JP2002139493A - 新規なハイスループット・スクリーニング方法 - Google Patents
新規なハイスループット・スクリーニング方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】新規なアッセイ系スクリーニング方法の提供。
【解決手段】活性の測定が困難な不安定な酵素に関し
て、その酵素のみと反応する抗体を選択し、その酵素活
性を損なうことなく粗抽出液より一段階で精製し、プレ
ート上に固定し、高速スクリーニング系として提供す
る。
て、その酵素のみと反応する抗体を選択し、その酵素活
性を損なうことなく粗抽出液より一段階で精製し、プレ
ート上に固定し、高速スクリーニング系として提供す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白機能の阻害
剤、活性化剤あるいは生体内細胞の制御物質を探索する
上で、効率的で高速で処理できるアッセイ系スクリーニ
ング方法に関する。さらには、不安定な蛋白の精製方法
に関する。詳しくは、Rho-kinaseで表されるセリン／ス
レオニンキナーゼの阻害剤、活性化剤あるいは生体内細
胞の制御物質を探索する上で、効率的で高速で処理でき
るアッセイ系スクリーニング方法に関する。具体的に
は、本発明は、組織ホモジネート中のRho-kinaseを用い
た当該蛋白機能の活性化剤、阻害剤あるいは生体内細胞
の制御物質のスクリーニング方法、及び当該スクリーニ
ングのためのスクリーニングツールなどに関する。
剤、活性化剤あるいは生体内細胞の制御物質を探索する
上で、効率的で高速で処理できるアッセイ系スクリーニ
ング方法に関する。さらには、不安定な蛋白の精製方法
に関する。詳しくは、Rho-kinaseで表されるセリン／ス
レオニンキナーゼの阻害剤、活性化剤あるいは生体内細
胞の制御物質を探索する上で、効率的で高速で処理でき
るアッセイ系スクリーニング方法に関する。具体的に
は、本発明は、組織ホモジネート中のRho-kinaseを用い
た当該蛋白機能の活性化剤、阻害剤あるいは生体内細胞
の制御物質のスクリーニング方法、及び当該スクリーニ
ングのためのスクリーニングツールなどに関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白機能の阻害剤・活性化剤あるいは生
体内細胞の制御物質の探索には、目的とする蛋白を多く
準備し効率的で高速で処理できるアッセイ系が重要であ
る。しかし、その蛋白活性が、細胞内あるいは目的とす
る組織の中で、特有の反応をになう場合、細胞ホモジネ
ート、組織ホモジネートなどの粗抽出液でも特異的に検
出することができ、目的とする化合物の精製は必ずしも
必要はない。ところが、キナーゼ (Knighton, D.R. et
al. Science, 253, 407, 1991, Hanks, S.K., and Hunt
er, T. FASEB J. 9, 576, 1995)、ホスファターゼ (Coh
en,P. Annu.Rev.Biochem. 58, 453, 1989, Murray, K.
J. et al, Annu.Report Med.Chem. 29, 255, 1994, Mum
by, M.C., and Walter, G. Physiol.Rev. 73, 673, 199
3, Hubbard, M.J., and Cohen, P. Trends Biochem.Sc
i. 18, 172, 1993, Chen, J. et al. J.Biol.Chem. 26
9, 7957, 1994, Mauro, L.J., and Dixon, J.E.Trends
Biochem.Sci. 19, 151, 1994)、エステラーゼ、リパー
ゼ (Kriz, R. etal.Ciba Found.Symp., 150, 112-127,
1990)などの酵素は、多くの似通った活性を持つ分子
（サブタイプ）よりなるファミリーであり、そのためそ
の中の特定の分子（サブタイプ）のみの活性を測定した
い場合には、組織ホモジネートより精製するか、あるい
は遺伝組み換え体の調製などの手法により、高度に純化
されたものを調製し、使用する必要があった。これら以
外でも、測定対象の酵素の活性測定系の妨害物質が粗抽
出液中に存在している場合には、その中の特定の酵素に
対する阻害剤、活性化剤の探索を行うには、酵素活性の
測定を再現性よく測定を行うことが難しい。このような
場合には、前述と同様に高度に純化された酵素を単離精
製し、準備する必要があった。
体内細胞の制御物質の探索には、目的とする蛋白を多く
準備し効率的で高速で処理できるアッセイ系が重要であ
る。しかし、その蛋白活性が、細胞内あるいは目的とす
る組織の中で、特有の反応をになう場合、細胞ホモジネ
ート、組織ホモジネートなどの粗抽出液でも特異的に検
出することができ、目的とする化合物の精製は必ずしも
必要はない。ところが、キナーゼ (Knighton, D.R. et
al. Science, 253, 407, 1991, Hanks, S.K., and Hunt
er, T. FASEB J. 9, 576, 1995)、ホスファターゼ (Coh
en,P. Annu.Rev.Biochem. 58, 453, 1989, Murray, K.
J. et al, Annu.Report Med.Chem. 29, 255, 1994, Mum
by, M.C., and Walter, G. Physiol.Rev. 73, 673, 199
3, Hubbard, M.J., and Cohen, P. Trends Biochem.Sc
i. 18, 172, 1993, Chen, J. et al. J.Biol.Chem. 26
9, 7957, 1994, Mauro, L.J., and Dixon, J.E.Trends
Biochem.Sci. 19, 151, 1994)、エステラーゼ、リパー
ゼ (Kriz, R. etal.Ciba Found.Symp., 150, 112-127,
1990)などの酵素は、多くの似通った活性を持つ分子
（サブタイプ）よりなるファミリーであり、そのためそ
の中の特定の分子（サブタイプ）のみの活性を測定した
い場合には、組織ホモジネートより精製するか、あるい
は遺伝組み換え体の調製などの手法により、高度に純化
されたものを調製し、使用する必要があった。これら以
外でも、測定対象の酵素の活性測定系の妨害物質が粗抽
出液中に存在している場合には、その中の特定の酵素に
対する阻害剤、活性化剤の探索を行うには、酵素活性の
測定を再現性よく測定を行うことが難しい。このような
場合には、前述と同様に高度に純化された酵素を単離精
製し、準備する必要があった。
【０００３】酵素を臓器の粗抽出液より高度に精製しよ
うとすると、通常は多数のカラムクロマトグラフィーを
用いて、取得目標量の数十倍、数百倍もの材料を使用し
て精製を行うという、労力と時間の要する作業を行わね
ばならない。また、往々にして、この過程で酵素活性が
失活することが多く、最終的には精製した酵素が充分単
離できないと言ったことが起きる場合がある。時には、
アフィニテイカラムクロマトグラフイーを使用して功を
奏する場合もあるが、例えば抗体カラムを用いた場合、
使用した抗体カラムに付着した酵素を溶出させる場合に
問題が生じる。即ち、抗原−抗体反応により強い親和性
を持って抗体カラムに結合した酵素を、その活性を失活
させることなく溶出させることができる場合は稀であ
る。遺伝子組換体より高度に精製しようとする場合に
は、遺伝子のクローニング、遺伝子配列が目的酵素であ
ることの確認、そして宿主細胞への導入、培養液からの
精製と言うように、これも労力と時間の要する作業であ
る。現在においても、以上に述べた労力と時間の要する
作業を回避できる、簡便なスクリーニング方法について
はほとんど検討されてはおらず、報告もなされていな
い。
うとすると、通常は多数のカラムクロマトグラフィーを
用いて、取得目標量の数十倍、数百倍もの材料を使用し
て精製を行うという、労力と時間の要する作業を行わね
ばならない。また、往々にして、この過程で酵素活性が
失活することが多く、最終的には精製した酵素が充分単
離できないと言ったことが起きる場合がある。時には、
アフィニテイカラムクロマトグラフイーを使用して功を
奏する場合もあるが、例えば抗体カラムを用いた場合、
使用した抗体カラムに付着した酵素を溶出させる場合に
問題が生じる。即ち、抗原−抗体反応により強い親和性
を持って抗体カラムに結合した酵素を、その活性を失活
させることなく溶出させることができる場合は稀であ
る。遺伝子組換体より高度に精製しようとする場合に
は、遺伝子のクローニング、遺伝子配列が目的酵素であ
ることの確認、そして宿主細胞への導入、培養液からの
精製と言うように、これも労力と時間の要する作業であ
る。現在においても、以上に述べた労力と時間の要する
作業を回避できる、簡便なスクリーニング方法について
はほとんど検討されてはおらず、報告もなされていな
い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、スクリーニ
ング方法に使用する蛋白において、精製等に労力、時間
等がかかり速やかな取得が困難である場合に有効なスク
リーニング方法を提供するものである。詳しくは、細胞
や組織のホモジネートの粗抽出液では、活性の測定が困
難な不安定な蛋白に関して、その蛋白のみと反応する抗
体を選択し、その蛋白機能の活性を損なうことなく粗抽
出液より一段階で精製し、プレート上に固定し、高速ス
クリーニング系として提供するものである。
ング方法に使用する蛋白において、精製等に労力、時間
等がかかり速やかな取得が困難である場合に有効なスク
リーニング方法を提供するものである。詳しくは、細胞
や組織のホモジネートの粗抽出液では、活性の測定が困
難な不安定な蛋白に関して、その蛋白のみと反応する抗
体を選択し、その蛋白機能の活性を損なうことなく粗抽
出液より一段階で精製し、プレート上に固定し、高速ス
クリーニング系として提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】スクリーニング方法の対
象となる蛋白としては、種々の可溶性蛋白あるいは可溶
化が可能な蛋白であるが、上述のように不安定で単離が
困難で、その結果大量に取得することが困難な蛋白質に
関して、効率的にスクリーニングを進める方法は未だ見
出されていなかった。そこで本発明者等は、このような
蛋白の一つとして、Rho-kinaseに着目し、この蛋白を用
いて本発明のスクリーニング方法の構築を検討した。Rh
o-kinaseは、近年、Rhoファミリーの構成因子であるRho
Aと相互作用するセリン/スレオニンキナーゼとして発見
されたものである（Matsui T. et al., EMBO. J 15, 22
08-2216, 1996, Ishizaki, T. et al., EMBO J. 15, 18
85-1893, 1996）。これはRhoと同様血管平滑筋に多く分
布しており、ミオシン軽鎖（MLC）をリン酸化する。さ
らに、本酵素はミオシン脱リン酸化酵素をリン酸化する
活性を持ち、リン酸化されたミオシン脱リン酸化酵素は
その活性が抑制される(Amano,M. et al., Science 275,
1308-1311, 1997, Kimura, K. et al., Science 273,2
45-248, 1996)。これよりMLCのリン酸化レベルが上昇
し、平滑筋収縮を引き起こすと推定されている。
象となる蛋白としては、種々の可溶性蛋白あるいは可溶
化が可能な蛋白であるが、上述のように不安定で単離が
困難で、その結果大量に取得することが困難な蛋白質に
関して、効率的にスクリーニングを進める方法は未だ見
出されていなかった。そこで本発明者等は、このような
蛋白の一つとして、Rho-kinaseに着目し、この蛋白を用
いて本発明のスクリーニング方法の構築を検討した。Rh
o-kinaseは、近年、Rhoファミリーの構成因子であるRho
Aと相互作用するセリン/スレオニンキナーゼとして発見
されたものである（Matsui T. et al., EMBO. J 15, 22
08-2216, 1996, Ishizaki, T. et al., EMBO J. 15, 18
85-1893, 1996）。これはRhoと同様血管平滑筋に多く分
布しており、ミオシン軽鎖（MLC）をリン酸化する。さ
らに、本酵素はミオシン脱リン酸化酵素をリン酸化する
活性を持ち、リン酸化されたミオシン脱リン酸化酵素は
その活性が抑制される(Amano,M. et al., Science 275,
1308-1311, 1997, Kimura, K. et al., Science 273,2
45-248, 1996)。これよりMLCのリン酸化レベルが上昇
し、平滑筋収縮を引き起こすと推定されている。
【０００６】平滑筋収縮は、高血圧症、狭心症および脳
血管攣縮等の病態に深く関与しており、Rho-kinaseの機
能を遮断する薬物はこれらの疾患に対する治療薬になる
と考えられる。実際、 Rho-kinaseの阻害剤であるY-276
32は、正常なWistarラットの血圧は下降させないが、SH
Rおよび腎性高血圧ラット、DOCA-Saltラットを用いた血
