓ２７１３５９４、ｒｓ２８３８３６１、ｒｓ３１５１１３、ｒｓ３７３５１１４、ｒｓ３７８４６０７、ｒｓ３８１７、ｒｓ３８５０８９０、ｒｓ３９３４５９１、ｒｓ４０２７３８４、ｒｓ４０５６６７、ｒｓ４２６３６６７、ｒｓ４３２８０３６、ｒｓ４３９９５６５、ｒｓ４７３９２７２、ｒｓ４７５０４９４、ｒｓ４７９０５１９、ｒｓ４８０５４０６、ｒｓ４８１５５３３、ｒｓ４８３０８１、ｒｓ４９４０７９１、ｒｓ４９４８１９６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５８２１１１、ｒｓ５９６８６８、ｒｓ６０１００６３、ｒｓ６０１４６０１、ｒｓ６０５０７９８、ｒｓ６１３１０３０、ｒｓ６３１６９１、ｒｓ６４３９５６３、ｒｓ６５５４１９９、ｒｓ６５８５６７７、ｒｓ６６８２７１７、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７２０１３５、ｒｓ６７２７０５５、ｒｓ６７４４２１９、ｒｓ６７６８２８１、ｒｓ６８１８３６、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４０１４１、ｒｓ６９７４８３４、ｒｓ７１８４６４、ｒｓ７２２２８２９、ｒｓ７３１０９３１、ｒｓ７３２４７８、ｒｓ７４２２５７３、ｒｓ７６３９１４５、ｒｓ７７３８０７３、ｒｓ７８４４９００、ｒｓ７９９７６５６、ｒｓ８０６９６９９、ｒｓ８０７８２２３、ｒｓ８０８０１６７、ｒｓ８１０３７７８、ｒｓ８１２８、ｒｓ８１９１２８８、ｒｓ８８６９８４、ｒｓ８９６５１１、ｒｓ９３１８８５、ｒｓ９４２６８４０、ｒｓ９９２０７１４、ｒｓ９９７６１２３、ｒｓ９９９５５７およびｒｓ９９９７６７４から選択される。
多型標的は、上に列挙された任意の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）およびそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含み得る。ＳＮＰパネルのＳＮＰのサブセットは、１つまたは複数の他のＳＮＰパネルからのＳＮＰの全部もしくはサブセットと組み合され得る。例えば、ある組み合わせは、ＳＮＰパネル１、２および３の各々からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；ＳＮＰパネル１および２からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；ＳＮＰパネル１および３からのＳＮＰの全部もしくはサブセット；またはＳＮＰパネル２および３からのＳＮＰの全部もしくはサブセットを含み得る。
ＳＮＰは、ＳＮＰ選択に対する本明細書に記載される基準のいずれか１つまたは全てを満たす本明細書に提供されるまたは当技術分野において公知の任意のＳＮＰから選択され得る。いくつかの例において、ＳＮＰは、任意の染色体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体、Ｘおよび／またはＹ染色体）上に位置し得る。いくつかの例において、ＳＮＰは、常染色体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体）に位置し得、かつＸ染色体またはＹ染色体上には位置し得ない。いくつかの例において、ＳＮＰは、特定の常染色体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１９、２０、２２番染色体であって、１３、１８または２２番染色体でない）上に位置し得る。いくつかの例において、ＳＮＰは、遺伝的変異（例えば、異数性）を有すると疑われる特定の染色体、例えば、１３、１８、２１番染色体、Ｘおよび／またはＹ染色体（すなわち、被験染色体）上に位置し得る。いくつかの例において、ＳＮＰは、参照染色体上に位置する。いくつかの例において、胎児画分および遺伝的変異（例えば、異数性）の有無は、本明細書に提供される方法を用いて同時に調べられる。
いくつかの実施形態において、富化される（例えば、増幅される）多型核酸標的は、シークエンシングプロセスによってシークエンシングされる。いくつかの例において、シークエンシングプロセスは、本明細書に記載されるような合成方法によるシークエンシングである。典型的には、合成方法によるシークエンシングは、複数の合成サイクルを含み、ここで、各サイクル中に、相補的なヌクレオチドが一本鎖鋳型に付加され、同定される。サイクル数は、一般に、リード長に対応する。いくつかの例において、多型標的は、増幅プライマー配列および多型標的部位（例えば、ＳＮＰ）をリードの中に含めるために最短のリード長（すなわち、最小のサイクル数）が必要とされるように選択される。いくつかの例において、増幅プライマー配列は、約１０〜約３０ヌクレオチドを含む。例えば、増幅プライマー配列は、いくつかの実施形態において、約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、増幅プライマー配列は、約２０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＳＮＰ部位は、増幅プライマーの３’末端から１ヌクレオチド塩基の（すなわち、３’末端に隣接した）位置〜約３０塩基の位置以内に存在する。例えば、ＳＮＰ部位は、増幅プライマーの末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチド以内に存在し得る。リード長は、増幅プライマー配列および多型配列または多型位置を含む任意の長さであり得る。いくつかの実施形態において、リード長は、約１０ヌクレオチド長〜約５０ヌクレオチド長であり得る。例えば、リード長は、約１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０または４５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例において、リード長は、約３６ヌクレオチドである。いくつかの例において、リード長は、約２７ヌクレオチドである。したがって、いくつかの例において、合成方法によるシークエンシングは、約３６サイクルを含み、約２７サイクルを含むこともある。
いくつかの実施形態において、複数のサンプルが、単一のコンパートメント（例えば、フローセル）においてシークエンシングされ、これは、本明細書においてサンプル多重化と呼ばれることもある。したがって、いくつかの実施形態において、胎児画分は、複数のサンプルに対して、多重化されたアッセイにおいて測定される。例えば、胎児画分は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００以上のサンプルに対して測定され得る。いくつかの例において、胎児画分は、約１０以上のサンプルに対して測定される。いくつかの例において、胎児画分は、約１００以上のサンプルに対して測定される。いくつかの例において、胎児画分は、約１０００以上のサンプルに対して測定される。
メチル化に基づく胎児数量アッセイ
胎児核酸の含有量（例えば、胎児画分）の測定は、本明細書、および例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開番号２０１０／０１０５０４９に記載されているような、メチル化に基づく胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を用いて行われることもある。このタイプのアッセイでは、サンプル中の核酸のメチル化状態に基づいて、母体サンプル中の胎児核酸の検出および定量化が可能である。いくつかの例において、母体サンプル由来の胎児核酸の量は、存在する核酸の合計量と比較して測定され、それにより、サンプル中の胎児核酸のパーセンテージが提供され得る。いくつかの例において、母体サンプル中の胎児核酸のコピー数が、測定され得る。いくつかの例において、胎児核酸の量は、配列特異的（または遺伝子座特異的）様式で、かつ時折、正確な染色体量決定分析（例えば、胎児の異数性の有無の検出）が可能であるのに十分な感度で、測定され得る。
胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を、本明細書に記載の方法のいずれかと合わせて行うことができる。このようなアッセイを、当技術分野において公知の、ならびに／または本明細書および米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号に記載の任意の方法、例えば、異なるメチル化状態に基づき、母体および胎児のＤＮＡ間を区別し、胎児のＤＮＡを定量化（すなわち、量を決定）することができる方法などにより行うことができる。メチル化状態に基づく核酸を鑑別するための方法は、例えば、ＭＢＤ２のメチル結合ドメインが抗体のＦｃフラグメントに融合されるＭＢＤ２−Ｆｃフラグメント（ＭＢＤ−ＦＣ）を使用するメチル化感受性捕捉（Ｇｅｂｈａｒｄら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６（１２）：６１１８−２８）；メチル化特異的抗体；亜硫酸水素変換法、例えば、ＭＳＰ（メチル化感受性ＰＣＲ）、ＣＯＢＲＡ、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）またはＳｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標）技術；およびメチル化感受性制限酵素（例えば、１つまたはそれより多いメチル化感受性制限酵素を使用する母体サンプルの母体のＤＮＡの消化により胎児のＤＮＡを富化）の使用を含むがそれらに限定されない。また、メチル感受性酵素を使用し、メチル化状態に基づき核酸を鑑別することができ、例えば、これは、ＤＮＡ認識配列がメチル化されない場合、この配列にて優先的にまたは実質的に切断または消化することができる。したがって、メチル化されていないＤＮＡサンプルを、メチル化されたＤＮＡサンプルより小さいフラグメントに切断し、高メチル化されたＤＮＡサンプルを切断しない。明記される場合を除き、メチル化状態に基づき核酸を鑑別するための任意の方法を本明細書における組成物および技術の方法とともに使用することができる。胎児のＤＮＡ量を、例えば、増幅反応中に既知の濃度にて１つまたはそれより多い競合因子を導入することにより決定することができる。胎児のＤＮＡ量の決定はまた、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸長、シークエンシングおよび／またはカウントによりなされ得る。特定の例において、核酸量を、米国特許出願公開第２００７／００６５８２３号に記載のＢＥＡＭ技術（ＢＥＡＭｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して決定することができる。いくつかの例において、制限効果を決定することができ、効果の割合を使用し、胎児のＤＮＡ量をさらに決定する。
いくつかの例において、胎児数量アッセイ（ＦＱＡ）を使用し、母体サンプルの胎児のＤＮＡ濃度を、例えば、以下の方法により決定することができる：ａ）母体サンプルに存在するＤＮＡ合計量を決定し、ｂ）１つまたはそれより多いメチル化感受性制限酵素を使用して、母体サンプルの母体のＤＮＡを選択的に消化し、それにより胎児のＤＮＡを富化し、ｃ）ステップｂ）から胎児のＤＮＡ量を決定し、ｄ）ステップｃ）からの胎児のＤＮＡ量とステップａ）からのＤＮＡ合計量を比較し、それにより母体サンプルの胎児のＤＮＡ濃度を決定する。いくつかの例において、母体サンプルの胎児の核酸の絶対コピー数を、例えば、質量分析および／または絶対コピー数測定のための競合的ＰＣＲ法を使用する系を使用して決定することができる。例えば、Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：３０５９−３０６４、および米国特許出願公開第２００４／００８１９９３号（ともに参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
他の方法と合わせた胎児核酸含有量の測定
細胞外核酸中の胎児核酸の量（例えば、胎児画分）は、遺伝的変異（例えば、胎児の異数性、胎児の性別）を評価する他の方法と合わせて、定量化され得、使用され得る。したがって、特定の実施形態において、遺伝的変異の有無を判定する方法は、例えば、胎児核酸の量を測定するさらなるステップを含む。胎児核酸の量は、サンプル核酸を調製する処理の前または後に、被験体由来の核酸サンプルにおいて測定され得る。特定の実施形態において、胎児核酸の量は、サンプル核酸を処理し、調製した後のサンプルにおいて測定され、その量は、さらなる評価のために利用される。いくつかの実施形態において、アウトカムは、サンプル核酸中の胎児核酸の画分の解析（ｆａｃｔｏｒｉｎｇ）を含む（例えば、カウントを調節すること、サンプルを除去すること、コールを生成することまたはコールを生成しないこと）。
胎児核酸の含有量（例えば、胎児画分）の測定は、遺伝的変異を評価する方法（例えば、異数性の検出、胎児の性別の判定）の前、その方法の最中、その方法における任意の１つの時点、またはそのような方法の後に行われ得る。例えば、所与の感度または特異性で胎児の性別または異数性の判定方法を行うために、胎児核酸を定量化する方法は、胎児の性別または異数性の判定の前、判定中、または判定の後に実行されることにより、約２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％，１５％，１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％超またはそれ以上の胎児核酸を有するサンプルが同定され得る。いくつかの実施形態において、特定の閾値量の胎児核酸（例えば、約１５％以上の胎児核酸；約４％以上の胎児核酸）を有すると測定されたサンプルは、例えば、胎児の性別もしくは異数性の判定、または異数性の有無もしくは遺伝的変異について、さらに分析される。特定の実施形態において、例えば、胎児の性別または異数性の有無の判定は、特定の閾値量の胎児核酸（例えば、約１５％以上の胎児核酸；約４％以上の胎児核酸）を有するサンプルの場合のみ、選択される（例えば、選択され、患者に伝えられる）。
核酸の亜集団について富化するためのさらなる方法
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、細胞外核酸）を核酸の亜集団または種において富化または相対的に富化する。核酸の亜集団は、例えば、胎児の核酸、母体の核酸、特定の長さまたは長さの範囲のフラグメントを含む核酸、あるいは特定のゲノム領域からの核酸（例えば、１本鎖の染色体、染色体のセット、および／または特定の染色体領域）を含むことができる。このような富化されたサンプルを、本明細書において提供される方法と合わせて使用することができる。したがって、特定の実施形態において、本明細書中の技術の方法は、サンプルの核酸の亜集団、例えば、胎児の核酸などにおいて富化するさらなるステップを含む。いくつかの例において、上記の胎児画分を決定する方法を使用し、胎児の核酸を富化することができる。特定の実施形態において、母体の核酸を、サンプルから選択的に（部分的に、実質的に、ほぼ完全にまたは完全に）除去する。いくつかの例において、特定の低コピー数の種の核酸（例えば、胎児の核酸）における富化は、定量的感度を改善し得る。特定の種の核酸におけるサンプルを富化するための方法は、本明細書に、および例えば、米国特許第６，９２７，０２８号、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４０４１７号、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４７０６３号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０３２７７９号、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０３２７８１号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１０／０３３６３９号、国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／０３４６３１号、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０５６４８０号、および国際特許出願公開第ＷＯ２０１１／１４３６５９号（これら全てを参照により本明細書に組み込む）に記載される。
いくつかの実施形態において、核酸を、特定の標的フラグメント種および／または参照フラグメント種において富化する。いくつかの例において、核酸を、以下に記載の１つまたはそれより多い長さに基づいた分離方法を使用して、特定の核酸フラグメント長またはフラグメント長の範囲において富化する。いくつかの例において、核酸を、本明細書に記載のおよび／または当技術分野において公知の１つまたはそれより多い配列に基づいた分離方法を使用して、選択ゲノム領域（例えば、染色体）からのフラグメントにおいて富化する。サンプルの核酸亜集団（例えば、胎児の核酸）において富化するための特定の方法を、以下に詳細に記載する。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる核酸亜集団（例えば、胎児の核酸）において富化するためのいくつかの方法は、母体および胎児の核酸間のエピジェネティックな差を利用する方法を含む。例えば、胎児の核酸を、メチル化の差に基づき、母体の核酸から鑑別し、かつ分離することができる。メチル化に基づいた胎児の核酸富化方法は、本明細書および例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１０５０４９号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。このような方法は、サンプル核酸を、メチル化特異的結合剤（メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭＢＤ）、メチル化特異的抗体など）と結合させ、差次的メチル化状態に基づき、結合していない核酸から結合した核酸を分離することを含むこともある。このような方法はまた、メチル化感受性制限酵素（上記に記載、例えばＨｈａＩおよびＨｐａＩＩ）の使用を含むことができ、これは、少なくとも１つの胎児の核酸領域についてサンプルを富化するために母体の核酸を選択的に、および完全に、または実質的に消化する酵素を用いて、母体サンプルからの核酸を選択的に消化することにより母体サンプルの胎児の核酸領域を富化することを可能にする。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる核酸亜集団（例えば、胎児の核酸）について富化するための別の方法は、制限エンドヌクレアーゼを富化した多型配列法、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３１７８１８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法である。このような方法は、非標的アレルを含むが、標的アレルを含まない核酸を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いた、非標的アレルを含む核酸の切断、および切断されていない核酸を増幅するが、切断した核酸を増幅しないことを含み、この場合、切断されていない、増幅された核酸は、非標的核酸（例えば、母体の核酸）に対して標的核酸（例えば、胎児の核酸）の富化を表す。いくつかの例において、核酸を、例えば、切断剤による選択的消化に感受性の多型部位を有するアレルを含むように選択し得る。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる核酸亜集団（例えば、胎児の核酸）について富化するためのいくつかの方法は、選択的酵素による分解法を含む。このような方法は、エキソヌクレアーゼ消化から標的配列を保護し、それにより所望でない配列（例えば、母体のＤＮＡ）のサンプル中での排除を容易にすることを含む。例えば、一方法において、サンプル核酸を変性させ、１本鎖核酸を生成し、１本鎖核酸を、適切なアニーリング条件下において、少なくとも１つの標的特異的プライマー対と接触させ、アニーリングしたプライマーを、ヌクレオチド重合により伸長して２本鎖標的配列を生成し、１本鎖（すなわち、非標的）核酸を消化するヌクレアーゼを使用して、１本鎖核酸を消化する。いくつかの例において、本方法を少なくともさらに１サイクル繰り返すことができる。いくつかの例において、同じ標的特異的プライマー対を使用して、第１および第２の伸長サイクルのそれぞれをプライムし、いくつかの例において、異なる標的特異的プライマー対を第１および第２のサイクルに使用する。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる核酸亜集団（例えば、胎児の核酸）について富化するためのいくつかの方法は、大規模並列シグネチャーシークエンシング（ＭＰＳＳ）法を含む。ＭＰＳＳは典型的に、アダプター（すなわち、タグ）ライゲーションを使用した後、アダプター復号し、少量の増分の核酸配列を読み取る固相方法である。タグ付けされたＰＣＲ生成物は、典型的に、各核酸が独自のタグを含むＰＣＲ生成物を生成するように増幅される。多くの場合、タグを使用し、ＰＣＲ生成物をマイクロビーズに結合させる。数ラウンドのライゲーションに基づいたシークエンシングの後、例えば、配列シグネチャーを、各ビーズから同定することができる。ＭＰＳＳデータセットの各シグネチャー配列（ＭＰＳＳタグ）を分析し、全ての他のシグネチャーと比較し、全ての同一のシグネチャーをカウントする。
いくつかの例において、特定のＭＰＳＳに基づいた富化方法は、増幅（例えば、ＰＣＲ）に基づいた方法を含むことができる。いくつかの例において、遺伝子座特異的増幅方法を使用することができる（例えば、遺伝子座特異的増幅プライマーを使用する）。いくつかの例において、マルチプレックスＳＮＰアレルＰＣＲ法を使用することができる。いくつかの例において、マルチプレックスＳＮＰアレルＰＣＲ法をユニプレックスシークエンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、このような方法は、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ系）の使用および捕捉プローブ配列をアンプリコンに組み込んだ後に、例えば、イルミナＭＰＳＳ系を使用して、シークエンシングすることを含むことができる。いくつかの例において、マルチプレックスＳＮＰアレルＰＣＲ法を、３プライマー系およびインデックスシークエンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、このような方法は、特定の遺伝子座特異的フォワードＰＣＲプライマーに組み込まれた第１の捕捉キャプチャープローブおよび遺伝子座特異的リバースＰＣＲプライマーに組み込まれたアダプター配列を有するプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ系）を使用し、それによりアンプリコンを生成した後、例えば、イルミナＭＰＳＳ系を使用して、シークエンシング用にリバース捕捉配列および分子インデックスバーコードを組み込む二次ＰＣＲを行うことを含むことができる。いくつかの例において、マルチプレックスＳＮＰアレルＰＣＲ法を、４つのプライマー系およびインデックスシークエンシングと組み合わせて使用することができる。例えば、このような方法は、遺伝子座特異的フォワードおよび遺伝子座特異的リバースＰＣＲプライマーの両方に組み込まれたアダプター配列を有するプライマーを用いるマルチプレックスＰＣＲ（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ系）を使用後、例えば、イルミナＭＰＳＳ系を使用して、シークエンシング用に、フォワードおよびリバース捕捉配列および分子インデックスバーコードを組み込む二次ＰＣＲを行うことを含むことができる。いくつかの例において、マイクロフルイディクス法を使用することができる。いくつかの例において、アレイに基づいたマイクロフルイディクス法を使用することができる。例えば、このような方法は、低多重化での増幅およびインデックスおよび捕捉プローブの組み込み用の、マイクロ流体アレイ（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）の使用後、シークエンシングを行うことを含み得る。いくつかの例において、エマルジョンマイクロフルイディクス法、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲなどを使用することができる。
いくつかの例において、ユニバーサル増幅法を使用することができる（例えば、ユニバーサルまたは非遺伝子座特異的増幅プライマーを使用する）。いくつかの例において、ユニバーサル増幅法を、プルダウン法と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、方法は、ユニバーサルに増幅されたシークエンシングライブラリからのビオチン化されたウルトラマープルダウン（例えば、ＡｇｉｌｅｎｔまたはＩＤＴからのビオチン化プルダウンアッセイ）を含むことができる。例えば、このような方法は、標準的なライブラリの調製、プルダウンアッセイにより選択された領域の富化および二次的ユニバーサル増幅ステップを含むことができる。いくつかの例において、プルダウン法を、ライゲーションに基づいた方法と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、方法は、配列特異的アダプターライゲーション（例えば、ＨＡＬＯＰＬＥＸ ＰＣＲ、Ｈａｌｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いたビオチン化ウルトラマープルダウンを含むことができる。例えば、このような方法は、制限酵素により消化されるフラグメントを捕捉するセレクタープローブを使用した後、捕捉した生成物をアダプターにライゲーションし、ユニバーサル増幅した後、シークエンシングを行うことを含み得る。いくつかの例において、プルダウン法を、伸長およびライゲーションに基づいた方法と組み合わせて使用することができる。いくつかの例において、方法は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）の伸長およびライゲーションを含むことができる。例えば、このような方法は、配列アダプターと組み合わせた分子反転プローブを使用した後、ユニバーサル増幅およびシークエンシングを行うことを含むことができる。いくつかの例において、相補的ＤＮＡを増幅することなく合成し、シークエンシングすることができる。
いくつかの例において、伸長およびライゲーション法を、プルダウン構成要素を用いずに行うことができる。いくつかの例において、方法は、遺伝子座特異的フォワードおよびリバースプライマーハイブリダイゼーション、伸長およびライゲーションを含むことができる。このような方法はさらに、ユニバーサル増幅または増幅することなく相補的ＤＮＡ合成した後、シークエンシングすることを含むことができる。いくつかの例において、このような方法は、分析中、バックグランド配列を減少または除外することができる。
いくつかの例において、プルダウン法を、最適増幅構成要素を用いて、または増幅構成要素を用いずに使用することができる。いくつかの例において、方法は、改変プルダウンアッセイおよびユニバーサル増幅することなく、捕捉プローブを十分に組み込んだライゲーションを含むことができる。例えば、このような方法は、制限酵素により消化したフラグメントを捕捉する改変セレクタープローブを使用した後、捕捉した生成物をアダプターにライゲーションし、任意選択の増幅、およびシークエンシングすることを含むことができる。いくつかの例において、方法は、環状１本鎖ライゲーションと組み合わせたアダプター配列の伸長およびライゲーションを用いたビオチン化プルダウンアッセイを含むことができる。例えば、このような方法は、目的の領域（すなわち、標的配列）を捕捉するセレクタープローブの使用、プローブの伸長、アダプターライゲーション、１本鎖環状ライゲーション、任意選択の増幅およびシークエンシングすることを含み得る。いくつかの例において、シークエンシングの結果の分析により、バックグランドから（ｆｏｒｍ）標的配列を分離することができる。
いくつかの実施形態において、核酸を、本明細書に記載の１つまたはそれより多い配列に基づく分離方法を使用して選択ゲノム領域（例えば、染色体）からのフラグメントについて富化する。配列に基づく分離は一般に、目的のフラグメント（例えば、標的および／または参照フラグメント）に存在し、サンプルの他のフラグメントに実質的に存在せず、またはごくわずかな量の他のフラグメント（例えば、５％以下）に存在するヌクレオチド配列に基づく。いくつかの実施形態において、配列に基づく分離により、分離した標的フラグメントおよび／または分離した参照フラグメントを生成することができる。分離した標的フラグメントおよび／または分離した参照フラグメントは、典型的に核酸サンプルの残りのフラグメントから離して単離される。いくつかの例において、分離された標的フラグメントおよび分離された参照フラグメントも、互いに離して単離される（例えば、個別のアッセイコンパートメントにおいて単離する）。いくつかの例において、分離された標的フラグメントおよび分離された参照フラグメントをともに単離する（例えば、同じアッセイコンパートメントにおいて単離する）。いくつかの実施形態において、結合されていないフラグメントを、区別して除去し、もしくは分解し、または消化することができる。
いくつかの実施形態において、選択性核酸捕捉プロセスを使用し、核酸サンプルから離して標的および／または参照フラグメントを分離する。市販の核酸捕捉系は、例えば、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉系（Ｒｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；イルミナＢＥＡＤＡＲＲＡＹプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；および関連のプラットフォームを含む。このような方法は典型的に、捕捉オリゴヌクレオチドを、標的または参照フラグメントのヌクレオチド配列の部分または全てにハイブリダイゼーションすることを含み、固相（例えば、固相アレイ）および／または溶液系プラットフォームの使用を含むことができる。捕捉オリゴヌクレオチド（“エサ”と呼ばれることもある）を、選択されたゲノム領域または遺伝子座（例えば、第２１番染色体、第１８番染色体、第１３番染色体、Ｘ染色体もしくはＹ染色体または参照染色体の１つ）からの核酸フラグメントを優先してハイブリダイズするように選択または設計することができる。
いくつかの実施形態において、核酸を、特定の核酸フラグメント長、長さの範囲、または１つまたはそれより多い長さに基づく分離方法を使用して特定の閾値またはカットオフ以下または以上の長さにおいて富化する。核酸フラグメント長は典型的に、フラグメントのヌクレオチドの数を指す。核酸フラグメント長も、核酸フラグメントのサイズを指すこともある。いくつかの実施形態において、長さに基づく分離方法を、個々のフラグメントの長さを測定することなく行う。いくつかの実施形態において、長さに基づく分離方法を、個々のフラグメントの長さを決定する方法と合わせて行う。いくつかの例において、長さに基づく分離は、断片化されたプールの全てまたは一部を単離（例えば、保持）し、かつ／または分析することができるサイズ分別法を指す。サイズ分別法は、当技術分野において公知である（例えば、アレイの分離、分子篩による分離、ゲル電気泳動による分離、カラムクロマトグラフィーによる分離（例えば、サイズ排除カラム）およびマイクロフルイディクスに基づく方法）。いくつかの実施形態において、長さに基づいた分離方法は、フラグメント環状化、化学処理、（例えば、ホルムアルデヒド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、質量分析法および／またはサイズ特異的核酸増幅などを含むことができる。
本明細書に記載される方法とともに使用され得る、長さに基づく特定の分離方法は、例えば、選択的配列タグ付け法を使用する。そのような方法では、長い核酸および短い核酸を含むサンプルにおいて、フラグメントサイズ種（例えば、短いフラグメント）の核酸を選択的にタグ付けする。そのような方法は、典型的には、内側のプライマーおよび外側のプライマーを含むネステッドプライマーのセットを使用する核酸増幅反応を行うステップを含む。いくつかの例において、内側の一方または両方をタグ付けすることにより、標的増幅産物上にタグを導入することができる。外側のプライマーは、通常、（内側の）標的配列を有する短いフラグメントにアニールしない。内側のプライマーは、短いフラグメントにアニールすることができ、タグおよび標的配列を有する増幅産物を生成することができる。典型的には、長いフラグメントのタグ付けは、例えば、事前のアニーリングによる内側のプライマーの伸長の阻止および外側のプライマーの伸長を含むメカニズムの組み合わせによって、阻害される。タグ付けされたフラグメントの富化は、例えば、一本鎖核酸のエキソヌクレアーゼ消化および少なくとも１つのタグに特異的な増幅プライマーを使用するタグ付けされたフラグメントの増幅を含む、種々の方法のうちのいずれかによって達成され得る。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる別の長さに基づいた分離方法は、核酸サンプルに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿を行うことを含む。方法の例として、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／１４０４１７号およびＷＯ２０１０／１１５０１６号に記載のものを含む。この方法は一般に、実質的に小さい（例えば、３００ヌクレオチド未満の）核酸を沈殿することなく、実質的に大きい核酸を沈殿させるのに十分な条件下において、１つまたはそれより多い一価の塩の存在下において、核酸サンプルとＰＥＧとを接触させることを必要とする。
本明細書に記載の方法とともに使用することができる別のサイズに基づいた富化方法は、例えば、ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用する、ライゲーションによる環状化を含む。短い核酸フラグメントは典型的に、長いフラグメントより高い効率で環状化することができる。非環状化配列を、環状化配列から分離し、富化された短いフラグメントをさらなる分析に使用することができる。
核酸の増幅および検出
メチル化差次的様式で核酸を分離した後、核酸は、増幅され得、かつ／または検出プロセス（例えば、配列に基づく分析、質量分析）に供され得る。さらに、胎児起源の１つの具体的なゲノム配列が、母体の対応物と比べて高メチル化されているかまたは低メチル化されていることが判明したら、この胎児ゲノム配列の量が測定され得る。続いて、この量は、標準コントロール値と比較され得、それは、特定の妊娠関連障害の可能性についての指標として機能し得る。
ヌクレオチド配列、または増幅された核酸配列、または前述のものから調製される検出可能な産物は、適切な検出プロセスによって検出され得る。検出、定量化、シークエンシングなどの方法の非限定的な例としては、質量が改変されたアンプリコンの質量検出（例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析およびエレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析）、プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（商標）；Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．）、ダイレクトＤＮＡシークエンシング、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによる分子反転プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ）（ＭＩＰ）技術、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ分析）、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、パイロシークエンシング分析、アシクロプライム分析、リバースドットブロット、遺伝子チップマイクロアレイ、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックト核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレート色素、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰ ｓｔｒｅａｍ、遺伝的ビット分析（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシークエンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ化プライマー伸長（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア、鋳型特異的取り込み（ＴＤＩ）、蛍光偏光、比色オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パドロックプローブ、インベーダーアッセイ、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識されたプローブを使用するハイブリダイゼーション、クローニングおよびシークエンシング、電気泳動、ハイブリダイゼーションプローブおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）の使用、デジタルＰＣＲ、ナノポアシークエンシング、チップならびにそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、増幅された各核酸種の量は、質量分析、プライマー伸長、シークエンシング（例えば、任意の適切な方法、例えば、ナノポアまたはパイロシークエンシング）、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲまたはＱＲＴ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、それらの組み合わせなどによって測定される。
