JP2002508668A - 疾病の処置及び診断に有用なｔｎｆファミリーのメンバー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＴＮＦ−γ遺伝子から転写された配列から構成される単離遺伝子。前記ＴＮＦ−γ配列から翻訳されたヒトポリペプチドと、組換え技術により前記ポリペプチドを製造するための方法も提供する。ＴＮＦ−γ欠乏症とＴＮＦ−γにより改善される疾病症状を処置するために使用可能な生物学的に活性な可溶性ＴＮＦ−γの製造方法も提供する。前記ポリペプチドの作用を阻止するために使用可能であり、従ってＴＮＦ−γ関連疾患、癌又は転移を処置するために治療用として使用可能な前記ポリペプチドの抗体、アンタゴニスト及びインヒビターも開示する。ＴＮＦ−γに起因すると考えられる症状及び疾病、特に炎症をスクリーニング、診断、予後判定、段階付け及び監視するための前記抗体、アゴニスト及びインヒビター並びに核酸配列の使用も開示する。非限定的な例として炎症等のＴＮＦ−γ関連疾患をスクリーニング、診断、段階付け及び監視するための抗体、アゴニスト及びインヒビター並びに部分核酸配列を提供するための前記部分配列の使用も開示する。ＴＮＦ−γの配列例とクローン名を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 疾病の処置及び診断に有用なＴＮＦファミリーのメンバー 発明の背景 本発明は一般には細胞外シグナル分子、より詳細にはＴＮＦ−γと呼ぶ腫瘍壊 死因子（ＴＮＦ）ファミリーの分子のメンバー、その検出のための試薬と方法及 び治療におけるその使用に関する。 ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）ファミリーは種々の疾病症状に密接に関連する生物活 性をもつ一連の細胞外シグナリング分子（リガンド）として益々拡大している。 このＴＮＦファミリーの典型的メンバーは敗血症ショック、炎症及び移植片対宿 主病のメディエーターとして周知である。例えば、Ａ．Ｃｅｒａｍｉ，Ｉｍｍｕ ｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ，９：２８−３１(１９８８)；Ｍ．Ｒｅｖｅｌ，Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ Ｓｙｍｐ ，１２９：２２３−３３（１９８７）；Ｊ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ３（３）：１９３−１９ ７（１９８８）参照。また、充実性腫瘍の脈管系に有益な効果があるため、ＴＮ Ｆの局所潅流は癌患者の治療剤として評価されている。Ｍ． Ｗ．Ｂｏｅｈｍｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２６：４０４−４１ ０（１９９６）。 免疫調節におけるＴＮＦファミリーの重要な役割はマウスとヒトの両者で突然 変異により立証されている。例えば、Ｆａｓリガンドとして知られるＴＮＦファ ミリーメンバーに機能低下突然変異をもつマウスはリンパ節症や自己免疫疾患を 含む種々の疾病を示す。例えば、Ｒ．Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｎ ａｔｕｒｅ ３５６：３１４−３１７（１９９２）；Ｔａｋａｈｉｓｈｉら，Ｃ ｅｌｌ ７６：９６９−９６６（１９９４）；Ａｄｉａｃｈｉら，ＰＮＡＳ，９ ０：１７５６（１９９３）；Ｆｉｓｈｅｒら，Ｃｅｌｌ ８１：９５３−９４６ （１９９５）；Ｆ．Ｒｉｅｕｘ−Ｌａｕｃａｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１３ ４７（１９９５）参照。免疫調節役割の別の例はヒトにおけるＴＮＦファミリー メンバーＣＤ４０リガンドの突然変異である。ヒト患者におけるＣＤ４０リガン ド自然突然変異は高Ｉｇ−Ｍ症候群の原因となり、Ｂ細胞成熟とアイソタイプス イッチングにＣＤ４０リガンドが必要であることを示している。また、マウスで ＴＮＦファミリーメンバーＬＴａを標的破壊すると、末梢リンパ核の発生障害を 生じ る。Ｐ．Ｄｅ Ｔｏｇｎｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：７０３−７０７（１９９ ４）。 臨床的に有用であると予想されるこのファミリーのリガンドの別の性質は、種 々の癌細胞で選択的にアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導できるが、大半 の正常細胞には誘導しないという点にある。多種多様の細胞系にアポトーシスを 誘導するＴＮＦファミリーのメンバーとしては、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポト ーシス誘導リガンド）とＦａｓリガンドの２種が公知である。例えば、Ｔ．Ｓｕ ｄａら，Ｃｅｌｌ ７５：１１６９−１１７８（１９９３）；Ｗｉｌｅｙら，Ｉ ｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２（１９９５）参照。この性質はＴＮＦファ ミリーのリガンドに固有である。 ＴＮＦファミリーのリガンドのメンバーはＮ末端１５０アミノ酸にほぼ制限さ れたアミノ酸保存領域により同定することができる。この領域は三量化してコグ ネイトレセプターと相互作用するβプリーツシート構造を形成する。このＮ末端 ドメインの内にβプリーツシートの鎖に対応する独立相同領域が存在する。従っ て、ＴＮＦファミリーメンバー間の完全アミノ酸配列相同度は、高くないが、当 業者により認識することができる。 このファミリーの分子のメンバーは免疫調節に重要な役割をもつので、ＴＮＦ ファミリーの他のメンバーの存在及び実体を調査することが望ましい。これらの 分子の同定と特性決定は、種々の免疫疾患の同定及び処置手段を提供する。発明の要約 本発明はＴＮＦファミリーのリガンドの新規メンバー、この新規メンバーの完 全タンパク質配列をコードする単離ＤＮＡ、及びこの新規メンバーの可溶性形態 をコードする発現ベクターを提供する。ＴＮＦファミリーのこの新規メンバーは このファミリーの他のどのメンバーよりもＴＮＦ−αに密接に関係しているので 、ＴＮＦ−γと呼ぶ。 ＴＮＦ−γポリペプチドの製造方法の１例では、ＴＮＦ−γの人工可溶性形態 とＴＮＦ−γの細胞表面発現形態を含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主 細胞で発現させる。 本発明は試料中のＴＮＦ−γのターゲットポリヌクレオチドの検出方法も提供 し、本方法は、ＴＮＦ−γに特異的なターゲットポリヌクレオチドを本発明の少 なくとも１種のＴＮＦ−γ特異的ポリヌクレオチド及びそのフラグメント又は相 補体と接触させる段階と、試料中のターゲットの存在を検出する段階を 含む。ポリヌクレオチドは配列番号１とそのフラグメント又は相補体を含む。更 に、アッセイを実施する前にＴＮＦ−γポリヌクレオチドを固相に結合してもよ い。 本発明は試料中のＴＮＦ−γ遺伝子の５’末端ｃＤＮＡの増幅方法も提供し、 本方法は、ランダムプライマーを用いて逆転写を実施する段階と、第１段階ＰＣ Ｒでセンス及びアンチセンスプライマーとしてＴＮＦ−γの他のオリゴヌクレオ チドプライマーを使用することにより得られたｃＤＮＡを増幅し、増幅ｃＤＮＡ を得る段階と、試料中のＴＮＦ−γアンプリコンの存在を検出する段階を含む。 増幅はポリメラーゼ連鎖反応により実施することができる。また、方法を実施す る前に試料を固相に結合してもよい。更に、検出段階は測定可能なシグナルを発 生することが可能な検出可能なラベルを使用することができる。検出可能なラベ ルは固相に結合してもよい。 本発明は更に、ＴＮＦ−γを含む疑いのある試料中のＴＮＦ−γの検出方法も 提供し、本方法は、前記試料をセンスプライマーとしての少なくとも１種のポリ ヌクレオチドとアンチセンスプライマーとしての少なくとも１種のポリヌクレオ チドとに接触させ、増幅して第１段階反応生成物を得る段階と、接触段 階の前記ポリヌクレオチドの少なくとも１種と、使用する第１のオリゴヌクレオ チドの３’に配置されており、前記第１のオリゴヌクレオチドに対して逆向きの 第２のポリヌクレオチドとに前記第１段階反応生成物を接触させる段階と、疾病 の存在の指標として前記ＴＮＦ−γを検出する段階を含む。増幅はポリメラーゼ 連鎖反応により実施することができる。方法を実施する前に試料を固相に結合し てもよい。更に、検出段階は測定可能なシグナルを発生することが可能な検出可 能なラベルを使用することができ、検出可能なラベルを固相に結合してもよい。 本発明は試料中のＴＮＦ−γターゲットの検出に有用な試験キットも提供し、該 キットは配列番号１とそのフラグメント又は相補体から構成される群から選択さ れる少なくとも１種のポリヌクレオチドを入れた容器を含む。これらの試験キッ トは更に、血液、尿、唾液及び便等の試料を採取するために有用なツールを入れ た容器も含む。このようなツールとしては、血液を採取及び安定化するためのラ ンセットと吸収紙又は布、唾液を採取及び安定化するためのスワブ、尿又は便サ ンプルを採取及び安定化するためのカップが挙げられる。採取材料、紙、布、ス ワブ、カップ等は場合によりサンプルの変性又は不可逆的吸着を 避けるように処理してもよい。更に、これらの材料は検体の完全性の維持を助長 するように防腐剤、安定剤又は抗菌剤で処理したり、添加してもよい。 本発明はゲノムＴＮＦ−γ遺伝子又はその相補体に選択的にハイブリダイズす ることが可能なＴＮＦ−γ遺伝子に由来する精製ポリヌクレオチド又はそのフラ グメントを提供する。ポリヌクレオチドは配列番号１とそのフラグメント又は相 補体から構成される群から選択される。更に、ポリヌクレオチドは組換え技術に より製造することができる。この組換えポリヌクレオチドはＴＮＦ−γの少なく とも１個のエピトープをコードする配列を含み、組換えベクター内に含まれる。 組換えポリヌクレオチドは更に、前記ベクターで形質転換した宿主細胞を含む。 本発明は更に、ＴＮＦ−γ遺伝子に由来するＤＮＡ又はＲＮＡのオープンリー ディングフレームを含む組換え発現系も提供し、前記オープンリーディングフレ ームは試料を少なくとも１種のＴＮＦ−γ特異的ポリヌクレオチド又はその相補 体と接触させ、試料中のＴＮＦ−γのターゲットポリヌクレオチドの存在を検出 することからなる。ＴＮＦ−γ特異的ポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌク レオチドとそのフラグメント、類似体又は 相補体に対して少なくとも５０％の相同度をもつ。方法を実施する前に、ＴＮＦ −γのターゲットポリヌクレオチドを固相に結合してもよい。 本発明は更に、試料中のＴＮＦ−γのｍＲＮＡの検出方法も提供し、本方法は 、（ａ）少なくとも１種のプライマーを用いて逆転写を実施し、ｃＤＮＡを生成 する段階と、（ｂ）第１段階増幅でセンス及びアンチセンスプライマーとしてＴ ＮＦ−γの他のオリゴヌクレオチドを使用することにより段階（ａ）で得られた ｃＤＮＡを増幅し、ＴＮＦ−γアンプリコンを得る段階と、（ｃ）試料中のＴＮ Ｆ−γアンプリコンの存在を検出する段階を含み、ＴＮＦ−γのオリゴヌクレオ チドプライマーは配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少 なくとも５０％の相同度をもつ。この方法は更に、段階（ａ）又は段階（ｂ）又 は段階（ｃ）を実施する前に試料を固相と反応させる段階を含む。更に、検出段 階は測定可能なシグナルを発生することが可能な検出可能なラベルを使用しても よい。 ターゲットを含む疑いのある試料中のターゲットＴＮＦ−γポリヌクレオチド の別の検出方法も提供する。本方法は、（ａ）ターゲットＴＮＦ−γポリヌクレ オチドをセンスプライマーと しての少なくとも１種のＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドとアンチセンスプライマ ーとしての少なくとも１種のＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドとに接触させ、増幅 して第１段階反応生成物を得る段階と、（ｂ）段階（ａ）で使用するＴＮＦ−γ オリゴヌクレオチドの３’に配置されており、第１段階反応生成物に相補的な少 なくとも１種の他のＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドと前記第１段階反応生成物を 接触させる段階と、（ｃ）ターゲットＴＮＦ−γポリヌクレオチドを検出する段 階を含み、段階（ａ）と段階（ｂ）で使用するＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドは 配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の 相同度をもつ。更に、段階（ａ）又は段階（ｂ）又は段階（ｃ）を実施する前に 試料を固相と反応させてもよい。また、検出段階は測定可能なシグナルを発生す ることが可能な検出可能なラベルを使用することができる。更に、検出可能なラ ベルを固相に結合してもよい。 本発明は更に試料中のＴＮＦ−γポリヌクレオチドを検出するために有用な試 験キットも提供し、該キットは、配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相 補体に対して少なくとも５０％の相同度をもつ少なくとも１種のＴＮＦ−γポリ ヌクレ オチドを入れた容器を含む。更に、試験キットはランセット、吸収紙、布、スワ ブ及びカップから構成される群から選択される前記試料の採取に有用なツールを 入れた容器を含む。 ＴＮＦ−γ遺伝子に由来する精製ポリヌクレオチド又はそのフラグメントも提 供する。精製ポリヌクレオチドは前記ＴＮＦ−γ遺伝子の核酸に選択的にハイブ リダイズすることができ、精製ポリヌクレオチドは配列番号１とそのフラグメン ト、類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の相同度をもつ。更に、精製ポ リヌクレオチドは組換え技術により製造することができる。組換え技術により製 造する場合には、精製ポリヌクレオチドは更にＴＮＦ−γによりコードされる少 なくとも１個のエピトープの配列を含むことができる。 本発明は所望宿主に適合可能な調節配列に作動的に結合したＴＮＦ−γに由来 するオープンリーディングフレームをコードする核酸を含む組換え発現系を提供 する。核酸配列は配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少 なくとも５０％の相同度をもつ。この組換え発現系は更に組換え発現系で形質転 換した細胞を含む。 本発明は更にＴＮＦ−γによりコードされるポリペプチドも 提供する。ポリペプチドは配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構 成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をも つ。ポリペプチドは組換え技術又は合成技術により製造することができる。 ＴＮＦ−γポリペプチドの活性化を阻害する化合物を提供する。ＴＮＦ−γポ リペプチドは配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群か ら選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつ。本発明は 更に、ＴＮＦ−γのレセプターに結合することが可能なＴＮＦ−γタンパク質の 可溶性フラグメントとしてのポリペプチドも提供する。 ＴＮＦ−γポリペプチドの活性化を誘導することが必要な患者の処置方法も提 供し、本方法は、ＴＮＦ−γポリペプチドの活性化を誘導する治療的に有効な量 の化合物を患者に投与することを特徴とする。ＴＮＦ−γポリペプチドは配列番 号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ 酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつ。 本発明はある化合物がＴＮＦ−γタンパク質のアゴニストであるかアンタゴニ ストであるかを判定するための方法も提供す る。本方法は、（ａ）ＴＮＦ−γタンパク質をその表面に発現する細胞を前記化 合物とレセプターリガンドとに接触させる段階と、（ｂ）リガンドとレセプター の相互作用から生物学的効果が生じるか否かを判定する段階と、（ｃ）化合物が アゴニストであるかアンタゴニストであるかを判定する段階を含む。タンパク質 は配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択され るアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつ。 本発明は更に、レセプターがＴＮＦ−γリガンドに結合するか否かを判定する ための方法も提供する。本方法は、（ａ）ＴＮＦ−γリガンドを発現する哺乳動 物細胞をレセプターと接触させる段階と、（ｂ）レセプターの存在を検出する段 階と、（ｃ）レセプターがＴＮＦ−γリガンドに結合するか否かを判定する段階 を含む。 ＴＮＦ−γによりコードされる少なくとも１個のエピトープに特異的に結合す る抗体も提供する。抗体はポリクローナル又はモノクローナルである。エピトー プは配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択さ れるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸配 列を含む。 試料中のＴＮＦ−γ抗原又は抗体の存在を判定するためのアッセイキットも提 供し、該キットは配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される 群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつＴＮＦ −γポリペプチドを入れた容器を含む。更に、ポリペプチドを固相に結合しても よい。更に、アッセイキットは更にランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップ から構成される群から選択される前記試料の採取に有用なツールを入れた容器も 含む。本発明により提供される試料中のＴＮＦ−γ抗原又は抗体の存在を判定す るための別のアッセイキットは、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメント から構成される群から選択される配列に対して少なくとも約３５％の相同度をも つＴＮＦ−γの少なくとも１個のエピトープを含むＴＮＦ−γ抗原に特異的に結 合する抗体を入れた容器を含む。更に、アッセイキットはランセット、吸収紙、 布、スワブ及びカップから構成される群から選択される前記試料の採取に有用な ツールを入れた容器も含む。更に、キットの抗体を固相に結合してもよい。 本発明はＴＮＦ−γの少なくとも１個のエピトープを含むポ リペプチドの製造方法を提供する。本方法は、配列番号２、配列番号３及びその フラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも 約６０％の相似度をもつアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌク レオチド配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞をインキュベートする ことを特徴とする。 本発明は更に、ＴＮＦ−γ抗原を含む疑いのある試料中のＴＮＦ−γ抗原の検 出方法も提供し、本方法は、（ａ）抗体／抗原複合体を形成させるために十分な 時間及び条件下で配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される 群から選択されるＴＮＦ−γ抗原の少なくとも１個のエピトープに特異的に結合 する抗体又はそのフラグメントと試料を接触させる段階と、（ｂ）前記複合体を 検出する段階を含む。本方法は更に、抗体を固相に結合する。 本発明は抗体を含む疑いのある試料中のＴＮＦ−γ抗原に結合する抗体の検出 方法を提供する。本方法は、（ａ）抗原／抗体複合体を形成させるために十分な 時間及び条件下で配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される 群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をも つアミノ酸配列又はそのフラグメントを含む少なくとも１個のＴＮＦ−γエピト ープを含むＴＮＦ−γポリペプチドと前記試料を接触させる段階と、（ｂ）前記 複合体を検出する段階を含む。ＴＮＦ−γポリペプチドは更に、固相に結合して もよい。 本発明は、ＴＮＦ−γ抗原又はそのフラグメントの少なくとも１個のエピトー プをコードする核酸配列を含む組織培養増殖細胞も提供し、核酸配列を細胞にト ランスフェクトし、核酸配列は配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補 体である。 更に、本発明はＴＮＦ−γ抗原に特異的に結合する抗体の製造方法も提供する 。本方法は、少なくとも１個のＴＮＦ−γエピトープを含み、配列番号２、配列 番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択される配列に対して少な くとも３５％の相同度をもち、免疫応答を発生するために十分な量の単離免疫原 ポリペプチド又はそのフラグメントを個体に投与することを特徴とする。本発明 はＴＮＦ−γ抗原に特異的に結合する抗体の別の製造方法も提供し、本方法はＴ ＮＦ−γの少なくとも１個のエピトープをコードする配列を含むプラスミドを哺 乳動物に投与することを特徴とし、ＴＮＦ−γ配列は配列番号１とそのフラグメ ント又は相補体から構成される群から選択 される。 本発明はＴＮＦ−γポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む組成物も提 供し、ポリヌクレオチドは配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に 対して少なくとも５０％の相同度をもつ。ＴＮＦ−γによりコードされる少なく とも１個のエピトープを含み、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントか ら構成される群から選択される配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつポ リペプチドを含む組成物も提供する。このポリペプチド組成物は更にＴＮＦ−γ タンパク質の可溶性フラグメントも含み、ＴＮＦ−γのレセプターに結合するこ とが可能である。 本発明は更に、配列番号２に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸 配列を含むＴＮＦ−γタンパク質をコードする遺伝子又はそのフラグメントも提 供する。更に、本発明は配列番号１に対して少なくとも３５％の相同度をもつＤ ＮＡを含む遺伝子又はそのフラグメントも提供する。図面の簡単な説明 図１はＴＮＦ−γとＴＮＦファミリーのリガンドの数種の従来記載されている メンバーのアミノ酸アラインメントを示す。 ｈＴＮＦ−γは配列番号２、ｈＴＮＦａは配列番号６、ｍＴＮＦａは配列番号７ 、ｈＴＮＦｂは配列番号８、ｈＬＴｂは配列番号９及びｈＴＲＡＩＬは配列番号 １０として示す。発明の詳細な説明 本発明はＴＮＦ−γと呼ぶ新規タンパク質、ＴＮＦ−γのレセプター結合ドメ インをコードするＤＮＡ及びＴＮＦ−γＤＮＡを製造するための組換えベクター を提供する。 本発明はＴＮＦ−γタンパク質に特異的に結合する抗体も提供する。１態様で は、これらの抗体はモノクローナル抗体である。 ヒトＴＮＦ−γをコードするｃＤＮＡクローンの同定を下記実施例１に記載す る。ヒトＴＮＦ−γのヌクレオチド配列は配列番号１に示し、アミノ酸配列は配 列番号２及び配列番号３に示す。 ＴＮＦファミリーのメンバーのカルボキシル末端〜１５０アミノ酸は配列保存 を示す。従って、ファミリーの新規メンバーはこの領域における公知ファミリー メンバーとの配列相同により認識することができる。本明細書に開示するアミノ 酸配列によると、ＴＮＦ−γはＴＮＦファミリーのリガンドのメンバー であることが明らかである。Ｓｍｉｔｈら，Ｃｅｌｌ ７３：１３４９（１９９ ３）；Ｓｕｄａら，Ｃｅｌｌ ７５：１１６９（１９９３）；Ｓｍｉｔｈら，Ｃ ｅｌｌ ７６：９５９（１９９４）。ＴＮＦファミリーの全公知メンバーのうち で、ＴＮＦ−γはＴＮＦ−αに最も密接に関係している。 ＴＮＦファミリーのリガンドのカルボキシル末端部分に位置する保存配列は上 記Ｓｍｉｔｈら，Ｃｅｌｌで同定されている。図１はＴＮＦ−γ（配列番号２） とＴＮＦファミリーのリガンドの数種の従来記載されているメンバーのアミノ酸 アラインメントを示す。図１中、これらのメンバーは上から下に向かってヒトＴ ＮＦ−γ（配列番号２）、ヒトＴＮＦ−α（配列番号６）、マウスＴＮＦ−α（ 配列番号７）、ヒトＴＮＦ−β（配列番号８）、ヒトリンホトキシン（ＬＴ）− β（配列番号９）及びヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１０）である。ＴＮＦ−γには ＴＮＦファミリーメンバーの大半と共通する数個の高度に保存された残基が存在 する。これらの残基は、特に１１９（Ｈ）、１３８（Ｗ）、１４７（Ｇ）、１６ ０（Ｇ）、１６２（Ｙ）、１６５（Ｙ）、１６６（Ｓ）、１６７（Ｑ）、１６８ （Ｖ）、１７０（Ｆ）、１９４（Ｌ）、２０８（Ｙ）、２１２（Ｙ）、２１５ （Ｇ）、２１７（Ｆ）、２１９（Ｌ）、２２２（Ｇ）、２２３（Ｄ）、２３６（ Ｌ）、２４４（Ｌ）及び２４６（Ｇ）である。治療用途 炎症は身体のある領域が細菌感染や自己免疫等の条件に応答して種々の活性化 リンパ球により浸潤される生物学的プロセスである。このプロセスは有益である が、組織損傷を生じる過剰及び不適切な炎症は疾病症状の原因となる。ＴＮＦは 敗血症、関節リウマチ及び炎症性腸疾患等のこれらの症状のいくつかの主原因に 数えられている。ＴＮＦ−γはＴＮＦファミリーのＴＮＦ−αメンバーに近似し ているので、本発明は炎症の指標としてのＴＮＦ−γの使用を提供し、炎症抑制 手段としてアンチセンスＲＮＡ、ブロッキング抗体又はＴＮＦ−γをターゲット することにより生成される化合物等の手段によりＴＮＦ−γをブロックする。 プログラム細胞死（アポトーシス）は適当な外部シグナルを与えられた細胞が 自己破壊に至る基礎生物学的プロセスである。このプロセスは肝形成、内分泌依 存性組織萎縮、正常組織ターンオーバー、神経及び免疫系発生中に生じると説明 されていた。免疫系の場合には、自己エピトープを認識するＴ細胞は胸腺で Ｔ細胞の成熟中にアポトーシスにより破壊される。自己反応性Ｔ細胞はアポトー シスを生じないので自己免疫疾患の原因となると示唆されている。Ｇａｍｍｏｎ ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：１９３（１９９１）。ＴＮＦフ ァミリーの特徴の１つは、多数のファミリーメンバーが正常及び腫瘍起源の両者 の種々の細胞にプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導できることである（Ｗ ｉｌｅｙら， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３−６８２，１９９５とその引用文 献）。従って、本発明は癌及び腫瘍関連細胞にアポトーシスを誘導するための抗 癌剤としてのＴＮＦ−γの使用を提供する。本発明は更に、自己反応性Ｔ細胞等 の不適切な未変換細胞を除去するための物質としてのＴＮＦ−γの使用を提供す る。ＴＮＦ−γは体内に単独で投与してもよいし、他の物質と併用投与してもよ いし、疾病組織のｅｘ ｖｉｖｏ処置及び置換に使用してもよい。例えば、循環 性リンパ腫を固定化ＴＮＦ−γにｅｘ ｖｉｖｏ暴露し、処置した血液を患者に 再導入することができる。 ＴＮＦファミリーのリガンドの別の特徴は、血管接着分子をアップレギュレー トすることにより免疫系の細胞の充実性腫瘍暴露を増し、抗腫瘍白血球を領域に 吸引することである。Ｍ． Ｗ．Ｂｏｅｈｍｅ， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，前出。ＴＮＦは 更に腫瘍の間質圧を下げ、より高濃度の化学抗癌剤又は化学抗癌剤の混合物を腫 瘍に導入することができる。本発明は腫瘍を処置するために化学療法抗癌剤と併 用する佐剤としてのＴＮＦ−γの使用を提供する。 更に、ウイルス感染正常細胞はＴＮＦ−αやＦａｓリガンド等のＴＮＦファミ リーメンバーにより誘導されるアポトーシスを受け易い。例えば、Ｃ．Ｖ．Ｐａ ｙａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：１９８９−１９９５（１９８８）；Ｐ． Ｄ．Ｋａｔｓｉｓｋａｓ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２０２９−２０３６（ １９９５）参照。本発明は単独使用するか又は抗ウイルス化合物もしくはタンパ ク質治療剤等の他の物質と併用する抗ウイルス治療剤としてのＴＮＦ−γの使用 を提供する。ウイルス感染細胞をγ−インターフェロンで前処理すると、ＴＮＦ ファミリーのメンバーにより誘導されるアポトーシスを増加することが示されて いるので、この用途の１態様はγ−インターフェロン等の他の物質とＴＮＦ−γ の併用投与である。 本発明はＴＮＦ−γタンパク質の量が不十分であったり、産生欠損により（直 接又は関節的に）媒介される任意疾患の発現 におけるＴＮＦ−γの使用も提供する。このような症状をもつ患者に精製ヒトＴ ＮＦ−γタンパク質を投与することができる。あるいは、ＴＮＦ−γペプチドをｉｎ ｖｉｖｏ 産生するための遺伝子治療法も提供する。 ＴＮＦ−γの医薬製剤は精製ＴＮＦ−γと、医薬的に許容可能なキャリヤー、 希釈剤又は賦形剤を含む。このような組成物としてはバッファー、酸化防止剤、 低分子量ペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、キレート化剤、グルタチ オン並びに医薬組成物に通常添加される他の賦形剤及び安定剤が挙げられる。 本発明はＴＮＦ−γ遺伝子の産物に関する試料のアッセイ方法を提供し、本方 法は試料中でｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する段階と、ＴＮＦ−γ遺伝子の存在 の指標としてｃＤＮＡを検出する段階を含む。本方法は、遺伝子又はそのフラグ メントに対応するｃＤＮＡの部分を増幅する増幅段階を加えてもよい。ｍＲＮＡ の翻訳産物のアッセイ方法も提供する。本発明の方法によりアッセイ可能な試料 としては、組織、細胞、体液及び分泌物が挙げられる。本発明はこれらの方法を 実施するのに有用なオリゴヌクレオチドプライマー及びポリペプチド等の試薬も 提供する。 本明細書に開示する核酸配列の部分はＲＮＡの逆転写もしくはｃＤＮＡの増幅 用プライマーとして、又は試料中の所定のｃＤＮＡ配列の存在を判定するための プローブとして有用である。診断イムノアッセイにおける標準もしくは試薬、医 薬スクリーニングアッセイのターゲット及び／又は種々の治療用成分もしくはタ ーゲット部位として有用なコード化ポリペプチド配列の製造を可能にする核酸配 列も開示する。これらのポリペプチド配列に含まれる少なくとも１個のエピトー プに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は、本発明で提供するＴＮＦ −γ遺伝子に関連する疾病又は症状、特に炎症の治療剤及びスクリーニング用診 断試験の送達剤として有用である。着目遺伝子の他の部分の配列の単離は、これ らの核酸配列から誘導されるプローブ又はＰＣＲプライマーを使用することによ り実施できる。こうして、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの付加プローブ及び対応するコ ード化ポリペプチド配列も得られる。これらの付加分子は本明細書に開示するＴ ＮＦ−γ遺伝子により特徴付けられる疾病及び症状を検出、診断、段階付け、監 視、予後判定、予防、処置又はその素因を決定するのに有用である。 アミノ酸配列「相似度」を決定するための方法は当該技術分野で周知である。 一般に「相似度」とは、アミノ酸が同一であるか又は電荷もしくは疎水性等の化 学及び／又は物理的性質が類似している適当な位置における２種以上ポリペプチ ドの厳密なアミノ酸対アミノ酸の比較を意味する。従って、比較するポリペプチ ド配列間で所謂「相似度百分率」を決定することができる。核酸及びアミノ酸配 列相同度を決定する方法も当該技術分野で周知であり、（通常はｃＤＮＡ中間体 により）該当遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定し、この配列にコード されたアミノ酸配列を決定し、第２のアミノ酸配列と比較することにより行われ る。一般に、「相同度」とは夫々２種のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列 の厳密なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。 ２種以上のポリヌクレオチド配列はそれらの「相同度百分率」を決定することに より比較することができる。２種のアミノ酸配列も同様にそれらの「相同度百分 率」を決定することにより比較することができる。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑ ｕｅｎｃｅ ＡｎａＬｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ市販品）で利用可能なプログラム（例えばＧＡＰプログラ ム）は、夫々２種のポリヌクレオチド間の相同度と、２種のポリペプチド配列間 の相同度及び相似度を計算することができる。配列間の相同度又は相似度を計算 するための他のプログラムも当該技術分野で公知である。 本明細書に記載する組成物及び方法を用いると、ＴＮＦ−γ疾病の指標として 所定のマーカーを認識することができ、それから得られる情報はＴＮＦ−γ遺伝 子に関連する疾病又は症状、特に炎症、癌及び移植片対宿主病を検出、診断、段 階付け、監視、予後判定、予防又は処置するのに有用である。試験方法としては 例えば、本発明で提供する配列と場合によりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及びハイブリダイゼーション等の核酸増幅方法も利 用するプローブアッセイが挙げられる。更に、本発明で提供するヌクレオチド配 列は免疫原エピトープを見いだすことができるオープンリーディングフレームを 含む。このエピトープはＴＮＦ−γ遺伝子に関連する疾病状態又は症状に固有で あると考えられる。また、本明細書に記載するＴＮＦ−γ遺伝子は炎症等の疾病 で増大したり、炎症等の疾病で変化したり、正常タンパク質として存在す るが不適切な身体区画に出現するマーカーとして有用であるとも考えられる。