JP4777785B2 - ケモカインレセプターccr5のn末端領域に対する抗体酵素 - Google Patents
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Samson,M., Libert,F.,Doranz,B,J.,et al. Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene.(1996)Nature.382:722-725. Lee,B.,Sharron,M.,Blanpain,C.,et al. Epitope Mapping or CCR5 Reveals Multiple Conformational States and Distinct but Overlapping Structures Involved in Chemokine and Coreceptor Function.(1999)J.Biol.Chem.274:9617-9626 「ケンモカインハンドブック」義江修 野見山尚行 宮坂昌之 監修(秀潤社)、200年11月20日発行 村上務、山本直樹著:タンパク質 核酸 酵素、Vol.43、677-685頁(1998年)、「新しい抗HIV薬剤の開発−HIVのコレセプター(セカンドレセプター)に作用する薬剤」
ここでは、本発明にかかる抗体酵素の一例として、ケモカインレセプターCCR5のN末端領域に対するモノクローナル抗体「5A2」、「6A2」および「2B8」の抗体断片を例に挙げて説明する。なお、以下の説明において、「ケモカインレセプターCCR5のN末端領域に対するモノクローナル抗体5A2」のことを「5A2」と、「ケモカインレセプターCCR5のN末端領域に対するモノクローナル抗体6A2」のことを「6A2」と、「ケモカインレセプターCCR5のN末端領域に対するモノクローナル抗体2B8」のことを「2B2」と称する。
本発明にかかる抗体酵素は、例えば、CCR5のN末端領域を構成するペプチド(N末端ペプチド)を免疫したマウス等の免疫動物の脾臓細胞と、マウスのミエローマ細胞等の融合パートナーとを融合させてなるハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を産生することにより製造することができる。モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖を得る場合には、得られたモノクローナル抗体を重鎖と軽鎖に分離すればよい。また、本発明の抗体断片を得る場合には、まず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。例えば、本発明にかかる抗体酵素が、5A2の軽鎖全長や、6A2の軽鎖全長、または2B8の軽鎖全長などのように、CCR5のN末端領域に対する抗体の軽鎖の全長である場合には、従来公知の抗体取得方法を利用して、該当するCCR5のN末端ペプチドを免疫原としてモノクローナル抗体を取得し、その軽鎖を分離して取得すればよい。また、本発明にかかる抗体酵素が、CCR5の抗体断片である場合には、先ず該当するモノクローナル抗体を取得し、その後、上記モノクローナル抗体を適当なプロテアーゼを用いて目的とする抗体断片が得られるように切断すればよい。また、ファージディスプレイ法で得られる抗体であって良い。なおモノクローナル抗体の取得は通常のハイブリドーマ法(Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)参照)、トリオーマ法、ヒトB−細胞ハイブリドーマ法(Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)参照)、EBV−ハイブリドーマ法(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc.,77-96(1985)参照)等により行なうことが可能である。
これまでに、CCR5の働きを抑制する作用をもつ抗HIV薬剤は開発されてきたが、本発明にかかる抗体酵素は、これらの抗HIV薬剤とは全く異なる手法に基づいて、CCR5を直接攻撃してそのコレセプターとしての機能を消失させることができる。そのため、この抗体酵素は抗HIV薬剤として利用することができる。
<免疫>
CCR5のN末端領域ペプチド(以下「NC5ペプチド」;MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAARLL;配列番号15)とKLH(Pierce, USA)とのconjugateの作製を以下の通りに行なった。NC5ペプチドは、Peptide & Protein Research Cons. Devon, UK.から購入された。
抗体価が上昇したマウスから脾臓を摘出し、マウスリンパ節細胞(1×108個)とマウスミエローマ細胞(P3U1;2×107個)との細胞融合を行なった。上記細胞融合の方法は、ポリエチレングリコール(PEG4000、和光純薬工業株式会社 コード162-09115)を使って行なう通常の方法で行なった。その後、HAT選択、スクリーニング、およびクローニングを繰り返し、表1に示す8個の抗NC5モノクローナル抗体産生細胞を確立した。