核酸の検出および／または定量化には、例えば、ＰＣＲ中もしくはＰＣＲ後に組み込まれた蛍光標識による、蛍光標識された核酸の固体支持体アレイに基づく検出、溶液中の蛍光標識されたもしくは固相上に捕捉された分子の単一分子検出、あるいは他のシークエンシング技術、例えば、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴもしくはＭＩＳＥＱプラットフォームを使用するシークエンシング、または例えば、ＰＡＣＢＩＯシークエンサー、ＨＥＬＩＣＯＳシークエンサーなどの装置もしくはナノポアシークエンシング技術を使用する単一分子シークエンシング技術も含まれ得る。
いくつかの例において、ヌクレオチド配列または増幅された核酸配列または前述のものから調製される検出可能な産物は、シークエンシングプロセス（例えば、本明細書に記載されるシークエンシングプロセス）を用いて検出される。シークエンシング検出プロセスを含む方法によってもたらされる核酸の定量化は、異なる検出プロセスを含む方法（例えば、質量分析）によってもたらされる核酸の定量化と比較され得る。そのような比較は、２つの結果（例えば、核酸の定量化）の間の相関関係の尺度であるＲ２値を用いて表現され得る。いくつかの例において、核酸の定量化（例えば、胎児のコピー数の定量化）は、異なる検出プロセス（例えば、シークエンシングおよび質量分析）を用いてもたらされる定量化に対して非常に相関する（すなわち、高いＲ２値を有する）。いくつかの例において、異なる検出プロセスを用いてもたらされる核酸の定量化に対するＲ２値は、約０．９０〜約１．０であり得る。例えば、Ｒ２値は、約０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８または０．９９であり得る。
ヌクレオチド配列の増幅
多くの例において、当技術分野において周知のいくつかの核酸増幅法（上に列挙したものおよび以下でさらに詳細に記載されるもの）のうちのいずれかを用いて本明細書における技術の核酸配列を増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列に相補的な配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成である。核酸増幅は、サンプル中に存在する標的配列の量が非常に少ないときに特に有用である。目的の生物またはウイルスに属するサンプル中の核酸の検出をより確実にするためにアッセイの開始時にはより少ない標的配列が必要とされるので、このアッセイの感度は、標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによって、大幅に改善され得る。
種々のポリヌクレオチド増幅法が、十分に確立されており、頻繁に研究において用いられている。例えば、ポリヌクレオチド配列増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の一般的な方法は、当技術分野において周知であるので、本明細書において詳細に記載しない。ＰＣＲの方法、プロトコルおよびプライマーを設計する際の原理の概説については、例えば、Ｉｎｎｉｓら、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．，１９９０を参照のこと。ＰＣＲの試薬およびプロトコルは、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓなどの商業的供給業者からも入手可能である。
ＰＣＲは、最も一般的には、熱安定酵素を用いて、自動化されたプロセスとして行われる。このプロセスでは、反応混合物の温度は、変性領域、プライマーアニーリング領域および伸長反応領域を自動的に繰り返す。この目的のために特別に適合された機械が市販されている。
ポリヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅は、典型的には、本技術の実施において使用されるが、当業者は、母体の血液サンプル中に見られるゲノム配列の増幅が、任意の公知の方法（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介性の増幅および自家持続配列複製または核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）（これらの各々は、十分な増幅をもたらす））によって達成され得ることを認識するだろう。最近開発された分岐ＤＮＡ技術もまた、具体的なメチル化パターンである本明細書における技術の具体的なゲノム配列の存在を定性的に証明するため、または母体血液中のこの具体的なゲノム配列の量を定量的に測定するために使用され得る。臨床サンプル中の核酸配列を直接定量化するための分岐ＤＮＡ信号増幅の概説については、Ｎｏｌｔｅ，Ａｄｖ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：２０１−２３５，１９９８を参照のこと。
本明細書における技術の組成物およびプロセスは、デジタルＰＣＲを用いて実施されるときも、特に有用である。デジタルＰＣＲは、Ｋａｌｉｎｉｎａおよび共同研究者らによって初めて開発され（Ｋａｌｉｎｉｎａら、“Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｓｃａｌｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９−２００４，（１９９７））、さらにＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒによって発展された（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６；９２３６−４１，（１９９９））。胎児診断法とともに使用するためのデジタルＰＣＲの適用は、Ｃａｎｔｏｒらによって初めて報告され（ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０５０２３０９１Ａ２）、続いてＱｕａｋｅらによって報告された（米国特許公開番号ＵＳ２００７０２０２５２５）（両方ともが参照により本明細書に組み込まれる）。デジタルＰＣＲは、単一分子レベルにおける核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）増幅を活用し、低コピー数の核酸を定量化するための高感度の方法を提供する。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、核酸のデジタル分析のためのシステムを提供している。
用語「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙ）」、「増幅」、「増幅反応」または「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」とは、核酸のコピー数を増大させる任意のインビトロプロセスのことを指す。増幅とは、核酸の「指数関数的な」増加のことを指すこともある。しかしながら、本明細書において使用される「増幅する（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」とは、選択核酸の数の線形の増加のことも指し得るが、１回限りの単一のプライマー伸長ステップとは異なる。いくつかの実施形態において、プレ増幅としても知られる限定された増幅反応が行われ得る。プレ増幅は、少ないサイクル数、例えば、１０サイクルを行うことに起因して、有限量の増幅を行う方法である。プレ増幅は、いくらかの増幅を可能にし得るが、指数関数期の前に増幅を停止し、典型的には、約５００コピーの所望のヌクレオチド配列を生成する。プレ増幅の使用は、例えば、標準的なＰＣＲ反応において反応体の枯渇に伴う誤りも制限し得るし、ヌクレオチド配列または大量の核酸に起因する増幅の偏りも減少させ得る。いくつかの実施形態において、１回限りのプライマー伸長が、線形のまたは指数関数的な増幅に対する前置きとして行われ得る。
任意の適切な増幅技術が、利用され得る。ポリヌクレオチドの増幅としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ライゲーション増幅（またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））；Ｑ−ベータレプリカーゼまたは鋳型依存性ポリメラーゼの使用に基づく増幅方法（米国特許公開番号ＵＳ２００５０２８７５９２を参照のこと）；ヘリカーゼ依存性等温増幅（Ｖｉｎｃｅｎｔら、“Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ ５（８）：７９５−８００（２００４））；鎖置換増幅（ＳＤＡ）；好熱性ＳＤＡ核酸配列ベース増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）および転写関連増幅（ＴＡＡ）が挙げられるが、それらに限定されない。ＰＣＲ増幅法の非限定的な例としては、標準的なＰＣＲ、ＡＦＬＰ−ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、Ａｌｕ−ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、コロニーＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ（ＩＰＣＲ）、インサイチュＰＣＲ（ＩＳＨ）、配列間特異的（Ｉｎｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＰＣＲ（ＩＳＳＲ−ＰＣＲ）、ロングＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、単一細胞ＰＣＲ、固相ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、それらの組み合わせなどが挙げられる。例えば、増幅は、特定の実施形態において、デジタルＰＣＲを用いて達成され得る（例えば、Ｋａｌｉｎｉｎａら、“Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｓｃａｌｅ ＰＣＲ ｗｉｔｈ ＴａｑＭａｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９−２００４，（１９９７）；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６；９２３６−４１，（１９９９）；ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ０５０２３０９１Ａ２；米国特許公開番号ＵＳ２００７０２０２５２５を参照のこと）。デジタルＰＣＲは、単一分子レベルにおける核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）の増幅を利用し、低コピー数の核酸を定量化するための高感度の方法を提供する。核酸のデジタル増幅および分析のためのシステムは、入手可能である（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは、市販されている。
増幅プロセスの一般的な説明は、本明細書に提供される。例えば、プライマーおよび核酸が接触し、相補的な配列が互いにアニールする。プライマーは、目的の配列におけるまたは目的の配列の付近（例えば、目的の配列に隣接、近接など）の核酸にアニールできる。いくつかの実施形態において、あるセットのプライマーは、目的の核酸配列から約１０〜３０ヌクレオチド以内にハイブリダイズし、増幅産物を生成する。いくつかの実施形態において、プライマーは、目的の核酸配列の中にハイブリダイズする。
酵素の機能に必要な構成要素を含む反応混合物が、プライマー−核酸ハイブリッドに加えられ、適切な条件下で増幅が生じ得る。増幅反応の構成要素としては、例えば、プライマー（例えば、個々のプライマー、プライマー対、プライマーセットなど）、ポリヌクレオチド鋳型、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどが挙げられ得るが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ、例えば、検出可能な標識（例えば、蛍光標識または比色標識）を含むアナログが、例えば、使用され得る。ポリメラーゼは、当業者によって選択され得、それらには、熱サイクル増幅用のポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｑ−Ｂｉｏ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５’−３’エキソ活性を失っているＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの組換え切断型）；ＳｕｒｅＰｒｉｍｅ（商標）ポリメラーゼ（「ホットスタート」ＰＣＲ用の化学的に改変されたＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）；Ａｒｒｏｗ（商標）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（高感度かつ長い鋳型の増幅））および熱安定性増幅用のポリメラーゼ（例えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ ＵＲＬ“ｇｅｎ−ｐｒｏｂｅ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／ｔｍａ＿ｗｈｉｔｅｐｐｒ．ｐｄｆ”に記載されている転写媒介性増幅（ＴＭＡ）用のＲＮＡポリメラーゼ）が含まれる。例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）反応用の逆転写酵素などの他の酵素の構成要素が、加えられ得る。
ＰＣＲ条件は、プライマー配列、核酸の存在量および所望の増幅量に依存し得るので、当業者は、利用可能ないくつかのＰＣＲプロトコルから選択し得る（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、ｅｄｓ，１９９０を参照のこと。デジタルＰＣＲもまた当技術分野において公知であり；例えば、参照により本明細書に組み込まれる２００７年２月２日に出願された米国特許出願公開番号２００７０２０２５２５を参照のこと）。ＰＣＲは、典型的には、熱安定酵素を用いる自動プロセスとして行われる。このプロセスでは、反応混合物の温度は、変性ステップ、プライマーアニーリングステップおよび伸長反応ステップによって自動的にサイクルされる。いくつかのＰＣＲプロトコルは、活性化ステップおよび最終的な伸長ステップも含む。この目的のために特別に適合された機械が市販されている。本明細書に記載される実施形態にとって適切であり得るＰＣＲプロトコルの非限定的な例は、サンプルを９５℃で５分間処理すること；９５℃４５秒および６８℃３０秒を３５サイクル繰り返すこと；次いで、そのサンプルを７２℃で３分間処理することである。完了したＰＣＲ反応物は、さらなる作用が望まれるまで、必要に応じて４℃で維持され得る。複数のサイクルは、市販のサーマルサイクラーを使用して行われることが多い。当業者に公知であり、当業者によって選択される適切な等温増幅プロセスも、特定の実施形態において適用され得る。
いくつかの実施形態において、増幅産物は、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、ヌクレオチドアナログなどおよび前述のものの組み合わせを含み得る。増幅産物は、多くの場合、本明細書における核酸配列と同一もしくは実質的に同一のヌクレオチド配列またはその相補鎖を有する。増幅産物中の「実質的に同一の」ヌクレオチド配列は、一般に、増幅されるヌクレオチド配列種またはその相補鎖に対して高度の配列同一性（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超の配列同一性）を有し、ばらつきは、伸長および／もしくは増幅のために使用されたポリメラーゼの非忠実度（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）、または増幅のために使用されたプライマーに付加されたさらなるヌクレオチド配列の結果であることもある。
プライマー
核酸の検出、増幅、定量化、シークエンシングおよび分析にとって有用なプライマーが、提供される。本明細書において使用される用語「プライマー」とは、目的の特定の領域におけるまたは目的の特定の領域の付近の（例えば、目的の特定の領域に隣接する）、標的核酸にハイブリダイズすることまたはアニーリングすることができるヌクレオチド配列を含む核酸のことを指す。プライマーは、例えば、標的核酸ヌクレオチド配列の特異的な測定、または標的核酸（例えば、配列の有無または配列のコピー数）、またはそれらの特徴の検出を可能にし得る。プライマーは、天然に存在し得るか、または合成であり得る。用語「特異的」または「特異性」は、本明細書において使用される場合、別の分子に対する１つ分子の、例えば、標的ポリヌクレオチドに対するプライマーの、結合またはハイブリダイゼーションのことを指す。すなわち、「特異的」または「特異性」とは、２つの分子のいずれかと他の分子との、実質的に程度が低い認識、接触または複合体形成と比べたときの、それら２つの分子の間の認識、接触、および安定な複合体形成のことを指す。本明細書において使用される場合、用語「アニーリング」とは、２つの分子の間における安定な複合体の形成のことを指す。用語「プライマー」、「オリゴ」または「オリゴヌクレオチド」は、プライマーについて言及されるとき、本文書全体にわたって交換可能に使用され得る。
プライマー核酸は、適切なプロセスを用いて設計され得、合成され得、目的のヌクレオチド配列へのハイブリダイズ（例えば、核酸が、液相中に存在するかまたは固体支持体に結合されている場合）および本明細書に記載される分析プロセスの実施に適した任意の長さであり得る。プライマーは、標的ヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。プライマーは、いくつかの実施形態において、約１０〜約１００ヌクレオチド、約１０〜約７０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチドまたは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ヌクレオチド長であり得る。プライマーは、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、標識されたヌクレオチド）またはそれらの混合物から構成され得る。本明細書に記載される実施形態での使用に適したプライマーは、公知の技術を用いて合成され得、標識され得る。プライマーは、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９−６１６８，１９８４に記載されているような自動合成装置を使用する、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．，２２：１８５９−１８６２，１９８１によって初めて報告された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学的に合成され得る。プライマーの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動、または例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．，２５５：１３７−１４９，１９８３に記載されているような陰イオン高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実行され得る。
プライマー核酸配列（天然に存在するまたは合成）の全部または一部は、いくつかの実施形態において、標的核酸に実質的に相補的であり得る。本明細書において言及される場合、配列に関して「実質的に相補的」とは、互いにハイブリダイズするヌクレオチド配列のことを指す。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、様々な量の配列ミスマッチに耐えるように変更され得る。互いに対して５５％以上、５６％以上、５７％以上、５８％以上、５９％以上、６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上相補的な標的配列およびプライマー配列が、含まれる。
標的核酸配列に実質的に相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）プライマーは、標的核酸配列の相補鎖（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）と実質的に同一でもある。すなわち、プライマーは、その核酸のアンチセンス鎖と実質的に同一である。本明細書において言及される場合、配列に関して「実質的に同一」とは、互いに対して５５％以上、５６％以上、５７％以上、５８％以上、５９％以上、６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上同一であるヌクレオチド配列のことを指す。２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるか否かを判定するための１つの検査は、共有されている同一のヌクレオチド配列のパーセントを測定することである。
プライマーの配列および長さは、標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに影響し得る。プライマーと標的核酸との間のミスマッチの程度に応じて、低、中または高ストリンジェンシー条件を用いることにより、プライマー／標的のアニーリングが行われ得る。本明細書において使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に対する条件のことを指す。ハイブリダイゼーション反応の温度条件を最適化する方法は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９８９）に見られ得る。水性および非水性の方法が、その参考文献に記載されており、いずれの方法も使用できる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、５０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の別の例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、５５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、６０℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。多くの場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーションに続く、６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。より多くの場合、ストリンジェンシー条件は、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳに続く、６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける１回または複数回の洗浄である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション温度は、特定の有機溶媒、例えば、ホルムアミドの添加を用いて、変更され得る（すなわち、低下され得る）。ホルムアミドのような有機溶媒は、二本鎖ポリヌクレオチドの熱安定性を低下させ、その結果、ストリンジェントな条件を維持し、熱不安定性であり得る核酸の有用な寿命を延長しつつ、ハイブリダイゼーションをより低い温度で行うことができる。プライマーの特徴は、プローブおよびオリゴヌクレオチド、例えば、本明細書に提供される競合性および阻害性オリゴヌクレオチドに適用され得る。
本明細書において使用される場合、句「ハイブリダイズする」またはその文法的変形例は、低、中もしくは高ストリンジェンシー条件下、または核酸合成条件下における、第１核酸分子と第２核酸分子との結合のことを指す。第１核酸分子と第２核酸分子とが相補的である場合、ハイブリダイズには、第１核酸分子が第２核酸分子に結合する場合が含まれ得る。本明細書において使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」とは、相補的な配列を有しない核酸分子へのハイブリダイゼーションと比べて、プライマーの核酸合成条件下における、そのプライマーに相補的な配列を有する核酸分子への優先的なハイブリダイゼーションのことを指す。例えば、特異的なハイブリダイゼーションには、プライマーに相補的な標的核酸配列へのプライマーのハイブリダイゼーションが含まれる。
いくつかの実施形態において、プライマーは、固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列に相補的であり得るかまたは固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列に実質的に相補的（例えば、アラインメントされたとき、プライマーハイブリダイゼーション配列の相補鎖と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％超同一）であり得るヌクレオチド部分配列を含み得る。プライマーは、固相核酸プライマーハイブリダイゼーション配列に相補的でないかまたは実質的に相補的でないヌクレオチド部分配列を含み得る（例えば、固相プライマーハイブリダイゼーション配列に相補的かまたは実質的に相補的なプライマーの中のヌクレオチド部分配列の３’または５’末端において）。
プライマーは、特定の実施形態において、改変、例えば、１つまたは複数のイノシン、脱塩基部位、ロックト核酸、副溝結合剤、二重鎖安定剤（例えば、アクリジン、スペルミジン）、Ｔｍ改変物質（ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）またはプライマーもしくはプローブの結合特性を変更する任意の改変物質を含み得る。プライマーは、特定の実施形態において、検出可能な分子または実体（例えば、標識された競合因子オリゴヌクレオチドに対して上に記載されたような、フルオロフォア、放射性同位体、比色分析用物質（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｇｅｎｔ）、粒子、酵素など）を含み得る。
プライマーは、標的核酸の部分配列または別のプライマーにハイブリダイズし、かつ例えば分子ビーコンと同様に、プライマー、標的核酸またはその両方の検出を容易にする、ポリヌクレオチド配列のことも指し得る。本明細書において使用される用語「分子ビーコン」とは、検出可能な分子のことを指し、ここで、その分子の検出可能な特性は、特定の特異的な条件下でのみ検出可能であり、それにより、それが特異的かつ情報的に有益な信号として機能することが可能になる。検出可能な特性の非限定的な例は、光学特性、電気特性、磁気特性、化学特性、および既知サイズの開口部を通過する時間または速度である。
いくつかの実施形態において、プライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列に相補的である。いくつかの例において、フォワードおよびリバースプライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列の５’および３’末端にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡ標的配列にハイブリダイズするプライマーは、対応するゲノムＤＮＡ標的配列とプライマーの結合について競合するように設計された競合因子オリゴヌクレオチドにもハイブリダイズする。いくつかの例において、プライマーは、ゲノムＤＮＡ標的配列および対応する競合因子オリゴヌクレオチドに、同じまたは類似のハイブリダイゼーション効率でハイブリダイズするかまたはアニーリングする。いくつかの例において、ハイブリダイゼーション効率は、異なる。ゲノムＤＮＡ標的アンプリコンと競合因子アンプリコンとの比は、反応中に測定され得る。例えば、その比が、２８サイクルにおいて１：１であるが、３５サイクルでは２：１である場合、これは、増幅反応の終わりに、一方の標的（すなわち、ゲノムＤＮＡ標的または競合因子）に対するプライマーが、他方よりも速く再アニーリングしているか、または変性が、他方よりも効率的でないことを示唆し得る。
いくつかの実施形態において、プライマーは、セットで使用される。本明細書において使用される場合、増幅プライマーセットは、所与の領域に対するフォワードプライマーとリバースプライマーとの１対または複数対である。したがって、例えば、領域１に対するゲノム標的（すなわち、標的１ａおよび１ｂ）を増幅するプライマーは、プライマーセットと見なされる。領域２に対するゲノム標的（すなわち、標的２ａおよび２ｂ）を増幅するプライマーは、異なるプライマーセットと見なされる。いくつかの実施形態において、具体的な領域内の標的を増幅するプライマーセットは、対応する競合因子オリゴヌクレオチドも増幅する。特定の実施形態において、複数のプライマー対が、プライマーセットを構成し得る（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００対）。いくつかの実施形態において、各セットがプライマー対を含む複数のプライマーセットが、使用され得る。
ポリヌクレオチド配列の決定
ポリヌクレオチド配列を決定するための技術もまた、十分に確立されており、関連性のある研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドをシークエンシングするための基本原理および一般的な技術は、分子生物学および組換え遺伝学に対する様々な研究報告および学術論文（例えば、Ｗａｌｌａｃｅら、前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出）に記載されている。研究室において日常的に行われている手動または自動のＤＮＡシークエンシング方法が、本技術を実施するために使用され得る。本技術の方法を実施するためのポリヌクレオチド配列の変化の検出に適したさらなる手段としては、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲおよび電気泳動が挙げられるが、それらに限定されない。
プライマー伸長反応の使用もまた、本明細書における技術の方法において適用され得る。プライマー伸長反応は、例えば、デオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドを、ＳＮＰ部位に隣接した領域にハイブリダイズするプライマー伸長プライマーに組み込むことによってＳＮＰアレルを識別することによって、作用する。そのプライマーは、ポリメラーゼによって伸長される。プライマーによって伸長されたＳＮＰは、質量分析またはビオチンなどのタグ部分によって物理的に検出され得る。そのＳＮＰ部位は、特定の標識によってタグ付けされた相補的なデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドによってのみ伸長されるか、または特定の質量を有するプライマー伸長産物を生成するので、そのＳＮＰアレルは、識別され得、定量化され得る。
逆転写された核酸および増幅された核酸は、改変された核酸であり得る。改変された核酸は、ヌクレオチドアナログを含み得、特定の実施形態において、検出可能な標識および／または捕捉剤を含み得る。検出可能な標識の例としては、フルオロフォア、放射性同位体、比色（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ）物質、発光物質、化学発光物質、光散乱物質、酵素などが挙げられるが、それらに限定されない。捕捉剤の例としては、抗体／抗原、抗体／抗体、抗体／抗体フラグメント、抗体／抗体レセプター、抗体／プロテインＡまたはプロテインＧ、ハプテン／抗ハプテン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、葉酸／葉酸結合タンパク質、ビタミンＢ１２／内因子、化学反応基／相補的化学反応基（例えば、スルフヒドリル／マレイミド、スルフヒドリル／ハロアセチル誘導体、アミン／イソトリオシアネート、アミン／スクシンイミジルエステルおよびアミン／スルホニルハロゲン化物）対などから選択される結合対由来の作用物質が挙げられるが、それらに限定されない。捕捉剤を有する改変された核酸が、特定の実施形態において、固体支持体に固定化され得る。
質量分析は、本明細書における技術のポリヌクレオチド、例えば、ＰＣＲアンプリコン、プライマー伸長産物または標的核酸から切断される検出プローブを検出するために特に有効な方法である。そのポリヌクレオチド配列の存在は、検出された信号の質量を目的のポリヌクレオチドの予想質量と比較することによって裏付けられる。具体的なポリヌクレオチド配列に対する相対的な信号強度、例えば、スペクトル上の質量ピークは、特定のアレルの相対的な集団を示唆し、ゆえに、そのデータから直接アレル比を計算することが可能になる。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）標準ｉＰＬＥＸ（商標）アッセイおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を用いるジェノタイピング方法の概説については、Ｊｕｒｉｎｋｅ，Ｃ．，Ｏｅｔｈ，Ｐ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ，Ｄ．，“ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１４７−１６４（２００４）；およびＯｅｔｈ，Ｐ．ら、“ｉＰＬＥＸ（商標）Ａｓｓａｙ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｌｅｘｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ．”ＳＥＱＵＥＮＯＭ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ（２００５）（両方が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。増幅プロセス中に切断され、質量分析によって検出される切断可能な検出プローブを用いた標的核酸（ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ）の検出および定量化の概説については、２００７年１２月４日に出願され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号１１／９５０，３９５を参照のこと。
シークエンシング技術は、処理能力およびコストに関して改善されている。シークエンシング技術（例えば、４５４プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ）（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、２００５ Ｎａｔｕｒｅ ４３７，３７６−３８０）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（またはＳｏｌｅｘａプラットフォーム）もしくはＳＯＬｉＤ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＨｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡシークエンシング技術（Ｈａｒｒｉｓ Ｔ Ｄら、２００８ Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０，１０６−１０９）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ．ＴＭ．）技術およびナノポアシークエンシング（Ｓｏｎｉ ＧＶ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．２００７ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５３：１９９６−２００１）において達成可能なシークエンシング技術）によって、並行様式での高次の多重化において、検体から単離された多くの核酸分子のシークエンシングが可能になる（Ｄｅａｒ Ｂｒｉｅｆ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ２００３；１：３９７−４１６）。