圧病態モデルにおいては、血圧低下作用を示すことが報
告されている（UeheraM. et al., Nature 389, 990-99
4, 1997）。また、脳血管攣縮治療剤として上市されて
いるMLCキナーゼ阻害剤Fasudil（商品名エリル、旭化
成）は、該酵素よりむしろRho-kinaseに対し強い阻害作
用を示すことが明らかとなっている(Uehera M. et al.,
Nature 389, 990-994, 1997)。本発明者等は、Rho-kin
aseを阻害する化合物のスクリーニング系の確立を一つ
の指標として、精製に困難が伴う蛋白を使用するスクリ
ーニング系の構築を目指し、鋭意検討を行った。その結
果、酵素活性を損なわずに酵素を免疫沈降させることの
できる抗体の作成に新たな方法を見出し、本発明を完成
させた。
血管攣縮等の病態に深く関与しており、Rho-kinaseの機
能を遮断する薬物はこれらの疾患に対する治療薬になる
と考えられる。実際、 Rho-kinaseの阻害剤であるY-276
32は、正常なWistarラットの血圧は下降させないが、SH
Rおよび腎性高血圧ラット、DOCA-Saltラットを用いた血
圧病態モデルにおいては、血圧低下作用を示すことが報
告されている（UeheraM. et al., Nature 389, 990-99
4, 1997）。また、脳血管攣縮治療剤として上市されて
いるMLCキナーゼ阻害剤Fasudil（商品名エリル、旭化
成）は、該酵素よりむしろRho-kinaseに対し強い阻害作
用を示すことが明らかとなっている(Uehera M. et al.,
Nature 389, 990-994, 1997)。本発明者等は、Rho-kin
aseを阻害する化合物のスクリーニング系の確立を一つ
の指標として、精製に困難が伴う蛋白を使用するスクリ
ーニング系の構築を目指し、鋭意検討を行った。その結
果、酵素活性を損なわずに酵素を免疫沈降させることの
できる抗体の作成に新たな方法を見出し、本発明を完成
させた。
【０００７】本発明では、例えば、Rho-kinaseの場合に
は、図１、図２に示すような工程での、酵素粗抽出液か
らの単離とアッセイ系の構築を一段階で行えるようにな
った。即ち、本発明の要旨は、以下に述べる通りであ
る。 （１）次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋
白の蛋白機能の活性化剤又は阻害剤のスクリーニング方
法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該酵素との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6) 当該蛋白の
固相化された上記(4)で得られた担体を使用して、被験
物質の溶液と反応させる、(7)反応終了後、当該蛋白の
活性を測定することにより、被験物質の蛋白機能の活性
に対する効果を調べる。 （２）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白が可溶化酵素で
ある、上記（１）記載のスクリーニング方法。 （３）可溶化酵素がセリン／スレオニンキナーゼ系酵素
である、上記（１）または（２）記載のスクリーニング
方法。 （４）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白の蛋白機能の活
性を基質への32Ｐまたは 33Ｐの取り込みで評価するた
め、リンの放射化活性を指標として効果を調べること、
あるいはリン酸化基質に対する抗体の結合を指標として
効果を調べることからなる、上記（１）記載のスクリー
ニング方法。 （５）蛋白機能の活性を測定する方法として、次の方法
で被験物質の効果を判定することからなる、上記（４）
記載のスクリーニング方法。 a)ＳＰＡ(Scintillation Proximity Assay)法 b)マルチスクリーン(Multiscreen)法 c)フィルター・スポット(filter-spot)法 （６）セリン／スレオニンキナーゼ系酵素がRho-kinase
酵素である、上記（３）記載のスクリーニング方法。 （７）Rho-kinase酵素がウシ、マウスあるいはラット由
来のRho-kinaseである上記（６）記載のスクリーニング
方法。 （８）組織ホモジネートがウシの脳灰白質由来の組織ホ
モジネートである上記（１）〜（７）に記載のスクリー
ニング方法。 （９）部分ペプチドを抗原として、親和性が１０６／Ｍ
以下の抗体であることを特徴とする上記（１）〜（７）
に記載のスクリーニング方法。 （１０）可溶性蛋白質がRho-kinaseであり、部分ペプチ
ドがRho-kinaseのＣ末部分の２０アミノ酸残基からなる
ペプチドである、上記（１）〜（９）のいずれかに記載
のスクリーニング方法。 （１１）部分ペプチドが、ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳＲＱ
ＬＡＰＮＫＰＳの２０アミノ酸残基からなるペプチドで
ある、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のスクリー
ニング方法。 （１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の
スクリーニング方法により得られる蛋白機能の活性化剤
又は阻害剤。 （１３）酵素蛋白がRho-kinaseである上記（１２）記載
の活性化剤又は阻害剤。
は、図１、図２に示すような工程での、酵素粗抽出液か
らの単離とアッセイ系の構築を一段階で行えるようにな
った。即ち、本発明の要旨は、以下に述べる通りであ
る。 （１）次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋
白の蛋白機能の活性化剤又は阻害剤のスクリーニング方
法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該酵素との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6) 当該蛋白の
固相化された上記(4)で得られた担体を使用して、被験
物質の溶液と反応させる、(7)反応終了後、当該蛋白の
活性を測定することにより、被験物質の蛋白機能の活性
に対する効果を調べる。 （２）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白が可溶化酵素で
ある、上記（１）記載のスクリーニング方法。 （３）可溶化酵素がセリン／スレオニンキナーゼ系酵素
である、上記（１）または（２）記載のスクリーニング
方法。 （４）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白の蛋白機能の活
性を基質への32Ｐまたは 33Ｐの取り込みで評価するた
め、リンの放射化活性を指標として効果を調べること、
あるいはリン酸化基質に対する抗体の結合を指標として
効果を調べることからなる、上記（１）記載のスクリー
ニング方法。 （５）蛋白機能の活性を測定する方法として、次の方法
で被験物質の効果を判定することからなる、上記（４）
記載のスクリーニング方法。 a)ＳＰＡ(Scintillation Proximity Assay)法 b)マルチスクリーン(Multiscreen)法 c)フィルター・スポット(filter-spot)法 （６）セリン／スレオニンキナーゼ系酵素がRho-kinase
酵素である、上記（３）記載のスクリーニング方法。 （７）Rho-kinase酵素がウシ、マウスあるいはラット由
来のRho-kinaseである上記（６）記載のスクリーニング
方法。 （８）組織ホモジネートがウシの脳灰白質由来の組織ホ
モジネートである上記（１）〜（７）に記載のスクリー
ニング方法。 （９）部分ペプチドを抗原として、親和性が１０６／Ｍ
以下の抗体であることを特徴とする上記（１）〜（７）
に記載のスクリーニング方法。 （１０）可溶性蛋白質がRho-kinaseであり、部分ペプチ
ドがRho-kinaseのＣ末部分の２０アミノ酸残基からなる
ペプチドである、上記（１）〜（９）のいずれかに記載
のスクリーニング方法。 （１１）部分ペプチドが、ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳＲＱ
ＬＡＰＮＫＰＳの２０アミノ酸残基からなるペプチドで
ある、上記（１）〜（９）のいずれかに記載のスクリー
ニング方法。 （１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の
スクリーニング方法により得られる蛋白機能の活性化剤
又は阻害剤。 （１３）酵素蛋白がRho-kinaseである上記（１２）記載
の活性化剤又は阻害剤。
【０００８】（１４）酵素蛋白がウシRho-kinaseである
上記（１２）記載の活性化剤又は阻害剤。 （１５）上記（１３）〜（１４）記載の活性化剤又は阻
害剤を有効成分として含有する医薬組成物。 （１６）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有するリン酸化反応抑制剤。 （１７）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有する平滑筋収縮抑制剤。 （１８）上記（１７）記載の平滑筋収縮抑制剤を有効成
分として含んでなる医薬組成物。 （１９）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有する、高血圧症あるいは狭心症、脳血管
攣縮の疾患治療剤。 （２０）上記（１３）記載のRho-kinaseの活性化剤を有
効成分として含有するリン酸化反応促進剤。 （２１）上記（１３）記載のRho-kinaseの活性化剤を有
効成分として含有する平滑筋収縮促進剤。 （２２）次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶化可能な
蛋白の精製方法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該酵素に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6)固定化した
当該蛋白を遊離させ回収する。 （２３）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白がRho-kinase
蛋白である、上記（２２）記載の蛋白質精製方法。
上記（１２）記載の活性化剤又は阻害剤。 （１５）上記（１３）〜（１４）記載の活性化剤又は阻
害剤を有効成分として含有する医薬組成物。 （１６）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有するリン酸化反応抑制剤。 （１７）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有する平滑筋収縮抑制剤。 （１８）上記（１７）記載の平滑筋収縮抑制剤を有効成
分として含んでなる医薬組成物。 （１９）上記（１３）記載のRho-kinaseの阻害剤を有効
成分として含有する、高血圧症あるいは狭心症、脳血管
攣縮の疾患治療剤。 （２０）上記（１３）記載のRho-kinaseの活性化剤を有
効成分として含有するリン酸化反応促進剤。 （２１）上記（１３）記載のRho-kinaseの活性化剤を有
効成分として含有する平滑筋収縮促進剤。 （２２）次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶化可能な
蛋白の精製方法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該酵素に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6)固定化した
当該蛋白を遊離させ回収する。 （２３）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白がRho-kinase
蛋白である、上記（２２）記載の蛋白質精製方法。
【０００９】（２４）可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白
がウシあるいはラット由来のRho-kinase蛋白である、上
記（２３）記載の蛋白質精製方法。 （２５）以下の方法で調製されるスクリーニングあるい
は蛋白精製用担体：(1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、
次の性質を示す部分ペプチドを合成し、これを抗原とし
て抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該酵素活性が失活することが
ない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する。（２６）可溶性蛋白又
は可溶化可能な蛋白がRho-kinase蛋白である、上記（２
５）記載の担体。 （２７）以下の方法で調製されるスクリーニング用の可
溶性蛋白質又は可溶化可能な蛋白質固定化担体： (1)該蛋白蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す
