KR20100061539A

KR20100061539A - 태아 세포 및 핵산의 동정 및 단리

Info

Publication number: KR20100061539A
Application number: KR1020107008140A
Authority: KR
Inventors: 패리더 비쇼프
Original assignee: 바이오셉트 인코포레이티드
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-22
Publication date: 2010-06-07
Also published as: WO2009039507A3; IL204585A0; MX2010003116A; AU2008302040A1; CN101883851A; CA2699958A1; JP2010539906A; ZA201001912B; EP2207879A2; NZ584165A; BRPI0817199A2; WO2009039507A2; EP2207879A4

Abstract

본 발명은 모체 숙주로부터 얻은 생물학적 샘플 내에 태아 세포 및/또는 태아 핵산의 존재를 검출하는데 유용한 방법, 항체 및 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 모체 자궁경부 점액 샘플로부터 태아 핵산을 단리하고, 태아의 유전적 이상에 대해 상기 단리된 핵산을 검사하거나 스크리닝하기 위한 방법 및 키트를 제공한다.

Description

태아 세포 및 핵산의 동정 및 단리{IDENTIFICATION AND ISOLATION OF FETAL CELLS AND NUCLEIC ACID}

본 출원은 2007년 9월 21일 출원된 미국 가출원 제60/974,392호를 우선권으로 주장하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 본 발명은 태아 세포 및 핵산의 동정 및 단리에 관한 것이다.

태아 검사 또는 스크리닝은 일반적으로 임신 중 태아의 유전적 장애 및/또는 염색체 이상을 발견하거나 또는 태아의 성별을 결정하기 위해 수행된다. 오늘날까지, 1 이상의 결함 유전자로 인해 발생하는 4000 이상의 유전적 장애가 인지되었다. 일부 예로는 낭성 섬유증, 헌팅톤 질환, 베타 탈라세미아, 근긴장성 이영양증, 겸상적혈구 빈혈증, 포르피린증 및 취약성 X 염색체 증후군 등이 포함된다. 염색체 이상은 염색체 수의 이상, 염색체 물질의 중복 또는 부재, 및 염색체 구조의 결합으로 인해 야기된다. 염색체 이상의 예로는, 삼염색체성, 예를 들어, 임신 초기 3개월 내 유산의 주 원인인, 삼염색체성 16, 삼염색체성 21(다운 증후군), 삼염색체성 13(파타우 증후군), 삼염색체성 18(에드워드 증후군), 클라인펠터 증후군(47, XXY), (47, XYY) 및 (47, XXX); 염색체 부재(일염색체성), 예를 들어, 터너 증후군(45, XO); 염색체 전좌, 결실 및/또는 미세결실, 예를 들어 로버트소니언 전좌, 안젤만 증후군, 디조지 증후군 및 울프-허쉬호른 증후군 등이 있다.

최근에 이용가능한 태아 유전자 검사는 일반적으로 침습성 시술을 포함한다. 예를 들어, 대략 임신 10 내지 12주에 접어드는 임산부에 수행되는 융모막 융모 샘플링(CVS) 및 대략 14 내지 16주에 수행되는 양수 천자는 모두 태아의 염색체 이상을 검사하기 위한 샘플을 얻기 위해 침습성 시술을 포함한다. 이러한 샘플링 시술을 통해 얻은 태아 세포는 일반적으로 인시츄 혼성화(FISH) 분석에서 형광 또는 세포유전학을 사용하여 염색체 이상을 검사하게 된다.

이러한 시술은 염색체 이상을 발견하는데 유용할 수 있지만, 유산 위험성과 연관될 수 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 양수 천자나 CVS는 모체 연령이 많은 경우(>35세), 비정상적인 모체 혈청이 스크리닝된 경우 또는 이전에 태아 염색체 이상이 있었던 경우를 비롯하여, 위험성이 높을 것으로 파악되는 여성에게만 제안된다. 이러한 검사 결과, 염색체 이상 예컨대 다운 증후군이 있는 아이를 낳는 35세 이상의 여성 비율이 현저하게 감소되었다. 하지만, 대다수의 임산부에 대해 적합하거나 또는 비교적 안전한 태아 검사 또는 스크리닝법이 없어서 다운 증후군 아기의 약 80%가 35세 이하의 여성에서 태어나고 있다.

따라서, 대부분의 임산부들을 위한 비침습성 스크리닝 검사, 특히 태아의 염색체 이상을 비롯하여 다른 유전적 변이나 결함을 확인할 수 있는 검사법이 요구된다. 이러한 검사법은 태아 유전자 스크리닝에 사용할 수 있는 태아 세포 및 태아 핵산의 단리와 검출을 위한 비침습성 기술을 필요로 한다.