これらのプラットフォームの各々は、核酸フラグメントのクローン的に増加された単一分子または増幅されていない単一分子のシークエンシングを可能にする。特定のプラットフォームは、例えば、（ｉ）色素で修飾されたプローブのライゲーションによるシークエンシング（周期性のライゲーションおよび切断を含む）、（ｉｉ）パイロシークエンシング、および（ｉｉｉ）１分子シークエンシングを含む。ヌクレオチド配列種、増幅核酸種およびそれらから生成された検出可能な産物は、そのような配列分析プラットフォームによってヌクレオチド配列を分析する目的の「研究核酸」と見なされ得る。
ライゲーションによるシークエンシングは、塩基対形成のミスマッチに対するＤＮＡリガーゼの感度に依存する核酸配列決定法である。ＤＮＡリガーゼは、正しく塩基対形成されたＤＮＡ末端をつなげる。ＤＮＡリガーゼが、正しく塩基対形成されたＤＮＡ末端だけをつなげる能力を、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドまたはプライマーの混合プールと組み合わせることにより、蛍光検出による配列決定が可能になる。標識が同定された後に切断され得る切断可能な結合を含むプライマーを含めることによって、より長い配列のリードが得られ得る。リンカーにおける切断は、標識を除去し、ライゲーションしたプライマーの末端に５’ホスフェートを再生することにより、次回のライゲーションのためのプライマーが調製される。いくつかの実施形態において、プライマーは、２つ以上の蛍光標識（例えば、１つの蛍光標識、２、３または４つの蛍光標識）で標識され得る。
当業者が使用し得る、ライゲーションによるシークエンシングに基づくシステムの例は、一般に、以下のステップを含む。研究核酸（「鋳型」）、増幅反応構成要素、ビーズおよびプライマーを含むエマルジョンマイクロリアクター内で、ビーズのクローン集団を調製し得る。増幅後、鋳型を変性し、ビーズの富化を行うことにより、望まれないビーズ（例えば、伸長していない鋳型を有するビーズ）から、伸長した鋳型を有するビーズが分離される。選択されたビーズ上の鋳型が、３’修飾を受けることにより、スライドへの共有結合が可能になり、そして修飾されたビーズは、スライドガラス上に沈着され得る。沈着チャンバーは、ビーズ充填プロセス中に、スライドを１、４または８つのチャンバーに分ける能力を付与する。配列分析にむけて、プライマーをアダプター配列にハイブリダイズさせる。４色の色素で標識されたプローブのセットは、シークエンシングプライマーへのライゲーションについて競合する。プローブライゲーションの特異性は、ライゲーションシリーズ中の全ての４番目および５番目の塩基を調べることによって達成される。５〜７回のライゲーション、検出および切断によって、全ての５番目の位置の色が記録される（回数は、使用されるライブラリのタイプによって決定される）。各回のライゲーションの後、５’方向に１塩基だけ相殺された新しい相補的プライマーが、新たなライゲーションシリーズのために置かれる。プライマーのリセットおよびライゲーションの回（１回あたり５〜７ライゲーションサイクル）が、続けて５回繰り返されることにより、１つのタグについて２５〜３５塩基対の配列が生成される。メイトペア（ｍａｔｅ−ｐａｉｒｅｄ）シークエンシングの場合、このプロセスは、第２のタグについて繰り返される。そのようなシステムは、例えば、異種核酸を、本明細書に記載されるプロセスによって生成された第１の増幅産物にライゲートし、第１の増幅産物を生成するために最初に使用された固体支持体と同じまたは異なる固体支持体を用いてエマルジョン増幅を行うことによって、本明細書に記載されるプロセスによって生成された増幅産物を指数関数的に増幅するために使用され得る。そのようなシステムは、指数関数的な増幅プロセスを迂回してスライドガラス上で本明細書に記載される固体支持体を直接選別することによって、本明細書に記載されるプロセスによって直接生成された増幅産物を分析するためにも使用され得る。
パイロシークエンシングは、合成によるシークエンシングに基づいた核酸配列決定法であり、ヌクレオチドの組み込み時に放出されるピロホスフェートの検出に依存する。一般に、合成によるシークエンシングは、配列を調べている鎖に相補的なＤＮＡ鎖を、１回につき１ヌクレオチドで合成するステップを含む。研究核酸は、固体支持体に固定化され、シークエンシングプライマーとハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ（ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸およびルシフェリンとともにインキュベートされ得る。ヌクレオチド溶液を連続的に加え、除去する。ヌクレオチドが正しく組み込まれるとピロホスフェートが放出され、それが、ＡＴＰスルフリラーゼと相互作用し、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下においてＡＴＰを生成することにより、ルシフェリン反応物に燃料供給され、それにより化学発光信号を生成することにより、配列決定が可能になる。
当業者によって使用され得る、パイロシークエンシングに基づくシステムの例は、一般に、以下のステップ：アダプター核酸を研究核酸にライゲートし、その研究核酸をビーズにハイブリダイズするステップ；エマルジョン内で研究核酸内のヌクレオチド配列を増幅するステップ；ピコリットルのマルチウェル固体支持体を用いてビーズを選別するステップ；および増幅されたヌクレオチド配列をパイロシークエンシング法によってシークエンシングするステップを含む（例えば、Ｎａｋａｎｏら、“Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ；”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０２：１１７−１２４（２００３））。そのようなシステムは、例えば、異種核酸を、本明細書に記載されるプロセスによって生成される第１の増幅産物にライゲートすることによって、本明細書に記載されるプロセスによって生成される増幅産物を指数関数的に増幅するために使用され得る。
特定の１分子シークエンシング実施形態は、合成によるシークエンシングの原理に基づくものであり、ヌクレオチドの組み込みが成功した結果として光子を放射するメカニズムとして一対の蛍光共鳴エネルギー転移（一対ＦＲＥＴ）を利用するものである。放射された光子は、多くの場合、全反射顕微鏡（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＴＩＲＭ）とともに増感または高感度の冷却電荷結合素子を用いて検出される。導入された反応溶液が、シークエンシングプロセスの結果として合成される成長中の核酸鎖に取り込むための正しいヌクレオチドを含むときだけ、光子が放射される。ＦＲＥＴに基づく１分子シークエンシングでは、エネルギーが、長距離の双極子相互作用によって２種の蛍光色素間、時折、ポリメチンシアニン色素Ｃｙ３とＣｙ５との間を転移する。ドナーは、その特定の励起波長において励起され、その励起状態エネルギーが、アクセプター色素に非放射的に転移され、そしてそのアクセプター色素が励起される。そのアクセプター色素は、最終的には光子の放射放出によって基底状態に戻る。このエネルギー転移プロセスにおいて使用される２種の色素は、一対ＦＲＥＴにおいて「一対」である。Ｃｙ３は、多くの場合、ドナーフルオロフォアとして使用され、多くの場合、１つ目の標識ヌクレオチドとして取り込まれる。Ｃｙ５は、多くの場合、アクセプターフルオロフォアとして使用され、１つ目のＣｙ３標識ヌクレオチドが取り込まれた後の、次のヌクレオチド付加用のヌクレオチド標識として使用される。これらのフルオロフォアは、通常、各々の１０ナノメートル以内に存在することにより、エネルギー転移が成功する。
使用され得る、１分子シークエンシングに基づくシステムの例は、通常、プライマーを研究核酸にハイブリダイズすることにより、複合体を生成するステップ；その複合体を固相と会合させるステップ；蛍光分子でタグ付けされたヌクレオチドによってプライマーを繰り返し伸長するステップ；および各反復後に蛍光共鳴エネルギー転移信号の像を捕捉するステップを含む（例えば、米国特許第７，１６９，３１４号；Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙら、ＰＮＡＳ １００（７）：３９６０−３９６４（２００３））。そのようなシステムは、本明細書に記載されるプロセスによって生成される増幅産物を直接シークエンシングするために使用され得る。いくつかの実施形態において、放出された線状増幅産物は、例えば、固体支持体、ビーズまたはスライドガラス上に存在する固定化された捕捉配列に相補的な配列を含むプライマーにハイブリダイズされ得る。プライマーと放出された線状増幅産物との複合体が固定化された捕捉配列とハイブリダイゼーションすることによって、合成による一対ＦＲＥＴベースのシークエンシングのために、放出された線状増幅産物が固体支持体に固定化される。固定化された核酸を含むスライド表面の最初の参照像が生成され得るように、そのプライマーは、多くの場合、蛍光性である。その最初の参照像は、真のヌクレオチドの組み込みが生じている位置を判定するために有用である。「プライマーのみ」の参照像において最初に同定されなかったアレイ位置において検出される蛍光信号は、非特異的蛍光として無視される。プライマーと放出された線状増幅産物との複合体を固定化した後、結合された核酸は、多くの場合、以下の反復ステップ、ａ）１種の蛍光標識ヌクレオチドの存在下におけるポリメラーゼ伸長、ｂ）適切な顕微鏡、例えば、ＴＩＲＭを用いた蛍光の検出、ｃ）蛍光ヌクレオチドの除去、およびｄ）異なる蛍光標識ヌクレオチドを用いるステップに戻るステップによって並行してシークエンシングされる。
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドシークエンシングは、固相１ヌクレオチドシークエンシング法およびプロセスによるものであり得る。固相１ヌクレオチドシークエンシング法は、サンプル核酸と固体支持体とを、１分子のサンプル核酸が１分子の固体支持体とハイブリダイズする条件下で接触させるステップを含む。そのような条件は、固体支持体分子および１分子のサンプル核酸を「マイクロリアクター」内に提供することを含み得る。そのような条件は、サンプル核酸分子が固体支持体上の固相核酸にハイブリダイズし得る混合物を提供することも含み得る。本明細書に記載される実施形態において有用な１ヌクレオチドシークエンシング法は、２００８年１月１７日出願の米国仮特許出願番号６１／０２１，８７１に記載されている。
特定の実施形態において、ナノポアシークエンシング検出法は、（ａ）シークエンシングのための核酸（「ベース核酸」、例えば、連結プローブ分子）を配列特異的検出物質と、その検出物質がそのベース核酸の実質的に相補的な部分配列に特異的にハイブリダイズする条件下において、接触させるステップ；（ｂ）検出物質からの信号を検出するステップおよび（ｃ）検出された信号に従ってベース核酸の配列を決定するステップを含む。特定の実施形態では、ベース核酸がポアを通過するときに検出物質がナノポア構造を干渉すると、ベース核酸にハイブリダイズされた検出物質は、ベース核酸から解離され（例えば、連続的に解離され）、そのベース配列から解離された検出物質が、検出される。いくつかの実施形態において、ベース核酸から解離された検出物質は、検出可能なある信号を放射し、ベース核酸にハイブリダイズされている検出物質は、異なる検出可能な信号を放射するか、または検出可能な信号を放出しない。特定の実施形態において、ある核酸（例えば、連結プローブ分子）内のヌクレオチドは、特定のヌクレオチドに対応する特定のヌクレオチド配列（「ヌクレオチド代表体（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｓ）」）で置換されることにより、増大された核酸が生じ（例えば、米国特許第６，７２３，５１３号）、検出物質は、増大された核酸内のヌクレオチド代表体にハイブリダイズし、それが、ベース核酸として機能する。そのような実施形態において、ヌクレオチド代表体は、２成分またはより高次の配列で配置され得る（例えば、Ｓｏｎｉ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５３（１１）：１９９６−２００１（２００７））。いくつかの実施形態において、核酸は、増大されず、増大された核酸を生じず、ベース核酸として直接働き（例えば、連結プローブ分子が、増大されないベース核酸として働き）、検出物質が、そのベース核酸と直接接触される。例えば、第１の検出物質は、第１の部分配列にハイブリダイズし得、第２の検出物質は、第２の部分配列にハイブリダイズし得、ここで、第１の検出物質および第２の検出物質の各々は、互いに区別され得る検出可能な標識を有し、第１の検出物質および第２の検出物質からの信号は、それらの検出物質がベース核酸から解離されると、互いに区別され得る。特定の実施形態において、検出物質は、約３〜約１００ヌクレオチド長（例えば、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５ヌクレオチド長）であり得るベース核酸にハイブリダイズする領域（例えば、２つの領域）を含む。検出物質は、ベース核酸にハイブリダイズしない１つまたは複数のヌクレオチド領域も含み得る。いくつかの実施形態において、検出物質は、分子ビーコンである。検出物質は、多くの場合、本明細書に記載されるものから独立して選択される１つまたは複数の検出可能な標識を含む。検出可能な標識の各々は、各標識（例えば、磁気的、電気的、化学的、光学的標識など）によって生成される信号を検出することができる任意の好都合な検出プロセスによって検出され得る。例えば、ＣＤカメラを用いることにより、検出物質に連結された１つまたは複数の識別可能である量子ドットから信号が検出され得る。
特定の配列分析実施形態において、リードを用いることにより、より長いヌクレオチド配列が構築され得、それは、異なるリード内のオーバーラップ配列を同定することおよびそのリード内の同定配列を使用することによって促進され得る。リードからより長い配列を構築するためのそのような配列分析法および配列分析ソフトウェアは、当業者に公知である（例えば、Ｖｅｎｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：１３０４−１３５１（２００１））。特定のリード、部分的なヌクレオチド配列構築物および完全なヌクレオチド配列構築物が、特定の配列分析実施形態において、サンプル核酸内のヌクレオチド配列間で比較されてもよいし（すなわち、内部比較）、参照配列と比較されてもよい（すなわち、参照比較）。内部比較は、サンプル核酸が、複数のサンプル、または配列変異を含む単一サンプル起源から調製される状況において行われることもある。参照比較は、参照ヌクレオチド配列が既知であるとき、およびその目的が、サンプル核酸が参照ヌクレオチド配列と実質的に類似もしくは全く同じまたは異なるヌクレオチド配列を含むか否かを判定することであるときに、行われることもある。配列分析は、当業者に公知の配列決定装置および配列分析構成要素によって促進される。
本明細書に提供される方法は、複数の核酸における核酸種（例えば、ヌクレオチド配列種、増幅された核酸種および前述のものから生成された検出可能な産物）のハイスループット検出を可能にする。多重化とは、２種以上の核酸種の同時検出のことを指す。質量分析とともに多重反応を行うための一般的な方法は、公知である（例えば、米国特許第６，０４３，０３１号、同第５，５４７，８３５号および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／３７０４１を参照のこと）。多重化は、個々の各標的核酸種に対して個別の質量分析を行わなければならないものと比べて、複数の核酸種（例えば、異なる配列変異を有するいくつかの核酸種）が、わずか１つの質量スペクトルにおいて同定され得るという利点を提供する。本明細書に提供される方法は、いくつかの実施形態において、高速かつ高精度で配列変異を分析するための高度に自動化されたハイスループットプロセスに適している。いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、単一反応において高レベルで多重化され得る。
特定の実施形態において、多重化される核酸種の数としては、約１〜約５００（例えば、約１〜３、３〜５、５〜７、７〜９、９〜１１、１１〜１３、１３〜１５、１５〜１７、１７〜１９、１９〜２１、２１〜２３、２３〜２５、２５〜２７、２７〜２９、２９〜３１、３１〜３３、３３〜３５、３５〜３７、３７〜３９、３９〜４１、４１〜４３、４３〜４５、４５〜４７、４７〜４９、４９〜５１、５１〜５３、５３〜５５、５５〜５７、５７〜５９、５９〜６１、６１〜６３、６３〜６５、６５〜６７、６７〜６９、６９〜７１、７１〜７３、７３〜７５、７５〜７７、７７〜７９、７９〜８１、８１〜８３、８３〜８５、８５〜８７、８７〜８９、８９〜９１、９１〜９３、９３〜９５、９５〜９７、９７〜１０１、１０１〜１０３、１０３〜１０５、１０５〜１０７、１０７〜１０９、１０９〜１１１、１１１〜１１３、１１３〜１１５、１１５〜１１７、１１７〜１１９、１２１〜１２３、１２３〜１２５、１２５〜１２７、１２７〜１２９、１２９〜１３１、１３１〜１３３、１３３〜１３５、１３５〜１３７、１３７〜１３９、１３９〜１４１、１４１〜１４３、１４３〜１４５、１４５〜１４７、１４７〜１４９、１４９〜１５１、１５１〜１５３、１５３〜１５５、１５５〜１５７、１５７〜１５９、１５９〜１６１、１６１〜１６３、１６３〜１６５、１６５〜１６７、１６７〜１６９、１６９〜１７１、１７１〜１７３、１７３〜１７５、１７５〜１７７、１７７〜１７９、１７９〜１８１、１８１〜１８３、１８３〜１８５、１８５〜１８７、１８７〜１８９、１８９〜１９１、１９１〜１９３、１９３〜１９５、１９５〜１９７、１９７〜１９９、１９９〜２０１、２０１〜２０３、２０３〜２０５、２０５〜２０７、２０７〜２０９、２０９〜２１１、２１１〜２１３、２１３〜２１５、２１５〜２１７、２１７〜２１９、２１９〜２２１、２２１〜２２３、２２３〜２２５、２２５〜２２７、２２７〜２２９、２２９〜２３１、２３１〜２３３、２３３〜２３５、２３５〜２３７、２３７〜２３９、２３９〜２４１、２４１〜２４３、２４３〜２４５、２４５〜２４７、２４７〜２４９、２４９〜２５１、２５１〜２５３、２５３〜２５５、２５５〜２５７、２５７〜２５９、２５９〜２６１、２６１〜２６３、２６３〜２６５、２６５〜２６７、２６７〜２６９、２６９〜２７１、２７１〜２７３、２７３〜２７５、２７５〜２７７、２７７〜２７９、２７９〜２８１、２８１〜２８３、２８３〜２８５、２８５〜２８７、２８７〜２８９、２８９〜２９１、２９１〜２９３、２９３〜２９５、２９５〜２９７、２９７〜２９９、２９９〜３０１、３０１〜３０３、３０３〜３０５、３０５〜３０７、３０７〜３０９、３０９〜３１１、３１１〜３１３、３１３〜３１５、３１５〜３１７、３１７〜３１９、３１９〜３２１、３２１〜３２３、３２３〜３２５、３２５〜３２７、３２７〜３２９、３２９〜３３１、３３１〜３３３、３３３〜３３５、３３５〜３３７、３３７〜３３９、３３９〜３４１、３４１〜３４３、３４３〜３４５、３４５〜３４７、３４７〜３４９、３４９〜３５１、３５１〜３５３、３５３〜３５５、３５５〜３５７、３５７〜３５９、３５９〜３６１、３６１〜３６３、３６３〜３６５、３６５〜３６７、３６７〜３６９、３６９〜３７１、３７１〜３７３、３７３〜３７５、３７５〜３７７、３７７〜３７９、３７９〜３８１、３８１〜３８３、３８３〜３８５、３８５〜３８７、３８７〜３８９、３８９〜３９１、３９１〜３９３、３９３〜３９５、３９５〜３９７、３９７〜４０１、４０１〜４０３、４０３〜４０５、４０５〜４０７、４０７〜４０９、４０９〜４１１、４１１〜４１３、４１３〜４１５、４１５〜４１７、４１７〜４１９、４１９〜４２１、４２１〜４２３、４２３〜４２５、４２５〜４２７、４２７〜４２９、４２９〜４３１、４３１〜４３３、４３３〜４３５、４３５〜４３７、４３７〜４３９、４３９〜４４１、４４１〜４４３、４４３〜４４５、４４５〜４４７、４４７〜４４９、４４９〜４５１、４５１〜４５３、４５３〜４５５、４５５〜４５７、４５７〜４５９、４５９〜４６１、４６１〜４６３、４６３〜４６５、４６５〜４６７、４６７〜４６９、４６９〜４７１、４７１〜４７３、４７３〜４７５、４７５〜４７７、４７７〜４７９、４７９〜４８１、４８１〜４８３、４８３〜４８５、４８５〜４８７、４８７〜４８９、４８９〜４９１、４９１〜４９３、４９３〜４９５、４９５〜４９７、４９７〜５０１）が挙げられるが、それらに限定されない。
多重アッセイを用いて質量スペクトルの分解を達成するための設計方法は、プライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計方法ならびに反応設計方法を含み得る。例えば、表ＸおよびＹに提供されている多重スキームを参照のこと。多重アッセイにおけるプライマーおよびオリゴヌクレオチドの設計については、誤ったプライミングおよびプライマーダイマーを回避することなどの一重反応に対するプライマー設計と同じ一般的ガイドラインが、適用され、より多くのプライマーが、多重反応のために含められるだけである。質量分析に適用するために、１つのアッセイに対する質量スペクトルにおける被分析物ピーク（ポージング（ｐａｕｓｉｎｇ）ピークおよび他の任意の副産物ピークを含む）は、そのアッセイと多重化される任意のアッセイの産物から十分に解明される。また、被分析物ピークは、ユーザーによって指定された質量ウィンドウ、例えば、５，０００〜８，５００Ｄａの範囲内に最適に入る。いくつかの実施形態において、多重分析は、例えば、染色体異常の質量分析検出に適合され得る。特定の実施形態において、多重分析は、本明細書に記載される様々な１ヌクレオチドシークエンシング法またはナノポアベースのシークエンシング法に適合され得る。商業的に作製されている微量反応チャンバーまたはデバイスまたはアレイまたはチップを使用することにより、多重分析が容易になり得、それらは、市販されている。
ヌクレオチド配列リードを得るためのさらなる方法
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、核酸フラグメント、サンプル核酸、無細胞核酸）が、シークエンシングされ得る。いくつかの例において、完全なまたは実質的に完全な配列が得られるが、部分的な配列が得られることもある。シークエンシング、マッピングおよび関連する分析方法は、当技術分野において公知である（例えば、参照により組み込まれる米国特許出願公開ＵＳ２００９／００２９３７７）。そのようなプロセスの特定の態様が、本明細書中以後、説明される。
本明細書において使用される場合、「リード」は、本明細書に記載されるかまたは当技術分野において公知の任意のシークエンシングプロセスによって生成される短いヌクレオチド配列である。リードは、核酸フラグメントの一端から生成され得（「片端リード」）、核酸の両端から生成されることもある（「両端リード」）。特定の実施形態において、被験体からサンプルの核酸配列リードを「得ること」および／または１人もしくは複数人の参照人から生物学的検体の核酸配列リードを「得ること」は、核酸を直接シークエンシングすることにより、配列情報を得ることを含み得る。いくつかの実施形態において、「得ること」は、別のものによって核酸から直接得られた配列情報を受け取ることを含み得る。
いくつかの実施形態において、１個体からの１つの核酸サンプルをシークエンシングする。特定の実施形態において、２つ以上の生物学的サンプルからの核酸サンプルを、この場合、各生物学的サンプルは、１個体から、または２例以上の個体からのものであるが、プールし、そのプールをシークエンシングする。後者の特定の実施形態において、各生物学的サンプルからの核酸サンプルを、多くの場合、１つまたはそれより多い独自の同定タグにより同定する。
いくつかの実施形態において、ゲノムの画分をシークエンシングし、これは決定されたヌクレオチド配列までをカバーするゲノムの量で表現されることもある（例えば、１未満の「倍数の」カバー率（“ｆｏｌｄ”ｃｏｖｅｒａｇｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １））。ゲノムを約１倍のカバー率でシークエンシングするときに、およそ１００％のゲノムのヌクレオチド配列がリードにより表される。また、ゲノムを冗長にシークエンシングすることができ、この場合、ゲノムの所与の領域を、２つ以上のリードまたはオーバーラップするリードによりカバーすることができる（例えば、１より大きい「倍数の」カバー率））。いくつかの実施形態において、ゲノムを約０．１倍〜約１００倍のカバー率、約０．２倍〜２０倍のカバー率または約０．２倍〜約１倍のカバー率（例えば、約０．２倍、０．３倍、０．４倍、０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍のカバー率）でシークエンシングする。
特定の実施形態において、１実行でシークエンシングされる核酸プールの画分をさらに、シークエンシングする前に部分選択（ｓｕｂ−ｓｅｌｅｃｔ）する。特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションに基づいた技術を使用し（例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用）、特定の染色体（例えば、異数体の可能性のある染色体および試験した異数性に関与しない他の染色体（複数可））からの核酸配列について、第１の部分選択をすることができる。いくつかの実施形態において、核酸を、サイズにより（例えば、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーにより、またはマイクロフルイディクスに基づいた方法により）分画することができ、特定の例において、胎児の核酸を、低分子量（例えば、３００塩基対未満、２００塩基対未満、１５０塩基対未満、１００塩基対未満）の核酸を選択することにより富化することができる。いくつかの実施形態において、胎児の核酸を、母体のバックグランドの核酸を抑制することにより、例えば、ホルムアルデヒドを添加することにより、富化することができる。いくつかの実施形態において、核酸の予備選択されたプールの部分またはサブセットを無作為にシークエンシングする。いくつかの実施形態において、核酸をシークエンシングする前に増幅する。いくつかの実施形態において、核酸の部分またはサブセットをシークエンシングする前に増幅する。
いくつかの例において、シークエンシングライブラリを、シークエンシングプロセスの前または間に調製する。シークエンシングライブラリを調製するための方法は、当技術分野で公知であり、市販のプラットフォームを特定の用途に使用することができる。特定の市販のライブラリプラットフォームを、本明細書に記載の特定のヌクレオチドシークエンシングプロセスに適合させることができる。例えば、１つまたはそれより多い市販のライブラリプラットフォームを合成プロセスによるシークエンシングと適合させることができる。いくつかの例において、ライゲーションに基づいたライブラリ調製方法を使用する（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＴＲＵＳＥＱ，Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）。ライゲーションに基づいたライブラリ調製方法は典型的に、最初のライゲーションステップにてインデックス配列を組み込むことができ、多くの場合、シングルリードシークエンシング、ペアエンドシークエンシングおよびマルチプレックスシークエンシング用にサンプルを調製するために使用することができるメチル化アダプター設計を使用する。いくつかの例において、トランスポゾンに基づいたライブラリ調製方法を使用する（例えば、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＮＥＸＴＥＲＡ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）。トランスポゾンに基づいた方法は典型的に、単一管反応において、ＤＮＡを同時に断片化およびタグ化するインビトロでの転位を使用し（多くの場合、プラットフォーム特異的タグおよび任意選択のバーコードの組み込みを可能にする）、シーケンサレディライブラリ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ−ｒｅａｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）を調製する。
本明細書に記載される方法を行うのに適した任意のシークエンシング方法を利用することができる。いくつかの実施形態において、ハイスループットシークエンシング方法が、使用される。ハイスループットシークエンシング方法は、一般に、１つのフローセル内において超並列様式でシークエンシングされる、クローン増幅されたＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子を必要とする（例えば、Ｍｅｔｚｋｅｒ Ｍ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ １１：３１−４６（２０１０）；Ｖｏｌｋｅｒｄｉｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５５：６４１−６５８（２００９）に記載されているように）。そのようなシークエンシング方法は、デジタル定量的情報も提供し得、ここで、各配列リードは、個々のクローンＤＮＡ鋳型または単一のＤＮＡ分子に相当するカウント可能な「配列タグ」または「カウント」である。ハイスループットシークエンシング技術には、例えば、リバーシブルダイターミネーターを用いる合成によるシークエンシング、オリゴヌクレオチドプローブライゲーションによるシークエンシング、パイロシークエンシングおよびリアルタイムシークエンシングが含まれる。
ハイスループットシークエンシング法に利用される系は市販されており、例えば、Ｒｏｃｈｅ４５４プラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＯＬＩＤプラットフォーム、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ単一分子ＤＮＡシークエンシング法、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．）、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）法（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、合成によるシークエンシングプラットフォーム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａおよびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびライゲーションによるシークエンシングプラットフォーム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含む。ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ法（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびナノポアシークエンシングもハイスループットシークエンシング法に使用することができる。
いくつかの実施形態において、第１世代技術、例えば、自動化サンガーシークエンシングを含むサンガーシークエンシングなどを本明細書に提供される方法に使用することができる。発達する核酸画像技術（例えば、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）および原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ））の使用を含むさらなるシークエンシング技術も、本明細書において考慮される。種々のシークエンシング技術の例を以下に記載する。
本明細書に記載の方法に使用し得る核酸シークエンシング技術は、合成によるシークエンシングおよびリバーシブルターミネーターに基づいたシークエンシング（例えば、イルミナのゲノム解析装置、ゲノム解析装置ＩＩ、ＨＩＳＥＱ２０００、ＨＩＳＥＱ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ））である。この技術を用いて、数百万個の核酸（例えば、ＤＮＡ）フラグメントを並列にシークエンシングすることができる。この種のシークエンシング技術の一例において、フローセルを使用するが、これは、表面にオリゴヌクレオチドアンカー（例えば、アダプタープライマー）を結合させた８個の個々のレーンを含む光学的に透明なスライドを含有する。フローセルは、多くの場合、結合させた被分析物に対して、試薬溶液の順序正しい通過を維持し、かつ／または可能にするよう構成され得る固体の支持体である。フローセルは、多くの場合、平面形状であり、光学的に透明な、一般にミリメートルまたはミリメートル以下のスケールであり、多くの場合、被分析物／試薬の相互作用が生じるチャンネルまたはレーンを有する。
特定の合成によるシークエンシング法において、例えば、鋳型ＤＮＡ（例えば、循環細胞非含有ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ））を、ライブラリ作製のための調製において数百塩基対の長さに断片化することもある。いくつかの実施形態において、ライブラリ調製を、鋳型ＤＮＡ（例えば、ｃｃｆＤＮＡ）のさらに断片化またはサイズ選択することなく行うことができる。特定の実施形態において、サンプル単離およびライブラリ作製を、自動化方法および装置を使用して行うことができる。つまり、鋳型ＤＮＡをフィルイン反応、エキソヌクレアーゼ反応またはフィルイン反応とエキソヌクレアーゼ反応の組み合わせにより末端修復する。得られた平滑末端修復された鋳型ＤＮＡを、アダプタープライマーの３’末端にオーバーハングする１本鎖ヌクレオチドに相補的な１本鎖ヌクレオチドにより伸長し、多くの場合、ライゲーション効率が増大する。任意の相補的ヌクレオチドを、伸長／オーバーハングヌクレオチド（例えば、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ）に使用することができるが、多くの場合、アデニンを使用し、末端修復されたＤＮＡを伸長し、多くの場合、チミンを３’末端オーバーハングヌクレオチドとして使用する。
特定の合成によるシークエンシング法において、例えば、アダプターオリゴヌクレオチドは、フローセルアンカーに相補的であり、改変鋳型ＤＮＡ（例えば、末端修復され、かつ１本鎖ヌクレオチドに伸長された）と、固体の支持体、例えば、フローセルの内面などが会合するのに利用することもある。いくつかの実施形態において、アダプターも識別子（すなわち、表示している（ｉｎｄｅｘｉｎｇ）ヌクレオチド、すなわち「バーコード」ヌクレオチド（例えば、サンプルおよび／または染色体の明白な同定を可能にする識別子として利用可能なヌクレオチドの独自の配列））、１つまたはそれより多いシークエンシングプライマーハイブリダイゼーション部位（例えば、ユニバーサルシークエンシングプライマー、シングルエンドシークエンシングプライマー、ペアエンドシークエンシングプライマー、マルチプレックスシークエンシングプライマーなどに相補的な配列）またはそれらの組み合わせ（例えば、アダプター／シークエンシング、アダプター／識別子、アダプター／識別子／シークエンシング）を含む。アダプターに含有される識別子またはヌクレオチドは、多くの場合、６ヌクレオチド長以上であり、多くの場合、識別子ヌクレオチドがシークエンシング反応中にシークエンシングされる第１のヌクレオチドとなるようにアダプターに位置付けされる。特定の実施形態において、識別子ヌクレオチドは、サンプルと会合するが、個別のシークエンシング反応においてシークエンシングし、配列リードの質が落ちることを避ける。続いて、識別子シークエンシングおよびＤＮＡ鋳型シークエンシングからのリードを合わせて結合させ、リードを脱多重化する。結合および脱多重化後に、シークエンスリードおよび／または識別子を、本明細書に記載のようにさらに調節または処理することができる。
特定の合成によるシークエンシング法において、識別子の利用により、フローセルレーンでのシークエンシング反応の多重化が可能になり、それにより、フローセルレーン当たりに複数のサンプルの分析が可能になる。所与のフローセルレーンにおいて分析することができるサンプル数は、多くの場合、ライブラリ調製および／またはプローブ設計中に利用される独自の識別子の数に依存する。市販のマルチプレックスシークエンシングキットの非限定的な例として、イルミナの多重化サンプル調製オリゴヌクレオチドキットおよび多重化シークエンシングプライマーならびにＰｈｉＸコントロールキット（例えば、それぞれ、イルミナのカタログ番号ＰＥ−４００−１００１およびＰＥ−４００−１００２）が挙げられる。本明細書に記載の方法を、任意の数の独自の識別子（例えば、４、８、１２、２４、４８、９６以上）を使用して行うことができる。独自の識別子の数が多いほど、例えば、単一のフローセルレーンにおいて多重化することができるサンプルおよび／または染色体の数が多くなる。例えば、１２識別子を使用する多重化は、８レーンのフローセルにおいて９６サンプル（例えば、９６ウェルマイクロウェルプレートのウェル数に等しい）の同時分析を可能にする。同様に、４８識別子を使用する多重化は、８レーンのフローセルにおいて３８４サンプル（例えば、３８４ウェルマイクロウェルプレートのウェル数に等しい）の同時分析を可能にする。
