JP3193301B2 - 生理活性タンパク質ｐ１６０ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野 本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する新規
なタンパク質に関する。

【０００２】背景技術 生体内には、サブユニット構造を有さない分子量２〜３
万の一群の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク
質）が存在している。現在、低分子量Ｇタンパク質のス
ーパーファミリーには酵母から哺乳動物に至るまですで
に５０種類以上のメンバーが見出されている。低分子量
Ｇタンパク質は、アミノ酸配列の類似性からＲａｓ、Ｒ
ｈｏ、Ｒａｂ、その他の４つのファミリーに大別するこ
とができる。この低分子量Ｇタンパク質は種々の細胞機
能を制御していることが明らかになってきており、例え
ば、Ｒａｓタンパク質は細胞の増殖や分化等を、Ｒｈｏ
タンパク質は細胞の形態変化や細胞接着、細胞運動等を
それぞれ制御していると考えられている。

【０００３】このうちＲｈｏタンパク質は、ＧＤＰ／Ｇ
ＴＰ結合能および内在性ＧＴＰａｓｅ活性を示し、リゾ
ホスファチジン酸（ＬＰＡ）およびある種の成長因子等
のような細胞外シグナルに対する細胞骨格応答に関係し
ているとされている。不活性型であるＧＤＰ結合Ｒｈｏ
タンパク質にある刺激が与えられると、Ｓｍｇ ＧＤ
Ｓ、ＤｂｌやＯｓｔのようなＧＤＰ／ＧＴＰ変換タンパ
ク質の働きによって活性型であるＧＴＰ結合Ｒｈｏタン
パク質（以下、「活性型Ｒｈｏタンパク質」という）に
変換される。そして、この活性型Ｒｈｏタンパク質が標
的タンパク質に作用することによってストレス繊維およ
び接着斑が形成され、細胞接着および細胞運動等が誘導
されると考えられている（実験医学 vol.12,No.8,97-10
2(1994) 、Takai, Y. et al. Trends Biochem. Sci., 2
0, 227-231 (1995) ）。一方、Ｒｈｏタンパク質内在性
ＧＴＰａｓｅにより活性型Ｒｈｏタンパク質はＧＤＰ結
合Ｒｈｏタンパク質に変換される。この内在性ＧＴＰａ
ｓｅの活性を亢進するタンパク質はＧＴＰａｓｅ活性化
タンパク質（ＧＡＰ）（Lamarche, N. & Hall,A. eta
l.,TIG, 10, 436-440 (1994) ）と呼ばれている。

【０００４】ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質、Ｒａｃ
２タンパク質、Ｃｄｃ４２タンパク質のようなＲｈｏフ
ァミリーのタンパク質のアミノ酸配列は、お互いに５０
％以上の類似性がある。このＲｈｏファミリーのタンパ
ク質は、リゾフォスファチジル酸（ＬＰＡ）や増殖因子
のような細胞外シグナルに応答して、ストレス繊維（st
ress fiber）やフォーカルコンタクト（focal contact
）の形成を引き起こす反応に関与していると考えられ
ている（A. J. Ridley & A. Hall、Cell,70,389-399 (1
992) ,A. J. Ridley& A. Hall, EMBO J.,1353,2600-261
0(1994)）。また、サブファミリーであるＲｈｏタンパ
ク質は、細胞の形態変化（H.F.Parterson et al., J.Ce
ll Biol.,111,1001-1007 (1990) ）、細胞接着（Morii,
N. et al.,J. Biol.Chem. 267, 20921-20926 (1992) 、
T. Tominaga et al.,J.Cell Biol., 120, 1529-1537(19
93) 、Nusrat, A. et al.,Proc, Natl. Acad. Sci. US
A, 92, 10629-10633 (1995)^＊、Landanna, C. et al.,
Science 271, 981-983 (1996)^＊）、細胞運動（K. Taka
ishi et al.,Oncogene,9,273-279 (1994)）、細胞質分
裂（cytokinesis ）（K. Kishi et al.,J. Cell Biol.,
120,1187-1195(1993) 、I. Mabuchi et al.,Zygote,1,3
25-331(1993)）のような細胞骨格の再編成をともなった
生理機能にも関連があると考えられている（本願の優先
権主張の基礎となる最初の出願の後に発行された刊行物
に^＊印を付した。以下同じ。）。更に、Ｒｈｏタンパク
質は、平滑筋収縮（K. Hirata et al.,J. Biol. Chem.,
267,8719-8722(1992) 、M. Noda et al., FEBS Lett.,
367, 246-250 (1995) 、M. Gong et al.,Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 93,1340〜1345 (1996) ^＊）、フォスフ
ァチジルイノシトール ３−キナーゼ（ＰＩ３−キナー
ゼ）（J. Zhang et al.,J. Biol. Chem.,268,22251-222
54 (1993) ）、フォスファチジルイノシトール ４−リ
ン酸 ５−キナーゼ（ＰＩ ４，５−キナーゼ）（L.
D. Chong et al.,Cell,79,507-513(1994)）やｃ−ｆｏ
ｓの発現（C. S. Hill et al.,Cell,81,1159-1170(199
5) ）の制御にも関与していることが示唆されている。

【０００５】また、最近では、アミノ酸配列を一部置換
したＲｈｏタンパク質が細胞内に導入されるとＲａｓ依
存的な腫瘍形成が抑制されること等が見出され、Ｒｈｏ
タンパク質がＲａｓによる細胞の形質転換、すなわち腫
瘍形成、において重要な役割を果たしていることが明ら
かにされている（G.C.Prendergast et al.,Oncogene,1
0,2289-2296(1995)、Khosravi-Far,R.,et al.,Mol.Cel
l.Biol.,15,6443-6453(1995)^＊、R.Qiu et al.、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,92,11781-11785(1995) ^＊、およびLe
bowitz,P.et al.,Mol.Cell.Biol.,15,6613-6622(1995)
^＊）。

【０００６】また、Ｒｈｏタンパク質のＧＤＰ／ＧＴＰ
変換タンパク質が変異すると、細胞が形質転換すること
が明らかにされている（Collard,J.,Int.J.Oncol.,8,13
1 〜138(1996) ^＊）、Hart,M. et al.,J.Biol Chem.,26
9,62-65 (1994)、Horii,Y. et al., EMBO J., 13,4776-
4786 (1994) ）。

【０００７】さらに、Ｒｈｏタンパク質はガン細胞の浸
潤、すなわちガン転移に関与していることが明らかにさ
れている（Yoshioka,K.et al.,FEBS Lett.,372,25 〜28
(1995) ）。ガン細胞の浸潤には、ガン細胞の細胞接着
能の変化が密接に関連しているが、Ｒｈｏタンパク質は
細胞接着に関与することが明らかにされている（前掲Mo
rii,N.et al.(1992)、Tominaga,T. et al.(1993)、Nusr
at,A.et al.(1995)、Landanna,C.et al.(1996) ^＊）。

【０００８】更に、Ｒｈｏタンパク質は細胞増殖、細胞
運動、細胞凝集ばかりでなく、平滑筋の収縮をも亢進す
ることが明らかとなってきた。最近の研究によれば、Ｒ
ｈｏタンパク質は平滑筋収縮に関与することが知られて
いる（K. Hirata et al.,J.Biol. Chem. 267, 8719-872
2 (1992) および Noda, M. et al., FEBS Lett., 367,
246-250(1995)) 。従って、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合タンパク質もまた、平滑筋収縮に関与する可能性が高
いと考えられる。

【０００９】以上のように、Ｒｈｏタンパク質は、細胞
の形態変化、細胞接着、細胞運動、細胞質分裂、腫瘍の
形成や転移、血管平滑筋の収縮等の多数のシグナル伝達
経路を調節していることがわかってきた。このことよ
り、Ｒｈｏタンパク質には多数の標的分子があり、上記
の多数のシグナル伝達経路を調節していると考えられて
いる。

【００１０】ごく最近（本願の優先権主張の基礎となる
最初の出願の後において）、哺乳類において、いくつか
の候補タンパク質が報告された。これらのタンパク質
は、プロテインキナーゼＮ（ＰＫＮ）（Watanabe, G. e
t al., Science 271, 645-648(1996)^＊; Amano, M. et
al., Sceince 271, 648-650 (1996) ^＊）、ローフィリ
ン（Watanabe, G. et al., Science 271, 645-648 (199
6)^＊）、シトロン（Madaule, P. et al., FEBS Lett. 3
77, 243-248 (1995)^＊）、ＲＯＫα（Leung, T.et al.,
J. Biol. Chem. 270, 29051-29054 (1995)^＊）、Ｒｈ
ｏ結合キナーゼ(Matsui,T.et al.,EMBO J.15,1885-1893
(1996)＊）、ローテキン(Reid,T.et al.,J.Biol.Chem.,
271,9816-9822(1996) ^＊）である。これらのタンパク質
はいずれもＧＴＰ結合ＲｈｏＡタンパク質に結合する
（ただし、シトロンだけはＧＴＰ結合Ｒａｃ１タンパク
質にも結合する）。

【００１１】これらの内、ＰＫＮはプロテインキナーゼ
Ｃのプロテインキナーゼ触媒領域と高い相同性を有する
触媒領域を有しており、セリン／スレオニン・プロテイ
ンキナーゼ活性を示す（Mukai, H. & Ono, Y., Bioche
m. Biopys. Res. Commun. 199, 897-904 (1994); Muka
i, H. et al., Biochem. Biopys. Res. Commun. 204, 3
48-356 (1994) ）。一方、ＲＯＫαおよびＲｈｏ結合キ
ナーゼ（前掲Matsui,T.et al.(1996) ^＊）もセリン／ス
レオニン・プロテインキナーゼ触媒領域様のアミノ酸配
列を有する（前掲Leung, T. et al(1995) ^＊）。

【００１２】一方、上記の哺乳類タンパク質に加えて、
最近、酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、哺乳類
のＲｈｏＡに相当するＲｈｏ１タンパク質の標的タンパ
ク質として、プロテインキナーゼＣ１（ＰＫＣ１）が同
定された（Nonaka, H. et al., EMBO J. 14, 5931-5938
(1995)^＊）。更にごく最近、酵母（Saccharomyces cere
visiae）のＲｈｏ１ｐタンパク質の標的タンパク質とし
て、１，３−β−グルカン合成酵素が同定された（Drgo
nova, J. et al., Science 272, 277-279(1996) ^＊およ
び Qadota, H. et al., Science 272, 279-281(199
6)^＊）。しかしながら、活性型Ｒｈｏタンパク質が関与
する細胞情報伝達機構、特に腫瘍形成や平滑筋収縮に関
する機構、は依然として解明されていない。

【００１３】

【発明の概要】今般、本発明者らは、活性型ＲｈｏＡタ
ンパク質結合能を有するタンパク質をヒト血液中の血小
板から単離した。また、本発明者らは、上記タンパク質
中においてＲｈｏタンパク質結合領域およびプロテイン
キナーゼ領域を特定した。本発明はかかる知見に基づく
ものである。

【００１４】即ち、本発明は、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能および／またはプロテインキナーゼ活性を有する
タンパク質の提供をその目的とする。また、本発明は、
前記タンパク質をコードする塩基配列、前記塩基配列を
含むベクター、前記ベクターによって形質転換された宿
主細胞、前記タンパク質の製造法、および活性型Ｒｈｏ
タンパク質とその標的タンパク質との結合を阻害するス
クリーニング法等の提供をその目的とする。そして、本
発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合
能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するもの、
である。

【００１５】

【発明の具体的説明】定義 本発明において、「アミノ酸」とは、光学異性体、すな
わちＬ体およびＤ体、のいずれをも含む意味で用いられ
るものとする。従って、本発明において「ペプチド」と
は、Ｌ体のアミノ酸のみによって構成されているペプチ
ドだけでなく、Ｄ体のアミノ酸を一部または全部含むペ
プチドをも意味するものとする。

【００１６】また、本発明において、「アミノ酸」と
は、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸
のみならず、それら以外のα−アミノ酸、並びにβ−、
γ−、δ−アミノ酸および非天然のアミノ酸等を含む意
味で用いられるものとする。従って、下記のようにペプ
チドにおいて置換されるかまたはペプチド中に挿入され
るアミノ酸としては、天然のタンパク質を構成する２０
種のα−アミノ酸だけに限定されることはなく、それら
以外のα−アミノ酸並びにβ−、γ−、δ−アミノ酸お
よび非天然のアミノ酸等であってもよい。このようなβ
−、γ−またはδ−アミノ酸としては、β−アラニン、
γ−アミノ酪酸あるいはオルニチンが挙げられ、また天
然タンパク質を構成するもの以外のアミノ酸あるいは非
天然のアミノ酸としては、３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルグリシ
ン、１，２，３，４−テトラハイドロイソキノリン−３
−カルボン酸あるいは二ペコチン酸等が挙げられる。

【００１７】また、本明細書において「本発明によるタ
ンパク質」というときは、その誘導体を含む意味で用い
られるものとする。更にまた、本明細書において「塩基
配列」とは、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列のいずれをも
意味するものとする。

【００１８】明細書中において、記号（例えば、ＫＤ、
Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、およびＣ等）の後に続く括弧内の番
号は、配列番号１のアミノ酸配列の領域を表す。例え
ば、ＫＤ（２‐３３３）は、配列番号１の２〜３３３番
のアミノ酸配列を表す。また、タンパク質変異体の変異
部位は、置換される前のアミノ酸残基（一文字表記）、
置換されるアミノ酸の位置、および置換された後のアミ
ノ酸残基（一文字表記）を連続して記載することで表し
た。例えば、「Ｋ９２１Ｍ（９０６‐９２６）」は、配
列番号１の９０６〜９２６番のアミノ酸配列であって、
９２１番目のアミノ酸残基であるＫ（Lys ：リジン）が
Ｍ（Met ：メチオニン）で置換されたアミノ酸配列を表
す。

【００１９】タンパク質 本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結
合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するタン
パク質またはその誘導体である。ここで、Ｒｈｏタンパ
ク質としては、ＲｈｏＡタンパク質、ＲｈｏＢタンパク
質、ＲｈｏＣタンパク質、またはＲｈｏＧタンパク質が
挙げられる。

【００２０】本発明において、「活性型Ｒｈｏタンパク
質結合能を有するタンパク質」とは、当業者により活性
型Ｒｈｏタンパク質との結合が認められたと評価される
タンパク質をいい、例えば、実施例１および４〜１０と
同様の条件において実験した場合に活性型Ｒｈｏタンパ
ク質との結合が認められたと評価されるタンパク質を意
味するものとする。

【００２１】本明細書においてＲｈｏタンパク質は、Ｒ
ｈｏタンパク質と本発明によるタンパク質との結合が実
質的に損われないように改変されたＲｈｏタンパク質を
も含むものとする。このような改変Ｒｈｏタンパク質と
しては、１４番目のアミノ酸をバリンで置換したＲｈｏ
Ａ変異体（ＲｈｏＡ^Val14 ）が挙げられる。

【００２２】本発明において、「プロテインキナーゼ活
性を有するタンパク質」とは、当業者によりプロテイン
キナーゼ活性が認められたと評価されるタンパク質をい
い、例えば、実施例２と同様の条件において実験した場
合にプロテインキナーゼ活性が認められたと評価される
タンパク質を意味するものとする。

【００２３】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質と結合することによってそのプロテインキナ
ーゼ活性が亢進されるとの性質を有する。ここで「プロ
テインキナーゼ活性」とは、セリン／スレオニン・プロ
テインキナーゼ活性を含む意味で用いられるものとす
る。

【００２４】本発明によるタンパク質の起源は特に限定
されず、ヒトを含むホ乳類由来のものであっても、それ
以外を由来とするものであってもよい。

【００２５】本発明によるタンパク質の分子量は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥによる測定で約１６０ｋＤである。

【００２６】本発明によるタンパク質は、例えば、実施
例１（２）に記載される方法によって得ることができ
る。

【００２７】本明細書において、「タンパク質の誘導
体」とは、タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部、および／またはペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末
端）のカルボキシル基または各アミノ酸の側鎖のカルボ
キシル基の一部もしくは全部、および／または、ペプチ
ドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基
以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミド基
等）の一部もしくは全部が、適当な他の置換基によって
修飾を受けたものをいう。適当な他の置換基による修飾
は、例えば、ペプチド中に存在する官能基の保護、安全
性ならびに組織移行性の向上、あるいは活性の増強等を
目的として行われる。

【００２８】タンパク質の誘導体としては、具体的に
は、（１）タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ
基または各アミノ酸の側鎖のアミノ基の一部もしくは全
部の水素原子が、置換または非置換のアルキル基（直
鎖、分岐鎖または環状であってもよい）（例えば、メチ
ル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブ
チル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、シクロプロピル基、
シクロヘキシル基、ベンジル基）、置換または非置換の
アシル基（例えば、ホルミル基、アセチル基、カプロイ
ル基、シクロヘキシルカルボニル基、ベンゾイル基、フ
タロイル基、トシル基、ニコチノイル基、ピペリジンカ
ルボニル基）、ウレタン型保護基（例えば、ｐ−ニトロ
ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオ
キシカルボニル基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシ
カルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基）またはウレ
ア型置換基（例えば、メチルアミノカルボニル基、フェ
ニルカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル
基）等によって置換されたもの、並びに（２）タンパク
質のカルボキシル末端（Ｃ末端）のカルボキシル基また
は各アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全
部が、エステル型の修飾を受けているもの（例えば、そ
の水素原子がメチル、エチル、イソプロピル、シクロヘ
キシル、フェニル、ベンジル、ｔ−ブチル、４−ピコリ
ルにより置換されたもの）、アミド型の修飾を受けてい
るもの（例えば、非置換アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルア
ミド（例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロ
ピルアミド）を形成しているもの、並びに（３）タンパ
ク質の各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル
基以外の官能基（例えば、水素基、チオール基、アミノ
基等）の一部もしくは全部が、上述のアミノ基と同様の
置換基あるいはトリチル基などで修飾されたもの等が挙
げられる。