上記で得られた抗NC5モノクローナル抗体産生細胞のうちの5クローン(5A2株、6A2株、2B8株、3F4株、および4H6株)の培養上清を用いて、NC5ペプチド以外の種々のペプチドおよびタンパク質との交差反応性をELISA法により調べた。ペプチドおよびタンパク質には、NC5ペプチド、Keyhole Lympet Hemocyanine(図15および図16では「KLH」と表記する)、ヒト血清アルブミン(図15および図16では「HSA」と表記する)、ウシ血清アルブミン(図15および図16では「BSA」と表記する)、ヒト-γ-グロブリン(図15および図16では「Human-γ-globlin」と表記する)、ヒトヘモグロビン(図15および図16では「Human-hemoglobin」と表記する)、TP41-1 peptide(TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD:21mer:配列番号16、図15および図16では「TP41-1」と表記する)、RT-1 peptide(KLLRGTKALTFVIPLTEEAE:配列番号17、図15および図16では「RT-1」と表記する、)を用いた。なお上記RT-1 peptideは、エイズウイルスの逆転写酵素の部分ペプチドである。
抗NC5モノクローナル抗体産生細胞(ハイブリドーマ)は20%FCSを含むIMDM培地(SIGMA社製、I−2510)を用い、37℃、CO2濃度5.5%の条件で、1〜5×107cellsが得られるまで培養された。上記培養によって得られた細胞を50ml遠心チューブに移し、1,400rpmで6分間、遠心分離して、当該細胞を回収した。培養培地をアスピレーターにて除去後、10mlのPBSで上記細胞を懸濁し、1つのチューブにまとめて再度1,400rpmで6分間、遠心分離を行なった。上清をアスピレーターにて吸引除去後、再度10mlのPBSで懸濁した後、血球計算盤を使用して細胞数をカウントした。
mRNAの抽出は、QuickPrepTM mRNA purirfcation Kit(アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社製)を用い、上記キットの推奨プロトコールに準じて行なった。以下にその方法を示す。
−130℃でエタノール沈殿の状態で保存していたmRNAを取り出し、4℃、15,000rpmで10分間遠心分離を行ない、マイクロピペットで上清を除去した。その後、1ml冷75%エタノール(当該冷75%エタノールは予めDEPC処理水で調製し、−30℃に保存したもの)を、マイクロチューブに対してペレットの無い方から穏やかに添加してリンスを行なった。次に上記マイクロチューブを、4℃、15,000rpmで10分間遠心分離を行なった後、マイクロピペットで上清を除去した。そして、15分間真空乾燥を行ない、RNA濃度が0.2μg/μlとなるようにDEPC処理水を添加し、1時間静置してRNAを溶解した。溶解後、確認の為にmRNA溶液をDEPC処理水でA260=1前後になるように希釈し、吸光度を測定した。
Mouse Ig primer Kit(Novagen社製)、およびNovaTaqTMHot Start DNA Polymerase Kit(Novagen社製)を使用し、上記にて得られたcDNAから、抗体遺伝子の可変領域の増幅を行なった。
以下のようにして、クローニングを行なった。
Thermo SequenaseTMCyTM5.5 Terminator Cycle Sequencing Kit (Pharmacia)を用いて、塩基配列の決定を行なった。A(アデニン)、C(シトシン)、G(グアニン)、およびT(チミン)の4種類の塩基用に、PCRチューブを用意し、d(N)TP/Cy5.5-dd(N)TPを各サンプル分、1μlずつ分注した。
上記にて決定した塩基配列から推測した抗体可変領域のアミノ酸配列をもとに、ソフトウェアAbM (Oxford Molecular社製、 Oxford、UK)を用いて、目的抗体のCDR領域のループ構造およびFR領域の立体構造を予測した。AbMで予測された立体構造をもとに、ソウトウェアInsightII/Discover3 (Molecular Simulatoin社製、USA)により分子間力計算を行ない、熱力学的に安定となる立体構造を予測した。
上記3つの抗NC5モノクローナル抗体の大量調製は、あらかじめプリスタン(2,6,10,14-tetramethylpentadecane)が投与されたBalb/cマウスに、各抗NC5モノクローナル抗体産生細胞 0.5×106個投与し、当該マウスから腹水を採取することによって行なった。上記のようにして取得した各抗NC5モノクローナル抗体を以下の方法で精製し、目的の実験に用いた。
腹水約8mlを同量のPBSで希釈後、濾過してフィブリンを除去した。これを2本の高速冷却遠心チューブに分け、各々、同量の飽和硫酸アンモニウムをドロップワイズで加えた。これを氷中で30分間静置し、その後、4℃、10000rpmで、10分間遠心分離した。デカンテーションにより上清を除去し、ペレットを6mlのPBSに溶解した。再度、等量の飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析し、ペレットを6mlのPBSに溶解した。これを、1本のチューブに合わせ、PBSに対して2回透析した。