部分ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成す
る、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該酵素に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該酵素を該担体に固相化する。 （２８）可溶性蛋白質がRho-kinaseである上記（２７）
記載のスクリーニング用Rho-kinase固定化担体プレー
ト。 （２９）組織ホモジネートがウシの脳灰白質由来の組織
ホモジネート、あるいはラットの脳由来の組織ホモジネ
ートである、上記（２７）のRho-kinase固定化担体プレ
ート。 （３０）Rho-kinaseがウシRho-kinaseである、上記（２
８）、（２９）記載のRho-kinase固定化担体プレート。
がウシあるいはラット由来のRho-kinase蛋白である、上
記（２３）記載の蛋白質精製方法。 （２５）以下の方法で調製されるスクリーニングあるい
は蛋白精製用担体：(1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、
次の性質を示す部分ペプチドを合成し、これを抗原とし
て抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該酵素活性が失活することが
ない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する。（２６）可溶性蛋白又
は可溶化可能な蛋白がRho-kinase蛋白である、上記（２
５）記載の担体。 （２７）以下の方法で調製されるスクリーニング用の可
溶性蛋白質又は可溶化可能な蛋白質固定化担体： (1)該蛋白蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す
部分ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成す
る、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該酵素に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該酵素を該担体に固相化する。 （２８）可溶性蛋白質がRho-kinaseである上記（２７）
記載のスクリーニング用Rho-kinase固定化担体プレー
ト。 （２９）組織ホモジネートがウシの脳灰白質由来の組織
ホモジネート、あるいはラットの脳由来の組織ホモジネ
ートである、上記（２７）のRho-kinase固定化担体プレ
ート。 （３０）Rho-kinaseがウシRho-kinaseである、上記（２
８）、（２９）記載のRho-kinase固定化担体プレート。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の第１の態様は、可溶性蛋
白又は可溶化可能な蛋白の蛋白機能の活性化剤又は阻害
剤のスクリーニング方法に関するものである（以下本発
明スクリーニング方法と略記する場合がある）。本発明
に用いられる「可溶性蛋白」とは、酵素、転写因子、核
内受容体（転写反応において RNAポリメラーゼ以外に必
要とされる蛋白質性因子で、細胞外のリガンドと結合
し、その転写に対する効果を発揮するもの）、アダプタ
ー蛋白、分泌される蛋白質、生理活性物質などが挙げら
れ、転写因子は例えば、Sp1、AP1、NF-kB、核内受容体
は例えば、ステロイド受容体、PPARa等が挙げられる。
また、アダプター蛋白（酵素活性をもたず他の蛋白質に
結合するための領域を有する蛋白質）としては例えば、
SH2ドメインを持つ PLCg、rasGAP、SH3を持つ Grb-2な
どが挙げられ、分泌される蛋白質、生理活性物質そして
例えば、成長因子、インシュリン、サイトカイン、ケモ
カインなどが挙げられる。酵素としては、細胞内外の可
溶性画分の酵素が好ましく。例えば、セリン／スレオニ
ンキナーゼ、チロジンキナーゼの一部、エステラーゼ、
プロテアーゼ、ホスファターゼの一部などを挙げること
ができる。本発明の「可溶化可能な蛋白」とは、膜画分
中の酵素、膜貫通型の受容体（膜画分中の分子であっ
て、界面活性剤やプロテアーゼにより限定分解、ホスホ
リパーゼ処理により可溶化できるものを言う。）が挙げ
られ例えば、CD4、セレクチン、CD14、糖転移酵素、レ
セプターの一部、などが挙げられ、好適なものとして
は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、CD4、セレクチ
ンなどが挙げられる。
白又は可溶化可能な蛋白の蛋白機能の活性化剤又は阻害
剤のスクリーニング方法に関するものである（以下本発
明スクリーニング方法と略記する場合がある）。本発明
に用いられる「可溶性蛋白」とは、酵素、転写因子、核
内受容体（転写反応において RNAポリメラーゼ以外に必
要とされる蛋白質性因子で、細胞外のリガンドと結合
し、その転写に対する効果を発揮するもの）、アダプタ
ー蛋白、分泌される蛋白質、生理活性物質などが挙げら
れ、転写因子は例えば、Sp1、AP1、NF-kB、核内受容体
は例えば、ステロイド受容体、PPARa等が挙げられる。
また、アダプター蛋白（酵素活性をもたず他の蛋白質に
結合するための領域を有する蛋白質）としては例えば、
SH2ドメインを持つ PLCg、rasGAP、SH3を持つ Grb-2な
どが挙げられ、分泌される蛋白質、生理活性物質そして
例えば、成長因子、インシュリン、サイトカイン、ケモ
カインなどが挙げられる。酵素としては、細胞内外の可
溶性画分の酵素が好ましく。例えば、セリン／スレオニ
ンキナーゼ、チロジンキナーゼの一部、エステラーゼ、
プロテアーゼ、ホスファターゼの一部などを挙げること
ができる。本発明の「可溶化可能な蛋白」とは、膜画分
中の酵素、膜貫通型の受容体（膜画分中の分子であっ
て、界面活性剤やプロテアーゼにより限定分解、ホスホ
リパーゼ処理により可溶化できるものを言う。）が挙げ
られ例えば、CD4、セレクチン、CD14、糖転移酵素、レ
セプターの一部、などが挙げられ、好適なものとして
は、ガラクトシルトランスフェラーゼ、CD4、セレクチ
ンなどが挙げられる。
【００１１】本発明の「セリン／スレオニンキナーゼ」
とは、蛋白のセリン残基あるいはスレオニン残基の水酸
基をリン酸化する酵素の総称である。例えば、Rho-kina
se、Protein kinase C、Protein kinase A等が挙げら
れ、好適なものとしては、Rho-kinaseを挙げることがで
きる。本発明の「Rho-kinase」とは、Rhoファミリーの
構成因子である Rho Aと相互作用するセリン/スレオニ
ンキナーゼである。本酵素はヒト型でも、ウシ型、マウ
ス型など他の種由来の Rho-kinaseも同様の目的に使用
できる。Rho-kinaseのマウス型のアミノ酸配列及び塩基
配列は、文献（Nakagawa, O., Fujisawa, K.,Ishizaki,
T., Saito, Y., Nakao, K. and Narumiya, S. FEBS Le
tt. 392(2), 189-193 (1966)）や Genbank accession番
号NM 009071、NM 09072において公開されている。Rho-k
inaseのラット型のアミノ酸配列及び塩基配列は、文献
（Leuting, T., Manser, E. Tan,L., and Lim, L. J. B
iol. Chem. 270 (49), 29051-29054 (1995)、Leuting,
T., Chen, X. -Q., Manser, E. and Lim, L. Mol. Cel
l.Biol. 16 (10), 5313-5327 (1996)）や Genbank acce
ssion番号U38481、U61266において公開されている。ま
た、Rho-kinazeのウシ型のアミノ酸配列及び塩基配列
は、文献（Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chi
hara, K., Nakafuku,M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,
K., Iwamatsu, A and Kaibuchi, K EMBO J.15(9), 220
8-2216 (1996)）や Genbank accession番号U36909にお
いて公開されている。ヒト型Rho-kinazeの配列は文献
（Narumiya, S. and Iwamatsu, A, Patent: JP 1997135
683-A 1 27-May-1997、Takahashi, N., Tuiki, H., Say
a, H. and Kaibuchi, K. Genomics 55(2), 235-237 (19
99)）又は Genbank accession番号E13124、D87931にお
いて公開されている。
とは、蛋白のセリン残基あるいはスレオニン残基の水酸
基をリン酸化する酵素の総称である。例えば、Rho-kina
se、Protein kinase C、Protein kinase A等が挙げら
れ、好適なものとしては、Rho-kinaseを挙げることがで
きる。本発明の「Rho-kinase」とは、Rhoファミリーの
構成因子である Rho Aと相互作用するセリン/スレオニ
ンキナーゼである。本酵素はヒト型でも、ウシ型、マウ
ス型など他の種由来の Rho-kinaseも同様の目的に使用
できる。Rho-kinaseのマウス型のアミノ酸配列及び塩基
配列は、文献（Nakagawa, O., Fujisawa, K.,Ishizaki,
T., Saito, Y., Nakao, K. and Narumiya, S. FEBS Le
tt. 392(2), 189-193 (1966)）や Genbank accession番
号NM 009071、NM 09072において公開されている。Rho-k
inaseのラット型のアミノ酸配列及び塩基配列は、文献
（Leuting, T., Manser, E. Tan,L., and Lim, L. J. B
iol. Chem. 270 (49), 29051-29054 (1995)、Leuting,
T., Chen, X. -Q., Manser, E. and Lim, L. Mol. Cel
l.Biol. 16 (10), 5313-5327 (1996)）や Genbank acce
ssion番号U38481、U61266において公開されている。ま
た、Rho-kinazeのウシ型のアミノ酸配列及び塩基配列
は、文献（Matsui, T., Amano, M., Yamamoto, T., Chi
hara, K., Nakafuku,M., Ito, M., Nakano, T., Okawa,
K., Iwamatsu, A and Kaibuchi, K EMBO J.15(9), 220
8-2216 (1996)）や Genbank accession番号U36909にお
いて公開されている。ヒト型Rho-kinazeの配列は文献
（Narumiya, S. and Iwamatsu, A, Patent: JP 1997135
683-A 1 27-May-1997、Takahashi, N., Tuiki, H., Say
a, H. and Kaibuchi, K. Genomics 55(2), 235-237 (19
99)）又は Genbank accession番号E13124、D87931にお
いて公開されている。
【００１２】本発明で抗原として用いられる「部分ペプ
チド」は、可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白のアミノ酸
配列の中で、蛋白機能の活性を示すドメインから遠く離
れたドメインのアミノ酸配列を有し、かつ、そのアミノ
酸配列は、当該蛋白ファミリーのアミノ酸配列の中で非
保存領域のアミノ酸配列であり、当該蛋白に特徴的で、
かつ少なくとも６個以上のアミノ酸からなり、親水性が
高い領域に存在するアミノ酸配列である。さらに、この
アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能基を
有し、このアミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗
体と当該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失
活することがないものを言う。なお、上記に該当するア
ミノ酸配列を持つ部分ペプチドの取得方法としては、そ
れ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って取得する
ことができる。例えば、“Antibodies - A laboratory
manual”(p72-87,Harlow & Lane, 1988, ColdSpring Ha
rbur Lab)に準じて取得することができる。例えば、当
該蛋白がセリン／スレオニンキナーゼ系酵素であれば、
酵素活性を示すドメインから遠く離れたドメインのアミ
ノ酸配列の中で、非保存領域のものであり、かつ、少な