特定の合成によるシークエンシング法において、アダプター改変された、１本鎖鋳型ＤＮＡを、フローセルに添加し、限界希釈条件下において、ハイブリダイゼーションによりアンカーに固定する。エマルジョンＰＣＲと対照的に、ＤＮＡ鋳型を、「ブリッジ」増幅により、フローセルにおいて増幅させるが、これは隣接のアンカーオリゴヌクレオチド上に「アーチを形成」し、かつこれにハイブリダイズする捕捉されたＤＮＡ鎖によるものである。複数の増幅サイクルが、単一分子ＤＮＡ鋳型（ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ）を、それぞれのクラスターがおよそ１０００クローン分子を含有するクローン増幅されたアーチ形「クラスター」に変換する。およそ５０×１０６の個別のクラスターをフローセル当たりに生成することができる。シークエンシングについては、クラスターを変性させ、続く化学的切断反応および洗浄によりシングルエンドシークエンシング用にフォワード鎖のみを残す。フォワード鎖のシークエンシングを、アダプター配列に相補的なプライマーをハイブリダイズすることにより開始した後、ポリメラーゼおよび異なる４色の蛍光リバーシブルダイターミネーターの混合物を添加する。ターミネーターを、クローンクラスターの各鎖に相補的な配列に従い組み込む。組み込まれた後、過剰の試薬を洗い流し、クラスターを必要に応じて調べ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）、蛍光を記録する。続く化学ステップで、リバーシブルダイターミネーターを取り除き（ｕｎｂｌｏｃｋｅｄ）、蛍光標識を切断し、洗い流し、次のシークエンシングサイクルを行う。この繰り返しの、合成によるシークエンシングプロセスは、３６塩基のリード長を作製するためにおよそ２．５日を必要することもある。フローセル当たりに５０×１０６個のクラスターを用いて、全体の配列出力が、分析試行当たり１０億塩基対（Ｇｂ）より大きくなり得る。
本明細書に記載の方法とともに使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、４５４シークエンシング（Ｒｏｃｈｅ）である。４５４シークエンシングは、実行当たり約４００〜６００メガ塩基のＤＮＡをシークエンシングすることができる大規模並列パイロシークエンシング系を使用する。プロセスは典型的に２つのステップを含む。第１のステップにおいて、サンプル核酸（例えば、ＤＮＡ）は、小さいフラグメント（３００〜８００塩基対）に分画され、仕上げが施される（各末端で平滑化する）こともある。次いで、短いアダプターをフラグメントの末端にライゲーションする。これらのアダプターは、サンプルライブラリフラグメントの増幅およびシークエンシングの両方においてプライミング配列を提供する。１つのアダプター（アダプターＢ）は、ストレプトアビジン被覆ビーズにＤＮＡライブラリを固定するための５’ビオチンタグを含有する。ニック修復後、非ビオチン化された鎖を放出し、１本鎖鋳型ＤＮＡ（ｓｓｔＤＮＡ）ライブラリとして使用する。ｓｓｔＤＮＡライブラリを、力価により決定されるｅｍＰＣＲに必要とされるその質および最適量（ビーズ当たりのＤＮＡコピー数）について評価する。ｓｓｔＤＮＡライブラリを、ビーズに固定する。ライブラリフラグメントを含有するビーズは、単一ｓｓｔＤＮＡ分子を担持する。ビーズ結合ライブラリを、油中水型混合物中に増幅試薬を用いて乳化させる。各ビーズを、ＰＣＲ増幅が生じるビーズ用のマイクロリアクター内で捕捉する。これにより、ビーズ固定した、クローン増幅されたＤＮＡフラグメントが生じる。
４５４シークエンシングの第２のステップにおいて、１本鎖鋳型ＤＮＡライブラリビーズを、ＤＮＡポリメラーゼを含有するインキュベーション混合物に添加し、ピコリットルのサイズのウェルを含有するデバイス上にスルフリラーゼおよびルシフェラーゼを含有するビーズとともに層にする。パイロシークエンシングを、各ＤＮＡフラグメントにおいて並列に行う。１つまたはそれより多いヌクレオチドの付加により、シークエンシング機器内のＣＣＤカメラにより記録される光信号を生成する。信号強度は、組み込まれたヌクレオチドの数に比例する。パイロシークエンシングは、ヌクレオチド付加時に、ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を利用する。ＰＰｉを、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下において、ＡＴＰスルフリラーゼによりＡＴＰに変換する。ルシフェラーゼは、ＡＴＰを使用し、ルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応により、識別および分析される光を生成する（例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ４３７：３７６−３８０（２００５）を参照のこと）。
本明細書において提供される方法に使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳＯＬｉＤ（商標）技術である。ライゲーションによるＳＯＬｉＤ（商標）シークエンシングにおいて、核酸フラグメントのライブラリを、サンプルから調製し、クローンビーズ集団を調製するために使用する。この方法を用いて、核酸フラグメントの１種が、各ビーズ（例えば、磁気ビーズ）の表面に存在する。サンプル核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）をフラグメントにせん断し、続いて、アダプターをフラグメントの５’および３’末端に結合させ、フラグメントライブラリを作製する。アダプターは典型的に、ユニバーサルアダプター配列であるため、各フラグメントの開始配列は公知であり、同一である。エマルジョンＰＣＲは、ＰＣＲに必要な試薬全てを含有するマイクロリアクターで行われる。次いで、ビーズに結合した、結果として得られたＰＣＲ生成物を、ガラススライドに共有結合させる。次いで、プライマーがライブラリ鋳型内でアダプター配列にハイブリダイズする。４つの蛍光標識させた２塩基プローブのセットが、シークエンシングプライマーにライゲーションするため競合する。２塩基プローブの特異性は、各ライゲーション反応において、第１および第２の塩基毎に調べることにより得られる。複数のライゲーションサイクル、検出および切断は、最終的なリード長を決定するサイクル数を用いて行われる。一連のライゲーションサイクルの後に、伸長生成物を取り出し、鋳型を第２のラウンドのライゲーションサイクルのためにｎ−１位に対して相補的なプライマーを用いて再設定する。多くの場合、各配列タグについて、５ラウンドのプライマー再設定が完了する。プライマー再設定プロセスにより、各塩基を、２つの異なるプライマーによる２つの独立したライゲーション反応において調べる。例えば、リード位置５の塩基を、ライゲーションサイクル２のプライマー番号２により、およびライゲーションサイクル１のプライマー番号３によりアッセイする。
本明細書に記載の方法に使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ単一分子シークエンシング（ｔＳＭＳ）である。ｔＳＭＳ技法において、ポリＡ配列を、サンプルからの各核酸（例えば、ＤＮＡ）鎖の３’末端に付加する。各鎖を、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加により標識する。次いで、ＤＮＡ鎖を、フローセルにハイブリダイズし、これは、フローセル表面に固定される数百万のオリゴＴ捕捉部位を含有する。鋳型は、約１億個の鋳型／ｃｍ２の密度であってよい。次いで、フローセルをシークエンシング装置にロードし、レーザーをフローセルの表面に照射し、各鋳型の位置を明らかにする。ＣＣＤカメラは、フローセル表面の鋳型の位置をマッピングすることができる。次いで、鋳型蛍光標識を切断し、洗い流す。シークエンシング反応を、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識されたヌクレオチドを導入することにより開始する。オリゴＴ核酸は、プライマーとして作用する。ポリメラーゼは、標識されたヌクレオチドを鋳型指向性の様式でプライマーに組み込む。ポリメラーゼおよび組み込まれていないヌクレオチドを除去する。蛍光標識されたヌクレオチドを定方向に組み込んだ鋳型を、フローセル表面を画像化することにより検出する。画像化後、切断ステップにより蛍光標識を除去し、このプロセスを、所望のリード長を達成するまで他の蛍光標識されたヌクレオチドを用いて繰り返す。配列情報を、各ヌクレオチド付加ステップを用いて収集する（例えば、Ｈａｒｒｉｓ Ｔ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３２０：１０６−１０９（２００８）を参照のこと）。
本明細書に提供される方法に使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子のリアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））シークエンシング技術である。この方法を用いて、４つのＤＮＡ塩基のそれぞれを、４つの異なる蛍光色素の１つに結合させる。これらの色素はホスホ結合する（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｎｋｅｄ）。１本鎖ＤＮＡポリメラーゼを、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の底部にて鋳型１本鎖ＤＮＡの単一分子と固定する。ＺＭＷは、ＺＭＷ外で急速（ミリ秒で）に拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグランドに対してＤＮＡポリメラーゼにより単一のヌクレオチドの組み込みを観察することができる閉じ込め構造である。ヌクレオチドを、成長する鎖に組み込むには数ミリ秒かかる。この間、蛍光標識を、励起させ、蛍光信号を生成し、蛍光タグを切断する。色素の対応する蛍光の検出は、塩基が組み込まれたことを示す。次いで、プロセスを繰り返す。
本明細書に記載の方法に使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、化学的にコードされた情報（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を半導体チップ上でデジタル情報（０、１）に直接翻訳する、簡易なシークエンシング化学を用いた半導体技術を組み合わせたＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）単一分子シークエンシングである。ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴは、微細加工されたウェルの高密度アレイを使用し、大規模並列手段で核酸シークエンシングを行う。各ウェルは、異なるＤＮＡ分子を保持する。ウェルの下は、イオン感受性層であり、その下はイオンセンサーである。典型的に、ヌクレオチドを、ポリメラーゼによりＤＮＡの鎖に組み込むときに、水素イオンを副生成物として放出する。ヌクレオチド、例えば、ＣをＤＮＡ鋳型に付加した後、ＤＮＡの鎖に組み込む場合、水素イオンが放出される。そのイオンからの電荷が溶液のｐＨを変化させ、これをイオンセンサーにより検出することができる。シーケンサが、塩基を呼び出し、化学情報からデジタル情報に直接進むことができる。次いで、シーケンサは、連続してヌクレオチドを次々とチップに送液する。チップに送液した次のヌクレオチドが一致しない場合、電圧変化を記録せず、塩基は呼び出されない。ＤＮＡ鎖に２つの同一の塩基が存在する場合、電圧を２倍にし、チップは、呼び出された２つの同一の塩基を記録する。これは、直接検出（すなわち、走査、カメラまたは光を用いずに検出）であるため、各ヌクレオチドの組み込みを、秒単位で記録する。
本明細書に記載の方法に使用し得る別の核酸シークエンシング技術は、化学感応型電界効果トランジスタ（ＣＨＥＭＦＥＴ）アレイである。このシークエンシング技法の一例において、ＤＮＡ分子を反応チャンバーに入れ、鋳型分子を、ポリメラーゼに結合させるシークエンシングプライマーにハイブリダイズすることができる。シークエンシングプライマーの３’末端にて、１つまたはそれより多い三リン酸を新しい核酸鎖に組み込むことで、ＣＨＥＭＦＥＴセンサーによる電流の変化により検出することができる。アレイは、複数のＣＨＥＭＦＥＴセンサーを有し得る。別の実施例において、単一の核酸をビーズに結合させ、核酸をビーズ上で増幅させることができ、個々のビーズを、ＣＨＥＭＦＥＴアレイの個々の反応チャンバー（各チャンバーは、ＣＨＥＭＦＥＴセンサーを有する）に移すことができ、核酸をシークエンシングすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号を参照のこと）。
本明細書に記載の方法に使用し得る別の核酸配列決定技術は、電子顕微鏡法である。このシークエンシング技術の一例において、個々の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子を、電子顕微鏡を使用して識別可能である金属標識を使用して標識する。次いで、これらの分子を平坦な表面で伸長させ、電子顕微鏡を使用して画像化し、配列を測定する（例えば、Ｍｏｕｄｒｉａｎａｋｉｓ Ｅ．Ｎ．ａｎｄ Ｂｅｅｒ Ｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９６５ Ｍａｒｃｈ；５３：５６４−７１を参照のこと）。いくつかの例において、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を使用する（例えば、Ｈａｌｃｙｏｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＴＥＭ法）。この方法は、Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｒａｐｉｄ Ｎａｎｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＩＭＰＲＮＴ）と呼ばれ、重原子マーカーで選択的に標識された高分子量（例えば、約１５０ｋｂ以上）のＤＮＡの単原子分解能透過型電子顕微鏡イメージングを利用し、塩基間の空間が一貫している超高密度（３ｎｍ鎖間）並列アレイにおいて超薄膜上にこれらの分子を整列させることを含む。電子顕微鏡を膜上の分子を画像化するために使用し、重原子マーカーの位置を決定し、ＤＮＡから塩基配列情報を抽出する（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０４６４４５号を参照のこと）。
本明細書において方法を行うために使用し得る他のシークエンシング方法は、デジタルＰＣＲおよびハイブリダイゼーションによるシークエンシングを含む。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲまたはｄＰＣＲ）を使用し、サンプル内の核酸を直接同定し、定量化することができる。いくつかの実施形態において、デジタルＰＣＲをエマルジョンで行うことができる。例えば、個々の核酸を、例えば、マイクロ流体チャンバーデバイス内で分離し、各核酸を、ＰＣＲにより個々に増幅させる。核酸を、ウェル当たり１核酸以下が存在するように分離することができる。いくつかの実施形態において、異なるプローブを使用し、種々のアレル（例えば、胎児アレルおよび母体アレル）を区別することができる。アレルを列挙し、コピー数を決定することができる。ハイブリダイゼーションによるシークエンシングにおいて、方法は、複数のポリヌクレオチド配列と、複数のポリヌクレオチドプローブを接触させることを含み、この場合、複数のポリヌクレオチドプローブのそれぞれを、必要に応じて基材に結合させることができる。いくつかの実施形態において、基材は、公知のヌクレオチド配列のアレイを含む平坦な表面であってよい。アレイにハイブリダイゼーションするパターンを使用して、サンプル内に存在するポリヌクレオチド配列を決定することができる。いくつかの実施形態において、各プローブをビーズ、例えば、磁気ビーズなどに結合させる。ビーズのハイブリダイゼーションは同定することができ、かつサンプル内の複数のポリヌクレオチド配列の同定に使用することができる。
いくつかの実施形態において、ナノポアシークエンシングを本明細書に記載の方法に使用することができる。ナノポアシークエンシングは、単一分子シークエンシング技術であり、これにより単一核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を、それがナノポアを通過するときに直接シークエンシングする。ナノポアは、直径がほぼ１ナノメートルの小さな孔またはチャンネルである。特定の膜貫通型細胞タンパク質が、ナノポア（例えば、アルファ−ヘモリシン）として作用することができる。いくつかの例において、ナノポアを合成することができる（例えば、シリコンプラットフォームを使用）。伝導液にナノポアを浸潤させ、それ全体に電位を加えることにより、ナノポアを通したイオンの伝導によりわずかな電流が生じる。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに影響を受けやすい。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するとき、ＤＮＡ分子上の各ヌクレオチドが、異なる程度でナノポアを遮断し、電流に特徴的な変化が生じる。任意の所与の時点にてナノポアを通過することができる電流の量は、それゆえ、ナノポアがＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔまたはいくつかの例において、メチル−Ｃにより遮断されるかどうかに応じて異なる。いくつかの例において、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときに、ナノポアを介する電流の変化が、ＤＮＡ配列の直接の読み取りを表す。ナノポアを使用し、正しい順でナノポアを通過するときに個々のＤＮＡ塩基を同定することができる（例えば、Ｓｏｎｉ ＧＶ ａｎｄ Ｍｅｌｌｅｒ Ａ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：１９９６−２００１ （２００７）；国際特許出願第ＷＯ２０１０／００４２６５号を参照のこと）。
ナノポアを使用し、核酸分子をシークエンシングすることができる多くの方法がある。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼ酵素、例えば、デオキシリボヌクレアーゼを使用する。この場合において、エキソヌクレアーゼ酵素を使用し、核酸（例えば、ＤＮＡ）分子からのヌクレオチドを連続して分離する。次いで、ヌクレオチドを検出し、その放出の順にナノポアにより識別されるため、元の鎖の配列を読み取る。このような実施形態において、エキソヌクレアーゼ酵素を、ＤＮＡ分子から放出されたヌクレオチドの割合が、ナノポアのチャンネルに進入し、これと相互作用することができるようにナノポアに結合させることができる。エキソヌクレアーゼを、チャンネルの開口部を形成するナノポアの部分にかなり近接する部位にてナノポア構造に結合させることができる。いくつかの例において、エキソヌクレアーゼ酵素を、そのヌクレオチドの出口の軌道部位（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ ｓｉｔｅ）が、開口部の一部を形成するナノポアの部分に向かうようにナノポア構造に結合させることができる。
いくつかの実施形態において、核酸のナノポアシークエンシングは、ポアを通して核酸（例えば、ＤＮＡ）分子を押し出しまたは引き出す酵素の使用を含む。この場合において、イオン電流は、ＤＮＡ分子のヌクレオチドがポアを通過する場合に変動する。電流の変動は、ＤＮＡ配列を示す。このような実施形態について、ポアを通るイオン電流の流れを干渉することなく、ナノポアのチャンネルを通して標的核酸を押し出しまたは引き出すことができるように、酵素をナノポア構造物に結合させることができる。酵素を、開口部の部分を形成するナノポア構造物の部分にかなり近接な部位にて該構造物に結合させることができる。酵素を、例えば、その活性部位が開口部の部分を形成する構造の部分に向けて配向するように、サブユニットに結合させることができる。
いくつかの実施形態において、核酸のナノポアシークエンシングは、ナノポア検出器にかなり近接したポリメラーゼ副生成物の検出を含む。この場合において、ヌクレオシドリン酸（ヌクレオチド）を標識し、その結果、リン酸標識された種を、ポリメラーゼをヌクレオチド鎖に付加するときに放出し、リン酸標識された種をポアにより検出する。典型的に、リン酸種は、各ヌクレオチドに特異的な標識を含有する。続いて、ヌクレオチドを核酸鎖に付加し、塩基付加の副生成物を検出する。リン酸標識された種を検出する順を使用し、核酸鎖の配列を決定することができる。
配列リードの長さは、多くの場合、特定のシークエンシング技術と関連する。例えば、ハイスループット法は、数十から数百の塩基対（ｂｐ）のサイズで異なり得る配列リードを提供する。例えば、ナノポアシークエンシングは、数十から数十万（ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｔｏ ｔｈｏｕｓａｎｄｓ）の塩基対のサイズで異なり得る配列リードを提供することができる。いくつかの実施形態において、配列リードは、約１５ｂｐ〜９００ｂｐ長（例えば、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４０ｂｐ、約４５ｂｐ、約５０ｂｐ、約５５ｂｐ、約６０ｂｐ、約６５ｂｐ、約７０ｂｐ、約７５ｂｐ、約８０ｂｐ、約８５ｂｐ、約９０ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０ｂｐ、約１２０ｂｐ、約１３０、約１４０ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、または約５００ｂｐの平均値、中央値または平均の長さのものである。いくつかの実施形態において、配列リードは、約１０００ｂｐ以上の平均値、中央値、最頻値または平均の長さのものである。
いくつかの実施形態において、核酸は、蛍光信号または配列タグ情報を含み得る。信号またはタグの定量化を、種々の技法、例えば、フローサイトメトリー、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、遺伝子チップ分析、マイクロアレイ、質量分析、細胞蛍光測定分析、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査型顕微鏡法、レーザー走査型サイトメトリー、アフィニティークロマトグラフィー、マニュアルバッチモード分離、電界懸濁、シークエンシングおよびそれらの組み合わせに使用し得る。
アダプター
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲアンプリコン、サンプル核酸）は、アダプター配列および／またはその相補鎖を含み得る。アダプター配列は、多くの場合、特定のシークエンシング方法、例えば、本明細書に記載される合成によるシークエンシングプロセスにとって有用である。アダプターは、シークエンシングアダプターまたはアダプターオリゴヌクレオチドと呼ばれることもある。アダプター配列は、典型的には、固体支持体（例えば、フローセル）への付着に有用な１つまたは複数の部位を含む。アダプターは、シークエンシングプライマーハイブリダイゼーション部位（すなわち、シークエンシング反応において使用されるプライマーに相補的な配列）および下記に記載されるような識別子（例えば、インデックス）も含み得る。アダプター配列は、核酸の５’および／または３’末端に位置し得、より大きな核酸配列の内部に位置し得ることもある。アダプターは、任意の長さおよび任意の配列であり得、アダプター設計に対する当技術分野の標準的な方法に基づいて選択され得る。
１つまたは複数のアダプターオリゴヌクレオチドが、核酸にアダプター配列を組み込むのに適した任意の方法によって、核酸（例えば、ＰＣＲアンプリコン）に組み込まれ得る。例えば、ＰＣＲアンプリコン（すなわち、増幅産物）を生成するために使用されるＰＣＲプライマーは、アダプター配列またはその相補鎖を含み得る。したがって、１つまたは複数のアダプター配列を含むＰＣＲアンプリコンが、増幅プロセス中に生成され得る。いくつかの例において、アダプター配列を核酸に付着するのに適した任意のライゲーション方法によって、１つまたは複数のアダプター配列が、核酸（例えば、ＰＣＲアンプリコン）にライゲートされ得る。ライゲーションプロセスには、例えば、ブラントエンドライゲーション、増幅プロセス中にＴａｑポリメラーゼによって生成された３’アデニン（Ａ）オーバーハングを利用し、３’チミン（Ｔ）オーバーハングを有するアダプターをライゲートするライゲーション、および他の「粘着末端」ライゲーションが含まれ得る。ライゲーションプロセスは、アダプター配列が、核酸の各端にハイブリダイズするが、互いにはハイブリダイズしないように、最適化され得る。
いくつかの例において、アダプターのライゲーションは、二方向であり、これは、後のシークエンシングプロセスにおいて核酸の両端がシークエンシングされるようにアダプター配列が核酸に付着されることを意味する。いくつかの例において、アダプターのライゲーションは、一方向であり、これは、後のシークエンシングプロセスにおいて核酸の一端がシークエンシングされるようにアダプター配列が核酸に付着されることを意味する。一方向および二方向のライゲーションスキームの例は、実施例４において考察され、図２１および２２に示される。
識別子
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ＰＣＲプライマー、ＰＣＲアンプリコン、サンプル核酸、シークエンシングアダプター）は、識別子を含み得る。いくつかの例において、識別子は、アダプター配列内に位置するか、またはアダプター配列に隣接する。識別子は、ゲノム標的配列の具体的な起源または態様を同定し得る任意の特徴であり得る。例えば、識別子（例えば、サンプル識別子）は、具体的なゲノム標的配列が由来するサンプルを同定し得る。別の例では、識別子（例えば、サンプルアリコート識別子）は、具体的なゲノム標的配列が由来するサンプルアリコートを同定し得る。別の例では、識別子（例えば、染色体識別子）は、具体的なゲノム標的配列が由来する染色体を同定し得る。識別子は、本明細書において、タグ、インデックス、バーコード、同定タグ、インデックスプライマーなどと呼ばれ得る。識別子は、独自のヌクレオチド配列（例えば、配列に基づく識別子）、検出可能な標識、例えば、下記に記載される標識（例えば、識別子標識）および／または具体的な長さのポリヌクレオチド（例えば、長さに基づく識別子；サイズに基づく識別子）、例えば、スタッファー配列であり得る。例えば、サンプルのコレクションまたは複数の染色体に対する識別子は、各々が独自のヌクレオチド配列を含み得る。識別子（例えば、配列に基づく識別子、長さに基づく識別子）は、特定の標的ゲノム配列を他の標的ゲノム配列と区別するのに適した任意の長さであり得る。いくつかの実施形態において、識別子は、約１〜約１００ヌクレオチド長であり得る。例えば、識別子は、独立して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、識別子は、６ヌクレオチドの配列を含む。いくつかの例において、識別子は、シークエンシングプロセス、例えば、本明細書にさらに詳細に記載される合成によるシークエンシングプロセスのためのアダプター配列の一部である。いくつかの例において、識別子は、単一ヌクレオチドの反復配列（例えば、ポリＡ、ポリＴ、ポリＧ、ポリＣ）であり得る。そのような識別子は、例えば、本明細書に記載されるようなナノポア技術を使用して、検出され得、互いと区別され得る。
いくつかの実施形態において、上記分析は、識別子を分析すること（例えば、検出すること、カウントすること、その識別子に対するカウントを処理することなど）を含む。いくつかの実施形態において、検出プロセスは、識別子を検出することを含み、核酸の他の特徴（例えば、配列）を検出することを含まないこともある。いくつかの実施形態において、カウントプロセスは、各識別子をカウントすることを含む。いくつかの実施形態において、識別子は、検出される、分析される、および／またはカウントされる、核酸の唯一の特徴である。
胎児の異数性の検出
胎児の異数性を検出するために、いくつかの方法が、母性遺伝されたアレルと父性遺伝されたアレルとの比の測定に依存する。しかしながら、染色体の変化を定量化する能力は、無細胞核酸に対する母体の関与によって損なわれ、そのせいで、測定の前に母体ＤＮＡ由来のサンプルを枯渇させることが必要になる。有望なアプローチは、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとで異なるサイズ分布を利用するか、またはもっぱら胎児によって発現されるＲＮＡを測定する（例えば、ＵＳ２００６０２５２０７１として公開されており、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願番号１１／３８４１２８を参照のこと）。胎児ＤＮＡが、母体血漿中の全無細胞ＤＮＡの約５％しか構成しないと仮定すると、トリソミーサンプルと健常コントロールとの間の比の差異は、１．６％からたった約１．２％にしか低下しない。その結果として、アレル比の変化の信頼度の高い検出には、例えば、本技術の組成物および方法を使用した、無細胞ＤＮＡの胎児画分の富化が必要である。
いくつかの方法は、母体血漿から胎児の染色体の異数性を検出するために、母体遺伝されたアレルと父性遺伝されたアレルとの比の測定に依存する。二倍体セットは、１：１という比をもたらすが、トリソミーは、２：１という比として検出され得る。この差異の検出は、胎児ＤＮＡの存在量が少ないこと、血漿サンプル中に過剰量の母体ＤＮＡが存在すること、および測定技術のばらつきに起因する、統計学的サンプリングによって損なわれる。後者は、デジタルＰＣＲまたは質量分析のような、高い測定精度を有する方法を用いることによって対処される。サンプル中の無細胞ＤＮＡの胎児画分の富化は、現在、サイズ排除によって母体ＤＮＡを枯渇させることまたは胎児によって発現されるＲＮＡのような胎児特異的核酸に注目することによって達成される。胎児ＤＮＡの別の判別特徴は、そのＤＮＡメチル化パターンである。したがって、胎児と母親との間の差次的なメチル化に基づいて胎児核酸を正確に定量化するための新規組成物および方法が、本明細書に提供される。その方法は、母体サンプルの胎児核酸部分を定量化する高感度の絶対コピー数分析に依存し、それにより、胎児の形質の出生前検出が可能になる。本明細書における技術の方法は、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間で差次的にメチル化された、ゲノム内のおよそ３０００個のＣｐＧリッチ領域を同定した。選択された領域は、測定された全てのサンプルにわたって、高度に保存された差次的なメチル化を示した。さらに、その領域のセットは、発生の制御において重要な遺伝子について富化されることから、これらの範囲のエピジェネティックな制御が、生物学的に関連性がありかつ一貫したプロセスであることが示唆される（表３を参照のこと）。胎児ＤＮＡの富化は、現在、ＭＢＤ−ＦＣタンパク質を使用して全ての無細胞ＤＮＡを捕捉し、次いで、高度にメチル化されたＤＮＡ画分を高塩濃度で溶出することによって、達成され得る。低塩溶出液画分を使用すると、そのＭＢＤ−ＦＣは、メチル化されていない胎児ＤＮＡを同様に富化することができる。
本技術は、低母体メチル化レベルおよび高胎児メチル化レベルを有する、１３、１８および２１番染色体上の６３個の確認されたゲノム領域を提供する。これらの領域を捕捉した後、ＳＮＰを使用することにより、上述のアレル比を測定することができる。両親が逆のホモ接合体遺伝子型を有し、子供がヘテロ接合体遺伝子型を有する場合、高頻度ＳＮＰを使用すると、少なくとも１つのＳＮＰを高信頼度で発見するために、およそ１０個のマーカーを測定しなければならない。
ある実施形態において、絶対コピー数の定量化を利用する、染色体の異常を検出する方法が提供される。二倍体染色体セットは、全ての染色体にわたって、差次的にメチル化される領域について同じコピー数を示すが、例えば、トリソミー２１サンプルであれば、２１番染色体上の差次的にメチル化される領域について１．５倍多いコピー数を示すだろう。二倍体染色体セットに対するゲノムＤＮＡ量の正規化は、変化していない常染色体を参照として使用することによって達成され得る（本明細書にも提供される、表１Ｂを参照のこと）。他のアプローチと同じように、単一のマーカーは、全コピー数が少ないので、この差異の検出にとって十分である可能性は低い。典型的には、妊娠１０〜１２週の１ｍｌの母体血漿におよそ１００〜２００コピーの胎児ＤＮＡが存在する。しかしながら、本技術の方法は、二倍体と異数体の染色体セットとの非常に信頼度の高い識別を可能にする検出可能なマーカーの重複をもたらす。
データ処理および染色体異常の有無の同定
染色体異常の「検出」という用語は、本明細書において使用される場合、増幅された核酸種、ヌクレオチド配列種、または前述のものから生成された検出可能な産物（集合的に「検出可能な産物」）のセットを検出することから生じたデータを処理することによって、染色体の不均衡を同定することを指す。任意の適切な検出デバイスおよび検出方法が、本明細書において扱われる検出可能な産物の１つまたは複数のセットを区別するために使用され得る。染色体異常の有無に関係するアウトカムは、被験体またはサンプルに対する染色体異常の存在に関連する、確率（例えば、オッズ比、ｐ値）、尤度、パーセンテージ、閾値を超える値または危険因子を含むがそれらに限定されない任意の適切な形態で表現され得る。アウトカムは、特定の実施形態において、感度、特異性、標準偏差、変動係数（ＣＶ）および／もしくは信頼水準、または前述のものの組み合わせの１つまたは複数によって提供され得る。
検出可能な産物の１つまたは複数のセットに基づく染色体異常の検出は、感度、特異性、標準偏差、変動係数（ＣＶ）、閾値、信頼水準、スコア、確率および／またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない１つまたは複数の計算された変数に基づいて同定され得る。いくつかの実施形態において、（ｉ）診断法に対して選択されたセットの数、および／または（ｉｉ）診断法に対して選択された各セットの具体的なヌクレオチド配列種が、そのような計算された変数の１つまたは複数に従って、部分的または全体的に、測定される。
特定の実施形態において、感度、特異性および／または信頼水準の１つまたは複数が、パーセンテージとして表現される。いくつかの実施形態において、そのパーセンテージは、各変数に対して独立して、約９０％超（例えば、約９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％または９９％超（例えば、約９９．５％以上、約９９．９％以上、約９９．９５％以上、約９９．９９％以上））である。変動係数（ＣＶ）は、いくつかの実施形態において、パーセンテージとして表現され、そのパーセンテージは、約１０％以下（例えば、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１％または１％未満（例えば、約０．５％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０１％以下））であることもある。確率（例えば、アルゴリズムによって測定された具体的なアウトカムが偶然に起因しない確率）は、特定の実施形態において、ｐ値として表現され、そのｐ値は、約０．０５以下（例えば、約０．０５、０．０４、０．０３、０．０２もしくは０．０１、または０．０１未満（例えば、約０．００１以下、約０．０００１以下、約０．００００１以下、約０．０００００１以下））であることもある。
例えば、スコアリングまたはスコアは、具体的な染色体異常が被験体／サンプル中に実際に存在するかまたは存在しない確率を計算することを指し得る。スコアの値は、例えば、実際の染色体異常に対応し得る増幅された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）の検出可能な産物の変動、差異または比を決定するために使用され得る。例えば、検出可能な産物から陽性スコアが計算されることにより、単一サンプルの分析に特に関連性のある染色体異常が同定され得る。
特定の実施形態において、シミュレートされた（またはシミュレーション）データは、例えば、アルゴリズムを訓練するかまたはアルゴリズムを試験することによって、データ処理を助け得る。シミュレートされたデータは、例えば、血清、血漿などにおける様々な濃度の胎児核酸および母体核酸の様々な仮定のサンプルを含み得る。シミュレートされたデータは、現実の集団から予想され得るものに基づき得るか、またはアルゴリズムを試験するためおよび／もしくはシミュレートされたデータセットに基づいて正確な分類を割り当てるために偏っている場合がある。シミュレートされたデータは、本明細書において「仮想」データとも呼ばれる。サンプル内における胎児／母体の寄与が、数の表もしくはアレイとして（例えば、参照生体分子または増幅された核酸配列の切断産物の質量信号に対応するピークのリストとして）、質量スペクトルとして、ゲル上のバンドパターンとして、または質量分布を測定する任意の手法の表示として、シミュレートされ得る。シミュレーションは、ほとんどの例において、コンピュータプログラムによって行われ得る。シミュレートされたデータセットを使用する際の１つのありうるステップは、同定された結果の信頼度、すなわち、選択された陽性／陰性が、どれくらい十分にそのサンプルに当てはまっているか、およびそれに加わる変動があるか否かを評価することである。通常のアプローチは、選択されたものよりも良いスコアを有するランダムなサンプルの確率を推定する確率値（ｐ値）を計算することである。ｐ値の計算が、特定の状況で許容され得ない場合、経験的なモデルを評価してもよく、この経験的なモデルでは、少なくとも１つのサンプルが（変動の分解の有無にかかわらず）基準となるサンプルに当てはまると仮定される。あるいは、ポアソン分布などの他の分布が、確率分布を説明するために使用され得る。