【００２９】本発明によるタンパク質の例としては、配
列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（本明細書
において「ｐ１６０」という）およびその誘導体が挙げ
られる。配列番号１のアミノ酸配列は、ヒト巨核球性白
血病細胞（Hirata, M. et al., Nature 349, 617-620(1
991)および Ogura, M. et al., Blood 66, 1384-1392(1
985)）由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたＤＮＡ
配列（ｃＤＮＡ配列）から決定されたものである。この
ｃＤＮＡライブラリーは、Kakizuka, M. et al.,Nature
349, 617-620(1991) に記載の方法に従って調製するこ
とができる。また、ｃＤＮＡ配列は、図１に記載のペプ
チドＡＰ−２３に対応するオリゴヌクレオチドをプロー
ブとして用いることによって得ることができる。

【００３０】また、本発明によるタンパク質の例として
は、配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号
１のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸配列が付加および
／または挿入され、および／または前記配列番号１のア
ミノ酸配列の１以上のアミノ酸が置換および／または欠
失されたタンパク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有するも
のが挙げられる。すなわち、ここにいう付加(additio
n)、挿入(insertion) 、置換(substitution)、および欠
失(deletion)とは、配列番号１のアミノ酸配列からなる
タンパク質の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能およびプロ
テインキナーゼ活性を損なわない（not damage）ような
ものをいう。

【００３１】このような置換の例は、下記の通りであ
る：Ｋ９２１Ｍ、Ｒ９２６Ａ、Ｅ９３０Ａ、Ｅ９４３
Ａ、Ｄ９５１Ａ、Ｅ９６０Ａ、Ｅ９８９Ａ、Ｅ９９５
Ａ、Ｋ９９９Ｍ、Ｒ１０１２Ｌ、およびＫ１０１３Ｍ。

【００３２】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質であっ
て、上記の置換を１つ有するものとしては、例えば、Ｋ
９２１Ｍ（１−１３５４）、Ｒ９２６Ａ（１−１３５
４）が挙げられる。活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有
し、かつプロテインキナーゼ活性を有するタンパク質で
あって、上記置換を２つ以上有するものとしては、Ｋ９
２１Ｍ・Ｒ９２６Ａ（１−１３５４）が挙げられる。

【００３３】また、このような欠失の例は、配列番号１
のアミノ酸配列から７２〜３４３番のアミノ酸配列（プ
ロテインキナーゼ領域）と９２０〜１０１５番のアミノ
酸配列（Ｒｈｏタンパク質結合領域）とを除いた領域ま
たはその一部分の欠失である。具体的には、１０１６〜
１３５４番のアミノ酸配列およびこの部分配列（例え
ば、１０２２〜１３５４番、および１０２５〜１３５４
番）、３４４〜９３３番のアミノ酸配列およびこの部分
配列（例えば、３４４〜７２６番、３４４〜８４６番、
３４４〜９０５番、および３４４〜９１９番）、並びに
１〜７１番のアミノ酸配列およびこの部分配列である。

【００３４】本発明の別の面によれば、配列番号１の７
２〜３４３番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領
域）と９２０〜１０１５番のアミノ酸配列（Ｒｈｏタン
パク質結合領域）とを有するタンパク質が提供される。

【００３５】本発明によれば、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さない
タンパク質またはその誘導体が提供される。

【００３６】上記タンパク質の例としては、配列番号１
のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配
列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入さ
れ、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１
以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパ
ク質であって、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、
かつプロテインキナーゼ活性を有さないものが挙げられ
る。すなわち、ここにいう付加、挿入、置換、および欠
失とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
の活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を損なわず、かつプロ
テインキナーゼ活性を損なうようなものをいう。

【００３７】このような欠失の例は、配列番号１の７２
〜３４３番のアミノ酸配列（プロテインキナーゼ領域）
もしくはプロテインキナーゼ活性に必要な領域またはそ
の一部を含む領域の欠失である。

【００３８】また、配列番号１のアミノ酸配列（但し、
付加、挿入、置換および／または欠失を有する）からな
る活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテイ
ンキナーゼ活性を有さないタンパク質またはその誘導体
は、上記付加、挿入、置換および／または欠失に加え
て、そのタンパク質のＲｈｏタンパク質結合能を損なわ
ないような付加、挿入、置換および／または欠失を有し
ていてもよい。

【００３９】このような欠失の例は、配列番号１のアミ
ノ酸配列から９３４〜１０１５番のアミノ酸配列（Ｒｈ
ｏタンパク質結合領域）を除いた領域またはその一部分
の欠失である。具体的には、１０１５〜１３５４番のア
ミノ酸配列およびその部分配列（例えば、１０２１〜１
３５４番、および１０２４〜１３５４番）、３４４〜９
３３番のアミノ酸配列およびその部分配列（例えば、３
４４〜７２６番、３４４〜８４６番、３４４〜９０５
番、および３４４〜９１９番）、並びに１〜７１番のア
ミノ酸配列およびその部分配列である。

【００４０】また、このような置換の例は、下記の通り
である：Ｋ９２１Ｍ、Ｒ９２６Ａ、Ｅ９３０Ａ、Ｅ９４
３Ａ、Ｄ９５１Ａ、Ｅ９６０Ａ、Ｅ９８９Ａ、Ｅ９９５
Ａ、Ｋ９９９Ｍ、Ｒ１０１２Ｌ、およびＫ１０１３Ｍ。

【００４１】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有さないタンパク質であっ
て、上記置換と欠失とを組み合わせて有するものの例
は、Ｋ９２１Ｍ（９０６−１０９４）、Ｒ９２６Ａ（９
０６−１０９４）、およびＫ９２１Ｍ・Ｒ９２６Ａ（９
０６−１０９４）等である。

【００４２】本発明の別の面によれば、配列番号１の９
３４〜１０１５番のアミノ酸配列を少なくとも有するタ
ンパク質（例えば、配列番号１の７２７〜１０２１番、
８４７〜１０２４番、９０６〜１０２４番、９２０〜１
０２４番、９０６〜１０１５番、９２０〜１０１５番、
または９０６〜１０９４番のアミノ酸配列からなるタン
パク質）またはその誘導体が提供される。これらのタン
パク質は、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつ
プロテインキナーゼ活性を有さないものである。

【００４３】本発明によれば、また、プロテインキナー
ゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有
さないタンパク質またはその誘導体が提供される。ここ
で「プロテインキナーゼ活性」とは、セリン／スレオニ
ン・プロテインキナーゼ活性を含む意味で用いられるも
のとする。

【００４４】上記タンパク質の例としては、配列番号１
のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配
列に１以上のアミノ酸配列が付加および／または挿入さ
れ、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１
以上のアミノ酸が置換および／または欠失されたタンパ
ク質であって、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有さないものが挙げられ
る。すなわち、ここにいう付加、挿入、置換、および欠
失とは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質
のプロテインキナーゼ活性を損なわず、かつ活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合能を損なうようなものをいう。

【００４５】このような欠失の例は、配列番号１の９３
４〜９４５番または１００５〜１０１５番アミノ酸配列
もしくは活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する領域ま
たはその一部を含む領域の欠失である。

【００４６】また、このような置換の例は、Ｋ９３４
Ｍ、Ｌ９４１Ａ、Ｅ１００８Ａ、およびＩ１００９Ａで
ある。

【００４７】また、配列番号１のアミノ酸配列（但し、
付加、挿入、置換、および／または欠失を有する）から
なるプロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能を有さないタンパク質またはその誘導
体は、上記付加、挿入、置換、および／または欠失に加
えて、そのタンパク質のプロテインキナーゼ活性を損な
わないような付加、挿入、置換、および／または欠失を
有していてもよい。

【００４８】このような欠失の例は、配列番号１のアミ
ノ酸配列から７２〜３４３番のアミノ酸配列（プロテイ
ンキナーゼ領域）を除いた領域またはその一部分の欠失
が挙げられる。具体的には、１〜７１番のアミノ酸配列
およびこの部分配列、並びに３４４〜１３５４番のアミ
ノ酸配列およびこの部分配列の欠失である。

【００４９】本発明の別の面によれば、配列番号１の７
２〜３４３番のアミノ酸配列を少なくとも有するタンパ
ク質またはその誘導体が提供される。このタンパク質
は、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能を有さないものである。このようなタ
ンパク質としては、例えば、Ｉ１００９Ａ（１−１３５
４）が挙げられる。

【００５０】本願の優先権主張の基礎となる最初の出願
の後に発行されたLeung, T. et al., J. Biol. Chem. 2
70, 29051-29054 (1995)^＊には、発現クローニングによ
りラット脳ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされ
たＲｈｏタンパク質結合タンパク質、すなわち、ｐ１６
０アイソザイム（ＲＯＫα）、が記載されている。これ
によれば、ＲＯＫαのＲｈｏタンパク質結合フラグメン
トは、ＲＯＫαのアミノ酸配列８９３‐９８２（これは
配列番号１の９４９〜１０３９番のアミノ酸配列に対応
する）をカバーしていることが示唆されている。２つの
アインザイムのアミノ酸配列の比較は図４２に示される
通りである。図４２によれば、ｐ１６０のＲｈｏタンパ
ク質結合領域、すなわち本発明による改変タンパク質、
は前記文献において示唆されたＲｈｏタンパク質結合領
域と相違する。

【００５１】本発明によれば、配列番号１のアミノ酸配
列の部分アミノ酸配列からなり、少くともロイシンジッ
パー様配列、コイルド−コイル領域、プレクストリン類
似領域またはジンク・フィンガー領域のいずれかを有す
るタンパク質またはその誘導体が提供される。

【００５２】本発明によるタンパク質は、活性型Ｒｈｏ
タンパク質結合能とプロテインキナーゼ活性とを有する
もの、あるいはこれらのいずれかまたは両方を失わせる
ように改変されたものである。また、Ｒｈｏタンパク質
は腫瘍の形成、転移をはじめとして細胞形態、細胞運
動、細胞接着、細胞質分裂等の細胞の機能発現に密接に
かかわっている（前掲Takai, Y., et al. 、G.C.Prende
rgast.et al.、Khosravi-Far, R., et al ．、R. Qiu e
t al. 、 Lebowitz 、P., et al., およびYoshioka,K.e
t al. ）。従って、本発明によるタンパク質は、腫瘍の
形成および転移の機構解明に有用であると考えられる。

【００５３】また、Ｒｈｏタンパク質は、平滑筋収縮に
関与することが知られている（前掲K. Hirata et al.
および M. Noda et al. ）。従って。本発明によるタン
パク質は、高血圧や血管攣縮等の種々の循環器系疾患の
機構の解明に有用であると考えられる。

【００５４】塩基配列 本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。

【００５５】配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のよう
に、ヒト巨核球性白血病細胞由来のｃＤＮＡライブラリ
ーから得られたものである。このＤＮＡ配列は、ｐ１６
０のオープンリーディングフレームに相当する。また、
その周辺配列を含めたＤＮＡ配列は図２から１０にかけ
て連続して記載されている。この配列中オープンリーデ
ィングフレームは４４８〜４５０番のＡＴＧから始ま
り、４５１０〜４５１２番のＴＡＡで終了する。

【００５６】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする
種々の塩基配列を選択することができる。従って、本発
明によるタンパク質をコードする塩基配列とは、配列番
号２に記載のＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一
のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係に
あるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味する
ものとし、更にこれらに対応するＲＮＡ配列も含まれ
る。

【００５７】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃ
ＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されて
いる方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作
成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを
行う方法、等によって得ることができる。本発明による
塩基配列は、例えば、Kakizuka, M. et al.,Nature 34
9, 617-620(1991) に記載の方法に従ってヒト巨核球性
白血病細胞ＭＥＧ−０１（Ogura, M. et al., Blood 6
6, 1384-1392(1985) ）由来のｃＤＮＡライブラリーを
調製し、図１に記載のペプチドＡＰ−２３に対応するオ
リゴヌクレオチドをプローブとするスクリーニングを実
施することによって得ることができる。

【００５８】塩基配列が天然由来のものである場合、そ
の起源は特に限定されず、ヒトを含むホ乳類由来のもの
であっても、それ以外を由来とするものであってもよ
い。

【００５９】本発明によるタンパク質をコードする塩基
配列の例は、配列番号２の塩基配列および配列番号２の
ＤＮＡ配列の一部（例えば、配列番号２の２１４〜１０
２９番、２１７９〜３０６３番、２５３９〜３０７２
番、２７１６〜３０７２番、２５３９〜３０４５番、２
７１６〜３０４５番、または２８００〜３０４５番のＤ
ＮＡ配列）である。

【００６０】ベクターおよび形質転換された宿主細胞 本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、宿主
細胞内で複製可能でかつその塩基配列がコードするタン
パク質を発現可能な状態で含んでなるベクターが提供さ
れる。更に、本発明によれば、このベクターによって形
質転換された宿主細胞が提供される。この宿主−ベクタ
ー系は特に限定されず、また、他のタンパク質との融合
タンパク質発現系などを用いることができる。融合タン
パク質発現系としては、ＭＢＰ（マルトース結合タンパ
ク質）、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラー
ゼ）、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ポリヒスチジン、ｍｙ
ｃ、Ｆａｓ等を用いたものが挙げられる。

【００６１】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、原核細胞、酵母、昆虫細胞動物細胞等での発
現ベクター）、ウイルスベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウ
イルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイ
ウイルスベクター、ＨＩＶベクター）、リポソームベク
ター（例えば、カチオニックリポソームベクター）等が
挙げられる。

【００６２】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列や宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー
等を含んでいてもよい。また、このベクターは、本発明
による塩基配列を反復した形で（例えば、タンデムで）
含んでいてもよい。これらは常法に従いベクターに存在
させてよく、このベクターによる宿主細胞の形質転換の
方法も、この分野で慣用されているものを用いることが
できる。

【００６３】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。

【００６４】また、宿主細胞としては、例えば、大腸
菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、
リンパ球、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、腫瘍
細胞等）が挙げられる。

【００６５】上記形質転換された宿主細胞を適当な培地
で培養し、その培養物から上記した本発明によるタンパ
ク質を得ることができる。従って、本発明の別の態様に
よれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供され
る。形質転換された宿主細胞の培養およびその条件は、
使用する細胞についてのそれと本質的に同様であってよ
い。また、培養液からの本発明によるタンパク質の回
収、精製も常法に従って行うことができる。

【００６６】形質転換される細胞が例えばガン患者体内
のガン細胞（例えば、白血病細胞、消化器ガン細胞、肺
ガン細胞、スイ臓ガン細胞、卵巣ガン細胞、子宮ガン細
胞、メラノーマ細胞、脳腫腸細胞等）であるときは、そ
の前記の本発明による塩基配列を含むベクターをヒトを
含む生体内のガン細胞に適当な方法によって導入するこ
とによって、本発明によるタンパク質を発現させること
により、悪性腫瘍等について遺伝子治療を行うことがで
きる。

【００６７】例えば、本発明によるタンパク質（活性型
Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキナー
ゼ活性を有さないタンパク質）がヒトを含む生体内で発
現されることにより、活性型Ｒｈｏタンパク質がこれに
結合し（内在性ｐ１６０と活性型Ｒｈｏタンパク質との
結合を阻害し）、その結果として活性型Ｒｈｏタンパク
質から内在性ｐ１６０へのシグナル伝達が遮断され、Ｒ
ｈｏタンパク質が関与する腫瘍の形成または転移を抑制
できると考えられる。遺伝子治療用のベクターについて
は、高久史磨監修の実験医学（増刊号）第１２巻、第１
５号「遺伝子治療の最前線」（１９９４年）を参照する
ことができる。

【００６８】用途／医薬組成物 前記のように活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有さないタンパク質は、活
性型Ｒｈｏタンパク質と結合することにより（内在性ｐ
１６０と活性型Ｒｈｏタンパク質との結合を阻害するこ
とにより）、活性型Ｒｈｏタンパク質から内在性ｐ１６
０へのシグナル伝達を遮断することができると考えられ
る。一方、前記のようにＲｈｏタンパク質が腫瘍の形
成、転移に密接にかかわっていることが確認されてい
る。また、本発明により、ｐ１６０はＲｈｏタンパク質
からのシグナル伝達を受け取ることが示されたことによ
り、ｐ１６０もまた腫瘍の形成または転移に密接にかか
わっていると考えられる。従って、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さ
ないタンパク質は、腫瘍の形成または転移を抑制するの
に有効であると考えられる。

【００６９】従って、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を
有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さないタンパク
質は、Ｒｈｏタンパク質が関与する（すなわち、Ｒｈｏ
タンパク質を経由するシグナルの伝達による）腫瘍形成
または転移の抑制剤（以下「腫瘍形成等抑制剤」とい
う）として用いることができる。

【００７０】ここで、腫瘍形成および転移としては、Ｒ
ｈｏが関与する腫瘍の形成、他の低分子量Ｇタンパク質
（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２、Ｒａｌ等）が
関与する腫瘍の形成、低分子量Ｇタンパク質のＧＤＰ／
ＧＴＰ交換タンパク質（例えば、Ｄｂｌ、Ｏｓｔ等）が
関与する腫瘍の形成、リソフォスファチジン酸（ＬＰ
Ａ）が関与する腫瘍の形成、受容体型チロシンキナーゼ
（例えば、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体等）、転写制
御タンパク質（ｍｙｃ、ｐ５３等）または種々のヒト腫
瘍ウイルスが関与する腫瘍の形成等が挙げられる。

【００７１】本発明による腫瘍形成等抑制剤は、また、
経口または非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投
与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）、好ましくは
経口投与することができ、薬剤として経口または非経口
投与に適した種々の剤型で、ヒトおよびヒト以外の動物
に使用される。