본 발명은 부분적으로, 뉴클레오솜 에피토프를 태아 세포 또는 태아 핵산에 대한 마커로 사용할 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 이러한 뉴클레오솜 에피토프에 대한 항체, 이러한 항체를 함유하는 키트, 및 태아 세포 및/또는 태아 핵산을 검출하거나 단리하기 위해 이러한 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명은 태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 태아의 유전적 조성을 검사하는데 적합한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 항체를 사용하여 단리한 태아의 단리된 핵산 샘플을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 태아의 모체 숙주에서 얻은 생물학적 샘플에서 태아 핵산 및/또는 태아 세포의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계 및 상기 생물학적 샘플에서 뉴클레오솜과 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 뉴클레오솜과 항체의 특이적 결합은 태아 핵산 및/또는 태아 세포의 존재를 의미한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 태아의 핵산을 단리하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체와 태아의 모체 숙주에서 얻은 자궁경부 점액 샘플을 접촉시켜 상기 자궁경부 점액 샘플에서 핵산을 단리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 태아의 핵산을 농축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체와 태아의 모체 숙주로부터 얻은 자궁경부 점액 샘플을 점촉시켜 상기 자궁경부 점액 샘플로부터 핵산을 단리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 태아의 유전적 조성을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 방법에 따라서 태아 핵산을 단리하는 단계 및 단리된 태아 핵산을 기초로 태아의 유전적 조성을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 번호 1의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 보조제를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열 번호 1의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 보조제를 함유하는 조성물로 동물을 면역화하는 단계를 포함한다.

본 발명은 부분적으로, 태아 세포 또는 태아 핵산에 대한 마커로서 뉴클레오솜 에피토프를 사용할 수 있다는 발견을 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 이러한 뉴크레오솜 에피토프에 결합하는 항체, 이러한 항체를 함유하는 키트 및 태아 세포 및/또는 태아 핵산을 검출하거나 단리하는데 이들 항체를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 명세서에서 사용하는 용어 "항체"는 항체 결합 영역, CDR, 단쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 포함한다. 본 발명의 항체는 단일클론 항체이거나 다클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 임의의 이소타입, 예를 들어 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE일 수 있다.

일 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 태아에 고유하거나, 또는 상응하는 모체 에피토프와 구별되는 태아 염색질 또는 뉴클레오솜와 연관된 임의 에피토프이다. 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 상응하는 모체 에피토프와는 구별되는 분자 구조(예를 들어, 1차, 2차 또는 3차 구조)를 갖는다. 또 다른 구체에에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 모체 뉴클레오솜보다 태아 뉴클레오솜에서 항체에 보다 접근가능하거나 또는 보다 노출되어 있다.

진핵생물에는, 염색질의 주된 단백질 성분인 주요한 5 부류의 히스틴이 존재한다. 이들은 H1(종종 링커 히스톤이라고도 함), H2A, H2B, H3 및 H4이다. 대체로, 2개의 각각의 H2A, H2B, H3 및 H4 히스톤이 어셈블링되어 단백질 스풀 주변에 146 염기쌍의 DNA가 감겨서 옥타머 뉴클레오솜 코어 입자가 형성된다. 링커 히스톤 H1 및 링커 DNA는 실위에 구슬처럼 개별 뉴클레오솜과 연결된다. H3 히스톤 부류는 4종의 상이한 단백질 유형으로 이루어지는데 즉, 주요 유형인 H3.1 및 H3.2; 교체 유형인 H3.3; 및 고환 특이적 변이체인 H3t이다. H3.1과 H3.2가 밀접하게 관련되어 있지만, Ser96에서만 상이하고, H3.1은 5 이상의 아미노산 위치에서 H3.3과 상이하다. 또한, H3.1은 간, 신장 및 심장을 포함하여 성인 조직에 존재하는 것과 비교하여, 태아의 간에 고도로 농축되어 있다. 성인 인간 조직에서, H3.3 변이체가 H3.1 변이체보다 더욱 풍부하게 존재하는데 반해, 태아 간에서는 그와는 반대이다. 이러한 차이는 태아와 모체 둘 모두의 세포 및/또는 태아 핵산을 포함하는 모체의 생물학적 샘플에서 태아 세포 및/또는 태아 핵산을 검출하기 위해 본 발명의 항체를 통해 활용될 수 있다.

따라서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤과 연관된 에피토프일 수 있다. 일 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3과 연관된 에피토프이다. 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3.1과 연관된 에피토프이다. 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3.1과 연관되지만, 히스톤 H3.3과는 연관되지 않은 에피토프이다. 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 아미노산 서열: Ser-Ala-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu-Ala-Cys(서열 번호 1)을 갖는 펩티드 내 에피토프를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 추가 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 잔기를 갖는 에피토프를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 내 에피토프를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3.1과 연관된 에피토프이고, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 내 에피토프를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 본 발명의 항체는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 내 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체와 경쟁하는 항체를 포함한다.

본 발명의 항체는 또한, 히스톤, 특히 히스톤 H3.1의 특이적인 형태적 또는 구조적 특징을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 모체 뉴클레오솜 내 상응하는 H3.1에 비하여 태아 뉴클레오솜에서 더욱 노출된 히스톤 H3.1의 영역과 연관된 에피토프일 수 있다. 태아 및 모체 H3 히스톤에서 일어나는 번역후 변형 차이, 예를 들어, 메틸화 또는 아세틸화도 역시, 태아 DNA를 검출, 농축 및/또는 단리하기 위해 태아 H3.1 히스톤을 표적화하는데 활용할 수 있다. 하나는 특이적 히스톤 형태 또는 서열에 결합하도록 설계하고, 다른 항체는 번역후 변형부에 결합하도록 설계한 2 세트의 항체를 사용하여 태아 핵산을 단리할 수도 있다.