特定の実施形態において、アルゴリズムが、計算された真陽性、真陰性、偽陽性および偽陰性に対して信頼度の値を割り当て得る。染色体異常の発生の尤度の割り当てもまた、特定の確率モデルに基づき得る。
シミュレートされたデータは、多くの場合、インシリコプロセスにおいて生成される。本明細書において使用される場合、用語「インシリコ」とは、コンピュータを用いて行われる調査および実験のことを指す。インシリコ方法としては、分子モデリング研究、核型分析、遺伝的計算、生体分子ドッキング実験、ならびに分子構造および／または分子相互作用などの分子プロセスの仮想表現が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書において使用される場合、「データ処理ルーチン」とは、取得したデータの生物学的意義（すなわち、アッセイの最終結果）を決定する、ソフトウェアに含まれ得るプロセスのことを指す。例えば、データ処理ルーチンは、収集されたデータに基づいて各ヌクレオチド配列種の量を決定し得る。データ処理ルーチンは、決定された結果に基づいて、機器および／またはデータ収集ルーチンも制御し得る。データ処理ルーチンおよびデータ収集ルーチンは、多くの場合、統合され、その機器によるデータ取得を操作するフィードバックを提供し、ゆえに、本明細書に提供されるアッセイベースの判断方法が提供される。
本明細書において使用される場合、ソフトウェアは、コンピュータによって実行されるときにコンピュータ操作を行うコンピュータ可読のプログラム命令のことを指す。典型的には、ソフトウェアは、コンピュータ可読媒体上に記録されたプログラム命令を含むプログラム製品において提供され、そのコンピュータ可読媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスクおよび磁気テープを含む磁気媒体；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスク、ＤＶＤディスク、光磁気ディスクを含む光学媒体、ならびにプログラム命令が記録され得る他のそのような媒体が挙げられるが、それらに限定されない。
異常または正常を予測する様々な方法が、様々なタイプの結果をもたらし得る。任意の所与の予測について、可能性のある４つのタイプのアウトカム：真陽性、真陰性、偽陽性または偽陰性が存在する。用語「真陽性」は、本明細書において使用される場合、染色体異常を有すると正しく診断された被験体のことを指す。用語「偽陽性」は、本明細書において使用される場合、染色体異常を有すると誤って同定された被験体のことを指す。用語「真陰性」は、本明細書において使用される場合、染色体異常を有しないと正しく同定された被験体のことを指す。用語「偽陰性」は、本明細書において使用される場合、染色体異常を有しないと誤って同定された被験体のことを指す。任意の所与の方法に対する性能の２つの尺度は、これらの発生頻度の比に基づいて計算され得る：（ｉ）感度の値、すなわち、陽性であると正しく同定される予測陽性の割合（例えば、そのように正しくまたは誤って同定された全てのヌクレオチド配列セットに対する、染色体異常を示唆するようなレベル比較検出／測定によって正しく同定されるヌクレオチド配列セットの割合）であって、これにより、染色体異常を検出する際の結果の精度が反映される、値；および（ｉｉ）特異性の値、すなわち、陰性であると正しく同定される予測陰性の割合（そのように正しくまたは誤って同定された全てのヌクレオチド配列セットに対する、染色体正常を示唆するようなレベル比較検出／測定によって正しく同定されるヌクレオチド配列セットの割合）によって、染色体異常を検出する際の結果の精度が反映される、値。
以下の実施例は、限定目的ではなく、例示という目的だけで提供される。したがって、下記に示される実施例は、特定の実施形態を例証するが、本技術を限定しない。当業者は、変更されるかまたは改変されても本質的に同じまたは類似の結果をもたらし得る種々の重要でないパラメータを容易に認識するだろう。
下記の実施例１では、本出願人は、ＣｐＧアイランドアレイと組み合わせて、メチル化されたＤＮＡを捕捉する新規融合タンパク質を使用することにより、胎児の胎盤組織と母体の血液との間で差次的にメチル化されたゲノム領域を同定した。厳密な統計学的アプローチを用いることにより、サンプル間でほとんどばらつきを示さない領域だけが選択され、ゆえに根底にある生物学的メカニズムが示唆された。主に１３、１８および２１番染色体上に位置する８５個の差次的にメチル化されたゲノム領域を検証した。この検証のために、これらの８５個の領域をカバーする２６１個のＰＣＲアンプリコンを調べる定量的質量分析ベースのアプローチを用いた。それらの結果は、非常に良く一致していることから（９５％確認）、このアプローチの実行可能性が証明される。
次に、本出願人は、アレル比ではなく絶対コピー数の測定に依存する、異数性検査用の画期的なアプローチを提供する。
実施例１
下記の実施例では、母体ＤＮＡと胎盤ＤＮＡとの１０対のサンプルを用いることにより、差次的にメチル化された領域を同定した。これらの結果は、質量分析ベースの定量的メチル化アッセイを用いて検証された。第１に、母体のバフィーコート由来および対応する胎盤組織由来のゲノムＤＮＡをまず抽出した。次に、ＭＢＤ−ＦＣを用いることにより、各ＤＮＡサンプルのメチル化された画分を捕捉した。図１〜３を参照のこと。２つの組織画分を異なる蛍光色素で標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄマイクロアレイにハイブリダイズさせた。図４を参照のこと。これを行うことにより、出生前診断に利用され得る差次的にメチル化された領域が同定された。それゆえ、２つの基準を使用することにより、潜在的な富化マーカーとしてのゲノム領域が選択された：観察されたメチル化の差は、検査された全てのサンプル対に存在しなければならないし、その領域は、２００ｂｐを超える長さでなければならなかった。
ＤＮＡの調製および断片化
母体のバフィーコート由来および胎盤組織由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をそれぞれ、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）およびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（商標）を用いて調製した。ＭＣＩｐのために、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ １０００（商標）分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標），Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いてｇＤＮＡを定量化した。Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ４５０（商標）（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）を以下の設定：振幅２０％、超音波処理時間１１０秒、パルスオン／パルスオフ時間１．４／０．６秒を用いて、２．５μｇのＤＮＡを５００μｌのＴＥ緩衝液中で３００〜５００ｂｐの平均フラグメントサイズに超音波処理した。フラグメントの範囲を、ゲル電気泳動を用いてモニターした。
メチル−ＣｐＧ免疫沈降
１サンプルあたり、５６μｇの精製ＭＢＤ−Ｆｃタンパク質および１５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標），Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を１５ｍｌのＴＢＳ中において４℃で一晩回転させた。次いで、そのＭＢＤ−Ｆｃビーズ（１５０μｌ／アッセイ）を、２ｍｌのＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＣＬ遠心濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標），Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に移し、それに分散させ、ＢｕｆｆｅｒＡ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ ３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＮＰ−４０）で３回、遠心分離によって洗浄した。２ｍｌのＢｕｆｆｅｒＡ中の洗浄されたＭＢＤ−Ｆｃビーズに超音波処理されたＤＮＡ（２μｇ）を加え、４℃で３時間回転させた。ビーズを遠心分離することにより、未結合のＤＮＡフラグメント（３００ｍＭの画分）を回収し、続いて増加性のＮａＣｌ濃度（４００、５００、５５０、６００および１０００ｍＭ）を含む６００μｌの緩衝液で２回洗浄した。各洗浄ステップのフロースルーを個別のチューブに回収し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて脱塩した。並行して、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて、２００ｎｇの超音波処理された投入ＤＮＡをコントロールとして処理した。
マイクロアレイの操作および分析
マイクロアレイハイブリダイゼーション用の蛍光標識ＤＮＡを生成するために、各サンプルに対する６００ｍＭおよび１ＭのＮａＣｌ画分（富化されたメチル化されたＤＮＡ）を併せ、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰ（母体）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ａｈａ−ｄＣＴＰ（胎盤）で標識した。この標識反応は、製造者のマニュアルに従って行われた。対応する母体／胎盤対の差次的に標識されたゲノムＤＮＡフラグメントを、５０μｇのＣｏｔ−１ ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、５２μｌのＡｇｉｌｅｎｔ１０×ブロッキング試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標），Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、７８μｌの脱イオンホルムアミドおよび２６０μｌのＡｇｉｌｅｎｔ２×ハイブリダイゼーション緩衝液が補充された最終体積８０μｌになるように併せた。そのサンプルを３分間９５℃に加熱し、混合し、続いて３７℃において３０分間インキュベートした。次いで、Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｋｉｔ（商標）におけるハイブリダイゼーションを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＨｙｂ（商標）チャンバーおよびＡｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーションオーブンを使用して６７℃において４０時間行った。スライドを、室温において５分間、Ｗａｓｈ Ｉ（６×ＳＳＰＥ、０．００５％Ｎ−ラウロイルサルコシン）中で洗浄し、３７℃においてさらに５分間、Ｗａｓｈ ＩＩ（０．０６×ＳＳＰＥ）中で洗浄した。次に、そのスライドをアセトニトリルおよびＡｇｉｌｅｎｔ Ｏｚｏｎｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）中に、それぞれ３０秒間浸漬した。直ちにＡｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（商標）を用いて像をスキャンし、分析した。Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ９．５および標準的なＣＧＨプロトコルを用いて、マイクロアレイ像を処理した。
亜硫酸水素塩処理
ゲノムＤＮＡの亜硫酸水素ナトリウム変換を、ＥＺ−９６ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商標）（ＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ Ｃｏｕｎｔｙ，ＣＡ）を用いて行った。製造者のプロトコルに従って、１μｇのゲノムＤＮＡおよび交互変換プロトコル（２温度のＤＮＡ変性）を用いた。
定量的メチル化分析
ＳｅｑｕｅｎｏｍのＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いることにより、定量的メチル化分析を行った。このシステムは、飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析をＲＮＡ塩基特異的切断（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（商標））と組み合わせて利用する。次いで、検出可能なパターンをメチル化の状態について分析する。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＤＥＳＩＧＮＥＲ（商標）（ｗｗｗ．ｅｐｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｃｏｍ）を用いて、ＰＣＲプライマーを設計した。８５個の標的領域をカバーする合計２６１個のアンプリコンを、検証のために使用した（増幅長中央値＝３６７ｂｐ、最小値＝１０８、最大値＝５００；１アンプリコンあたりのＣｐＧ数の中央値＝２３、最小値＝４、最大値＝６５）。各リバースプライマーについてはインビボ転写用のさらなるＴ７プロモータータグ、ならびにフォワードプライマーには融解温度の差について調節する１０ｍｅｒのタグが付加された。ＭａｓｓＣＬＥＡＶＥ（ｔｍ）の生化学反応を以前に報告されているように行った（Ｅｈｒｉｃｈ Ｍ，ら、（２００５）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１５７８５−１５７９０）。ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（商標）Ｃｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて質量スペクトルを取得し、メチル化の比をＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）ソフトウェアｖ１．０（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）によって生成した。
統計分析
全ての統計的計算を、Ｒ統計学的ソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて行った。まず、アレイプローブをそれらのゲノム位置に基づいてグループ分けした。続いて、１０００ｂｐ以上離れていないプローブを一緒にグループ分けした。差次的にメチル化された領域を同定するために、コントロールサンプルを参照として使用した。コントロールサンプルにおいて、血液由来コントロールＤＮＡのメチル化画分を、それ自体に対してハイブリダイズさせた。理想的には、このサンプルは、およそ０の２色チャンネルのｌｏｇ比を示すべきである。しかしながら、ハイブリダイゼーション挙動のばらつきが原因で、それらのプローブは、０．０２という平均ｌｏｇ比および０．１８という標準偏差を示す。次に、それらのサンプルにおいて観察されたｌｏｇ比をコントロールサンプルと比較した。二元配置の（ｔｗｏ ｗａｙ）対応のあるｔ検定を用いることにより、それらのグループが同一であるという帰無仮説を試験した。４つ未満のプローブしか含まないグループをこの分析から除外した。４または５つのプローブを含むグループについては、全てのプローブを対応のあるｔ検定に使用した。６つ以上のプローブを含むグループについては、１回につき５つのプローブからなるスライディングウィンドウ検定（ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ｔｅｓｔ）を用い、そのウィンドウを、プローブ１つ分ずつ移動させた。各試験サンプルをコントロールサンプルと比較し、ｐ値を記録した。１０個中８個のサンプルがｐ値＜０．０１を示すか、または１０個中６個のサンプルがｐ値＜０．００１を示す場合に、ゲノム領域を、差次的にメチル化されているとして選択した。そのグループの８個未満のサンプルがｐ値＜０．０１を示し、６個未満のサンプルがｐ値＜０．００１を示すとき、そのゲノム領域を差次的にメチル化されていないと分類した。いずれのカテゴリーにも入らなかったサンプルは、この分析から除外した。差次的にメチル化されていると同定されたゲノム領域のサブセットについて、その結果を、定量的メチル化分析を用いて確認した。
オンラインのＧＯｓｔａｔツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｏｓｔａｔ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ／ｃｇｉｂｉｎ／−ｇｏＳｔａｔ．ｐｌ）を用いてＧｏ分析を行った。フィッシャーの正確検定を用いてＰ値を計算した。
マイクロアレイに基づいたマーカー発見の結果
差次的にメチル化された領域を同定するために、単球のメチル化されたＤＮＡ画分をそれ自体に対してハイブリダイズさせた標準的なサンプルを使用した。この標準物質は、あるゲノム領域における蛍光測定値のばらつきに対する参照を提供した。次いで、この標準に対する１０個の胎盤／母体サンプルの各々のｌｏｇ比を比較することによって、差次的にメチル化された領域を同定した。本研究の目的は、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの信頼度の高い分離を可能にするマーカーを同定することであるので、標的の選択は、ある連続した一続きのゲノムＤＮＡにわたって安定して一貫したメチル化の差を示す遺伝子に限定された。これにより、その分析の焦点が、複数のプローブが差次的なメチル化を示唆するゲノム領域に当てられた。その選択は、個体間の差が大きいサンプルを除く全てのサンプルが差次的なメチル化を示す標的領域にも限定された。これらのサンプルのうちの２つが、このマイクロアレイ分析において概して低いｌｏｇ比を示した。対応のある検定を標的選択に使用したので、これは、その結果に対して悪影響を及ぼさなかった。
これらの選択基準に基づいて、母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間で差次的にメチル化された３０４３個のゲノム領域が同定された。２１７７８個の領域が、メチル化の差を示さなかった。差次的にメチル化された領域の分布における染色体間の偏りは、観察されなかった。差次的にメチル化された領域は、２１５９個の既知遺伝子に隣り合って位置していたか、またはそれらの既知遺伝子内に位置していた。その差次的にメチル化された領域の大部分は、プロモーター領域（１８％）およびコード領域内部（６８％）に位置しており、ほんのわずかな領域が、遺伝子の下流（７％）またはプロモーターからコード領域への移行部（７％）に位置している。差次的なメチル化を示さなかった領域は、プロモーター（１３％）および下流（５％）の位置に対して同様の分布を示したが、プロモーターからコード領域への移行部に位置する領域の割合は、より高く（３９％）、コード領域内の割合は、より低かった（４３％）。
ポリコーム抑制複合体（ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）２（ＰＲＣ２）によって標的化される遺伝子が、発生を制御する遺伝子を多く含むことが、胚性幹細胞（ＥＳ）において示されている（Ｌｅｅ ＴＩ，ら、（２００６）Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｂｙ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ １２５：３０１−３１３）。差次的にメチル化された遺伝子が、多くの癌タイプにおいて、ＰＲＣ２によって標的化される遺伝子を多く含むことも示されている（Ｅｈｒｉｃｈ Ｍ，ら、（２００８）Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０５：４８４４−４８）。本研究において差次的にメチル化されていると同定された遺伝子のセットもまた、ＰＲＣ２によって標的化される遺伝子を多く含む（ｐ値＜０．００１、オッズ比＝３．６、オッズ比に対する９５％ＣＩ＝３．１〜４．２）。差次的にメチル化された遺伝子のセットのＧＯ分析により、このセットが、発生中の重要な機能を有意に多く含むことが明らかになる。最も多く含まれた１０個の機能のうち６個が、発生または形態形成のプロセスを含む［解剖学的構造の形態形成（ＧＯ：０００９６５３，ｐ値＝０）、発生プロセス（ＧＯ：００３２５０２，ｐ値＝０）、多細胞生物の発生（ＧＯ：０００７２７５，ｐ値＝０）、器官の発生（ＧＯ：００４８５１３，ｐ値＝０）、器官系の発生（ＧＯ：００４８７３１，ｐ値＝０）および解剖学的構造の発生（ＧＯ：００４８８５６，ｐ値＝０）］。
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）を用いた検証
マイクロアレイの知見を検証するために、１３、１８および２１番染色体由来の６３個の領域ならびに他の常染色体由来のさらなる２６個の領域を、異なる技術によって確認するために選択した。母体および胎盤のサンプル中のＤＮＡメチル化を定量的に測定するために、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）技術を使用した。ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）法の説明については、Ｅｈｒｉｃｈ Ｍ，Ｎｅｌｓｏｎ ＭＲ，Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ Ｐ，Ｚａｂｅａｕ Ｍ，Ｌｉｌｏｇｌｏｕ Ｔ，Ｘｉｎａｒｉａｎｏｓ Ｇ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ，Ｆｉｅｌｄ ＪＫ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ Ｄ（２００５）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｙ ｂａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２：１５７８５−１５７９０）を参照のこと。標的領域内の個々の各ＣｐＧ部位について、全ての母体ＤＮＡサンプルおよび全ての胎盤サンプルにおける平均メチル化値を計算した。次いで、母体のメチル化の平均と胎盤のメチル化の平均との差をマイクロアレイの結果と比較した。この２つの技術からの結果は、よく一致していた（図７を参照のこと）。８５個の標的領域について、定量的結果は、マイクロアレイの結果を確認する（９５％の確認率）。全てが１８番染色体上に位置する４つの標的領域については、結果を確認できなかった。この矛盾の理由は、現在のところ不明である。
メチル化の差の同定に焦点を合わせたマイクロアレイとは対照的に、ＤＮＡメチル化の定量的測定は、絶対的なメチル化値の分析を可能にした。確認された８５個の差次的にメチル化された領域の検証セットにおいて、２６個の領域のサブセットが、母体ＤＮＡサンプル中でよりメチル化されており、５９個の領域が、胎盤サンプル中でよりメチル化されている（表１Ａを参照のこと）。興味深いことに、胎盤サンプル中で低メチル化されている遺伝子は、胎盤サンプル中で高メチル化されている遺伝子よりも大きなメチル化の差を示す傾向がある（低メチル化遺伝子に対するメチル化の差の中央値＝３９％、高メチル化遺伝子に対するメチル化の差の中央値＝２０％）。
実施例２
実施例２では、胎児の形質（例えば、胎児の性別または（ｏｆ）ＲｈＤ適合性）を検出するかもしくは確認するため、またはトリソミー２１などの染色体異常を診断するため（両方が、本明細書において「メチル化に基づく胎児診断法」と呼ばれる）に使用され得る、母体サンプル中に存在する胎児核酸の量を検出するための非侵襲性のアプローチ（本明細書において「胎児数量法」と呼ばれる）が記載される。図１０は、胎児数量法の１つの実施形態を示しており、図１１は、メチル化に基づく胎児診断法の１つの実施形態を示している。両方のプロセスが、母体サンプルから得られた胎児ＤＮＡを使用する。そのサンプルは、差次的にメチル化された母体核酸と胎児核酸とを含む。例えば、そのサンプルは、母体の血漿または血清であり得る。胎児ＤＮＡは、母体血漿中の全ＤＮＡのおよそ２〜３０％を構成する。サンプル中に存在する全核酸に対する胎児の寄与の実際の量は、妊娠ごとに異なり、在胎期間、母体の健康状態および胎児の健康状態を含むがそれらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化し得る。
本明細書に記載されるように、母体血漿中の胎児ＤＮＡの分析によって引き起こされる技術的障害は、胎児ＤＮＡを、同時に存在する母体のバックグランドＤＮＡと識別できる必要があるという点にある。本技術の方法は、そのような差、例えば、胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間に見られる差次的なメチル化を、母体由来のサンプル中に存在する比較的低いパーセンテージの胎児ＤＮＡを富化する手段として利用する。本アプローチの非侵襲性の性質は、従来の出生前診断の方法（例えば、羊水穿刺、絨毛生検（ｃｈｒｏｎｉｃ ｖｉｌｌｕｓ ｓａｍｐｌｉｎｇ）および臍帯穿刺（これらは、胎児が死亡する、低いが絶対でないリスクを伴う））よりも大きな利点を提供する。また、この方法は、任意の具体的な細胞分裂の相にある胎児の細胞に依存しないので、この方法は、染色体異常の存在および性質を判定する迅速な検出手段を提供する。さらに、このアプローチは、性別非依存的であり（すなわち、Ｙ染色体の存在を必要としない）、多型非依存的である（すなわち、アレル比を測定しない）。したがって、本明細書における技術の組成物および方法は、母体サンプル中に存在する胎児核酸の量を正確に測定するための、改善された普遍的な非侵襲性のアプローチである。
アッセイの設計および利点
母体サンプルから非侵襲的に単離された胎児ＤＮＡを、正確に検出および定量化する必要がある。本技術は、母体の血漿中または血清中の循環無細胞胎児核酸（ｃｃｆＤＮＡ）の存在を利用する。商業的および臨床的に実施するために、本明細書における技術の方法は、利用可能な少量の限られた胎児ＤＮＡを消費するだけであるべきである。例えば、サンプルの５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満またはそれ以下。さらに、このアプローチは、好ましくは、以下のアッセイの１つまたは複数（好ましくは、全て）が含まれる多重アッセイ形式で開発されるべきである：
・サンプル中に存在するゲノム当量の合計量を検出するためのアッセイ、すなわち、母体ＤＮＡ種と胎児ＤＮＡ種の両方を認識するアッセイ；
・男児を妊娠している女性から単離された胎児ＤＮＡ、すなわち、Ｙ染色体に特異的な配列を検出するためのアッセイ；
・胎児と母体との間で差次的にメチル化されると同定された領域に特異的なアッセイ；または
・調査される全ての組織において低メチル化されていると知られている領域に特異的なアッセイ（制限効率に対するコントロールとして機能し得る）。
このアッセイの他の特徴は、以下の１つまたは複数を含み得る：
・各アッセイについて、標的配列と比べて１つまたは複数のヌクレオチドの差などの競合因子の識別可能である特徴ではなく、標的配列と同一または実質的に同一である、標的特異的な競合因子オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応物に加えられると、標的と同時に増幅され、これらの２つのＰＣＲアンプリコンから得られる比は、母体サンプル中に存在する標的特異的なＤＮＡ配列の数（例えば、具体的な遺伝子座由来の胎児ＤＮＡ）を示唆し得る。
・アンプリコンの長さは、好ましくは、より短いフラグメントに対する増幅に偏らないように同様の長さであるべきである。しかしながら、増幅効率がほぼ等しい限り、様々な長さを使用してよい。
・差次的にメチル化された標的は、表１Ａ〜１Ｃ、または母体と胎児との間で差次的にメチル化されると知られている他の任意の標的から選択され得る。これらの標的は、非妊婦から単離されたＤＮＡでは低メチル化され得、胎児サンプルから得られたサンプル中では高メチル化され得る。これらのアッセイは、制限効率に対するコントロールとして機能し得る。
・異なるアッセイから得られた結果は、以下の１つまたは複数を定量化するために使用され得る：
○サンプル中に存在する増幅可能なゲノムの総数（ゲノム当量の合計量）；
○増幅可能なゲノムのうちの胎児の割合（胎児の濃度またはパーセンテージ）；または
○胎児から得られたＤＮＡ配列間の（例えば、胎児の２１番染色体と３番染色体などの参照染色体との間の）コピー数の差。
本試験において使用されるアッセイの例
下記は、例えば、図１０に提供されているような、本明細書における技術の方法を行うために用いられる反応ステップの概要である。この概要は、本明細書における技術の範囲を限定すると意図されない。むしろ、この概要は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を用いる本明細書における技術の１つの実施形態を提供する。
１）血漿サンプルからのＤＮＡの単離。
２）メチル化感受性制限酵素（例えば、ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩ）を用いたＤＮＡ標的の消化。
各反応について、利用可能なＤＮＡを水と混合して、２５μｌの最終容積にした。
１０単位のＨｈａＩ、１０単位のＨｐａＩＩおよび反応緩衝液からなる１０μｌの反応混合物を加えた。そのサンプルを制限酵素に対する最適温度においてインキュベートした。ＨｈａＩおよびＨｐａＩＩは、メチル化されていないＤＮＡを消化する（かつ、ヘミメチル化されたＤＮＡまたは完全にメチル化されたＤＮＡを消化しない）。消化の後、加熱ステップを用いて、それらの酵素を変性させた。
３）ゲノム増幅−ＰＣＲ試薬（緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマーおよびポリメラーゼ）を加えることによって５０μｌの総体積中でＰＣＲを行った。例示的なＰＣＲおよび伸長プライマーは、以下に提供される。さらに、既知濃度の合成競合因子オリゴヌクレオチドを加えた。
４）複製（任意）−本試験のＰＣＲ後のステップ中に導入されるばらつきを最小にするために、ＰＣＲの後、５０μｌの反応物を５μｌの対応反応物に分けた（複製物）。ＰＣＲ後のステップは、ＳＡＰ、プライマー伸長（ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）技術）、樹脂処理、スペクトロチップ（ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｐ）の調製およびＭａｓｓＡＲＲＡＹを含む。
５）増幅可能なゲノムの定量化−Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を用いることにより、各アッセイに対する増幅産物の量を測定した。ＰＣＲの後、一塩基伸長アッセイを用いることにより、増幅された領域（ステップ３において導入された競合因子オリゴヌクレオチドを含む）を調べた。目的の部位に直接隣接してハイブリダイズするように設計された特異的な伸長プライマーを導入した。以下に提供される伸長プライマーを参照のこと。これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ｉＰＬＥＸ（登録商標）ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（登録商標）プライマーと呼ばれる。伸長反応において、ｉＰＬＥＸプライマーは、相補的なＤＮＡ鋳型にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長された。酵素および緩衝液とともに、様々な組み合わせのデオキシヌクレオチド三リン酸およびジデオキシヌクレオチド三リン酸を含む特別な終結混合物が、ｉＰＬＥＸプライマーの限定的な伸長を指示した。相補的なジデオキシヌクレオチドが組み込まれるまで、プライマー伸長が起きる。
伸長反応は、各々が独自の分子量を有する様々な長さのプライマー産物を生成した。結果として、そのプライマー伸長産物は、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔにおける飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を用いて分離と同時に検出が行われ得る。この分離および検出の後、ＳＥＱＵＥＮＯＭの専売ソフトウェアが、データを自動的に分析する。
６）胎児核酸の量および濃度の計算−差次的にメチル化された標的に基づいて、サンプル中に存在するゲノム当量の合計量、男児を妊娠している女性から単離された胎児核酸の量（および濃度）、および胎児核酸の量（および濃度）を計算する方法は、下記ならびに図１８および１９に提供される。
上記プロトコルは、以下に記載されるアッセイの１つまたは複数を行うために使用され得る。すぐ下に提供される配列に加えて、複数の標的を調べる多重スキームが、下記の表Ｘに提供される。
１）サンプル中の増幅可能なゲノム当量の総数を定量化するためのアッセイ
１３、１８、２１番染色体、ＸまたはＹ染色体上に位置しないハウスキーピング遺伝子において標的を選択した。その標的は、１コピー遺伝子に存在するべきであり、メチル化感受性制限酵素に対するいかなる認識部位も含むべきでない。
下線の配列は、ＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体は、一塩基伸長プライマーに対する部位であり、太字（Ｃ）は、ヒトＤＮＡ上で伸長されるヌクレオチドである。
１９番染色体ＡｐｏＥ：調べられている太字のヌクレオチドＣを有する４５４０９８３５−４５４０９９２２ＤＮＡ標的配列。この項で提供される染色体位置の全てが、Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００９ ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｕｉｌｄに由来する。
Figure 2015521862
 ＡｐｏＥフォワードプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＡｐｏＥリバースプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＧＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＡＧ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＡｐｏＥ伸長プライマー：５’−ＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴ［Ｃ／Ｔ］本プライマーは、ヒトＤＮＡ標的上ではＣを、合成ＤＮＡ標的上ではＴを伸長する。
ＡｐｏＥ合成競合因子オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧＧＣ（５７位の太字のＴは、ヒトＤＮＡと異なる）
２）サンプル中のＹ染色体の配列の総数を定量化するためのアッセイ
ゲノム内の他の位置に類似配列またはパラログ配列を有しない、Ｙ染色体に特異的な標的を選択した。それらの標的は、好ましくは、１コピー遺伝子に存在するべきであり、メチル化感受性制限酵素に対するいかなる認識部位も含むべきでない。
下線の配列は、ＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体のヌクレオチドは、一塩基伸長プライマーに対する部位であり、太字（Ｃ）は、ヒトＤＮＡにおいて伸長されるヌクレオチドである。
Ｙ染色体上のＳＲＹ：２６５５６２８−２６５５７１７（逆相補）
Figure 2015521862
 ＳＲＹフォワードプライマー：５’−ＡＣＧ−ＴＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＴＧ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている３ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＳＲＹリバースプライマー：５’−ＧＡＡＧＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＣＡＴＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣ
ＳＲＹ伸長プライマー：５’−ａＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＣＴ［Ｃ／Ｔ］本プライマーは、ヒトＤＮＡ標的上ではＣを、合成ＤＮＡ標的上ではＴを伸長する。５’の小文字「ａ」は、非相補的ヌクレオチドである。