【００７２】腫瘍形成等抑制剤は、例えばその用途に応
じて、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒
剤、トローチ錠などの経口剤、静注および筋注などの注
射剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいず
れかの製剤形態に調製することができる。これらの各種
製剤は、通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、
湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝
剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化
剤、安定化剤などを用いて常法により製造することがで
きる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば
乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネ
シウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレン
グリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノ
ール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウ
ム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられ
る。

【００７３】薬剤中における本発明のタンパク質の含有
量はその剤形に応じて異なるが、通常全組成物中約０．
１〜約５０重量％、好ましくは約１〜約２０重量％濃度
である。

【００７４】腫瘍形成および転移の治療のための投与量
は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮し
て適宜決定されるが、通常成人１日当り約０．１〜約５
００ｍｇ、好ましくは約０．５〜約５０ｍｇ程度とする
のがよく、これを１日１回または数回に分けて投与する
ことができる。

【００７５】本発明によれば、活性型Ｒｈｏタンパク質
結合能を有し、かつプロテインキナーゼ活性を有さない
タンパク質を、腫瘍が形成されている細胞、またはその
腫瘍が転移する恐れのある細胞に存在させることを含ん
でなる、腫瘍形成または転移の抑制方法が提供される。
この場合の有効投与量、投与方法、および投与形態等
は、前記腫瘍形成等抑制剤に準ずることができる。

【００７６】活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、か
つプロテインキナーゼ活性を有さないタンパク質をコー
ドする塩基配列は、これを有する前記ベクターを用いて
標的細胞を形質転換し、腫瘍の形成または転移を抑制す
る様な態様で用いることができる。すなわち該塩基配列
は腫瘍形成または転移抑制用遺伝子治療剤として用いる
ことができる。

【００７７】スクリーニング法 本発明によれば、（１）スクリーニングの対象となる物
質を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、活性型Ｒｈｏタンパ
ク質結合能を有する本発明によるタンパク質とを含むス
クリーニング系に存在させ、そして（２）活性型Ｒｈｏ
タンパク質と、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有する
本発明によるタンパク質との結合の阻害の程度を測定す
ることを含む、活性型Ｒｈｏタンパク質と、活性型Ｒｈ
ｏタンパク質結合能を有する本発明によるタンパク質と
の結合を阻害する物質のスクリーニング法が提供され
る。

【００７８】ここで、「結合の阻害の程度を測定する」
方法としては、無細胞系での本発明によるタンパク質と
組換え型ＧＴＰγＳ・ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質との
結合をグルタチオンセファロースビーズを用いて測定す
る方法、動物細胞内（細胞系）での本発明によるタンパ
ク質とＲｈｏタンパク質との結合を免疫沈降とイムノブ
ロットとを用いて測定する方法、ツー・ハイブリッド・
システム（two hybridsystem ）（M.Kawabata 実験医
学13,2111-2120(1995)、 A.B.Vojetk et al.Cell 74,20
5-214(1993) ）等が挙げられ、例えば、実施例１（１）
および（３）並びに実施例４〜１０に記載される方法に
準じて結合の阻害の程度を測定することができる。ま
た、本明細書において「結合の阻害の程度を測定する」
とは結合の有無の測定を含む意味で用いられるものとす
る。

【００７９】スクリーニング系は細胞系または無細胞系
のいずれであってもよく、細胞系としては、例えば、酵
母細胞、ＣＯＳ細胞、大腸菌、昆虫細胞、線虫細胞、リ
ンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、およ
び腫瘍細胞が挙げられる。スクリーニングの対象となる
ものは、特に限定されないが、例えばペプチド、ペプチ
ドのアナログ、微生物培養液、有機化合物等が挙げられ
る。

【００８０】本発明によれば、また、（１）スクリーニ
ングの対象となる物質を、プロテインキナーゼ活性を有
する本発明によるタンパク質またはその誘導体を含むス
クリーニング系に存在させ、そして（２）プロテインキ
ナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質またはその
誘導体のプロテインキナーゼの活性の阻害の程度を測定
することを含む、プロテインキナーゼ活性を有する本発
明によるタンパク質またはその誘導体のプロテインキナ
ーゼの活性を阻害する物質のスクリーニング法が提供さ
れる。

【００８１】本発明によれば、更にまた、（１）スクリ
ーニングの対象となる物質を、活性型Ｒｈｏタンパク質
と、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテ
インキナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質また
はその誘導体とを含むスクリーニング系に存在させ、そ
して（２）活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつ
プロテインキナーゼ活性を有する本発明によるタンパク
質またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性または
その活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、活
性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロテインキ
ナーゼ活性を有する本発明によるタンパク質またはその
誘導体のプロテインキナーゼの活性またはその活性の亢
進を阻害する物質のスクリーニング法提供される。

【００８２】「プロテインキナーゼの活性の阻害の程
度」または「プロテインキナーゼ活性の亢進の阻害の程
度」を測定する方法としては、本発明によるタンパク質
の自己リン酸化活性または適当な基質をリン酸化する活
性、または活性型Ｒｈｏタンパク質存在下でこれらの活
性の亢進の程度を測定する方法が挙げられ、例えば、実
施例２および５に記載される方法に準じてプロテインキ
ナーゼ活性の亢進の阻害の程度を測定することができ
る。また、本明細書において「プロテインキナーゼの活
性の阻害の程度」または「プロテインキナーゼ活性の亢
進の阻害の程度」を測定するとは、プロテインキナーゼ
の活性またはプロテインキナーゼ活性の亢進の阻害の有
無の測定を含む意味で用いられるものとする。

【００８３】プロテインキナーゼの活性またはその活性
の亢進の阻害の程度は、例えば、ヒストン等を基質とし
て用いて測定することができる。

【００８４】スクリーニング系およびスクリーニングの
対象は、前記スクリーニング法と同様のものが挙げられ
る。

【００８５】活性型Ｒｈｏタンパク質は、前記のよう
に、腫瘍の形成または転移および平滑筋収縮に密接に関
わっていることが確認されている。また、本発明によ
り、ｐ１６０は活性型Ｒｈｏタンパク質からのシグナル
伝達を受け取ることが示されたことにより、ｐ１６０も
また腫瘍の形成または転移および平滑筋収縮に密接にか
かわっていると考えられる。従って、上記スクリーニン
グ法は、腫瘍形成または転移抑制物質あるいは平滑筋収
縮抑制物質のスクリーニング法としても用いることがで
きる。

【００８６】

【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００８７】実施例１ 活性型Ｒｈｏタンパク質結合タ
ンパク質の精製等 （１）リガンド・オーバーレイ・アッセイによるＲｈｏ
タンパク質結合タンパク質の同定 細胞のホモジェネート（各１００μｇのタンパク質量）
もしくは精製タンパク質を８％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
にかけ、分離したタンパク質をニトロセルロース膜（シ
ュライヒアー＆シュエル社製）にトランスファーした。
Manser,E.et al.J.Biol.Chem.267,16025-16028(1992)お
よびManser,E.et al.Nature 367,40-46(1994) に記載さ
れた方法に従って、膜上のタンパク質を変性させ、リネ
イチャーした。ただし、リネイチャーは、０．１％のウ
シ血清アルブミン，０．５ｍＭＭｇＣｌ_２，５０μＭ
ＺｎＣｌ_２，０．１％トリトンＸ−１００および５ｍＭ
ジチオスレイトールを含むダルベッコの生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）中、４℃で、一晩かけて実施した。

【００８８】組換えＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質（Ｒｈ
ｏＡとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）との組換え融合タンパク質）は、Morii,N.et al.J.
Biol.Chem.,268,27160-27163(1993)に記載の方法に従っ
て作製した。組換えＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質に［
^３５Ｓ］ＧＴＰγＳまたは［^３５Ｓ］ＧＤＰβＳ（デュ
ポン−ニュー・イングランド・ヌクレアー社製）をロー
ドしたが、その際には４０μＭの組換えＲｈｏＡタンパ
ク質を１００μＭの各ヌクレオシド（１，０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ）とともに、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ，１００ｍＭＮａＣｌ，０．０５％ ツイーン２
０および５ｍＭ ジチオスレイトールを含む２５ｍＭ
トリス−塩酸，ｐＨ７．５中で、３０℃、３０分間イン
キュベートした。組換えＲｈｏＡタンパク質に結合した
放射能活性は、Morii,N.et al.J.Biol.Chem.263,12420-
12426(1988) に記載された方法に従って、フィルター・
アッセイにより決定した。放射性ヌクレオシドが結合し
た組換えＲｈｏＡタンパク質を、その後リネイチャーし
たタンパク質に５ｎＭとなるように加え、Manser,E.et
al.Nature 367,40-46(1994) に記載された方法に従っ
て、インキュベーションした。続いて膜を洗浄し、乾燥
し、Ｘ線フィルムに暴露しオートラジオグラフィーを行
った。結果は図１１に示される通りであった。

【００８９】（２）Ｒｈｏタンパク質結合タンパク質の
精製 ヒト血液中の血小板を、Morii,N.J.Biol.Chem.267,2092
1-20926.(1992)に記載された方法に従って、バッフィー
・コート画分より集めた。これ以降の実験は、全て４℃
で実施した。１００ユニットの血液由来の洗浄した血小
板を、ポッター・エルベジェム・ホモジェナイザーを用
いて、１００ｍｌのバッファーＡ（１ｍＭ ジチオスレ
イトール，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，１ｍ
Ｍベンザミジン・ハイドロクロライド，１μｇ／ｍｌ
ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡおよび１
００μＭ ＰＭＳＦを含む１０ｍＭ トリス−塩酸，ｐ
Ｈ７．４）中でホモジェナイズした後、１００，０００
×ｇで６０分間遠心分離した。９７０ｍｇのタンパク質
を含む上清を、バッファーＡで平衡化したＤＥＡＥ−セ
ファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア・バイオテ
ック社製、ベッド・ボリューム，７０ｍｌ）にかけた。
溶出は、０から０．５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡ
（トータル量，１２００ｍｌ）の直線勾配によって実施
した。活性型Ｒｈｏタンパク質に結合する分子量約１６
０ｋＤのタンパク質（以下、「ｐ１６０」という）は、
０．２５Ｍ ＮａＣｌの濃度でブロードなピークとして
現れた。

【００９０】１７０ｍｇのタンパク質を含むＲｈｏタン
パク質に結合活性を示す画分をプールし、バッファーＡ
で平衡化したレッドＡ・セファロースカラム（アミコン
社製、ベッド・ボリューム，７ｍｌ）にかけた。続い
て、カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡ（１５
０ｍｌ）で洗浄した後、さらに１．５Ｍ ＮａＣｌを含
むバッファーＡ（５０ｍｌ）で洗浄した。溶出は、１．
５Ｍ ＮａＣｌと５０％エチレン・グリコールを含むバ
ッファーＡ（５０ｍｌ）で行った。回収した画分（１
７．５ｍｇのタンパク質量）を、２回に分けて１リット
ルずつのバッファーＡに対して４８時間透析した。ダイ
アライゼートを、バッファーＡで平衡化した２ｍｌのマ
クロ−プレップ・セラミック・ハイドロキシアパタイト
（粒子径４０μｍ）・カラム（バイオ−ラッド社製）に
かけた後、１０〜３００ｍＭのリン酸化カリウム溶液，
ｐＨ７．０の直線勾配（トータル量，９０ｍｌ）で溶出
した。その後、Ｒｈｏタンパク質結合活性画分（０．７
５ｍｇのタンパク質量）をモノＱ ＨＲ５／５カラム
（ファルマシア・バイオテック社製）にかけ、タンパク
質を、トータル量３５ｍｌの１５０〜５００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ溶液の直線勾配で溶出した。ｐ１６０は、３５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌの濃度でブロードなピークとして溶出さ
れ、これを最終的な標品とした。精製の結果は図１２に
示される通りであった。

【００９１】また、この標品を前述の方法に従って［
^３２Ｓ］ＧＴＰγＳをロードしたＲｈｏＡタンパク質等
とともにオーバーレイアッセイにかけた。ここで用いた
組換えヒトＲｈｏＡタンパク質、Ｒａｃ１タンパク質お
よびＣｄｃ４２Ｈｓタンパク質は常法に従って、グルタ
チオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質として
大腸菌に発現させた後、Morii,N.et al.J.Biol.Chem.26
8,27160-27163(1993) に記載された方法に従って精製し
た。結果は図１３に示される通りであった。

【００９２】（３）ＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質を用い
たアフィニティー沈降実験 約０．２ｐｍｏｌのｐ１６０を含むハイドロキシアパタ
イト画分を２０μＭのＧＴＰγＳまたはＧＤＰを含むオ
ーバーレイ・バッファーに対して透析した。この画分
に、２０ｐＭのＧＴＰγＳまたはＧＤＰをロードした組
換えＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質を加え、トータル液量
を２００μｌに合わせた。インキュベーションは、４℃
で６０分間、緩やかに振とうさせて行った。

【００９３】その後、各ヌクレオシドを含むオーバーレ
イ・バッファーで予め平衡化したＧＳＨ−セファロース
を３０μｌずつを加えて、さらに３０分間４℃でインキ
ュベーションを続けた。混合物を１，０００×ｇで５分
間遠心した。その後、ペレットを洗浄バッファー（２５
ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６．５，１５０ｍＭＮａ
Ｃｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．０５％ トリトンＸ−
１００および２０μＭ ＧＴＰγＳまたはＧＤＰ）で２
回洗浄した。その後、セファロース・ビーズを等量の２
×レムリ・サンプル・バッファーに懸濁した。懸濁液を
煮沸し、前述の方法に従って、抽出液を［^３５Ｓ］ＧＴ
ＰγＳまたはＧＤＰをロードしたＧＳＴ−ＲｈｏＡ、Ｇ
ＳＴ−Ｒａｃ、ＧＳＴ−Ｃｄｃ４２およびＧＳＴととも
にオーバーレイ・アッセイにかけた。結果は図１４に示
される通りであった。

【００９４】実施例２ プロテインキナーゼ活性試験 （１）ｐ１６０の自己リン酸化とリン酸化アミノ酸分析 ｐ１６０のモノＱ画分（８ｎｇのタンパク質）を４μＭ
［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（デュポン−ニュー・イングラン
ド・ヌクレアー社製、２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに３
０℃で３０分、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ
７．３，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２，
５ｍＭ ＭｎＣｌ_２，０．０３％ ブリジ３５および２
ｍＭジチオスレイトール中でインキュベーションした。
インキュベーション後、溶液を等量の２×レムリ・サン
プル・バッファーと混合し、５分間煮沸した後、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥにかけた。ゲルをクーマシー・ブリリアント
・ブルーで染色し、乾燥後オートラジオグラフィーにか
けた。結果は図１５に示される通りであった。

【００９５】リン酸化アミノ酸分析を行うために、放射
能標識されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファー
した。次に、放射能標識されたバンドを切り出し、Kuma
gai,N.et al.FEBS Lett.366,11-16(1995) に記載された
方法に従って、リン酸化アミノ酸分析にかけた。結果は
図１６に示される通りであった。

【００９６】（２）リン酸化反応 ｐ１６０のモノＱ画分（１７．５ｎｇのタンパク質）を
４０μＭ［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（３．３Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ）および３μｇのヒストン（ＨＦ２Ａ，ワーシングト
ン社製），脱リン酸化したカゼイン（シグマ社製）もし
くはミエリン塩基性タンパク質（ギブコ社製）ととも
に、０．４μＭ ＧＤＰ−またはＧＴＰγＳをロードし
たＧＳＴ−ＲｈｏＡタンパク質（実施例１）存在下で、
トータル量３１μｌとして３０℃でインキュベーション
した。７μｌずつを、０，５，１０，２０分に取り、等
量の２×レムリ・サンプル・バッファーと混合し、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにかけた。ゲルをクーマシー・ブリリアン
ト・ブルーで染色し、乾燥後オートラジオグラフィーに
かけた。２０分後の結果は図１７に示される通りであっ
た。

【００９７】次に、ヒストンに関し、放射活性を有する
バンドを切り出し、放射活性をチェレンコフ測定法によ
り決定した。結果は図１８に示される通りであった。な
お、ＧＴＰ結合Ｒｈｏタンパク質存在下でのヒストンの
リン酸化は、ＧＤＰ結合Ｒｈｏタンパク質存在下でのそ
れと比べて明らかに亢進していた。

【００９８】実施例３ ｐ１６０のアミノ酸配列および
これをコードするＤＮＡ配列 （１）ペプチド断片の配列決定 ｐ１６０を３０ｐｍｏｌ含むモノＱ画分をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけた後、ＰＶＤＦ膜にトランシファーした。タ
ンパク質をＰｏｎｃｅａｕ Ｓで染色し、ｐ１６０のバ
ンドを切り出した。Iwamatsu,A.Electrophoresis 13,14
2-147(1992) およびMaekawa,M.et al.Mol.Cell.Biol.1
4,6879-6885(1994)に記載された方法に従って、固定化
したｐ１６０をアクロモバクターのリジル・エンドペプ
チダーゼまたはエンドプロテイナーゼ Ａｓｐ−Ｎで消
化し、得られたペプチド断片を分離し配列を決定した。

【００９９】（２）ｃＤＮＡクローニング 培養ＭＥＧ−０１Ｓヒト巨核球性白血病細胞ＭＥＧ−０
１（Hirata,M.et al.Nature 349,617-620(1991) および
Ogura,M.et al.Blood 66,1384-1392(1985)）より、ポリ
（Ａ）^＋ ＲＮＡを調製し、Kakizuka,A.et al.A Pract
ical Approach(Oxford:IRL Press),pp.223-232. に記載
の方法に従って、λｇｔ−１０およびλＺＡＰ−IIｃＤ
ＮＡライブラリーを構築した。λｇｔ−１０はまず２０
残基のデジェネレート・オリゴヌクレオチド・プローブ
（７残基の部分アミノ酸配列ＡＰ−２３に相当）でスク
リーニングした。２．６ｋｂｐのインサート（クローン
Ｐ２）を含むポジティブ・クローンのひとつを、３×１
０^５プラークより単離した。このクローンは、プローブ
に相当する塩基配列を含み、ｐ１６０由来の２つの他の
ペプチド配列をイン・フレームでコードしていた。