일 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 번역후 변형을 포함하는 히스톤(예를 들어, 히스톤 H3 또는 H3.1)과 연관된 에피토프를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 번역후 인산화, 메틸화 또는 아세틸화된 아미노산을 포함하는 히스톤(예를 들어, 히스톤 H3 또는 H3.1)과 연관된 에피토프를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 번역후 인산화된 세린("S") 잔기 또는 번역후 메틸화 또는 아세틸화된 리신("K") 또는 아르기닌("R") 잔기를 포함하는 히스톤(예를 들어, 히스톤 H3 또는 H3.1)과 연관된 에피토프를 포함하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 메틸화된 N 말단으로부터 4위치의 리신 잔기("K4"), 메틸화 또는 아세틸화된 위치 9의 리신 잔기("K9"), 또는 인산화된 위치 10의 세린 잔기("S10")를 포함하는 히스톤(예를 들어, H3 또는 H3.1)과 연관된 에피토프를 포함하지 않는다.

대체로, 본 발명의 항체는 검출가능한 부분(예를 들어, 표지)을 함유한다. 다양한 여러 검출가능한 표지가 당분야에 존재하며 표지화 방법도 당분야의 당업자들에게 공지이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 일반적인 표지 부류에는 이에 제한되는 것은 아니고, 방사능 동위원소, 형광성, 화학발광성 및 생물발광성 분자, 발색단, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 발색단, 염료, 금속 이온, 금속 졸, 리간드(예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 디그옥시게닌 또는 햅텐 등) 등을 포함한다. 검출가능한 표지는 검출가능한 범위에서 형광을 나타낼 수 있는 물질 또는 이의 일부를 포함하는 형광발광하는 것들을 포함한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 표지의 특정 예에는 이에 제한되는 것은 아니고, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ³²P, ¹⁴C 및 ³H 등을 비롯한 방사성 동위원소; 이에 제한되는 것은 아니고, 루미놀, 이소루미놀, 써로마틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함하는 화학발광성 화합물; 이에 제한되는 것은 아니고, 루시페린, 루시퍼라제 및 아쿠오린을 포함하는 생물발광성 화합물; 이에 제한되는 것은 아니고, 플루오레세인, FITC, 로다민, 파이코에리쓰린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈데히드, 텍사스 레드, 단실 클로라이드, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 녹색 형광 단백질 및 플루오레사민을 포함하는 형광발광성 물질; 이에 제한되는 것은 아니고 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우라제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP), 알칼리 포스파타제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제, 헥소키나제 및 GDPase, RNase, 루시퍼라제, 포스포플룩토키나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 포스포에놀피루베이트 디카르복실라제, α-글리세로포스페이트, 아스파리기나제, 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제, 글루코아밀라제 및 β-락타마제를 포함하는 효소를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 형광 표지된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 형광 표지되고 태아 세포 또는 태아 핵산과 항체의 특이적 결합은 유세포 측정법, 예를 들어 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)을 통해 검출한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 고상 지지체 상에 고정된다. 항체는 예를 들어, 링커를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 고상 지지체 상에 고정될 수 있다. 항체를 고상 지지체에 부착하는 방법은 당분야의 당업자에게 공지이고 현재 알려지거나 이후에 개발되는 모든 방법을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 고상 지지체는 자성 입자군, 컬럼에 함유된 입자, 예를 들어 수지 컬럼, 미세채널 표면, 마이크로웰, 플레이트, 어레이, 필터, 멤브레인 또는 유리 슬라이드 등이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 장치, 예를 들어, 미세유동 장치 표면 상에 고정되거나, 또는 코팅될 수 있다. 예시적인 미세유동 장치는 입구 수단, 출구 수단 및 상기 입구와 출구 수단 사이에 연장된 미세채널 배열부를 포함한다. 상기 미세채널 배열부는 생물학적 샘플에 대해 무작위적인 유로를 제공할 수 있는 임의의 미세채널일 수 있다. 예를 들어, 미세채널 배열부는 미세채널의 베이스 표면과 통합되고 그로부터 돌출된 다수의 횡단 격리판(separator) 포스트를 포함할 수 았다. 포스트는 대체로, 무작위 유로를 제공할 수 있는 패턴으로 배열된다. 미세유동 장치의 예는 미국 특허 출원 제11/458,668호 및 제11/331,988호에 기술되어 있으며, 이들 두 문헌을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 미세유동 장치의 미세채널 배열부의 표면은 부분적으로 또는 전체적으로 본 발명의 항체로 코팅될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 일 구체예에서, 키트는 또한 모체 숙주의 생물학적 샘플에서 태아 핵산을 단리하거나 또는 태아 세포를 검출하기 위한 키트를 사용하기 위한 지시서를 포함한다. 일 구체예에서, 키트는 미세유동 장치 또는 본 발명의 항체가 코팅된 다른 고상 지지체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 태아의 유전적 조성을 검사하는데 적절한 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 항체를 사용하여 단리 또는 농축시킨 태아의 단리 또는 농축된 핵산 샘플을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 태아의 모체 숙주에서 얻은 생물학적 샘플에서 태아 핵산의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계 및 생물학적 샘플에서 뉴클레오솜과 항체의 결합을 검출하는 단계를 포함한다. 뉴클레오솜과 항체의 특이적 결합은 태아 세포의 존재를 의미한다.