ＳＲＹ合成競合因子オリゴヌクレオチド：５’−ＧＡＧＴＴＴＴＧＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＴＣＧＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＴＣＧＣＡＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＣ
３）サンプル中に存在する胎児のメチル化されたＤＮＡ配列を定量化するためのアッセイ
母体ＤＮＡと胎児ＤＮＡとの間で差次的にメチル化されると知られている領域において標的を選択した。メチル化感受性酵素に対するいくつかの制限酵素認識部位を含む配列を選択した。本研究の場合、ＨｈａＩ（ＧＣＧＣ）およびＨｐａＩＩ（ＣＣＧＧ）酵素を使用した。
下線の配列は、ＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体は、一塩基伸長プライマーに対する部位であり、太字（Ｃ）は、ヒトＤＮＡ上で伸長されるヌクレオチドであり、小文字は、メチル化感受性制限酵素に対する認識部位である。
１２番染色体上のＴＢＸ３：１１５１２４９０５−１１５１２５００１
Figure 2015521862
 ＴＢＸ３フォワードプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＴＢＸ３リバースプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＴＴＡＡＴＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＴＧＧＣ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＴＢＸ３伸長プライマー：５’−ＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡ［Ｃ／Ｔ］本プライマーは、ヒトＤＮＡ標的上ではＣを、合成ＤＮＡ標的上ではＴを伸長する。５’の小文字「ａ」は、非相補的ヌクレオチドである。
ＴＢＸ３合成競合因子オリゴヌクレオチド：５’−ＧＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＣＴＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＧＴＧＡＴＴＡＡＴＴＴＧＣＧＡ
４）酵素の制限効率についてのコントロールアッセイ
調査される任意の組織においてメチル化されていないと知られている領域において標的を選択した。使用される各制限酵素に対する１つ以下の部位を含むように配列を選択した。
下線の配列は、ＰＣＲプライマー部位であり、イタリック体のヌクレオチドは、一塩基伸長プライマーに対する部位であり、太字（Ｇ）は、ヒトＤＮＡにおいて伸長されるリバースヌクレオチドであり、小文字は、メチル化感受性制限酵素に対する認識部位である。ＣＡＣＮＡ１Ｇ ｃｈｒ１７：４８６３７８９２−４８６３７９７７（逆相補）
Figure 2015521862
 ＨｈａＩフォワードプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＣＣＡＴＴＧＧＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＴＧ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＨｈａＩリバースプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧ−ＴＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＡＡ（本プライマーは、ダッシュによって分断されている１０ｂｐの５’ＭａｓｓＴａｇを含む）
ＨｈａＩ伸長プライマー：５’−ＴＴＣＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣ
ＨｈａＩ合成競合因子オリゴヌクレオチド：
Figure 2015521862
検証実験
本技術の感度および精度を、モデルシステムと臨床サンプルの両方を用いて測定した。様々なサンプルにおいて、総コピー数を定量化するための２つのアッセイ、メチル化を定量化するための３つのアッセイ、Ｙ染色体に特異的な１つのアッセイ、および１つの消化コントロールアッセイを含む多重アッセイを行った。表Ｘを参照のこと。さらなるアッセイを含む別の多重スキームが、表Ｙに提供される。
Figure 2015521862
Figure 2015521862
Figure 2015521862
ゲノムＤＮＡを用いるモデルシステム
サンプル中の増幅可能なゲノムの総コピー数を測定するときの方法の感度および精度を測定するために、非妊婦の血液から単離された様々なＤＮＡサンプルのサブセットを検査した。１反応物あたりおよそ２５００、１２５０、６２５または３１３コピーを含むように各サンプルを希釈した。３つの総コピー数アッセイから得られた平均ＤＮＡ／競合因子比を取得することによって、増幅可能なゲノムの総コピー数を得た。４つの異なるサンプルからの結果を図１２に示す。
反応を最適化するために、血漿から単離されたＤＮＡサンプルをシミュレートするモデルシステムを開発した。これらのサンプルは、一定数のメチル化されていない母体ＤＮＡを含み、様々な量の男児のメチル化された胎盤ＤＮＡと混合されていた。そのサンプルは、メチル化されていない母体ＤＮＡに対しておよそ０〜２５％の範囲の量で混合されていた。結果を図１３ＡおよびＢに示す。メチル化アッセイ（図１３Ａ）、ＳＲＹマーカー（図１３Ｂ）および総コピー数アッセイから得られた比を用いて、胎盤ＤＮＡの割合を計算した。メチル化アッセイ（ＴＢＸ）、Ｙ染色体アッセイ（ＳＲＹ）および総コピー数（ＡＰＯＥ）のためのプライマー配列は、上に提供されている。このモデルシステムから、メチル化に基づく方法が、Ｙ染色体の方法（ＳＲＹマーカー）と等しく行われることが証明され、ゆえに、メチル化に基づく方法が、性別に依存しない胎児数量法として検証された。
血漿サンプル
臨床サンプルにおいて上記方法の感度および精度を調査するために、男児胎児を妊娠している女性から得られた３３個の血漿サンプルを、表Ｘの多重スキームを用いて調査した。全サンプルの一部だけを使用するという重要な要件を満たすために、各反応について、４ｍｌの抽出物から得られたＤＮＡの４分の１を使用した。
総コピー数の定量化
総コピー数の定量化の結果は、図１４ＡおよびＢに見られる。図１４Ａでは、各サンプルに対するコピー数が示されている。２つのサンプル（２５および２６番）が、他の全てのサンプルよりも有意に多い総コピー数を有する。概して、約１３００個の増幅可能なコピー／ｍｌ血漿という平均値が得られた（７６６〜２０５５の範囲）。図１４Ｂは、所与の値の箱ひげ図を示しており、結果を要約している。
メチル化マーカーおよびＹ染色体マーカーから得られた結果の相関関係
図１５ＡおよびＢでは、各サンプルについての胎児のコピー数がプロットされている。全てのサンプルが男児妊娠に由来した。得られたコピー数は、メチル化特異的マーカーまたはＹ染色体特異的マーカーを用いて計算され得る。図１５Ｂに見られるように、所与の値の箱ひげ図は、２つの異なる測定間の最小の差を示した。
メチル化マーカーから得られた結果とＹ染色体マーカー（ＳＲＹ）から得られた結果との相関関係を示している結果が、図１６に示されている。また、メチル化に基づく方法がＹ染色体法（ＳＲＹマーカー）と同様に行われ、そのメチル化に基づく方法が、性別に依存せず、かつ多型に依存しない胎児数量法であるとさらに検証された。表Ｘに開示されている多重アッセイを用いることにより、胎児核酸の量が測定された。
最後に、コントロール対競合因子に対する消化の比を使用し、この値を総コピー数アッセイの平均値と比較することによって、消化効率が測定された。図１７を参照のこと。サンプル２６は別として、全ての反応物が、９９％を超える効率を示している。
データ分析
Ｔｙｐｅｒ４（Ｓｅｑｕｅｎｏｍソフトウェア製品）を用いて、質量スペクトル分析を行った。個々の各ＤＮＡ被分析物および競合因子アッセイに対するピークの高さ（ノイズに対する信号）を測定し、さらなる分析のためにエクスポートした。
ＤＮＡ特異的ピークを競合因子特異的ピークで除算して比を得ることによって、各アンプリコンについて存在する分子の総数を計算した。（図１８および１９中の「ＤＮＡ」ピークは、所与のアッセイに対する被分析物ピークと考えられ得る）。反応物中に加えられる競合因子分子の数は既知であるので、ＤＮＡ分子の総数は、加えられた競合因子分子の数にその比を乗算することによって決定され得る。
男児妊娠についてはＹ染色体特異的マーカーを用い、全ての妊娠についてはメチル化された画分の平均値を用いて、各サンプル中の胎児ＤＮＡの割合（または濃度）を計算した。簡潔には、Ｙ染色体の場合、被分析物（ＤＮＡ）ピークを競合因子ピークで除算し、この比に反応物中に加えられた競合分子の数を乗算することによって比を得た。この値を、増幅可能なゲノム当量測定の総数から得られた（合計量についてのアッセイを用いて）同様の比で除算した。図１８を参照のこと。サンプル中に存在する核酸の合計量は、母体核酸と胎児核酸との合計であるので、胎児の寄与は、バックグランドのより多い母体寄与の一部分であると見なされ得る。それゆえ、これを図１８に示される式に翻訳すると、サンプル中に存在する総核酸の胎児の割合（ｋ）は、式：ｋ＝２×Ｒ／（１−２Ｒ）（式中、Ｒは、Ｙ染色体の量と合計量との比である）に等しい。Ｙ染色体は、半数体であり、合計量に対するアッセイは、二倍体の標的を用いて測定されるので、この計算は、母体の割合の５０％より少ない胎児の割合に限定される。
図１９には、メチル化特異的マーカーを使用することによる同様の胎児濃度の計算が示されている（メチル化定量化に対するアッセイを参照のこと）。Ｙ染色体特異的マーカーとは対照的に、これらのマーカーは、二倍体の標的に由来するので、Ｙ染色体特異的アッセイについて述べられた限定は、除外され得る。したがって、胎児の割合（ｋ）は、式：ｋ＝Ｒ（１−Ｒ）（式中、Ｒは、メチル化アッセイと総アッセイとの比である）を用いて決定され得る。
シミュレーション
２１番染色体由来の２０個のマーカーおよび他の１本以上の常染色体由来の２０個のマーカーを使用する測定システムを仮定する第１の単純な検出力計算を行った。１００コピーの胎児ＤＮＡ、２５コピーという測定値標準偏差、および０．００１より小さい第１種の過誤に対する確率から出発して、本明細書における技術の方法が、全ての場合の９９．５％において、三倍体の染色体セットと二倍体を判別することができることが見出された。そのようなアプローチの実際の実行は、例えば、絶対コピー数の測定のために競合ＰＣＲ法を用いる系である質量分析を用いて達成され得る。この方法は、１つの反応において２０のアッセイを行い得、繰り返された測定のおよそ３〜５％において標準偏差を有すると示されている。この方法は、例えば、核酸を分離するためにメチル結合剤を用いるか、または母体核酸を消化するためにメチル化感受性酵素を用いる、メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを判別するための既知の方法と組み合わせて使用された。図８には、メチル化されていない過剰のＤＮＡの存在下において、メチル化されたＤＮＡを捕捉し、それにより分離するためのＭＢＤ−ＦＣタンパク質（メチル結合剤）の有効性が示されている（図８を参照のこと）。
本明細書に記載されるメチル化に基づく胎児診断法の実施形態の予測力を評価する第２の統計的検出力分析を行った。そのシミュレーションは、トリソミーの２１番染色体に特異的なマーカーの群を参照マーカーの群（例えば、２１番染色体を除く常染色体）と判別する尤度を証明するように設計された。多くのパラメータが、２つのマーカー集団を確実に識別する能力に影響する。本シミュレーションの場合、実験法に基づいて生じる可能性が最も高いと示されている各パラメータに対する値が選択された。以下のパラメータおよび各値を使用した：
コピー数
母体のコピー数＝２０００
２１番、ＸおよびＹ以外の染色体について胎児のコピー数＝２００
正倍数性の胎児の場合の２１番染色体に対する胎児のコピー数＝２００
異数性Ｔ２１胎児の場合の２１番染色体に対する胎児のコピー数＝３００
パーセント胎児ＤＮＡ（メチル化に基づく富化の前）＝１０％（上記を参照のこと）
メチル化頻度
母体ＤＮＡに対する標的領域における平均メチル化パーセンテージ＝１０％
胎児ＤＮＡに対する標的領域における平均メチル化パーセンテージ＝８０％
メチル化されておらず、消化されない母体ＤＮＡの平均パーセンテージ（すなわち、制限効率の関数（とりわけ）＝５％
２１番染色体を標的にしているアッセイの数＝１０
２１番、ＸおよびＹ以外の染色体を標的にしているアッセイの数＝１０
結果は、図２０に示されている。ｘ軸における変動係数（ＣＶ）と、単純なｔ検定を用いてアッセイ集団を識別する能力（ｙ軸）との間の関係が、示されている。このデータから、全ての場合の９９％において、０．００１の有意水準で５％以下のＣＶを提供する２つの集団（正倍数性 対 異数性）が識別され得ることが示唆される。このシミュレーションに基づくと、本方法は、性別に依存せず、全ての民族的背景において機能する（すなわち、アレルの偏りがない）、胎児異数性の出生前検出のための強力な非侵襲性の診断法である。
実施例３−さらなる差次的にメチル化された標的
２１番染色体上に位置しない差次的にメチル化された標的
さらなる差次的にメチル化された標的を、さらなる分析のために、以前のマイクロアレイ分析に基づいて選択した。マイクロアレイ分析の説明については、実施例１を参照のこと。マイクロアレイスクリーニングにおいて、胎盤組織とＰＢＭＣとの間で差次的にメチル化される領域（ＤＭＲ）を定義した。ＰＢＭＣと比べて胎盤において高メチル化されていることに基づいてＥｐｉＴＹＰＥＲを確認するための領域を選択した。変化の方向性を選択した後、領域を、有意性に関して最も有意から始めて低下させて設計された領域を用いて、統計的有意性に基づいて選択した。これらの研究を、ＰＢＭＣと胎盤との８対のサンプルにおいて行った。さらなる非２１番染色体標的を、表４Ｂにおける各標的の代表的なゲノム配列とともに、表１Ｂに提供する。
２１番染色体上に位置する差次的にメチル化された標的
マイクロアレイスクリーニングは、２１番染色体上に位置するＤＭＲのサブセットだけしか明らかにしなかった。しかしながら、そのマイクロアレイによる２１番染色体のカバーも、不十分だった。ゆえに、ＵＣＳＣゲノムブラウザの標準的な設定を使用して２１番染色体上の３５６個全てのＣｐＧアイランドを調べるさらなる分析を完了させた。下記の表１Ｃに示されるように、これらの標的のいくつかは、表１Ａにおいて既に調べられた標的とオーバーラップしていた。より詳細には、各ＣｐＧの約１０００ｂｐ上流および下流を含む、２１番染色体上に位置するＣｐＧ部位を、ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術を使用して調査した。ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術の説明については、実施例１の「Ｓｅｑｕｅｎｏｍ（登録商標）ＥｐｉＴＹＰＥＲ（商標）を用いた検証」を参照のこと。ＰＢＭＣと胎盤との８対のサンプルにおいて、これらの研究を行った。さらに、ＤＭＲは、規定のＣｐＧアイランドの外側にも位置し得るので、公的に入手可能なマイクロアレイデータに対してデータマイニングを行うことにより、以下の特性：母体の血液と比べて胎盤において高メチル化されていること、規定のＣｐＧアイランドに位置しないこと、４つより多いＣｐＧジヌクレオチドを含むこと、およびメチル化感受性制限酵素に対する認識配列を含むことを有する潜在的な候補領域を同定した。次いで、これらの基準を満たす領域を、ＰＢＭＣと胎盤との８対のサンプルにおいて、ＳｅｑｕｅｎｏｍのＥｐｉＴＹＰＥＲ（登録商標）技術を用いて調べた。さらなる２１番染色体の標的を、表４Ｃにおける各標的からの代表的なゲノム配列とともに、表１Ｃに提供する。
表１Ｂおよび１Ｃは、種々の標的の位置、およびそれらが分析の異なる段階、すなわち、マイクロアレイ分析、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８分析およびＥｐｉＴＹＰＥＲ７３分析において分析されたかを含む、それらの種々の標的の説明を提供している。「ＹＥＳ」は、それが分析されたことを示し、「ＮＯ」は、それが分析されなかったことを示す。表１Ｂおよび１Ｃにおける各縦列の定義を、下記に列挙する。
・領域名：各領域は、規定の範囲内または近くに存在する遺伝子によって命名されている。遺伝子名が列挙されておらず、遺伝子座だけを含む領域は、近くにｒｅｆｓｅｑ遺伝子を有しない。
・遺伝子領域：ある遺伝子に近接してまたはある遺伝子内に含まれる領域について、その遺伝子領域は、この領域と近くの遺伝子との関係性をさらに説明する。
・染色体：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドを使用してＤＭＲが配置される染色体。
・開始：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドによって指定されるＤＭＲの開始位置。
・終了：ＵＣＳＣゲノムブラウザのｈｇ１８ビルドによって指定されるＤＭＲの終了位置。
・マイクロアレイ分析：この領域も／この領域が最初に、マイクロアレイ分析によって差次的にメチル化されると判定されたかどうかを記載している。胎盤とＰＢＭＣとの１０対のサンプルのメチル化された画分を、ＭＢＤ−Ｆｃタンパク質を使用して単離した。次いで、２つの組織画分を、ＢｉｏＰｒｉｍｅ Ｔｏｔａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）を使用してＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰ（ＰＢＭＣ）またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−ａｈａ−ｄＣＴＰ（胎盤）で標識し、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）ＣｐＧアイランドマイクロアレイにハイブリダイズさせた。これらの研究において調べられた多くの領域は、最初のマイクロアレイに含まれなかった。
・ＥｐｉＴＹＰＥＲ８サンプル：この領域が、ＥｐｉＴＹＰＥＲ技術を使用して、分析され、胎盤と末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との８対のサンプルにおいて差次的にメチル化されると判定されたかどうかを記載している。試験のために選択された領域は、複数の基準に基づいた。まず、マイクロアレイ分析のデータに基づいて領域を選択した。第２に、２１番染色体上に位置する全てのＣｐＧアイランドの包括的な試験に着手した。最後に、ＣｐＧアイランドに位置する領域よりも低いＣｐＧ頻度を有する２１番染色体上の選択された領域を調べた。
・ＥｐｉＴＹＰＥＲ７３サンプル：この領域が、続いて、胎盤とＰＢＭＣとの７３対のサンプルからなるサンプルコホートにおいてＥｐｉＴＹＰＥＲ技術を使用して分析されたかどうかを記載している。この第２のサンプルコホートにおける、分析のために選択された全ての領域を、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８の縦列に記載された実験の結果に基づいて選択した。より詳細には、このさらなるコホート内の領域は、ＥｐｉＴＹＰＥＲ８サンプル分析において判定されたものと同様のメチル化のプロファイルを示した。例えば、表１Ｂ〜１Ｃに列挙されている領域の全てが、規定の領域内の調べられたＣｐＧジヌクレオチドのかなりの部分において異なるレベルのＤＮＡメチル化を示す。ＣｐＧ部位の差次的なＤＮＡのメチル化を、対応のあるＴ検定を使用して判定し、ｐ値（胎盤組織とＰＢＭＣを比較したとき）がｐ＜０．０５である場合に、それらの部位を差次的にメチル化されていると見なした。
・以前に検証されたＥｐｉＴＹＰＥＲ：この領域またはこの領域の一部が、以前の実験においてＥｐｉＴＹＰＥＲを使用して検証されたかどうかを記載している（実施例１および２を参照のこと）。
・胎盤と母体との相対的なメチル化：差次的なメチル化の方向を記載している。「高メチル化」と表示された領域は、ＰＢＭＣと比べて胎盤サンプル中の指定された領域内でよりメチル化されおり、「低メチル化」は、ＰＢＭＣサンプル中の指定された領域内でよりメチル化されている。
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表１Ａの中の情報は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって生成された、２００６年３月のヒト参照配列（ＮＣＢＩ Ｂｕｉｌｄ ３６．１）に基づく。
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実施例４：超並列ショットガンシークエンシングを使用する胎児ＤＮＡの定量化
この実施例では、胎児特異的ＤＮＡメチル化マーカーを利用することにより、超並列ショットガンシークエンシング（ＭＰＳＳ）プラットフォームを使用して母体血漿中の循環無細胞胎児ＤＮＡの画分を定量化した。この実施例のために、４つのタイプのＤＮＡマーカーをアッセイした：１）胎児ＤＮＡの選択的富化およびその後の定量化を可能にする胎児特異的メチル化マーカー（例えば、ＳＯＸ１４、ＴＢＸ）、２）胎児ＤＮＡの定量化を確認するＹ染色体マーカー（男児胎児を含むサンプルの場合；例えば、ＳＲＹ１、ＳＲＹ２、ＵＴＹ）、３）胎児ＤＮＡおよび母体ＤＮＡを含む全無細胞ＤＮＡを定量化するために使用される制限酵素認識部位を欠く（ａｖｏｉｄ ｏｆ）全マーカー（例えば、ＡＬＢ、ＡＰＯＥ、ＲＮＡｓｅＰ、および４）制限消化の完全性およびゆえにメチル化マーカーに基づく胎児の定量化の精度をモニターする、消化コントロールマーカー（例えば、ＬＤＨＡ、ＰＯＰ５）。
メチル化特異的制限消化
メチル化感受性制限酵素を使用する、メチル化されていない母体ＤＮＡの選択的消化によって、胎児メチル化ＤＮＡマーカーを富化した。下記の表５に明記されるパラメータに従って、消化を行った。
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競合的ＰＣＲ
消化されたサンプルを、既知のコピー数の競合因子オリゴヌクレオチドを加えて、ＰＣＲによって増幅した。それらの競合因子は、標的ＤＮＡと競合因子とを判別する合成標的部位における１塩基の差異以外は標的ＤＮＡと同じヌクレオチド配列を有する合成オリゴヌクレオチドだった。標的特異的プライマーを使用する競合的ＰＣＲによって、各マーカーの別個の定量化が可能だった。下記の表６に明記されるパラメータに従って、競合的ＰＣＲを行った。
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アダプターオリゴヌクレオチドライゲーション
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターオリゴヌクレオチド（ＴＲＵＳＥＱアダプター）を、上に記載された競合的ＰＣＲにおいて生成されたアンプリコンにライゲートした。続いて、そのアダプターにライゲートされたアンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱ２０００プラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）を使用してシークエンシングした。２つの異なるライゲーションに基づくアプローチを使用して、アダプターをアンプリコンに隣接させた。そのライゲーションの手法は、二重ライゲーション産物（すなわち、アンプリコンの両端にライゲートされたアダプターオリゴヌクレオチド）の量を最大にし、かつ単一のライゲーションおよび／または空のライゲーション（すなわち、２つのアダプターオリゴヌクレオチドがアンプリコンの挿入なしで互いにライゲートする）を最小にするように最適化された。
アダプターの直接ライゲーション
ＰＣＲアンプリコンをＭＰＳＳに適合させるために、そのアンプリコン（ＰＣＲ反応中にＴａｑポリメラーゼによって生成される３’アデニン（Ａ）オーバーハングを有する）を、３’チミン（Ｔ）オーバーハングを有するアダプターオリゴヌクレオチドにライゲートした（図２１を参照のこと）。そのライゲーション反応の前に、ＰＣＲ反応体積の２倍の体積のＡＭＰＵＲＥ ＸＰビーズを使用して、一本鎖プライマーおよび非対称ＰＣＲによって生成されたアンプリコンを除去した。浄化されたアンプリコンを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱライブラリアダプターと８：１の比で混合した。２μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）および１７．５μＬの２×リガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を加え、ライゲーション反応を室温において１５分間行った。
一方向アダプターライゲーション
いくつかの例において、ライゲーション効率を改善し、一方向のライゲーションを確実に行う改変プロトコルを使用した。一塩基オーバーハングライゲーションは、より長い付着末端のライゲーションと比べて効率的でないことがある。さらに、一塩基オーバーハングライゲーションを使用すると、ＰＣＲアンプリコンは、いずれかの方向でＩｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱアダプターとライゲートすることができ、ライゲートされた生成物がシークエンシングされたとき、約半数の配列リードしか、コピー数計算のための標的部位をカバーしなかった。ゆえに、そのような限界を克服するために、そのライゲーションの手法の変法を開発した。まず、ＰＣＲプライマーの中の元のタグ配列（１０ヌクレオチド長）を５ヌクレオチド長のタグ配列で置き換えるように設計した（上記の競合的ＰＣＲの場合；下記の表７に提供される）。それらのタグは、リバースまたはフォワードＰＣＲプライマーに対して異なる配列であり、各々が、タグ配列と標的特異的配列との間の接合部にデオキシウリジンを有した。それらの改変されたプライマーは、上記の競合的ＰＣＲ反応において等モル比で使用した。
ＰＣＲ増幅の後、それらのタグを、ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；ＵＤＧ）およびＥｎｄｏＶＩＩＩ消化によってアンプリコンから切断し、高効率でＰＣＲアンプリコンをユニバーサルアダプターまたはインデックスアダプター（下記の表７に提供される）に選択的にライゲートする５塩基オーバーハングを得た（図２２を参照のこと）。詳細には、１μＬのＵＤＧ（５Ｕ／μＬ，ＮＥＢ）および５μＬのＥｎｄｏＶＩＩＩ（１０Ｕ／μＬ，ＮＥＢ）を各反応物に加え、３７℃で３０分間インキュベーションした。９５℃で１０分間加熱してＵＤＧを不活性化することによって、反応を停止し、その後、それを徐々に２５℃まで冷却した。ライゲーション反応の前に、ＡＭＰＵＲＥ ＸＰビーズによってアンプリコンを浄化した。
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プレアニーリングされたインデックスアダプターおよびインデックスリンカーを、等モル比で混合し、５分間９５℃に加熱し、徐々に２５℃まで冷却することによって調製した。等モル比のユニバーサルアダプターとプレアニーリングされたインデックスアダプターとを、ＵＤＧ／ＥｎｄｏＶＩＩＩで消化されたＰＣＲアンプリコン（５ヌクレオチドオーバーハングを有する）と混合した。アダプターとアンプリコンとの比は、８：１から２：１で変動した。２μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）および１７．５μＬの２×リガーゼ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）を加え、室温で１５分間、ライゲーション反応を行った。
両方のライゲーション法のために、ライゲートされた生成物（５μＬ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱ ＰＣＲ混合物および下記の表８に明記されるプライマーを用いて増幅した。増幅されたライブラリを、ＡＭＰＵＲＥ ＸＰビーズを使用して精製することにより、遊離プライマー／アダプターおよびより小さいサイズのＤＮＡフラグメントを除去した。
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増幅されたライブラリをＩｌｌｕｍｉｎａフローセル上に保持し、ブリッジ増幅することにより、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨＩＳＥＱ２０００におけるその後のシークエンシングのためのクラスターを生成させた。インデックスアダプターを使用することにより、そのフローセル上の単一レーンにおいて複数のサンプルのシークエンシングが可能になった。
ヌクレオチド配列リードの分析および胎児ＤＮＡの定量化
ヌクレオチド配列リードを分析し、それを使用して、個々のマーカーのコピー数および胎児のパーセンテージを計算した。５０塩基対（ｂｐ）のヌクレオチド配列リードを、標的部位／合成標的部位の外側に最大５つのミスマッチを許容して、予想される染色体位置に一意的にアラインメントした。予想される標的ＤＮＡまたは競合因子アレルとともに標的部位において１３より大きい品質スコアを有するリードを使用して、各マーカーのコピー数を計算した。詳細には、以下の式を使用した：
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胎児ＤＮＡ、Ｙ染色体ＤＮＡおよび全ＤＮＡのコピー数は、それぞれメチル化マーカー、Ｙマーカーおよび全ＤＮＡマーカーの平均値によって表わされた。胎児のパーセンテージを以下の式に従って計算した：
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 および
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消化効率を
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 によって計算した。
結果
この実施例に記載されたＭＰＳＳを使用する胎児ＤＮＡの定量化方法を、妊婦由来の４８個の血漿サンプルから抽出されたｃｃｆＤＮＡに適用した。その結果は、ＭＰＳＳの代わりの検出方法として質量分析（例えば、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ）を使用した別の方法から得られた結果に匹敵した。両方の方法の結果は、高度に相関した（図２３および２４を参照のこと）。消化マーカー（ＭＰＳＳ法によって、より高いレベルで検出されたＬＤＨＡおよびＰＯＰ５）を除いては、Ｒ２値は、０．９６５〜０．９９８の範囲内だった。メチル化マーカーから得られた胎児画分もまた、ＭＰＳＳ法と質量分析法との間で高度に相関した（図２５を参照のこと）。
実施例５：胎児画分を定量化するためのＳＮＰアレル頻度に基づく方法
この実施例では、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）マーカーを利用して、母体血漿中の循環無細胞（ＣＣＦ）胎児ＤＮＡ（すなわち、胎児画分）を検出し、定量化した。いくつかの例において、超並列ショットガンシークエンシング（ＭＰＳＳ）を介したアンプリコンシークエンシングのために単一のチューブでの多重ＰＣＲを使用して単一ヌクレオチド多型アレルを測定することによって、胎児画分を測定した。この方法の利点としては、例えば、１）母親または父親のＳＮＰ遺伝子型に関する事前の知識なしで、男児と女児の両方の胎児からのＤＮＡのＣＣＦ画分を検出することができること；２）従来のライブラリ作製を必要としない、ＭＰＳＳ準備生成物を生成する単純化されたワークフロー、および３）同じフローセルレーンにおいてゲノムライブラリと多重化されたサンプルに対してＭＰＳＳ胎児画分の定量化を行うことができることが挙げられる。
材料および方法
５５μｌの溶出体積においてＱＩＡＡＭＰ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄキットを使用して、４６人の妊婦の４ｍＬの血漿からＣＣＦ ＤＮＡを抽出した。母親の遺伝子型を確認するために、母体のバフィーコートサンプルからもＤＮＡを抽出した。収集時の在胎期間は、１０〜１７週の範囲だった。母体年齢は、１８〜４２歳の範囲だった。サンプルの民族的なバックグランドには、アフリカ系アメリカ、アジア人、白人およびヒスパニックの民族的背景が含まれた。インデックスタグを組み込むように設計されたユニバーサルＰＣＲプライマーによる第２の増幅を可能にするアダプター配列を含むフォワードおよびリバースＰＣＲプライマーの単一チューブ多重化を使用して、各ＳＮＰパネルに対して１５μｌのＣＣＦ ＤＮＡのＰＣＲを行った。インデックスタグを有するアンプリコンライブラリは、ｃＢＯＴ上でクラスター形成し、ＨｉＳｅｑ２０００において、アンプリコン配列リードを生成するために３６サイクルまたは２７サイクル、およびインデックスタグ配列を決定するために７サイクルにわたってシークエンシングされた。リードを、ヒトゲノムとアラインメントし（ｈｇ１９）、予想されるＳＮＰアレルに対するマッチしたリードカウントを使用して、各ＣＣＦ ＤＮＡ内の各ＳＮＰのアレル比を計算した。１５μｌのＣＣＦ ＤＮＡもまた、ＳＮＰに基づく定量化と比較するために、胎児特異的なメチル化パターンによる胎児画分の定量化のために使用した。
父性遺伝されたアレルの検出
母体血漿中のＣＣＦ胎児ＤＮＡは、母性遺伝されたＤＮＡと父性遺伝されたＤＮＡの両方（例えば、ＳＮＰアレル）を含む。母体のゲノムには存在しない父親のＳＮＰアレルの検出は、胎児ＤＮＡの存在の確認を可能にし得る。さらに、父親：母親のＳＮＰアレル比の定量化は、母体血漿中の胎児ＤＮＡ画分の測定を提供し得る。単一遺伝子座において父性遺伝されたアレルが検出される可能性は、アレル頻度および個々の遺伝パターンに依存する。例えば、図２６は、予想される遺伝子型の要約、および０．４というマイナーアレル集団頻度を有するＳＮＰに基づく各遺伝子型の関連する集団頻度を提供している。マイナーアレル頻度の高いＳＮＰは、所与のＳＮＰ遺伝子座において父親のアレルと母親のアレルとが異なる確率を上げ得る。十分なＳＮＰが、問い合わせされる場合、胎児が、母体アレルとは異なるいくつかの父親のアレルを含む高い確率が、立証され得る。したがって、複数のＳＮＰアレルを使用することによって、情報的に有益な胎児の遺伝子型と母親の遺伝子型との組み合わせの尤度が増加する。父親のアレルは、母体／胎児の無細胞ＤＮＡ混合物中の非母体アレルの存在によって推測され得るので、多くの場合、父親の遺伝子型に関する事前の知識は、必要とされない。図２７および２８は、どのようにしてＳＮＰアレル頻度を使用して胎児画分が計算され得るかを示している。
ＳＮＰパネル
２つの公知のアレルしか含まないマイナーアレル頻度の高いＳＮＰを同定した。３つのＳＮＰパネルを作製した：６７ＳＮＰパネル（ＳＮＰパネル１）、８６ＳＮＰパネル（ＳＮＰパネル２）および８１ＳＮＰパネル（ＳＮＰパネル３）。ＳＮＰパネル１および２に対する個々のＳＮＰ識別子は、下記の表９Ａおよび表１０Ａに提供される。表９Ｂおよび１０Ｂには、各ＳＮＰに対する染色体が何であるかが含まれる。表１２には、染色体の番号（Ｃｈ）、染色体の位置（位置）、参照ゲノム（Ｒｅｆ）、アレル１（Ａ１）およびアレル２（Ａ２）が何であるか、ならびにＳＮＰパネル１および２におけるＳＮＰに対するＳＮＰ増幅用のフォワードおよびリバースＰＣＲプライマー配列が含まれる。ＳＮＰパネル３に対する個々のＳＮＰ識別子は、下記の表１３に提供される。表１３は、染色体の番号（Ｃｈ）、染色体の位置（位置）、参照ゲノム（Ｒｅｆ）、アレル１（Ａ１）およびアレル２（Ａ２）が何であるか、ならびにＳＮＰパネル３におけるＳＮＰに対するＳＮＰ増幅用のフォワードおよびリバースＰＣＲプライマー配列も提供している。
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Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンサー準備アンプリコンの生成
ＳＮＰパネル１の場合、標的化された６７個のＳＮＰ＋そのＳＮＰ部位の周囲の３５塩基対（ｂｐ）のフランキング領域を増幅するように、ＰＣＲプライマーを設計した。その標的化された６７個の領域を、単一の多重反応において増幅した。ＳＮＰパネル２の場合、標的化された８６個のＳＮＰ＋そのＳＮＰ部位の周囲の２６塩基対（ｂｐ）のフランキング領域を増幅するように、ＰＣＲプライマーを設計した。その標的化された８６個の領域を、単一の多重反応において増幅した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターが、ＳＮＰ特異的ＰＣＲプライマーの５’末端に組み込まれたユニバーサルタグ配列を介して付加され得るように、ＰＣＲプライマーを改変した。Ｉｌｌｕｍｉｎａタグを、２つの個別のＰＣＲ反応を用いて付加した（図２９および下記の表１１を参照のこと）：１）遺伝子座特異的ＰＣＲ（これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターの一部を組み込んでいる）に続く、２）ユニバーサルＰＣＲ（このＰＣＲのプライマーは、遺伝子座特異的ＰＣＲにおけるタグにアニーリングすることにより、このユニバーサルＰＣＲにおけるリバースプライマーを介してサンプル特異的なインデックス配列の付加を可能にしつつ、アダプターの付加を完了させる）。第３の単一サイクルＰＣＲを行うことにより、同じ多重化における異なるアンプリコン間の共有アダプター配列のクロスアニーリングに起因して、ユニバーサルＰＣＲ段階の間にアンプリコンに生じ得るヘテロ二重鎖の二次構造を除去した。遺伝子座特異的ＰＣＲおよびユニバーサルＰＣＲは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）が合成した、特別な修飾を有しないプライマーを使用して、標準的な条件下で行った。