【０１００】このｃＤＮＡの５’部分（４５０塩基対）
をプローブとして、λＺＡＰ−IIｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、ひとつのクローン（クローンＮ）
を単離した。このクローンはＰ２と重複し、さらに３’
側の４５０塩基対を含んでいた。この３’末端まで伸び
ている部分をプローブとして用いて、クローン４Ｎをλ
ｇｔ−１０ライブラリーより得た。クローン４Ｎはクロ
ーンＮよりもさらに３５０塩基対の３’末端側の延長部
分を有していた。この３’末端側の延長部分をプローブ
として用いて、同一のライブラリーよりクローンＣを単
離した。クローンＣは、３’末側にさらに２．５ｋｂｐ
伸びていた。各クローンの位置関係等は図１９に示され
る通りであった。

【０１０１】（３）配列分析 ヌクレオチド配列は、両方のストランドについて、ダイ
デオキシ・チェーン・ターミネーション法で決定した。
推定アミノ酸配列およびＤＮＡ配列は図１および図２〜
１０に示される通りであった。

【０１０２】配列の比較等は、ＢＬＡＳＴ（Altschul,
S.F.et al.J.Mol.Biol.215,403-410(1990) ）を用い
て、ノン−リダンダントＰＤＰ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋
ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ＋ＧｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰｕｐ
ｄａｔｅデータベースに対して実施した。コイルドーコ
イル構造の可能性については、Ｌｕｐａｓらによって開
発されたアルゴリズム（Lupas,A.et al.Science 252,11
62-1164(1991) ）によって解析した。その結果、ｐ１６
０の構造は図２１に示されるように推定された。

【０１０３】ｐ１６０の構造中には、Ｎ末端の２７２ア
ミノ酸から成る配列（図１の配列番号７２から３４３に
相当）にセリンスレオニンキナーゼのファミリーのひと
つであるプロテインキナーゼＡファミリーのタンパク質
に特徴的な配列（S.K.Hankset al.,Science 241, 42-52
(1998) ）が存在することが明らかとなった。このプロ
テインキナーゼＡに特徴的な配列を含むＮ末側の４２０
アミノ酸配列（図１の配列番号１から４２０に相当）
は、マイトニック・ディストロフィー・キナーゼ（MD-P
K ）のアミノ酸配列（J.D.Brook et al.,Cell,68,799-8
08(1992)およびM.S.Mahadevan et al.,Hum.Mol.Genet,
2,299-344(1993)）と４４% の同一性があることが明ら
かとなった（図２５）。このキナーゼ領域に続く６００
アミノ酸の配列（図１の配列番号４２３から１０９６に
相当）は、ミオシン重鎖を含む様々なコイルド−コイル
タンパク質との類似性を示す配列が存在することが明ら
かとなった（図２６）。また、ｐ１６０のＣ末側には図
２７に示される様にプレクストリン類似（ＰＨ）領域
（A.Musaccio et al.,Trends Biochem Sci,18,343-348
(1993) ）に類似するアミノ酸配列が存在し、また図２
８に示される様に、プロテイン・キナーゼＣに存在する
様なシステインに富むジンク・フィンガー領域（A.F.Qu
estetal,J.Biol.Chem,269,2961-70(1994) およびJ.Zhan
g et al.,J.Biol.Chem,269,18727-18730(1994)）に類似
するアミノ酸配列が存在することが明らかとなった。ま
た、図１に示したように、ｐ１６０にはロイシンジッパ
ー様配列が存在することが明らかとなった。

【０１０４】（４）ノーザン・ブロット解析 ノーザン・ブロット解析は、ヒューマン・マルチプル・
ティッシュー・ブロッツＩ（クロンテック社製）を用い
て、^３２Ｐで標識したＰ２のＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ消化
断片の５’−フラグメントをプローブとして実施した。
ハイブリダイゼーションは、５０ｍＭ リン酸化ナトリ
ウム・バッファー，ｐＨ６．５，５０％フォルムアミ
ド，５×デンハーズ，０．１％ＳＤＳおよび０．２ｍｇ
／ｍｌ酵母ｔＲＮＡを含む５×ＳＳＰＥ中で、４２℃で
１６時間行った。フィルターを、２×ＳＳＣ−０．１％
ＳＤＳ中で、４２℃、１５分、３回洗浄した後、４日間
Ｘ−線フィルムへ暴露した。結果は図２２に示される通
りであった。

【０１０５】実施例４ 発現ベクターとトランスフェク
ション・ベクターの構築 発現用に用いたフル・サイズのｃＤＮＡは、下記の通り
に構築した。クローン４Ｎ ｃＤＮＡの挿入されたプラ
スミドＤＮＡ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋（スト
ラタジーン社製）を、ＳｐｈＩおよびＳａｃＩで消化
し、クローンＣのＳｐｈＩ−ＳｐｅＩフラグメントおよ
びＳｐｅＩ−ＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩリンカー
とライゲーションし、プラスミド４Ｎ−Ｃを作製した。
次に、クローンＮ ｃＤＮＡを鋳型とし、フォワード・
プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＡＣ
ＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＧＡＣＡＧＴＴＴＴＧＡＧ−
３’）およびリバース・プライマー（５’−ＣＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＣＴＣＴＧ
−３’）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲフラグメント
をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ^＋（ストラタジーン社
製）中にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こ
のプロダクトが挿入されたプラスミドをＢａｍＨＩとＥ
ｃｏＲＶで消化し、プラスミド４Ｎ−Ｃ由来のＸｂａＩ
−ＥｃｏＲＶフラグメントおよびクローンＮ由来のＢａ
ｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントとライゲーションした。
結果としてできたプラスミドから、Ａｓｐ７１８−Ｅｃ
ｏＲＶフラグメントを切り出し、ｍｙｃ−エピトープ配
列を含むｐＣＭＸベクター（Dyck,J.A.et al.Cell 76,3
33-343）に挿入した（ｐＣＭＸ−ｍｙｃ−ｐ１６０）。

【０１０６】ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６
５１）を１０^５細胞／３．５ｃｍディッシュとなるよう
にプレートに蒔き、一晩培養した後、リポフェクタミン
を用いて１．５μｇのｐＣＭＸベクターでトランスフェ
クションした。細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で６時間イ
ンキュベートした後、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ中で１８時間培養した。培地を除去し、細胞をＰＢＳ
で２回洗浄した後、１００μｌの２×レムリ・サンプル
・バッファー中で溶解した。３０μｌずつのライゼート
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、分離したタンパク質をＰＶ
ＤＦ膜またはニトロセルロース膜にトランスファーし
た。９Ｅ１０抗ｍｙｃエピトープ抗体を用いたイムノブ
ロッティングおよびリガンド・オーバーレイ解析は、前
述の方法に従って実施した。結果は図２０に示される通
りであった。

【０１０７】実施例５ ｐ１６０ｃＤＮＡとＲｈｏＡ
^Ｖａｌ14−および野生型ＲｈｏＡｃＤＮＡとのコトラン
スフェクション ＣＯＳ７細胞を１．２×１０^５細胞／６ｃｍディッシュ
の密度に蒔いた。１日間培養した後、培地を除去し、
２．２５μｇのｐＣＭＸ−ｍｙｃ−ｐ１６０またはｐＣ
ＭＸ−ｍｙｃを、０．７５μｇのｐＥＦ−ＢＯＳ−ＨＡ
（ヘモフィルス・インフルエンザ・ヘマグルチニン）が
標識として結合しているＶａｌ^１４−ＲｈｏＡ、ｐＥＦ
−ＢＯＳ−ＨＡ−ＲｈｏＡまたはベクターのみととも
に、２ｍｌのＯｐｉ−ＭＥＭ中でリポフェクタミンを用
いてトランスフェクションした。６時間後、３ｍｌのＯ
ｐｉ−ＭＥＭを添加し、細胞をさらに３０時間培養し
た。氷令したＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、リシス・
バッファー（２０ｍＭ トリス−塩酸，ｐＨ７．５，
ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，５ｍＭ ＭｇＣｌ
_２，２５ｍＭ ＮａＦ，１０ｍＭ β−グリセロフォス
フェート，５ｍＭ リン酸化ナトリウム，０．２ｍＭ
ＰＭＳＦ，２ｍＭ ジチオスレイトール，０．２ｍＭ
ソディウム・ヴァナデート，０．０５％ トリトンＸ−
１００および０．１μＭカリクリンＡ）を用いて、氷上
で２０分間で細胞を溶解した。ライゼートを１０，００
０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。

【０１０８】次に、プロテインＧ−セファロースに結合
した９Ｅ１０抗体またはコントロールＩｇＧを上清に加
え、混合液を４℃で３時間震とうした。懸濁液を１，０
００×ｇで５分間遠心分離し、結果として得られたペレ
ットを３回、０．５ｍｌのリシス・バッファーで洗浄し
た。Morii,N.et al.J.Biol.Chem.263,12420-12426(198
8) に記載された方法に従ってＡＤＰ−リボシル化反応
のために、ペレットを５００μｌのジチオスレイトール
を含まないＡＤＰ−リボシル化バッファーに再び懸濁し
た。１００μｌずつを取り、沈澱後、抗−ｍｙｃ抗体を
用いたイムノブロッティングに用いた。結果は図２３下
段に示される通りであった。

【０１０９】残りの４００μｌの懸濁液を遠心分離し、
ペレットを再び３４μｌのＡＤＰ−リボシル化バッファ
ーに懸濁した。［^３２Ｐ］ＮＡＤ（デュポン−ニュー・
イングランド・ヌクレアー社製、１０^６ｃｐｍ／ｐｍｏ
ｌ）を１μＭとなるように加え、４００ｎｇのボツリヌ
ス菌Ｃ３酵素と３０℃、１２時間反応させた。ＡＤＰ−
リボシル化反応の解析は、Morii,N.et al.J.Biol.Chem.
263,12420-12426(1988) に記載された方法に従って実施
した。結果は図２３上段に示される通りであった。

【０１１０】キナーゼ・アッセイのために、ペレットを
５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および０．１μＭカリキュリンＡを
含む２０ｍＭ トリス−塩酸，ｐＨ７．５で１回洗浄し
た後、リン酸化反応用バッファーに再び懸濁させた。リ
ン酸化反応は、前述の方法に従って、ヒストンを基質と
して実施した。結果は図２４に示される通りであった。

【０１１１】実施例６ ｐ１６０のＲｈｏタンパク質結
合領域の同定 実施例１、２、４、５に示したように、ＧＴＰ結合型の
ＲｈｏＡはｐ１６０と特異的に結合して、それを活性化
する。ｐ１６０のＲｈｏタンパク質結合領域を同定する
ために、ｐ１６０を５つのフラグメントに分け（図２
９）、それらをＨｉｓ融合タンパク質として発現させ、
Ｎｉ‐ＮＴＡ樹脂を使用することにより精製した。具体
的には、下記の方法に従って実施した。

【０１１２】ｐ１６０を図２９で示されるような５つの
フラグメント、ＫＤ（２- ３３３）、Ｍ１（３３４- ７
２６）、Ｍ２（７２７- １０２１）、Ｍ３（１０１８-
１０９４）およびＣ（１０９６- １３５４）に分割し、
各々をヒスチジン６残基よりなるタグとの融合タンパク
質として発現させた。まず、これらのフラグメントを大
腸菌で発現させるために、プラスミドベクターｐＱＥ‐
１１（Ｑｕｉａｇｅｎ社）のクローニング領域（ＧＧＧ
ＡＴＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＧＣＡＧＣＣ Ａ
ＡＧ ＣＴＴ）をＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｔ
ＡＣ ＣＧＡＧＣＴ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＧＧ ＣＣＧ
ＣＴＡ ＧＡＴ ＡＧＡ ＴＡＧ ＡＡＧ ＣＧＡ
ＧＣＴ ＣＧＡ ＡＴＴに代えて、ＢａｍＨＩ、Ｓｍ
ａＩ、Ａｓｐ７１８、ＳａｃＩおよびＮｏｔＩの制限部
位を作った。

【０１１３】上記のように改変したｐＱＥ‐１１（以下
「改変ｐＱＥ‐１１」という）のＳａｃＩ部位にインフ
レームでＫＤフラグメント（２‐３３３）を挿入するた
めに、配列番号１の２〜７３番のアミノ酸配列に相当す
るｃＤＮＡフラグメントを５′‐ＧＧ ＧＧＡ ＧＣＴ
ＣＡＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＧ ＡＣＴ ＧＧＧＧ
ＡＣ ＡＧＴ ＴＴＴ ＧＡＧ‐３′および５′‐ＣＧ
ＣＣＴ ＧＣＡＧＧＣ ＴＴＴ ＣＡＴ ＴＣＧ Ｔ
ＡＡ ＡＴＣ ＴＣＴ Ｇ‐３′の合成プライマーを用
いてＰＣＲにより増幅した。ここに記載されたすべての
ＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートはｐＣＭＸ‐ｍｙｃ‐ｐ
１６０（実施例４）に由来する。ＰＣＲは初めに９５℃
で１分間、その後（９５℃で１分間、５３℃で１分間、
７２℃で１分間）の１５サイクル、その後７２℃で２分
間インキュベートすることにより行った。このフラグメ
ントをＳａｃＩおよびＰｓｔＩで消化し、ｐＳＫ^＋（ス
トラタジーン社製）のＳａｃＩおよびＰｓｔＩ部位中に
ライゲーションした。

【０１１４】このプラスミドをＢａｍＨＩおよびＰｓｔ
Ｉで消化し、オリジナルｐ１６０クローンＮ ｃＤＮＡ
（実施例３）のＢａｍＨＩ‐ＰｓｔＩフラグメントをこ
れらの部位に挿入した（ｐＳＫ^＋‐ＮＴ１）。配列番号
１の７４〜３３３番のアミノ酸配列に相当するフラグメ
ントＮＴ２も合成オリゴヌクレオチドプライマー５′‐
ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＡＡ Ｇ
ＡＴ ＴＡＴ ＧＡＡＧＴＡ ＧＴＧ ＡＡＧ Ｇ‐
３′および５′‐ＴＣ ＡＧＣ ＴＡＡ ＴＴＡ ＧＡ
Ｇ ＣＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＡＣ
ＡＣＣ ＡＴＴ ＴＣ‐３′を用いてＰＣＲにより作
製した。ＰＣＲは初めに９５℃で１分間、その後（９５
℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間）の１５
サイクル、最後に７２℃で２分間インキュベートするこ
とにより行った。次いで生成物をブラント・エンドと
し、ｐＳＫ^＋（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＶ部位
中にライゲーションした（ｐＳＫ^＋‐ＮＴ２）。ＮＴ１
およびＮＴ２を連結させるために、ｐＳＫ^＋‐ＮＴ２の
ＰｓｔＩ‐ＰｓｔＩフラグメントをｐＳＫ^＋‐ＮＴ１の
ＰｓｔＩ部位中にライゲーションして、配列番号１の２
〜３３３番のアミノ酸配列に相当するインサートを得た
（ｐＳＫ^＋‐ＫＤ）。ｐＳＫ^＋‐ＫＤのＳａｃＩ‐Ｎｏ
ｔＩフラグメントを改変ｐＱＥ‐１１中に連結して、Ｈ
ｉｓ（×６）‐ＫＤを発現するプラスミドを作製した。

【０１１５】Ｍ１フラグメントを作製するために、配列
番号１の３３４〜３９５番のアミノ酸配列に相当するｃ
ＤＮＡフラグメントをまず５′‐ＧＧ ＧＧＡ ＧＣＴ
ＣＧＡ ＣＡＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＡ
ＡＡＴ Ｇ‐３′および５′‐ＣＣ ＴＡＣ ＡＡＡ
ＡＧＧ ＴＡＧ ＴＴＧ Ａ‐３′のプライマーを用い
てＰＣＲにより増幅させた（９５℃で１分間、その後９
５℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で１分間の１５
サイクル、最後に７２℃で２分間のインキュベート）。
生成物をブラントエンドとし、ＳａｃＩで消化した。
ｐＳＫ^＋（ストラタジーン社製）をＡｓｐ７１８で消化
し、１４マーのオリゴヌクレオチドを挿入してＮｏｔＩ
部位を作製した。次いでＰＣＲ生成物を上記のように改
変したｐＳＫ^＋のＳａｃＩおよびＥｃｏＲＶ部位中に連
結した。次いでこのプラスミドをＳｐｅＩおよびＸｈｏ
Ｉで消化し、オリジナルｐ１６０クローン４Ｎ ｃＤＮ
Ａ（実施例３（２））のＳｐｅＩ‐ＸｈｏＩフラグメン
トをこれらの部位に挿入した（ｐＳＫ^＋‐Ｍ１）。ｐＳ
Ｋ^＋‐Ｍ１のＳａｃＩ‐ＮｏｔＩフラグメント（３３４
‐７２６）を改変ｐＱＥ‐１１中に連結した。

【０１１６】Ｍ２フラグメント（７２７‐１０２１）
は、配列番号１の２７３〜１０２１番のアミノ酸配列を
コードするオリジナルクローン４Ｎ ｃＤＮＡ（実施例
３（２））を含むｐＳＫ^＋（ストラタジーン社製）をＸ
ｈｏＩで消化して、Ｎ末端を欠失させ、セルフ・ライゲ
ーションさせることにより作製した。このプラスミドを
Ａｓｐ７１８およびＳａｃＩで切断して、改変ｐＱＥ‐
１１のＡｓｐ７１８およびＳａｃＩ部位中にライゲーシ
ョンした。