透析終了後、抗体の精製を行った。操作はMAPS-IIキット(BIO-RAD社製/ProteinAを使った精製キット)の説明に従い、4℃で行なった。使用する試薬として、0.05%NaN3/PBS、Binding buffer、Elution buffer、および2M Tris−HCl(pH8.0)を以下のようにして調製した。0.05%NaN3/PBSは、0.1gのNaN3を200mlのPBSに溶解した。Binding bufferは、47.1gのBinding buffer粉末を蒸留水に溶解し、150mlにメスアップして調製した。この時、pHメーターを用い、pHが9±0.2であることを確認し、範囲外である時はHClまたはNaOHでpHを調整した。Elution bufferは2.3gのElution buffer粉末を蒸留水に溶解し、100mlにメスアップして調製した。この時、pHメーターを用い、pHが3±0.2であることを確認し、範囲外である時はHClまたはNaOHでpHを調整した。2M Tris−HClは、12.11gのTrisを蒸留水に溶解し、HClでpHを8.0に調整した後、蒸留水で50mlにメスアップした。
(1)限界ろ過
上記精製した抗体溶液(タンパク質5mg分)を0.15M NaClを含む50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)に対して2回透析した。透析終了後の抗体溶液をセントリプレップ−10(ミリポア社製)を用い、4℃、2,800rpmで遠心し、約1mlになるまで限外ろ過濃縮を行なった。上記抗体溶液に対して、5mlの50mM Tris-HCl+0.15M NaCl buffer(pH8.0)を加え、約1mlになるまで再び限外ろ過濃縮を行なった。上記操作を再度行なった後、50mM Tris-HCl+0.15M NaCl buffer(pH8.0)で抗体溶液を2.7mlに調整し、当該抗体溶液を褐色瓶に入れた。上記抗体溶液は、以下の実験に使用するまで低温下で保存された。
50mM Tris-HCl+0.15M NaCl buffer(pH8.0)、1M Tris solution、および抗体溶液2.7mlをそれぞれ脱気した。2-ME(メルカプトエタノール)と50mM Tris-HCl+0.15M NaCl buffer(pH8.0)とを抗体溶液に加え、ピペッティングによって溶液を軽く混合しつつ、1M Tris solutionでpH8.0に調整した後、反応容器内に窒素を封入した。インキュベーター内で、15℃、3時間スターラーで撹拌しながら還元反応を行なった。脱気後の0.6M ヨードアセトアミド 600μlを抗体溶液に対して加え、混合した。上記抗体溶液のpHを、1M Tris solutionでpH8.0に調整した。15℃で15分間撹拌しながらアルキル化反応を行なった。ディスクフィルター(ポアサイズ0.2μm)を使用し、抗体溶液の除粒子を行なった。上記抗体溶液を、セントリプレップ−10を用いて、液量が約0.5mlになるまで、限外ろ過濃縮を行なった。
重鎖および軽鎖の精製は、サイズ排除クロマトグラフィー(JASCO,PU-2080 Plus)、カラム(Waters,Protein-PakTM300SW,7.5 × 300 mm Column)を使用して行なわれた。移動相に用いる6M グアニジン塩酸塩(pH6.5)、流速0.15ml/分でカラムの平衡化を行なった(120 分間程度)。抗体溶液のサンプルを2〜3回に分けてカラムへインジェクションした。クロマトグラムを参照しながら、重鎖および軽鎖をそれぞれ分取した。取得した重鎖および軽鎖のサンプルそれぞれをPBSに対して透析し、重鎖および軽鎖をRefoldingした。重鎖および軽鎖のサンプルのバッファーを15mM PBに交換した後、クリーンベンチ内でサンプルを回収した。重鎖および軽鎖のサンプルについてDCプロテインスタンダードアッセイ(BIO-RAD社製)で重鎖および軽鎖の濃度を測定した後、SDS−PAGEで純度を確認して当該サンプルを4℃で保存した。
天然型抗体酵素の特徴は、その抗体自身が標的となるタンパクを特異的に完全分解することである。しかし、ペプチド基質を用いて抗体酵素の分解活性を検討する場合には、非特異的に反応するということが知られている。そこで、これまでの抗体酵素のペプチダーゼ活性の検討によく用いられてきたペプチドTP41-1 peptide(TPRGPDRPEGIEEEGGERDRD:21mer:配列番号16)を使用して該抗体が該ペプチド分解能を有するか検討した。なお、マウスの免疫に用いた抗原ペプチドは水に難溶性であったため、ペプチダーゼ活性の検討の基質として用いることはできなかった。
まずクリーンベンチ内で、240μMのTP41-1 peptide 溶液(15mM PB(pH6.5)を調製し、0.2μmのフィルターでろ過滅菌を行なった。試験管内でTP41-1 peptide 溶液と15mM PB(pH6.5)とを1:1となるように混合したものをコントロール溶液とした。上記のようにして調製した各反応溶液は以下の通りである。
反応液(1)0.8μM 軽鎖+TP41-1 peptide溶液 ・・・600μl作製