エ ピトープの固有性は、（ｉ）特定ＴＮＦ−γ遺伝子によりコードされるタンパク 質及びポリペプチドに対する抗体に対するその免疫反応性及び特異性と、他のＴ ＮＦマーカーに対するその無反応性又は低度の交差反応性により決定することが できる。免疫反応性の決定方法は周知であり、非限定的な例として、例えばラジ オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、凝集 （ＨＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（Ｃ ＬＩＡ）等が挙げられ、本明細書では利用可能な方法の数例を説明する。 特に指定しない限り、以下の用語は以下の意味をもつ。 指定配列「から誘導される」又は「に特異的な」ポリヌクレオチドとは、指定 ヌクレオチド配列のある領域に対応即ち同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレ オチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約 １０〜１０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチド の連続配列を含むポリヌクレオチド配列を意味する。配列は当該技術分野で公知 の技術により決定した場合に特定ポリ ヌクレオチド配列に固有の配列に相補的でも同一でもよい。指定配列の固有性を 決定するための方法としては、例えばデータベースの配列との比較を使用するこ とができる。配列を誘導することができる領域の非限定的な例としては、特定エ ピトープをコードする領域や、非翻訳及び／又は非転写領域が挙げられる。 誘導されるポリヌクレオチドは必ずしも着目ヌクレオチド配列から物理的に誘 導する必要はなく、非限定的な例としてポリヌクレオチドが誘導される領域の塩 基配列により提供される情報に基づく化学合成、複製、逆転写又は転写等の任意 方法により作製することができる。従って、元のポリヌクレオチドのセンス又は アンチセンスのどちらの向きでもよい。更に、指定配列の領域に対応する領域の 組み合わせを所期用途に合わせて当該技術分野で公知の方法で改変してもよい。 特定ポリヌクレオチドの「フラグメント」とは、指定ヌクレオチド配列のある 領域に対応即ち同一又は相補的な少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少な くとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２ヌクレオチド 、更に好ましくは少なくとも約１５〜２０ヌクレオチドの連続配列を含 むポリヌクレオチド配列を意味する。 「プライマー」なる用語は、ターゲットヌクレオチド配列に相補的であり、タ ーゲットヌクレオチド配列にハイブリダイズするために使用する特定オリゴヌク レオチド配列を意味する。この配列はＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ 又は逆転写酵素により触媒するヌクレオチド重合の開始点として機能する。 「プローブ」なる用語は、相補的配列をもつ試料中に存在する特定ポリヌクレ オチドを同定するために使用可能な規定核酸セグメント（又はヌクレオチド類似 体セグメント、例えば下記に定義するようなＰＮＡ）を意味する。 「〜によりコードされる」とは、少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは 少なくとも８〜１０アミノ酸、更に好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸の アミノ酸配列を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列又は核酸配列により コードされるポリペプチドを意味する。配列によりコードされるポリペプチドで 免疫学的に識別可能なポリペプチド配列も含まれる。従って、ＴＮＦ−γ「ポリ ペプチド」、「タンパク質」又は「アミノ酸」配列は、ＴＮＦ−γのポリペプチ ド又はアミノ酸配列 に対して少なくとも６０％の相似度、好ましくは少なくとも約７５％の相似度、 より好ましくは約８５％の相似度、最も好ましくは約９５％の相似度をもつもの とすることができる。このアミノ酸配列は配列番号２及び配列番号３から構成さ れる群から選択することができる。 「組換えポリペプチド」又は「組換えタンパク質」又は「組換え技術により製 造したポリペプチド」とは本明細書では同義に使用し、その起源又は操作により 天然に会合しているポリペプチドの全部もしくは一部に会合していないか、及び ／又は天然に結合しているポリペプチド以外のポリペプチドに結合しているポリ ペプチドを意味する。組換え又はコード化ポリペプチド又はタンパク質は必ずし も指定核酸配列から翻訳する必要はない。化学合成や、組換え発現系の発現等の 任意の方法で作製することができる。 本明細書で使用する「合成ペプチド」なる用語は、当業者に周知の方法により 化学的に合成することが可能な任意長さのポリマー形態のアミノ酸を意味する。 これらの合成ペプチドは種々の用途で有用である。 本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」なる用語は、リボ ヌクレオチドであるかデオキシリボヌクレオチドであるかを問わずに任意長さの ポリマー形態のヌクレオチドを意味する。この用語は分子の一次構造のみを表す 。従って、この用語は２本鎖及び１本鎖ＤＮＡと、２本鎖及び１本鎖ＲＮＡを含 む。更に、ポリヌクレオチドのメチル化やキャッピング等の修飾形態と非修飾形 態を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」及 び「オリゴ」なる用語は本明細書では同義に使用する。 「ｃＤＮＡに対応する配列」とは、配列が指定ＤＮＡ中のある配列に同一又は 相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。ｃＤＮＡに対する相 同度又は相補度（又は「百分率」）は約５０％以上、好ましくは少なくとも約７ ０％以上、より好ましくは少なくとも約９０％である。指定ｃＤＮＡに対応する 配列は少なくとも約５０ヌクレオチド長、好ましくは約６０ヌクレオチド長、よ り好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長である。着目遺伝子又は遺伝子フ ラグメントとｃＤＮＡの対応は、当該技術分野で公知の方法により決定すること ができ、例えば配列決定した材料を既知ｃＤＮＡと直接比較したり、ハイブリダ イゼーション及び１本鎖ヌクレアーゼで消化後に消 化したフラグメントのサイズを決定すればよい。 「精製ポリヌクレオチド」とは、このポリヌクレオチドが天然に会合している タンパク質を実質的に含まず、即ちその含有量が約５０％未満、好ましくは約７ ０％未満、より好ましくは約９０％未満である着目ポリヌクレオチド又はそのフ ラグメントを意味する。着目ポリヌクレオチドの精製方法は当該技術分野で周知 であり、例えばポリヌクレオチドを含む細胞をカオトロピック剤で破壊したり、 イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び密度に よる沈殿によりポリヌクレオチドとタンパク質を分離する方法がある。 「精製ポリペプチド」とは、着目ポリペプチドが天然に会合している細胞成分 を実質的に含まず、即ちその含有量が約５０％未満、好ましくは約７０％未満、 より好ましくは約９０％未満である着目ポリペプチド又はそのフラグメントを意 味する。精製方法は当該技術分野で公知である。 「単離」なる用語は、材料がその初期環境（例えば天然に存在する場合には天 然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、動物生体に存在する天 然ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然系に共存する 材料の一 部又は全部から分離された同一ポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドは 単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部を構成すること ができ、及び／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一 部を構成することができ、ベクターや組成物はその天然環境を構成しないので単 離されているとみなす。 「ポリペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では同義に使用し、共有及び ／又は非共有結合を介して結合したアミノ酸の分子鎖を意味する。この用語は生 成物の特定長部分を意味するものではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド 及びタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。これらの用語は例えばグリコ シル化、アセチル化、リン酸化等のポリペプチドの発現後修飾を含む。更に、タ ンパク質フラグメント、類似体、成熟又は変異タンパク質、融合タンパク質等も ポリペプチドの意味に含まれる。 特定ポリペプチドの「フラグメント」とは、特定ポリペプチドから誘導される 少なくとも約３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８〜１０アミノ酸、 更に好ましくは少なくとも約１５〜２０アミノ酸を含むアミノ酸配列を意味する 。 「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」 及び単細胞体として培養した微生物又は高級真核細胞系を表す他の同様の用語は 、組換えベクター又は他の導入ＤＮＡのレシピエントとして使用できるか又は使 用されている細胞を意味し、トランスフェクトした元の細胞の元の子孫も含む。 本明細書で使用する「レプリコン」とは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自 律単位として挙動するプラスミド、染色体又はウイルス等の任意遺伝子エレメン トを意味する。 「ベクター」とは、結合したセグメントの複製及び／又は発現を生じるため等 の目的で別のポリヌクレオチドセグメントを結合したレプリコンである。 「調節配列」なる用語は、連結しているコーディング配列を発現させるために 必要なポリヌクレオチド配列を意味する。このような調節配列の種類は宿主生物 によって異なる。原核生物では、このような調節配列は一般にプロモーター、リ ボソーム結合部位及びターミネーターを含み、真核生物ではこのような調節配列 は一般にプロモーター、ターミネーター及び場合によりエンハンサーを含む。従 って、「調節配列」なる用語は最低 限でその存在が発現に必要な全成分を含み、更にその存在が有利である付加成分 （例えばリーダー配列）を含んでいてもよい。 「作動的に結合」とは、指定成分がその所期方法で機能できるような関係にあ る状況を意味する。従って、例えばコーディング配列に「作動的に結合した」調 節配列は、調節配列に適合可能な条件下でコーディング配列の発現が達成される ように連結されている。 「オープンリーディングフレーム」又は「ＯＲＦ」なる用語は、ポリペプチド をコードするポリヌクレオチド配列の領域を意味し、この領域はコーディング配 列の一部でも完全コーディング配列でもよい。 「コーディング配列」とは、適当な調節配列の制御下におかれると、ｍＲＮＡ に転写され、ポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディ ング配列の境界は５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳停止コドンにより 決定される。コーディング配列の非限定的な例としてはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び 組換えポリヌクレオチド配列が挙げられる。 「〜で／として免疫学的に識別可能」なる用語は、指定ポリペプチドにも存在 し且つ指定ポリペプチドに固有のエピトープ とポリペプチドの存在を意味する。免疫学的相同度は抗体結合及び／又は結合競 合により決定することができる。これらの技術は当業者に公知であり、本明細書 にも記載する。エピトープの固有性は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知データバンクの コンピューター検索によりエピトープをコードするポリヌクレオチド配列を検索 したり、他の公知タンパク質とのアミノ酸配列比較により決定することもできる 。 本明細書で使用する「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味す る。エピトープはエピトープに固有の空間コンホメーションで３個のアミノ酸を 含むと考えられる。一般に、エピトープは少なくとも５個のこのようなアミノ酸 から構成され、より一般には少なくとも８〜１０個のアミノ酸から構成される。 空間コンホメーションの試験方法は当該技術分野で公知であり、例えばＸ線結晶 解析及び二次元核磁気共鳴等が挙げられる。 「配座エピトープ」とは、免疫学的に認識可能な構造のアミノ酸の特定並列か ら構成されるエピトープであり、このようなアミノ酸は同一ポリペプチドに連続 的もしくは不連続的に存在するか又は異なるポリペプチドに存在する。 ポリペプチドはポリペプチドに含まれる特定エピトープの抗体認識により抗体 と結合する場合に抗体に対して「免疫反応性」である。免疫反応性は抗体結合、 より詳細には抗体結合の動態及び／又は抗体の対象エピトープを含む公知ポリペ プチドを競合剤として使用する結合競合により決定することができる。ポリペプ チドが抗体に対して免疫反応性であるか否かを決定する方法は当該技術分野で公 知である。 本明細書で使用する「着目エピトープを含む免疫原性ポリペプチド」なる用語 は、天然に存在する着目ポリペプチド又はそのフラグメントと、他の手段（例え ば化学合成又は組換え生物におけるポリペプチドの発現）により製造したポリペ プチドを意味する。 「形質転換」なる用語は、挿入に使用する方法に関係なく、宿主細胞への外来 ポリヌクレオチドの挿入を意味する。例えば、直接取り込み、形質導入又はｆ交 配が挙げられる。外来ポリヌクレオチドは非組み込みベクター（例えばプラスミ ド）として維持してもよいし、宿主ゲノムに組み込んでもよい。 「処置」とは予防及び／又は治療を意味する。 本明細書で使用する「個体」なる用語は脊椎動物、特に哺乳 動物種の構成員を意味し、非限定的な例として家畜、競技用動物、霊長類及びヒ トが挙げられ、より特定的にはこの用語はヒトを意味する。 本明細書で使用する「センス鎖」又は「＋鎖」（又は「＋」）なる用語は、ポ リペプチドをコードする配列を含む核酸を意味する。「アンチセンス鎖」又は「 −鎖」（又は「−」）なる用語は、「＋」鎖の配列に相補的に配列を含む核酸を 意味する。 「試料」なる用語は、分析物（例えば着目抗体又は着目抗原）の起源である個 体の身体の成分を意味する。これらの成分は当該技術分野で周知である。これら の試料としては、本明細書に記載する本発明の方法により試験することができる 生物サンプルが挙げられ、ヒト及び動物体液（例えば血液、血清、血漿、脳髄液 、尿、リンパ液、呼吸管、腸管及び尿生殖管の種々の体外分泌物、涙、唾液、乳 汁、白血球、ミエローマ等）、生物学的液体（例えば細胞培養上清）、固定組織 検体及び固定細胞検体が挙げられる。 「精製物」とは、物質が通常会合している細胞成分及び着目試料中に存在し得 る他の型の細胞から分離した物質の調製物を意味する。 「ＰＮＡ」とは、ターゲットの存在を判定するために本明細書に記載するアッ セイ等の方法で使用可能な「ペプチド核酸類似体」を意味する。「ＭＡ」とは、 ターゲットの存在を判定するために本明細書に記載するアッセイ等の方法で使用 可能な「モルホリノ類似体」を意味する。例えば、参考資料として本明細書の一 部とする米国特許第５，３７８，８４１号参照。ＰＮＡは中性帯電部分であり、 ＲＮＡターゲットもＤＮＡも対象にできる。例えば本発明のＤＮＡプローブの代 わりにアッセイで使用されるＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを使用する場合 には得られない利点がある。これらの利点としては、生産性、大規模標識、再生 産性、安定性、イオン強度変化に対する不感受性及びＤＮＡ又はＲＮＡを使用す る方法に存在する酵素分解に対する耐性が挙げられる。これらのＰＮＡはフルオ レセイン、放射性核種、化学発光化合物等のシグナル発生化合物で標識すること ができる。従って、ＰＮＡ又は他の核酸類似体（例えばＭＡ）はＤＮＡ又はＲＮ Ａの代わりにアッセイ方法で使用することができる。本明細書ではＤＮＡプロー ブを使用するアッセイについて記載するが、アッセイ試薬で必要に応じて適当な 変更を加えてＰＮＡ又はＭＡをＲＮＡ又はＤＮＡに代用する ことは当業者に実施可能である。 本明細書で使用する「分析物」なる用語は、試料中に存在し得る被験物質であ る。分析物は天然特異的結合メンバー（例えば抗体）が存在するか、又は特異的 結合メンバーを作製することかできる任意物質とすることができる。従って、分 析物はアッセイで１種以上の特異的結合メンバーに結合することができる物質で ある。「分析物」は更に任意抗原物質、ハプテン、抗体及びその組み合わせも含 む。特異的結合対のメンバーとして、分析物は天然特異的結合パートナー（対） により検出することができ、例えばビタミンＢ１２の試験には特異的結合対のメ ンバーとして内因子タンパク質を使用し、葉酸の試験には葉酸結合タンパク質を 使用し、炭水化物の試験には特異的結合対のメンバーとしてレクチンを使用する 。分析物としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチドターゲット等 が挙げられる。 本明細書で使用する「炎症」又は「炎症性疾患」とは、好中球、好酸球、マク ロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞等の活性化リンパ球が宿主組織に浸潤し、宿主生 物に損傷を生じることを意味する。炎症性疾患の非限定的な例としては、炎症性 腸疾患、敗血症及び関節リウマチ等の症状が挙げられる。 「発現配列Ｔａｇ」又は「ＥＳＴ」とは、組織から抽出したｍＲＮＡの逆転写 後にベクターに挿入することにより作製したｃＤＮＡインサートの部分配列を意 味する。 「転写物像」とは、ライブラリーでＥＳＴの定量分布を与えるテーブル又はリ ストを意味し、ライブラリーを作製した組織中で活性な遺伝子を表す。 本発明は特異的結合メンバーを利用するアッセイを提供する。本明細書で使用 する「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対、即ち、一方が化学又は物理的 手段により第２の分子に特異的に結合する２個の異なる分子のメンバーである。 従って、慣用イムノアッセイの抗原−抗体特異的結合対以外に、他の特異的結合 対としては、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配 列、エフェクター分子とレセプター分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素等が 挙げられる。更に、特異的結合対は、元の特異的結合メンバーの類似体であるメ ンバー（例えば分析物類似体）でもよい。免疫反応性特異的結合メンバーはモノ クローナル及びポリクローナル抗原、抗原フラグメント、抗体及び抗体フラグメ ントとその複合体を含み、組換えＤＮＡ分子により形成されるものも含む。 本明細書で使用する「ハプテン」なる用語は、抗体と結合することができるが 、キャリヤータンパク質と結合しない限り、抗体形成を誘発することができない 部分抗原又は非タンパク質結合メンバーを意味する。 本明細書で使用する「捕獲試薬」とは未標識特異的結合メンバーを意味し、サ ンドイッチアッセイでは分析物、競合アッセイでは指示試薬又は分析物、間接ア ッセイではそれ自体分析物に特異的な補助特異的結合メンバーに対して夫々特異 的である。捕獲試薬はアッセイの実施前又はアッセイの実施中に固相材料に直接 又は間接的に結合し、試料から固定化複合体を分離することができる。 「指示試薬」は外部手段により検出可能な測定可能なシグナルを発生すること が可能であり、特異的結合メンバーに結合した「シグナル発生化合物」（「ラベ ル」）を含む。本明細書で使用する「特異的結合メンバー」とは、特異的結合対 即ち、分子の一方が化学又は物理的手段により第２の分子に特異的に結合する２ 個の異なる分子のメンバーを意味する。特異的結合対の抗体メンバー以外に、指 示試薬は任意の特異的結合対のメンバーとすることができ、例えばハプテン−抗 ハプテン系（例え ばビオチンと抗ビオチン）、ビオチン又はアビジン、炭水化物又はレクチン、相 補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子又はレセプター分子、酵素補因子又は 酵素、酵素阻害剤又は酵素等が挙げられる。免疫反応性特異的結合メンバーはサ ンドイッチアッセイでは着目ポリペプチド、競合アッセイでは捕獲試薬、間接ア ッセイでは補助特異的結合メンバーと夫々結合することが可能な抗体、抗原又は 抗体／抗原複合体とすることができる。プローブとプローブアッセイについて記 載する際には、「レポーター分子」なる用語を使用する場合がある。レポーター 分子は特異的結合対の特異的結合メンバーに結合した上記のようなシグナル発生 化合物（例えばカルバゾール又はアダマンタン）を含む。 予想される種々の「シグナル発生化合物」（ラベル）としては、色素、触媒（ 例えば酵素）、発光化合物（例えばフルオレセイン及びローダミン）、化学発光 化合物（例えばジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミ ノール）、放射性元素及び直接可視ラベルが挙げられる。酵素の例としてはアル カリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が 挙げられる。単独又は１種以上の付加 物質と併用してシグナルを発生することができるならば、特定ラベルの選択は重 要ではない。 「固相」（「固体支持体」）は当業者に公知であり、反応トレーのウェルの壁 、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜 、微粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球及びＤｕ ｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂ ｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬから市販されている無水ピルビン酸とホルムアルデヒ ドにより「固定された」赤血球）等が挙げられる。「固相」は重要ではなく、当 業者により選択することができる。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気又は 非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラ ス又はシリコンチップ、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球及びＤｕｒａｃｙｔｅ ｓ（登録商標）はいずれも適当な例である。ペプチドを固相に固定化するために 利用可能な方法としては、イオン、疎水性、共有相互作用等が挙げられる。本明 細書で使用する「固相」とは、不溶性であるか又は後期反応により不溶性にする ことができる任意材料を意味する。固相は捕獲試薬を吸引して固定化するその固 有の能力により選択する ことができる。あるいは、固相は捕獲試薬を吸引して固定化する能力をもつ付加 レセプターを保持することができる。付加レセプターとしては、捕獲試薬自体又 は捕獲試薬に結合した帯電物質に対して逆の電荷をもつ物質が挙げられる。更に 別の例としてレセプター分子は、固相に固定化（結合）し、特異的結合反応を介 して捕獲試薬を固定化する能力をもつ任意特異的結合メンバーとすることができ る。レセプター分子はアッセイの実施前又はアッセイの実施中に捕獲試薬を固相 材料に間接結合することができる。従って、固相はプラスチック、改質プラスチ ック、磁性又は非磁性金属、試験管のガラス又はシリコン表面、マイクロタイタ ーウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（又は他の動物の）赤血球 、Ｄｕｒａｃｙｔｅｓ（登録商標）及び当業者に公知の他の構造とすることがで きる。 固相は更に検出抗体と接触できるようにするために十分な多孔度と抗原と結合 するのに適した表面親和性をもつ任意の適当な多孔質材料でもよいと考えられ、 この点も本発明の範囲内である。一般には微孔質構造が好ましいが、水和状態で ゲル構造をもつ材料も使用できる。このような有用な固体支持体の非限定的な例 としてはニトロセルロースとナイロンが挙げられる。 本明細書に記載するこのような多孔質個体支持体は厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ 、好ましくは約０．１ｍｍのシート状であることが好ましい。細孔寸法は広い範 囲をとることができ、好ましくは約０．０２５〜１５μｍ、特に約０．１５〜１ ５μｍである。このような支持体の表面は、抗原又は抗体を支持体に共有結合す る化学的プロセスにより活性化してもよい。しかし、十分に解明されていない疎 水力による多孔質材料への吸着により一般には抗原又は抗体の不可逆的結合が得 られる。試薬 本発明は着目ＴＮＦ−γから誘導されるポリヌクレオチド配列、該配列でコー ドされるポリペプチド、及びこれらのポリペプチドから生成される抗体等の試薬 を提供する。本発明は更に、開示するポリヌクレオチド及びこれらのポリヌクレ オチドに相補的な核酸配列から誘導されるオリゴヌクレオチドフラグメント等の 試薬も提供する。本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド又は抗体はＴＮＦ −γ遺伝子に関連する症状（例えば炎症）をもつ個体の診断、予後判定及び／又 は処置、又はこの症状の素因を同定するために使用することができる。本明細書 に開示する配列は、アッセイで使用することができるか又は遺伝 子転写活性の特定プロフィルを生成するための独自のポリヌクレオチドを表す。 本明細書に記載する方法では正常又は変異遺伝子発現の検出に選択ＴＮＦ−γ 由来ポリヌクレオチドを使用することができる。このような方法は本明細書に開 示するＴＮＦ−γ由来ポリヌクレオチド又はそのオリゴヌクレオチド、フラグメ ントもしくはその誘導体、又はこれらのポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を 利用することができる。 本明細書に開示するポリヌクレオチド、その相補的配列又はそのフラグメント はＴＮＦ−γ疾患及び関連症状に関係する遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを検出 、増幅又は定量するためのアッセイで使用することができる。また、ＴＮＦ−γ ポリペプチドをコードする完全又は部分コーディング領域を同定するためにも使 用することができる。更に、アッセイ用キットとして個々の容器に入れて提供す ることもできるし、個々の組成物として提供することもできる。アッセイ用キッ トで提供する場合には、バッファー、結合体等の他の適当な試薬も加えてもよい 。 ポリヌクレオチドはｍＲＮＡの形態でもＤＮＡの形態でもよい。ＤＮＡ、ｃＤ ＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡの形態の ポリヌクレオチドが本発明の範囲に含まれる。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよ く、１本鎖の場合にはコーディング（センス）鎖でも非コーディング（アンチセ ンス）鎖でもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は本発明で提供 するコーディング配列と同一でもよいし、遺伝暗号の冗長又は縮重の結果として 本発明で提供するＤＮＡと同一ポリペプチドをコードする別のコーディング配列 でもよい。 このポリヌクレオチドはポリペプチドのコーディング配列のみを含むものでも よいし、ポリペプチドのコーディング配列と付加コーディング配列（例えばリー ダーもしくは分泌配列又はプロタンパク質配列）を含むものでもよいし、ポリペ プチドのコーディング配列（及び場合により付加コーディング配列）と非コーデ ィング配列（例えばポリペプチドのコーディング配列の５’及び／又は３’非コ ーディング配列）を含むものでもよい。 更に、本発明はポリヌクレオチド欠失、置換又は付加等の変異と、変異ポリヌ クレオチド配列に起因する任意ポリペプチド変異を含む変異ポリヌクレオチドも 包含する。本発明のポリヌクレオチドは更に、本発明で提供するコーディング配 列の天然 対立遺伝子変異体であるコーディング配列も含んでいてもよい。 更に、ポリペプチドのコーディング配列は、宿主からのポリペプチドの発現及 び分泌を助長するポリヌクレオチド配列（例えば細胞からのポリペプチドの輸送 を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）に同一読み枠内で融合 してもよい。リーダー配列をもつポリペプチドはプレタンパク質であり、ポリペ プチドの形態を形成するために宿主細胞により開裂されるリーダー配列をもつこ とができる。ポリヌクレオチドは更にタンパク質と付加５’アミノ酸残基からな るプロタンパク質をコードすることができる。プロ配列をもつタンパク質はプロ タンパク質であり、タンパク質の不活性形態の場合もある。プロ配列が開裂され ると、活性タンパク質が残る。従って、本発明のポリヌクレオチドはタンパク質 又はプロ配列をもつタンパク質又はプレ配列（リーダー配列）とプロ配列の両者 をもつタンパク質をコードすることができる。 本発明のポリヌクレオチドは更に本発明のポリペプチドの精製を可能にするマ ーカー配列にインフレーム融合したコーディング配列をもつことができる。マー カー配列は細菌宿主の場合にはマーカーに融合したポリペプチドを精製できるよ うにｐＱＥ− ９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグとすることができ、例えば哺 乳動物宿主（例えばＣＯＳ−７細胞）を使用する場合には、マーカー配列は赤血 球凝集素（ＨＡ）タグとすることができる。ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝 集素タンパク質から誘導されるエピトープに対応する。例えば、Ｉ．Ｗｉｌｓｏ ｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４）参照。 ポリヌクレオチドと配列の間の相同度が少なくとも５０％、好ましくは少なく とも７０％である場合には、ポリヌクレオチドは本発明で提供する配列にハイブ リダイズすると考えられる。 本発明は更に、ポリペプチドの少なくとも一部が本発明で提供するポリヌクレ オチドから選択されるＴＮＦ−γ遺伝子によりコードされる精製ＴＮＦ−γ遺伝 子ポリペプチドを使用することにより製造した抗体も提供する。これらの抗体は 本発明で提供する試料中のＴＮＦ−γポリペプチドの検出方法で使用することが できる。これらの抗体は例えば変異又は異常発現に関連する症状でＴＮＦ−γポ リペプチドの活性を中和するのに治療目的で使用することもできる。 本発明は更に、本発明で提供する推定アミノ酸配列をもつＴＮＦ−γポリペプ チドと、該ポリペプチドのフラグメント、 類似体及び誘導体にも関する。本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天 然精製ポリペプチド又は合成ポリペプチドのいずれでもよい。ＴＮＦ−γポリペ プチドのフラグメント、誘導体又は類似体は、アミノ酸残基の１個以上が保存又 は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されているもので もよく、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによりコードされるものでも されないものでもよいし、アミノ酸残基の１個以上が置換基を含むものでもよい し、例えばポリペプチドの半減期を延ばすための化合物（例えばポリエチレング リコール）等の別の化合物とポリペプチドを融合したものでもよいし、リーダー もしくは分泌配列又はポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製に使用さ れる配列等の付加アミノ酸をポリペプチドに融合したものでもよい。このような フラグメント、誘導体及び類似体は本発明の範囲内である。本発明のポリペプチ ド及びポリヌクレオチドは単離形態で提供することが好ましく、精製形態が好ま しい。 従って、本発明のポリペプチドは天然に存在するポリペプチドと同一であるか 又は１個以上のアミノ酸置換による副次的変異の点で異なるアミノ酸配列をもつ ことができる。変異は一般 に約１〜５アミノ酸の範囲の「保存変異」とすることができ、置換アミノ酸は類 似の構造又は化学性質をもち、例えばロイシンをイソロイシン又はスレオニンを セリンで置換する。他方、変異は非保存変異でもよく、例えばグリシンをトリプ トファンで置換してもよい。アミノ酸欠失又は挿入又はその両者による同様の副 次的変異でもよい。生物又は免疫活性を変えずにどのアミノ酸残基を何個置換、 挿入又は欠失すればよいかを決定するには、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア （ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）等の当該技術分野で周知 のコンピュータープログラムを使用することができる。 本発明のポリヌクレオチド配列により構築したプローブは、種々の分析を提供 するために種々のアッセイ方法で使用することができる。例えば、このようなプ ローブは染色体分析を実施するために蛍光Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーショ ン（ＦＩＳＨ）技術で使用することができ、染色体分布から目に見えるか又は、 ＰＣＲにより作製するか及び／又は対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプロ ーブ、対立遺伝子特異的増幅もしくは直接配列決定により検出可能な欠失又は転 位等の染色体の癌特異的構造変異を同定するために使用することができる。プロ ーブは更 に、放射性同位体、直接もしくは間接検出可能なハプテン、又は蛍光分子で標識 し、固定組織検体又は細胞におけるポリヌクレオチドを含む遺伝子のｍＲＮＡ発 現を評価するためにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験で使用すること もできる。 