【０１１７】Ｍ３フラグメント（１０１８‐１０９４）
は、９５℃で３分間、その後９５℃で１分間、５９℃で
１分間、７２℃で１分間の１５サイクル、最後に７２℃
で２分間かけて５′‐Ｃ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＣＣ Ｇ
ＡＴ ＡＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＡＡＴ ＡＣ
Ａ ＣＡ‐３′および５′‐ＴＡＡ ＣＣＣ ＧＧＧＡ
ＡＧ ＴＴＴ ＡＧＣ ＡＣＧ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＴ
Ｃ‐３′のプライマーを用いてＰＣＲにより作製した。
生成物をブラント・エンドとし、ＢａｍＨＩで消化し、
ｐＳＫ^＋（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩおよびＥ
ｃｏＲＶ部位中に挿入した（ｐＳＫ^＋‐Ｍ３）。ｐＳＫ
^＋‐Ｍ３のＢａｍＨＩ‐Ａｓｐ７１８フラグメント（１
０１８‐１０９４）を改変ｐＱＥ‐１１中にライゲーシ
ョンした。

【０１１８】Ｈｉｓ６‐Ｃ（１０９６‐１３５４）を発
現するプラスミドを作製するために、オリジナルｐ１６
０クローンＣ ｃＤＮＡ（実施例３（２））のＳａｕ９
６Ｉ‐ＨｉｎｃIIフラグメントをブラント・エンドと
し、改変ｐＱＥ‐１１のＳｍａＩ部位中にライゲーショ
ンした。

【０１１９】大腸菌を上記ｐＱＥプラスミドで形質転換
させ、増殖させた。イソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクト
シドをＡ600 が０．８の増殖段階で培養物に加え、培養
を３０℃で更に２０時間続けた。細胞を０．１Ｍリン酸
ナトリウムおよび１０ｍＭＴｒｉｓ- ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）を含む８Ｍ尿素で溶解させた。２５℃で１時間のイ
ンキュベート後に、ライゼートを１２，０００×ｇで１
０分間遠心した。上清をＮｉ‐ＮＴＡ樹脂(Qiagen 社）
と共に２５℃で１時間インキュベートした。樹脂を８Ｍ
尿素、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．０１Ｍ Tris-Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ６．３）で洗浄し、Laemmli サンプル緩衝液
中で５分間煮沸した。組換えヒトＲｈｏＡはグルタチオ
ン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ融合タンパク質として発現
させ、Morii, N. et al., J. Biol. Chem .268, 27160-
27163 (1993)に記載されたように精製した。

【０１２０】このアッセイで用いた標品の純度をＳＤＳ
‐ＰＡＧＥにより調べた。図３２で示されたように、各
タンパク質標品は予想されたサイズで単一のバンドを示
し、各タンパク質の量はＩＰＴＧ誘導により増加した。
ＫＤフラグメントは発現されなかったが、これはおそら
くＫＤタンパク質が構成的に活性化した変異体として機
能したためであると考えられる。

【０１２１】次いで発現タンパク質はプローブとして〔
³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳをロードしたＧＳＴ‐ＲｈｏＡを用い
てリガンドオーバーレイアッセイにかけた。具体的に
は、まず、Laemmli 緩衝液で抽出されたＨｉｓ標識タン
パク質を８、１０または１５％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにか
けて、分離したタンパク質をニトロセルロース膜(Schle
icher & Schuell)に移した。次に、膜上のタンパク質を
Manser, E. et al., J. Biol. Chem. 267, 16025-16028
(1992) に記載されたように変性およびリネイチャーさ
せた（実施例１参照）。次いで、リネイチャーした膜
を、Manser, E. et al., J. Biol. Chem. 267, 16 025-
16028 (1992)に記載された方法（実施例１参照）に従っ
て、オーバーレイバッファー中で１０または２０ｎＭ〔
³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳをロードした各Ｒｈｏタンパク質と共
にインキュベートした。最後に、膜を洗浄し、乾燥さ
せ、Ｘ線フィルムに暴露した。

【０１２２】結果は図３３で示した通りであった。レー
ン３および４のみで、放射能活性を示すバンドがこのフ
ィルター上でアミドブラックで染色されたＭ２フラグメ
ントと同一の泳動位置にみられた。これらの結果より、
Ｍ２フラグメント（７２７‐１０２１）がＧＴＰ‐Ｒｈ
ｏＡの結合領域を含むことが示された。

【０１２３】実施例７ Ｍ２フラグメント内のＲｈｏタ
ンパク質結合部位の同定 Ｍ２フラグメント内のＲｈｏＡ結合に必須の最小部分を
同定するために、初めにＮ末端側からＭ２フラグメント
を欠失（ delete ）させ（図３０のＭ２‐１〜Ｍ２‐
６）、末端欠失体をＨｉｓ融合タンパク質として発現さ
せ、それらを精製した（図３４、レーン１‐７）。具体
的には下記に記載の方法にしたがって実施した。

【０１２４】Ｍ２フラグメントの様々な部分断片をＰＣ
Ｒを用いて作製し、各々をＨｉｓを融合させたタンパク
質として大腸菌で発現させた（図３０）。フラグメント
Ｍ２‐１（８４７‐１０２４）、Ｍ２‐２（９０６‐１
０２４）、Ｍ２‐３（９２０‐１０２４）、Ｍ２‐４
（９３４‐１０２４）、Ｍ２‐５（９４６‐１０２４）
およびＭ２‐６（９７４‐１０２４）を表１で示された
ような一対のプライマー（プライマーペア）を用いて増
幅させた。Ｍ２‐１、Ｍ２‐２；ＰＣＲは９５℃で３分
間、その後（９５℃で１分間、５９℃で１分間、７２℃
で２分間）の１５サイクル、その後７２℃で２分間行っ
た。Ｍ２‐３、Ｍ２‐４、Ｍ２‐５、Ｍ２‐６；ＰＣＲ
は９５℃で３分間、その後（９５℃で１分間、５５℃で
１分間、７２℃で１分間）の１５サイクル、その後７２
℃で２分間行った。尚、ここに記載されたすべてのＰＣ
Ｒ用のＤＮＡテンプレートはｐＣＭＸ‐ｍｙｃ‐ｐ１６
０（実施例４）であった。

【０１２５】次いで生成物をブラントエンドとし、Ｂａ
ｍＨＩで消化し、ｐＳＫ⁻（ストラタジーン社製）のＢ
ａｍＨＩおよびＥｒｏＲＶ部位中に挿入した。各プラス
ミドのＢａｍＨＩ‐Ａｓｐ７１８フラグメントを改変ｐ
ＱＥ‐１１のＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８部位中にラ
イゲーションして、発現させた。Ｈｉｓ６‐Ｍ２‐７
（９０６‐１０１５）およびＭ２‐８（９２０‐１０１
５）を発現するプラスミドを作製するために、ｐＳＫ⁻
−Ｍ２‐２（９０６‐１０２４）およびＭ２‐３（９２
０‐１０２４）のＢａｍＨＩ‐ＤｒａＩフラグメントを
改変ｐＱＥ‐１１のＢａｍＨＩ部位およびブラントエン
ドとしたＮｏｔＩ部位中に各々ライゲーションした。Ｍ
２‐９（９０６‐１００４）ｃＤＮＡをＮｏ．７プライ
マーペア（表１）を用いてＰＣＲにより増幅させた。

【０１２６】

【表１】

【０１２７】ＰＣＲは９５℃で３分間、その後（９５℃
で１分間、５９℃で１分間、７２℃で２分間）の１５サ
イクル、その後７２℃で２分間行った。生成物をＢａｍ
ＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、改変ｐＱＥ‐１１のＢａ
ｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位中にライゲーションした。大
腸菌での各Ｈｉｓに融合させたＭ２フラグメントの発現
と精製、リガンドオーバーレイアッセイは、実施例６に
記載の方法に従って実施した。

【０１２８】結果は図３５に示したとおりであった。強
い結合シグナルは初めの３つの変異体、Ｍ２‐１（８４
７‐１０２４）、Ｍ２‐２（９０６‐１０２４）および
Ｍ２‐３（９２０‐１０２４）でみられた。このシグナ
ルはＭ２‐４（９３４‐１０２４）で弱くなり、Ｍ２‐
５（９４６‐１０２４）でほとんどみられず、およびＭ
２‐６（９７４‐１０２４）で消失した。次いでＭ２‐
２およびＭ２‐３のＣ末端を欠失（ delete ）させた
後、上記の方法に準じてＭ２‐７（９０６‐１０１
５）、Ｍ２‐８（９２０‐１０１５）およびＭ２‐９
（９０６‐１００４）のＨｉｓ融合タンパク質を作製
し、リガンドオーバーレイアッセイにかけた。

【０１２９】結果は図３５のレーン８〜１０に示した通
りであった。Ｍ２‐７（９０６‐１０１５）（レーン
８）およびＭ２‐８（９２０‐１０１５）（レーン９）
では、９アミノ酸の欠失は〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ‐Ｒｈｏ
Ａとの結合にほとんど影響を与えなかったが、Ｍ２‐９
（９０６‐１００４）ではシグナルが全くみられなかっ
た（レーン１０）。

【０１３０】実施例８ 酵母ツー・ハイブリッド・シス
テムによるＲｈｏタンパク質結合部位の同定 リガンドオーバーレイアッセイでの結果を確認するため
に、酵母ツー・ハイブリッド・アッセイをＭ２部分変異
体（実施例７）を用いて行った（図３６）。ＶＰ１６活
性化領域に融合された各変異体は酵母株ＡＭＲ７０で発
現させ、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域に融合されたＲｈｏ
ＡまたはＲｈｏＡ^Ｖａｌ14を発現する酵母株Ｌ４０と交
配させた。結合はβ‐ガラクトシダーゼ活性により測定
した。具体的には下記に記載の方法に従って実施した。

【０１３１】酵母ツー・ハイブリッド・システムを実施
するため、Ｍ２‐２〜Ｍ２‐９を含む各ｐＱＥプラスミ
ドＤＮＡのＢａｍＨＩ‐ＮｏｔＩフラグメントをｐＶＰ
‐１６（Vojtek, A. et al., Cell 74,205-214 (1993)
）中に挿入した。ｐＢＴＭ１１６（Vojtek, A. et a
l.,Cell 74,205-214 (1993)）をMadaule, P. et al., F
EBS Le tt. 377, 243-248(1995)^＊に記載された方法に
従って改変した。前掲Madaule,P.et al.(1995)^＊に記載
の方法に従って、ｐＧＥＸ‐ｒｈｏＡおよびｒｈｏＡ
^Ｖａｌ14のＢａｍＨＩ‐ＥｃｏＲＩフラグメントを上記
のように改変されたｐＢＴＭ１１６のＢａｍＨＩおよび
ＥｃｏＲＩ部位中に挿入した。前掲Madaule, P. et al.
(1995) ^＊に記載の方法に従って、ｐＧＥＸ‐ｒｈｏＢ
および‐ｒｈｏＣのＢａｍＨＩ‐ＢａｍＨＩフラグメン
トを改変ｐＢＴＭ１１６のＢａｍＨＩ部位中に挿入し
た。ｐ１６０の様々な部分断片のＲｈｏタンパク質結合
領域を発現するＡＭＲ７０株を、各ＢＴＭコンストラク
トで形質転換したＬ４０株と交配させて得られた二倍体
について、β‐ガラクトシダーゼ活性を調べた。

【０１３２】結果は図３６で示した通りであった。強い
染色がＭ２‐２、Ｍ２‐３、Ｍ２‐４、Ｍ２‐７および
Ｍ２‐８で認められた。結合は野生型ＲｈｏＡよりもＲ
ｈｏＡ^Ｖａｌ14で強かった。Ｍ２‐５では非常にかすか
なシグナルが認められたがＭ２‐６およびＭ２‐９では
シグナルが認められなかった。このように、ツー・ハイ
ブリッド・システムで得られた結果はリガンドオーバー
レイアッセイの結果（実施例７）と一致した。

【０１３３】実施例９ Ｍ２の部位特異的変異体を用い
たＲｈｏタンパク質結合部位の解析 実施例７および８に記載したオーバーレイ・アッセイお
よびツー・ハイブリット・システムを用いた解析によ
り、ＧＴＰ‐Ｒｈｏの結合におけるＭ２内のいくつかの
領域の重要性が示唆された。第一に、Ｍ２‐９での結合
の消失およびＭ２‐５で結合の有意な減少は、２つの領
域すなわち配列番号１の９３４〜９４５および１００５
〜１０１５のアミノ酸配列がＲｈｏタンパク質認識で必
須の役割を果たしていることを示す。第二に、Ｍ２‐４
での結合の減少は、９２０〜９３３番の領域が支持的役
割を有する可能性を示している。しかしながら、介在領
域９４６‐１００４）の役割は不明のままである。

【０１３４】これらを確認あるいはさらに検討するため
に、下記の実験を実施した。ＲｈｏＡとの結合に必要な
アミノ酸を同定するために、我々はいくつかの点変異を
Ｍ２‐８中に導入して（図３７参照）、ＧＴＰ‐Ｒｈｏ
結合に対するそれらの効果を分析した。変異体は、ｐ１
６０およびそのホモローグ、ＲＯＫα（ＲＯＣＫ‐II）
で保存されているアミノ酸残基（ほとんど親水性アミノ
酸残基）を選択して作製した（Leung, T. et al., J. B
iol. Chem. 270, 29051-29054 (1995)^＊）。これらの変
異体を、実施例６に記載した方法に準じてＨｉｓ融合タ
ンパク質として発現させ、精製した。ほぼ同量の精製タ
ンパク質をＳＤＳ‐ＰＡＧＥにかけ、リガンドオーバー
レイアッセイに用いた（図３８）。具体的には下記に記
載の方法に従って実施した。

【０１３５】全部で１５種の異なる点変異は、野生型配
列を各変異を有する配列と置換することにより、アミノ
酸配列９０６‐１０９４に相当するｃＤＮＡ中に導入し
た（図３１）。まず野生型フラグメント（９０６‐１０
９４）をプライマーペア（Ｎｏ．８、表２）を用いてＰ
ＣＲにより作製した。

【０１３６】

【表２】

【０１３７】この段落に記載されたＰＣＲは９５℃で２
分間、その後（９５℃で１分間、４５℃で１分間、７２
℃で１分間）の１５サイクル、その後７２℃で２分間行
った。生成物をブラント・エンドとし、ＢａｍＨＩで消
化し、ｐＳＫ⁻（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩお
よびＥｃｏＲＶ部位中に挿入した（ｐＳＫ⁻‐Ｍ２‐１
０）。ｐＳＫ⁻‐Ｍ２‐１０（９０６‐１０９４）のＡ
ｓｐ７１８フラグメントを改変ｐＱＥ‐１１中にライゲ
ーションした。

【０１３８】初めの３つの変異体を作製するために、Ｋ
９２１Ｍ（９０６‐９２６）、Ｍ２‐１１（９２４‐１
０２４）、Ｍ２‐１２（９０６‐９２６）、Ｒ９２６Ａ
（９２４‐１０２４）およびＥ９３０Ａ（９２４‐１０
２４）のｃＤＮＡを表２で示されたプライマーを用いて
ＰＣＲにより作製した。次いで生成物をブラント・エン
ドとし、ＢａｍＨＩで消化し、ｐＳＫ^＋（ストラタジー
ン社製）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃII部位中に挿入し
た（各々ｐＳＫ^＋‐Ｋ９２１Ｍ（９０６‐９２６）、‐
Ｍ２‐１１（９２４‐１０２４）、‐Ｍ２‐１２（９０
６‐９２６）、‐Ｒ９２６Ａ（９２４‐１０２４）、‐
Ｅ９３０Ａ（９２４‐１０２４））。Ｋ９２１Ｍ（９０
６‐９２６）および‐Ｍ２‐１１（９２４‐１０２４）
を連結させるために、ｐＳＫ^＋‐Ｍ２‐１１（９２４‐
１０２４）のＮｈｅＩ‐ＸｈｏＩフラグメントをｐＳＫ
^＋‐Ｋ９２１Ｍ（９０６‐９２６）のＮｈｅＩおよびＸ
ｈｏＩ部位中にライゲーションした。同様に、ｐＳＫ^＋
‐Ｒ９２６Ａ（９２４‐１０２４）およびｐＳＫ^＋‐Ｅ
９３０Ａ（９２４‐１０２４）のＮｈｅＩ‐ＸｈｏＩフ
ラグメントをｐＳＫ^＋‐Ｍ２‐１２（９０６‐９２６）
のＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ部位中にライゲーションし
た。これらｐＳＫ^＋（ストラタジーン社製）ＤＮＡのＢ
ａｍＨＩ‐ＨｉｎｃIIフラグメントをｐＱＥ‐Ｍ２‐１
０（９０６‐１０９４）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃII
部位中にライゲーションした。

【０１３９】Ｋ９３４Ｍ、Ｌ９４１ＡおよびＥ９４３Ａ
変異体は、各々プライマーペアＮｏ．１４、Ｎｏ．１５
およびＮｏ．１６を用いたＰＣＲで、配列番号１の９０
６〜９４８番のアミノ酸配列に相当するｃＤＮＡ中に導
入した。次いでＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩ‐ＳｐｈＩフ
ラグメントをｐＱＥ‐Ｍ２‐１０のＢａｍＨＩおよびＳ
ｐｈＩ部位中にライゲーションした。Ｄ９５１Ａ、Ｅ９
６０ＡおよびＥ９８９Ａ変異体も同様に、各々プライマ
ーペアＮｏ．１７、Ｎｏ．１８およびＮｏ．１９を用い
て、図３１で示されたようにＰＣＲにより作製した。次
いでこれら生成物のＳｐｈＩ‐ＨｉｎｃIIフラグメント
をｐＱＥ‐Ｍ２‐１０のＳｐｈＩおよびＨｉｎｃII部位
中にライゲーションした。２つの他の変異体Ｅ９９５Ｑ
およびＫ９９９Ｍも同様に、各々プライマーペアＮｏ．
２０およびＮｏ．２１を用いて、図３１で示されたよう
にＰＣＲにより作製した。ＰＣＲ生成物のＢａｍＨＩ‐
ＨｉｎｃIIフラグメントをｐＱＥ‐Ｍ２‐１０のＢａｍ
ＨＩおよびＨｉｎｃII部位中にライゲーションした。