くとも６個以上のアミノ酸を有するペプチドを選択すれ
ばよい。また、当該蛋白がRho-kinaseである場合、Rho-
kinaseの部分ペプチドを取得する場合の１例として下述
の方法が挙げられる。Rho-kinase酵素の一次構造を考慮
すると、Ｎ末端側にキナーゼドメイン、中央にcoiled c
oilドメイン、そしてＣ末端側にPHドメインなどから構
成されていることから、Ｎ末端付近の酵素活性ドメイン
に立体障害を与えないよう、できるだけ離れた場所とし
てＣ末付近で、かつ Rho-kinaseに特異的なアミノ酸配
列を有する部位（抗原ペプチド、アミノ酸２０個）を抗
原として作製し、これを抗原としてポリクロナール抗体
（ウサギＩｇ由来）を取得した。例えば、Rho-kinaseに
特異的なアミノ酸配列を有する部位（抗原ペプチド、ア
ミノ酸２０個）の一例として、ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳ
ＲＱＬＡＰＮＫＰＳを使用することができる。他の酵素
についても同様にして適切な特異的抗原ペプチドを取得
することができる。
チド」は、可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白のアミノ酸
配列の中で、蛋白機能の活性を示すドメインから遠く離
れたドメインのアミノ酸配列を有し、かつ、そのアミノ
酸配列は、当該蛋白ファミリーのアミノ酸配列の中で非
保存領域のアミノ酸配列であり、当該蛋白に特徴的で、
かつ少なくとも６個以上のアミノ酸からなり、親水性が
高い領域に存在するアミノ酸配列である。さらに、この
アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能基を
有し、このアミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗
体と当該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失
活することがないものを言う。なお、上記に該当するア
ミノ酸配列を持つ部分ペプチドの取得方法としては、そ
れ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って取得する
ことができる。例えば、“Antibodies - A laboratory
manual”(p72-87,Harlow & Lane, 1988, ColdSpring Ha
rbur Lab)に準じて取得することができる。例えば、当
該蛋白がセリン／スレオニンキナーゼ系酵素であれば、
酵素活性を示すドメインから遠く離れたドメインのアミ
ノ酸配列の中で、非保存領域のものであり、かつ、少な
くとも６個以上のアミノ酸を有するペプチドを選択すれ
ばよい。また、当該蛋白がRho-kinaseである場合、Rho-
kinaseの部分ペプチドを取得する場合の１例として下述
の方法が挙げられる。Rho-kinase酵素の一次構造を考慮
すると、Ｎ末端側にキナーゼドメイン、中央にcoiled c
oilドメイン、そしてＣ末端側にPHドメインなどから構
成されていることから、Ｎ末端付近の酵素活性ドメイン
に立体障害を与えないよう、できるだけ離れた場所とし
てＣ末付近で、かつ Rho-kinaseに特異的なアミノ酸配
列を有する部位（抗原ペプチド、アミノ酸２０個）を抗
原として作製し、これを抗原としてポリクロナール抗体
（ウサギＩｇ由来）を取得した。例えば、Rho-kinaseに
特異的なアミノ酸配列を有する部位（抗原ペプチド、ア
ミノ酸２０個）の一例として、ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳ
ＲＱＬＡＰＮＫＰＳを使用することができる。他の酵素
についても同様にして適切な特異的抗原ペプチドを取得
することができる。
【００１３】本発明の「親水性が高い領域」とは、水分
子との親和性の高い領域で、リジン、アルギニン、グル
タミン酸、アスパラギン酸などの親水性アミノ酸より構
成されている領域を言う。一般に可溶性蛋白又は、可溶
化可能な蛋白の場合、この領域が分子の外側に面してい
る。その結果、この領域部分が該蛋白のエピトープとな
る。本発明の「キャリヤー蛋白質と結合できる官能基」
とは、システインのＳＨ基、チロシンの水酸基、グルタ
ミン酸・アスパラギン酸のカルボン酸あるいはリジンの
アミノ基のことを言う。これらの官能基が適切な数があ
ることにより、キャリヤー蛋白と結合することができ
る。従って、官能基の数はキャリヤー蛋白と結合できる
数が存在することが必要であり、複数個存在することが
望ましい。
子との親和性の高い領域で、リジン、アルギニン、グル
タミン酸、アスパラギン酸などの親水性アミノ酸より構
成されている領域を言う。一般に可溶性蛋白又は、可溶
化可能な蛋白の場合、この領域が分子の外側に面してい
る。その結果、この領域部分が該蛋白のエピトープとな
る。本発明の「キャリヤー蛋白質と結合できる官能基」
とは、システインのＳＨ基、チロシンの水酸基、グルタ
ミン酸・アスパラギン酸のカルボン酸あるいはリジンの
アミノ基のことを言う。これらの官能基が適切な数があ
ることにより、キャリヤー蛋白と結合することができ
る。従って、官能基の数はキャリヤー蛋白と結合できる
数が存在することが必要であり、複数個存在することが
望ましい。
【００１４】本発明の「部分ペプチドを抗原とする抗体
(Ig)及びそれに対する抗体」とは、部分ペプチドを抗原
とする抗体の抗原との結合活性を損ねないようにデザイ
ンされた抗体を言う。一般に前者を一次抗体、後者を二
次抗体と呼ぶ。二次抗体は、一次抗体の由来となった動
物種で、対応するアイソタイプの Fc領域を抗原として
作成されたものが望ましい。なお、全領域あるいは Fa
b、F(ab')2では一次抗体の活性を損ねる場合がでてくる
ので、避ける方が望ましい。上記における一次抗体、二
次抗体はポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体
でもよい。本発明における抗体の親和性は、１０５／Ｍ
以下であれば好ましく、より好ましくは１０６／Ｍであ
る。本発明の「細胞ホモジネートあるいは組織ホモジネ
ート」とは、ホモジナイザーにより、適切なバッファー
中で細胞あるいは組織を破壊して得られた懸濁液を言
う。スクリーニング目的に応じて適宜必要な細胞ホモジ
ネートあるいは組織ホモジネートを使用することができ
る。例えば、Rho-kinaseに関しては、ウシの脳灰白質由
来の組織ホモジネート、あるいはラットの脳由来の組織
ホモジネート等を用いることができる。また、組織特異
的に発現している酵素に関して、スクリーニング系を確
立したい場合には、特異的に発現している組織部位のホ
モジネートを使用することができる。本発明の「担体に
反応させ、当該酵素を該担体に固相化する」とは、当該
酵素をプレート、樹脂などのビーズに上記抗体を介して
結合させ、通常の洗浄操作でははがすことのできない状
態にすることを言う。本発明の「被験物質の溶液と反応
させる」とは、阻害剤あるいは活性化剤としての性質の
期待される物質とそれらに効果、影響を調べたい酵素と
を混ぜ合わせて、活性測定のため、反応させることを言
う。本発明の「当該酵素の活性を測定する」とは、至適
条件下、適切な基質の変換させる量を測定することを言
う。酵素活性は、一定の単位として定量化されるが、こ
れは一般に、酵素の最適条件下、30度、1分間あたり1mo
lの基質を変換させる量で定義される。なお、基質が高
分子量のものであったり、モル表示しにくい場合は、別
単位が用いられることもある。
(Ig)及びそれに対する抗体」とは、部分ペプチドを抗原
とする抗体の抗原との結合活性を損ねないようにデザイ
ンされた抗体を言う。一般に前者を一次抗体、後者を二
次抗体と呼ぶ。二次抗体は、一次抗体の由来となった動
物種で、対応するアイソタイプの Fc領域を抗原として
作成されたものが望ましい。なお、全領域あるいは Fa
b、F(ab')2では一次抗体の活性を損ねる場合がでてくる
ので、避ける方が望ましい。上記における一次抗体、二
次抗体はポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体
でもよい。本発明における抗体の親和性は、１０５／Ｍ
以下であれば好ましく、より好ましくは１０６／Ｍであ
る。本発明の「細胞ホモジネートあるいは組織ホモジネ
ート」とは、ホモジナイザーにより、適切なバッファー
中で細胞あるいは組織を破壊して得られた懸濁液を言
う。スクリーニング目的に応じて適宜必要な細胞ホモジ
ネートあるいは組織ホモジネートを使用することができ
る。例えば、Rho-kinaseに関しては、ウシの脳灰白質由
来の組織ホモジネート、あるいはラットの脳由来の組織
ホモジネート等を用いることができる。また、組織特異
的に発現している酵素に関して、スクリーニング系を確
立したい場合には、特異的に発現している組織部位のホ
モジネートを使用することができる。本発明の「担体に
反応させ、当該酵素を該担体に固相化する」とは、当該
酵素をプレート、樹脂などのビーズに上記抗体を介して
結合させ、通常の洗浄操作でははがすことのできない状
態にすることを言う。本発明の「被験物質の溶液と反応
させる」とは、阻害剤あるいは活性化剤としての性質の
期待される物質とそれらに効果、影響を調べたい酵素と
を混ぜ合わせて、活性測定のため、反応させることを言
う。本発明の「当該酵素の活性を測定する」とは、至適
条件下、適切な基質の変換させる量を測定することを言
う。酵素活性は、一定の単位として定量化されるが、こ
れは一般に、酵素の最適条件下、30度、1分間あたり1mo
lの基質を変換させる量で定義される。なお、基質が高
分子量のものであったり、モル表示しにくい場合は、別
単位が用いられることもある。
【００１５】本発明のスクリーニング方法では、後述の
ように、蛋白を付着結合させた担体をそのまま用いるこ
とができる。例えば、９６穴等のマイクロプレート上に
蛋白を固定し、スクリーニングに用いる場合は、例えば
下述のＳＰＡ法のようにして、固定化に用いたプレート
で活性の測定に至るまでのすべての操作を済ませてしま
う方法や、マルチスクリーン法及びfilter-spot法のよ
うにしてプレートのウェル内で蛋白機能の反応を進め、
反応終了後の溶液を別のプレートやフィルター上に移
し、そこで処理を行い活性測定すると言う、主に2通り
の方法で、本発明を実施することができる。
ように、蛋白を付着結合させた担体をそのまま用いるこ
とができる。例えば、９６穴等のマイクロプレート上に
蛋白を固定し、スクリーニングに用いる場合は、例えば
下述のＳＰＡ法のようにして、固定化に用いたプレート
で活性の測定に至るまでのすべての操作を済ませてしま
う方法や、マルチスクリーン法及びfilter-spot法のよ
うにしてプレートのウェル内で蛋白機能の反応を進め、
反応終了後の溶液を別のプレートやフィルター上に移
し、そこで処理を行い活性測定すると言う、主に2通り
の方法で、本発明を実施することができる。
【００１６】以上のようなスクリーニングツールを用い
た場合、例えば、可溶性蛋白としてRho-kinaseを使用す
ると、本発明のスクリーニング方法は以下のように実施
できる。まず、Rho-kinaseが結合した担体と被験物質と
を反応させ、そこにRho-kinaseの基質を反応させて基質
のリン酸化活性の阻害を指標として、本発明のRho-kina
seの活性化剤又は阻害剤を決定する。このスクリーニン
グ検出方法として、以下の４つの方法を具体的に例示す
ることができる。
た場合、例えば、可溶性蛋白としてRho-kinaseを使用す
ると、本発明のスクリーニング方法は以下のように実施
できる。まず、Rho-kinaseが結合した担体と被験物質と
を反応させ、そこにRho-kinaseの基質を反応させて基質
のリン酸化活性の阻害を指標として、本発明のRho-kina
seの活性化剤又は阻害剤を決定する。このスクリーニン
グ検出方法として、以下の４つの方法を具体的に例示す
ることができる。
【００１７】１）SPA法 ・streptavidin-PVTビーズを使用。 酵素の固定化されたプレートに、反応液（２０Mm Tris-
Cl(pH7.5)、１０mＭＭgCl2、０．１mM ATP、１．８５KB
q[32P]-ATP）３０μlと、基質としてビオチン標識ヒス
トンHF2A０．２mg／mlを添加する。反応終了時、停止液
を添加した。停止液の組成は500uM ATP、20mM EDTA、0.
1% BSA、0.1mg streptavidin-PVTビーズ。5時間静置
後、MicroBeta（Wallac社）で測定した。 ・poly-L-lysine-YSiビーズを使用（ＳＰＡ−ＹＳｉ
法）。 基質としてビオチン標識ヒストンHF2A０．２mg／mlを使
用。反応終了時、停止液を添加した。停止液の組成は50
0uM ATP、20mM EDTA、0.25mg poly-L-lysine-YSiビーズ
/150ul。2時間静置後、MicroBeta（Wallac社）で測定し
た。
Cl(pH7.5)、１０mＭＭgCl2、０．１mM ATP、１．８５KB
q[32P]-ATP）３０μlと、基質としてビオチン標識ヒス
トンHF2A０．２mg／mlを添加する。反応終了時、停止液
を添加した。停止液の組成は500uM ATP、20mM EDTA、0.