本発明は更に本発明で提供するポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造に関 する教示も提供する。プローブアッセイ 本発明で提供する配列は、試料中の核酸の検出のためのアッセイで使用可能な プローブを作製するために使用することができる。プローブは着目ポリヌクレオ チドの保存ヌクレオチド領域から設計してもよいし、着目ポリヌクレオチドの非 保存ヌクレオチド領域から設計してもよい。アッセイで最適化するためのこのよ うなプローブの設計は当業者により実施可能である。一般に、最大特異性が所望 される場合には、非保存又は固有領域から核酸プローブを作製し、例えば多重遺 伝子ファミリーの異なるメンバーに密接に関連するか又はマウスとヒトのような 関連種に存在するヌクレオチド領域をアッセイする場合には保存領域から核酸プ ローブを作製する。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は核酸又はその混合物に含 まれる所望核酸配列（ターゲット）を増幅するための技術である。ＰＣＲでは、 １対のプライマーを過剰に使用してターゲット核酸の相補鎖の外側末端でハイブ リダイズする。プライマーは各々鋳型としてターゲット核酸を使用してポリメラ ーゼにより伸長する。伸長産物は元のターゲット鎖から解離後にそれ自体ターゲ ット配列となる。その後、新しいプライマーをハイブリダイズし、ポリメラーゼ により伸長し、ターゲット配列分子の数を幾何学的に増加するようにサイクルを 反復する。ＰＣＲは参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，６８３ ，１９５号及び４，６８３，２０２号に開示されている。 リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は別の核酸増幅法である。ＬＣＲでは、いずれも ターゲットに対してモル過剰で使用する２個の一次（第１及び第２）プローブと ２個の二次（第３及び第４）プローブを含むプローブ対を使用する。第１のプロ ーブはターゲット鎖の第１のセグメントにハイブリダイズし、第２のプローブは ターゲット鎖の第２のセグメントにハイブリダイズし、第１及び第２のセグメン トは隣接しているので、一次プローブは５’リン酸−３’ヒドロキシル関係で相 互に隣接し、リガーゼは２個のプローブを共有的に融合又は連結して融合産物と する ことができる。更に、同様の隣接関係で第３（二次）プローブは第１のプローブ の一部にハイブリダイズし、第４（二次）プローブは第２のプローブの一部にハ イブリダイズすることができる。当然のことなから、ターゲットが元々２本鎖で ある場合には、二次プローブは最初にターゲット相補体にもハイブリダイズする 。一次プローブの連結鎖はターゲット鎖から分離されると、第３及び第４のプロ ーブとハイブリダイズし、これらのプローブを連結して相補的な二次連結産物を 形成することができる。連結産物はターゲット又はその相補対に機能的に等価で あることに留意すべきである。ハイブリダイゼーション及び連結サイクルを繰り 返すことにより、ターゲット配列の増幅が達成される。この技術は、いずれも参 考資料として本明細書の一部とする１９８９年６月１６日付けで公開されたＫ． ＢａｃｋｍａｎのＥＰ−Ａ−３２０３０８及び１９９１年７月３１日付けで公開 されたＫ．ＢａｃｋｍａｎらのＥＰ−Ａ−４３９１８２により詳細に記載されて いる。 ｍＲＮＡの増幅では、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後にポリメラーゼ連鎖反応 を実施する（ＲＴ−ＰＣＲ）か、又は参考資料として本明細書の一部とする米国 特許第５，３２２，７７０号に記 載されているように両段階で単一酵素を使用するか、又は同様に参考資料として 本明細書の一部とするＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０−８４（１９９４）に記載されてい るようにｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後に非対称ギャップリガーゼ連鎖反応を実 施する（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）ことが本発明の範囲内である。 本発明で利用可能な他の公知増幅方法の非限定的な例としては、ＰＮＡＳ Ｕ ＳＡ ８７：１８７４−１８７８（１９９０）とＮａｔｕｒｅ ３５０（Ｎｏ． ６３１３）：９１−９２（１９９１）に記載されている所謂「ＮＡＳＢＡ」又は 「３ＳＲ」技術、公開ヨーロッパ特許出願（ＥＰＡ）第４５４４６１０号に記載 されているようなＱ−β増幅、Ｇ．Ｔ．Ｗａｌｋｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ４２：９−１３（１９９６）とヨーロッパ特許出願第６８４３１５号に記載され ているような鎖置換増幅、及びＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１号に記載されてい るようなターゲット媒介増幅が挙げられる。 １態様では、本発明は一般にターゲットポリヌクレオチド配列を含む疑いのあ る試料を、増幅プライマーとアンプリコン配列の内部領域にハイブリダイズする ことが可能な検出プローブ を含む増幅反応試薬と接触させる段階を含む。本発明で提供する方法により使用 するプローブとプライマーは捕獲及び検出ラベルで標識し、プローブは一方の型 のラベルで標識し、プライマーは他方の型のラベルで標識する。更に、プライマ ーとプローブはプローブ配列がプライマー配列よりも低い融点をもつように選択 する。増幅試薬、検出試薬及び試料は、ターゲット配列の存在下でターゲット配 列（アンプリコン）のコピーが生成されるような増幅条件におく。通常の場合に は、プライマーはターゲット配列とその相補鎖を増幅するように提供されるので 、アンプリコンは２本鎖である。その後、２本鎖アンプリコンを熱変性させ、１ 本鎖アンプリコンメンバーを生成する。１本鎖アンプリコンメンバーが形成され たら、混合物を冷却し、プローブと１本鎖アンプリコンメンバーの複合体を形成 させる。 １本鎖アンプリコン配列とプローブ配列を冷却するにつれてプローブ配列は１ 本鎖アンプリコンメンバーに優先的に結合した。プローブ配列は一般にプライマ ー配列よりも短くなるように選択し、従ってプライマーよりも低い融点をもつの で、この知見は意外である。プライマーにより生成されるアンプリコンの融点は プローブの融点よりも高くなるはずである。従って、 混合物を冷却するにつれて２本鎖アンプリコンが再形成されると予想された。し かし、上述のように実際にはそうではない。プローブは１本鎖アンプリコンメン バーに優先的に結合することが判明した。更に、プライマー配列をプローブより も過剰に加えても、プローブ／１本鎖アンプリコン結合のこの優先が存在する。 プローブ／１本鎖アンプリコンメンバーハイブリッドが形成された後、これら のハイブリッドを検出する。プライマー及びプローブ上に存在する検出ラベル及 び捕獲ラベルを使用してハイブリッドを検出するためには標準不均一アッセイフ ォーマットを利用できる。ハイブリッドは捕獲ラベルにより固相試薬に結合し、 検出ラベルにより検出することができる。検出ラベルが直接検出可能な場合には 、固相上のハイブリッドの存在は、ラベルに検出可能なシグナルを発生させ、必 要に応じてシグナルを検出することにより検出することができる。ラベルが直接 検出可能でない場合には、一般に直接検出可能なラベルに結合した結合メンバー を含む結合体と捕獲ハイブリッドを接触させる。結合体は複合体に結合し、複合 体上の結合体の存在を直接検出可能なラベルで検出することができる。従って、 固相試薬 上のハイブリッドの存在を決定することができる。当業者に自明の通り、ハイブ リダイズしていないアンプリコン又はプローブと未結合結合体を洗い流すために 洗浄段階を使用してもよい。 試料は一般にターゲット配列を含む疑いのある任意材料である。試料は例えば 個体から検体を得、必要に応じて検体に含まれる細胞を破壊してターゲット核酸 を放出させることにより、当該技術分野で周知の技術を使用して調製することが できる。ターゲット配列は１本鎖として記載するが、ターゲット配列が実際には ２本鎖であるが、増幅プライマー配列とのハイブリダイゼーションの前にその相 補体から分離されている場合も含むと考えられる。この方法でＰＣＲを使用する 場合には、ターゲット配列の末端は通常分かっている。好ましい方法でＬＣＲ又 はその変法を使用する場合には、完全ターゲット配列は通常分かっている。一般 に、ターゲット配列は例えばＲＮＡ又はＤＮＡ等の核酸配列である。 本発明で提供する方法は熱サイクル反応混合物を含む周知増幅反応、特にＰＣ Ｒ及びＧＬＣＲで使用することができる。増幅反応は一般にプライマーを利用し 、通常は著しく大きい核酸配列の小領域であるターゲット核酸配列のコピーを繰 り返し生 成する。プライマーはそれ自体、ターゲット配列の領域に相補的な核酸配列であ る。増幅条件下でこれらのプライマーはターゲット配列の相補領域にハイブリダ イズ又は結合する。ターゲット配列のコピーは一般に、ポリメラーゼ又はリガー ゼ活性をもつ酵素を別々又は併用し、ハイブリダイズしたプライマーにヌクレオ チドを付加及び／又は隣接プローブ対を連結するプライマー伸長及び／又は連結 方法により生成される。モノマー又は予備形成オリゴマーとしてプライマー又は プローブに付加するヌクレオチドもターゲット配列に相補的である。プライマー 又はプローブは十分に伸長及び／又は連結されると、例えば相補的核酸鎖が解離 する温度である「融点」まで反応混合物を加熱することにより、ターゲット配列 から分離される。こうして、ターゲット配列に相補的な配列が形成される。 次に、新しい増幅サイクルを実施し、２本鎖配列を分離し、プライマー又はプ ローブを夫々のターゲットにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたプライマ ー又はプローブを伸長及び／又は連結し、再分離することにより、ターゲット配 列の数を更に増幅することができる。増幅サイクルにより生成される相補的配列 はプライマー伸長の鋳型として又は２本のプローブの ギャップを埋めるように機能し、ターゲット配列の数を更に増幅することができ る。一般に、反応混合物は２０〜１００回、より一般には２５〜５０回サイクル を繰り返す。サイクル数は当業者により決定することができる。こうして、ター ゲット配列とその相補的配列の多重コピーが生成される。こうして、プライマー はターゲット配列が増幅条件下に存在する場合にはその増幅を開始する。 一般に、ＰＣＲではターゲット鎖とその相補体の一部に相補的な２個のプライ マーを使用する。ＬＣＲでは、ターゲット配列に相補的な２個のプローブと、同 様にターゲット相補体に相補的な２個のプローブの４個のプローブを一般に使用 する。プライマーセットと従来記載されている酵素に加え、核酸増幅反応混合物 は更に周知の他の試薬を含むことができ、非限定的な例としては、マンガン、マ グネシウム塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びデオキシ ヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）（例えばデオキシアデニン三リン酸、デオキ シグアニン三リン酸、デオキシシトシン三リン酸及びデオキシチミン三リン酸） 等の酵素補因子が挙げられる。 増幅プライマーはターゲット配列の増幅を開始するが、検出 （又はハイブリダイゼーション）プローブは増幅に関与しない。検出プローブは 一般に例えば国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２号に開示されているペプチド核 酸、米国特許第５，１８５，４４４号、５，０３４，５０６号及び５，１４２， ０４７号に記載されているモルホリノ類似体等の核酸配列又は非帯電核酸類似体 である。プローブに付けるラベルの種類に応じて、増幅反応により生成されるア ンプリコンを捕獲又は検出するためにプローブを使用する。プローブはターゲッ ト配列の増幅には関与しないので、場合により、付加ｄＮＴＰをプローブに付加 できないという意味で「非伸長性」にする必要がある。類似体自体は通常非伸長 性であり、核酸プローブはヒドロキシル基が伸長に関与できないようにプローブ の３’末端を修飾することにより非伸長性にすることができる。例えば、プロー ブの３’末端を捕獲又は検出ラベルで官能化すると、ヒドロキシル基を消費又は 他の方法でブロックすることができる。あるいは、３’ヒドロキシル基を単に開 裂、置換又は修飾してもよい。参考資料として本明細書の一部とする１９９３年 ４月１９日付け米国特許出願第０７／０４９，０６１号は、プローブを非伸長性 にするために使用可能な修飾について記載している。 従って、プライマーとプローブの比は重要ではない。即ち、プローブ又はプラ イマーの一方が他方よりも高濃度になるようにどちらかを過剰に反応混合物に加 えてもよい。あるいは、プライマーとプローブを等濃度で使用してもよいし。し かし、プライマーをプローブよりも過剰に反応混合物に加えることが好ましい。 従って、プライマーとプローブの比は例えば、５：１及び２０：１が好ましい。 プライマーとプローブの長さは決まっていないが、プローブ配列はプライマー 配列よりも低い融点をもつように選択する。従って、プライマー配列は一般にプ ローブ配列よりも長い。一般に、プライマー配列は２０〜５０ヌクレオチド長、 より一般には２０〜３０ヌクレオチド長である。典型的プローブは１０〜２５ヌ クレオチド長である。 プライマーとプローブの合成方法は種々のものが当該技術分野で周知である。 また、プライマー又はプローブにラベルを結合する方法も当該技術分野で周知で ある。例えば、慣用ヌクレオチドホスホロアミダイト化学とＡｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｄｕｐｏｎｔ （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）又はＭｉｌｌｉｇｅｎ （Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）から市販されている器具を使用して所望の核酸プライ マー又はプローブを合成することは日常的に行われている。本発明のプライマー 又はプローブ等のオリゴヌクレオチドを標識する方法は多数のものが記載されて いる。Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）とＣｌｏ ｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）はいずれもプローブ標識技術を記載及 び商業化している。例えば、３’−Ａｍｉｎｅ−ＯＮ ＣＰＧ（登録商標）（Ｃ ｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して３’オリゴ末端に第１ 級アミンを結合することができる。同様に、ＡｍｉｎｏｍｏｄｉｆｉｅｒＩＩ（ 登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して第１級アミンを５’オリゴ末端に結 合することができる。アミンは慣用活性化及び結合化学を使用して種々のハプテ ンと反応させることができる。更に、各々参考資料として本明細書の一部とする 同時係属出願である１９９０年１２月１１日付け米国出願第６２５，５６６号及 び１９９０年１２月２０日付け米国出願第６３０，９０８号は、夫々５’及び３ ’末端でプローブを標識する方法を教示している。１９９２年６月２５日付けで 公開されたＷＯ９２／１０５０５号及び１９９２年７月９日付けで公 開されたＷＯ９２／１１３８８は、夫々５’及び３’末端でプローブを標識する 方法を教示している。オリゴヌクレオチドの公知標識方法によると、ラベル−ホ スホロアミダイト試薬を調製して使用し、その合成中にオリゴヌクレオチドにラ ベルを加える。例えばＮ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ２９（ ４６）：５９０５−５９０８（１９８８）又はＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎら，公開米国 特許出願第０７／２４６，６８８号（ＮＩＴＳ ＯＲＤＥＲ番号ＰＡＴ−ＡＰＰ Ｌ−７−２４６，６８８）（１９８９）参考。プローブは３’及び５’で標識す ることが好ましい。 プライマー又はプローブに付ける捕獲ラベルは、固相試薬の特異的結合メンバ ーと結合対を形成する特異的結合メンバーとすることができる。当然のことなが ら、プライマー又はプローブ自体を捕獲ラベルとして使用してもよい。例えば、 固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、プライマー又はプローブの 相補的部分と結合してプライマー又はプローブを固相に固定化するように選択す ることができる。プローブ自体を結合メンバーとして利用する場合には、プロー ブは１本鎖アンプリコンメンバーに非相補的な配列又は「テール」を含むことが 当業者に理解されよう。プライマー自体を捕獲ラベルとして利用する場合には、 プローブはプライマー配列と完全に相補的にならないように選択するので、プラ イマーの少なくとも一部は固相上の核酸と自由にハイブリダイズする。 一般に、プローブ／１本鎖アンプリコンメンバー複合体は、不均一イムノアッ セイを実施するために一般に使用されている技術を使用して検出することができ る。この態様では、市販のＡｂｂｏｔｔ ＬＣｘ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔ ｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により使用さ れているプロトコールに従って検出を行うことが好ましい。 本明細書に開示するプライマーとプローブは、試料を１対のプライマーと接触 させ、増幅を行い、ハイブリダイゼーションプローブを加え、検出を行う典型的 ＰＣＲアッセイで有用である。 本発明により提供される別の方法では、少なくとも１種が本発明で提供するポ リヌクレオチドである複数のポリヌクレオチドと試料を接触させ、試料を複数の ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を検出 する。ハ イブリダイゼーション複合体を同定及び定量し、ＴＮＦ−γ疾患の指標である特 徴をまとめる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の当該技術分野で周知の方法 によりＤＮＡ産物を逆転写及び増幅することにより、発現させたＲＮＡ配列を更 に検出してもよい。薬剤スクリーニング及び遺伝子治療 本発明は更に、癌を含むＴＮＦ−γ疾患に関係するポリヌクレオチドの異常発 現に関連する症状をもつ患者に本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチ ド等のアンチセンスＴＮＦ−γ遺伝子由来分子を導入するための遺伝子治療法の 使用も包含する。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡフラグメント及びリボザイムを 含むこれらの分子は、ＴＮＦ−γ由来ポリヌクレオチドｍＲＮＡの翻訳を阻害す るように設計し、ＴＮＦ−γ由来ポリヌクレオチドの変異又は異常発現に関連す る症状の処置に治療的に使用することができる。 あるいは、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡが上記のようにＴＮＦ−γ由来ポリ ペプチドの産生を阻害するようにｉｎ ｖｉｖｏ発現されるように、上記オリゴ ヌクレオチドを当該技術分野で公知の方法により細胞に送達することができる。 従っ て、ＴＮＦ−γ由来ポリヌクレオチドに対するアンチセンス構築物はＴＮＦ−γ 由来転写産物の作用を逆行させ、炎症等のＴＮＦ−γ疾患症状を処置するために 使用することができる。これらのアンチセンス構築物は腫瘍転移を処置するため にも使用することができる。 このファミリーの分子に関連するもの等の腫瘍血管系に及ぼす効果（Ｍ．Ｗ． Ｂｏｅｈｍｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２６：４０４−４１０， １９９６）は一次及び転移性両者の充実性腫瘍の処置に有用であり、例えば乳癌 、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌 、朋嚢管及び朋管癌、小腸癌、尿管癌（腎臓、膀胱及び尿路上皮を含む）、女性 生殖管癌（子宮頚癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛上皮腫及び妊娠性栄養膜病を含む） 、男性生殖管癌（前立腺癌、精嚢癌、精巣癌及び胚細胞腫瘍を含む）、内分泌腺 癌（甲状腺、副腎及び脳下垂体を含む）、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫（骨及 び軟組織に起因するものやカポジ肉腫を含む）、脳腫瘍、神経腫瘍、眼腫瘍、髄 膜腫瘍（星状細胞腫、神経膠腫、神経グリア芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経腫、 腫瘍芽腫、シュヴァン鞘腫及び髄膜腫を含む）が挙げられる。このよ うなタンパク質は、白血病等の造血悪性病変に起因する充実性腫瘍（即ち緑色腫 、プラズマ細胞腫並びに菌状息肉腫及び皮膚Ｔ細胞リンパ腫／白血病のプラーク 及び腫瘍）の処置及びリンパ腫（ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の両者 ）の処置にも有用である。更に、これらのタンパク質又はその発現をコードする 遺伝子は、単独使用又は放射線療法及び／又は他の化学療法剤と併用した場合に 上記腫瘍の転移を予防するのにも有用であると思われる。 更に、自己免疫疾患（例えばリウマチ様関節炎、免疫関節炎及び変性関節炎） 、種々の眼病（例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植拒絶、水晶体後 方線維増殖症、血管新生緑内障、ルベオーシス、黄斑変性による網膜血管新生、 低酸素症及び他の眼科血管新生症状）、皮膚病（例えば乾癬）、血管病（例えば 血管腫及びアテローム斑内の血管増殖）、オスラーーウェーバー症候群、心筋血 管形成、斑血管新生、末梢血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫及び創傷肉芽 の処置及び予防にも利用できる。更に、内皮細胞の過剰又は異常刺激により特徴 付けられる疾病にも利用でき、非限定的な例として腸癒着、クローン病、アテロ ーム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕（即 ちケロイド）が挙げられる。更には、排卵と胎盤の定着を抑制することにより避 妊剤としても利用できる。ＴＮＦ−γはネコひっかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉ ｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ ）及び潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ ｏｒｉ ）等の病的結果として血管形成をもつ疾病の治療にも有用である。 ＴＮＦ−γは他の疾病治療用組成物及び方法と併用してもよい。例えば、従来 通りに外科手術、放射線照射又は化学療法とＴＮＦ−γを併用して腫瘍を処置し た後、ＴＮＦ−γを患者に投与すると、微小転移巣の休眠を延ばし、残留一次腫 瘍の増殖を安定化及び抑制することができる。更に、ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−γフ ラグメント、ＴＮＦ−γ抗血清、ＴＮＦ−γレセプターアゴニスト、ＴＮＦ−γ レセプターアンダコニスト又はその組み合わせを医薬的に許容可能な賦形剤及び 場合により徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマー）と併用し、治療用組 成物を形成してもよい。 本発明で使用する徐放性マトリックスは酵素もしくは酸−塩基加水分解又は溶 解により分解可能な材料、通常はポリマーからなるマトリックスである。体内に 入ると、マトリックスは酵素と体液の作用を受ける。徐放性マトリックスはリポ ソーム、 ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリ ラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）、ポリ無水物、ポリ （オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチ ン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸 （例えばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポ リビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーン等の生体適合性材料 から選択することが望ましい。好ましい生分解性マトリックスはポリラクチド、 ポリグリコリド、又はポリラクチドコグリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリ マー）の１種のマトリックスである。 リシン等の細胞毒性物質をＴＮＦ−γと高親和性ＴＮＦ−γペプチドフラグメ ントに結合すると、ＴＮＦ−γに結合する細胞を破壊するためのツールを提供す ることができる。細胞毒性物質に結合したペプチドは、所望位置への送達を最大 にするような方法で注入することができる。例えば、リシンを結合した高親和性 ＴＮＦ−γフラグメントはカニューレによりターゲット部位に供給する血管又は 直接ターゲットに送達することができる。このような物質は注入カニューレに結 合した浸透圧ポン プにより制御下に送達することもできる。ＴＮＦ−γアンタゴニストの組み合わ せを血管形成刺激剤と併用投与し、組織の血管新生を増すこともできる。この種 の治療法は転移性癌を破壊する有効な手段を提供することができる。 本発明は更に、ＴＮＦ−γをコードする遺伝子を患者で調節する遺伝子治療も 包含する。参考資料として本明細書の一部とする“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖ ｏ ”，Ｎ．Ｙａｎｇ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ．１２（４）：３３ ５−３５６（１９９２）には、遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞にＤＮ Ａを導入又は送達する種々の方法（遺伝子治療とも呼ぶ）が開示されている。遺 伝子治療はｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ治療で使用するために体細胞又は 生殖系細胞にＤＮＡ配列を組み込むものである。遺伝子治療は遺伝子を置換し、 正常又は異常遺伝子機能を増し、感染性疾患及び他の疾病を治療するように機能 する。 遺伝子治療でこれらの医療問題に対処するためのストラテジーとしては、欠損 遺伝子を同定した後、機能的遺伝子を付加して欠損遺伝子の機能を置換するか又 は低機能性遺伝子を増強す る等の治療ストラテジーや、症状を処置するか又は組織もしくは臓器を処置法に 対してより感受性にするタンパク質産物をコードする遺伝子を付加する等の予防 ストラテジーがある。予防ストラテジーの１例としては、ＴＮＦ−γをコードす る遺伝子を患者に導入して血管形成の発生を予防したり、腫瘍の放射線照射によ り腫瘍細胞の死滅を増すように腫瘍細胞を放射線照射に感受性にする遺伝子を挿 入することができる。 本発明では、ＴＮＦ−γＤＮＡ又はＴＮＦ−γ調節配列の多数の導入プロトコ ールが予想される。ＴＮＦ−γに特異的に関連するもの以外のプロモーター配列 又はＴＮＦ−γタンパク質の産生を増加する他の配列のトランスフェクションも 遺伝子治療法として予想される。この技術の１例として、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓに所在のＴｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａ ｐｉｅｓ，Ｉｎｃ．は相同組換えを使用して細胞中のエリスロポエチン遺伝子を オンにする「遺伝子スイッチ」を挿入している。Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ ，Ａｐｒｉｌ １５，１９９４参照。このような「遺伝子 スイッチ」はこれらのタンパク質を正常に発現しない細胞でＴＮＦ−γ（又はＴ ＮＦ−γレセプター）を活性化するために使用する ことができる。 遺伝子治療のための遺伝子導入法は、（１）物理的(例えばエレクトロポレー ション、直接遺伝子導入及び粒子衝撃)、（２）化学的（例えば脂質系キャリヤ ー及び他の非ウイルスベクター）及び（３）生物学的（例えばウイルス由来ベク ター）の主に３種類に分類される。例えば、ＤＮＡを被覆したリポソーム等の非 ウイルスベクターは患者に直接静脈内注射することができる。リポソーム／ＤＮ Ａ複合体は肝臓に集中してマクロファージとクッパー細胞にＤＮＡを送達すると 考えられる。更に、治療ＤＮＡの標的送達としてベクター又は遺伝子の「裸の」 ＤＮＡを所望臓器、組織又は腫瘍に直接注入することもできる。 遺伝子治療法は送達部位により説明することもできる。遺伝子を送達するため の基本的方法には、ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入及び ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導入がある。ｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入では、細胞を患 者から取り出して細胞培養する。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトし、トランス フェクトした細胞を増殖した後、患者に再注入する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子導 入では、形質転換細胞は組織培養細胞等の培養増殖細胞であり、特定患者からの 特定細胞ではない。 これらの「実験室細胞」をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞を選 択及び増殖し、患者に注入又は他の用途に用いる。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入で は、細胞が患者の体内にあるときに患者の細胞にＤＮＡを導入する。上記全３種 の広義分類を使用すると、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒ ｏ遺伝子導入を達成することができる。 機械的（物理的）ＤＮＡ送達法は、ＤＮＡの直接注入（例えば生殖細胞又は体 細胞へのＤＮＡのマイクロインジェクション）、ＤＮＡを被覆した粒子の空気送 達（例えば「遺伝子銃」で使用される金粒子）、及び無機化学的アプローチ（例 えばリン酸カルシウムトランスフェクション）により実施することができる。筋 細胞にプラスミドＤＮＡを物理的に注入すると、トランスフェクトされる細胞の 百分率が高くなり、マーカー遺伝子を持続発現できることが判明した。プラスミ ドＤＮＡは細胞のゲノムに組み込んでもよいし、組み込まなくてもよい。トラン スフェクトするＤＮＡを組み込まないと、細胞又はミトコンドリアゲノムに突然 変異性挿入、欠失又は変異の恐れなしに長期間にわたって終末分化非増殖組織で 遺伝子産物タンパク質のトランスフェクションと発現が可能になる。必ずしも永 久的で はないが、長期間にわたって治療遺伝子を特定細胞に導入すると、遺伝病を処置 又は予防できる。ＤＮＡを周期的に再注入すると、受容細胞のゲノムに突然変異 を生じることなしに遺伝子産物レベルを維持することができる。外来ＤＮＡを組 み込まないと、１つの細胞内の数種の異なる外来ＤＮＡ構築物と、種々の遺伝子 産物を発現する全構築物を共存させることができる。 粒子による遺伝子導入も、細胞、組織及び臓器にＤＮＡを注入するために使用 することができる。粒子衝撃装置又は「遺伝子銃」では、動力を発生し、標的臓 器、組織又は細胞の侵入を可能にする高速までＤＮＡ被覆高密度粒子（例えば金 又はタングステン）を加速する。遺伝子導入用エレクトロポレーションは電流を 使用して細胞又は組織をエレクトロポレーションによる遺伝子導入に感受性にす る。ＤＮＡ分子が細胞に侵入できるように、所定の電界強度をもつ短い電気イン パルスを使用して膜の浸透性を増加する。粒子による遺伝子導入及びエレクトロ ポレーション技術は当業者に周知である。 化学的遺伝子導入法では、リポソームや他の膜融合用ベジクル等の紡錘形脂質 ベジクルを使用することにより、キャリヤーにより遺伝子を導入する。着目ＤＮ Ａをもつキャリヤーを体液 又は血流に簡便に導入し、その後、体内の標的臓器又は組織に部位特異的に誘導 することができる。例えば、細胞特異的又は臓器特異的なリポソームを作製する ことができる。こうして、リポソームに担持させた外来ＤＮＡは特定細胞に取り 込まれる。所定細胞上の特定レセプターを標的とするイムノリポソームの注入は 、レセプターをもつ細胞にＤＮＡを挿入する簡便な方法として使用することがで きる。別のキャリヤーシステムとして、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入のためにＤＮ Ａを肝細胞に輸送するためにアシアログリコプロテイン／ポリリジン結合体系も 使用されている。 トランスフェクトするＤＮＡを他の種のキャリヤーと複合体化し、ＤＮＡを受 容細胞に輸送した後、受容細胞の細胞質又は核質に配置するようにしてもよい。 特別に作製したベジクル複合体でＤＮＡをキャリヤー核タンパク質に結合し、核 に直接輸送することができる。 キャリヤーによる遺伝子導入では、リポソーム以外の脂質系タンパク質を使用 してもよい。例えば、リポフェクチンとサイトフェクチンは負電荷をもつＤＮＡ と結合し、細胞膜を通ってＤＮＡを輸送可能な複合体を形成する脂質系陽イオン である。 キャリヤーによる別の遺伝子導入法ではレセプターによるエンドサイトーシスを 利用する。この方法では、（細胞表面レセプターに特異的な）リガンドを作製し て着目遺伝子と複合体を形成した後、血流に注入すると、細胞表面レセプターを もつターゲット細胞はリガンドと特異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細 胞内に輸送する。 生物学的遺伝子治療法は、通常、ウイルスベクターを利用して遺伝子を細胞に 挿入する。