【０１４０】他の変異を有する４種類の配列、Ｅ１００
８Ａ（１００３‐１０９４）、Ｉ１００９Ａ（１００３
‐１０９４）、Ｒ１０１２Ｌ（１００３‐１０９４）お
よびＫ１０１３Ｍ（１００３‐１０９４）は、各々プラ
イマーペアＮｏ．２２、Ｎｏ．２３、Ｎｏ．２４および
Ｎｏ．２５を用いたＰＣＲにより増幅させた。生成物を
ブラント・エンドとし、ＨｉｎｃI I で消化し、ｐＳＫ
^＋（ストラタジーン社製）のＨｉｎｃII部位中に挿入し
た（各々ｐＳＫ^＋‐Ｅ１００８Ａ（１００３‐１０９
４）、‐Ｉ１００９Ａ（１００３‐１０９４）、‐Ｒ１
０１２Ｌ（１００３‐１０９４）および‐Ｋ１０１３Ｍ
（１００３‐１０９４））。次いでこれらｐＳＫ^＋（ス
トラタジーン社製）のＨｉｎｃII‐ＮｏｔＩフラグメン
トをｐＱＥ‐Ｍ２‐１０のＨｉｎｃIIおよびＮｏｔＩ部
位中にライゲーションした。

【０１４１】その結果は図３９に示したとおりであっ
た。野生型ペプチド（Ｍ２−１０（９０６〜１０９４）
で観察された強いシグナルは配列番号１の９３４〜９４
５番のアミノ酸配列に位置するＫ９３４ＭおよびＬ９４
１Ａ変異とＥ１００８Ａ変異で有意に減少し、Ｉ１００
９Ａ変異で消失した。余分なバンドは分解産物であると
思われる。この結果は、配列番号１の９３４〜９４５番
および１００４〜１０１５番のアミノ酸配列領域がＲｈ
ｏＡ結合に重要であるという上記仮定と一致した。

【０１４２】実施例１０ ｐ１６０の部位特異的変異体
のＲｈｏタンパク質結合活性についての細胞生物学的な
解析 本発明者らは組換えタンパク質としてＫＤフラグメント
を発現させることができなかったため、Ｍ２領域だけで
なくＫＤ領域にもＲｈｏタンパク質結合活性が存在する
という可能性が否定されずに残っている。そこでＭ２領
域がｐ１６０で唯一のＲｈｏタンパク質結合領域である
かどうかについて検討した。まず、ＣＯＳ細胞でｍｙｃ
標識タンパク質としてＥ１００８Ａ、Ｉ１００９Ａまた
はＲ１０１２Ｌ変異のある変異体ｐ１６０（即ちＫＤ領
域と変異Ｍ２領域を含むｐ１６０）あるいはこれの野生
型を発現させた。これらのタンパク質を９Ｅ１０抗ｍｙ
ｃ抗体と免疫沈降させ、リガンドオーバーレイアッセイ
にかけた。より具体的には下記に記載の方法に従って実
施した。

【０１４３】培養細胞へのトランスフェクションのた
め、各変異（Ｅ１００８Ａ、Ｉ１００９ＡおよびＲ１０
１２Ｌ）を有する全長ｐ１６０ｃＤＮＡを作製した。Ｍ
２‐１０（Ｅ１００８Ａ）、Ｍ２‐１０（Ｉ１００９
Ａ）およびＭ２‐１０（Ｒ１０１２Ｌ）をコードするｐ
ＱＥプラスミド（Ｑｕｉａｇｅｎ社）ＤＮＡの各Ｓｐｈ
Ｉ‐ＢａｌＩフラグメントを全長ｐ１６０ｃＤＮＡを含
むｐＳＫプラスミドのＳｐｈＩおよびＢａｌＩ部位中に
挿入した（実施例４）。得られたプラスミドからＸｈｏ
Ｉ‐ＳｍａＩフラグメントを切り出し、その後ｐＣＭＸ
‐ｍｙｃ‐ｐ１６０（実施例４）のＸｈｏＩおよびＳｍ
ａＩ部位中に挿入した。ＣＯＳ‐７細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ １６５１）を６ｃｍシャーレ当たり１．２×１０
^５細胞の密度でプレーティングした。１日間の培養後、
培地を除去し、細胞を実施例４に記載された方法に従っ
てリポフェクタミンを用いて３μｇのｐＣＭＸ‐ｍｙ
ｃ、ｐＣＭＸ‐ｍｙｃ‐ｐ１６０野生型または変異体プ
ラスミドＤＮＡでトランスフェクトさせた。細胞を溶解
させ、抗ｍｙｃ抗体との免疫沈降物を記載された方法に
従ってイムノブロットおよびリガンドオーバーレイアッ
セイにかけた（実施例１および４）。

【０１４４】結果は図４０および４１に示したとおりで
あった。この操作から沈降物中に定量的に各ｐ１６０が
回収された。Ｒｈｏタンパク質結合の強いシグナルは野
生型およびＲ１０１２Ｌ変異体で観察された。シグナル
はＥ１００８Ａ変異で有意に減少し、Ｉ１００９Ａ変異
で消失した。これらの結果より、配列番号１の９３４〜
１０１５番のアミノ酸配列領域がｐ１６０で唯一のＲｈ
ｏタンパク質結合領域であることが明らかとなった。

【０１４５】以上のように、最小のＲｈｏタンパク質結
合領域をｐ１６０のα‐ヘリックスのＣ末端のアミノ酸
配列（配列番号１の９３４〜１０１５番のアミノ酸配
列）に位置づけた（実施例６〜８）が、ここにはロイシ
ンジッパー様モチーフが含まれている（実施例３）。ま
た、この領域でＲｈｏタンパク質結合にとって重要な残
基も同定した（実施例９および１０）。この領域のアミ
ノ酸配列は図４２に示されている。

【０１４６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１３５４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源： 生物名：ヒト 配列 Met Ser Thr Gly Asp Ser Phe Glu Thr Arg Phe Glu Lys Met Asp Asn 1 5 10 15 Leu Leu Arg Asp Pro Lys Ser Glu Val Asn Ser Asp Cys Leu Leu Asp 20 25 30 Gly Leu Asp Ala Leu Val Tyr Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 35 40 45 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Ser Arg Tyr Lys Asp Thr Ile Asn 50 55 60 Lys Ile Arg Asp Leu Arg Met Lys Ala Glu Asp Tyr Glu Val Val Lys 65 70 75 80 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 85 90 95 Ser Thr Arg Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 100 105 110 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 115 120 125 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Tyr Ala Phe Gln 130 135 140 Asp Asp Arg Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 145 150 155 160 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Arg 165 170 175 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 180 185 190 Gly Phe Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 195 200 205 Ser Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asn 210 215 220 Lys Glu Gly Met Val Arg Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 225 230 235 240 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly 245 250 255 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Tyr Glu Met Leu 260 265 270 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 275 280 285 Lys Ile Met Asn His Lys Asn Ser Leu Thr Phe Pro Asp Asp Asn Asp 290 295 300 Ile Ser Lys Glu Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 305 310 315 320 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Lys Arg His Leu 325 330 335 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp Ala Trp Glu Thr Leu Arg Asp Thr Val 340 345 350 Ala Pro Val Val Pro Asp Leu Ser Ser Asp Ile Asp Thr Ser Asn Phe 355 360 365 Asp Asp Leu Glu Glu Asp Lys Gly Glu Glu Glu Thr Phe Pro Ile Pro 370 375 380 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Val Gly Phe Thr Tyr Tyr 385 390 395 400 Ser Asn Arg Arg Tyr Leu Ser Ser Ala Asn Pro Asn Asp Asn Arg Thr 405 410 415 Ser Ser Asn Ala Asp Lys Ser Leu Gln Glu Ser Leu Gln Lys Thr Ile 420 425 430 Tyr Lys Leu Glu Glu Gln Leu His Asn Glu Met Gln Leu Lys Asp Glu 435 440 445 Met Glu Gln Lys Cys Arg Thr Ser Asn Ile Lys Leu Asp Lys Ile Met 450 455 460 Lys Glu Leu Asp Glu Glu Gly Asn Gln Arg Arg Asn Leu Glu Ser Thr 465 470 475 480 Val Ser Gln Ile Glu Lys Glu Lys Met Leu Leu Gln His Arg Ile Asn 485 490 495 Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Glu Gln Glu Asn Glu Lys Arg Arg Asn Val 500 505 510 Glu Asn Glu Val Ser Thr Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys Lys 515 520 525 Val Ser Gln Asn Ser Gln Leu Ala Asn Glu Lys Leu Ser Gln Leu Gln 530 535 540 Lys Gln Leu Glu Glu Ala Asn Asp Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp Thr 545 550 555 560 Ala Val Arg Leu Arg Lys Ser His Thr Glu Met Ser Lys Ser Ile Ser 565 570 575 Gln Leu Glu Ser Leu Asn Arg Glu Leu Gln Glu Arg Asn Arg Ile Leu 580 585 590 Glu Asn Ser Lys Ser Gln Thr Asp Lys Asp Tyr Tyr Gln Leu Gln Ala 595 600 605 Ile Leu Glu Ala Glu Arg Arg Asp Arg Gly His Asp Ser Glu Met Ile 610 615 620 Gly Asp Leu Gln Ala Arg Ile Thr Ser Leu Gln Glu Glu Val Lys His 625 630 635 640 Leu Lys His Asn Leu Glu Lys Val Glu Gly Glu Arg Lys Glu Ala Gln 645 650 655 Asp Met Leu Asn His Ser Glu Lys Glu Lys Asn Asn Leu Glu Ile Asp 660 665 670 Leu Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gln Glu Val 675 680 685 Asn Glu His Lys Val Thr Lys Ala Arg Leu Thr Asp Lys His Gln Ser 690 695 700 Ile Glu Glu Ala Lys Ser Val Ala Met Cys Glu Met Glu Lys Lys Leu 705 710 715 720 Lys Glu Glu Arg Glu Ala Arg Glu Lys Ala Glu Asn Arg Val Val Gln 725 730 735 Ile Glu Lys Gln Cys Ser Met Leu Asp Val Asp Leu Lys Gln Ser Gln 740 745 750 Gln Lys Leu Glu His Leu Thr Gly Asn Lys Glu Arg Met Glu Asp Glu 755 760 765 Val Lys Asn Leu Thr Leu Gln Leu Glu Gln Glu Ser Asn Lys Arg Leu 770 775 780 Leu Leu Gln Asn Glu Leu Lys Thr Gln Ala Phe Glu Ala Asp Asn Leu 785 790 795 800 Lys Gly Leu Glu Lys Gln Met Lys Gln Glu Ile Asn Thr Leu Leu Glu 805 810 815 Ala Lys Arg Leu Leu Glu Phe Glu Leu Ala Gln Leu Thr Lys Gln Tyr 820 825 830 Arg Gly Asn Glu Gly Gln Met Arg Glu Leu Gln Asp Gln Leu Glu Ala 835 840 845 Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val Lys Glu Leu Lys 850 855 860 Glu Glu Ile Glu Glu Lys Asn Arg Glu Asn Leu Lys Lys Ile Gln Glu 865 870 875 880 Leu Gln Asn Glu Lys Glu Thr Leu Ala Thr Gln Leu Asp Leu Ala Glu 885 890 895 Thr Lys Ala Glu Ser Glu Gln Leu Ala Arg Gly Leu Leu Glu Glu Gln 900 905 910 Tyr Phe Glu Leu Thr Gln Glu Ser Lys Lys Ala Ala Ser Arg Asn Arg 915 920 925 Gln Glu Ile Thr Asp Lys Asp His Thr Val Ser Arg Leu Glu Glu Ala 930 935 940 Asn Ser Met Leu Thr Lys Asp Ile Glu Ile Leu Arg Arg Glu Asn Glu 945 950 955 960 Glu Leu Thr Glu Lys Met Lys Lys Ala Glu Glu Glu Tyr Lys Leu Glu 965 970 975 Lys Glu Glu Glu Ile Ser Asn Leu Lys Ala Ala Phe Glu Lys Asn Ile 980 985 990 Asn Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 995 1000 1005 Ile Met Asn Arg Lys Asp Phe Lys Ile Asp Arg Lys Lys Ala Asn Thr 1010 1015 1020 Gln Asp Leu Arg Lys Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu Gln Leu Glu 1025 1030 1035 1040 Leu Asn Gln Glu Arg Glu Lys Phe Asn Gln Met Val Val Lys His Gln 1045 1050 1055 Lys Glu Leu Asn Asp Met Gln Ala Gln Leu Val Glu Glu Cys Ala His 1060 1065 1070 Arg Asn Glu Leu Gln Met Gln Leu Ala Ser Lys Glu Ser Asp Ile Glu 1075 1080 1085 Gln Leu Arg Ala Lys Leu Leu Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser Val Ala 1090 1095 1100 Ser Phe Pro Ser Ala Asp Glu Thr Asp Gly Asn Leu Pro Glu Ser Arg 1105 1110 1115 1120 Ile Glu Gly Trp Leu Ser Val Pro Asn Arg Gly Asn Ile Lys Arg Tyr 1125 1130 1135 Gly Trp Lys Lys Gln Tyr Val Val Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1140 1145 1150 Tyr Asn Asp Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Ser Met Val Leu 1155 1160 1165 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Gly Asp Val 1170 1175 1180 Tyr Arg Ala Glu Thr Glu Glu Ile Pro Lys Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1185 1190 1195 1200 Ala Asn Glu Gly Glu Cys Arg Lys Asp Val Glu Met Glu Pro Val Gln 1205 1210 1215 Gln Ala Glu Lys Thr Asn Phe Gln Asn His Lys Gly His Glu Phe Ile 1220 1225 1230 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Ala Asn Cys Asp Ala Cys Ala Lys Pro 1235 1240 1245 Leu Trp His Val Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1250 1255 1260 His Val Lys Cys His Arg Asp His Leu Asp Lys Lys Glu Asp Leu Ile 1265 1270 1275 1280 Cys Pro Cys Lys Val Ser Tyr Asp Val Thr Ser Ala Arg Asp Met Leu 1285 1290 1295 Leu Leu Ala Cys Ser Gln Asp Glu Gln Lys Lys Trp Val Thr His Leu 1300 1305 1310 Val Lys Lys Ile Pro Lys Asn Pro Pro Ser Gly Phe Val Arg Ala Ser 1315 1320 1325 Pro Arg Thr Leu Ser Thr Arg Ser Thr Ala Asn Gln Ser Phe Arg Lys 1330 1335 1340 Val Val Lys Asn Thr Ser Gly Lys Thr Ser1345 1350