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Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳによるアンプリコンのシークエンシング
ユニバーサルＰＣＲ産物を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒなどの標準的なＤＮＡフラグメント分析法を使用して定量化した。最大１２個のサンプルからの、シークエンサー準備アンプリコンをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＩＳＥＱ装置においてシークエンシングした。ＳＮＰパネル１の場合、標的ＳＮＰ＋３５ｂｐフランキング領域をシークエンシングするために３６サイクルを用いた。ＳＮＰパネル２の場合、標的ＳＮＰ＋２６ｂｐフランキング領域をシークエンシングするために２７サイクルを用いた。ユニバーサルＰＣＲの段階において組み込まれた６ｂｐのインデックス識別子を使用して、サンプルを脱多重化した。
情報的に有益なアレルの割り当ておよび胎児画分の測定
標的ＳＮＰ位置におけるシークエンシングエラーおよびバリアントアレルを許容するために各リードにおいて最大３つのミスマッチで、リードをヒトゲノムとアラインメントした（ｈｇ１９）。目的のアレルを有するリードの数をカウントし、それを各ＳＮＰ遺伝子座に対するリードの総数で除算すること（すなわち、（＃リードアレル１）／（＃リードアレル１＋＃リードアレル２））によって、各ＳＮＰアレルの頻度を決定した。このデータから生成された頻度値に基づいて、シークエンシングされた遺伝子型を、タイプ０の情報的に有益でない遺伝子型、タイプ１の情報的に有益な遺伝子型またはタイプ２の情報的に有益な遺伝子型として割り当てた。タイプ０の情報的に有益でない遺伝子型は、胎児が母親と同じ遺伝子型を有する（例えば、母親が「Ａａ」であり、胎児も「Ａａ」である）ので、母親の遺伝子型と区別できない胎児の遺伝子型である。タイプＩの情報的に有益な遺伝子型は、母親がホモ接合（ＡＡ）であり、胎児がヘテロ接合（Ａａ）である状況である。この遺伝子型は、アレル「ａ」が父親由来であるので、情報的に有益である。タイプ１の情報的に有益なアレルの頻度は、混合物中の胎児ＤＮＡのパーセンテージを示し得る。タイプ２の情報的に有益な遺伝子型は、母親がヘテロ接合（Ａａ）であり、胎児がホモ接合（ＡＡ）である状況である。さらなる「Ａ」アレルに寄与する胎児ＤＮＡが存在するとき、母体アレル「ａ」の頻度は、０．５という予想されるメンデル頻度から逸脱し得るので、この遺伝子型は、情報的に有益である。この０．５からのずれの値は、胎児画分を算出するために使用され得る。
各ＳＮＰに対するアレル頻度を、上に記載されたように、各アレルを含むリードの数に基づいて、各サンプルについて計算した。予想されるアレル頻度のばらつきは、父親の異なるアレルとともに胎児ＤＮＡが存在することに起因し得るか、またはＩｌｌｕｍｉｎａシークエンサーによって誤って組み込まれた配列（例えば、バックグランドノイズ）に起因し得る。いくつかの例において、具体的な各ＳＮＰアンプリコンに関連するバックグランドノイズの量を測定することにより、各ＳＮＰに対する動的カットオフ値を確立した。母体ＤＮＡ（すなわち、バフィーコート）サンプルをシークエンシングし、ホモ接合体に対する１およびヘテロ接合体に対する０．５という予想されるメンデル比からの偏差を観察した。これらの値から、各ＳＮＰアッセイに対して、中央補正偏差（ＭＡＤスコア）を特定した。いくつかの例において、測定された父親のアレル頻度が３×ＭＡＤスコアより高いとき、遺伝子型をタイプＩの情報的に有益な遺伝子型であると同定した。いくつかの例において、複数のタイプ１の情報的に有益な遺伝子型を特定し、平均アレル頻度を測定した。タイプ１の情報的に有益な平均アレル頻度に２を乗算することによって、胎児画分を計算した。例えば、４．１５％という情報的に有益な平均アレル頻度は、８．３％という胎児画分を示唆した。胎児画分は、例えば、０．５から３×ＭＡＤ超だけ逸脱している母体アレル「ａ」の頻度を測定することによって、タイプ２の情報的に有益な遺伝子型からも計算され得る。胎児画分は、この偏差に２を乗算することによって特定され得る。
いくつかの例において、母親または父親の遺伝子型に関する事前の知識なしで、情報的に有益な遺伝子型を割り当てた。検査された４６個のサンプルのうちの２つに対する各ＳＮＰ（ＳＮＰパネル１の）に対するアレル頻度を、図３０および図３１に示されているようにプロットした。母体のバフィーコートにおけるホモ接合のアレル頻度は、０または１に近かった。タイプ１の情報的に有益なＳＮＰを、胎児からの父親のアレルの存在に起因して、０または１という予想されるアレル頻度から逸脱したアレル頻度によって特定した。偏差のサイズは、ＣＣＦ ＤＮＡの胎児画分のサイズに依存した。０．００７というバックグランドアレル頻度の最大値が、母体のバフィーコートＤＮＡに対して観察された。このアプローチの場合、０．０１という固定されたカットオフ頻度値を使用して、血漿サンプル中の情報的に有益でないホモ接合体と情報的に有益な遺伝子型とを区別した（特定のタイプ１の情報的に有益な遺伝子型の割り当てを示している、図３２および３３を参照のこと）。０．２５という固定されたカットオフ値を使用して、情報的に有益でないヘテロ接合体を他の遺伝子型と区別した。情報的に有益な遺伝子型のアレル頻度の平均値を取り、この値に２を乗算することによって、４６個の血漿サンプルについて胎児画分を計算した。１サンプルあたりに割り当てられた情報的に有益な遺伝子型は、１〜２６の範囲だった。胎児画分は、２．５％〜１４％の範囲だった（図３４を参照のこと）。
上記方法の成績を評価するために、差次的なメチル化に基づく胎児数量アッセイを用いて、４６個の血漿サンプルについて胎児画分を測定した。ＳＮＰに基づく胎児画分の推定値は、メチル化に基づく推定値と線形の関連を示した（ｒ２＝０．７２）。図３５は、胎児画分推定方法の線形回帰を斜線として示している。
アンプリコン配列のカバー率
様々な量のＳＮＰアンプリコンライブラリを、ＴＲＵＳＥＱライブラリと混和（すなわち、希釈）することにより、様々なレベルのアンプリコン配列のカバー率でアレル頻度の測定が行われ得ることを証明した。６つの血漿サンプルおよび６つのバフィーコートサンプルからのＳＮＰアンプリコンライブラリを、１１個のＴＲＵＳＥＱライブラリと混和し、ＨＩＳＥＱ２０００装置の同じフローセルレーンにおいて同時にシークエンシングした。ＴＲＵＳＥＱライブラリと混和されたＳＮＰアンプリコンライブラリのパーセント（％）は、５０％〜０．８％の範囲だった。アラインメントの後、各アンプリコンライブラリに対する１ＳＮＰあたりのカバー率は、１ＳＮＰあたり７１６１９ｘ（５０％アンプリコンライブラリ）〜１ＳＮＰあたり１４１３ｘ（０．８％アンプリコンライブラリ）の範囲だった。胎児画分の推定値は、最も低いカバー率のレベルでも有意に異ならなかった（図３６を参照のこと）。これらの知見は、ＨＩＳＥＱ２０００装置における１％未満のフローセルクラスターを使用することにより、アンプリコンライブラリを同時にシークエンシングできること、および高レベルのサンプル多重化（例えば、９６超）を達成できることを示唆する。
実施例６：実施形態の例
本技術の特定の実施形態の非限定的な例が、本明細書中以後、提供される。
Ａ１．サンプル中の胎児核酸の量を測定する方法であって：
（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；
（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を：
（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および
（ｉｉ）サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセット
と増幅条件下で接触させ（ここで、その第１領域および第２領域は、異なっている）、それにより、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物が生成される、ステップ；
（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；
（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；
（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および
（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児核酸の量を測定するステップ
を含む、方法。
Ａ２．第１領域が１つまたは複数の遺伝子座を含み、その遺伝子座の各々がメチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を含む、実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ４．第２領域が、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含まない１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ａ２またはＡ３に記載の方法。
Ａ５．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、亜硫酸水素塩を含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ６．アダプターオリゴヌクレオチドが、ライゲーションによって増幅産物に組み込まれる、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ７．ライゲーションが、一方向のライゲーションである、実施形態Ａ６に記載の方法。
Ａ８．アダプターオリゴヌクレオチドが、アダプターオリゴヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを使用して増幅産物に組み込まれる、実施形態Ａ１〜Ａ５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９．アダプターオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のインデックス配列を含む、実施形態Ａ１〜Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０．１つまたは複数のインデックス配列が、サンプル特異的インデックスを含む、実施形態Ａ９に記載の方法。
Ａ１１．１つまたは複数のインデックス配列が、アリコート特異的インデックスを含む、実施形態Ａ９に記載の方法。
Ａ１２．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１４．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１５．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１６．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１７．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
Ａ１８．シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングである、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９．シークエンシングプロセスが、リバーシブルターミネーターに基づくシークエンシング方法である、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０．測定される胎児核酸の量が、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物の各々の量に基づく、サンプル中の胎児核酸の画分である、実施形態Ａ１〜Ａ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２１．胎児核酸の画分が、胎児核酸増幅産物量と全核酸増幅産物量との比である、実施形態Ａ２０に記載の方法。
Ａ２２．胎児特異的核酸の有無の判定を可能にする、サンプル核酸中の第３の領域を増幅する第３増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．胎児特異的核酸が、Ｙ染色体核酸である、実施形態Ａ２２に記載の方法。
Ａ２４．第３の領域が、Ｙ染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ａ２３に記載の方法。
Ａ２５．消化効率の指標としての、消化された核酸または消化されていない核酸の量の測定を可能にする、サンプル核酸中の第４の領域を増幅する第４増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ３〜Ａ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６．第４の領域が、胎児核酸と母体核酸の両方に存在しかつ胎児核酸と母体核酸の両方においてメチル化されていない１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ａ２５に記載の方法。
Ａ２７．第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第１領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第２領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．第３増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第３領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第３競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ２２〜Ａ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０．第４増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第４領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第４競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ２５〜Ａ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１．測定される胎児核酸の量が、使用される競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づく胎児核酸のコピー数である、実施形態Ａ２７〜Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３２．測定される胎児核酸の量が、配列リードの定量化に基づく胎児核酸のコピー数である、実施形態Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３３．サンプル核酸が、細胞外核酸である、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３４．核酸サンプルが、妊娠女性被験体から得られる、実施形態Ａ１〜Ａ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３５．被験体が、ヒトである、実施形態Ａ３４に記載の方法。
Ａ３６．サンプル核酸が、血漿または血清由来である、実施形態Ａ１〜Ａ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３７．第１領域内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる、実施形態Ａ１〜Ａ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３８．胎児核酸の量が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と実質的に等しい、実施形態Ａ１〜Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３９．胎児核酸の量が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と比較されるとき、０．９７以上のＲ２値で測定される、実施形態Ａ１〜Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１．サンプル中の胎児核酸の量を測定する方法であって：
（ａ）サンプル核酸を１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に消化されたサンプル核酸が生成される、ステップ；
（ｂ）その消化されたサンプル核酸を：
（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および
（ｉｉ）サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセット
と増幅条件下で接触させ（ここで、その第１領域および第２領域は、異なっている）、それにより、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物が生成される、ステップ；
（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；
（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；
（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および
（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児核酸の量を測定するステップ
を含む、方法。
Ｂ２．アダプターオリゴヌクレオチドが、ライゲーションによって増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．ライゲーションが、一方向のライゲーションである、実施形態Ｂ２に記載の方法。
Ｂ４．アダプターオリゴヌクレオチドが、アダプターオリゴヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを使用して増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｂ１〜Ｂ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ５．アダプターオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のインデックス配列を含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ６．１つまたは複数のインデックス配列が、サンプル特異的インデックスを含む、実施形態Ｂ５に記載の方法。
Ｂ７．１つまたは複数のインデックス配列が、アリコート特異的インデックスを含む、実施形態Ｂ５に記載の方法。
Ｂ８．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ９．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１０．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１１．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１２．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１３．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｂ８に記載の方法。
Ｂ１４．シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングである、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５．シークエンシングプロセスが、リバーシブルターミネーターに基づくシークエンシング方法である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６．測定される胎児核酸の量が、胎児核酸増幅産物および全核酸増幅産物の各々の量に基づく、サンプル中の胎児核酸の画分である、実施形態Ｂ１〜Ｂ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１７．胎児核酸の画分が、胎児核酸増幅産物量と全核酸増幅産物量との比である、実施形態Ｂ１６に記載の方法。
Ｂ１８．胎児特異的核酸の有無の判定を可能にする、サンプル核酸中の第３の領域を増幅する第３増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１９．胎児特異的核酸が、Ｙ染色体核酸である、実施形態Ｂ１８に記載の方法。
Ｂ２０．第３の領域が、Ｙ染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ｂ１９に記載の方法。
Ｂ２１．消化効率の指標としての、消化された核酸または消化されていない核酸の量の測定を可能にする、サンプル核酸中の第４の領域を増幅する第４増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２２．第４の領域が、胎児核酸と母体核酸の両方に存在しかつ胎児核酸と母体核酸の両方においてメチル化されていない１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ｂ２１に記載の方法。
Ｂ２３．第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第１領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２４．第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第２領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１〜Ｂ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２５．第３増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第３領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第３競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１８〜Ｂ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６．第４増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第４領域と競合する所定のコピー数の１つまたは複数の第４競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ２１〜Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７．測定される胎児核酸の量が、使用される競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づく胎児核酸のコピー数である、実施形態Ｂ２３〜Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２８．測定される胎児核酸の量が、配列リードの定量化に基づく胎児核酸のコピー数である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２９．サンプル核酸が、細胞外核酸である、実施形態Ｂ１〜Ｂ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３０．核酸サンプルが、妊娠女性被験体から得られる、実施形態Ｂ１〜Ｂ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３１．被験体が、ヒトである、実施形態Ｂ３０に記載の方法。
Ｂ３２．サンプル核酸が、血漿または血清由来である、実施形態Ｂ１〜Ｂ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３３．第１領域内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる、実施形態Ｂ１〜Ｂ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３４．胎児核酸の量が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と実質的に等しい、実施形態Ｂ１〜Ｂ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ３５．胎児核酸の量が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸の量と比較されるとき、０．９７以上のＲ２値で測定される、実施形態Ｂ１〜Ｂ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１．サンプル中の胎児核酸のコピー数を測定する方法であって：
（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；
（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を：
（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される１つまたは複数の遺伝子座を含む、サンプル核酸中の第１領域を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および
（ｉｉ）第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第１領域と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチド
と増幅条件下で接触させ、それにより、胎児核酸増幅産物および競合因子増幅産物が生成されるステップ；
（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；
（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；
（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および
（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化および使用された競合因子オリゴヌクレオチドの量に基づいて、サンプル中の胎児核酸のコピー数を測定するステップ
を含む、方法。
Ｃ２．第１領域が、１つまたは複数の遺伝子座を含み、その各遺伝子座が、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ３．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を含む、実施形態Ｃ２に記載の方法。
Ｃ４．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、亜硫酸水素塩を含む、実施形態Ｃ１に記載の方法。
Ｃ５．アダプターオリゴヌクレオチドが、ライゲーションによって増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ６．ライゲーションが、一方向のライゲーションである、実施形態Ｃ５に記載の方法。
Ｃ７．アダプターオリゴヌクレオチドが、アダプターオリゴヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを使用して増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｃ１〜Ｃ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ８．アダプターオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のインデックス配列を含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ９．１つまたは複数のインデックス配列が、サンプル特異的インデックスを含む、実施形態Ｃ８に記載の方法。
Ｃ１０．１つまたは複数のインデックス配列が、アリコート特異的インデックスを含む、実施形態Ｃ８に記載の方法。
Ｃ１１．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１２．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１３．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１４．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１５．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１６．第１領域内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
Ｃ１７．シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングである、実施形態Ｃ１〜Ｃ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１８．シークエンシングプロセスが、リバーシブルターミネーターに基づくシークエンシング方法である、実施形態Ｃ１〜Ｃ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ１９．サンプル中の全核酸の測定を可能にする、サンプル核酸中の第２領域を増幅する第２増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含み、ここで、その第１領域および第２領域は、異なっている、実施形態Ｃ１〜Ｃ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２０．第２領域が、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含まない１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ｃ１９に記載の方法。
Ｃ２１．胎児特異的核酸の有無の判定を可能にする、サンプル核酸中の第３の領域を増幅する第３増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ１〜Ｃ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２２．胎児特異的核酸が、Ｙ染色体核酸である、実施形態Ｃ２１に記載の方法。
Ｃ２３．第３の領域が、Ｙ染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ｃ２２に記載の方法。
Ｃ２４．消化効率の指標としての、消化された核酸または消化されていない核酸の量の測定を可能にする、サンプル核酸中の第４の領域を増幅する第４増幅プライマーセットと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ３〜Ｃ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２５．第４の領域が、胎児核酸と母体核酸の両方に存在しかつ胎児核酸と母体核酸の両方においてメチル化されていない１つまたは複数の遺伝子座を含む、実施形態Ｃ２４に記載の方法。
Ｃ２６．第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第２領域と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ１９〜Ｃ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２７．第３増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第３領域と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第３競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ２１〜Ｃ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２８．第４増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて第４領域と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第４競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ２４〜Ｃ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ２９．サンプル核酸が、細胞外核酸である、実施形態Ｃ１〜Ｃ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３０．核酸サンプルが、妊娠女性被験体から得られる、実施形態Ｃ１〜Ｃ２９のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３１．被験体が、ヒトである、実施形態Ｃ３０に記載の方法。
Ｃ３２．サンプル核酸が、血漿または血清由来である、実施形態Ｃ１〜Ｃ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３３．第１領域内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる、実施形態Ｃ１〜Ｃ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３４．胎児核酸のコピー数が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸のコピー数と実質的に等しい、実施形態Ｃ１〜Ｃ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｃ３５．胎児核酸のコピー数が、質量分析法を用いて測定される胎児核酸のコピー数と比較されるとき、０．９７以上のＲ２値で測定される、実施形態Ｃ１〜Ｃ３４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１．サンプル中の胎児の異数性の有無を検出する方法であって：
（ａ）メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質とサンプル核酸を接触させ（そのサンプル核酸は、差次的にメチル化された胎児核酸と母体核酸とを含み、その胎児核酸と母体核酸との組み合わせは、そのサンプル中の全核酸を構成する）、それにより、差次的に改変されたサンプル核酸が生成される、ステップ；
（ｂ）その差次的に改変されたサンプル核酸を、
（ｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を特異的に増幅する第１増幅プライマーセット、および
（ｉｉ）胎児核酸と母体核酸との間で差次的にメチル化される参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座を特異的に増幅する第２増幅プライマーセット
と増幅条件下で接触させ、それにより、標的染色体増幅産物および参照染色体増幅産物が生成されるステップ；
（ｃ）（ｂ）における増幅産物にアダプターオリゴヌクレオチドを組み込み；それにより、アダプターによって改変された増幅産物が生成されるステップ；
（ｄ）シークエンシングプロセスによって、（ｃ）におけるアダプターによって改変された増幅産物のヌクレオチド配列を得て、それにより、配列リードが生成されるステップ；
（ｅ）それらの配列リードを定量化するステップ；および
（ｆ）（ｅ）における配列リードの定量化に基づいて、サンプル中の胎児の異数性の有無を検出するステップ
を含む、方法。
Ｄ２．標的染色体が、１つまたは複数の遺伝子座を含み、その各遺伝子座が、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｄ１に記載の方法。
Ｄ３．参照染色体が、１つまたは複数の遺伝子座を含み、その各遺伝子座が、メチル化感受性制限酵素に対する制限酵素認識部位を含む、実施形態Ｄ１またはＤ２に記載の方法。