生物学的遺伝子治療に関して本明細書で使用する「ベクター」なる用 語は、特定ポリヌクレオチド配列を含むか又はこれに会合することができ、特定 ポリヌクレオチド配列を細胞に輸送するように機能するキャリヤーを意味する。 トランスフェクトする細胞は患者の正常組織に由来する細胞でもよいし、患者の 病変組織に由来する細胞でもよいし、患者以外の細胞でもよい。ベクターの例と しては、プラスミドと感染性微生物(例えばウイルス)又は非ウイルスベクター( 例えば上記リガンド−ＤＮＡ結合体、リポソーム及び脂質−ＤＮＡ複合体)が挙 げられる。 ＴＮＦ−γＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を発現調節配列に作動的に結合 し、ＴＮＦ−γを発現することが可能な発現 ベクターを形成することが望ましい場合がある。あるいは、ＴＮＦ−γ遺伝子に 結合するタンパク質、又はＴＮＦ−γ遺伝子に関連する調節領域、又はその対応 するＲＮＡ転写産物を投与して転写又は翻訳率を変えることにより、ＴＮＦ−γ の遺伝子調節を行ってもよい。 遺伝子治療プロトコールに使用されているウイルスベクターの非限定的な例と しては、レトロウイルス、他のＲＮＡウイルス（例えばポリオウイルス又はシン ドビスウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、 ＳＶ４０、ワクシニア及び他のＤＮＡウイルスが挙げられる。最も広く使用され ている遺伝子導入ベクターは複製欠損マウスレトロウイルスベクターである。マ ウス白血病レトロウイルスは核コアタンパク質及びポリメラーゼ(ｐｏｌ)酵素と 複合体化しており、タンパク質コア（ｇａｇ）に包まれ、宿主範囲を決定する糖 タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）により包囲された１本鎖ＲＮＡから構成され る。レトロウイルスのゲノム構造は５’及び３’の長い末端反復配列（ＬＴＲ） により囲まれたｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイルスベクタ ー系は、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞系にｉｎ ｔｒａｎｓ 供給されるならば、５’及び３’ＬＴＲとパッケージングシグナルを含む最小ベ クターでターゲット細胞へのベクターパッケージング、感染及び組み込みを可能 にするに十分であるという事実を利用している。遺伝子導入に用いるレトロウイ ルスベクターの基本的利点としては、大半の細胞型で効率的な感染及び遺伝子発 現が得られ、ターゲット細胞染色体ＤＮＡに単コピーベクターを正確に組み込む ことができ、レトロウイルスゲノムは操作し易い。例えば、末梢及び腫瘍浸潤リ ンパ球、肝細胞、表皮細胞、筋細胞、又は（その後、患者に導入して挿入ＤＮＡ から遺伝子産物を提供することが可能な）他の体細胞に遺伝子を導入するために 、改変レトロウイルスベクターがｅｘ ｖｉｖｏ法で使用されている。 アデノウイルスはコアタンパク質と複合体化しており、キャプシドタンパク質 に包囲された直鎖状２本鎖ＤＮＡから構成される。分子ウイルス学の進歩により 、新規遺伝子配列をターゲット細胞にｉｎ ｖｉｖｏ形質導入することが可能な ベクターを作製するために、これらの生物の生活現象を利用できるようになった 。アデノウイルス系ベクターは高レベルで遺伝子産物ペプチドを発現する。アデ ノウイルスベクターはウイルス力価 が低くても高い感染効率をもつ。更に、ウイルスは無細胞ビリオンとして完全に 感染性であるため、産生細胞系を注入する必要がない。アデノウイルスベクター には、異種遺伝子の長期間ｉｎ ｖｉｖｏ発現を達成できるという潜在的な利点 もある。 ウイルスベクターはｉｎ ｖｉｖｏプロトコールを使用して遺伝子を細胞に挿 入するためにも使用されている。外来遺伝子の組織特異的発現を誘導するために は、組織特異的であることがわかっているｃｉｓ作用調節エレメント又はプロモ ーターを使用することができる。あるいは、特定ｉｎ ｖｉｖｏ解剖学的部位へ のＤＮＡ又はウイルスベクターのｉｎ ｓｉｔｕ送達を使用してもこれを達成す ることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入した内皮細胞を動脈壁上の 選択部位に注入することにより、血管へのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入が達成され た。ウイルスは周囲細胞に感染し、周囲細胞も遺伝子産物を発現した。ウイルス ベクターは例えばカテーテルによりｉｎ ｖｉｖｏ部位に直接送達することがで き、こうして所定領域のみにウイルスを感染させ、長期的部位特異的遺伝子発現 を実現することができる。臓器に通じる血管に改変ウイルスを注入することによ り、哺乳動物組織及び肝組織でレトロウイルスベク ターを使用したｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入も立証されている。 上記又は他の処置で使用する場合には、治療的に有効な量の本発明のタンパク 質の１種を純形態で利用してもよいし、医薬的に許容可能な塩形態が存在する場 合には塩形態で利用してもよい。「治療的に有効な量」の本発明のタンパク質と は、任意医療処置に適用可能な妥当な利益／危険比で血管病を処置するため（例 えば腫瘍増殖を制限するため又は腫瘍転移を遅らせるかもしくは阻止するため） に十分なタンパク質の量を意味する。しかし、本発明のタンパク質及び組成物の １日総用量は、通常の医療判断の範囲内で主治医により決定される。任意特定患 者の特定の治療的に有効な用量レベルは、治療する疾患と疾患の重篤度、使用す る特定タンパク質の活性、使用する特定組成物、患者の年齢、体重、一般健康状 態、性別及び食事、投与時期、投与経路、使用する特定タンパク質の排出率、治 療期間、使用する特定タンパク質と併用又は同時投与する薬剤等の医療分野で周 知の因子を含む種々の因子に依存する。例えば、所望治療効果を達成するために 必要なレベルよりも低いレベルのタンパク質用量から開始し、所望効果を達成す るまで用量を漸増することは当業者が実施可能である。 本発明のタンパク質は無機又は有機酸から誘導される塩の形態で使用すること ができる。これらの塩の非限定的な例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギ ン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、 二硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリ ン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化 水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸 塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタ レンスルホン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒 石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ−トルエン スルホン酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられる。こうして、水又は油溶性又は分 散性製剤が得られる。 医薬的に許容可能な酸付加塩を形成するために利用可能な酸の例としては、塩 酸、硫酸及びリン酸等の無機酸と、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸等の有機 酸が挙げられる。他の塩としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（ナ トリウム、 カリウム、カルシウム又はマグネシウム)との塩や、有機塩基との塩が挙げられ る。本発明のタンパク質の好ましい塩としてはリン酸塩、トリス及び酢酸塩が挙 げられる。 ヒト又は下級動物に投与する本発明のタンパク質の１日総用量は、約０．００ ０１〜約１ｍｇ／ｋｇ患者体重／日とすることができる。所望により、有効１日 用量を投与の目的で多重用量にわけてもよく、従って、単用量組成物は１日用量 を構成するようにこのような量を含むか又はその１回分を含むことができる。 あるいは、本発明のタンパク質は１種以上の医薬的に許容可能な賦形剤と共に 着目タンパク質を含む医薬組成物として投与することができる。医薬的に許容可 能なキャリヤー又は賦形剤とは、非毒性固体、半固体又は液体充填剤、希釈剤、 封入剤又は任意種の製剤助剤を意味する。組成物は非経口、槽内、膣内、腹膜組 織内、（粉末、軟膏、点滴剤又は経皮パッチにより）局所、直腸内又は頬経路で 投与することができる。本明細書で使用する「非経口」なる用語は、静脈内、筋 肉内、腹膜組織内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入等の投与方法を意味す る。 非経口注射用医薬組成物は、医薬的に許容可能な無菌水性又 は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルションや、使用直前に無菌注射溶液又 は分散液に再構成するための無菌粉末を含む。利用可能な水性及び非水性キャリ ヤー、希釈剤、溶剤又はビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール( 例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等)、カ ルボキシメチルセルロース及びその適当な混合物、植物油(例えばオリーブ油)、 並びに注射可能な有機エステル類（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。例 えば、レシチン等のコーティング材を使用したり、分散液の場合には必要な粒度 を維持したり、界面活性剤を使用することにより、適当な流動性を維持すること ができる。 これらの組成物は更に、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤等のアジュバント を加えてもよい。種々の抗細菌及び抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノー ル、フェノールソルビン酸等）を加えることにより、微生物の作用の防止を確保 することができる。糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を加えることが望ましい場 合もある。吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチ ン）を加えると、注射可能な医薬形態の長期吸収が可能になる。 注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエス テル）及びポリ（無水物）等の生分解性ポリマー中で薬剤のマイクロカプセルマ トリックスを形成することにより製造される。薬剤対ポリマー比と、使用する特 定ポリマーに応じて薬剤放出速度を調節することができる。注射可能なデポー製 剤は、体組織に適合可能なリポソーム又はマイクロエマルションに薬剤を封入す ることによっても製造される。 注射製剤は、例えば細菌保持フィルターで濾過するか、使用直前に無菌水又は 他の注射可能な無菌媒体に溶解又は分散することができる無菌固体組成物の形態 で滅菌剤に加えることにより滅菌することができる。 局所投与としては、肺と目の表面を含めた皮膚又は粘膜投与が挙げられる。吸 入用組成物を含めた局所投与用組成物は、加圧形態でも非加圧形態でもよい乾燥 粉末として製造することができる。非加圧粉末組成物では、例えば直径１００μ ｍまでの寸法をもつ粒子を含むより大きい寸法の医薬的に許容可能な不活性キャ リヤーと微粉状活性成分を混合使用することができる。利用可能な不活性キャリ ヤーとしては、ラクトース等の糖類を挙げることができる。活性成分の粒子の少 なくとも９５重量％ が０．０１〜１０μｍの有効粒度をもつことが望ましい。 あるいは、組成物は加圧形態でもよく、窒素又は液化ガス噴射剤等の圧縮ガス を加えることができる。液化噴射媒体と実際に組成物全体は、活性成分が実質的 程度まで溶けないようにすることが好ましい。加圧組成物は更に、液体もしくは 固体非イオン界面活性剤又は固体アニオン界面活性剤等の界面活性剤を加えても よい。ナトリウム塩形態の固体アニオン界面活性剤を使用することが好ましい。 別の局所投与形態は眼科剤である。本発明のタンパク質は例えば前眼房、後眼 房、ガラス体、眼房水、ガラス体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網 膜及び強膜等の眼の角膜及び内部領域にタンパク質を浸透させるために十分な時 間にわたってタンパク質を眼の表面と接触させておくように、医薬的に許容可能 な眼科ビヒクルに加えて送達する。医薬的に許容可能な眼科ビヒクルとしては例 えば軟膏、植物油又は封入剤を利用できる。あるいは、ガラス体液及び眼房水に 本発明のタンパク質を直接注入してもよい。 直腸内又は膣内投与用組成物は、室温では固体であるが、体温で液体となり、 従って、直腸又は膣腔で融解して活性タンパ ク質を放出する適当な非刺激性賦形剤又はキャリヤー（例えばカカオ脂、ポリエ チレングリコール又は座剤ろう）と本発明のタンパク質を混合することにより製 造することができる。 本発明のタンパク質はリポソームの形態で投与することもできる。当該技術分 野で公知の通り、リポソームは一般にリン脂質又は他の脂質物質から得られる。 リポソームは水性媒体に分散した単又は多重ラメラ水和液体結晶により形成され る。リポソームを形成することが可能な任意の非毒性で生理的に許容可能な代謝 性脂質を使用することができる。リポソーム形態の本発明の組成物は本発明のタ ンパク質以外に、安定剤、防腐剤、賦形剤等を含むことができる。好ましい脂質 はリン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であり、天然でも合成でもよ い。リポソームの形成方法は当該技術分野で公知である。例えば、Ｐｒｅｓｃｏ ｔｔ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ Ｘ ＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６ ），３３頁以降参照。 本発明のタンパク質は単独活性薬剤として投与することができるが、血管病を 処置するために患者に旧来投与されている１ 種以上の物質と併用してもよい。例えば、充実性腫瘍の処置に使用する場合には 、本発明のタンパク質はα−インターフェロン、ＣＯＭＰ(シクロホスファミド 、ビンクリスチン、メトトレキセート及びプレドニゾン)、エトポシド、ｍＢＡ ＣＯＤ(メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファ ミド、ビンクリスチン及びデキサメタゾン)、ＰＲＯ−ＭＡＣＥ／ＭＯＰＰ（プ レドニゾン、メトトレキセート（ｗ／ロイコビンレスキュー）、ドキソルビシン 、シクロホスファミド、タキソール、エトポシド／メクロレタミン、ビンクリス チン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、 アンギオインヒビン、ＴＮＰ−４７０、ペントサンポリ硫酸、血小板因子４、ア ンギオスタチン、ＬＭ−６０９、ＳＵ−１０１、ＣＭ−１０１、テクガラン、サ リドマイド、ＳＰ−ＰＧ等の抗腫瘍剤と併用投与することができる。 （本発明のタンパク質と併用して）１回又は分割してヒト又は他の哺乳動物宿 主に投与するＴＮＦ−γの１日総用量は、例えば０．０００１〜３００ｍｇ／ｋ ｇ体重／日、より一般には１〜３００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。 血管病の抑制、処置又は予防のために本発明のタンパク質と 併用可能な物質は上記のものに制限されず、一般に血管病の処置又は予防に有用 な任意物質を利用できることが理解されよう。 ＴＮＦ−γの合成ペプチドフラグメントも種々の用途で製造及び使用すること ができる。例えば、（１）ＴＮＦ−γ結合部位で活性なアゴニスト及びアンタゴ ニスト、（２）ＴＮＦ−γレセプターを単離するための手段、（３）特定抗血清 を作製するための抗原、（４）診断キットで使用するペプチド、並びに（５）（ ＴＮＦ−γに結合する細胞の標的死滅のために）細胞毒性物質に結合又は併用使 用されるペプチドとしてＴＮＦ−γの種々のペプチドフラグメントを利用するこ とができる。これらのペプチドを含むアミノ酸配列は、抗血清と結合するために 利用可能な分子の外側領域のその位置に基づいて選択することができる。更に、 これらのペプチド配列はＧｅｎＢａｎｋ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ及びＰＩＲ等のタンパク質配列データベースを使用し て既知配列と比較し、潜在的配列相同を決定することができる。この情報は、他 の分子に対して高度の配列相同を示す配列を除去するのに役立ち、ＴＮＦ−γに 対する抗血清、アゴニスト及びアンタゴニストの作製において高特異性の可能性 を増すことができ る。 これらの合成ペプチド内のアミノ酸の系統的置換は、ＴＮＦ−γレセプターに 対する高親和性ペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを形成することができる ので、ＴＮＦ−γとそのレセプターとの結合を増減することができる。このよう なアゴニストを使用すると微小転移巣の増殖を抑制し、癌の広がりを制限するこ とができる。不適合血管新生の場合には、ＴＮＦ−γに対するアンタゴニストを 投与すると、ＴＮＦ−γの阻害効果を阻止し、血管形成を助長することができる 。例えば、この種の処置は糖尿病で創傷治癒を助長する治療効果があると思われ る。 ＴＮＦ−γペプチドは例えば培養内皮細胞でＴＮＦ−γレセプターを単離する ためのアフィニティーカラムを作製するためにも使用することができる。当該技 術分野で公知のように、ＴＮＦ−γレセプターの単離と精製後にアミノ酸配列決 定を行うと、ＴＮＦ−γレセプターをコードするポリヌクレオチドを同定及び単 離することができる。このようなポリヌクレオチドはその後、適当な発現ベクタ ーにクローニングし、腫瘍細胞にトランスフェクトすることができる。トランス フェクトした腫 瘍細胞によるレセプターの発現は内在又は外来ＴＮＦ−γに対するこれらの細胞 の応答性を増し、その結果、転移性増殖速度が低下すると考えられる。更に、こ のレセプターの組換え発現は、より多量のレセプターを生産でき、例えばＴＮＦ −γの作用に似たより小さいアンタゴニストを同定するための高スループットス クリーニングで使用するのに十分な量を生産できると考えられる。 本発明のＴＮＦ−γペプチドは、ＴＮＦ−γインヒビターに特異的なポリクロ ーナル又はモノクローナル抗体を生産するための抗原として使用することもでき る。このような抗体を使用可能な方法の１例は診断法及びキットで体液又は組織 中のＴＮＦ−γを検出又は定量することである。これらの試験の結果を使用する と、ＴＮＦ−γの予後関係を診断又は判定することができる。 ＴＮＦ−γペプチドは種々の用途にあわせて同位体、酵素、輸送タンパク質、 細胞毒性物質、蛍光分子、化学発光タンパク質、生物発光タンパク質及び他のタ ンパク質に化学的に結合することができる。例えば、ＴＮＦ−γポリペプチドは ＴＮＦ−γ抗血清と結合する能力を試験し易くするため又はＴＮＦ−γ レセプターをもつ細胞型を検出するために標識することができる。結合技術は一 般にＴＮＦ−γ配列のアミノ酸上で利用可能な官能基に基づいて選択され、非限 定的な例としてアミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、フェノール及 びイミダゾールが挙げられる。このような結合を行うために使用される種々の試 薬としては、特にグルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド及 びｐ−ベンゾキノンが挙げられる。 結合反応の効率は特定反応に適した種々の方法を使用して測定される。例えば 、ＴＮＦ−γペプチドのＴ¹²⁵放射性標識は高比活性のクロラミンＴ及びＮａＩ^{1 25} を使用して実施することかできる。メタ亜硫酸ナトリウムで反応を終了し、混 合物をディスポーザブルカラムで脱塩する。標識したペプチドをカラムから溶離 し、フラクションを集める。各フラクションからアリコートを分取し、γカウン ターで放射能を測定する。こうして、未反応ＮａＩ¹²⁵を含まない標識ＴＮＦ− γペプチドが得られる。 ペプチド結合の別の用途はポリクローナル抗血清の生産である。例えば、グル タルアルデヒドを使用してリジン残基を含むＴＮＦ−γペプチドを精製ウシ血清 アルブミンに結合すること ができる。この反応の効率は、放射性標識ペプチドの取り込みを測定することに より測定することができる。未反応グルタルアルデヒド及びペプチドを透析によ り分離し、結合体を後期使用に備えて保存することができる。 ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−γ類似体、ＴＮＦ−γのペプチドフラグメント及びＴＮ Ｆ−γレセプターに対する抗血清の生産は当業者に公知の確立技術を使用して実 施することができる。例えば、ウサギ、ヒツジ、ヤギ又は他の動物でポリクロー ナル抗血清を生産することができる。ウシ血清アルブミン等のキャリヤー分子に 結合したＴＮＦ−γペプチド又はＴＮＦ−γそれ自体をアジュバント混合物と混 合し、乳化させ、適当な宿主の背中、首、脇腹及び場合によっては足趾の多重部 位に皮下注射することができる。一般に、例えば２〜４週毎等の一定間隔でブー スター注射を行う。各注射から約７〜１０日後に、例えば拡張後の耳辺縁静脈を 使用して静脈穿刺により血液サンプルを得る。血液サンプルを一晩４度で凝固さ せ、約２４００×ｇで４℃で３０分間遠心分離する。血清を取り出し、アリコー トに分け、すぐ使用する場合には４℃、後期分析のためには−２０〜−９０℃で 保存する。 ポリクローナル抗血清の生産からの血清サンプル又はモノクローナル抗血清の 生産からの媒体サンプルを分析して抗体力価を測定し、特に高力価抗血清を判定 することができる。その後、最高力価のＴＮＦ−γ抗血清を試験すると、ａ）抗 原の最高特異的結合と最低非特異的結合に最適な抗血清希釈率、ｂ）標準置換曲 線で増加量のＴＮＦ−γペプチドに結合する能力、ｃ）プラスミノーゲン及び関 連種のＴＮＦ−γを含む関連ペプチド及びタンパク質に対する潜在的交差反応性 、並びにｄ）血漿、尿、組織及び細胞培養液の抽出液中でＴＮＦ−γペプチドを 検出する能力を決定することができる。 力価は当該技術分野で公知の数種の手段により決定することができ、例えばド ットブロット及び密度分析や、プロテインＡ、二次抗血清、冷エタノール又は木 炭−デキストランを使用して放射性標識ペプチド−抗体複合体の沈殿後にγカウ ンターで活性を測定する。所望により、最高力価の抗血清をアフィニティーカラ ムで精製してもよい。例えば、ＴＮＦ−γペプチドを市販樹脂に結合して使用す ると、アフィニティーカラムを形成することができる。その後、抗血清をカラム に通すと、ＴＮＦ−γ抗体は（ＴＮＦ−γを介して）カラムと結合する。これら の 結合抗体をその後、溶離し、収集し、力価と特異性を測定する。 本発明は更に、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド又はその任意フラグメントに対す る特異的結合に関して複数の化合物をスクリーニングし、ＴＮＦ−γ由来ポリペ プチドに特異的に結合する少なくとも１種の化合物を同定する方法も提供する。 このような方法は、少なくとも１種の化合物を準備する段階と、結合を可能にす るための十分な時間にわたって適当な条件下でＴＮＦ−γ由来ポリペプチドを各 化合物と混合する段階と、ＴＮＦ−γポリペプチドと各化合物の結合を検出する 段階を含む。 アンチセンス技術を使用して三重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡもしくはＲ ＮＡにより遺伝子発現を調節することができ、どちらの方法もポリヌクレオチド とＤＮＡ又はＲＮＡの結合に基づく。例えば、本発明のポリペプチドをコードす るポリヌクレオチドの５’コーディング部分を使用して１０〜４０塩基対長のア ンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの転写と生産を阻止するように、転写に関与する遺 伝子の領域に相補的となるように設計する。三重螺旋については、例えばＬｅｅ ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．６：３０７３（１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）及びＤｅｒｖａ ｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）参照。アンチセンスＲＮ ＡオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡにｉｎ ｖｉｖｏハイブリダイズし、ＴＮＦ− γ由来ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。アンチセンスについて は、例えばＯｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）； 及び“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓ ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８）参照。アンチセンス オリゴヌクレオチドは、分子を耐核分性にするような人工ヌクレオチド間結合を 含むように改変すると、より高い効率で作用する。このような人工ヌクレオチド 間結合の非限定的な例としては、メチルホスホネート、ホスホロチオエート及び ホスホロアミデートヌクレオチド間結合が挙げられる。 このような試験で使用されるポリペプチド又はペプチドフラグメントは溶液に 遊離していてもよいし、固体支持体に固定してもよいし、細胞表面に担持しても よいし、細胞内に配置してもよい。薬剤スクリーニング法の１例では、ポリペプ チド又は ペプチドフラグメントを発現することが可能な組換え核酸で安定に形質転換した 真核又は原核宿主細胞を使用する。薬剤は競合的結合アッセイでこのような形質 転換細胞に対してスクリーニングすることができる。例えば、ポリペプチドと被 験物質の複合体の形成は生存又は固定細胞で測定することができる。 従って、本発明はＴＮＦ−γヌクレオチドもしくはタンパク質の生産量に及ぼ す薬剤の効果又はＴＮＦ−γの生物学的効果を測定することにより、ＴＮＦ−γ 遺伝子に関連する疾病を処置するために使用可能な薬剤又は他の任意物質のスク リーニング方法を提供する。これらの型の測定の非限定的な例としては、Ｃａ⁺⁺ 流出、ｃＡＭＰ生産、アポトーシス等の測定が挙げられる。これらの測定は当業 者に公知である。本発明は更にＴＮＦ−γに応答するように設計した組換えレポ ーター遺伝子に及ぼす薬剤の効果の測定方法も提供する。これらの方法は、培養 細胞、細菌又は実験室動物等の天然又は遺伝子組換え実験生物に薬剤を投与する 効果を測定する段階と、ＴＮＦ−γヌクレオチドもしくはタンパク質の生産量、 又はＴＮＦ−γの生物学的効果、又はルシフェラーゼ等の組換えレポーター遺伝 子の量を測定する段階を含む。 従って、本発明はＴＮＦ−γ遺伝子に関連する疾病を処置するための使用可能 な薬剤又は他の任意物質のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、薬 剤をポリペプチド又はそのフラグメントと接触させる段階と、薬剤とポリペプチ ドの複合体の存在又はポリペプチドと細胞の複合体の存在をアッセイする段階を 含む。競合的結合アッセイでは、一般にポリペプチドを標識する。適当なインキ ュベーション後に遊離（又は非複合体化）ポリペプチド又はそのフラグメントを 結合形態で存在するものから分離し、遊離又は非複合体化ラベルの量により、特 定薬剤がポリペプチドに結合するか又はポリペプチド／細胞複合体と干渉する能 力を測定する。 本発明は更に、ポリペプチドと特異的に結合することが可能な中和抗体をポリ ペプチド叉はそのフラグメントとの結合に関して試験薬剤と競合させる競合的薬 剤スクリーニングアッセイの使用も包含する。このように、本発明で提供するポ リペプチドと１個以上の抗原決定基を共有する任意ポリペプチドの存在を試料中 で検出するために抗体を使用することができる。 別の薬剤スクリーニング法は、本明細書に開示する少なくとも１種のポリペプ チドに対して適当な結合親和性をもつ化合物 の高スループットスクリーニングを提供する。要約すると、多量の種々の小ペプ チド試験化合物をプラスチックピン又は他の何らかの表面等の固相で合成する。 ペプチド試験化合物をポリペプチドと反応させ、洗浄する。こうして固相に結合 したポリペプチドを当該技術分野で周知の方法により検出する。精製ポリペプチ ドをプレートに直接被覆し、本明細書に記載する薬剤スクリーニング法で使用し てもよい。更に、非中和抗体を使用してポリペプチドを捕獲し、固相に固定化し てもよい。例えば、参考資料として本明細書の一部とする１９８４年９月１３日 付けで公開されたＥＰ８４／０３５６４参照。 合理的薬剤設計の目標は、着目する生物学的に活性なポリペプチド又は該ポリ ペプチドと相互作用するアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビターを含 む小分子の構造類似体を作製することである。このような構造類似体はポリペプ チドのより活性もしくは安定な形態であるか又はポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ 機能を強化もしくは妨害する薬剤を製造するために使用することができる。参考 資料として本明細書の一部とするＪ．Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ ｏｇｙ ９：１９−２１（１９９１）参照。 例えば、１つのアプローチでは、Ｘ線結晶分析、コンピューターモデル化、又 は最も一般的な方法としてこの２つのアプローチの組み合わせによりポリペプチ ド叉はポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造を決定する。構造を解明 し、分子の活性部位を決定するために、ポリペプチドの形状と電荷を確定しなけ ればならない。多くはないが、相同タンパク質の構造に基づくモデル化により、 ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる場合もある。いずれの場合も 、関連構造情報を使用して類似ポリペプチド様分子を設計又は有効なインヒビタ ーを同定する。 合理的薬剤設計の有用な例としては、参考資料として本明細書の一部とするＳ ．Ｂｒａｘｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ３１：７７９６−７８０１（１９ ９２）に示されているように活性又は安定性を改善した分子や、Ｓ．Ｂ．Ｐ．Ａ ｔｈａｕｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１１３（６）：７４２− ７４６（１９９３）に示されているように天然ペプチドのインヒビター、アゴニ スト又はアンタゴニストとして作用する分子が挙げられる。 上述のようなアッセイにより選択したターゲット特異的抗体 を単離した後、その結晶構造を決定することも可能である。一般に、このアプロ ーチではその後の薬剤設計に利用可能な薬剤基剤が得られる。更に、薬理的に活 性な機能的抗体に対する抗イディオタイプ抗体（「抗ｉｄ」）を作製することに より、タンパク質結晶分析を全く回避することも可能である。鏡像の鏡像として 、抗ｉｄの結合部位は元のレセプターの類似体である。その後、抗ｉｄを使用す ると、化学的又は生物学的に生産したペプチドのバンクからペプチドを同定及び 単離することができる。その後、単離したペプチドは薬剤基剤（即ち原型薬剤） として作用することができる。 Ｘ線結晶分析等の分析試験を実施するために十分な量の本発明の組換えポリペ プチドが入手可能になる。更に、本発明で提供する核酸配列から得られるポリペ プチドアミノ酸配列の情報は、コンピューターモデル化をＸ線結晶分析に代用又 は併用する人の手引きとなろう。 ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドに特異的な抗体を使用すると、更にポリペプチド に結合することによりポリペプチドの生物学的作用を抑制することができる。こ うして、例えば炎症を含むＴＮＦ−γ疾患を処置するための治療で抗体を使用す ることが できる。 更に、このような抗体はＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの有無を検出することが できるので、ＴＮＦ−γ疾患、特に炎症の診断のための診断マーカーとして有用 である。このような抗体は炎症等のＴＮＦ−γ疾患症状の診断マーカーとしても 機能することができる。本発明は更に、本発明のポリペプチドのアンタゴニスト とインヒビターにも関する。アンタゴニストとインヒピターはポリペプチドの機 能を抑制又は除去するものである。従って、例えばアンタゴニストは本発明のポ リペプチドに結合し、その機能を抑制又は除去することができる。アンタゴニス トは、例えばＴＮＦ−γ由来ポリペプチドに結合することによりＴＮＦ−γ由来 ポリペプチドの活性を除去するポリペプチドに対する抗体とすることができ、場 合によってはアンタゴニストはオリゴヌクレオチドでもよい。小分子インヒビタ ーの非限定的な例としては小ペプチド又はペプチド様分子が挙げられる。 アンタゴニストとインヒビターは非限定的な例として塩類、緩衝塩類、デキス トロース、水、グリセロール、エタノール及びその組み合わせ等の医薬的に許容 可能なキャリヤーを含む組成物として利用することができる。ＴＮＦ−γ由来ポ リペプチ ドインヒビターの投与は全身が好ましい。本発明は更にこのようなポリペプチド の作用を抑制する抗体も提供する。組換え技術 本発明は本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞及び発現ベクターと、前記 ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの製造方法も提供する。この ような方法は、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を 培養する段階と、細胞培養物からＴＮＦ−γ由来ポリペプチドを回収する段階を 含む。 本発明は更に、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクター を用いて遺伝子組換えした宿主細胞及び組換え技術による本発明のポリペプチド の製造も提供する。 