【０１４７】 配列番号：２ 配列の長さ：４０６５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源： 生物名：ヒト 配列 ATG TCG ACT GGG GAC AGT TTT GAG ACT CGA TTT GAA AAA ATG GAC AAC 48 Met Ser Thr Gly Asp Ser Phe Glu Thr Arg Phe Glu Lys Met Asp Asn 1 5 10 15 CTG CTG CGG GAT CCC AAA TCG GAA GTG AAT TCG GAT TGT TTG CTG GAT 96 Leu Leu Arg Asp Pro Lys Ser Glu Val Asn Ser Asp Cys Leu Leu Asp 20 25 30 GGA TTG GAT GCT TTG GTA TAT GAT TTG GAT TTT CCT GCC TTA AGA AAA 144 Gly Leu Asp Ala Leu Val Tyr Asp Leu Asp Phe Pro Ala Leu Arg Lys 35 40 45 AAC AAA AAT ATT GAC AAC TTT TTA AGC AGA TAT AAA GAC ACA ATA AAT 192 Asn Lys Asn Ile Asp Asn Phe Leu Ser Arg Tyr Lys Asp Thr Ile Asn 50 55 60 AAA ATC AGA GAT TTA CGA ATG AAA GCT GAA GAT TAT GAA GTA GTG AAG 240 Lys Ile Arg Asp Leu Arg Met Lys Ala Glu Asp Tyr Glu Val Val Lys 65 70 75 80 GTG ATT GGT AGA GGT GCA TTT GGA GAA GTT CAA TTG GTA AGG CAT AAA 288 Val Ile Gly Arg Gly Ala Phe Gly Glu Val Gln Leu Val Arg His Lys 85 90 95 TCC ACC AGG AAG GTA TAT GCT ATG AAG CTT CTC AGC AAA TTT GAA ATG 336 Ser Thr Arg Lys Val Tyr Ala Met Lys Leu Leu Ser Lys Phe Glu Met 100 105 110 ATA AAG AGA TCT GAT TCT GCT TTT TTC TGG GAA GAA AGG GAC ATC ATG 384 Ile Lys Arg Ser Asp Ser Ala Phe Phe Trp Glu Glu Arg Asp Ile Met 115 120 125 GCT TTT GCC AAC AGT CCT TGG GTT GTT CAG CTT TTT TAT GCA TTC CAA 432 Ala Phe Ala Asn Ser Pro Trp Val Val Gln Leu Phe Tyr Ala Phe Gln 130 135 140 GAT GAT CGT TAT CTC TAC ATG GTG ATG GAA TAC ATG CCT GGT GGA GAT 480 Asp Asp Arg Tyr Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Met Pro Gly Gly Asp 145 150 155 160 CTT GTA AAC TTA ATG AGC AAC TAT GAT GTG CCT GAA AAA TGG GCA CGA 528 Leu Val Asn Leu Met Ser Asn Tyr Asp Val Pro Glu Lys Trp Ala Arg 165 170 175 TTC TAT ACT GCA GAA GTA GTT CTT GCA TTG GAT GCA ATC CAT TCC ATG 576 Phe Tyr Thr Ala Glu Val Val Leu Ala Leu Asp Ala Ile His Ser Met 180 185 190 GGT TTT ATT CAC AGA GAT GTG AAG CCT GAT AAC ATG CTG CTG GAT AAA 624 Gly Phe Ile His Arg Asp Val Lys Pro Asp Asn Met Leu Leu Asp Lys 195 200 205 TCT GGA CAT TTG AAG TTA GCA GAT TTT GGT ACT TGT ATG AAG ATG AAT 672 Ser Gly His Leu Lys Leu Ala Asp Phe Gly Thr Cys Met Lys Met Asn 210 215 220 AAG GAA GGC ATG GTA CGA TGT GAT ACA GCG GTT GGA ACA CCT GAT TAT 720 Lys Glu Gly Met Val Arg Cys Asp Thr Ala Val Gly Thr Pro Asp Tyr 225 230 235 240 ATT TCC CCT GAA GTA TTA AAA TCC CAA GGT GGT GAT GGT TAT TAT GGA 768 Ile Ser Pro Glu Val Leu Lys Ser Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Tyr Gly 245 250 255 AGA GAA TGT GAC TGG TGG TCG GTT GGG GTA TTT TTA TAC GAA ATG CTT 816 Arg Glu Cys Asp Trp Trp Ser Val Gly Val Phe Leu Tyr Glu Met Leu 260 265 270 GTA GGT GAT ACA CCT TTT TAT GCA GAT TCT TTG GTT GGA ACT TAC AGT 864 Val Gly Asp Thr Pro Phe Tyr Ala Asp Ser Leu Val Gly Thr Tyr Ser 275 280 285 AAA ATT ATG AAC CAT AAA AAT TCA CTT ACC TTT CCT GAT GAT AAT GAC 912 Lys Ile Met Asn His Lys Asn Ser Leu Thr Phe Pro Asp Asp Asn Asp 290 295 300 ATA TCA AAA GAA GCA AAA AAC CTT ATT TGT GCC TTC CTT ACT GAC AGG 960 Ile Ser Lys Glu Ala Lys Asn Leu Ile Cys Ala Phe Leu Thr Asp Arg 305 310 315 320 GAA GTG AGG TTA GGG CGA AAT GGT GTA GAA GAA ATC AAA CGA CAT CTC 1008 Glu Val Arg Leu Gly Arg Asn Gly Val Glu Glu Ile Lys Arg His Leu 325 330 335 TTC TTC AAA AAT GAC CAG TGG GCT TGG GAA ACG CTC CGA GAC ACT GTA 1056 Phe Phe Lys Asn Asp Gln Trp Ala Trp Glu Thr Leu Arg Asp Thr Val 340 345 350 GCA CCA GTT GTA CCC GAT TTA AGT AGT GAC ATT GAT ACT AGT AAT TTT 1104 Ala Pro Val Val Pro Asp Leu Ser Ser Asp Ile Asp Thr Ser Asn Phe 355 360 365 GAT GAC TTG GAA GAA GAT AAA GGA GAG GAA GAA ACA TTC CCT ATT CCT 1152 Asp Asp Leu Glu Glu Asp Lys Gly Glu Glu Glu Thr Phe Pro Ile Pro 370 375 380 AAA GCT TTC GTT GGC AAT CAA CTA CCT TTT GTA GGA TTT ACA TAT TAT 1200 Lys Ala Phe Val Gly Asn Gln Leu Pro Phe Val Gly Phe Thr Tyr Tyr 385 390 395 400 AGC AAT CGT AGA TAC TTA TCT TCA GCA AAT CCT AAT GAT AAC AGA ACT 1248 Ser Asn Arg Arg Tyr Leu Ser Ser Ala Asn Pro Asn Asp Asn Arg Thr 405 410 415 AGC TCC AAT GCA GAT AAA AGC TTG CAG GAA AGT TTG CAA AAA ACA ATC 1296 Ser Ser Asn Ala Asp Lys Ser Leu Gln Glu Ser Leu Gln Lys Thr Ile 420 425 430 TAT AAG CTG GAA GAA CAG CTG CAT AAT GAA ATG CAG TTA AAA GAT GAA 1344 Tyr Lys Leu Glu Glu Gln Leu His Asn Glu Met Gln Leu Lys Asp Glu 435 440 445 ATG GAG CAG AAG TGC AGA ACC TCA AAC ATA AAA CTA GAC AAG ATA ATG 1392 Met Glu Gln Lys Cys Arg Thr Ser Asn Ile Lys Leu Asp Lys Ile Met 450 455 460 AAA GAA TTG GAT GAA GAG GGA AAT CAA AGA AGA AAT CTA GAA TCT ACA 1440 Lys Glu Leu Asp Glu Glu Gly Asn Gln Arg Arg Asn Leu Glu Ser Thr 465 470 475 480 GTG TCT CAG ATT GAG AAG GAG AAA ATG TTG CTA CAG CAT AGA ATT AAT 1488 Val Ser Gln Ile Glu Lys Glu Lys Met Leu Leu Gln His Arg Ile Asn 485 490 495 GAG TAC CAA AGA AAA GCT GAA CAG GAA AAT GAG AAG AGA AGA AAT GTA 1536 Glu Tyr Gln Arg Lys Ala Glu Gln Glu Asn Glu Lys Arg Arg Asn Val 500 505 510 GAA AAT GAA GTT TCT ACA TTA AAG GAT CAG TTG GAA GAC TTA AAG AAA 1584 Glu Asn Glu Val Ser Thr Leu Lys Asp Gln Leu Glu Asp Leu Lys Lys 515 520 525 GTC AGT CAG AAT TCA CAG CTT GCT AAT GAG AAG CTG TCC CAG TTA CAA 1632 Val Ser Gln Asn Ser Gln Leu Ala Asn Glu Lys Leu Ser Gln Leu Gln 530 535 540 AAG CAG CTA GAA GAA GCC AAT GAC TTA CTT AGG ACA GAA TCG GAC ACA 1680 Lys Gln Leu Glu Glu Ala Asn Asp Leu Leu Arg Thr Glu Ser Asp Thr 545 550 555 560 GCT GTA AGA TTG AGG AAG AGT CAC ACA GAG ATG AGC AAG TCA ATT AGT 1728 Ala Val Arg Leu Arg Lys Ser His Thr Glu Met Ser Lys Ser Ile Ser 565 570 575 CAG TTA GAG TCC CTG AAC AGA GAG TTG CAA GAG AGA AAT CGA ATT TTA 1776 Gln Leu Glu Ser Leu Asn Arg Glu Leu Gln Glu Arg Asn Arg Ile Leu 580 585 590 GAG AAT TCT AAG TCA CAA ACA GAC AAA GAT TAT TAC CAG CTG CAA GCT 1824 Glu Asn Ser Lys Ser Gln Thr Asp Lys Asp Tyr Tyr Gln Leu Gln Ala 595 600 605 ATA TTA GAA GCT GAA CGA AGA GAC AGA GGT CAT GAT TCT GAG ATG ATT 1872 Ile Leu Glu Ala Glu Arg Arg Asp Arg Gly His Asp Ser Glu Met Ile 610 615 620 GGA GAC CTT CAA GCT CGA ATT ACA TCT TTA CAA GAG GAG GTG AAG CAT 1920 Gly Asp Leu Gln Ala Arg Ile Thr Ser Leu Gln Glu Glu Val Lys His 625 630 635 640 CTC AAA CAT AAT CTC GAA AAA GTG GAA GGA GAA AGA AAA GAG GCT CAA 1968 Leu Lys His Asn Leu Glu Lys Val Glu Gly Glu Arg Lys Glu Ala Gln 645 650 655 GAC ATG CTT AAT CAC TCA GAA AAG GAA AAG AAT AAT TTA GAG ATA GAT 2016 Asp Met Leu Asn His Ser Glu Lys Glu Lys Asn Asn Leu Glu Ile Asp 660 665 670 TTA AAC TAC AAA CTT AAA TCA TTA CAA CAA CGG TTA GAA CAA GAG GTA 2064 Leu Asn Tyr Lys Leu Lys Ser Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gln Glu Val 675 680 685 AAT GAA CAC AAA GTA ACC AAA GCT CGT TTA ACT GAC AAA CAT CAA TCT 2112 Asn Glu His Lys Val Thr Lys Ala Arg Leu Thr Asp Lys His Gln Ser 690 695 700 ATT GAA GAG GCA AAG TCT GTG GCA ATG TGT GAG ATG GAA AAA AAG CTG 2160 Ile Glu Glu Ala Lys Ser Val Ala Met Cys Glu Met Glu Lys Lys Leu 705 710 715 720 AAA GAA GAA AGA GAA GCT CGA GAG AAG GCT GAA AAT CGG GTT GTT CAG 2208 Lys Glu Glu Arg Glu Ala Arg Glu Lys Ala Glu Asn Arg Val Val Gln 725 730 735 ATT GAG AAA CAG TGT TCC ATG CTA GAC GTT GAT CTG AAG CAA TCT CAG 2256 Ile Glu Lys Gln Cys Ser Met Leu Asp Val Asp Leu Lys Gln Ser Gln 740 745 750 CAG AAA CTA GAA CAT TTG ACT GGA AAT AAA GAA AGG ATG GAG GAT GAA 2304 Gln Lys Leu Glu His Leu Thr Gly Asn Lys Glu Arg Met Glu Asp Glu 755 760 765 GTT AAG AAT CTA ACC CTG CAA CTG GAG CAG GAA TCA AAT AAG CGG CTG 2352 Val Lys Asn Leu Thr Leu Gln Leu Glu Gln Glu Ser Asn Lys Arg Leu 770 775 780 TTG TTA CAA AAT GAA TTG AAG ACT CAA GCA TTT GAG GCA GAC AAT TTA 2400 Leu Leu Gln Asn Glu Leu Lys Thr Gln Ala Phe Glu Ala Asp Asn Leu 785 790 795 800 AAA GGT TTA GAA AAG CAG ATG AAA CAG GAA ATA AAT ACT TTA TTG GAA 2448 Lys Gly Leu Glu Lys Gln Met Lys Gln Glu Ile Asn Thr Leu Leu Glu 805 810 815 GCA AAG AGA TTA TTA GAA TTT GAG TTA GCT CAG CTT ACG AAA CAG TAT 2496 Ala Lys Arg Leu Leu Glu Phe Glu Leu Ala Gln Leu Thr Lys Gln Tyr 820 825 830 AGA GGA AAT GAA GGA CAG ATG CGG GAG CTA CAA GAT CAG CTT GAA GCT 2544 Arg Gly Asn Glu Gly Gln Met Arg Glu Leu Gln Asp Gln Leu Glu Ala 835 840 845 GAG CAA TAT TTC TCG ACA CTT TAT AAA ACC CAG GTA AAG GAA CTT AAA 2592 Glu Gln Tyr Phe Ser Thr Leu Tyr Lys Thr Gln Val Lys Glu Leu Lys 850 855 860 GAA GAA ATT GAA GAA AAA AAC AGA GAA AAT TTA AAG AAA ATA CAG GAA 2640 Glu Glu Ile Glu Glu Lys Asn Arg Glu Asn Leu Lys Lys Ile Gln Glu 865 870 875 880 CTA CAA AAT GAA AAA GAA ACT CTT GCT ACT CAG TTG GAT CTA GCA GAA 2688 Leu Gln Asn Glu Lys Glu Thr Leu Ala Thr Gln Leu Asp Leu Ala Glu 885 890 895 ACA AAA GCT GAG TCT GAG CAG TTG GCG CGA GGC CTT CTG GAA GAA CAG 2736 Thr Lys Ala Glu Ser Glu Gln Leu Ala Arg Gly Leu Leu Glu Glu Gln 900 905 910 TAT TTT GAA TTG ACG CAA GAA AGC AAG AAA GCT GCT TCA AGA AAT AGA 2784 Tyr Phe Glu Leu Thr Gln Glu Ser Lys Lys Ala Ala Ser Arg Asn Arg 915 920 925 CAA GAG ATT ACA GAT AAA GAT CAC ACT GTT AGT CGG CTT GAA GAA GCA 2832 Gln Glu Ile Thr Asp Lys Asp His Thr Val Ser Arg Leu Glu Glu Ala 930 935 940 AAC AGC ATG CTA ACC AAA GAT ATT GAA ATA TTA AGA AGA GAG AAT GAA 2880 Asn Ser Met Leu Thr Lys Asp Ile Glu Ile Leu Arg Arg Glu Asn Glu 945 950 955 960 GAG CTA ACA GAG AAA ATG AAG AAG GCA GAG GAA GAA TAT AAA CTG GAG 2928 Glu Leu Thr Glu Lys Met Lys Lys Ala Glu Glu Glu Tyr Lys Leu Glu 965 970 975 AAG GAG GAG GAG ATC AGT AAT CTT AAG GCT GCC TTT GAA AAG AAT ATC 2976 Lys Glu Glu Glu Ile Ser Asn Leu Lys Ala Ala Phe Glu Lys Asn Ile 980 985 990 AAC ACT GAA CGA ACC CTT AAA ACA CAG GCT GTT AAC AAA TTG GCA GAA 3024 Asn Thr Glu Arg Thr Leu Lys Thr Gln Ala Val Asn Lys Leu Ala Glu 995 1000 1005 ATA ATG AAT CGA AAA GAT TTT AAA ATT GAT AGA AAG AAA GCT AAT ACA 3072 Ile Met Asn Arg Lys Asp Phe Lys Ile Asp Arg Lys Lys Ala Asn Thr 1010 1015 1020 CAA GAT TTG AGA AAG AAA GAA AAG GAA AAT CGA AAG CTG CAA CTG GAA 3120 Gln Asp Leu Arg Lys Lys Glu Lys Glu Asn Arg Lys Leu Gln Leu Glu 1025 1030 1035 1040 CTC AAC CAA GAA AGA GAG AAA TTC AAC CAG ATG GTA GTG AAA CAT CAG 3168 Leu Asn Gln Glu Arg Glu Lys Phe Asn Gln Met Val Val Lys His Gln 1045 1050 1055 AAG GAA CTG AAT GAC ATG CAA GCG CAA TTG GTA GAA GAA TGT GCA CAT 3216 Lys Glu Leu Asn Asp Met Gln Ala Gln Leu Val Glu Glu Cys Ala His 1060 1065 1070 AGG AAT GAG CTT CAG ATG CAG TTG GCC AGC AAA GAG AGT GAT ATT GAG 3264 Arg Asn Glu Leu Gln Met Gln Leu Ala Ser Lys Glu Ser Asp Ile Glu 1075 1080 1085 CAA TTG CGT GCT AAA CTT TTG GAC CTC TCG GAT TCT ACA AGT GTT GCT 3312 Gln Leu Arg Ala Lys Leu Leu Asp Leu Ser Asp Ser Thr Ser Val Ala 1090 1095 1100 AGT TTT CCT AGT GCT GAT GAA ACT GAT GGT AAC CTC CCA GAG TCA AGA 3360 Ser Phe Pro Ser Ala Asp Glu Thr Asp Gly Asn Leu Pro Glu Ser Arg 1105 1110 1115 1120 ATT GAA GGT TGG CTT TCA GTA CCA AAT AGA GGA AAT ATC AAA CGA TAT 3408 Ile Glu Gly Trp Leu Ser Val Pro Asn Arg Gly Asn Ile Lys Arg Tyr 1125 1130 1135 GGC TGG AAG AAA CAG TAT GTT GTG GTA AGC AGC AAA AAA ATT TTG TTC 3456 Gly Trp Lys Lys Gln Tyr Val Val Val Ser Ser Lys Lys Ile Leu Phe 1140 1145 1150 TAT AAT GAC GAA CAA GAT AAG GAG CAA TCC AAT CCA TCT ATG GTA TTG 3504 Tyr Asn Asp Glu Gln Asp Lys Glu Gln Ser Asn Pro Ser Met Val Leu 1155 1160 1165 GAC ATA GAT AAA CTG TTT CAC GTT AGA CCT GTA ACC CAA GGA GAT GTG 3552 Asp Ile Asp Lys Leu Phe His Val Arg Pro Val Thr Gln Gly Asp Val 1170 1175 1180 TAT AGA GCT GAA ACT GAA GAA ATT CCT AAA ATA TTC CAG ATA CTA TAT 3600 Tyr Arg Ala Glu Thr Glu Glu Ile Pro Lys Ile Phe Gln Ile Leu Tyr 1185 1190 1195 1200 GCA AAT GAA GGT GAA TGT AGA AAA GAT GTA GAG ATG GAA CCA GTA CAA 3648 Ala Asn Glu Gly Glu Cys Arg Lys Asp Val Glu Met Glu Pro Val Gln 1205 1210 1215 CAA GCT GAA AAA ACT AAT TTC CAA AAT CAC AAA GGC CAT GAG TTT ATT 3696 Gln Ala Glu Lys Thr Asn Phe Gln Asn His Lys Gly His Glu Phe Ile 1220 1225 1230 CCT ACA CTC TAC CAC TTT CCT GCC AAT TGT GAT GCC TGT GCC AAA CCT 3744 Pro Thr Leu Tyr His Phe Pro Ala Asn Cys Asp Ala Cys Ala Lys Pro 1235 1240 1245 CTC TGG CAT GTT TTT AAG CCA CCC CCT GCC CTA GAG TGT CGA AGA TGC 3792 Leu Trp His Val Phe Lys Pro Pro Pro Ala Leu Glu Cys Arg Arg Cys 1250 1255 1260 CAT GTT AAG TGC CAC AGA GAT CAC TTA GAT AAG AAA GAG GAC TTA ATT 3840 His Val Lys Cys His Arg Asp His Leu Asp Lys Lys Glu Asp Leu Ile 1265 1270 1275 1280 TGT CCA TGT AAA GTA AGT TAT GAT GTA ACA TCA GCA AGA GAT ATG CTG 3888 Cys Pro Cys Lys Val Ser Tyr Asp Val Thr Ser Ala Arg Asp Met Leu 1285 1290 1295 CTG TTA GCA TGT TCT CAG GAT GAA CAA AAA AAA TGG GTA ACT CAT TTA 3936 Leu Leu Ala Cys Ser Gln Asp Glu Gln Lys Lys Trp Val Thr His Leu 1300 1305 1310 GTA AAG AAA ATC CCT AAG AAT CCA CCA TCT GGT TTT GTT CGT GCT TCC 3984 Val Lys Lys Ile Pro Lys Asn Pro Pro Ser Gly Phe Val Arg Ala Ser 1315 1320 1325 CCT CGA ACG CTT TCT ACA AGA TCC ACT GCA AAT CAG TCT TTC CGG AAA 4032 Pro Arg Thr Leu Ser Thr Arg Ser Thr Ala Asn Gln Ser Phe Arg Lys 1330 1335 1340 GTG GTC AAA AAT ACA TCT GGA AAA ACT AGT TAA 4065 Val Val Lys Asn Thr Ser Gly Lys Thr Ser 1345 1350