생물학적 샘플은 임의의 모체 생물학적 샘플, 예를 들어, 태아 세포 또는 태아 핵산을 함유할 수 있는 체액 또는 이의 분획일 수 있다. 일 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 자궁경부 점액, 양수, 융모막 융모 샘플 또는 이의 분획이다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변 또는 이의 분획이다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 자궁경부 점액 샘플이다. 상기 생물학적 샘플은 당분야에 공지되거나 또는 이후 발견되는 수단을 통해서 태아의 모체 숙주로부터 얻을 수 있다.

또 다른 구체예에서, 검출 단계는 세포 또는 이의 단편(예를 들어, 아폽토시스체)과 본 발명의 항체의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함한다. 세포와 항체의 특이적 결합은 태아 세포의 존재를 의미한다. 대체로, 생물학적 샘플 내 세포 또는 뉴클레오솜과 본 발명의 항체의 특이적 결합의 검출은 유세포 측정법을 사용하여 수행할 수 있다. 사용할 수 있는 예시적인 유세포 측정법은, 예를 들어, 항체가 형광 표지된 경우에, 이에 제한되는 것은 아니고, 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 태아의 핵산을 단리하거나 농축하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 항체와 태아의 모체 숙주에서 얻은 생물학적 샘플을 접촉시켜서 상기 생물학적 샘플로부터 핵산을 단리하는 단계를 포함한다.

상기 생물학적 샘플은 임의 시기에, 예를 들어, 초기, 제2기 또는 제3기 3개월 기간 동안 태아의 모체 숙주로부터 획득할 수 있다. 일 구체예에서, 생물학적 샘플은 임신 초기 3개월 동안 획득한다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 2차 3개월 동안 획득한다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 임신 4주 내지 12주, 8주 내지 12주 또는 10주 내지 12주 동안 얻는다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 임신 13주 내지 28주, 13주 내지 24주, 13주 내지 20주, 13주 내지 16주, 17주 내지 20주 또는 21주 내지 24주 동안 얻는다.

생물학적 샘플은 상기 기술한 바와 같이 임의의 모체의 생물학적 샘플일 수있다. 일 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 자궁경부 점액, 양수, 융모막 융모 샘플 또는 이의 분획이다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 소변, 자궁경부 점액, 양수, 융모막 융모 샘플 또는 이의 분획이다. 또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 자궁경부 점액 샘플 또는 이의 분획이다. 자궁경부 점액 샘플, 예를 들어, 자궁경부내 점액 샘플 또는 경자궁경부 점액 샘플은 당분야에 공지된 임의 기술 또는 이후 개발될 임의 기술을 통해 얻을 수 있다. 이러한 기술은 이에 제한되는 것은 아니고, 경자궁경부 면봉, 자궁경내 세정, 스크레이프, 세포채집솔, 흡인술, 자궁내 세정 또는 이의 조합 등을 포함한다.

자궁경부 점액 샘플은 신선한 샘플, 예를 들어, 실질적으로 보존하지 않은 것이나 또는 신선한 샘플 유래의 보존 샘플, 예를 들어, 적절한 수성 보존 매질에 보존된 샘플, 또는 다르게는, 1 이상의 자궁경부 점액 샘플에서 걸러낸 핵산을 함유하는 매질의 샘플일 수 있다. 본 발명의 자궁경부 점액 샘플은 약 4℃∼약 20℃, 예를 들어, 저 칼슘 기본 매질에 유지되거나 또는 저장될 수 있다.

일 구체예에서, 자궁경부 점액 샘플은 처리된 샘플, 예를 들어, 점액 용해를 촉진하여 이후 샘플로부터 핵산 성분의 단리를 보조할 수 있는 적절한 시약(들)으로 처리한 신선하거나 또는 보존된 샘플이다. 예를 들어, 본 발명의 자궁경부 점액 샘플은 점액 용해제(들) 또는 뮤시나제(들), 예를 들어, N-아세틸-L-시스테인, L-시스테인, 디티오트레이톨(DTT), 브론헥신 히드로클로라이드, 및 히알루로네이트 리아제, 히알루로노그루코사르니니다제 및 히알루론글루쿠로니다제를 포함하는 임의의 히알루로니다제 등으로 처리된 샘플일 수 있다. 다른 예에서, 본 발명의 자궁경부 점액 샘플은 효소(들), 예를 들어, 당 가수분해 효소(들), 예컨대 β-갈락토시다제 또는 인버타제; 프로테아제; 펩신; 또는 이의 조합으로 처리된 샘플이다.