1% BSA、0.1mg streptavidin-PVTビーズ。5時間静置
後、MicroBeta（Wallac社）で測定した。 ・poly-L-lysine-YSiビーズを使用（ＳＰＡ−ＹＳｉ
法）。 基質としてビオチン標識ヒストンHF2A０．２mg／mlを使
用。反応終了時、停止液を添加した。停止液の組成は50
0uM ATP、20mM EDTA、0.25mg poly-L-lysine-YSiビーズ
/150ul。2時間静置後、MicroBeta（Wallac社）で測定し
た。
【００１８】２）マルチスクリーン法 ・TCA沈殿−PVDF膜 反応終了時、終濃度30mMのEDTAを添加し、25mM ATP50ul
と氷冷30%TCA（トリクロロ酢酸）100ulを添加しておい
たマルチスクリーンHV（Millipore社 MHVB N45）にこれ
を添加した。この上から、30%TCAを100ul添加し、30分4
℃で静置した。その後、吸引ろ過し、100ulの30%TCAで
洗浄吸引を3回行った。さらに100%エタノール100ulで洗
浄吸引し、乾燥させた。これにシンチレーションカクテ
ル（ACS-II）を20ul添加し、MicroBeta（Wallac社）で
蛍光を測定した。 ・TCA沈殿−陽イオン交換リン酸セルロース膜 反応終了時、終濃度75mMのリン酸、25mMのATPを添加
し、マルチスクリーンPH（Millipore社 MAPH M0B）に添
加した。吸引した後、75mMリン酸200ulで5回洗浄吸引
し、さらに100%エタノール100ulで洗浄吸引して乾燥さ
せた。これにシンチレーションカクテル（ACS-II）を20
ul添加し、MicroBeta（Wallac社）で蛍光を測定した。
と氷冷30%TCA（トリクロロ酢酸）100ulを添加しておい
たマルチスクリーンHV（Millipore社 MHVB N45）にこれ
を添加した。この上から、30%TCAを100ul添加し、30分4
℃で静置した。その後、吸引ろ過し、100ulの30%TCAで
洗浄吸引を3回行った。さらに100%エタノール100ulで洗
浄吸引し、乾燥させた。これにシンチレーションカクテ
ル（ACS-II）を20ul添加し、MicroBeta（Wallac社）で
蛍光を測定した。 ・TCA沈殿−陽イオン交換リン酸セルロース膜 反応終了時、終濃度75mMのリン酸、25mMのATPを添加
し、マルチスクリーンPH（Millipore社 MAPH M0B）に添
加した。吸引した後、75mMリン酸200ulで5回洗浄吸引
し、さらに100%エタノール100ulで洗浄吸引して乾燥さ
せた。これにシンチレーションカクテル（ACS-II）を20
ul添加し、MicroBeta（Wallac社）で蛍光を測定した。
【００１９】３）filter-spot法 反応終了時、終濃度75mMのリン酸、500uMのATPを添加
し、MicroBeta用フィルターP30（Wallac社、1450-523）
に15ulをスポットした。これを75mMのリン酸150mlを入
れたプラスチック容器中で振とう洗浄（10分×3）し、
電子レンジで3分間乾燥、固体シンチレーター（メルチ
レックス、Wallac社）を溶解浸潤固化してMicroBeta（W
allac社）にて測定した。
し、MicroBeta用フィルターP30（Wallac社、1450-523）
に15ulをスポットした。これを75mMのリン酸150mlを入
れたプラスチック容器中で振とう洗浄（10分×3）し、
電子レンジで3分間乾燥、固体シンチレーター（メルチ
レックス、Wallac社）を溶解浸潤固化してMicroBeta（W
allac社）にて測定した。
【００２０】上記検出方法の中で、より好ましい検出方
法としては、ＳＰＡ−ＹＳｉ法、filter-spot法を挙げ
ることができる。更に好ましい検出方法としては、ＳＰ
Ａ−ＹＳｉ法を挙げることができる。特に、ＳＰＡ−Ｙ
Ｓｉ法として、nativeなヒストンを基質として使用し、
反応産物をSPAビーズのタンパク吸着を利用してトラッ
プする方法が良好な結果を与えた。どのようなＳＰＡビ
ーズでも結合し、活性の検出が可能であったが、このう
ち高カウントが得られ尚且つ低コストな poly-L-lysine
-YSi ビーズを使用することが望ましい。以下、上記ア
ッセイ法がスクリーニングのアッセイ系として適してい
ることを示す。 ・バックグラウンド： S/N：backに対し1.85倍
（以上） （33P特有のNon Proximity Effectは除去不可）→ ア
ッセイとしては可能な範囲 ・ばらつき： 48wellのCV：10%前後 ・同等性：既知阻害剤の阻害プロファイルはSPA-YSi法
とfilter-spot法でほぼ一致した。
法としては、ＳＰＡ−ＹＳｉ法、filter-spot法を挙げ
ることができる。更に好ましい検出方法としては、ＳＰ
Ａ−ＹＳｉ法を挙げることができる。特に、ＳＰＡ−Ｙ
Ｓｉ法として、nativeなヒストンを基質として使用し、
反応産物をSPAビーズのタンパク吸着を利用してトラッ
プする方法が良好な結果を与えた。どのようなＳＰＡビ
ーズでも結合し、活性の検出が可能であったが、このう
ち高カウントが得られ尚且つ低コストな poly-L-lysine
-YSi ビーズを使用することが望ましい。以下、上記ア
ッセイ法がスクリーニングのアッセイ系として適してい
ることを示す。 ・バックグラウンド： S/N：backに対し1.85倍
（以上） （33P特有のNon Proximity Effectは除去不可）→ ア
ッセイとしては可能な範囲 ・ばらつき： 48wellのCV：10%前後 ・同等性：既知阻害剤の阻害プロファイルはSPA-YSi法
とfilter-spot法でほぼ一致した。
【００２１】本発明の第２の態様は、本発明のスクリー
ニング方法により得られる活性化剤又は阻害剤に関す
る。本発明の「活性化剤又は阻害剤」とは、該蛋白機能
の活性化又は阻害を惹き起こす物質のことである。例え
ば、該蛋白がRho-kinaseである場合、Rho-kinaseの活性
化剤又は阻害剤は、Rho-kinaseのリン酸化をコントロー
ルできる。即ち、本発明の「活性化剤」はRho-kinaseの
リン酸化を亢進し、平滑筋収縮を促すことができる。ま
た、本発明の「阻害剤」はRho-kinaseのリン酸化を抑制
し、その結果、平滑筋収縮を抑制することができる。特
に、平滑筋収縮は、高血圧症、狭心症および脳血管攣縮
等の病態に深く関与しており、Rho-kinaseの阻害剤はこ
れらの疾患に対する治療薬及び／又は予防薬になると考
えられる。例えば、Rho-kinaseの阻害剤は、降圧剤とし
て使用することができる。このように本発明のスクリー
ニング方法で得られたRho-kinase阻害剤は、平滑筋収縮
に基づく循環器系疾患の治療剤又は予防剤を選別するた
めに有用である。また本発明のRho-kinaseの阻害剤は、
Rho-kinaseのリン酸化抑制剤も提供する。本発明の「Rh
o-kinaseの阻害剤」とは、Rho-kinaseに結合して、ML
C、Myelinbasic protein、ヒストンH1、HF2A等の基質の
リン酸化を阻害する物質を指す。本発明の「Rho-kinase
の活性化剤」とは、Rho-kinaseに結合して、MLC、Myeli
n basic protein、ヒストンH1、HF2A等の基質のリン酸
化を活性化する物質を指す。
ニング方法により得られる活性化剤又は阻害剤に関す
る。本発明の「活性化剤又は阻害剤」とは、該蛋白機能
の活性化又は阻害を惹き起こす物質のことである。例え
ば、該蛋白がRho-kinaseである場合、Rho-kinaseの活性
化剤又は阻害剤は、Rho-kinaseのリン酸化をコントロー
ルできる。即ち、本発明の「活性化剤」はRho-kinaseの
リン酸化を亢進し、平滑筋収縮を促すことができる。ま
た、本発明の「阻害剤」はRho-kinaseのリン酸化を抑制
し、その結果、平滑筋収縮を抑制することができる。特
に、平滑筋収縮は、高血圧症、狭心症および脳血管攣縮
等の病態に深く関与しており、Rho-kinaseの阻害剤はこ
れらの疾患に対する治療薬及び／又は予防薬になると考
えられる。例えば、Rho-kinaseの阻害剤は、降圧剤とし
て使用することができる。このように本発明のスクリー
ニング方法で得られたRho-kinase阻害剤は、平滑筋収縮
に基づく循環器系疾患の治療剤又は予防剤を選別するた
めに有用である。また本発明のRho-kinaseの阻害剤は、
Rho-kinaseのリン酸化抑制剤も提供する。本発明の「Rh
o-kinaseの阻害剤」とは、Rho-kinaseに結合して、ML
C、Myelinbasic protein、ヒストンH1、HF2A等の基質の
リン酸化を阻害する物質を指す。本発明の「Rho-kinase
の活性化剤」とは、Rho-kinaseに結合して、MLC、Myeli
n basic protein、ヒストンH1、HF2A等の基質のリン酸
化を活性化する物質を指す。
【００２２】以下、蛋白機能の活性化剤又は阻害剤を有
効成分とする医薬組成物の投与方法、投与形態及び投与
量等につき記述する。
効成分とする医薬組成物の投与方法、投与形態及び投与
量等につき記述する。
【００２３】本発明の蛋白機能の活性化剤／又は阻害剤
が低分子化合物やタンパク質、又はペプチドである場合
は、通常知られている一般的な医薬組成物の形態とし、
経口または非経口的に投与される。一般的には以下のよ
うな投与形態、投与方法が挙げられる。
が低分子化合物やタンパク質、又はペプチドである場合
は、通常知られている一般的な医薬組成物の形態とし、
経口または非経口的に投与される。一般的には以下のよ
うな投与形態、投与方法が挙げられる。
【００２４】すなわち、経口的に投与する場合、通常当
分野で用いられる投与形態で投与することができる。非
経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、
直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与するこ
とができる。経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカ
プセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、座剤、液剤等が
挙げられる。注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸
濁液、乳剤等が挙げられ、具体的には水、水−プロピレ
ングリコール溶液、緩衝化液、0.4%の生理食塩水等が挙
げられる。さらに液状製剤とした場合は凍結保存、又は
凍結乾燥等により水分を除去して保存することができ
る。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、
再溶解して使用される。局所投与剤としては、例えばク
リーム、軟膏、ローション、経皮剤等が挙げられる。
分野で用いられる投与形態で投与することができる。非
経口的に投与する場合には、局所投与剤（経皮剤等）、
直腸投与剤、注射剤、経鼻剤等の投与形態で投与するこ
とができる。経口剤又は直腸投与剤としては、例えばカ
プセル、錠剤、ピル、散剤、ドロップ、座剤、液剤等が
挙げられる。注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸
濁液、乳剤等が挙げられ、具体的には水、水−プロピレ
ングリコール溶液、緩衝化液、0.4%の生理食塩水等が挙
げられる。さらに液状製剤とした場合は凍結保存、又は
凍結乾燥等により水分を除去して保存することができ
る。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、
再溶解して使用される。局所投与剤としては、例えばク
リーム、軟膏、ローション、経皮剤等が挙げられる。
【００２５】以上の剤形は通常当分野で行われている手
法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に製
剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤として
は、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安
定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、pH調節剤、
張度調節剤、浸潤剤等が挙げられる。また、薬学的に許
容される担体としては、例えば炭酸マグネシウム、ラク
トース、ぺクチン、澱粉、メチルセルロース等が挙げら
れる。
法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に製
剤化される。薬学的に許容される賦形剤、添加剤として
は、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安
定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、pH調節剤、
張度調節剤、浸潤剤等が挙げられる。また、薬学的に許
容される担体としては、例えば炭酸マグネシウム、ラク
トース、ぺクチン、澱粉、メチルセルロース等が挙げら
れる。
【００２６】このような医薬組成物は、治療目的の疾
患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され
得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに
投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接
局所投与することができる。また経口投与や坐薬として
の投与も可能である。
患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与され
得る。例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内などに
投与するか、又は病変の認められる組織そのものに直接
局所投与することができる。また経口投与や坐薬として
の投与も可能である。
【００２７】投与量、投与回数は患者の症状、年齢、体
重、投与形態等によって異なるが、通常は成人に対し1
日あたり約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好まし
くは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数
回に分けて投与することができる。
重、投与形態等によって異なるが、通常は成人に対し1
日あたり約０．０００１〜約５００ｍｇの範囲、好まし
くは約０．００１〜約１００ｍｇの範囲を１回または数
回に分けて投与することができる。
【００２８】本発明の第３の態様は蛋白質の単離精製方
法に関する（以下本発明精製方法と略記する場合があ
る）。本発明精製方法での「固相化した当該蛋白を遊離
させる」とは、pH、塩濃度等の公知の手段を使用して固
相化した当該蛋白を遊離することである。例えば、抗体
と目的とする蛋白の結合親和性次第では、抗体を調製す
る際に用いた抗原ペプチド溶液により固相化された蛋白
を効率的に遊離させることができる。例えば蛋白がRho-
kinaseの場合、前記したRho-kinaseが付着した担体を充
填したカラムにより、抗原に使用した部分ペプチドを含