宿主細胞はクローニングベクターでも発現ベクターでもよい本発明のベクター を用いて遺伝子組換え（形質導入又は形質転換又はトランスフェクト）する。ベ クターはプラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形態とすることができる。遺 伝子組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化するため、形質転換細胞を選択す るため又はＴＮＦ−γ由来遺伝子を増幅するために適宜変形した慣用栄養培地で 培養することができる。温度、ｐＨ 等の培養条件は発現に選択する宿主細胞で従来使用されている条件であり、当業 者に自明である。 本発明のポリヌクレオチドは組換え技術によりポリペプチドを生産するために 使用することができる。従って、ポリヌクレオチド配列は種々の発現ビヒクルの 任意の１種、特にポリペプチドを発現するためのベクター又はプラスミドに加え ることができる。このようなベクターとしては染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ 配列（例えばＳＶ４０の誘導体）、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、酵母プラ スミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、ウ イルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス及び仮性狂犬 病ウイルス）が挙げられる。しかし、宿主で複製可能且つ生存可能である限り、 他の任意プラスミド又はベクターも使用することができる。 適当なＤＮＡ配列を種々の手順によりベクターに挿入することができる。一般 に、当該技術分野で公知の手順により適当な制限エンドヌクレアーゼ部位にＤＮ Ａ配列を挿入する。このような手順等は当業者に実施可能であるとみなされる。 発現ベクター中のＤＮＡ配列はｍＲＮＡ合成を誘導するように適当な発 現調節配列（プロモーター）に作動的に結合する。このようなプロモーターの非 限定的な代表例としては、ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又は ｔｒｐ、ファージλＰサブｌプロモーター及び原核もしくは真核細胞又は他のウ イルスで遺伝子の発現を調節することが知られている他のプロモーターが挙げら れる。発現ベクターは更に翻訳開始のためのリボソーム結合部位と、転写ターミ ネーターも含む。ベクターは更に、発現を増幅するための適当な配列も含むこと ができる。更に、発現ベクターは形質転換宿主細胞の選択用表現型形質（例えば 真核細胞培養ではジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、大腸菌では テトラサイクリン又はアンピシリン耐性）を提供するための遺伝子を含むことが 好ましい。 上記のような適当なＤＮＡ配列と適当なプロモーター又は調節配列を含むベク ターを使用すると、適当な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるこ とができる。適当な宿主の代表例としては、細菌細胞（例えば大腸菌、サルモネ ラチフィムリウム、ストレプトミセス種）、真菌細胞（例えば酵母）、昆虫細胞 （例えばショウジョウバエ及びＳｆ９）、動物細胞（例えばＣＨＯ、ＣＯＳ又は バウズ黒肉腫）、植物細胞等が挙げら れる。適当な宿主の選択は本明細書に提供する教示から当業者が実施可能である とみなされる。 より詳細には、本発明は更に上記に広義に説明したような配列の１種以上を含 む組換え構築物も含む。構築物は本発明の配列を順又は逆方向に挿入したプラス ミド又はウイルスベクター等のベクターを含む。この態様の好ましい側面では、 構築物は更に例えば配列に作動的に結合したプロモーター等の調節配列を含む。 多数の利用可能なベクター及びプロモーターが当業者に公知であり、市販されて いる。例えば、以下のベクターが挙げられる。細菌：ｐＩＮＣＹ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）； ｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ，ＭＤ）；ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）；ｐＢｓ、 ファージスクリプト、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐＢｓ ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５ ４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａ ｔ、ｐＯＧ４４、 ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ 、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかし、宿主で複製可能且つ生存可能であ る限り、他の任意プラスミド又はベクターも使用できる。 プラスミドｐＩＮＣＹは、ポリリンカー（多重クローニング部位）に２つの変 異をもつ以外は、プラスミドｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ市販品）とほぼ同一である。これらの変 異は（１）ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の欠失と、（２）そのＥｃｏＲＩ制限部位の 位置が異なることである。ｐＩＮＣＹはｐＳＰＯＲＴＩをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃ ｏＲＩで消化し、ポリリンカーの切除したフラグメントを合成ＤＮＡフラグメン トである配列番号１１及び配列番号１２で置換することによりｐＳＰＯＲＴＩか ら作製される。この置換は当業者に公知の任意方法で実施することができる。例 えば、２種のヌクレオチド配列である配列番号１１及び配列番号１２を５’末端 リン酸で合成し、相互に混合した後、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐ ＳＰＯＲＴＩプラスミドへの付着末端連結を実施するための標準条件下で連結す る。その後、連結したＤＮＡで適当な宿主細胞（例えば大腸菌ＤＨ５μ細胞）を 形質転換し、組換えクローンをアンピシリン耐性について選択する。その後、個 々のクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素分析又はＤＮＡシーケン シングにより、適正な向きの挿入配列の存在を確認する。当業者に公知の他のク ローニングストラテジーも利用できる。 プロモーター領域はＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベク ター又は選択マーカーをもつ他のベクターを使用して任意所望遺伝子から選択す ることができる。ｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７の２種が適当なベクターである。 細菌プロモーターの特定名としては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、ＳＰ６、Ｔ７ 、ｇｐｔ、λＰサブＬ及びｔｒｐが挙げられる。真核プロモーターとしてはサイ トメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジン キナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ及びマウスメタ ロチオネイン−Ｉが挙げられる。適当なベクターとプロモーターの選択は当業者 が実施可能である。 別の態様では、本発明は上記構築物を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は哺 乳動物等の高級真核細胞でもよいし、酵母細胞等の下級真核細胞でもよいし、細 菌細胞等の原核細胞でもよ い。構築物の宿主細胞導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡ Ｅ−デキストランによるトランスフェクション又はエレクトロポレーション（Ｌ ．Ｄａｖｉｓら，“Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，第２版，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇ，Ｐａｒａｍ ｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔ Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４ ））により実施することかできる。 宿主細胞中の構築物は組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産するた めに慣用方法で使用することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは慣用 ペプチド合成器により合成することもできる。 タンパク質は適当なプロモーターの制御下に哺乳動物細胞、酵母、細菌又は他 の細胞で発現させることができる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡ を使用してこのようなタンパク質を生産するために、無細胞翻訳も利用できる。 原核及び真核宿主で使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、参考 資料として本明細書の一部とするＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されている。 高級真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エン ハンサー配列をベクターに挿入することにより増加する。エンハンサーは通常約 １０〜３００ｂｐのＤＮＡのｃｉｓ作用エレメントであり、プロモーターに作用 してその転写を増す。エンハンサーの例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０ エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーター エンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルス エンハンサーが挙げられる。 一般に、組換え発現ベクターは複製起点と、宿主細胞の形質転換を可能にする 選択マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ ＴＲＰ１遺伝子）と、下流構造配列の転写を誘導するための高度発現遺 伝子から誘導されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは特に３−ホ スホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ等の解糖酵 素又は熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導することができる。 翻訳開始及び終結配列、好ましくは細胞周辺腔又は細胞外媒質への翻訳タンパク 質の分泌を誘導することが可能なリーダー配列と適当な読み枠で非相同構造配列 を結合する。場合により、非相同配列は所望特性（例えば発現される組換え産物 の安定化又は簡略精製）を付与するＮ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質を コードすることができる。 細菌に使用するのに有用な発現ベクターは、機能的プロモーターと同一の作動 的読み枠に適当な翻訳開始及び終結シグナルと共に所望タンパク質をコードする 構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。ベクターは１個以上の表現型 選択マーカーと、ベクターの維持を確保し、所望により宿主内の増幅を提供する ための複製起点を含む。形質転換に利用可能な原核宿主としては、大腸菌、サル モネラチフィムリウム並びにシュードモナス、ストレプトマイセス及びスタフィ ロコッカス属に含まれる種々の種が挙げられるが、他の種も日常的選択により利 用することができる。 細菌で使用するのに有用な発現ベクターは、周知クローニングベクターｐＢＲ ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含むプラスミドに由来する 選択マーカーと細菌複製起点を含む。他のベクターの非限定的な例としては、ｐ ＫＫ２２３ −３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）とＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」セクションを適当なプロモ ーター及び発現しようとする構造配列と結合する。 適当な宿主株を形質転換させ、宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後、選 択したプロモーターを適当な手段（例えば温度シフト又は化学的誘導）により抑 制解除し、細胞を更に培養する。一般に細胞を遠心分離により回収し、物理的又 は化学的手段により破壊し、得られた粗抽出液を更に精製にする。タンパク質の 発現に使用する微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊又 は細胞溶解剤の使用等の簡便な任意方法により破壊することかでき、このような 方法は当業者に周知である。 組換えタンパク質を発現させるためには、種々の哺乳動物細胞培養系も利用で きる。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ ２３：１７５ （１９８１）に記載されているサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ７系や、適合可能な ベクターを発現することが可能な他の細胞系（例えばＣ１２７、 ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系）を挙げることができる。哺乳動物 発現ベクターは複製起点と、適当なプロモーター及びエンハンサーと、任意の必 要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプ ター部位、転写終結配列並びに５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０ウ イルスゲノム（例えばＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプラ イス及びポリアデニル化部位）から誘導されるＤＮＡ配列を使用すると、必要な 非転写遺伝子エンハンサーを提供することができる。代表的な有用なベクターと しては、ｐＲｃ／ＣＭＶとｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉ ｅｇｏ，ＣＡ市販品）が挙げられる。 ＴＮＦ−γポリペプチドは硫安もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンも しくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー 、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ ー又はレクチンクロマトグラフィー等の公知方法により組換え細胞培養物から回 収及び精製する。精製中に存在するカルシウムイオンの濃度を低く（約０．１〜 ５ｍＭ）することが好ましい（Ｐｒｉｃｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４ −９１７［１９６９］）。必 要に応じてタンパク質再生段階を使用してタンパク質の構造を補うことができる 。最後に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階に利用す ることができる。 本発明のポリペプチドは高度発現細胞系から発現される天然精製物でもよいし 、化学合成物でもよいし、原核又は真核宿主（例えば細菌、酵母、高級植物、昆 虫及び哺乳動物培養細胞）から組換え技術により製造してもよい。組換え製造法 で使用する宿主に応じて本発明のポリペプチドは哺乳動物又は他の真核炭水化物 でグリコシル化してもよいし、グリコシル化しなくてもよい。本発明のポリペプ チドは更に元のメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。 本発明は更に、酵母、昆虫又は哺乳動物発現系でタンパク質の還元炭水化物形 態の発現を可能にしながら、グリコシル化を阻止するように改変したＴＮＦ−γ ポリペプチドも含む。グリコシル化部位を不活化させるための公知方法の非限定 的な例としては、参考資料として本明細書の一部とする米国特許第５，０７１， ９７２号及びＥＰ２７６，８４６に記載されている方法が挙げられる。 本発明に含まれる他の変形例によると、システイン残基をコ ードする配列を除去し、タンパク質産物の生物学的活性を低下させる不適性な細 胞内ジスルフィド橋の形成を阻止する。更に本発明によると、タンパク分解プロ セシング部位を除去し、問題のあるプロテアーゼ（例えば酵母におけるＫＥＸ２ プロテアーゼ）を含む系で発現できるようにする。このようなプロテアーゼ部位 を除去する公知方法の非限定的な例としては、ＥＰ２１２，９１４に記載されて いるＫＥＸ２部位の除去方法が挙げられる。 本発明は、オリゴマー、二量体、三量体及び高次オリゴマー形態のＴＮＦ−γ ペプチドを含む。オリゴマーは数種の手段により形成することができ、非限定的 な例としてはペプチド間のジスルフィド結合、ペプチド間の非共有相互作用及び ペプチド間のポリエチレングリコール結合が挙げられる。 オリゴマーの高次化を促進することが可能なペプチドリンカー又はペプチドと ＴＮＦ−γペプチドの融合も本発明に含まれる。このようなペプチドの非限定的 な例としては、Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１５７９（ １９８８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ ｙ，増補４ ，１０．１９．１〜１０．１９．１１ 頁（１９９２）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹに所収のＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈとＡｒｕｆｆｏ，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ ｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”に 記載されているようなロイシンジッパーや抗体由来ペプチドが挙げられる。 出発プラスミドは公表されている公知手順に従って入手可能なプラスミドから 構築することができる。更に、記載するプラスミドと等価のプラスミドも当該技 術分野で公知であり、当業者に自明である。 以下、ｃＤＮＡクローンの単離と分析の一般手順を説明する。本明細書に開示 する特定態様では、ｍＲＮＡをＴＮＦ−γから単離して使用し、ｃＤＮＡライブ ラリーを作製した。ＴＮＦ−γは外科的抽出により関節リウマチ患者の滑膜から 得た。 ＴＮＦ−γの単離物からのｃＤＮＡインサートを完全に配列決定し、実施例に 記載するように詳細に分析し、配列表に配列番号１として開示する。これらのポ リヌクレオチドは生物学的に活性な分子をコードする着目遺伝子の十分な部分を コードする。多数の遺伝子は数百、場合により数千塩基長であり、ベク ターの制約や第１鎖の不完全な逆転写や第２鎖の不完全な複製により現行技術で は完全にクローニングできないため、完全長クローンが得られないのだと考えら れる。当業者に公知の種々の方法を使用し、付加ヌクレオチド配列を含む隣接二 次クローンが得られる。 ＤＮＡ配列決定法は当該技術分野で周知である。慣用酵素法はＤＮＡポリメラ ーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）又はＴａｑポリメラーゼを 使用して着目ＤＮＡ鋳型にアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮ Ａ鎖を伸長する。１本鎖鋳型と２本鎖鋳型のどちらを使用する方法も開発されて いる。連鎖終結反応産物を尿素／ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、オ ートラジオグラフィー（放射性核種標識前駆物質の場合）又は蛍光（蛍光標識前 駆物質の場合）により検出することができる。機械化反応物調製、配列決定及び 蛍光検出法を使用する分析における最近の改良の結果、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等の機械を使用して１日 当たりに決定可能な 配列数を増加できるようになった。 ヌクレオチド配列の読み枠は数種の分析法により確定することができる。まず 、コーディング配列内に含まれる読み枠は出発コドンＡＴＧと停止コドンＴＧＡ 、ＴＡＡ又はＴＡＧの存在について分析することができる。一般に、１個の読み 枠はｃＤＮＡ配列の大部分に連続しているが、他の２個の読み枠は多数の停止コ ドンを含む傾向がある。このような場合には、読み枠の決定は簡単である。他の より困難な場合には、更に分析が必要である。正確なオープンリーディングフレ ームの最終確認は、当業者に周知の方法によりヌクレオチド配列を使用して生物 学的に活性な分子を生成することにより行われる。 各推定コドントリプレットにおける個々のヌクレオチド塩基の出現を分析する アルゴリズムが設定されている。例えばＪ．Ｗ．Ｆｉｃｋｅｔｔ，Ｎｕｃ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ ．１０：５３０３（１９８２）参照。特定生物（細菌、植物及び 動物）のコーディングＤＮＡは所定のヌクレオチドを所定のトリプレット周期性 で含む傾向がある（例えば３番目のコドン位置におけるピリミジンの有意優先） 。これらの優先傾向は所与長さのＤＮＡのコーディング可能性（及び枠）を決定 するために使用 可能な広く入手可能なソフトウェアに組み込まれている。アルゴリズムからの情 報を出発／停止コドン情報と組み合わせて使用すると、高い確度で適正な枠を決 定することができる。この結果、適正な読み枠内の配列を適当な発現ベクターに 容易にクローニングすることができる。 本明細書に開示する核酸配列は確立された組換えＤＮＡ技術により、種々の他 の着目ポリヌクレオチド配列及びベクターに結合することができる。Ｊ．Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら．，前出参照。着目ベクターとしては、クローニングベクター（例 えばプラスミド、コスミド、ファージ誘導体、ファージミド）と、配列決定、複 製及び発現ベクター等が挙げられる。一般に、このようなベクターは少なくとも １種の生物で機能的な複製起点と、適当な制限エンドヌクレアーゼ消化部位と、 特定宿主細胞に適した選択マーカーを含む。ベクターを当業者に公知の種々の手 段により適当な宿主細胞に導入すると、所望のＤＮＡ、ＲＮＡ又はポリペプチド を生産することができる。 場合により、配列決定又はランダム逆転写エラーにより適当なオープンリーデ ィングフレーム又は調節エレメントの存在がマスクされることがある。このよう な場合には、ポリペプチド を発現させるように試み、標準ペプチドマッピング及び配列決定技術によりアミ ノ酸配列を決定することにより、適正な読み枠を決定することができる。Ｆ．Ｍ ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏ ｒｋ，ＮＹ（１９８９）参照。更に、所与ヌクレオチド配列の実際の読み枠は可 能な全３個の読み枠を含むベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによ り決定することができる。適正な読み枠にヌクレオチド配列をもつ細胞のみが予 想長ペプチドを生産する。 本発明で提供するヌクレオチド配列は現在最新技術の自動方法により調製した ので、未同定ヌクレオチドを含む場合もある。これらのヌクレオチドは本発明を 実施しようとする当業者に問題ではない。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出又はそ の定期改訂版に記載されている数種の標準組換え技術を使用すると未知配列情報 を補うことができる。完全長配列を得るために使用する本明細書に記載すると同 一の技術を使用してヌクレオチド配列を得ることもできる。 特定ｃＤＮＡの発現は、ｃＤＮＡを適当な発現ベクターにサ ブクローニングし、このベクターを適当な発現宿主にトランスフェクトすること により実施することができる。ＴＮＦ−γｃＤＮＡライブラリーの作製に使用す るクローニングベクターを使用して特定ｃＤＮＡのｍＲＮＡを転写することがで きる。人工プライミング及び転写に有用な構築バクテリオファージプロモーター と多数のクローニング用固有制限部位（例えばＥｃｏＲＩ）をこれらの８個の残 基の直後に配置する。ベクターは適当な大腸菌宿主株にトランスフェクトするこ とができる。 標準方法を使用して単離細菌株をイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ） で誘導すると、最初から７個のβ−ガラクトシダーゼ残基と、約１５個のリンカ ー残基と、ｃＤＮＡ内でコードされるペプチドを含む融合タンパク質が生産され る。ｃＤＮＡクローンインサートはほぼランダムな方法により作製するので、加 えたｃＤＮＡが適正な翻訳のために正しい枠に配置される確率は３分の１である 。ｃＤＮＡが適正な読み枠にない場合には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、エ キソヌクレアーゼＩＩＩもしくはヤエナリヌクレアーゼによる消化又はオリゴヌ クレオチドリンカー添加等の周知方法により適当な数の塩基の欠失又は挿入によ り適正な枠を得ることができる。 ｃＤＮＡは特定宿主でタンパク質を発現させるために有用であることが分かっ ている他のベクターに挿入してもよい。ターゲットｃＤＮＡの両末端の配列にハ イブリダイズするために十分なクローニング部位とＤＮＡセグメントを含むオリ ゴヌクレオチドプライマーは標準方法により化学的に合成することができる。そ の後、これらのプライマーを使用し、ＰＣＲにより所望遺伝子セグメントを増幅 することができる。得られた新しい遺伝子セグメントを標準条件下で適当な制限 酵素で消化し、ゲル電気泳動による単離することができる。あるいは、ｃＤＮＡ を適当な制限酵素で消化し、化学的に合成したオリゴヌクレオチドで欠失遺伝子 セグメントを埋めることにより同様の遺伝子セグメントを作製することもできる 。２個以上の遺伝子からのコーディング配列のセグメントを相互に連結して適当 なベクターにクローニングすると、組換え配列の配列を最適化することができる 。 このようなキメラ分子に利用可能な発現宿主の非限定的な例としては、チャイ ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びヒト２９３細胞等の哺乳動物細胞、Ｓｆ９ 細胞等の昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵 母 細胞及び大腸菌等の細菌が挙げられる。これらの細胞系の各々で、有用な発現ベ クターは更に細菌での増殖を可能にするための複製起点と、細菌での選択を可能 にするための選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ抗生物質耐性遺伝子）を含 むことができる。更に、ベクターはトランスフェクトした真核宿主細胞での選択 を可能にするための第２の選択マーカー例えば（ネオマイシンホスホトランスフ ェラーゼ遺伝子）を含むことができる。真核発現宿主で使用するベクターは場合 により、着目配列がポリＡを欠失している場合には３’ポリＡテールを付加する 必要があり、及び／又は遺伝子産物のアミノ酸配列を変えずにｍＲＮＡの適正な スプライシングとプロセシングを助長するイントロン配列を加える必要がある。 更に、本発明はシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡを、ＴＮＦ−γをコ ードするオープンリーディングフレームにインフレーム融合することにより、宿 主細胞の外側にタンパク質を分泌する発現ベクターも包含する。これらの配列は 原核、真核又はウイルスのいずれの起源でもよい。 更に、ベクターは遺伝子発現を増加するプロモーター又はエンハンサーを含ん でいてもよい。このようなプロモーターは宿 主特異的であり、非限定的な例として、ＣＨＯ細胞にはＭＭＴＶ、ＳＶ４０又は メタロチオニンプロモーター、細菌宿主にはｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ又はＴ７プ ロモーター、酵母にはα因子、アルコールオキシダーゼ又はＰＧＨプロモーター が挙げられる。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー等の転写エンハンサ ーを含むか又は含まないアデノウイルスベクターを使用して哺乳動物細胞系でタ ンパク質発現を誘導することもできる。組換え細胞の均一培養物が得られたら、 組換えにより生産された大量のタンパク質を条件付け培地から回収し、当該技術 分野で周知のクロマトグラフィー法を使用して分析することができる。大量の分 泌タンパク質を生産する別法では、哺乳動物胎児を形質転換し、トランスジェニ ックウシ、ヤギ、ヒツジ等により生産される乳汁から組換えタンパク質を回収す る。ポリペプチドと近縁分子は、タンパク質精製を容易にするように組換え発現 させることができる。１つのアプローチでは、ヒトポリペプチドに天然に存在し ない１個以上の付加ポリペプチドドメインを含むキメラタンパク質を発現させる 。このような精製助長ドメインの非限定的な例としては、固定化金属上で精製を 可能にするヒスチジン−トリプトファンドメイン等の金属キレート化ペ プチド、固定化イムノグロブリン上で精製を可能にするプロテインＡドメイン及 びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ， Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で使用されるドメインが挙げられる。ポリペプチド配列 と精製ドメインの間にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から のファクタＸＡ又エンテロキナーゼ等の開裂可能なリンカー配列を加えると、ポ リペプチドを回収するのに有用であると思われる。イムノアッセイ 本発明のポリペプチド（そのフラグメント又は誘導体又は類似体を含む）又は その発現ベクターは、ＴＮＦ−γに対する抗体を検出するための種々のアッセイ で使用することができ、本明細書ではその多くについて説明する。これらは抗体 を生産するための免疫原として使用することもできる。これらの抗体は例えばポ リクローナル又はモノクローナル抗体、キメラ、単鎖及びヒト化抗体とすること ができ、更にＦａｂフラグメントや、Ｆａｂ発現ライブラリーの産物でもよい。 このような抗体及びフラグメントの生産には当該技術分野で公知の種々の手順を 使用することができる。 例えば、本発明の配列に対応するポリペプチドに対する抗体は、ポリペプチド を動物に直接注入するか又はマウス、ウサギ、ヤギもしくはヒト等の動物にポリ ペプチドを投与することにより得られる。マウス、ウサギ又はヤギが好ましい。 その後、こうして得られた抗体はポリペプチド自体に結合する。こうして、ポリ ペプチドのフラグメントのみをコードする配列を使用しても、天然ポリペプチド に結合する抗体を作製することができる。その後、このような抗体を使用すると 、当該ポリペプチドを含む疑いのある組織等の試料からポリペプチドを単離する ことができる。モノクローナル抗体を作製するには、連続細胞系培養により生産 される抗体を提供する任意技術を使用することができる。例えばＫｏｈｌｅｒと Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載 されているようなハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍ ｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３）に記載されているようなヒトＢ細胞 ハイブリドーマ技術及びＣｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎ ｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，７７〜９６頁（１９８５） に記載されているようなヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶ−ハイ ブリドーマ技術が挙げられる。単鎖抗体の生産に記載されている技術を応用して 本発明の免疫原ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生産することもできる。例 えば、参考資料として本明細書の一部とする米国特許第４，９４６，７７８号参 照。 本発明の抗体は「サンドイッチ」イムノアッセイやプローブアッセイを含む種 々のアッセイフォーマットで利用することができる。例えば、本発明のモノクロ ーナル抗体又はそのフラグメントは試料中のＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの存在 を判定するための種々のアッセイシステムで利用することができる。例えば、第 １のアッセイフォーマットでは、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体又 はそのフラグメント又はこれらの抗体の組み合わせを固相に被覆して試料と接触 させ、第１の混合物を形成する。抗原／抗体複合体を形成するために十分な時間 及び条件下でこの第１の混合物をインキュベートする。その後、モノクローナル もしくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント又はこれらの抗体の組み合わ せを含む指示試薬にシグナル発生化合物を結合し、抗原／抗体複合体と接触させ 、第２の混 合物を形成する。その後、抗体／抗原／抗体複合体を形成するために十分な時間 及び条件下でこの第２の混合物をインキュベートする。