다른 구체예에서, 태아의 모체 숙주에서 얻은 생물학적 샘플은 아폽토시스 유도 처리되거나, 또는 항체와 접촉시키기 전에, 완전한 태아 세포로부터 태아 핵산이 방출되는 것을 촉진시키기 위해 처리된다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 시약으로 처리하거나, 또는 높은 pH, 전단력 또는 열충격 등으로 처리될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, VP16을 포함하는 에토포시드 등의 시약, 및 다른 유사한 효소 등을 사용하여 태아 핵산의 방출을 촉진시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 태아 핵산을 농축시키고/시키거나 모체 핵산 함량을 감소시키기 위해 처리된다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 임의의 핵산, 예를 들어, 모체 DNA 특징을 나타내는 DNA 등을 줄이거나 분해시키기 위해 처리될 수 있다. 이러한 핵산의 일례는 과메틸화된 모체 DNA이다. 과메틸화된 모체 DNA를 감소, 분해 또는 선택적으로 제거하기 위해서, 어떠한 제한없이, 메틸화 특이적 제한효소 예컨대 McrBC(BioLabs), 과메틸화 모체 DNA 특이적 항체 예컨대 항-5'-메틸-시토신 항체 및/또는 항-메틸CpG 결합 단백질-2(MeCP2) 항체 또는 리간드 또는 단백질 예컨대 모체 DNA 내 메틸화된 CpG 아일랜드에 특이적으로 결합하는 MeCP2 등을 포함하는 임의 수단을 사용할 수 있다.

다르게, 태아 핵산은 태아 핵산에 특이적인 마커를 사용하여 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 저메틸화된 MASPIN DNA를 태아 DNA용 마커로서 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 생물학적 샘플의 전체 DNA를 중아황산나트륨으로 처리하여 저메틸화된 태아 DNA에 화학적 변화를 유도시켜서, 태아 DNA의 비메틸화 시토신을 우리딘(U)으로 전환시킨다. 이러한 변화법을 사용하여 태아 DNA를 우선적으로 단리하거나 농축시킬 수 있는데, 예를 들어, 시토신(들)에서 전환된 우리딘(들)을 함유하는 태아 DNA를 우선적으로 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 태아의 유전적 조성을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 방법에 따라서 태아 핵산을 단리하는 단계 및 단리된 태아 핵산을 기초로 태아의 유전적 조성을 확인하는 단계를 포함한다.

태아의 유전적 조성은 태아 성별의 지표가 되거나 또는 태아의 병태나 장애의 지표가 될 수 있다. 일 구체예에서, 유전적 조성은 이에 제한되는 것은 아니고, 일염색체성, 부분 일염색체성, 삼염색체성, 부분 삼염색체성, 염색체 전좌, 염색체 중복, 염색체 결실 또는 미세결실 및 염색체 역위를 포함한다.

대체로, 용어 "일염색체성"은 염색체 쌍에 단지 하나의 염색체만 존재하는 것을 의미한다. 일염색체성는 이수체(aneuploidy)의 일종이다. 부분 일염색체성은 염색체의 장팔(arm) 또는 단팔이 누락된 경우에 일어난다. 일염색체성으로 인한 일반적인 인간 유전자 장애는 X0, 정상 여성에서 관찰되는 일반적인 2개의 (XX) 염색체 대신 하나의 X 염색체(터너 증후군으로 알려짐); 염색체 5의 짧은 p(프랑스어로 작은의 의미인 단어 petit) 팔의 말단 결실로 인한 부분 일염색체성인, 묘성 증후군; 및 염색체 1의 짧은 p 팔의 말단 결실로 인한 부분 일염색체성인, 1p36 결실 증후군 등을 포함한다.

대조적으로, 용어 "삼염색체성"은 유기체에서 특정 번호 유형의 염색체가 정상적인 2개 대신 3개 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 잉여의 염색체 21이 존재하는 것을 삼염색체성 21이라고 한다. 염색체 번호의 다른 대부분의 이상에서와 마찬가지로 대부분의 삼염색체성도 특유한 선천적 결손증을 일으킨다. 많은 삼염색체성은 유산되거나 어린 나이에 사망한다. 부분 삼염색체성은 잉여 염색체의 일부가 다른 염색체의 하나에 결합하거나, 또는 염색체 중 하나가 그 염색체 일부를 2카피로 갖는 경우에 일어난다. 모자이크 삼염색체성은 잉여 염색체 물질이 유기체 세포의 일부에만 존재하는 상태이다. 임의 염색체에서 삼염색체성이 일어날 수 있지만, 대부분 삼염색체성을 갖고 출생까지 생존하는 아기는 드물다. 인간에서 자연 유산없이 생존하는 가장 일반적인 유형은 삼염색체성 21(다운 증후군); 삼염색체성 18(에드워드 증후군); 삼염색체성 13(파타우 증후군); 삼염색체성 9; 삼염색체성 8 (워커니 증후군 2); 및 삼염색체성 16(인간에서 가장 일반적인 삼염색체성이며, 1%를 넘는 임산부에서 발생함, 그러나 일반적으로 임신 초기 3개월 내에 자연 유산됨)을 포함한다. 성염색체가 관여되는 삼염색체성은 XXX(세쌍 X 염색체 증후군); XXY(클라인펠터 증후군); 및 XYY(XYY 증후군)을 포함한다.