む溶液を該カラムに流下させることにより、その流出液
から高純度のRho-kinaseを精製することができる。この
ように本発明精製方法は、不安定な蛋白例えば、Rho-ki
nase蛋白等の単離精製方法として有用であり、この方法
により大量に精製して得られるウシ型Rho-kinase蛋白等
が提供できる。
法に関する（以下本発明精製方法と略記する場合があ
る）。本発明精製方法での「固相化した当該蛋白を遊離
させる」とは、pH、塩濃度等の公知の手段を使用して固
相化した当該蛋白を遊離することである。例えば、抗体
と目的とする蛋白の結合親和性次第では、抗体を調製す
る際に用いた抗原ペプチド溶液により固相化された蛋白
を効率的に遊離させることができる。例えば蛋白がRho-
kinaseの場合、前記したRho-kinaseが付着した担体を充
填したカラムにより、抗原に使用した部分ペプチドを含
む溶液を該カラムに流下させることにより、その流出液
から高純度のRho-kinaseを精製することができる。この
ように本発明精製方法は、不安定な蛋白例えば、Rho-ki
nase蛋白等の単離精製方法として有用であり、この方法
により大量に精製して得られるウシ型Rho-kinase蛋白等
が提供できる。
【００２９】本発明の第４の態様は、スクリーニングあ
るいは蛋白精製用の担体（以下本発明担体と略記する場
合がある）とその作成方法又はスクリーニング用の可溶
性蛋白質又は可溶化可能な蛋白質固定化担体に関する
（以下本発明固定化担体と略記する場合がある）。本発
明担体は通常担体として使用されるものであれば特に限
定されるものではない。例えば、９６穴のマイクロプレ
ート、樹脂などのビーズ等が挙げられる。本発明担体の
作製方法は、該蛋白の部分ペプチドを抗原とする抗体
（１次抗体）の抗原性を損なわないようにデザインされ
た抗体（２次抗体）を固相化して作製する。例えば、該
蛋白がRho-kinaseの場合、例えばウサギ抗ヤギIgG/Fcに
抗Rho-kinase抗体を加え１次抗体とし、抗Rho-kinase抗
体をそのFcフラグメントを認識する２次抗体を介して固
相化してプレートとを作成する。
るいは蛋白精製用の担体（以下本発明担体と略記する場
合がある）とその作成方法又はスクリーニング用の可溶
性蛋白質又は可溶化可能な蛋白質固定化担体に関する
（以下本発明固定化担体と略記する場合がある）。本発
明担体は通常担体として使用されるものであれば特に限
定されるものではない。例えば、９６穴のマイクロプレ
ート、樹脂などのビーズ等が挙げられる。本発明担体の
作製方法は、該蛋白の部分ペプチドを抗原とする抗体
（１次抗体）の抗原性を損なわないようにデザインされ
た抗体（２次抗体）を固相化して作製する。例えば、該
蛋白がRho-kinaseの場合、例えばウサギ抗ヤギIgG/Fcに
抗Rho-kinase抗体を加え１次抗体とし、抗Rho-kinase抗
体をそのFcフラグメントを認識する２次抗体を介して固
相化してプレートとを作成する。
【００３０】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定される
ものではない。
るが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定される
ものではない。
【００３１】実施例1抗Rho-kinase抗体作成のための部分ペプチドの調製 ウシ脳Rho-kinaseのアミノ酸配列の疎水性分析（Kyte &
Doolittle法）により行った。すると、Rho-kinaseの触
媒領域（Catalytic domain）の位置するN-末領域と反対
の、C-末領域に非常に親水性の高い領域のあることが見
出された（図３）。そこで、C-末付近20アミノ酸配列
（ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳＲＱＬＡＰＮＫＰＳ）を取り
上げ、この配列をGenBankデータベースに対してBlast s
earchを行ったところ、ホモロジーを有するものは、様
々な種のRho-kinase（ヒト（GenBank accession番号：D
87931、AB014519）、マウス（ GenBank accession番
号：U58513）、ラット（ GenBank accession番号：U384
81）、ウシ（ GenBank accession番号：U36909）、アフ
リカ爪蛙（ GenBank accession番号：AF037073））のみ
で、他の分子へのホモロジーは見出されなかった。この
配列中には、Lysineのε-アミノ基が1つ存在しているの
みで、N末とのキャリアー蛋白との結合物を得ること
が、それほど難しくないと判断されたので、これを抗原
として選択することとした。
Doolittle法）により行った。すると、Rho-kinaseの触
媒領域（Catalytic domain）の位置するN-末領域と反対
の、C-末領域に非常に親水性の高い領域のあることが見
出された（図３）。そこで、C-末付近20アミノ酸配列
（ＩＱＱＮＱＳＩＲＲＰＳＲＱＬＡＰＮＫＰＳ）を取り
上げ、この配列をGenBankデータベースに対してBlast s
earchを行ったところ、ホモロジーを有するものは、様
々な種のRho-kinase（ヒト（GenBank accession番号：D
87931、AB014519）、マウス（ GenBank accession番
号：U58513）、ラット（ GenBank accession番号：U384
81）、ウシ（ GenBank accession番号：U36909）、アフ
リカ爪蛙（ GenBank accession番号：AF037073））のみ
で、他の分子へのホモロジーは見出されなかった。この
配列中には、Lysineのε-アミノ基が1つ存在しているの
みで、N末とのキャリアー蛋白との結合物を得ること
が、それほど難しくないと判断されたので、これを抗原
として選択することとした。
【００３２】実施例２抗体の調製 A.抗原ペプチドのキャリアー蛋白への結合抗原ペプチド
をPBSに溶解し5 mg/mlの溶液を調製する。キャリア蛋白
として卵白アルブミン1 mg/ml溶液を調製し、この2 ml
に抗原ペプチド溶液5〜10 μl添加し、よく攪拌する。
ここに、PBSにて調製した0.2%グルタルアルデヒド溶液
等量を少量ずつ添加し、1時間室温で攪拌する。PBSにて
調製した1Mグリシン溶液を終濃度200 mMまで添加し、更
に1時間攪拌する。PBSに対して限外濾過しあるいは透析
を繰り返す。 B. ウサギへの抗原ペプチドの免疫 体重2.5 kg程度のウサギに抗原として準備したペプチド
−卵白アルブミン複合体10 mg/mlをFreund完全アジュバ
ントと1:1で試験管内で混合し、超音波で十分（20秒〜1
分）攪拌する。油中水（water-in-oil）状態のエマルジ
ョンになったことを確認する。このエマルジョンに等量
の2% Tween 80-生理食塩水を加え、試験管内で更に超音
波で20秒間攪拌する。これを注射筒に入れ、ウサギの皮
下に数個所（両脊側部、臀部など）に注射する。1個所
0.2 ml程注射する。以後、2週間おきに3回同様の注射を
行なう。最終注射より2週間後に耳介静脈より採血し、
血清を調製しその抗体価のチェックをELISAにより行
う。十分な抗体価が確認されれば全採血を行ない、血清
を調製する。 C. IgG画分のプロテインA-Sepaharoseによる精製 血清をPBSで2倍に希釈し、プロテインA-Sepaharose CL-
4Bカラムにのせる。流速30 ml/hrで流し続ける。ゲルに
結合しない蛋白をPBSでよく洗い流し、0.1 Mグリシン塩
酸緩衝液 (pH2.8)で結合したIgGを溶出させる。溶出液
をNaOHで中和し、PBSに対して透析し、調製する。
をPBSに溶解し5 mg/mlの溶液を調製する。キャリア蛋白
として卵白アルブミン1 mg/ml溶液を調製し、この2 ml
に抗原ペプチド溶液5〜10 μl添加し、よく攪拌する。
ここに、PBSにて調製した0.2%グルタルアルデヒド溶液
等量を少量ずつ添加し、1時間室温で攪拌する。PBSにて
調製した1Mグリシン溶液を終濃度200 mMまで添加し、更
に1時間攪拌する。PBSに対して限外濾過しあるいは透析
を繰り返す。 B. ウサギへの抗原ペプチドの免疫 体重2.5 kg程度のウサギに抗原として準備したペプチド
−卵白アルブミン複合体10 mg/mlをFreund完全アジュバ
ントと1:1で試験管内で混合し、超音波で十分（20秒〜1
分）攪拌する。油中水（water-in-oil）状態のエマルジ
ョンになったことを確認する。このエマルジョンに等量
の2% Tween 80-生理食塩水を加え、試験管内で更に超音
波で20秒間攪拌する。これを注射筒に入れ、ウサギの皮
下に数個所（両脊側部、臀部など）に注射する。1個所
0.2 ml程注射する。以後、2週間おきに3回同様の注射を
行なう。最終注射より2週間後に耳介静脈より採血し、
血清を調製しその抗体価のチェックをELISAにより行
う。十分な抗体価が確認されれば全採血を行ない、血清
を調製する。 C. IgG画分のプロテインA-Sepaharoseによる精製 血清をPBSで2倍に希釈し、プロテインA-Sepaharose CL-
4Bカラムにのせる。流速30 ml/hrで流し続ける。ゲルに
結合しない蛋白をPBSでよく洗い流し、0.1 Mグリシン塩
酸緩衝液 (pH2.8)で結合したIgGを溶出させる。溶出液
をNaOHで中和し、PBSに対して透析し、調製する。
【００３３】実施例3抗Rho kinase抗体による免疫沈降物中のRho kinase活性
の評価材料および方法 （材料） ・GST-RhoA（Cat. No.555466 CALBIOCHEM社） ・牛の脳（白井松（株）） ・ヤギ由来抗Rho-kinaseぺプチド抗体（Lot:#079, 200
μg/μl Santa Cruz Biotechnology社） ・ウサギ抗ヤギIgG（Fc）抗体（Lot:19030542,2.4mg/ml
CHEMICON社） ・ELISAプレート：Nunc社より購入抗Rho-kinaseペプチド抗体を用いた免疫沈降産物の調製 牛の脳抽出画分は、以下の様に調製された。すなわち、
牛の脳より灰白質を回収し、ハサミで細断の後、ＩＰバ
ッファーに懸濁した。その懸濁液をテフロン（登録商
標）製のホモジェナイザーで組織を破砕し、15Ｋ rpmで
15分間の遠心を行った。上清を回収し、さらに35Ｋ rp
m、60分間の超遠心を行った。その上清液を脳抽出画分
（組織ホモジェネート）とした。次に、脳抽出画分1ｍ
ｇを、IPバッファーにて1mlに希釈し、抗Rho-kinaseペ
プチドポリクローナル抗体を0.1ug（0.5ul）添加した。
4℃で1.5hrゆるやかに振とうし、Protein G PLUS-agaro
se（SC-2002、Santa Cruz社）を15ul加えてさらに4℃で
1.5hr振とうした。これを冷却遠心機で10,000rpmで30se
c遠心し、上清を除去した。沈殿したアガロースビーズ
を1mlのIPバッファーで3回洗浄し、Kバッファーで2回洗
浄した。これを1反応チューブに全量用いた。 IPバッファー： 20mM Tris・Cl(pH7.5) 150mM NaCl
20mM NaF 1mM EDTA 1mM EGTA 0.2mM PMSF Kバッファー： 50mM Tris・Cl(pH7.5) 150mM NaCl 5
mM MgCl2 抗Rho-kinase抗体用量依存性を調べる目的で、種々の抗
体用量による免疫沈降物中のRho kinase活性を基質Hist
one HF2Aを用いて測定した。抗体の量をウシ脳抽出画分
1 mgに対し、1/500希釈 (2 ug)、1/2500希釈 (0.4ug)、
1/10000希釈 (0.1 ug)の用量で免疫沈降を行い、リン酸
化反応を行った。その結果、抗体量に依存してリン酸化
の上昇が検出された（図４）。一方、1/500、1/2500お
よび1/10000希釈となるように抗体を添加して得られた
免疫沈降産物をSDS-PAGEで電気泳動し、ウエスタンブロ
ッティングの後、抗Rho-kinase抗体（マウス由来モノク
ローナル抗体、Transduction Laboratory社より入手）
で染色したところ、160 kDa付近にRho-kinaseのバンド
が検出され、抗体用量依存的にRho-kinaseが回収されて
いることが確認された (図５)。
の評価材料および方法 （材料） ・GST-RhoA（Cat. No.555466 CALBIOCHEM社） ・牛の脳（白井松（株）） ・ヤギ由来抗Rho-kinaseぺプチド抗体（Lot:#079, 200
μg/μl Santa Cruz Biotechnology社） ・ウサギ抗ヤギIgG（Fc）抗体（Lot:19030542,2.4mg/ml
CHEMICON社） ・ELISAプレート：Nunc社より購入抗Rho-kinaseペプチド抗体を用いた免疫沈降産物の調製 牛の脳抽出画分は、以下の様に調製された。すなわち、
牛の脳より灰白質を回収し、ハサミで細断の後、ＩＰバ
ッファーに懸濁した。その懸濁液をテフロン（登録商
標）製のホモジェナイザーで組織を破砕し、15Ｋ rpmで
15分間の遠心を行った。上清を回収し、さらに35Ｋ rp
m、60分間の超遠心を行った。その上清液を脳抽出画分
（組織ホモジェネート）とした。次に、脳抽出画分1ｍ
ｇを、IPバッファーにて1mlに希釈し、抗Rho-kinaseペ
プチドポリクローナル抗体を0.1ug（0.5ul）添加した。
4℃で1.5hrゆるやかに振とうし、Protein G PLUS-agaro
se（SC-2002、Santa Cruz社）を15ul加えてさらに4℃で
1.5hr振とうした。これを冷却遠心機で10,000rpmで30se
c遠心し、上清を除去した。沈殿したアガロースビーズ
を1mlのIPバッファーで3回洗浄し、Kバッファーで2回洗
浄した。これを1反応チューブに全量用いた。 IPバッファー： 20mM Tris・Cl(pH7.5) 150mM NaCl
20mM NaF 1mM EDTA 1mM EGTA 0.2mM PMSF Kバッファー： 50mM Tris・Cl(pH7.5) 150mM NaCl 5
mM MgCl2 抗Rho-kinase抗体用量依存性を調べる目的で、種々の抗
体用量による免疫沈降物中のRho kinase活性を基質Hist
one HF2Aを用いて測定した。抗体の量をウシ脳抽出画分
1 mgに対し、1/500希釈 (2 ug)、1/2500希釈 (0.4ug)、
1/10000希釈 (0.1 ug)の用量で免疫沈降を行い、リン酸
化反応を行った。その結果、抗体量に依存してリン酸化
の上昇が検出された（図４）。一方、1/500、1/2500お
よび1/10000希釈となるように抗体を添加して得られた
免疫沈降産物をSDS-PAGEで電気泳動し、ウエスタンブロ
ッティングの後、抗Rho-kinase抗体（マウス由来モノク
ローナル抗体、Transduction Laboratory社より入手）
で染色したところ、160 kDa付近にRho-kinaseのバンド
が検出され、抗体用量依存的にRho-kinaseが回収されて
いることが確認された (図５)。
【００３４】実施例4抗Rho kinase抗体による免疫沈降物中のRho kinase活性
のRhoA依存性 Rho-kinaseは、 活性型RhoAの添加により、リン酸化反
応が1.5-2倍亢進されることが知られている（Matsui T.