反応液(2)0.4μM 重鎖+TP41-1 peptide溶液 ・・・600μl作製
反応液(3)コントロール溶液 ・・・500μl作製
反応は、25℃で行なわれた。
上記試験の結果を示すべく、反応基質(TP41-1 peptide)の経時変化を図5〜8に示した。図5は抗NC5モノクローナル抗体5A2(Lot.1)の結果を示し、図6は抗NC5モノクローナル抗体5A2(Lot.2)の結果を示し、図7は抗NC5モノクローナル抗体6A2の結果を示し、図8は抗NC5モノクローナル抗体2B8の結果を示している。また各図において、丸のシンボルは上記反応液(1)の結果を示し、四角のシンボルは上記反応液(2)の結果を示し、三角のシンボルは上記反応液(3)の結果を示している。
(1)方法
抗NC5モノクローナル抗体の動力学的パラメーターを求めるにあたり、当該抗NC5モノクローナル抗体の軽鎖は、2相性の曲線を描きながら基質(TP41-1 peptide)を分解するため、分解初速度を求めるのは困難である。そこで、一度完全に基質(TP41-1 peptide)を分解した反応液に再びペプチドを添加して反応させることによって、誘導期が存在しない条件で動力学的パラメーターの解析を行なった。
図17には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果(抗NC5モノクローナル抗体5A2の軽鎖)を示す。図17(a)は、基質(TP41-1 peptide)濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図17(b)は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
Km=1.7×10−6(M)
kcat=1.4×10−1(min-1)
kcat/Km=8.5×104(M−1min−1)
また図18には、上記酵素分解実験における速度論的解析結果(抗NC5モノクローナル抗体2B8の軽鎖)を示す。図18(a)は、基質(TP41-1 peptide)濃度と分解速度との関係を示すグラフであり、図18(b)は、Hanes-Woolfプロットの結果を示すグラフである。
Km=1.1×10−5(M)
kcat=6.1×10−1(min-1)
kcat/Km=5.7×104(M−1min−1)
以上の結果より、上記抗体軽鎖によるペプチド基質の分解反応は酵素反応であるということが分かった。
(1)方法
抗NC5モノクローナル抗体(5A2、6A2、2B8)の軽鎖と反応基質(TP41-1 peptide)とをあらかじめ反応させた後、MOLT-4/CCR5破砕液(「MOLT-4/CCR5」については「MASANORI BABA,HIROSHI MIYAKE,MIKA OKAMOTO,YUJI IIZAWA,and KENJI OKONOGI”Establishment of a CCR5-Expressing T-Lymphoblastoid Cell Line Highly Susceptible to R5 HIV Type 1”AIDS RESEARCH AND HUMAN RETROVIRUSES Volume 16,Number 10,2000,pp.9350941」参照)を上記反応液に対して、体積比で反応液:破砕液=4:1となるように添加した。上記反応液を25℃のインキュベーターに入れ、反応を開始した。反応開始後0、6、12、24、および48時間後の反応液を採取した。
図9にウェスタンブロットの結果を示した。同図中、上部に「MOLT-4/CCR5」を付したものは、比較として抗NC5モノクローナル抗体(5A2、2B8)の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させていない場合の結果であり、「5A2」を付したものは、抗NC5モノクローナル抗体5A2の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果であり、「2B8」を付したものは、抗NC5モノクローナル抗体2B8の軽鎖をMOLT-4/CCR5に作用させた場合の結果である。また同図中、上部に「0」、「6」、「12」、「24」、「48」を付したものは、「反応開始0時間後の反応液」、「反応開始6時間後の反応液」、「反応開始12時間後の反応液」、「反応開始24時間後の反応液」、「反応開始48時間後の反応液」をそれぞれ示している。なお、同図中「M」は分子量マーカーを示す。
Claims (4)
- ヒト由来ケモカインレセプターCCR5のN末端領域に対する抗体または抗体断片であり、
当該ケモカインレセプターCCR5のN末端領域と特異的に結合し、かつ、
当該ケモカインレセプターCCR5を分解する活性を有し、かつ、
配列番号9に示されるアミノ酸配列からなる可変領域を含むことを特徴とする抗体酵素。 - 請求項1に記載の抗体酵素をコードする遺伝子。
- 配列番号10に示す塩基配列からなることを特徴とする請求項2に記載の遺伝子。
- 請求項2または3に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
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