試料中に存在し、固相に 捕獲されたＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原の有無は、シグナル発生化合物によ り発生される測定可能なシグナルを検出することにより判定される。試料中に存 在するＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原の量は発生されるシグナルに比例する。 あるいは、固相に結合したポリクローナルもしくはモノクローナルＴＮＦ−γ 由来ポリペプチド抗体又はそのフラグメント又はこれらの抗体の組み合わせと、 試料と、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原に特異的に結合するモノクローナルも しくはポリクローナル抗体又はそのフラグメント又はこれらの抗体の組み合わせ にシグナル発生化合物を結合した指示試薬を接触させて混合物を形成する。抗体 ／抗原／抗体複合体を形成するために十分な時間及び条件下でこの混合物をイン キュベートする。試料中に存在し、固相に捕獲されたＴＮＦ−γ由来ポリペプチ ドの有無は、シグナル発生化合物により発生される測定可能なシグナルを検出す ることにより判定される。試料中に存在するＴＮＦ−γ由来ポペプチドタンパク 質の量は発生されるシグ ナルに比例する。 別のアッセイフォーマットでは、本発明のモノクローナル抗体の１種又は少な くとも２種の組み合わせをＴＮＦ−γ由来ポリペプチドタンパク質に対する抗体 の検出のための競合プローブとして使用することができる。例えば、本明細書に 開示する組換え抗原のようなＴＮＦ−γ由来ポリペプチドタンパク質を単独又は 組み合わせて固相に被覆する。その後、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原に対す る抗体を含む疑いのある試料を、シグナル発生化合物と少なくとも１種の本発明 のモノクローナル抗体を含む指示試薬と共に、固相に結合した試料と指示試薬又 は固相に結合した指示試薬の抗原／抗体複合体を形成するために十分な時間及び 条件下でインキュベートする。モノクローナル抗体の固相結合の低下を定量的に 測定することができる。 更に別の検出方法では、免疫組織化学分析による固定組織切片及び固定細胞中 のＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原の検出に本発明のモノクローナル又はポリク ローナル抗体の各々を使用することができる。これらの抗体を（例えばフルオレ セイン、金コロイド、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等 で）直接標識するか、又は（本明細書に例示するよう な種々のラベルで）二次標識した抗種抗体を使用することにより標識し、疾病の 組織病理を追跡することも本発明の範囲に含まれる。 更に、これらのモノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅと同 様のマトリックスに結合し、細胞培養物又は生物組織から特定ＴＮＦ−γ由来ポ リペプチドタンパク質をアフィニティー精製するのに使用し、例えば組換え及び 天然ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原及びタンパク質を精製することができる。 本発明のモノクローナル抗体は治療用又は他の同様の用途のキメラ抗体の作製 にも使用することができる。 モノクローナル抗体又はそのフラグメントはＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗原 を検出するために個々に提供することができる。本発明の少なくとも１種のＴＮ Ｆ−γ由来ポリペプチド抗体と各々異なる結合特異性をもつ他のＴＮＦ−γ由来 ポリペプチド領域に対する抗体との混合物又は「カクテル」の成分として本発明 で提供するモノクローナル抗体（及びそのフラグメント）の組み合わせを併用し てもよい。従って、このカクテルはＴＮＦ−γのＴＮＦ−γ由来ポリペプチドタ ンパク質に対する 本発明のモノクローナル抗体と、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドゲノムの他の抗原 決定基に対する他のモノクローナル抗体を含むことができる。 アッセイフォーマットで使用可能なポリクローナル抗体又はそのフラグメント は、アッセイで使用するＴＮＦ−γ由来ポリペプチド領域又は他のＴＮＦ−γ由 来ポリペプチドタンパク質に特異的に結合することが好ましい。使用するポリク ローナル抗体は哺乳動物起源のものが好ましく、ヒト、ヤギ、ウサギ又はヒツジ 抗ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドポリクローナル抗体を使用することができる。ポ リクローナル抗体はウサギポリクローナル抗ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗体が 最も好ましい。アッセイで使用するポリクローナル抗体は単独で使用してもよい し、ポリクローナル抗体のカクテルとして使用してもよい。アッセイフォーマッ トで使用するカクテルは異なるＴＮＦ−γ由来ポリペプチド特異性をもつモノク ローナル抗体又はポリクローナル抗体から構成されるので、ＴＮＦ−γ由来ポリ ペプチド症状の診断、評価及び予後判定並びにＴＮＦ−γ由来ポリペプチドタン パク質分化及び特異性の試験に有用である。 ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドは組換え抗原を使用するか又は ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドのアミノ酸配列を含む合成ペプチドもしくは精製ペ プチドを使用することによりアッセイで検出可能であると予想され、また、この ことは本発明の範囲に含まれる。ＴＮＦ−γ疾患症状を診断、評価又は予後判定 するためのアッセイでＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの種々のエピトープを識別す る種々の合成、組換え又は精製ペプチドを併用できることも本発明の範囲に含ま れる。この場合には、これらのペプチドを１個の固相に被覆してもよいし、各ペ プチドを微粒子等の別々の固相に被覆した後、混合してアッセイで後期使用可能 なペプチドの混合物を形成してもよい。更に、種々のポリペプチドからのエピト ープを規定する多重ペプチドを併用してＴＮＦ−γ疾患の診断、評価叉は予後判 定を行うこともできると予想される。固相に被覆又は検出可能なラベルで標識し たペプチドをその後、制限量の抗体について患者試料からのペプチドと競合させ る。合成、組換え又は精製ペプチドの抗体結合が低下すると、患者試料中にＴＮ Ｆ−γ分泌ポリペプチドが存在すると判断され、患者にＴＮＦ−γ遺伝子が存在 すると判断される。アッセイフォーマットのこのような変形は当業者に公知であ り、本明細書で後述する。 別のアッセイフォーマットでは、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドに対する抗体及 び／又は抗原の存在を次のように同時アッセイで検出することかできる。固相に 結合した第１の分析物に特異的な第１の結合メンバーを含む第１の分析物の捕獲 試薬と、第２の固相に結合した第２の分析物に対する第１の結合メンバーを含む 第２の分析物の捕獲試薬とに試料を同時に接触させて混合物を形成する。捕獲試 薬／第１の分析物及び捕獲試薬／第２の分析物複合体を形成するために十分な時 間及び条件下でこの混合物をインキュベートする。こうして形成されたこれらの 複合体を、その後、シグナル発生化合物で標識した第１の分析物に特異的な結合 対のメンバーを含む指示試薬と、シグナル発生化合物で標識した第２の分析物に 特異的な結合対のメンバーを含む指示試薬とに接触させ、第２の混合物を形成す る。捕獲試薬／第１の分析物／指示試薬複合体と捕獲試薬／第２の分析物／指示 試薬複合体を形成するために十分な時間及び条件下でこの第２の混合物をインキ ュベートする。１種以上の分析物の存在は試料中の１種以上の分析物の存在の指 標として一方又は両方の固相上に形成された複合体に関して発生されるシグナル を検出することにより判定される。このアッセイフォーマット では、ヒト発現系に由来する組換え抗原を使用してもよいし、本明細書に開示す る哺乳動物発現系に由来するタンパク質から作製したモノクローナル抗体を使用 してもよい。このようなアッセイシステムはヨーロッパ特許公開第０４７３０６ ５号に詳細に記載されている。 更に別のアッセイフォーマットでは、本明細書に開示するポリペプチドを使用 して試料中の抗ＴＮＦ−γ由来ポリペプチドの存在を検出することができる。例 えば、少なくとも１種の組換えタンパク質を結合した固相と共に試料をインキュ ベートする。これらは抗原／抗体複合体を形成するために十分な時間及び条件下 で反応させる。インキュベーション後に抗原／抗体複合体を検出する。選択する アッセイシステムに応じて検出を容易にするために指示試薬を使用してもよい。 別のアッセイフォーマットでは、本明細書に記載するように作製した組換えタン パク質を結合した固相と、好ましくは指示試薬で標識した該タンパク質に特異的 なモノクローナル又はポリクローナル抗体とに試料を接触させる。抗体／抗原複 合体を形成するために十分な時間及び条件下でインキュベーション後に固相を遊 離相から分離し、ＴＮＦ−γ由来ポリペプチド抗体の存在の指標として 固相又は遊離相からラベルを検出する。本明細書に開示する組換え抗原を使用す る他のアッセイフォーマットも予想される。このようなフォーマットでは、第１ の資源からの少なくとも１種の抗原を結合した固相と試料を接触させ、抗原／抗 体複合体を形成するために十分な時間及び条件下で固相と試料をインキュベート した後、第１の資源とは異なる第２の資源に由来する標識抗原と固相を接触させ る。例えば、大腸菌等の第１の資源に由来する組換えタンパク質を固相上の捕獲 抗原として使用し、こうして調製した固相に試料を加え、別の資源（即ち大腸菌 以外）に由来する組換えタンパク質を指示試薬の一部として使用する。同様に、 固相上の組換え抗原と指示相の合成ペプチドの組み合わせも可能である。第１の 資源からのＴＮＦ−由来ポリペプチドに特異的な抗原を捕獲抗原として使用し、 別の第２の資源からのＴＮＦ−γ由来ポリペプチドに特異的な抗原も使用する任 意アッセイフォーマットが予想される。従って、組換え抗原の種々の組み合わせ と、合成ペプチド、精製タンパク質等の使用が本発明の範囲に含まれる。このよ うなアッセイ及び他のアッセイは参考資料として本明細書の一部とする本願と共 通名義の米国特許第５，２５４，４５８号に記載されている。 種々の他の固相を使用する他の態様も予想され、本発明の範囲内である。例え ば、（ヨーロッパ特許公開第０３２６１００号及びヨーロッパ特許公開第０４０ ６４７３号に記載されている）負電荷をもつポリマーとの固定化可能な反応複合 体を固定化するためのイオン捕獲法を本発明により利用すると、迅速な溶液相免 疫化学反応を実施することができる。負電荷をもつポリアニオン／免疫複合体と 予め処理しておいた正電荷をもつ多孔質マトリックスの間のイオン相互作用によ り、固定化可能な免疫複合体を反応混合物の残余から分離し、ヨーロッパ特許公 開第０２７３，１１５号に記載されているような化学発光シグナル測定に記載さ れているシステム等の従来記載されている種々のシグナル発生システムを使用す ることにより検出する。 また、本発明の方法は、固相が（磁性又は非磁性）微粒子を含む自動及び半自 動システム等の微粒子技術を利用するシステムで使用できるように適応させるこ とができる。このようなシステムとしては、夫々公開ヨーロッパ出願ＥＰ０４２ ５６３３及びＥＰ０４２４６３４に記載されているシステムが挙げられる。 イムノアッセイに走査型プローブ顕微鏡試験（ＳＰＭ）に使 用することも、本発明のモノクローナル抗体を容易に応用可能な技術である。走 査型プローブ顕微鏡試験、特に原子間力顕微鏡試験では、捕獲相（例えば本発明 のモノクローナル抗体の少なくとも１種）を固相に付着し、走査型プローブ顕微 鏡を使用して固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。多くのイム ノアッセイシステムでは抗原／抗体複合体を検出するために通常ラベルを使用し なければならないが、走査型トンネル顕微鏡を使用すると不要になる。ＳＰＭは 特異的結合反応をモニターするために多数の方法で使用することができる。１態 様では、特異的結合パートナーの一方のメンバー（本発明のモノクローナル抗体 である分析物特異的物質）を走査に適した表面に結合する。分析物特異的物質の 結合は、当業者に公知の方法に従ってプラスチック又は金属表面の固相を含む試 験片に吸着させることにより実施することができる。あるいは、改質プラスチッ ク、金属、シリコン又はガラスの固相を含む試験片と特異的結合パートナー（分 析物特異的物質）の共有結合も利用できる。共有結合法は当業者に公知であり、 特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に結合するための種々の手段を含む。 試験片がシリコン又はガラスである場合には、特異的結合パー トナーを結合する前に表面を活性化する必要がある。また、技術及び化学を使用 することにより高分子電解質相互作用を使用して特異的結合パートナーを試験片 の表面に固定化することもできる。好ましい結合方法は共有手段である。非特異 的結合を最小限にするために、特異的結合メンバーの結合後に表面を血清、タン パク質、又は他のブロッキング剤等の材料で更に処理してもよい。また、アッセ イ目的への適性を確認するために製造地点又は使用地点で表面を走査してもよい 。走査工程は試験片の特異的結合性を変えないと思われる。 本発明は固相の使用が好ましいと開示しているが、本発明の抗体、タンパク質 及びペプチド等の試薬は非固相アッセイシステムでも使用できると予想される。 これらのアッセイシステムは当業者に公知であり、本発明の範囲に含まれるとみ なされる。 アッセイに使用する試薬は、バイアル又はびんの形態の１個以上の容器の各々 にアッセイで使用するプローブ、プライマー、モノクローナル抗体もしくはモノ クローナル抗体のカクテル又はポリペプチド（組換え又は合成）等の別個の試料 を入れたテストキットとして提供できると予想される。当業者に公知のバッファ ー、対照等の他の成分もこのようなテストキットに加え てもよい。採取可能な体液（例えば血液、尿、唾液及び便）を含む試料の採取手 段をもつテストキットを提供することも予想される。採取に有用なこのようなツ ール（「採取材料」）としては、血液を採取及び安定化するためのランセットと 吸収紙又は布、唾液を採取及び安定化するためのスワブ、尿又は便サンプルを採 取及び安定化するためのカップが挙げられる。採取材料、紙、布、スワブ、カッ プ等は場合によりサンプルの変性又は不可逆的吸着を避けるように処理してもよ い。採取材料は更に検体の完全性の維持を助長するように防腐剤、安定剤又は抗 菌剤で処理したり、溺加してもよい。外科又は穿刺生検により得られる試料を採 取、安定化及び保存するように設計されたテストキットも有用である。このよう な全キットは検体の採取及び輸送用コンポーネントと、検体の分析用コンポーネ ントの２つの別個に提供可能なコンポーネントとして構成できると予想される。 例えば採取コンポーネントは公開市場使用者に提供することができ、分析用コン ポーネントは分析物の有無又は量を測定するための実験室従業者等に提供するこ とができる。更に、素人が使用できるように試料の採取、安定化及び保存用キッ トを構成して公開市場で市販し、家庭で使用後に試料分析用実験 室に輸送するようにしてもよい。 大腸菌（クローン１７７３９３）はブダペスト条約に基づいて 日 付けで１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａ ｒｙｌａｎｄ ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）に寄託し、寄託日から３０年間 、又は最後の寄託株申請から５年間、又は米国特許の権利期間のうちで最も長い 期間にわたって保存される。この寄託株と本明細書に記載する他の寄託材料は単 に便宜のために記載するものであり、本発明の教示に基づいて本発明を実施する ために必ずしも必要ではない。全寄託材料のｃＤＮＡ配列は参考資料として本明 細書の一部とする。クローン１２３５０９５はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号 を付与された。 以下、実施例により本発明を説明するが、以下の実施例は例示に過ぎず、本発 明の範囲を制限するものではない。実施例 実施例１：ＴＮＦ−γライブラリーＥＳＴクローンの同定 Ａ．発現配列タグ（ＥＳＴ）又は転写産物像のライブラリー比較 多数の疾病及び正常組織から作製したｃＤＮＡライブラリーから発現配列タグ （ＥＳＴ）と呼ぶｃＤＮＡクローンインサートの部分配列を得、遺伝子転写産物 像としてデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａ ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ市販品ＬＩＦＥＳＥＱ（登録商標）データベース）に入力 した。次に、配列を評価し、予想アミノ酸配列がＴＮＦファミリーの遺伝子に相 当するＥＳＴ配列を同定した。このようなＥＳＴを同定後、有意相同度をもつ配 列をオーバーラップさせるために利用可能な公営及び私営の全ヒトＤＮＡ配列デ ータベースを検索することにより、ＥＳＴにより表される遺伝子の既知配列を拡 張した。この拡張配列を以下、コンティグと呼ぶ。こうして、現時点で入手可能 な５’最長クローンをＥＳＴ供給業者（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌｓ）から入手し、社内配列決定により配列を確認した。配列の作製者らは 、これらのオーバーラップするＥＳＴ配列がＩｎｃｙｔｅデータベースにも公営 データベースにも存在しないのは、ＴＮＦファミリーのリガンドのメンバーであ るからだと説明した。また、これらの配列間に独立した配列が存在しないことは タンパク質の可溶性活性形態を作製するための十分な条件である。実施例２：ＥＳＴを含むクローンの配列決定 公知方法に従って色素標識プライマー、色素ターミネーター又は放射性標識ヌ クレオチドによるジデオキシターミネーション配列決定を使用してコンティグの 最上流ＥＳＴを含むクローンのＤ配列を決定する。例えば、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３参照。 ベクターｐＳＰＯＲＴ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）とｐＳＰＯＲＴ−１に基づくｐＩＮＣＹはインサートの ３’及び５’連結部にすぐ隣接するユニバーサルプライミング部位を含むので、 ユニバーサルプラマーを使用して両方向にインサートを配列決定する。配列決定 反応はポリアクリルアミド変性ゲル上で実施し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ ３７７ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ市販品）又は他の配列決定装置により配列を 決定する。 ＴＮＦファミリーのリガンドの他のメンバーとの相同と、インフレーム上流停 止コドンの存在により、クローンＩＤ＃１７７３９３(配列番号１)は完全ＴＮＦ −γタンパク質コーディング領域（配 列番号２）を含むので、配列番号３等の生物学的に活性な分子を形成するに十分 である。実施例３：核酸調製 Ａ．組織からのＲＮＡ抽出。Ｎ．Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１： ２１８２−２１９１（１９８７）により記載されている当該技術分野で公知の塩 化リチウム／尿素法を使用して、前立腺癌をもつ患者からの固体組織又は細胞と 非腫瘍組織から全ＲＮＡを単離する。非腫瘍組織は陰性対照として使用する。ポ リアデニル化ＲＮＡの単離用として市販されているオリゴｄＴセルローススピン カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン市販品ＲｅｄｉＣ ｏｌ（登録商標））等のキットを使用して全ＲＮＡから更にｍＲＮＡを精製する ことができる。その後、全又はｍＲＮＡを溶解用バッファー（５Ｍチオシアン酸 グアニジン、０．１Ｍ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）に溶かし、リボヌクレアーゼ保 護アッセイで分析する。 Ｂ．血液からのＲＮＡ抽出。標準ＱＩＡａｍｐ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｔｓ ｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ＲＮＡプロトコールによりＴＮＦ−γ関連疾患をもつと診断 された患者ともたないと診断された患者からの血液サンプルからＲＮＡを調製す る。要約す ると、血液２５μｌをＱｉａｇｅｎ ＡＶＬバッファー２８０μｌと混合し、室 温で１５分間インキュベートする。次に、１００％エタノール２８０μｌを混合 物に加え、混合物全体をＱＩＡａｍｐスピンカラムに移す。次に、カラムを６， ０００×ｇで２分間回転し、Ｑｉａｇｅｎ ＡＷ／エタノールバッファー５００ μｌで洗浄し、６，０００×ｇで２分間回転する。カラムを＞１０，０００×ｇ で更に３分間回転する。８０℃に予熱したＲＮａｓｅを含まない水１００μｌを カラムに加えて６，０００×ｇで２分間回転することによりＲＮＡを溶離する。 Ｃ．ポリソームからのＲＮＡ抽出。組織を４℃で塩類溶液中で細断し、６ｍＭ ２−メルカプトエタノールを加えたＴＫ₁₅₀Ｍ（１５０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）溶液中０．８Ｍスク ロース２．５容量と混合する。組織をＢ．Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：２４１−２４８（１９８７）に記載されて いるように、Ｔｅｆｌｏｎガラスｐｏｔｔｅｒホモジナイザーで１００〜２００ ｒｐｍで５行程、次いでＤｏｕｎｃｅホモジナイザーで６行程ホモジナイズする 。次にホモジネートを４℃で１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、核を沈殿 さ せる。上清２ｍｌをＴＫ₁₅₀Ｍ中２．５Ｍスクロース６ｍｌと混合し、この混合 物を３８ｍｌポリアロマーチューブでＴＫ₁₅₀Ｍ中２．５Ｍスクロース４ｍｌに 重層することによりポリソームを単離する。更に、２．０５Ｍスクロース１３ｍ ｌの第１層と、１．３Ｍスクロース６ｍｌの第２層の２種のスクロースＴＫ₁₅₀ Ｍ溶液を抽出液フラクションに順次重層する。グラジェントを４℃で９０，００ ０×ｇで５時間遠心分離することによりポリソームを単離する。次に、シリコン 被覆パスツールピペットを使用して１．３Ｍスクロース／２．０５Ｍスクロース 界面からフラクションを取り出し、等容量のＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ７．４，１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈する。等容量の９０℃ＳＤＳバッファ ー（１％ＳＤＳ，２００ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７ ．４）を加え、溶液を沸騰水浴中で２分間インキュベートする。次に、タンパク 質をプロテイナーゼ−Ｋ消化（５０ｍｇ／ｍｌ）により３７℃で１５分間消化す る。ｍＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出剤３等量で精製した後、２Ｍ酢酸 ナトリウム（ｐＨ５．２）０．１容量と１００％エタノール２容量で−２０℃で 一晩沈殿させる。沈殿したＲＮＡを１２，０００×ｇで１０分間４℃で遠心分離 することにより回収する。ＲＮＡを乾燥し、ＴＥ，ｐＨ７．４又は蒸留水に再懸 濁する。再懸濁したＲＮＡはその後、ＥＳＴ配列を含むｍＲＮＡの存在を調べる ためにスロットブロット又はドットブロットハイブリダイゼーションアッセイで 使用することができる（実施例６参照）。 核酸とタンパク質の品質は使用する製造方法に依存する。ターゲット分子の単 離効率を最大にするためにはサンプル毎に異なる製造技術が必要であると思われ る。実施例４：リボヌクレアーゼ保護アッセイ Ａ．相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）ハイブリダイゼーションプローブの標識。ＳＰ ６又はＴ７等の５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＥＳＴ配列から標識 センス及びアンチセンスリボプローブを転写する。配列は適当なＥＳＴインサー トを含むベクターから得てもよいし、５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列 を含むＰＣＲプライマーを使用するインサートのＰＣＲ産物から得てもよい。転 写産物は転写用バッファー（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，６ｍＭ ＭｇＣｌ₂，２ｍＭスペルミジンＨＣｌ，５ｍＭ ＮａＣｌ）中にＤＮＡ鋳型 １μｇ、１００ｍＭジチオトレイトール２μｌ、ＲＮａｓｉｎ（１０〜 ４０Ｕ）０．８μｌ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ各５００μＭ、（α³²Ｐ）ＵＴＰ ５μｌ又はビオチン化ＵＴＰ１００〜５００μＭ及びＲＮＡポリメラーゼ１μｌ を含む２０μｌ反応容量中で調製する。３７℃で１時間インキュベーシヨン後に 転写産物をＤＮａｓｅＩ（１５Ｕ）で更に３０分間処理し、鋳型を消化する。次 に当該技術分野で周知のスピンカラム、塩沈殿又は電気泳動技術によりプローブ を単離する。最後に、プローブを溶解用バッファー（５Ｍチオシアン酸グアノジ ン，０．１ＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．０）に溶かす。 Ｂ．標識化プローブとターゲットのハイブリダイゼーション。上記実施例３で 得た抽出全細胞ＲＮＡ約２０μｇを溶解用バッファー１０μｌに加え、各々溶解 用バッファー２μｌ中（ｉ）放射能標識プローブ１×１０⁵ｃｐｍ又は(ｉｉ)非 同位体標識プローブ２５０ｐｇと混合する。次に、混合物を６０℃で５分間イン キュベートし、室温で一晩ハイブリダイズする。Ｔ．Ｋａａｂａｃｈｅら，Ａｎ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ．２３２：２２５−２３０（１９９５）参照。 Ｃ．ＲＮａｓｅ消化。１ｍＭ ＥＤＴＡ，３００ｍＭ ＮａＣｌ，３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４中に４０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡと６２５単位／ｍｌ ＲＮａｓｅＴ１を含む溶液３８０μｌと共に ４５〜６０分間室温でインキュベートすることによりハイブリダイゼーションを 終了する。次に、３．３％ＳＤＳを含むプロテイナーゼ−Ｋ（１．７ｍｇ／ｍｌ ）６０μｌを添加後、３０分間３７℃でインキュベートすることによりＲＮａｓ ｅ消化を終了する。消化した混合物を次にフェノール：クロロホルム：イソアミ ルアルコールで抽出し、タンパク質を除去する。酵母ｔＲＮＡ４μｇとエタノー ル８００μｌを加えて−８０℃で３０分間インキュベートすることによりｍＲＮ Ａ：ｃＲＮＡハイブリッドを水相から沈殿させる。速心分離により沈殿を集める 。 Ｄ．フラグメント分析。沈殿を変性ゲル負荷色素（８０％ホルムアミド，１０ ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１ｍｇ／ｍｌキシレンシアノール，１ｍｇ／ｍｌ ブロモフェノールブルー）５μｌに溶かし、６％ポリアクリルアミドＴＢＥ、８ Ｍ尿素変性ゲル中で電気泳動させる。ゲルを減圧乾燥し、オートラジオグラフに かける。センス鎖である校正物質を使用することにより作製した校正曲線と試料 から得られたカウントを比較することにより定量を行うことができる。非同位体 ラベルを使用する 場合には、ハイブリッドをブロッティングによりゲルから膜(ナイロン又はニト ロセルロース)に移した後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合体 と化学発光又は化学蛍光試薬を利用する検出システムを使用して分析する。その 後、配列番号１又はそのフラグメントもしくは相補体から構成される群から選択 される配列に対応するｍＲＮＡが高レベルで発現された場合には、ＴＮＦ−γ遺 伝子が存在すると判断する。実施例５：ノーザンブロッティング ノーザンブロット技術を使用し、ゲル電気泳動と核酸ハイブリダイゼーション を使用してＲＮＡの複合集団から特定サイズのＲＮＡフラグメントを同定する。 ノーザンブロッティングは当該技術分野で周知の技術である。要約すると、４０ ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ），ｐＨ７．０，１０ｍＭ酢酸ナ トリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２．２Ｍホルムアルデヒド，５０％ｖ／ｖホルム アミドを含む溶液２０μｌ中で抽出ＲＮＡ（実施例３参照）２０μｇまでを１５ 分間５５℃でインキュベートする。変性ＲＮＡをローディングバッファー（５０ ％グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．４％ブロモフェノールブルー，０．４ ％キシレンシアノール）２μｌと混合 し、４０ｍＭモルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ），ｐＨ７．０，１０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム，１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２．２Ｍホルムアルデヒドを含む変性 １．５％アガロースゲルにロードする。ゲルを適当な時間電気泳動させ、洗浄用 トレーに移し、ＲＮａｓｅを含まない水を５回交換して洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨ及び１０ｍＭ ＮａＣｌに室温で４５分間浸漬する。０．１Ｍ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５に４５分間浸漬することによりゲルを中和する。２０ｘ ＳＳＣバッファー（３Ｍ ＮａＣｌ，３００ｍＭクエン酸三ナトリウム）に１時 間浸漬後、ゲルをニトロセルロース又はナイロンマトリックスに移す。移転の完 了後、フィルターを３×ＳＳＣで洗浄し、２時間風乾し、８０℃で４時間減圧下 に焼付ける。上記実施例４と同様にｍＲＮＡを検出する。この場合も、配列番号 １とそのフラグメント又は相補体に対応するｍＲＮＡが高レベルで発現された場 合には、ＴＮＦ−γ遺伝子が存在すると判断する。実施例６：ドットブロット／スロットブロット ドットブロット及びスロットブロットアッセイは核酸の複雑な混合物中の特定 核酸配列の存在を評価するための迅速な方法である。 実施にあたり、５０％ホルムアミド，７％ホルムアルデヒド，１×ＳＳＣ ５ ０μｌにＲＮＡ２０μｇまでを混合し、１５分間６８℃でインキュベートし、氷 冷する。次に、２０×ＳＳＣ１００μｌをＲＮＡ混合物に加え、作製したニトロ セルロース又はナイロン膜をもつマニホールド装置に減圧下にロードする。膜を 水、２０×ＳＳＣに１時間浸漬し、２０×ＳＳＣに予め浸したＷｈａｔｍａｎ＃ ３濾紙２枚に載せ、スロットブロット又はドットブロット減圧マニホールド装置 にロードする。上記実施例４に記載したように調製及び標識したプローブを用い てスロットブロットを分析する。配列番号１とそのフラグメント又は相補体に対 応するｍＲＮＡが検出された場合にはＴＮＦ−γ遺伝子が存在すると判断し、炎 症性疾患の診断が予想される。 実施例５及び６に具体的に記載していない他の方法及びバッファーはＪ．Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら，前出に記載されている。実施例７：ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション この方法は検出可能な核酸ハイブリダイゼーションプを使用して細胞中の特定 ターゲット核酸配列を直接検出するために有用である。 細胞ＲＮＡ保持を最大にするように、パラホルムアルデヒド 又はグルタルアルデヒド等の架槁性固定剤を使用して組織を調製する。Ｌ．Ａｎ ｇｅｒｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３５：３７−７１ （１９９１）参照。要約すると、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．５中１％ グルタルアルデヒド＞５容量に４℃で３０分間組織を浸ける。溶液を新しい溶液 に交換して更に３０分間固定する。固定溶液は約０．３７５％ＮａＣｌのオスモ ル濃度をもつことが好ましい。組織を等張ＮａＣｌで１回洗浄し、リン酸塩を除 去する。 次に、固定した組織を次のようにパラフィン包埋する。組織を１５分ずつ５０ ％２回、７０％２回、８５％、９０％及び１００％２回の一連のエタノール濃度 で脱水する。次に、室温で２０分ずつ２回交換してキシレンに組織を浸漬した後 、６０℃で２０分ずつ２回交換して１キシレン：１パラフィンに浸漬した後、最 後に１５分ずつ３回交換してパラフィンに浸漬する。 次に、標準ミクロトームを使用して組織を５μｍ切片に切断し、組織接着性３ −アミノプロピルトリエトキシシランで予め処理しておいたスライドに載せる。 キシレンに１０分ずつ２回浸漬することにより組織からパラ フィンを除去し、９９％２回、９５％、８５％、７０％、５０％、３０％の一連 のエタノール濃度と蒸留水２回で再水和する。切片を０．２Ｍ ＨＣｌで１０分 間前処理し、２μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを３７℃で１５分間浸透させる。 ＥＳＴ ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（実施例４参照）から転写した標識リボプ ローブを調製組織切片にハイブリダイズさせ、３×標準塩類抽出液及び５０％ホ ルムアミド中で５６℃で一晩ハイブリダイズさせる。２×標準クエン酸塩及び５ ０％ホルムアミドで洗浄した後、１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡで３７℃で３ ０分間消化することにより、過剰のプローブを除去する。顕微鏡下で紫外線照射 により蛍光プローブを検出する。