et al., EMBO. J 15, 2208-2216, 1996）。そこで、免
疫沈降物中のRho-kinaseの反応性を調べるた。すると、
GTPγSにより活性化されたGST-RhoAを添加すると、GDP
により活性を消失しているGST-RhoAを添加した場合に比
べて、約1.5倍程度のリン酸化亢進が認められた（図
６）。
のRhoA依存性 Rho-kinaseは、 活性型RhoAの添加により、リン酸化反
応が1.5-2倍亢進されることが知られている（Matsui T.
et al., EMBO. J 15, 2208-2216, 1996）。そこで、免
疫沈降物中のRho-kinaseの反応性を調べるた。すると、
GTPγSにより活性化されたGST-RhoAを添加すると、GDP
により活性を消失しているGST-RhoAを添加した場合に比
べて、約1.5倍程度のリン酸化亢進が認められた（図
６）。
【００３５】実施例5抗Rho-kinase抗体を固相化したプレートの調製条件 （Rho-kinaseの固相化担体の作製）イムノプレートII
（Nunc社、442404、高結合能）またはフルオレッセンス
/ルミネッセンスソリッドアッセイプレート（COSTAR
社、3922白色）にウサギ抗ヤギIgG/Fc（ケミコン社、AP
127）をPBS(-)で希釈して50ul分注した。室温で1.5hr静
置した後、これを除きブロッキング溶液200ul（ブロッ
クエース（大日本製薬UK-B25）1/4希釈PBS(-)）を加え
て攪拌した。さらに室温で1.5hr静置した後、PBST（0.0
5%Tween20/PBS(-)）にて200ul×3回洗浄し、0.1ug/50ul
PBS(-)の抗Rho-kinase抗体を添加した。室温で1.5hr静
置した後、PBSTで200ul×3回洗浄し、1.5mg/mlのウシ脳
ライセートを50ul入れ、4℃で一晩静置した。これをPBS
Tで200ul×2回洗浄し、PBS(-)200ulで1回洗浄して固相
化プレートとした。抗Rho-kinase抗体をそのFcフラグメ
ントを認識する二次抗体を介してELISAプレートに固定
化し、ヒストンHF2Aを基質としてリン酸化反応を試み
た。二次抗体を1/1,000、1/300および1/100希釈でプレ
ートに固定化し、抗Rho-kinase抗体(一次抗体）は、免
疫沈降法で検出できた1/10,000希釈で用いた。その結
果、二次抗体だけが固定化されたウェルでは、約100 rp
m以下の放射能活性を示すが、抗Rho-kinase抗体を用い
たウェルでは、二次抗体の用量依存性的に約500-800 rp
mの放射活性が検出された(図７)。一方、抗Rho-kinase
抗体 1/10,000 (0.1 ug)のみをELISAプレート上に固定
化し、上記に示されたようにリン酸化反応を行った。そ
の結果、放射能活性はコントロールのレベルを上回らな
かった。以上より、抗Rho-kinase抗体をELISAプレート
に固定化し、Rho-kinase活性を捉えるためには、直接プ
レートに本抗体を固相化させるのではなく、2次抗体を
介して固相化した方が好ましいと考えられた。この至適
条件は、抗Rho-kinase抗体は 1/10,000 (0.1 ug)、2次
抗体は1/300であった。直接プレートに抗Rho-kinase抗
体を固相化しても、活性を捉えることのできなかった原
因としては、抗原認識部位がなんらかの立体障害が生じ
たことが考えられる。 ＜実施例6＞抗Rho-kinase抗体固相化プレートへのRho-kinase結合の
抗原ペプチドによる阻害 実施例5により至適化された条件で、ウシ脳抽出物中のR
ho-kinaseを固相化する際、その抽出物中に抗Rho-kinas
e抗体を調製する際に用いた抗原ペプチドを種々の濃度
で添加した。すると、濃度依存的にRho-kinaseの固相化
が阻害された（図８）。3.5 uMのペプチドの添加により
ほぼ100% 固相化が阻害された。又、IC50は 0.35 uMで
あった。
（Nunc社、442404、高結合能）またはフルオレッセンス
/ルミネッセンスソリッドアッセイプレート（COSTAR
社、3922白色）にウサギ抗ヤギIgG/Fc（ケミコン社、AP
127）をPBS(-)で希釈して50ul分注した。室温で1.5hr静
置した後、これを除きブロッキング溶液200ul（ブロッ
クエース（大日本製薬UK-B25）1/4希釈PBS(-)）を加え
て攪拌した。さらに室温で1.5hr静置した後、PBST（0.0
5%Tween20/PBS(-)）にて200ul×3回洗浄し、0.1ug/50ul
PBS(-)の抗Rho-kinase抗体を添加した。室温で1.5hr静
置した後、PBSTで200ul×3回洗浄し、1.5mg/mlのウシ脳
ライセートを50ul入れ、4℃で一晩静置した。これをPBS
Tで200ul×2回洗浄し、PBS(-)200ulで1回洗浄して固相
化プレートとした。抗Rho-kinase抗体をそのFcフラグメ
ントを認識する二次抗体を介してELISAプレートに固定
化し、ヒストンHF2Aを基質としてリン酸化反応を試み
た。二次抗体を1/1,000、1/300および1/100希釈でプレ
ートに固定化し、抗Rho-kinase抗体(一次抗体）は、免
疫沈降法で検出できた1/10,000希釈で用いた。その結
果、二次抗体だけが固定化されたウェルでは、約100 rp
m以下の放射能活性を示すが、抗Rho-kinase抗体を用い
たウェルでは、二次抗体の用量依存性的に約500-800 rp
mの放射活性が検出された(図７)。一方、抗Rho-kinase
抗体 1/10,000 (0.1 ug)のみをELISAプレート上に固定
化し、上記に示されたようにリン酸化反応を行った。そ
の結果、放射能活性はコントロールのレベルを上回らな
かった。以上より、抗Rho-kinase抗体をELISAプレート
に固定化し、Rho-kinase活性を捉えるためには、直接プ
レートに本抗体を固相化させるのではなく、2次抗体を
介して固相化した方が好ましいと考えられた。この至適
条件は、抗Rho-kinase抗体は 1/10,000 (0.1 ug)、2次
抗体は1/300であった。直接プレートに抗Rho-kinase抗
体を固相化しても、活性を捉えることのできなかった原
因としては、抗原認識部位がなんらかの立体障害が生じ
たことが考えられる。 ＜実施例6＞抗Rho-kinase抗体固相化プレートへのRho-kinase結合の
抗原ペプチドによる阻害 実施例5により至適化された条件で、ウシ脳抽出物中のR
ho-kinaseを固相化する際、その抽出物中に抗Rho-kinas
e抗体を調製する際に用いた抗原ペプチドを種々の濃度
で添加した。すると、濃度依存的にRho-kinaseの固相化
が阻害された（図８）。3.5 uMのペプチドの添加により
ほぼ100% 固相化が阻害された。又、IC50は 0.35 uMで
あった。
【００３６】実施例７Rho-kinase固相化プレートを用いた、Rho-kinase阻害剤
の効果の検討 （被験化合物の溶液調製と、実施例５の固相化プレート
との反応） 被験化合物の溶液調製 被験化合物の溶液と基質を用いる実施例3の固相化プ
レートとの反応 反応液組成は、以下に示す。 20mM Tris・Cl(pH7.5) 10mM MgCl2 0.1uM ATP 0.2mg/ml
histone HF2A1.85KBq [33P]ATP /30ul 上記反応液を用いて、Rho-kinase固相化プレートに30ul
添加して反応開始とした。反応時間は4hr行なった。 （活性評価方法／リン酸化活性の評価法）SPAマルチス
クリーン法で評価をおこなった。Rho-kinaseの阻害剤と
してFasudil（ HA1077、旭化成）、Y-27632（吉富製
薬）が知られている。そこで、抗体プレートアッセイ系
で検出されているリン酸化反応の放射能活性が、Rho-ki
naseに依存した活性であることを確認するために、これ
らの阻害剤を用いて、その阻害効果を調べた。その阻害
効果は、IC50値でそれぞれ、0.56 uM、0.35 uMであっ
た。また、chelerythrineの効果は、11 uMでった。ROKa
/ROK-II, active Cat (Upstate社)を入手し、同様のア
ッセイ条件で、これら３つの阻害剤の効果を調べたとこ
ろ、IC50値は、0.1.5 uM、0.79 uM、11 uMとほぼ同様の
値を示した。結果を表１、図９に示す。
の効果の検討 （被験化合物の溶液調製と、実施例５の固相化プレート
との反応） 被験化合物の溶液調製 被験化合物の溶液と基質を用いる実施例3の固相化プ
レートとの反応 反応液組成は、以下に示す。 20mM Tris・Cl(pH7.5) 10mM MgCl2 0.1uM ATP 0.2mg/ml
histone HF2A1.85KBq [33P]ATP /30ul 上記反応液を用いて、Rho-kinase固相化プレートに30ul
添加して反応開始とした。反応時間は4hr行なった。 （活性評価方法／リン酸化活性の評価法）SPAマルチス
クリーン法で評価をおこなった。Rho-kinaseの阻害剤と
してFasudil（ HA1077、旭化成）、Y-27632（吉富製
薬）が知られている。そこで、抗体プレートアッセイ系
で検出されているリン酸化反応の放射能活性が、Rho-ki
naseに依存した活性であることを確認するために、これ
らの阻害剤を用いて、その阻害効果を調べた。その阻害
効果は、IC50値でそれぞれ、0.56 uM、0.35 uMであっ
た。また、chelerythrineの効果は、11 uMでった。ROKa
/ROK-II, active Cat (Upstate社)を入手し、同様のア
ッセイ条件で、これら３つの阻害剤の効果を調べたとこ
ろ、IC50値は、0.1.5 uM、0.79 uM、11 uMとほぼ同様の
値を示した。結果を表１、図９に示す。
【００３７】
【表１】 前の 2者の阻害剤は、Ki値（今回の反応条件に関して
は、Ki=IC50）がFasudilに関しては 0.33 uM、Y-27632
に関しては 0.14 uMと報告されている（Uehera M.et a
l., Nature 389, 990-994, 1997）。本実施例のIC50値
は、この文献値とほぼ同値を示した。このように、Rho-
kinaseを単離精製し、それを用いて阻害剤との阻害活性
を量った文献値と、本発明のスクリーニング方法の測定
値が一致したことから、本発明のスクリーニング方法の
有用性が確認できた。即ち、Rho-kinaseのような不安定
で単離が困難で、その結果大量に取得することが困難な
酵素蛋白質に関して、効率的にスクリーニングを進める
方法が確立できたことが示された。
は、Ki=IC50）がFasudilに関しては 0.33 uM、Y-27632
に関しては 0.14 uMと報告されている（Uehera M.et a
l., Nature 389, 990-994, 1997）。本実施例のIC50値
は、この文献値とほぼ同値を示した。このように、Rho-
kinaseを単離精製し、それを用いて阻害剤との阻害活性
を量った文献値と、本発明のスクリーニング方法の測定
値が一致したことから、本発明のスクリーニング方法の
有用性が確認できた。即ち、Rho-kinaseのような不安定
で単離が困難で、その結果大量に取得することが困難な
酵素蛋白質に関して、効率的にスクリーニングを進める