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐ１６０の推定アミノ酸配列を示した図であ
る。太い下線はペプチドＡＰ−２３を、細い下線は他の
アミノ酸配列を、それぞれ示す。また、星印はロイシン
ジッパー様配列におけるロイシン残基を示す。

【図２】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図２から図１０
までの図は、連続してひと続きの塩基配列およびアミノ
酸配列を示す。

【図３】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図２の続きであ
る。

【図４】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図３の続きであ
る。

【図５】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図４の続きであ
る。

【図６】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図５の続きであ
る。

【図７】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図６の続きであ
る。

【図８】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図７の続きであ
る。

【図９】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに対
応するアミノ酸配列を示した図である。図８の続きであ
る。

【図１０】ｐ１６０をコードする塩基配列およびこれに
対応するアミノ酸配列を示した図である。図９の続きで
ある。

【図１１】リガンドオーバーレ アッセイによるヒト血
小板における活性型Ｒｈｏタンパク質結合タンパク質の
同定を示した電気泳動写真である。レーン１および２：
［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ−Ｒｈｏタンパク質、レーン３お
よび４：［^３５Ｓ］ＧＤＰβＳ−Ｒｈｏタンパク質、レ
ーン５：［^３５Ｓ］ＧＴＰγＳ。

【図１２】ｐ１６０の精製の結果を示した電気泳動写真
である。

【図１３】ｐ１６０とＲｈｏサブファミリータンパク質
との結合を示した電気泳動写真である。

【図１４】ＧＳＴ−ＲｈｏＡ、ＧＳＴ−Ｒａｃ、ＧＳＴ
−Ｃｄｃ４２、およびＧＳＴを用いたアフィニティー沈
降実験の結果を示した電気泳動写真である。

【図１５】ｐ１６０の自己リン酸化を示した電気泳動写
真である。

【図１６】リン酸化アミノ酸分析の結果を示した電気泳
動写真である。Ｐ−Ｓｅｒ、Ｐ−Ｔｈｒ、およびＰ−Ｔ
ｙｒは、それぞれリン酸化セリン、リン酸化スレオニ
ン、およびリン酸化チロシンの位置を示す。

【図１７】ｐ１６０によるＭＢＰおよびヒストンのリン
酸化を示した電気泳動写真である。

【図１８】ＧＴＰγＳ結合Ｒｈｏタンパク質によるヒス
トンリン酸化の活性を定量的に示した図である。●：Ｇ
ＴＰγＳ結合ＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質、○：ＧＤＰγ
Ｓ結合ＧＳＴ−Ｒｈｏタンパク質。

【図１９】単離されたｐ１６０クローンの概要を示した
図である。太い矢印はオープンリーディングフレームを
示す。

【図２０】発現タンパク質に対するＲｈｏタンパク質の
結合を示した電気泳動写真である。レーン１および３：
偽トランスフェクトされた細胞、レーン２および４：ト
ランスフェクトされた細胞。

【図２１】ｐ１６０の構造の概要を示した図である。

【図２２】種々のヒト組織におけるｐ１６０の発現のノ
ーザンブロット分析を示した電気泳動写真である。

【図２３】ＣＯＳ細胞由来のｐ１６０およびＲｈｏタン
パク質の共沈降を示した電気泳動写真である。上段：Ａ
ＤＰ−リボシル化反応、下段：抗ｍｙｃ抗体とのイムノ
ブロッティング。一本の矢印はＨＡに標識された発現Ｒ
ｈｏタンパク質を、二本の矢印はｍｙｃで標識された発
現ｐ１６０を、それぞれ示す。

【図２４】ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｐ１６０キナーゼ活
性の活性化を示した図である。

【図２５】ｐ１６０のアミノ酸配列とマイトニック・デ
ィストロフィー・キナーゼ（ＭＤ−ＰＫ）のそれとを整
列させた図である。

【図２６】ｐ１６０のコイルド−コイル領域の分析結果
を示した図である。

【図２７】ｐ１６０のアミノ酸配列とＰＨ領域とを整列
させた図である。

【図２８】ｐ１６０のアミノ酸配列とシステインに富む
領域とを整列させた図である。

【図２９】ｐ１６０の末端欠失変異体を示した概略図で
ある。５つの欠失変異体：ＫＤ、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およ
びＣを太線で示した。各線の下にある番号は、各フラグ
メントのアミノおよびカルボキシル末端のアミノ酸残基
を示している。ｐ１６０の機能および構造領域は中間に
概略的に示した。上方の線には、これら変異体の作製に
用いたｐ１６０ｃＤＮＡの制限酵素部位の位置を示し
た。

【図３０】Ｍ２フラグメントの末端変異体を示した図で
ある。９つの変異体（Ｍ２‐１〜Ｍ２‐９）の長さと各
変異体によりカバーされるＭ２の部分を示した。上方の
アミノ酸の線にある番号は、Ｍ２および末端欠失変異体
のアミノおよびカルボキシル末端残基を示している。番
号はｐ１６０におけるアミノ酸残基を示す。矢印は、Ｍ
２‐７およびＭ２‐８以外の各変異体のＰＣＲ増幅に用
いられたプライマーの位置を示している。Ｍ２−７およ
びＭ２−８は、オリジナルｐ１６０ｃＤＮＡから切り出
した。用いたプライマー配列は表１に示した。

【図３１】Ｍ２‐１０変異体の作製に用いたＰＣＲ産物
を示した図である。ＰＣＲに用いたプライマーは矢印で
示した。ＰＣＲにより導入された点変異の位置は星印で
示されている。作製に用いられた制限酵素部位は上方の
線に示した。ＰＣＲフラグメントに相当するＭ２‐１０
でのアミノ酸の位置は中間に線で示した。ＰＣＲに用い
たプライマーの配列は表２に示した。

【図３２】ｐ１６０の末端欠失変異体の精製の結果を示
した電気泳動写真である。末端欠失変異体、Ｍ１、Ｍ
２、Ｍ３およびＣは、ＩＰＴＧと共に（レーン２、４、
６および７）またはＩＰＴＧなしで（レーン１、３およ
び５）発現させ、精製タンパク質を１０％（Ｍ１、Ｍ２
およびＣ）または１５％（Ｍ３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに
かけた。分子量マーカータンパク質の位置はキロダルト
ンで左に示されている。

【図３３】ｐ１６０の末端欠失変異体のリガンドオーバ
ーレイアッセイの結果を示した電気泳動写真である。末
端欠失変異体、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３およびＣは、ＩＰＴＧ
と共に（レーン２、４、６および７）またはＩＰＴＧな
しで（レーン１、３および５）発現させ、精製タンパク
質を、１０％（Ｍ１、Ｍ２およびＣ）または１５％（Ｍ
３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。タンパク質量は図３
２の１０の１の量である。分子量マーカータンパク質の
位置はキロダルトンで左に示されている。

【図３４】Ｍ２の末端欠失変異体の精製の結果を示した
電気泳動写真である。分子量マーカータンパク質の位置
はキロダルトンで左に示されている。

【図３５】Ｍ２の末端欠失変異体のリガンドオーバーレ
イアッセイの結果を示した電気泳動写真である。分子量
マーカータンパク質の位置はキロダルトンで左に示され
ている。

【図３６】Ｍ２の末端欠失変異体とＲｈｏとの結合に関
するツー・ハイブリッド・アッセイの結果を示した電気
泳動写真である。Ｍ２‐ＶＰ１６転写活性化領域に融合
した各末端欠失変異体タンパク質を発現する酵母Ｌ４０
細胞を、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合領域‐ＲｈｏＡまたはＲ
ｈｏＡ^Ｖａｌ14融合タンパク質を発現するＡＭＲ７０細
胞と交配した。

【図３７】Ｍ２‐１０（９０６‐１０２４）の一部に導
入した点変異の導入部位を星印で示した図である。他の
末端欠失変異体（Ｍ２‐２〜Ｍ２‐９）を配列の上に示
した。ロイシンジッパーを＃で示した。

【図３８】点変異を有するＭ２‐１０（実施例９）の電
気泳動写真である。分子量マーカータンパク質の位置は
キロダルトンで左に示されている。

【図３９】点変異を有するＭ２‐１０（実施例９）のリ
ガンドオーバーレイアッセイの結果を示した電気泳動写
真である。分子量マーカータンパク質の位置はキロダル
トンで左に示されている。

【図４０】ＣＯＳ‐７細胞での変異体ｐ１６０タンパク
質の抗ｍｙｃ抗体との免疫沈降物を抗ｍｙｃ抗体で免疫
ブロットした結果を示した電気泳動写真である。分子量
マーカータンパク質の位置をキロダルトンで左に示し
た。

【図４１】ＣＯＳ‐７細胞での変異体ｐ１６０タンパク
質の抗ｍｙｃ抗体との免疫沈降物を〔³⁵Ｓ〕ＧＴＰγＳ
をロードしたＲｈｏタンパク質でリガンドオーバーレイ
アッセイにかけた結果を示した電気泳動写真である。分
子量マーカータンパク質の位置をキロダルトンで左に示
した。

【図４２】ｐ１６０およびＲＯＫαの推定ＲｈｏＡ結合
領域を比較した図である。ｐ１６０で同定されたＲｈｏ
タンパク質結合領域と、ＲＯＫαで提示されたＲｈｏタ
ンパク質結合領域を太線で示した。保存アミノ酸を網か
け部分として示した。星印は点変異の位置を示してい
る。ＲＯＫαの配列はLeung, T. et al., J. Biol. Che
m. 270, 29051-29054 (1995)による。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/11 - 15/28 C12N 15/55 C07K 14/47 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 9/12 C12Q 1/48 G01N 33/15 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列からなる、タン
   パク質またはその誘導体。
2. 【請求項２】１以上のアミノ酸配列が付加および／また
   は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
   よび／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列から
   なり、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロ
   テインキナーゼ活性を有する、タンパク質またはその誘
   導体。
3. 【請求項３】置換されたアミノ酸が下記の群から選択さ
   れる、請求項２に記載のタンパク質またはその誘導体： Ｋ９２１Ｍ、Ｒ９２６Ａ、Ｅ９３０Ａ、Ｅ９４３Ａ、Ｄ
   ９５１Ａ、Ｅ９６０Ａ、Ｅ９８９Ａ、Ｅ９９５Ａ、Ｋ９
   ９９Ｍ、Ｒ１０１２Ｌ、およびＫ１０１３Ｍ。
4. 【請求項４】１０１６〜１３５４番のアミノ酸配列また
   はこの部分配列、および／または３４４〜９３３番のア
   ミノ酸配列またはこの部分配列、および／または１〜７
   １番のアミノ酸配列またはこの部分配列が欠失された、
   請求項２または３に記載のタンパク質またはその誘導
   体。
5. 【請求項５】配列番号１の７２〜３４３番のアミノ酸配
   列と９３４〜１０１５番のアミノ酸配列とを有するタン
   パク質またはその誘導体。
6. 【請求項６】１以上のアミノ酸配列が付加および／また
   は挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換お
   よび／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列から
   なり、活性型Ｒｈｏタンパク質結合能を有し、かつプロ
   テインキナーゼ活性を有さない、タンパク質またはその
   誘導体。
7. 【請求項７】配列番号１の７２〜３４３番のアミノ酸配
   列もしくはプロテインキナーゼ活性に必要な領域または
   その一部を含む領域が欠失された、請求項６に記載のタ
   ンパク質またはその誘導体。
8. 【請求項８】配列番号１の７２７〜１０２１番、８４７
   〜１０２４番、９０６〜１０２４番、９２０〜１０２４
   番、９０６〜１０１５番、９２０〜１０１５番、または
   ９０６〜１０９４番のアミノ酸配列からなるタンパク質
   またはその誘導体。
9. 【請求項９】下記の群から選択される１以上の置換を有
   する、請求項８に記載のタンパク質またはその誘導体： Ｋ９２１Ｍ、Ｒ９２６Ａ、Ｅ９３０Ａ、Ｅ９４３Ａ、Ｄ
   ９５１Ａ、Ｅ９６０Ａ、Ｅ９８９Ａ、Ｅ９９５Ａ、Ｋ９
   ９９Ｍ、Ｒ１０１２Ｌ、およびＫ１０１３Ｍ。
10. 【請求項１０】１以上のアミノ酸配列が付加および／ま
    たは挿入され、および／または１以上のアミノ酸が置換
    および／または欠失された配列番号１のアミノ酸配列か
    らなり、プロテインキナーゼ活性を有し、かつ活性型Ｒ
    ｈｏタンパク質結合能を有さない、タンパク質またはそ
    の誘導体。
11. 【請求項１１】置換されたアミノ酸がＫ９３４Ｍ、Ｌ９
    ４１Ａ、Ｅ１００８Ａ、およびＩ１００９Ａからなる群
    から選択される、請求項１０に記載のタンパク質または
    その誘導体。
12. 【請求項１２】配列番号１の９３４〜９４５番または１
    ００５〜１０１５番のアミノ酸配列もしくは活性型Ｒｈ
    ｏタンパク質結合能を有する領域またはその一部を含む
    領域が欠失された、請求項１０または１１に記載のタン
    パク質またはその誘導体。
13. 【請求項１３】配列番号１の７２〜３４３番のアミノ酸
    配列からなるタンパク質またはその誘導体。
14. 【請求項１４】請求項１〜１３に記載のタンパク質また
    はその誘導体をコードするポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全
    部を有する、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
16. 【請求項１６】ポリヌクレオチドの一部が、配列番号２
    の２１４〜１０２９番、２１７９〜３０６３番、２５３
    ９〜３０７２番、２７１６〜３０７２番、２５３９〜３
    ０４５番、２７１６〜３０４５番、または２８００〜３
    ０４５番のＤＮＡ配列からなる、請求項１５に記載のポ
    リヌクレオチド。
17. 【請求項１７】請求項１４〜１６のいずれか一項に記載
    のポリヌクレオチドを含んでなる、ベクター。
18. 【請求項１８】プラスミドベクター、ウイルスベクタ
    ー、およびリポソームベクターからなる群から選択され
    る、請求項１７に記載のベクター。
19. 【請求項１９】請求項１７または１８に記載のベクター
    によって形質転換された、宿主細胞（ただし、ヒト細胞
    にあってはヒトから単離された細胞に限る）。
20. 【請求項２０】大腸菌、酵母、昆虫細胞、ＣＯＳ細胞、
    リンパ細胞、繊維芽細胞、ＣＨＯ細胞、血液系細胞、お
    よび腫瘍細胞からなる群から選択されるものである、請
    求項１９に記載の宿主細胞。
21. 【請求項２１】請求項１９または２０に記載の宿主細胞
    を培養し、そしてその培養物から請求項１〜１３のいず
    れか一項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体を単
    離することを含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一
    項に記載のタンパク質またはそれらの誘導体の製造法。
22. 【請求項２２】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜９のいずれ
    か一項に記載のタンパク質またはその誘導体とを含むス
    クリーニング系に存在させ、そして （２）活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜９のいず
    れか一項に記載のタンパク質またはその誘導体との結合
    の阻害の程度を測定することを含む、活性型Ｒｈｏタン
    パク質と、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパ
    ク質またはその誘導体との結合を阻害する物質のスクリ
    ーニング法。
23. 【請求項２３】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、請求項１〜５および１０〜１３のいずれか一項に記
    載のタンパク質またはその誘導体とを含むスクリーニン
    グ系に存在させ、そして （２）請求項１〜５および１０〜１３のいずれか一項に
    記載のタンパク質またはその誘導体のプロテインキナー
    ゼの活性の阻害の程度を測定することを含む、請求項１
    〜５および１０〜１３のいずれか一項に記載のタンパク
    質またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性を阻害
    する物質のスクリーニング法。
24. 【請求項２４】（１）スクリーニングの対象となる物質
    を、活性型Ｒｈｏタンパク質と、請求項１〜５のいずれ
    か一項に記載のタンパク質またはその誘導体とを含むス
    クリーニング系に存在させ、そして （２）請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質
    またはその誘導体のプロテインキナーゼの活性またはそ
    の活性の亢進の阻害の程度を測定することを含む、請求
    項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質またはその
    誘導体のプロテインキナーゼの活性またはその活性の亢
    進を阻害する物質のスクリーニング法。
25. 【請求項２５】スクリーニングの系が細胞系または無細
    胞系である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の
    スクリーニング法。
26. 【請求項２６】腫瘍形成または転移抑制物質のスクリー
    ニング法である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記
    載のスクリーニング法。