細胞質中の蛍光はｍＲＮＡ生産を表す。核中の 蛍光はゲノム物質の存在を表す。あるいは、切片をオートラジオグラフィーによ り可視化することもできる。実施例８：逆転写ＰＣＲ Ａ．１段階ＲＴ−ＰＣＲアッセイ。当該技術分野で公知の方法により逆転写Ｐ ＣＲにより上記ターゲット配列を検出するようにターゲット特異的プライマーを 設計する。１段階ＲＴ−ＰＣＲは単一反応混合物でＲＴとＰＣＲの両者を実施す る連続 法である。方法は５０ｍＭ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン） ，ｐＨ８．１５，８１．７ｍＭ ＫＯＡｃ，３３．３３ｍＭ ＫＯＨ，０．０１ ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸，０．０２ ｍｇ／ｍｌＮａＮ₃，８％ｗ／ｖグリセロール，ｄＮＴＰ各１５０ｍＭ，プライ マー各０．２５μＭ，ｒＴｔｈポリメラーゼ５Ｕ、３．２５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ ）₂及びターゲットの血液等価物（実施例３参照）５μｌを含む反応混合物２０ ０μｌ中で実施する。ＲＮＡとｒＴｔｈポリメラーゼ酵素はＭｎ（ＯＡｃ）₂の 存在下で不安定であるので、Ｍｎ（ＯＡｃ）₂はターゲット添加の直前に添加す べきである。ｃＤＮＡ合成と熱サイクリングの最適条件は当業者が容易に決定す ることができる。反応混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃ ｙｃｌｅｒ ４８０でインキュベートする。ｃＤＮＡ合成と熱サイクリングの最 適条件は当業者が容易に決定することができる。有用であると思われる条件とし ては、６０℃〜７０℃で１５〜４５分間のｃＤＮＡ合成と、９４℃１分間、５５ ℃〜７０℃１分間、７０℃２分間の増幅サイクル３０〜４５回が挙げられる。Ｔ ａｑポリメラーゼとＭＭＬＶ又はＡＭＶ ＲＴ酵素等の逆転写酵素による二重酵 素法を使用しても１段階ＲＴ−ＰＣＲを実施することができる。 Ｂ．慣用ＲＴ−ＰＣＲ。あるいは、Ｋ．−Ｑ．Ｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １ ８１：７２１−７２６（１９９１）に記載されているように慣用２段階ＲＴ−Ｐ ＣＲ反応を次のように実施してもよい。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８． ３，５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，５００μＭ ｄＮＴＰ，２０Ｕ ＲＮａｓｉｎ，１μ Ｍアンチセンスプライマー及び２５Ｕ ＡＭＶ（鳥類骨髄芽球症ウイルス）又は ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素を含む反応混合物２５μ ｌ中で抽出ｍＲＮＡを転写する。３７〜４５℃で３０〜６０分間逆転写を行った 後、９５℃で５分間更にインキュベートし、ＲＴを不活化する。ＰＣＲは１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ₂， ２００μＭ ｄＮＴＰ，各プライマー０．５μＭ及びＴａｑポリメラーゼ５Ｕ２ ．５Ｕを含む５０μｌの最終ＰＣＲ反応容量中ｃＤＮＡ反応混合物１０μｌを使 用して実施する。ｃＤＮＡ合成と熱サイクリングの最適条件は当業者が容易に決 定することができる。反応混合物をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０でインキュベートする。有用であると思われる条件とし ては、３０〜 ４５回の増幅サイクル（９４℃１分間、５５℃〜７０℃１分間、７０℃２分間） と、最終伸長（７２℃１０分間）と４℃浸漬が挙げられる。 Ｃ．ＰＣＲフラグメント分析。その後、蛍光インターカレーターによるゲル電 気泳動を使用するサイズ決定又はＰＣＲ産物の内部配列に対する標識プローブを 使用するサザンブロッティング法により適正な配列を確認することができる。プ ローブはモルホリノ又はペプチド核酸（ＰＮＡ）等のポリヌクレオチド類似体で もよい。その後、配列番号１及び／又はそのフラグメント又は相補体が検出され ると、ＴＮＦ−γ遺伝子が存在すると判断され、炎症性疾患の診断が予想される 。 Ｄ．自動定量ＰＣＲ。クエンチング部分に結合したＰＣＲ産物の内部配列に対 する蛍光標識プローブを使用することにより、所与サンプル中の特定ＰＣＲ産物 の量を自動的に確認することができる。熱サイクリング中にＰＣＲポリメラーゼ によりＰＣＲ産物にハイブリダイズした内部プローブからのクエンチング部分と 蛍光タグの分離は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７７００定量ＰＣＲ機械等の機 械により検出することができ、サンプル中に存在するＰＣＲ産物の量に比例する 。その後、配列番号及 び／又はそのフラグメント又は相補体が検出されると、ＴＮＦ−γ遺伝子が存在 すると判断され、炎症性疾患の診断が予想される。実施例９：ＯＨ−ＰＣＲ Ａ．プローブ選択及び標識。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションＰＣ Ｒにより上記ターゲット配列を検出するようにターゲット特異的プライマー及び プローブを設計する。１９９２年６月２５日付けで公開された公開ＷＯ９２／１ ０５０５及び１９９２年７月９日付けで公開された公開ＷＯ９２／１１３８８は 、夫々５’及び３’末端でオリゴヌクレオチドを標識する方法を教示している。 オリゴヌクレオチドを標識するための１公知方法によると、ラベル−ホスホロア ミダイト試薬を調製して使用し、その合成中にオリゴヌクレオチドにラベルを加 える。例えば、Ｎ．Ｔ．Ｔｈｕｏｎｇら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９（４６ ）：５９０５−５９０８（１９８８）又はＪ．Ｓ．Ｃｏｈｅｎらの公開米国特許 出願第０７／２４６，６８８号（ＮＴＩＳＯＲＤＥＲ番号ＰＡＴ−ＡＰＰＬ−７ −２４６，６８８）（１９８９）参照。ＰＣＲへの関与と望ましくない伸長産物 の形成を阻止するようにプローブを３’末端で標識することが好 ましい。１段階ＯＨ−ＰＣＲでは、プローブはプライマーのＴ_Mよりも少なくと も１５℃低いＴＭをもつべきである。プライマーとプローブは当業者に周知の標 準ホスホロアミダイト化学を使用して捕獲可能又は検出可能部分で標識する。 Ｂ．１段階オリゴハイブリダイゼーションＰＣＲ。５０ｍＭ（Ｎ，Ｎ−ビス［ ２−ヒドロキシエチル］グリシン），ｐＨ８．１５，８１．７ｍＭ ＫＯＡｃ， ３３．３３ｍＭ ＫＯＨ，０．０１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン，０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸，０．０２ｍｇ／ｍｌ ＮａＮ₃，８％ｗ／ｖグリセロ ール，ｄＮＴＰ各１５０ｍＭ，プライマー各０．２５μＭ，ｒＴｔｈポリメラー ゼ５Ｕ、３．２５ｍＭ Ｍｎ（ＯＡｃ）₂及びターゲットの血液等価物（実施例 ３参照）５μｌを含む反応混合物２００μｌ中でＯＨ−ＰＣＲを実施する。ＲＮ ＡとｒＴｔｈポリメラーゼ酵素はＭｎ(ＯＡｃ)₂の存在下で不安定であるので、 Ｍｎ（ＯＡｃ）₂はターゲット添加の直前に添加すべきである。反応混合物をＰ ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０でインキュベ ートする。ｃＤＮＡ合成と熱サイクリングの最適条件は当業者が容易に決定する ことができる。有用であると思われる条件としては、ｃＤＮＡ合成 （６０℃３０分間）と、３０〜４５回の増幅サイクル（９４℃４０秒間、５５℃ 〜７０℃６０秒間）と、オリゴハイブリタイゼーション（９７℃５分間、１５℃ ５分間、１５℃浸漬）が挙げられる。適正な反応産物はＰＣＲ産物の鎖の少なく とも１個と内部にハイブリダイズしたプローブを含む。 Ｃ．ＯＨ−ＰＣＲ産物分析。増幅した反応産物をＬＣｘ（登録商標）アナライ ザーシステム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａ ｒｋ，ＩＬ市販品）で検出する。要約すると、ＰＣＲ産物鎖又はハイブリダイゼ ーションプローブ上の捕獲可能部位で抗体標識微粒子により適正な反応産物を捕 獲し、プローブ又はＰＣＲ鎖上の検出可能部位に検出可能な抗体結合体を結合す ることにより複合体を検出する。内部プローブとハイブリダイズしたＰＣＲ鎖を 含む複合体のみが検出可能である。その後、この複合体が検されると、ＴＮＦ− γ遺伝子が存在すると判断され、関節リウマチ等の炎症性疾患の診断が予想され る。 ＴＮＦ−γをコードする核酸配列の存在を検出するために使用可能な検出フォ ーマットはこの他にも多数のものが存在する。非限定的な例としてリガーゼ連鎖 反応（ＬＣＲ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）、Ｑβレプリカー ゼ（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｋ（登録商標），Ｎａｐｅｒｖｉｌｌ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ ）、分枝鎖反応（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）及び鎖置換アッ セイ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌ ｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）等の他の方法により配列を検出することもできる。実施例１０：合成ペプチド生産 合成ペプチドはＴＮＦ−βポリペプチドの予想アミノ酸配列（実施例１参照） に基づいて調製する。全ペプチドはＦＭＯＣ化学、標準サイクル及びＤＣＣ−Ｈ ｏＢｔ活性化を使用してＡＢＩ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａ ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＯＣＡＴＩＯＮ市販品），Ｍｏｄｅ ｌ４３１Ａで合成する。開裂及び脱保護条件は次の通りである。樹脂をトリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）２０ｍｌ、水０．３ｍｌ、エタンジチオール０．２ｍｌ、チ オアニソール０．２ｍｌ及びフェノール１００ｍｇに加え、室温で１．５時間撹 拌する。次に、樹脂を吸引濾過し、ＴＦＡ溶液のエーテル沈殿後に濾過すること によりペプチドを得る。水／アセトニトリル／０．１％ ＴＦＡグラジエントを使用して逆相分取ＨＰＬＣにより各ペプチドを精製し、凍 結乾燥する。生成物を質量スペクトロメトリーにより確認する（実施例１２参照 ）。 自動酸化条件を使用して次のようにジスルフィド結合形成を行う。ペプチドを 最小量のＤＭＳＯ（約１０ｍｌ）に溶かした後、バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．２）を濃度０．３〜０．８ｍｇ／ｍｌまで加える。ジスル フィド結合が完全に形成されるまでＨＰＬＣにより反応をモニターした後、水／ アセトニトリル／０．１％ＴＦＡグラジエントを使用して逆相分取ＨＰＬＣを行 い、凍結乾燥する。その後、生成物を質量スペクトロメトリーにより確認する（ 実施例１２参照）。 精製ペプチドはグルタルアルデヒドを用いてキーホールリンペットヘモシアニ ン又は他の免疫反応性分子と結合し、アジュバントと混合して動物に注入するこ とができる。実施例１１：細胞系におけるタンパク質の発現 Ａ．ＥＳＴ発現プラスミドの構築。参考資料として本明細書の一部とする１９ ９５年６月７日付け米国特許出願第０８／４７８，０７３号に記載されているプ ラスミド５７７は永久細胞系で分泌抗原を発現させるために構築されている。こ のプラ スミドは以下のＤＮＡセグメントを含む。（ａ）細菌βラクタマーゼとＤＮＡ複 製起点を含むｐＢＲ３２２の２．３Ｋｂフラグメント、（ｂ）ＨＳＶ−１チミジ ンキナーゼプロモーターとポリＡ付加シグナルの制御下にネオマイシン耐性遺伝 子の発現を誘導する１．８Ｋｂカセット、（ｃ）ＳＶ−４０プロモーターとポリ Ａシグナルの制御下にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の発現を誘導する１．９ Ｋｂカセット、（ｄ）サルウイルス４０Ｔ−Ａｇプロモーターと転写エンハンサ ーであるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）エンハンサーＩの制御下に改 変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２タンパク質に融合したウサギイムノグロブリ ンＨ鎖シグナル配列の発現を誘導する３．５Ｋｂカセットと、それに続いて配置 され、ポリＡ付加シグナルを提供する単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１） ゲノムのフラグメント、及び（ｅ）このプラスミドで無機能のサルウイルス４０ ゲノム後期領域の残余０．７Ｋｂフラグメント。ベクターの全セグメントは分子 生物学の当業者に公知の標準方法により結合されている。 プラスミド５７７のＣ型肝炎ウイルスＥ２タンパク質をコードする配列を配列 番号１又はそのフラグメントから構成される 群から選択されるＥＳＴ配列からの配列で置換することにより分泌可能なＴＮＦ −γタンパク質の発現用プラスミドを次のように構築する。プラスミド５７７を ＸｂａＩで消化し、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２遺伝子フラグメントを除去する。得ら れたプラスミド主鎖は、発現されたタンパク質を細胞の分泌経路に誘導するウサ ギイムノグロブリンＨ鎖シグナル配列の下流にＴＮＦ−γインサートを挿入する ことができる。ＴＮＦ−γフラグメントは標準手順を使用してＰＣＲにより作製 する。センスＰＣＲプライマー配列ではＸｂａＩ部位がコードされ、その直後の １２ヌクレオチド配列がアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（「ＳＮ ＥＬ」；配列番号１３）をコードし、シグナルプロテアーゼプロセシング、効率 的分泌及び培養液中の最終産物安定性を助長する。この１２ヌクレオチド配列の 直後にプライマーはＴＮＦ−γ配列のアミノ酸をコードする鋳型配列に相補的な ヌクレオチドを含む。アンチセンスプライマーは停止コドンの直前に８アミノ酸 Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓをコードす る配列（配列番号５）を含む。この配列には抗ＦＬＡＧ Ｍ２（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）と呼ばれるモノクローナ ル抗体（ＭＡｂ）の認識部位が含まれる。この部位はＥＳＴタンパク質産物の分 析と精製を助長するために組み込まれる。ＰＣＲはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ− Ｃｅｔｕｓから得られるＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬をほぼ供給業者の指示 に従って使用して実施する。ＰＣＲプライマーは０．５μＭの最終濃度で使用す る。ＰＣＲは１００μｌ反応溶液中ｐＳＰＯＲＴ１プラスミド鋳型で３５サイク ル（９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃９０秒間）実施した後、７０℃で １０分間伸長サイクルを行う。 分泌可能なＴＮＦ−γタンパク質を発現させるためのプラスミドの別例では、 ヒト血清アルブミンリーダー配列をコードする配列（配列番号４）を、８アミノ 酸Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓをコード する合成オクタペプチド（抗ＦＬＡＧ Ｍ２と呼ばれるモノクローナル抗体によ り認識される；配列番号５）とインフレーム融合し、その後にコグネイトレセプ ターと相互作用するＴＮＦ−γの適当なカルボキシル末端部分を付け、従って、 生物活性を誘導することができる（配列番号３）。このような形態の可溶性ＴＮ Ｆ−γの１例を配列番号３に示す。この組換え合成オープンリー ディングフレーム（配列番号４＋配列番号５＋配列番号３）は、ｐｃＤＮＡ３（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）等の目的ターゲッ ト細胞に適した適当なＤＮＡ主鎖に配置することができる。 Ｂ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞のトラン スフェクション 。カチオニックリポソームによる方法（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒ ら，ＰＮＡＳ ８４：７４１３−７４１７［１９８７］）を使用して上記プラス ミドをＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞（ＤＸＢ−１１１）（Ｕｒｉａｃｉｏら，ＰＮＡＳ ７７，４４５１−４４６６；１９８０）（これらの細胞は１２３０１Ｐａｒｋ ｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ２０８５２に所在のＡ．Ｔ． Ｃ．Ｃ．から受託番号ＣＲＬ９０９６として入手可能）に次のようにトランスフ ェクトする。１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（１ｍＭ）を補充したハムの Ｆ−１２培地でＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞を培養し、２５ｃｍ²フラスコに５〜８× １０⁵細胞／フラスコの密度で新たに播種する。細胞をトランスフェクションの ために６０〜８０％コンフルエントまで増殖させる。プラスミドＤＮＡ２０μｇ をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地１．５ｍｌに加え、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）１０ ０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地の第２の１．５ｍｌ部分に加える。２種の溶 液を混合し、室温で２０分間インキュベートする。培地を細胞から除去し、細胞 をＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地５ｍｌで３回濯ぐ。次に、ＯＰｔｉ−ＭＥＭ Ｉ− Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ−プラスミドＤＮＡ溶液を細胞に重層する。細胞を３時間 ３７℃でインキュベートした後、更に２４時間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ−Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔｉｎ−ＤＮＡ溶液を培地に交換した後、選択する。 Ｃ．選択と増幅。トランスフェクションから１日後に、細胞を１：３に継代し 、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選択培地（以下、「Ｆ−１２マイナス培地Ｇ」と呼ぶ）と 共にインキュベートする。選択培地はＬ−グルタミンを加え、ヒポキサンチン、 チミジン及びグリシンを加えないハムのＦ−１２（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ ｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓａｓ）と、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒ ａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）３００μｇ／ｍｌである。２５ｃｍ²当たり５ｍ ｌの培地容量対表面積比を維持する。約２週間後に、ＤＨＦＲ／Ｇ４１８細胞を 継代増殖し、Ｆ−１２マイナス培地Ｇで連続保存する。 トランスフェクトしたＥＳＴ遺伝子の各々の増幅は、ＤＨＦＲ⁺，Ｇ４１８⁺細 胞をメトトレキセートで段階的に選択することにより行う（Ｒ．Ｓｃｈｉｍｋｅ ，Ｃｅｌｌ ３７：７０５−７１３［１９８４］）。耐性コロニーが出現するま で、１５０ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含むＦ−１２マイナス培地Ｇと共に細胞を約２週間インキュベートする 。１５０ｎＭ適応細胞を５μＭ ＭＴＸで選択することにより更に遺伝子増幅を 行う。 Ｄ．タンパク質／抗原生産。５μＭ ＭＴＸを補充したＦ−１２マイナス培地 をちょうどコンフルエントな単層に５％ＣＯ₂中３７℃で１２〜２４時間重層す る。増殖培地を除去し、細胞をダルベッコのリン酸緩衝塩類（ＰＢＳ）（カルシ ウムとマグネシウム添加）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ；Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）で３回濯ぎ、培地／血清が残留している場合には除去する。次に細胞を５ ％ＣＯ₂中３７℃で１時間ＶＡＳ注文培地(Ｌ−グルタミンとＨＥＰＥＳを加え、 フェノールレッドを加えないＶＡＳ注文製剤、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ市販品、製品番号５２−０８６７８Ｐ）と共にインキュベー トする。次にＴ形２５ｃｍ²フラスコ当たり５ｍｌの割合で生 産するように細胞にＶＡＳを重層する。７日間インキュベーション後に培地を取 り出した後、凍結し、回収液２、３及び４による精製を待つ。単層にＶＡＳを重 層し、更に３個の７日回収液を得る。 Ｅ．ＴＮＦ−γタンパク質／抗原発現の分析。標準方法と当該技術分野で公知 の試薬（Ｌａｅｍｍｌｅ不連続ゲル）を使用するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）又は質量スペクトロメトリーにより、組換えタ ンパク質構築物を発現する細胞からのＶＡＳ上清のアリコートを分析する。 Ｆ．精製。ＦＬＡＧ配列を含むＥＳＴタンパク質の精製は、ヒドラジド結合に よりアガロースに共有結合した抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体（Ｅａｓｔｍ ａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ.，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を含むアフィニティー マトリックスを使用するイムノアフィニティークロマトグラフィーにより実施す る。アフィニティー精製に先立ち、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）カラムを 使用してローラーびんからのプールしたＶＡＳ培地回収液中のタンパク質を５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌバッフ ァーに交換する。このバッファー中のタンパク質を抗ＦＬＡＧＭ２抗体アフィニ ティーカラムに加え、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌバッファーでカラムを洗浄することにより非結合タンパク質を溶離し、 ５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ中過剰のＦＬＡ Ｇペプチドを使用して結合タンパク質を溶離する。過剰のＦＬＡＧペプチドはＥ ＳＴ精製タンパク質からゲル電気泳動により除去することができる。 次に、ＥＳＴ領域を含む最大クローン化インサートを（ｉ）サイトメガロウイ ルス（ＣＭＶ）プロモーター及び／又はタンパク質発現と検出に役立つタンパク 質融合性配列を含み得る真核発現ベクター、又は（ｉｉ）スーパーオキシドジス ムターゼ（ＳＯＤ）及びＣＭＰ−ＫＤＤシンテターゼ（ＣＫＳ）又はタンパク質 配列の発現のための他のタンパク質融合遺伝子を含む細菌発現ベクターにサブク ローニングする。ＳＯＤの融合配列を含むポリペプチドの生産に有用な方法及び ベクターは、１９８６年１０月１日公開ＥＰＯＯ１９６０５６に記載されており 、ＣＫＳについては１９８９年９月１３日公開ＥＰＯ公開第０３３１９６１号に 記載されている。精製タンパク質は非限 定的な例として動物免疫試験、固相イムノアッセイ等の種々の技術で使用するこ とができる。実施例１２：ＴＮＦ−γタンパク質の化学分析 Ａ．ＭＳを使用したトリプシンペプチドフラグメントの分析。標準手順を使用 して炎症性疾患をもつ患者からの血清をポリアクリルアミドゲルで泳動させ、ク ーマシーブルーで染色する。未知ポリペプチドを含む疑いのあるゲルのセクショ ンを切り出し、ケル内還元、アセトアミド化及びトリプシン消化する。Ｐ．Ｊｅ ｎｏら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２２４：４５１−４５５（１９９５）及びＪ．Ｒｏ ｓｅｎｆｅｌｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ．２０３：１７３−１７９（１９９２）。 ゲルセクションを１００ｍＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃とアセトニトリルで洗浄する。収縮 したゲル片を消化用バッファー（５０ｍＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃，５ｍＭＣａＣｌ₂及 び１２．５μｇ／ｍｌトリプシン）で４℃で４５分間膨潤させる。上消を吸引し 、トリプシンを含まない消化用バッファー５〜１０μｌで置換し、一晩３７℃で インキュベートする。５％ギ酸とアセトニトリルを３回交換してペプチドを抽出 し、蒸発乾涸する。５％ギ酸１０μｌに溶かして毛管に通すことにより、吸引ガ スクロマトグラフィー毛管の先端にト ラップしたＰＯＲＯＳ Ｒ２溶剤（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）約０．１μｌにペプ チドを吸着させる。吸着したペプチドを水洗し、６０％メタノール中５％ギ酸で 溶離する。ＡＰＩ ＩＩＩ質量スペクトロメーター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ，Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）の噴霧毛管に溶 離剤を直接通し、ナノエレクトロスプレー質量スペクトロメトリーにより分析す る。Ｍ．Ｗｉｌｍら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｒ ｏｃｅｓｓ １３６：１６７−１８０（１９９４）及びＭ．Ｗｉｌｍら，Ａｎａｌ ．Ｃｈｅｍ ．６６：１−８（１９９４）。最初の４極子から得られる質量スペク トルからトリプシンペプチドの質量を決定する。予想ペプチドに対応する質量を ＭＳ／ＭＳモードで更に分析すると、ペプチドのアミノ酸配列が得られる。 Ｂ．ＬＣ／ＭＳを使用したペプチドフラグメント分析。液体クロマトグラフィ ー／タンデム質量スペクトロメトリー（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用すると、過形 成疾患組織に見いだされるｍＲＮＡ配列から予想されるポリペプチドの存在も確 認することもできる。Ｄ．Ｈｅｓｓら，ＭＥＴＨＯＤＳ，Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏ ｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６：２２７−２３８（１ ９９４）。患者からの血清検体又は腫瘍抽出液をＳＤＳで変性させ、ジチオトレ イトール（１．５ｍｇ／ｍｌ）で３０分間９０℃で還元した後、ヨードアセトア ミド（４ｍｇ／ｍｌ）で１５分間２５℃でアルキル化する。アクリルアミド電気 泳動後、ポリペプチドをカチオニックメンブレンにエレクトロブロットし、クー マシーブルーで染色する。染色後、メンブレンを洗浄し、未知ポリペプチドを含 むと考えられるセクションを切断し、小片に細断する。メンブレンを５００μｌ マイクロ遠心チューブに入れ、タンパク分解消化用バッファー（１００ｍＭ Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．２，０．１ＭＮａｃｌ，１０％アセトニトリル，２ｍ Ｍ ＣａＣｌ₂及び５μｇ／ｍｌトリプシン含有）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕ ｉｓ，ＭＯ）１０〜２０μｌに含浸させる。３７℃で１５時間後に飽和尿素３μ ｌと１００μｇ／ｍｌトリプシン１μｌを加え、３７℃で更に５時間インキュベ ートする。消化混合物を１０％トリフルオロ酢酸３μｌで酸性化し、遠心分離し て上清をメンブレンから分離する。上清を微腔逆相ＨＰＬＣカラムに直接注入し 、０．０５％トリフルオロ酢酸中アセトニトリルの直線勾 配で溶離する。必要に応じて分流器に通して材料の容量を調節した後、溶出液を エレクトロスプレー質量スペクトロメーターに直接供給する。実施例１２、セク ションＡに記載した手順に従ってデータを分析する。実施例１３：遺伝子免疫プロトコール Ａ．ｉｎ ｖｉｖｏ抗原発現。遺伝子免疫は適当な発現ベクターの接種後に抗 原を直接ｉｎ ｖｉｖｏ発現させることによりタンパク質精製段階を回避する。 また、この方法による抗原の生産は哺乳動物組織でタンパク質を生産するので、 適正なタンパク質のフォールディングとグリコシル化を可能にすると思われる。 この方法はＣＭＶプロモーターを含むプラスミドへの遺伝子配列の挿入、プラス ミドの発現と精製及び動物の筋肉組織へのプラスミドＤＮＡの注入を利用する。 例えば、Ｈ．Ｄａｖｉｓら，Ｈｕｍａｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ ２：１８４７−１８５１（１９９３）参照。１又は２回ブースター免疫後、 動物から採血、腹水採取するか又は牌臓を回収し、ハイブリドーマを作製するこ とができる。 Ｂ．プラスミド調製及び精製。適当な５’制限部位を含む適当なＰＣＲプライ マーを使用してｐＳＰＯＲＴ１ ＥＳＴベク ターからＥＳＴ ＤＮＡ配列を作製する。ＰＣＲ産物を適当な制限酵素で切断し 、ＣＭＶプロモーターを含むベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ市販品ｐＲｃ／ＣＭＶ又はｐｃＤＮＡ３ベクター）に挿入す る。このプラスミドをその後、適当な細菌株で増殖し、ＣｓＣｌ勾配又はＱｉａ ｇｅｎプラスミドＤＮＡ精製カラムを使用して細胞溶解液から精製する。これら の全技術は分子生物学の当業者に周知である。 Ｃ．免疫プロトコール。麻酔した動物にＰＢＳ又は他のＤＮＡ取り込みエンハ ンサー（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ ２５％スクロース）で希釈した精製プラスミ ド０．１〜１００μｇを筋肉内免疫する。例えば、Ｈ．Ｄａｖｉｓら，Ｈｕｍａ ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：７３３−７４０（１９９３）；及びＰ．Ｗ ．Ｗｏｌｆｆら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：４７４−４８５（１９９ １）参照。２回のブースター注射のうちの１回は１カ月間隔で行う。 Ｄ．抗血清の試験及び使用。動物から採血し、ウェスタンブロッティング又は ＥＩＡ法等により既知遺伝子配列から合成したペプチド（実施例１６参照）を使 用して血清に抗体が存在す るか否かを試験する。この方法により生産した抗血清はその後、ＥＬＩＳＡ又は ウェスタンブロッティング法により患者の血清又は腫瘍組織抽出液中の抗原の存 在を検出するために使用することができる。実施例１４：ＴＮＦ−γに対する抗体の生産 Ａ．ポリクローナル抗血清の生産。ＴＮＦ−γ配列（配列番号２）のペプチド に由来する配列をもつペプチドを適当な動物に注入することによりＰＳ１０８に 対する抗血清を調製する。ペプチドの合成は実施例１０に記載した通りである。 免疫原として使用するペプチドは以下に記載するように調製したキーホールリン ペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリヤーに結合してもよいし、未結合（即 ちＫＬＨ等のキャリヤーに結合しない）でもよい。 １．ペプチド結合。ペプチドをマレイミドで活性化したキーホールリンペット ヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒ ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬの市販品Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標））に結合する。Ｉｍｊ ｅｃｔ（登録商標）はヘモシアニン１モル当たり約２５０モルの反応性マレイミ ド基を含む。活性化ＫＬＨをリン酸緩衝塩類（ＰＢＳ， ｐＨ８．４）に約７．７ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かす。ペプチドはペプチド配列中 に存在するシステインを介して結合するか、又は結合点を提供するために合成ペ プチドに予め付加したシステインに結合する。ペプチドをジメチルスルホキシド （ＤＭＳＯ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ ｓ，ＭＯ）に溶かし、ＫＬＨに結合した反応性マレイミド１モル当たりペプチド 約１．５モルのモル比で活性化ＫＬＨと反応させる。ペプチド結合手順について は以下に説明する。ペプチド結合を最適にするようにこのような手順の量、回数 及び条件を変更できることは当業者に知られている。 以下、約０．７７μｍｏｌの反応性マレイミド基を含むＫＬＨペプチド結合体 （「結合ペプチド」）３ｍｇを得るための結合反応について記載する。このペプ チド結合体の量は通常、ウサギでポリクローナル抗血清を生産するために一次注 入と４回のブースター注入に十分な量である。要約すると、ペプチドをＤＭＳＯ １００μｌ当たり１．１６μｍｏｌの濃度でＤＭＳＯに溶かす。上記のように調 製した活性化ＫＬＨ溶液３８０μｌにＤＭＳＯ溶液１００μｌを加え、ＰＢＳ（ ｐＨ８．４）２０μｌを加えて容量を５００μｌにする。反応溶液を室温で一晩 撹拌下にインキュベートする。反応混合物中の未反応チオールの量を測定するこ とにより反応の程度を調べる。