다른 구체예에서, 유전적 조성은 대립유전자 또는 유전자 이상, 예를 들어, 1 이상의 돌연변이 예컨대 1 이상의 유전자에 점 돌연변이, 삽입, 결실 등을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 유전적 조성은 임의의 제한없이, 1 이상의 다형성 패턴 또는 유전자 마커, 예를 들어, STR(short tandem repeat sequences), SNP(single nucleotide polymorphisms) 등을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 유전적 조성은 질환 또는 장애의 지표가 된다. 질환 또는 장애의 예에는, 이에 제한되는 것은 아니고, 낭성 섬유증, 겸상적혈구 빈혈증, 페닐케톤뇨증, 테이삭스 질환, 부신 과형성증, 판코니 빈혈증, 척수성 근위축증, 듀센형 근이영양증, 헌팅톤 질환, 베타 탈라세미아, 근긴장성 이영양증, 취약성 X 염색체 증후군, 다운 증후군, 에드워드 증후군, 파타우 증후군, 클라인펠터 증후군, 세쌍 X 염색체 증후군, XYY 증후군, 삼염색체성 8, 삼염색체성 16, 터너 증후군, 로버트소니언 전좌, 안젤만 증후군, 디조지 증후군, 울프-허쉬호른 증후군, RhD 증후군, 결절성 경화증, 혈관확장성 운동실조증 및 프래더-윌리 증후군 등이 포함된다.

추가 구체예에서, 유전적 조성은 Y 염색체와 특이적으로 연관되지 않은 임의의 유전적 상태 또는 이상을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 유전적 조성은 태아의 부계와 대응되거나 또는 연관된 임의의 유전적 상태를 포함한다.

본 발명의 유전적 검사는 직접적으로 또는 "증폭-기반" 유전적 조성 검사 분석법을 위한 주형으로서 본 발명의 단리된 핵산 샘플을 사용할 수 있다. 이러한 분석법은 당분야에 공지이고, 임의의 제한없이, 중합효소 연쇄 반응("PCR"), 실시간 중합효소 연쇄 반응("RT-PCR"), 리가제 연쇄 반응("LCR"), 핵산 서열 기반 증폭법("NASBA")으로도 알려진 자가 유지 서열 복제("3SR"), Q-B-레플리카제 증폭법, 롤링 써클 증폭법("RCA"), 전사 매개 증폭법("TMA"), 링커-보조 DNA 증폭법("LADA"), 다중 치환 증폭법("MDA"), 및 인베이더 및 스트랜드 치환 증폭법("SDA")을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열 번호 1의 서열과 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 보조제를 함유하는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 펩티드는 서열 번호 1의 서열과 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 적절한 보조제는 이에 제한되는 것은 아니고, 프로인트 완전 보조제, 프로인트 불완전 보조제, 프로인트 완전 보조제 대체물, 백반, 에틸렌 비닐 아세테이트 공중합체, L-티로신, 만니드-올레에이트, 사포닌/콜레스테롤 미셀, 또는 니트로셀룰로스(즉, 펩티드 항원이 흡착되는 니트로셀룰로스) 등을 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 서열 번호 1의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 보조제를 함유하는 조성물로 동물을 면역화하는 단계를 포함한다. 상기 동물은 예를 들어, 포유류(예컨대, 마우스, 래트, 귀니아 피크, 토끼, 염소, 말 등)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 면역화된 동물로부터 세포(예를 들어, 비장 세포)를 획득하는 단계, 단일클론 항체를 생성하는 단계, 태아 뉴클레오솜-특이적 결합에 대해 이러한 단일클론 항체를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 면역화 동물로부터 다클론 항-혈청을 획득하는 단계, 및 경우에 따라 다클론 항-혈청으로부터 태아 뉴클레오솜-특이적 항체를 정제하는 단계를 포함한다.

실시예

하기 실시예는 예시를 위한 것이며, 본 발명을 임의의 방식, 양상 또는 형태로, 명시적으로 또는 함축적으로 제한하려는 것이 아니다. 이들 실시예는 사용할 수 있는 대표적인 것이지만, 당분야의 당업자에게 공지된 다른 절차, 방법론, 또는 기술을 대안적으로 사용할 수 있다.

실시예 1

임신 제2기 3개월(또는 초기 3개월 후반기) 초인 임산부로부터 면봉 또는 세정을 통해 자궁경부 점액 샘플을 채집하였다. 채집 장치 상의 자궁경부 점액 샘플을 수성 완충액을 함유하는 튜브에 넣고, 약 4℃에 저장한 후, 샘플의 온도를 약 4℃로 유지하면서 처리되는 실험실로 운반하였다. 적절한 얼음 팩 등을 사용하여 4℃ 환경을 유지하였다.

처리 실험실로 운반되면, 이 샘플을 검토하고 실험실 테크니션에게 보내어 처리하였다. 후속 절차를 위해 실온으로 샘플을 승온시켰다. 다음으로, 점액 내 포획된 DNA를 방출시키기 위해 대략 15분 내지 30분간 37℃ 인큐베이터 내 락커에 샘플을 위치시켰다.