Ｄ４．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素を含む、実施形態Ｄ２またはＤ３に記載の方法。
Ｄ５．メチル化された核酸とメチル化されていない核酸とを差次的に改変する１つまたは複数の作用物質が、亜硫酸水素塩を含む、実施形態Ｄ１に記載の方法。
Ｄ６．アダプターオリゴヌクレオチドが、ライゲーションによって増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ７．ライゲーションが、一方向のライゲーションである、実施形態Ｄ６に記載の方法。
Ｄ８．アダプターオリゴヌクレオチドが、アダプターオリゴヌクレオチド配列を含む増幅プライマーを使用して増幅産物に組み込まれる、実施形態Ｄ１〜Ｄ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ９．アダプターオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数のインデックス配列を含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１０．１つまたは複数のインデックス配列が、サンプル特異的インデックスを含む、実施形態Ｄ９に記載の方法。
Ｄ１１．１つまたは複数のインデックス配列が、アリコート特異的インデックスを含む、実施形態Ｄ９に記載の方法。
Ｄ１２．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１３．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１４．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１５．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１６．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１７．標的染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ１２に記載の方法。
Ｄ１８．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１９．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２０．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号９０〜２６１の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２１．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９および配列番号８６〜８９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２２．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号１〜５９の中から選択されるヌクレオチド配列またはそのフラグメントを含む、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２３．参照染色体内の１つまたは複数の遺伝子座の少なくとも１つが、配列番号４２、配列番号５２、配列番号１５４、配列番号１５８および配列番号１６３の中から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｄ１８に記載の方法。
Ｄ２４．シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングである、実施形態Ｄ１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２５．シークエンシングプロセスが、リバーシブルターミネーターに基づくシークエンシング方法である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２６．第１増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて標的染色体と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第１競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２７．第２増幅プライマーセットのプライマーのハイブリダイゼーションについて参照染色体と競合する、所定のコピー数の１つまたは複数の第２競合因子オリゴヌクレオチドと核酸サンプルを増幅条件下で接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｄ１〜Ｄ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２８．サンプル核酸が、細胞外核酸である、実施形態Ｄ１〜Ｄ２７のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２９．核酸サンプルが、妊娠女性被験体から得られる、実施形態Ｄ１〜Ｄ２８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３０．被験体が、ヒトである、実施形態Ｄ２９に記載の方法。
Ｄ３１．サンプル核酸が、血漿または血清由来である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３２．標的染色体内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる、実施形態Ｄ１〜Ｄ３１のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３３．参照染色体内の２つ以上の別個の遺伝子座が、アッセイされる、実施形態Ｄ１〜Ｄ３２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３４．標的染色体が、１３番染色体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３５．標的染色体が、１８番染色体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ３６．標的染色体が、２１番染色体である、実施形態Ｄ１〜Ｄ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１．サンプル中の胎児画分を測定する方法であって：
（ａ）サンプル核酸を複数の多型核酸標的について富化するステップ（そのサンプル核酸は、胎児核酸および母体核酸を含む）；
（ｂ）シークエンシングプロセスによって、核酸標的の一部または全部に対するヌクレオチド配列を得るステップ；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列を分析するステップ；および
（ｄ）（ｃ）の分析に基づいて胎児画分を測定するステップ（ここで、その多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす）
を含む、方法。
Ｅ２．富化ステップが、複数の多型核酸標的を増幅するステップを含む、実施形態Ｅ１に記載の方法。
Ｅ３．富化ステップが、増幅反応において増幅産物を生成するステップを含む、実施形態Ｅ１またはＥ２に記載の方法。
Ｅ４．増幅反応が、単一の容器内で行われる、実施形態Ｅ３に記載の方法。
Ｅ５．多型核酸標的の各々における母親の遺伝子型および父親の遺伝子型が、（ａ）の前は不明である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ５．１ 約４０％以上のマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が選択される、実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ６．多型核酸標的の各々についてサンプル中のアレル頻度を測定するステップを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ５．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ７．どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップが、各アレル頻度を１つまたは複数の固定されたカットオフ頻度と比較することによって、情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ７．１ 情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフが、約１％以上のアレル頻度のシフトである、実施形態Ｅ７に記載の方法。
Ｅ７．２ 情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフが、約２％以上のアレル頻度のシフトである、実施形態Ｅ７に記載の方法。
Ｅ７．３ 情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフが、約２５％以上のアレル頻度のシフトである、実施形態Ｅ７に記載の方法。
Ｅ７．４ 情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための固定されたカットオフが、約５０％以上のアレル頻度のシフトである、実施形態Ｅ７に記載の方法。
Ｅ８．どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップが、各アレル頻度を１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度と比較することによって、情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む、実施形態Ｅ６に記載の方法。
Ｅ９．１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度が、各多型核酸標的について決定される、実施形態Ｅ８に記載の方法。
Ｅ１０．各標的特異的なカットオフ頻度が、対応する多型核酸標的に対するアレル頻度の変動に基づいて決定される、実施形態Ｅ８またはＥ９に記載の方法。
Ｅ１１．アレル頻度の平均値を測定するステップをさらに含む、実施形態Ｅ６〜Ｅ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１２．胎児画分が、アレル頻度の平均値に部分的に基づいて測定される、実施形態Ｅ１１に記載の方法。
Ｅ１３．１つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型が、ヘテロ接合である、実施形態Ｅ１〜Ｅ１２のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１４．１つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型が、ホモ接合である、実施形態Ｅ１〜Ｅ１３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１５．胎児画分が、０．２０以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、実施形態Ｅ１〜Ｅ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１６．胎児画分が、０．１０以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、実施形態Ｅ１５に記載の方法。
Ｅ１７．胎児画分が、０．０５以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、実施形態Ｅ１６に記載の方法。
Ｅ１８．多型核酸標的の各々が、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ１９．ＳＮＰが、
ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２、ｒｓ９８５４６２、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される、実施形態Ｅ１８に記載の方法。
Ｅ２０．ＳＮＰが、ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２およびｒｓ９８５４６２から選択される、実施形態Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．ＳＮＰが、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される、実施形態Ｅ１９に記載の方法。
Ｅ２１．１ ＳＮＰが、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１０８３９５９８、ｒｓ１０８７５２９５、ｒｓ１２１０２７６０、ｒｓ１２３３５０００、ｒｓ１２３４６７２５、ｒｓ１２５７９０４２、ｒｓ１２５８２５１８、ｒｓ１７１６７５８２、ｒｓ１８５７６７１、ｒｓ２０２７９６３、ｒｓ２０３７９２１、ｒｓ２０７４２９２、ｒｓ２６６２８００、ｒｓ２６８２９２０、ｒｓ２６９５５７２、ｒｓ２７１３５９４、ｒｓ２８３８３６１、ｒｓ３１５１１３、ｒｓ３７３５１１４、ｒｓ３７８４６０７、ｒｓ３８１７、ｒｓ３８５０８９０、ｒｓ３９３４５９１、ｒｓ４０２７３８４、ｒｓ４０５６６７、ｒｓ４２６３６６７、ｒｓ４３２８０３６、ｒｓ４３９９５６５、ｒｓ４７３９２７２、ｒｓ４７５０４９４、ｒｓ４７９０５１９、ｒｓ４８０５４０６、ｒｓ４８１５５３３、ｒｓ４８３０８１、ｒｓ４９４０７９１、ｒｓ４９４８１９６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５８２１１１、ｒｓ５９６８６８、ｒｓ６０１００６３、ｒｓ６０１４６０１、ｒｓ６０５０７９８、ｒｓ６１３１０３０、ｒｓ６３１６９１、ｒｓ６４３９５６３、ｒｓ６５５４１９９、ｒｓ６５８５６７７、ｒｓ６６８２７１７、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７２０１３５、ｒｓ６７２７０５５、ｒｓ６７４４２１９、ｒｓ６７６８２８１、ｒｓ６８１８３６、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４０１４１、ｒｓ６９７４８３４、ｒｓ７１８４６４、ｒｓ７２２２８２９、ｒｓ７３１０９３１、ｒｓ７３２４７８、ｒｓ７４２２５７３、ｒｓ７６３９１４５、ｒｓ７７３８０７３、ｒｓ７８４４９００、ｒｓ７９９７６５６、ｒｓ８０６９６９９、ｒｓ８０７８２２３、ｒｓ８０８０１６７、ｒｓ８１０３７７８、ｒｓ８１２８、ｒｓ８１９１２８８、ｒｓ８８６９８４、ｒｓ８９６５１１、ｒｓ９３１８８５、ｒｓ９４２６８４０、ｒｓ９９２０７１４、ｒｓ９９７６１２３、ｒｓ９９９５５７およびｒｓ９９９７６７４から選択される、実施形態Ｅ１８に記載の方法。
Ｅ２２．多型核酸標的およびその数が、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす、実施形態Ｅ１〜Ｅ２１．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２３．多型核酸標的およびその数が、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす、実施形態Ｅ２２に記載の方法。
Ｅ２４．多型核酸標的およびその数が、少なくとも９０％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、実施形態Ｅ１〜Ｅ２１．１のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２５．多型核酸標的およびその数が、少なくとも９５％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、実施形態Ｅ２４に記載の方法。
Ｅ２６．多型核酸標的およびその数が、少なくとも９９％のサンプルに対する胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、実施形態Ｅ２５に記載の方法。
Ｅ２７．１０個以上の多型核酸標的が富化される、実施形態Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ２７．１ 約４０〜約１００個の多型核酸標的が富化される、実施形態Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２８．５０個以上の多型核酸標的が富化される、実施形態Ｅ２７に記載の方法。
Ｅ２９．１００個以上の多型核酸標的が富化される、実施形態Ｅ２８に記載の方法。
Ｅ３０．５００個以上の多型核酸標的が富化される、実施形態Ｅ２９に記載の方法。
Ｅ３１．シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３１．１ 合成方法による前記シークエンシングが、複数の合成サイクルを含む、実施形態Ｅ３１に記載の方法。
Ｅ３１．２ 合成方法によるシークエンシングが、約３６サイクルを含む、実施形態Ｅ３１．１に記載の方法。
Ｅ３１．３ 合成方法によるシークエンシングが、約２７サイクルを含む、実施形態Ｅ３１．１に記載の方法。
Ｅ３２．シークエンシングプロセスが、ライゲーション方法によるシークエンシングを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３３．シークエンシングプロセスが、単一分子シークエンシング方法を含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３４．シークエンシングプロセスが、単一のコンパートメントにおいて複数のサンプルをシークエンシングするステップを含む、実施形態Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３５．胎児画分が、１０個以上のサンプルについて測定される、実施形態Ｅ３４に記載の方法。
Ｅ３６．胎児画分が、１００個以上のサンプルについて測定される、実施形態Ｅ３５に記載の方法。
Ｅ３７．胎児画分が、１０００個以上のサンプルについて測定される、実施形態Ｅ３６に記載の方法。
Ｅ３８．サンプル核酸が、無細胞ＤＮＡである、実施形態Ｅ１〜Ｅ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ３９．サンプル核酸が、妊娠女性被験体から得られる、実施形態Ｅ１〜Ｅ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ｅ４０．被験体が、ヒトである、実施形態Ｅ３９に記載の方法。
Ｅ４１．サンプル核酸が、血漿または血清由来である、実施形態Ｅ１〜Ｅ４０のいずれか１つに記載の方法。
本明細書において参照される特許、特許出願、刊行物および文書の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。上記の特許、特許出願、刊行物および文書の引用は、前述のもののいずれかが、適切な従来技術であることを認めるものではなく、また、これらの刊行物または文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成するものでもない。
本技術の基本的な態様から逸脱することなく、前述のものに対して改変が行われ得る。本技術は、１つまたは複数の特定の実施形態に照らして実質的に詳細に記載されてきたが、当業者は、本願において具体的に開示された実施形態に対して変更がなされ得るが、これらの改変および改善が、本技術の範囲および精神の範囲内であることを認識するだろう。
適切に本明細書に例示的に記載された本技術は、本明細書に具体的に開示されていない任意のエレメントの非存在下において実施され得る。したがって、例えば、本明細書における各例において、用語「含む」、「〜から本質的になる」および「〜からなる」のいずれかは、その他の２つの用語のいずれかで置き換えられ得る。使用された用語および表現は、説明の用語であって限定ではない用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示されるおよび記載される特徴またはその一部の任意の等価物を除外せず、特許請求される本技術の範囲内で様々な改変がありうる。用語「ａ」または「ａｎ」は、それらが修飾するエレメントのうちの１つまたはそれらのエレメントのうちの２つ以上が記載されていることが文脈上明らかでない限り、それらのエレメントのうちの１つまたは複数のことを指し得る（例えば、「試薬（ａ ｒｅａｇｅｎｔ）」は、１つまたは複数の試薬を意味し得る）。用語「約」は、本明細書において使用される場合、基礎をなすパラメータの１０％以内（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）の値のことを指し、一連の値の始めにおける用語「約」の使用は、その各値を修飾する（すなわち、「約１、２および３」とは、約１、約２および約３のことを指す）。例えば、「約１００グラム」という重量は、９０グラム〜１１０グラムの重量を含み得る。さらに、値の列挙（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または８６％）が本明細書に記載されるとき、その列挙は、その全ての中間の値および小数値（例えば、５４％、８５．４％）を含む。したがって、本技術は、代表的な実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されてきたが、本明細書に開示される概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられ得、そのような改変およびバリエーションは、本技術の範囲内であると見なされることが理解されるべきである。
本技術の特定の実施形態が、以下の請求項に示される。

Claims (51)

  1. サンプル中の胎児画分を測定する方法であって：
    （ａ）サンプル核酸を複数の多型核酸標的について富化するステップであって、該サンプル核酸は、胎児核酸および母体核酸を含む、ステップ；
    （ｂ）シークエンシングプロセスによって、該核酸標的の一部または全部に対するヌクレオチド配列を得るステップ；
    （ｃ）（ｂ）のヌクレオチド配列を分析するステップ；および
    （ｄ）（ｃ）の分析に基づいて胎児画分を測定するステップであって、ここで、該多型核酸標的およびその数は、少なくとも９０％のサンプルに対する該胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす、ステップ
    を含む、方法。
  2. 前記富化するステップが、前記複数の多型核酸標的を増幅するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記富化するステップが、増幅反応において増幅産物を生成するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記増幅反応が、単一の容器内で行われる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記多型核酸標的の各々における母親の遺伝子型および父親の遺伝子型が、（ａ）の前は不明である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 約４０％以上のマイナーアレル集団頻度を有する多型核酸標的が選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記多型核酸標的の各々について前記サンプル中のアレル頻度を測定するステップを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップが、各アレル頻度を１つまたは複数の固定されたカットオフ頻度と比較することによって、情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための前記固定されたカットオフが、約１％以上のアレル頻度のシフトである、請求項８に記載の方法。
  10. 情報的に有益でないホモ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための前記固定されたカットオフが、約２％以上のアレル頻度のシフトである、請求項８に記載の方法。
  11. 情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための前記固定されたカットオフが、約２５％以上のアレル頻度のシフトである、請求項８に記載の方法。
  12. 情報的に有益でないヘテロ接合体から情報的に有益な遺伝子型を同定するための前記固定されたカットオフが、約５０％以上のアレル頻度のシフトである、請求項８に記載の方法。
  13. どの多型核酸標的が情報的に有益であるかを判定するステップが、各アレル頻度を１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度と比較することによって、情報的に有益な遺伝子型を同定するステップを含む、請求項７に記載の方法。
  14. 前記１つまたは複数の標的特異的なカットオフ頻度が、各多型核酸標的について測定される、請求項１３に記載の方法。
  15. 各標的特異的なカットオフ頻度が、対応する多型核酸標的に対する前記アレル頻度の変動に基づいて測定される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. アレル頻度の平均値を測定するステップをさらに含む、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 胎児画分が、前記アレル頻度の平均値に部分的に基づいて測定される、実施形態１６に記載の方法。
  18. １つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型が、ヘテロ接合である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  19. １つまたは複数の情報的に有益な多型核酸標的における胎児の遺伝子型が、ホモ接合である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 胎児画分が、０．２０以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 胎児画分が、０．１０以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、請求項２０に記載の方法。
  22. 胎児画分が、０．０５以下の変動係数（ＣＶ）で測定される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記多型核酸標的の各々が、少なくとも１つの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ＳＮＰが、ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２、ｒｓ９８５４６２、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記ＳＮＰが、ｒｓ１０４１３６８７、ｒｓ１０９４９８３８、ｒｓ１１１５６４９、ｒｓ１１２０７００２、ｒｓ１１６３２６０１、ｒｓ１１９７１７４１、ｒｓ１２６６０５６３、ｒｓ１３１５５９４２、ｒｓ１４４４６４７、ｒｓ１５７２８０１、ｒｓ１７７７３９２２、ｒｓ１７９７７００、ｒｓ１９２１６８１、ｒｓ１９５８３１２、ｒｓ１９６００８、ｒｓ２００１７７８、ｒｓ２３２３６５９、ｒｓ２４２７０９９、ｒｓ２４３９９２、ｒｓ２５１３４４、ｒｓ２５４２６４、ｒｓ２８２７５３０、ｒｓ２９０３８７、ｒｓ３２１９４９、ｒｓ３４８９７１、ｒｓ３９０３１６、ｒｓ３９４４１１７、ｒｓ４２５００２、ｒｓ４３２５８６、ｒｓ４４４０１６、ｒｓ４４５３２６５、ｒｓ４４７２４７、ｒｓ４７４５５７７、ｒｓ４８４３１２、ｒｓ４９９９４６、ｒｓ５０００９０、ｒｓ５００３９９、ｒｓ５０５３４９、ｒｓ５０５６６２、ｒｓ５１６０８４、ｒｓ５１７３１６、ｒｓ５１７９１４、ｒｓ５２２８１０、ｒｓ５３１４２３、ｒｓ５３７３３０、ｒｓ５３９３４４、ｒｓ５５１３７２、ｒｓ５６７６８１、ｒｓ５８５４８７、ｒｓ６００９３３、ｒｓ６１９２０８、ｒｓ６２２９９４、ｒｓ６３９２９８、ｒｓ６４２４４９、ｒｓ６７００７３２、ｒｓ６７７８６６、ｒｓ６８３９２２、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４１９４２、ｒｓ７０４５６８４、ｒｓ７１７６９２４、ｒｓ７５２５３７４、ｒｓ８７０４２９、ｒｓ９４９３１２、ｒｓ９５６３８３１、ｒｓ９７００２２およびｒｓ９８５４６２から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＳＮＰが、ｒｓ１００５２４１、ｒｓ１００６１０１、ｒｓ１０７４５７２５、ｒｓ１０７７６８５６、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１１０７６４９９、ｒｓ１１１０３２３３、ｒｓ１１１３３６３７、ｒｓ１１９７４８１７、ｒｓ１２１０２２０３、ｒｓ１２２６１、ｒｓ１２４６０７６３、ｒｓ１２５４３０４０、ｒｓ１２６９５６４２、ｒｓ１３１３７０８８、ｒｓ１３１３９５７３、ｒｓ１３２７５０１、ｒｓ１３４３８２５５、ｒｓ１３６０２５８、ｒｓ１４２１０６２、ｒｓ１４３２５１５、ｒｓ１４５２３９６、ｒｓ１５１８０４０、ｒｓ１６８５３１８６、ｒｓ１７１２４９７、ｒｓ１７９２２０５、ｒｓ１８６３４５２、ｒｓ１９９１８９９、ｒｓ２０２２９５８、ｒｓ２０９９８７５、ｒｓ２１０８８２５、ｒｓ２１３２２３７、ｒｓ２１９５９７９、ｒｓ２２４８１７３、ｒｓ２２５０２４６、ｒｓ２２６８６９７、ｒｓ２２７０８９３、ｒｓ２４４８８７、ｒｓ２７３６９６６、ｒｓ２８５１４２８、ｒｓ２９０６２３７、ｒｓ２９２９７２４、ｒｓ３７４２２５７、ｒｓ３７６４５８４、ｒｓ３８１４３３２、ｒｓ４１３１３７６、ｒｓ４３６３４４４、ｒｓ４４６１５６７、ｒｓ４４６７５１１、ｒｓ４５５９０１３、ｒｓ４７１４８０２、ｒｓ４７７５８９９、ｒｓ４８１７６０９、ｒｓ４８８４４６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５３０９１３、ｒｓ６０２０４３４、ｒｓ６４４２７０３、ｒｓ６４８７２２９、ｒｓ６５３７０６４、ｒｓ６５４０６５、ｒｓ６５７６５３３、ｒｓ６６６１１０５、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７０３３２０、ｒｓ６７５８２８、ｒｓ６８１４２４２、ｒｓ６９８９３４４、ｒｓ７１２０５９０、ｒｓ７１３１６７６、ｒｓ７２１４１６４、ｒｓ７４７５８３、ｒｓ７６８２５５、ｒｓ７６８７０８、ｒｓ７８２８９０４、ｒｓ７８９９７７２、ｒｓ７９００９１１、ｒｓ７９２５２７０、ｒｓ７９７５７８１、ｒｓ８１１１５８９、ｒｓ８４９０８４、ｒｓ８７３８７０、ｒｓ９３８６１５１、ｒｓ９５０４１９７、ｒｓ９６９０５２５およびｒｓ９９０９５６１から選択される、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記多型核酸標的およびその数が、少なくとも９５％のサンプルに対する前記胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記多型核酸標的およびその数が、少なくとも９９％のサンプルに対する前記胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも５つの多型核酸標的をもたらす、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記多型核酸標的およびその数が、少なくとも９０％のサンプルに対する前記胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記多型核酸標的およびその数が、少なくとも９５％のサンプルに対する前記胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記多型核酸標的およびその数が、少なくとも９９％のサンプルに対する前記胎児画分の測定にとって情報的に有益な少なくとも１０個の多型核酸標的をもたらす、請求項３０に記載の方法。
  32. １０個以上の多型核酸標的が富化される、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 約４０〜約１００個の多型核酸標的が富化される、請求項３２に記載の方法。
  34. ５０個以上の多型核酸標的が富化される、請求項３２に記載の方法。
  35. １００個以上の多型核酸標的が富化される、請求項３４に記載の方法。
  36. ５００個以上の多型核酸標的が富化される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記シークエンシングプロセスが、合成方法によるシークエンシングを含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 合成方法による前記シークエンシングが、複数の合成サイクルを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 合成方法による前記シークエンシングが、約３６サイクルを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 合成方法による前記シークエンシングが、約２７サイクルを含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記シークエンシングプロセスが、ライゲーション方法によるシークエンシングを含む、請求項１〜３６のうちの１つのいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記シークエンシングプロセスが、単一分子シークエンシング方法を含む、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記シークエンシングプロセスが、単一のコンパートメントにおいて複数のサンプルをシークエンシングするステップを含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記胎児画分が、１０個以上のサンプルについて測定される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記胎児画分が、１００個以上のサンプルについて測定される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記胎児画分が、１０００個以上のサンプルについて測定される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記サンプル核酸が、無細胞ＤＮＡである、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記サンプル核酸が、妊娠女性被験体から得られる、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記被験体が、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記サンプル核酸が、血漿または血清由来である、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ＳＮＰが、ｒｓ１０７９０３４２、ｒｓ１０８３９５９８、ｒｓ１０８７５２９５、ｒｓ１２１０２７６０、ｒｓ１２３３５０００、ｒｓ１２３４６７２５、ｒｓ１２５７９０４２、ｒｓ１２５８２５１８、ｒｓ１７１６７５８２、ｒｓ１８５７６７１、ｒｓ２０２７９６３、ｒｓ２０３７９２１、ｒｓ２０７４２９２、ｒｓ２６６２８００、ｒｓ２６８２９２０、ｒｓ２６９５５７２、ｒｓ２７１３５９４、ｒｓ２８３８３６１、ｒｓ３１５１１３、ｒｓ３７３５１１４、ｒｓ３７８４６０７、ｒｓ３８１７、ｒｓ３８５０８９０、ｒｓ３９３４５９１、ｒｓ４０２７３８４、ｒｓ４０５６６７、ｒｓ４２６３６６７、ｒｓ４３２８０３６、ｒｓ４３９９５６５、ｒｓ４７３９２７２、ｒｓ４７５０４９４、ｒｓ４７９０５１９、ｒｓ４８０５４０６、ｒｓ４８１５５３３、ｒｓ４８３０８１、ｒｓ４９４０７９１、ｒｓ４９４８１９６、ｒｓ４９５０８７７、ｒｓ５８２１１１、ｒｓ５９６８６８、ｒｓ６０１００６３、ｒｓ６０１４６０１、ｒｓ６０５０７９８、ｒｓ６１３１０３０、ｒｓ６３１６９１、ｒｓ６４３９５６３、ｒｓ６５５４１９９、ｒｓ６５８５６７７、ｒｓ６６８２７１７、ｒｓ６６９１６１、ｒｓ６７２０１３５、ｒｓ６７２７０５５、ｒｓ６７４４２１９、ｒｓ６７６８２８１、ｒｓ６８１８３６、ｒｓ６８６８５１、ｒｓ６９４０１４１、ｒｓ６９７４８３４、ｒｓ７１８４６４、ｒｓ７２２２８２９、ｒｓ７３１０９３１、ｒｓ７３２４７８、ｒｓ７４２２５７３、ｒｓ７６３９１４５、ｒｓ７７３８０７３、ｒｓ７８４４９００、ｒｓ７９９７６５６、ｒｓ８０６９６９９、ｒｓ８０７８２２３、ｒｓ８０８０１６７、ｒｓ８１０３７７８、ｒｓ８１２８、ｒｓ８１９１２８８、ｒｓ８８６９８４、ｒｓ８９６５１１、ｒｓ９３１８８５、ｒｓ９４２６８４０、ｒｓ９９２０７１４、ｒｓ９９７６１２３、ｒｓ９９９５５７およびｒｓ９９９７６７４から選択される、請求項２３に記載の方法。
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