方法が確立できたことが示された。
【００３８】
【発明の効果】本発明により、不安定で単離が困難な酵
素蛋白を用いた活性化剤又は阻害剤のスクリーニング方
法、及び当該スクリーニングのためのスクリーニングツ
ールなどを提供することができる。また、Rho-kinaseは
平滑筋収縮に関連する酵素蛋白であるので、本発明のス
クリーニング方法により得られるRho-kinaseの阻害剤ト
は、平滑筋収縮抑制作用を示し、高血圧等の平滑筋収縮
が関与する循環器系疾患の治療剤又は予防剤として有用
である。
素蛋白を用いた活性化剤又は阻害剤のスクリーニング方
法、及び当該スクリーニングのためのスクリーニングツ
ールなどを提供することができる。また、Rho-kinaseは
平滑筋収縮に関連する酵素蛋白であるので、本発明のス
クリーニング方法により得られるRho-kinaseの阻害剤ト
は、平滑筋収縮抑制作用を示し、高血圧等の平滑筋収縮
が関与する循環器系疾患の治療剤又は予防剤として有用
である。
【図１】抗Rho-kinase抗体作製のための抗原ペプチドと
して使用するRho-kinaseの部分アミノ酸配列の一例およ
びその存在位置を示す図である。
して使用するRho-kinaseの部分アミノ酸配列の一例およ
びその存在位置を示す図である。
【図２】Rho-kinaseを用いて例示される本発明のアッセ
イ系の反応原理を示す模式図である。
イ系の反応原理を示す模式図である。
【図３】ウシRho-kinaseの疎水性分析結果を示す図であ
る。
る。
【図４】本発明のアッセイ系における抗Rho-kinase抗体
用量依存性（リン酸化反応）を示す図である。
用量依存性（リン酸化反応）を示す図である。
【図５】本発明の固層化相体により回収されるRho-kina
seの抗Rho-kinase抗体用量依存性を示す図である。
seの抗Rho-kinase抗体用量依存性を示す図である。
【図６】免疫沈降物中のRho-kinaseの反応性を示す図で
ある。
ある。
【図７】本発明のアッセイ系における２次抗体の用量依
存性を示す図である。
存性を示す図である。
【図８】抗原ペプチドによるRho-kinase酵素の固相化に
対する阻害効果を示す図である。
対する阻害効果を示す図である。
【図９】本発明のスクリーニング系におけるRho-kinase
阻害剤の効果の濃度依存性を示す図である。
阻害剤の効果の濃度依存性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 11/02 11/02 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣＣ Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣＣＺ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ 33/573 33/573 Ａ 33/58 33/58 Ｚ 37/00 １０３ 37/00 １０３ (72)発明者 合田 昌央 大阪市此花区春日出中三丁目１番98号 住 友製薬株式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 DA36 DA77 FB01 FB03 FB08 FB15 4B033 NA02 NA23 NB62 NB63 NC02 ND03 ND05 ND12 4B050 CC07 DD11 FF16E LL01 4B063 QA01 QQ02 QQ08 QR07 QR48 QR66 QR83 QR84 QS15 QS36 QX02 QX07 4C084 AA19 NA14 ZA232 ZA362 ZA402 ZA422 ZC202
Claims (29)
- 【請求項１】 次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶化
可能な蛋白の蛋白機能の活性化剤又は阻害剤のスクリー
ニング方法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白機能の活性が失活する
ことがない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6) 当該蛋白の
固相化された上記(4)で得られた担体を使用して、被験
物質の溶液と反応させる、(7)反応終了後、当該蛋白の
活性を測定することにより、被験物質の蛋白機能の活性
に対する効果を調べる。 - 【請求項２】 可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白が可溶
化酵素である請求項１記載のスクリーニング方法。 - 【請求項３】 可溶酵素がセリン／スレオニンキナーゼ
系酵素である、請求項１または２記載のスクリーニング
方法。 - 【請求項４】 可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白の蛋白
機能の活性を基質への32Ｐまたは33Ｐの取り込みで評価
するため、リンの放射化活性を指標として効果を調べる
こと、あるいはリン酸化基質に対する抗体の結合を指標
として効果を調べることからなる、請求項１記載のスク
リーニング方法。 - 【請求項５】 蛋白機能の活性を測定する方法として、
次の方法で被験物質の効果を判定することからなる、請
求項４記載のスクリーニング方法。 a)ＳＰＡ(Scintillation Proximity Assay)法 b)マルチスクリーン(Multiscreen)法 c)フィルター・スポット(filter-spot)法 - 【請求項６】 セリン／スレオニンキナーゼ系酵素がRh
o-kinase酵素である、請求項３記載のスクリーニング方
法。 - 【請求項７】 Rho-kinase酵素がウシ、マウスあるいは
ラット由来のRho-kinaseである請求項６記載のスクリー
ニング方法。 - 【請求項８】 組織ホモジネートがウシの脳灰白質由来
の組織ホモジネートである請求項１〜７に記載のスクリ
ーニング方法。 - 【請求項９】 可溶性蛋白質がRho-kinaseであり、部分
ペプチドがRho-kinaseのＣ末部分の２０アミノ酸残基か
らなるペプチドである、請求項１〜８のいずれかに記載
のスクリーニング方法。 - 【請求項１０】 部分ペプチドが、ＩＱＱＮＱＳＩＲＲ
ＰＳＲＱＬＡＰＮＫＰＳの２０アミノ酸残基からなるペ
プチドである、請求項１〜９のいずれかに記載のスクリ
ーニング方法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか１項に記載
のスクリーニング方法により得られる蛋白機能の活性化
剤又は阻害剤。 - 【請求項１２】 蛋白がRho-kinaseである請求項１１記
載の活性化剤又は阻害剤。 - 【請求項１３】 蛋白がウシRho-kinaseである請求項１
２記載の活性化剤又は阻害剤。 - 【請求項１４】 請求項１１〜１３記載の活性化剤又は
阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物。 - 【請求項１５】 請求項１２記載のRho-kinaseの阻害剤
を有効成分として含有するリン酸化反応抑制剤。 - 【請求項１６】 請求項１２記載のRho-kinaseの阻害剤
を有効成分として含有する平滑筋収縮抑制剤。 - 【請求項１７】 請求項１６記載の平滑筋収縮抑制剤を
有効成分として含んでなる医薬組成物。 - 【請求項１８】 請求項１２記載のRho-kinaseの阻害剤
を有効成分として含有する、高血圧症あるいは狭心症、
脳血管攣縮の疾患治療剤。 - 【請求項１９】 請求項１２記載のRho-kinaseの活性化
剤を有効成分として含有するリン酸化反応促進剤。 - 【請求項２０】 請求項１２記載のRho-kinaseの活性化
剤を有効成分として含有する平滑筋収縮促進剤。 - 【請求項２１】 次の工程からなる可溶性蛋白又は可溶
化可能な蛋白の精製方法： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白活性が失活することが
ない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネート
あるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反応
させ、当該蛋白を該担体に固相化する、(6)固定化した
当該蛋白を遊離させ回収する。 - 【請求項２２】 可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白がRh
o-kinase蛋白である、請求項２１記載の蛋白質精製方
法。 - 【請求項２３】 可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白がウ
シあるいはラット由来のRho-kinase蛋白である、請求項
２１記載の蛋白質精製方法。 - 【請求項２４】 以下の方法で調製されるスクリーニン
グあるいは蛋白精製用担体： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白活性が失活することが
ない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／Ｍ
以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する抗
体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で作
成された抗体(Ig)を固相化する。 - 【請求項２５】 可溶化蛋白質がRho-kinase蛋白であ
る、請求項２４記載の担体。 - 【請求項２６】 以下の方法で調製されるスクリーニン
グ用の可溶性蛋白又は可溶化可能な蛋白固定化担体： (1)該蛋白のアミノ酸配列の中で、次の性質を示す部分
ペプチドを合成し、これを抗原として抗体を作成する、 該蛋白の属するファミリーの中で、当該蛋白に特異的
なアミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配列は少なくとも６個以上のアミノ酸から
なり、親水性が高い領域に存在する、 該アミノ酸配列はキャリヤー蛋白質と結合できる官能
基を有する、 該アミノ酸配列の部分ペプチドを抗原とする抗体と当
該蛋白との反応により、当該蛋白活性が失活することが
ない、 (2)該部分ペプチドを抗原として、親和性が１０５／μ
Ｍ以下の抗体を作成する、(3)上記の抗体(Ig)に対する
抗体を固相化した担体を作成する、(4)上記担体に(1)で
作成された抗体(Ig)を固相化する、(5)細胞ホモジネー
トあるいは組織ホモジネートを(3)で得られた担体に反
応させ、当該蛋白を該担体に固相化する。 - 【請求項２７】 可溶性蛋白質がRho-kinaseである請求
項２６記載のスクリーニング用Rho-kinase固定化担体プ
レート。 - 【請求項２８】 組織ホモジネートがウシの脳灰白質由
来の組織ホモジネート、あるいはラットの脳由来の組織
ホモジネートである、請求項２７のRho-kinase固定化担
体プレート。 - 【請求項２９】 Rho-kinaseがウシRho-kinaseである、
請求項２７、２８記載のRho-kinase固定化担体プレー
ト。
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