DNA 방출을 위해 뮤시나제를 사용하여 점액을 더욱 용해시킬 수 있으며, 또한 상기 샘플을 예컨대 화학적 처리를 비롯하여 당분야에 공지된 조건으로 처리하여 태아 뉴클레오솜이 방출되도록 아폽토시스를 유도하였다. 채집 장치를 제거하고 수성 완충액을 예를 들어, 0.22 gm 필터로 여과시켜 모체 세포 및 정자 세포를 비롯한 오염물을 제거하였다. 대안적으로, 고 분자량의 점액 및 세포로부터 자유 DNA를 분리하기 위해 샘플의 액체를 원심분리하여 펠렛화할 수 있다. 선택적으로 DNAse I을 수성 완충액 중 샘플에 부가하여 비보호된 고분자량 DNA를 제거하였다.

깨끗한, 농축 샘플을, 포스트-함유 채집 영역 내에 히스톤 특이적 항체를 부착시켜 준비된, 다수개의 무작위적으로 위치한 포스트가 장착된 채집 영역을 갖는, 미국 특허 출원 제11/038,920호에 개시된 유형의 미세유동 장치를 통해 흘려주었다. 상기 항체는 아미노산 잔기 서열: Ser-Ala-Val-Met-Ala-Leu-Gln-Glu-Ala-Cys을 갖는 데카펩티드와 커플링되도록 설계하였다.

상기와 같이 준비하여, 처리한 샘플을 진공 펌프를 통해 구동되는 미세유동 장치를 통해 서서히 이동시켰다. 상기 항체는, 노출된 고유 서열에 커플링되어 태아 히스톤 3.1을 함유하는 샘플 내 염색질에 커플링하여 염색질을 격리시켰다. 다음으로, 미세유동 장치를 완충액으로 세척하였고, 세척을 2-3회 반복하여 자궁경부 점액에 존재할 수 있는 임의의 비특이적으로 결합된 생물학적 물질을 제거하였다.

번역후 변형, 예컨대 태아 핵산 상의 글리코실화, 인산화 및/또는 메틸화와 커플링되도록 설계된 항체도 사용할 수 있다. 다르게는, 상기 기술한 바와 같이 특이적인 히스톤 형태와 커플링되고, 번역후 변형부와 커플링되도록 설계된 2 세트의 항체를 사용한다.

항체에 의해 격리된 생물학적 물질을 미세유동 장치로부터 방출시키고 정제하여, 존재할 수 있는 염을 제거하였다. 다음으로, 시판되는 DNA 추출 키트, 예컨대 Roche에서 판매하는 키트를 사용하여 샘플에서 DNA를 추출하였다.

이어서, 상기 DNA를 적절한 부피, 즉 20∼50 ㎕로 농축하고, 실시간 PCR 또는 형광 기반 PCR을 사용하여 염색체 Y-특이적 서열을 검출하기 위한 분석을 수행하였다. 이러한 분석 결과 DNA의 남성 Y-서열의 양성 검출 결과가 확인되었고, 이러한 결과는 항체에 의해 격리된 생물학적 물질에 태아 DNA가 존재한다는 증거가 된다. 임의의 유의한 양으로, 격리된 DNA 물질 내 모체 DNA가 없다는 것은 2 유전자좌의 정량적 실시간 PCR을 사용하여 확인하였다. 예를 들어, Y-수준이 제2의 편재 서열(예를 들어, β-글로빈) 수준의 적어도 절반과 동일하다는 것을 보여줌으로써 대부분 또는 거의 모든 DNA가 태아 유래라는 것이 증명된다. 다르게, DNA 내 H3.1 대 H3.3의 상대적 비율 측정법을 사용하여, 존재하는 상대적 비율이 태아 유래 뉴클레오솜에 존재하는 것임을 보여줌으로써, 태아 유래 DNA라는 것을 검증할 수 있다.

이러한 검증을 후속하여, 임신 합병증을 시사할 수 있는 이수체 또는 다른 유전적 장애 또는 병태에 대한 DNA 분석을 확신을 갖고 수행할 수 있다. 단리된 태아 DNA에 대해 분자 DNA 서열분석 또는 다형성 DNA 서열 분석을 수행할 수 있다. 이러한 분석은 실시간 PCR을 활용하여, 이수체에 대한 스크리닝을 위해 특이적 DNA 서열과 연관된 DNA 수준을 정량하거나, 또는 PCR을 사용하여 DNA를 증폭시키고, 이후 이를 돌연변이 마이크로어레이 또는 유전자-특이적 마이크로어레이와 함께 항온반응시킬 수 있다.

본 명세서에서 언급한 모든 특허 및 공개물을 전체로 참조하여 명백하게 포함시킨다. 본 발명은 바람직한 구체예를 참조하여 기술되었지만, 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다.

Claims

태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3과 연관된 에피토프인 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3.1과 연관된 에피토프인 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 모체 뉴클레오솜보다 태아 뉴클레오솜에서 보다 노출된 히스톤 H3.1의 영역과 연관된 에피토프인 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 히스톤 H3.1과 연관되나, 히스톤 H3.3과는 연관되지 않는 에피토프인 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩티드내 에피토프인 항체.
태아 뉴클레오솜 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체로서, 상기 에피토프를 함유하는 펩티드와의 결합에서 제6항의 항체와 경쟁하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 태아 뉴클레오솜 에피토프는 서열 번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 내 에피토프인 항체.
제1항에 있어서, 검출가능한 부분을 포함하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 형광 표지된 것인 항체.
제1항에 있어서, 고상 지지체 상에 고정된 것인 항체.
제1항의 항체를 포함하는 키트.
제12항에 있어서, 모체 숙주의 생물학적 샘플로부터 태아 세포를 검출하거나 또는 태아 핵산을 단리하기 위해 키트를 사용하기 위한 지시서를 추가로 포함하는 것인 키트.
단리된 태아의 핵산 샘플을 포함하는 태아의 유전적 조성을 검사하는데 적합한 키트로서, 상기 샘플은 제1항의 항체를 사용하여 단리된 것인 키트.
생물학적 샘플에서 태아 핵산의 존재를 검출하기 위한 방법으로서, 제1항의 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 생물학적 샘플 내 뉴클레오솜과 상기 항체의 결합을 검출하는 단계로서, 여기서 뉴클레오솜과 항체의 특이적 결합은 태아 핵산의 존재를 의미하는 것인 검출 단계
를 포함하는 검출 방법.
제15항에 있어서, 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 자궁경부 점액, 양수 또는 융모막 융모 샘플인 검출 방법.
제15항에 있어서, 생물학적 샘플은 자궁경부 점액 샘플인 검출 방법.
제15항에 있어서, 검출 단계는 세포와 항체의 특이적 결합을 검출하는 것을 포함하고, 여기서 세포와 항체의 특이적 결합은 태아 세포의 존재를 의미하는 것인 검출 방법.
제15항에 있어서, 검출 단계는 유세포 측정법을 사용하여 수행하는 것인 검출 방법.
제15항에 있어서, 검출 단계는 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)을 사용하여 수행되고, 여기서 항체는 형광 표지된 것인 검출 방법.
태아의 핵산을 단리하는 방법으로서, 제1항의 항체를 사용하여 태아의 모체 숙주로부터 얻은 생물학적 샘플로부터 핵산을 단리하는 단계를 포함하는 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 소변, 자궁경부 점액, 양수 또는 융모막 융모 샘플인 단리 방법.
제21항에 있어서, 항체는 고상 표면 상에 고정된 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 항체와 접촉 전에 아폽토시스-유도 처리되는 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 항체와 접촉 전에 아폽토시스 유도 처리되고, 여기서 아폽토시스 유도 처리는 화학적 처리, 높은 pH, 전단력 또는 열충격을 포함하는 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 임신 초기 3개월 동안 얻은 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 자궁경부 점액 샘플이고, 여기서 자궁경부 점액 샘플은 경자궁경부 면봉, 자궁경내 세정, 세포채집솔, 흡인술, 자궁내 세정 또는 이의 조합을 통해 얻은 것인 단리 방법.
제21항에 있어서, 생물학적 샘플은 자궁경부 점액 샘플이고, 여기서 자궁경부 점액 샘플은 항체와 접촉전에 점액 용해제로 처리되는 것인 단리 방법.
태아의 유전적 조성을 확인하는 방법으로서, 제21항의 방법에 따라 태아 핵산을 단리하는 단계, 및 단리된 태아 핵산을 기초로 태아의 유전적 조성을 확인하는 단계
를 포함하는 것인 확인 방법.
제29항에 있어서, 유전적 조성은 일염색체성, 부분 일염색체성, 삼염색체성, 부분 삼염색체성, 염색체 전좌, 염색체 중복, 염색체 결실 또는 미세결실 및 염색체 역위로 이루어진 군에서 선택된 것인 확인 방법.
제29항에 있어서, 유전적 조성은 낭성 섬유증, 겸상적혈구 빈혈증, 페닐케톤뇨증, 테이삭스 질환, 부신 과형성증, 판코니 빈혈증, 척수성 근위축증, 듀센형 근이영양증, 헌팅톤 질환, 베타 탈라세미아, 근긴장성 이영양증, 취약성 X 염색체 증후군, 다운 증후군, 에드워드 증후군, 파타우 증후군, 클라인펠터 증후군, 세쌍 X 염색체 증후군, XYY 증후군, 삼염색체성 8, 삼염색체성 16, 터너 증후군, 로버트소니언 전좌, 안젤만 증후군, 디조지 증후군, 울프-허쉬호른 증후군, RhD 증후군, 결절성 경화증, 혈관확장성 운동실조증 및 프래더-윌리 증후군으로 이루어진 군에서 선택된 질환 또는 장애를 의미하는 것인 확인 방법.
서열 번호 1의 서열과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 및 보조제를 함유하는 조성물.
제32항에 있어서, 아미노산 서열은 서열 번호 1의 서열과 100% 동일한 것인 조성물.