出発チオール濃度と最終濃度との差は活性化ＫＬ Ｈに結合したペプチドの濃度であると予想される。残留チオールの量はエルマン 試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸），ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉ ｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して測定する。シス テインＨＣｌ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆ ｏｒｄ，ＩＬ）３５ｍｇをＰＢＳ（ｐＨ７．２）１０ｍｌに溶かし、ストック溶 液を所望濃度まで希釈することにより濃度０、０．１、０．５、２．５及び２０ ｍＭのシステイン標準を調製する。Ｉｍｍｕｌｏｎ２（登録商標）マイクロウェ ルプレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，Ｖ Ａ）の各ウェルにＰＢＳ（ｐＨ８．４）２００μｌを入れ、チオール濃度の光分 析測定を行う。次に、標準又は反応混合物１０μｌを各ウェルに加える。最後に 、ＰＢＳ（ｐＨ８．４）中ｌｍｇ／ｍｌの濃度でエルマン試薬２０μｌを各ウェ ルに加える。ウェルを室温で１０分間インキュベートし、全ウェルの４１５ｎｍ 吸光度をマイクロプレートリーダー（例えばＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ３５５０，ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）で読み取る 。標準の吸光度を使用して標準曲線を作成し、反応混合物のチオール濃度を標準 曲線から決定する。遊離チオール濃度の低下は結合反応の成功を表す。室温で６ 時間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で透析することにより未反応ペプチドを除去する。結 合体をすぐに使用する場合には２〜８℃で保存し、すぐに使用しない場合には− ２０℃以下で保存する。 ２．動物免疫。体重２ｋｇ以上の雌ニュージーランドシロウサギを使用してポ リクローナル抗血清を作製する。一般に、（上記のように調製した）未結合又は 結合ペプチド毎に動物１匹を免疫する。最初の免疫よりも１週間前に、動物から 血液５〜１０ｍｌを採取し、非免疫予備採血サンプルとして使用する。 未結合又は結合ペプチドを使用し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（ Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ｍｌを加えたＰＢＳ，ｐＨ７．２中 ２ｍｇ／ｍｌの濃度でペプチド０．５ｍｌを乳化することにより一次免疫原を調 製する。免疫原を動物の数筒所の部位に皮下、腹膜組織内及び筋肉内等の経路で 注射する。一次免疫から４週間後にブースター免疫を行う。ブースター免疫に使 用する免疫原はペプチドを不完全フ ロイントアジュバント（ＩＦＡ）（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）０．５ ｍＬで１ｍｇ／ｍｌまで希釈する以外は、一次免疫原に使用したと同一の未結合 又は結合ペプチド０．５ｍｌを乳化することにより調製する。この場合もブース ター用量は数箇所の部位に皮下、腹膜組織内及び筋肉内注射により投与する。ブ ースター免疫から２週間後に動物から採血（５ｍｌ）し、上述のようにペプチド に対する血清の免疫反応性を試験する。ブースター及び採血スケジュールは十分 な力価が得られるまで４週間隔で繰り返す。抗血清の力価又は濃度は下記実施例 １７に記載するようにマイクロタイターＥＩＡにより測定する。１：５００以上 の抗体力価がその後の使用及び試験に十分な力価であるとみなされる。 Ｂ．モノクローナル抗体の生産。 １．免疫プロトコール。マウスでモノクローナル抗体を生産するために使用す る未結合又は結合ペプチドの量をウサキでポリクローナル抗血清を生産するため に使用する量の１０分の１にする以外は、上記のように調製した免疫原を使用し てマウスに免疫する。従って、一次免疫原はＣＦＡエマルション０．１ｍｌ中未 結合又は結合ペプチド１００μｇから構成され、ブー スター免疫に使用する免疫原はＩＦＡ０．１ｍｌ中未結合又は結合ペプチド５０ μｇから構成される。標準技術を使用してモノクローナル抗体の作製用ハイブリ ドーマを調製及びスクリーニングする。モノクローナル抗体作製に使用する方法 は、当該技術分野で公知の手順に従い、このような手順はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌ ｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９４（１９７５）に詳細に記載され、Ｊ ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｂｏｃｏ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に も記載されている。ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に基づく別のモノク ローナル抗体作製法は、参考資料として本明細書の一部とするＬ．Ｔ．Ｍｉｍｍ ｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：６０４−６１９（１９９０）の方法である。 （マウス１匹毎の）免疫計画は一次免疫と付加ブースター免疫から構成される 。一次免疫に使用する一次免疫原はＣＦＡ５０μｌに予め乳化したＰＢＳ（ｐＨ ７．２）５０μｌ中未結合又は結合ペプチド１００μｇから構成される。一次免 疫から約２週間及び４週間後に実施されるブースター免疫はＩＦＡ５０μｌ で乳化したＰＢＳ（ｐＨ７．２）５０μｌ中未結合又は結合ペプチド５０μｇか ら構成される。合計１００μｌのこの免疫原を各マウスに腹膜組織内及び皮下接 種する。第３回目の免疫から約４週間後に実施例１７に記載するようなマイクロ タイタープレート酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）により個々のマウスの免疫応答 をスクリーニングする。第３回目の免疫から約１５週間後にＰＢＳ（ｐＨ７．２ ）中未結合又は結合ペプチド５０μｇをマウスに静脈内、脾臓内又は腹膜組織内 接種する。 この静脈内ブーストから３日後に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法を使 用して脾細胞を例えばＳｐ２／０−Ａｇ１４ミエローマ細胞（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，英国）と融合する。１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ ）と１％ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ）を加えたＩｓ ｃｏｖｅの変形ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で融合物を培養する。粗培養物を実 施例１７のプロトコールに従ってマイクロタイタープレートＥＩＡによりスクリ ーニングする。免疫原として使用してペプチドに対して反応性であり且つ他のペ プチド（即ち免疫原として使用しないＰＳ１０８のペプチド）に対して非反応性 のクローンを最終増殖に選択する。こうして選択 したクローンを増殖し、アリコートに分け、１０％ＦＣＳと１０％ジメチルスル ホキシドを加えたＩＭＤＭ中で凍結する。 ２．モノクローナル抗体を含む腹水の生産。上記のように調製した凍結ハイブ リドーマ細胞を融解し、増殖培養する。生存可能なハイブリドーマ細胞をプリス タンで処理したマウスに腹膜組織内接種する。マウスから腹水を取り出してプー ルし、０．２μフィルターで濾過し、イムノグロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）分析 して精製に必要なプロテインＡカラムの容積を決定する。 ３．腹水からのモノクローナル抗体の精製。要約すると、濾過及び融解した腹 水を等容量のプロテインＡセファロース結合用バッファー（１．５Ｍグリシン、 ３．０Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．９）と混合し、０．２μフィルターで再濾過する 。腹水中に存在するＩｇＧの量によりプロテインＡカラムの容積を決定する。次 に溶出液をＰＢＳ，ｐＨ７．２で２〜８℃で一晩透析する。透析したモノクロー ナル抗体を滅菌濾過し、アリコートに分配する。実施例１７のＥＩＡマイクロタ イタープレートアッセイ手順を使用することにより免疫原として使用するペプチ ドに特異的に結合する能力を測定することにより、精製モノクローナル抗体の免 疫反応性を確認する。免疫原として使用しな いＰＳ１０８のペプチド等の無関係のペプチドに対する結合の欠如を判定するこ とにより、精製モノクローナル抗体の特異性を確認する。こうして調製及び特性 決定した精製抗ＰＳ１０８モノクローナル抗体を短期保存には２〜８℃、長期保 存には−８０℃で保存する。 ４．モノクローナル抗体のその他の特性決定。市販キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ．Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ市販品）を使用すると 、上記のように生産したモノクローナル抗体のアイソタイプとサブタイプを決定 することができる。モノクローナル抗体のアリコートを２〜８℃で連続保存し、 所与期間を通して光学密度（ＯＤ）の読みをアッセイすることによりモノクロー ナル抗体で安定性試験を実施することもできる。 Ｃ．免疫原としての組換えタンパク質の使用。当業者に公知の試薬及び技術に 対応する変更を加えることにより、本明細書に記載するように作製した組換えタ ンパク質をポリクローナル及びモノクローナル抗体の生産で免疫原として利用で きることは本発明の範囲に含まれる。 実施例１５：血清からのＴＮＦ−γペプチド特異的抗体の精製 当該技術分野で公知の方法により固定化合成ペプチドを使用 して免疫血清をアフィニティー精製する。実施例１０に記載したようなペプチド に対して生産した抗血清を種々の方法でアフィニティー精製する。希釈粗抗血清 をプロテインＡカラム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ，Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に通すことによりＩｇＧフラクションを得る。 製造業者により供給されている結合バッファーで溶離し、イムノグロブリン以外 の全タンパク質を除去する。０．１Ｍ緩衝グリシン（ｐＨ３）で溶離すると、ア ルブミンと他の血清タンパク質を実質的に含まないイムノグロブリン調製物が得 られる。 イムノアフィニティークロマトグラフィーを実施し、特異的抗原結合抗体の含 有率の高い調製物を得る。抗血清を作製するために使用するペプチドをクロマト グラフィー樹脂に固定化し、そのエピトープに対する特異的抗体を樹脂に吸着さ せる。非結合成分を洗い流した後に特異的抗体を０．１Ｍグリシンバッファー（ ｐＨ２．３）で溶離し、抗体フラクションを１．０ＭＴｒｉｓバッファー（ｐＨ ８．０）ですぐに中和して免疫反応性を維持する。選択する樹脂はペプチド中に 存在する反応性基に依存する。ペプチドがアミノ基をもつ場合には、Ａｆｆｉ− Ｇｅｌ １０又はＡｆｆｉ−Ｇｅｌ １５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ，ＣＡ）等の樹脂を使用する。ペプチド上のカルボキシル基を介する結合が所望 される場合には、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ １２を使用することができる（Ｂｉｏ−Ｒ ａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。ペプチドが遊離スルフヒドリル基をもつ場合 には、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ ５０１等の有機水銀化合物樹脂を使用することができ る（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。 あるいは、脾臓を回収してハイブリドーマの生産に使用し、モノクローナル抗 体を生産することもできる。実施例１６：組織サンプルのウェスタンブロッティング 組織サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，ｐＨ６．８，１００ｍＭジチオトレイトール，２％ＳＤＳ，０．１％ブ ロモフェノールブルー，１０％グリセロール）中でホモジナイズし、１００℃で １０分間加熱し、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，２５０ｍＭグリシ ン，０．１％ＳＤＳ泳動用バッファーを用いて１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動 させる。３９ｍＭグリシン，４８ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，０．０ ３７％ＳＤＳ， ２０％メタノールを含むトランスファーバッファー中でタンパク質を電気泳動に よりニトロセルロースに移す。ニトロセルロースを室温で６０分間乾燥した後、 ウシ血清アルブミン又は５％脱脂粉乳を加えたＰＢＳ溶液で２時間４℃でブロッ クする。 ＰＢＳ中５％脱脂粉乳の溶液を入れたヒートシール可能なプラスチックバッグ に１：１００〜１：２０００のアフィニティー精製抗ＥＳＴペプチド抗体（実施 例１５参照）の希釈度でフィルターを入れ、４℃で２時間インキュベートした後 、ＰＢＳで１０分間３回洗浄する。アルカリホスファターゼに結合した二次抗体 である抗マウス／ウサギＩｇＧを１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ，ｐＨ７．５バッファー中１：２００〜１：２０００の希釈度でフィルタ ーに加え、１時間室温でインキュベートする。 ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラ ゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）等の色素基質を添加及び展開し、バンドを可視化 する。この色素溶液は１００ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１００ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５を含む溶液中に０．０３３％ＮＢＴと０．０ １６％ＢＣＩＰを含む。バンドが所望強度に展開するま でフィルターを溶液中で室温でインキュベートする。２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰ ＢＳバッファーで展開を停止する。予備染色分子量標準（Ｒａｉｎｂｏｗ ｍａ ｒｋｅｒｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）の 移動度に基づいて分子量決定を行う。実施例１７：ＥＩＡマイクロタイタープレートアッセイ ＥＳＴ合成ペプチドに対する相対免疫反応性の測定方法を実証するために、９ ６穴マイクロタイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ ４ ポ リスチレン）のウェルを５００μＭ、５０μＭ、５μＭ、０．５μＭ、０．０５ μＭ及び０．００５μＭの濃度のＥＳＴペプチド１００μｌで４℃で１６時間被 覆する。これらのペプチドの被覆に使用するバッファーは１００ｍＭモルホリノ エタンスルホン酸，ｐＨ５．５である。ＥＳＴペプチドを被覆したウェルを次に 洗浄用バッファー（８ｍＭリン酸ナトリウム，２ｍＭリン酸カリウム． 14Ｏｍ Ｍ塩化ナトリウム，１０ｍＭ塩化カリウム，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０ ．１％ウシ血清アルブミン，ｐＨ７．４）で３回洗浄する。 次に、リン酸緩衝塩類（８ｍＭリン酸ナトリウム，２ｍＭリン酸カリウム．１ ４０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭ塩化カリ ウム，ｐＨ７．４）中９％ｗ／ｖカーネーション脱脂粉乳でウェルを室温で１時 間ブロックする。次に、ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄する。 試料又は対照（マウス又はウサギ抗血清）をＰＢＳ中４．５％カーネーション 脱脂粉乳で１５０倍に希釈する。次に、このサンプル１００μｌをウェル中で３ ７℃で１時間インキュベートした後、洗浄用バッファーで３回洗浄する。 西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したヤギ抗マウス／ウサギＩｇＧを第２抗 体ラベルとして使用して陽性ウエルで形成された抗ＥＳＴ抗体／ＥＳＴ抗原複合 体と結合する。洗浄用バッファー中約１：５０００の希釈度のＨＰＲＯ−ヤギ抗 マウス／ウサギＩｇＧ結合体１００μＬを各ウェルに加え、室温で１時間インキ ュベートする。ウェルを洗浄用バッファーで３回洗浄する。 ウェルをＡＢＴＳ溶液（２，２’−アジノビス−［３−エチルベンゾチゾリン −６−スルホン酸］２アンモニウム塩）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ ｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）１００μＬに暴露した後に４０５ｎｍの 吸光度を読み取ることにより陽性ウェルを識別する。あるいは、各ウェ ルにｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）の過酸化水素溶液１００μｌを加えて室 温で１０分間インキュベートして発色させてもよい。１Ｎ硫酸１００μｌで発色 反応を停止させる。ウェル内の色をＤｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ５０００プレートリ ーダーで４９０ｎｍ及び６３０ｎｍ波長の吸光度として読み取る。陽性シグナル は抗ＥＳＴペプチド抗体の存在を表す。実施例１８：固相粒子の被覆 Ａ．抗ＥＳＴペプチド抗体による微粒子の被覆。半径約０．１〜２０μｍのポ リスチレン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアクリレート又は同様の 粒子であり得る微粒子にアフィニティー精製抗ＥＳＴペプチド抗体（実施例１５ 参照）を被覆する。微粒子は受動的に被覆してもよいし、能動的に被覆してもよ い。方法の１例として、ＥＤＡＣ（塩酸１−（３−ジメチルアミノプロピル）− ３−エチルカルボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉ ｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））で活性化したカルボキシル化ラテックス微粒子を抗Ｅ ＳＴ抗体で被覆する。要約すると、適当な容器で５０ｍＭ ＭＥＳバッファー， ｐＨ４．０と１５０ｍｇ／ｌアフィニティー精製抗ＥＳＴ抗体（実施例１５参照 ）を含む溶液に樹脂で洗浄したカルボキ シル化ラテックス微粒子の最終濃度０．３７５％固溶体を１５分間混合する。Ｅ ＤＡＣカップリング剤を混合物に５．５μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、２．５ 時間室温で混合する。 次に、０．２μｍ Ｍｉｃｒｏｇｏｎ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎモジュールを使 用して接線流濾過によりＴｗｅｅｎ ２０（登録商標）／リン酸ナトリウム，ｐ Ｈ７．２洗浄用バッファー８容量で微粒子を洗浄する。通常は希界面活性剤とブ ロッキング剤として無関係のタンパク質を加えた適当なバッファー中で洗浄済み 微粒子を必要になるまで保存する。 Ｂ．１／４インチビーズの被覆。当該技術分野で公知の日常的方法（参考資料 として本明細書の一部とするＳｎｉｔｍａｎらの米国特許第５，２７３，８８２ 号）により１／４インチポリスチレンビーズの表面に抗ＥＳＴ抗体を被覆し、競 合的結合又はＥＩＡサンドイッチアッセイで使用してもよい。まずポリスチレン ビーズを１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ８．０）中で約１５秒間超音 波処理することにより清浄にする。次に、全微粉が除去されるまでビーズを脱イ オン水で洗浄する。次に、１０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ８〜９．５）中抗体溶 液にビーズを含浸させる。抗体溶液は高親和性モノクローナル抗体の場 合には１μｇ／ｍｌ程度の希釈液とし、アフィニティー精製していないポリクロ ーナル抗体では約５００μｇ／ｍｌ程度の濃厚液とすることができる。ビーズを 室温で少なくとも１２時間被覆した後、脱イオン水で洗浄する。ビーズは乾燥し てもよいし、湿式保存してもよい。タンパク質安定剤（スクロース）や非特異的 結合ブロッカー（無関係のタンパク質、カーネーション脱脂乳等）をオーバーコ ートしてもよい。実施例１９：微粒子酵素イムノアッセイ（ＭＥＩＡ） ＩＭｘ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で標準商業化抗原競合ＥＩＡアッセイ又 はポリクローナル抗体サンドイッチＥＩＡアッセイを使用してＥＳＴタンパク質 及びペプチドを検出する。要約すると、ＥＳＴタンパク質を含む疑いのあるサン プルを抗ＥＳＴ被覆微粒子（実施例１６参照）の存在下にインキュベートする。 微粒子を洗浄し、検出可能な物質（即ちアルカリホスファターゼ）と結合した二 次ポリクローナル抗ＥＳＴ抗体を加え、微粒子と共にインキュベートする。微粒 子を洗浄し、二次結合抗体と反応して検出可能なシグナルを発生する基質（即ち ４−メチルウンベリフェリルホスフェー ト）（ＭＵＰ）を加えることにより結合抗体／抗原／抗体複合体を検出する。Ｅ ＳＴタンパク質の存在を示す高レベルのシグナルは癌の徴候である。 競合的結合アッセイは検出可能に標識したペプチドを使用するものであり、こ のようなペプチドはペプチドが抗ペプチド抗体を被覆した微粒子に結合するとＩ Ｍｘ（登録商標）アナライザーで特異的バックグラウンドシグナルを発生する。 同様に、ＥＳＴタンパク質を含む疑いのある患者サンプルの存在下に標識ペプチ ドを微粒子に加える。患者サンプル中にＥＳＴタンパク質が存在していると、微 粒子上の結合部位に関して標識化ＥＳＴペプチドと競合し、ＩＭｘ（登録商標） シグナルが低下する。シグナルの低下は患者サンプル中にＥＳＴタンパク質が存 在することを示し、ＴＮＦ−γ遺伝子産物の存在を示し、炎症性疾患の診断を示 唆する。 従って、上記ＴＮＦ−γ遺伝子ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドでコー ドされるタンパク質はＴＮＦ−γ関連疾患のマーカーとして有用であると考えら れる。血液、血漿又は血清等の試料中のこのマーカーの出現に基づく試験は、低 コストで非侵襲性の診断情報を提供し、医師が癌の診断を行うのを助け、 治療プロトコールの選択に役立ち、又は選択した治療の成功をモニターすること ができる。このマーカーは免疫学的方法により検出可能な疾患組織に由来する抗 原として血液、尿又は便等の容易に採取可能な体液中で検出することができる。 このマーカーは疾患状態で増加したり、疾患状態で変化したり、不適切な身体区 画に出現する正常タンパク質であったりする。また、本発明により提供するＴＮ Ｆ−γ遺伝子ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質 は種々の疾患を処置するのに有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 21/08 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/68 5/00 Ａ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中のＴＮＦ−γのターゲットポリヌクレオチドの存在の検出方法であっ て、 （ａ）少なくとも１種のＴＮＦ−γ特異的ポリヌクレオチド又はその相補体と前 記試料を接触させる段階と、 （ｂ）試料中のＴＮＦ−γの前記ターゲットポリヌクレオチドの存在を検出する 段階を含み、前記ＴＮＦ−γ特異的ポリヌクレオチドが配列番号１のポリヌクレ オチドとそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の相同 度をもつ前記方法。 ２．段階（ａ）を実施する前にＴＮＦ−γの前記ターゲットポリヌクレオチドを 固相に結合する請求項１に記載の方法。 ３．試料中のＴＮＦ−γのｍＲＮＡの検出方法であって、 （ａ）少なくとも１種のプライマーを用いて逆転写を実施し、ｃＤＮＡを生成す る段階と、 （ｂ）第１段階増幅でセンス及びアンチセンスプライマーとしてＴＮＦ−γの他 のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより段階（ａ）から得られた 前記ｃＤＮＡを増幅し、Ｔ ＮＦ−γアンプリコンを得る段階と、 （ｃ）試料中の前記ＴＮＦ−γアンプリコンの存在を検出する段階を含み、ＴＮ Ｆ−γの前記オリゴヌクレオチドプライマーが配列番号１とそのフラグメント、 類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の相同度をもつ前記方法。 ４．段階（ａ）又は段階（ｂ）又は段階（ｃ）を実施する前に前記試料を固相と 反応させる請求項３に記載の方法。 ５．前記検出段階が測定可能なシグナルを発生することが可能な検出可能なラベ ルを使用する請求項３に記載の方法。 ６．ターゲットＴＮＦ−γポリヌクレオチドを含む疑いのある試料中のターゲッ トＴＮＦ−γポリヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）センスプライマーとしての少なくとも１種のＴＮＦ−γオリゴヌクレオチ ドとアンチセンスプライマーとしての少なくとも１種のＴＮＦ−γオリゴヌクレ オチドとに前記ターゲットＴＮＦ−γポリヌクレオチドを接触させ、増幅して第 １段階反応生成物を得る段階と、 （ｂ）段階（ａ）で使用するＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドの３’に配置されて おり、第１段階反応生成物に相補的な少なく とも１種の他のＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドと前記第１段階反応生成物を接触 させる段階と、 （ｃ）前記ターゲットＴＮＦ−γポリヌクレオチドを検出する段階を含み、段階 （ａ）及び段階（ｂ）で使用する前記ＴＮＦ−γオリゴヌクレオチドが配列番号 １とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の相同度を もつ前記方法。 ７．段階（ａ）又は段階（ｂ）又は段階（ｃ）を実施する前に前記試料を固相と 反応させる請求項６に記載の方法。 ８．前記検出段階が測定可能なシグナルを発生することが可能な検出可能なラベ ルを使用する請求項６に記載の方法。 ９．前記検出可能なラベルを固相と反応させる請求項８に記載の方法。 １０．試料中のＴＮＦ−γポリヌクレオチドを検出するために有用なテストキッ トであって、配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少なく とも５０％の相同度をもつ少なくとも１種のＴＮＦ−γポリヌクレオチドを入れ た容器を含む前記テストキット。 １１．ＴＮＦ−γ遺伝子に由来する精製ポリヌクレオチド又は そのフラグメントであって、前記精製ポリヌクレオチドが前記ＴＮＦ−γ遺伝子 の核酸に選択的にハイブリダイズすることができ、前記精製ポリヌクレオチドが 配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して少なくとも５０％の 相同度をもつ前記精製ポリヌクレオチド。 １２．前記精製ポリヌクレオチドが組換え技術により製造される請求項１１に記 載の精製ポリヌクレオチド。 １３．組換え技術により製造される前記ポリヌクレオチドがＴＮＦ−γによりコ ードされる少なくとも１個のエピトープの配列を含む請求項１２に記載の精製ポ リヌクレオチド。 １４．所望宿主に適合可能な調節配列に作動的に結合したＴＮＦ−γに由来する オープンリーディングフレームをコードする核酸配列を含む組換え発現系であっ て、前記核酸配列が配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に対して 少なくとも５０％の相同度をもつ前記組換え発現系。 １５．前記組換え発現系で形質転換した細胞を更に含む請求項１４に記載の組換 え発現系。 １６．ＴＮＦ−γによりコードされるポリペプチドであって、配列番号２、配列 番号３及びそのフラグメントから構成される 群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつ前記ポ リペプチド。 １７．前記ポリペプチドが組換え技術により製造される請求項１６に記載のポリ ペプチド。 １８．前記ポリペプチドが合成技術により製造される請求項１６に記載のポリペ プチド。 １９．請求項１６に記載のＴＮＦ−γポリペプチドの活性化を阻害する化合物。 ２０．前記ポリペプチドがＴＮＦ−γタンパク質の可溶性フラグメントであり、 ＴＮＦ−γのレセプターと結合することができる請求項１６に記載のポリペプチ ド。 ２１．請求項１６に記載のＴＮＦ−γポリペプチドの活性化を誘導することが必 要な患者の処置方法であって、請求項１６に記載のＴＮＦ−γポリペプチドの活 性化を誘導する治療的に有効な量の化合物を前記患者に投与することを特徴とす る前記方法。 ２２．化合物がＴＮＦ−γタンパク質のアゴニストであるかアンタゴニストであ るかを判定するための方法であって、 （ａ）その表面にＴＮＦ−γタンパク質を発現する細胞を前記 化合物とレセプターリガンドとに接触させる段階と、 （ｂ）リガンドとレセプターの相互作用により生物学的効果が生じるか否かを判 定する段階と、 （ｃ）前記化合物がアゴニストであるかアンタゴニストであるかを判定する段階 を含む前記方法。 ２３．レセプターがＴＮＦ−γリガンドに結合するか否かを判定するための方法 であって、 （ａ）ＴＮＦ−γリガンドを発現する哺乳動物細胞をレセプターに接触させる段 階と、 （ｂ）レセプターの存在を検出する段階と、 （ｃ）レセプターがＴＮＦ−γリガンドに結合するか否かを判定する段階を含む 前記方法。 ２４．ＴＮＦ−γによりコードされる少なくとも１個のエピトープと特異的に結 合する抗体であって、前記抗体がポリクローナル又はモノクローナルであり、前 記エピトープが配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群 から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸 配列を含む前記抗体。 ２５．試料中のＴＮＦ−γ抗原又は抗体の存在を判定するため のアッセイキットであって、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから 構成される群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度を もつＴＮＦ−γポリペプチドを入れた容器を含む前記アッセイキット。 ２６．前記ポリペプチドが固相に結合されている請求項２５に記載のアッセイキ ット。 ２７．試料中のＴＮＦ−γ抗原又は抗体の存在を判定するためのアッセイキット であって、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から 選択される配列に対して少なくとも６０％の相似度をもつＴＮＦ−γの少なくと も１個のエピトープを含むＴＮＦ−γ抗原に特異的に結合する抗体を入れた容器 を含む前記アッセイキット。 ２８．前記抗体が固相に結合されている請求項２７に記載のアッセイキット。 ２９．ＴＮＦ−γの少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチドの製造方法 であって、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から 選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸配列 を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベク ターで形質転換した宿主細胞をインキュベートすることを特徴とする前記方法。 ３０．ＴＮＦ−γ抗原を含む疑いのある試料中のＴＮＦ−γ抗原の検出方法であ って、 （ａ）抗体／抗原複合体を形成させるために十分な時間及び条件下で配列番号２ 、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択されるＴＮＦ−γ 抗原の少なくとも１個のエピトープと特異的に結合する抗体又はそのフラグメン トと前記試料を接触させる段階と、 （ｂ）前記複合体を検出する段階を含む前記方法。 ３１．前記抗体を固相に結合する請求項３０に記載の方法。 ３２．ＴＮＦ−γ抗原に結合する抗体を含む疑いのある試料中の前記抗体の検出 方法であって、 （ａ）抗原／抗体複合体を形成させるために十分な時間及び条件下で配列番号２ 、配列番号３及びそのフラグメントから構成される群から選択されるアミノ酸配 列に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸配列又はそのフラグメント を含む少なくとも１個のＴＮＦ−γエピトープを含むＴＮＦ−γポリペプチドと 前記試料を接触させる段階と、 （ｂ）前記複合体を検出する段階を含む前記方法。 ３３．前記ＴＮＦ−γポリペプチドを固相に結合する請求項３２に記載の方法。 ３４．ＴＮＦ−γ抗原又はそのフラグメントの少なくとも１個のエピトープをコ ードする核酸配列を含む組織培養増殖細胞であって、核酸配列を前記細胞にトラ ンスフェクトし、前記核酸配列が配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相 補体である前記組織培養増殖細胞。 ３５．ＴＮＦ−γ抗原に特異的に結合する抗体の製造方法であって、少なくとも １個のＴＮＦ−γエピトープを含み、配列番号２、配列番号３及びそのフラグメ ントから構成される群から選択される配列に対して少なくとも３５％の相同度を もち、免疫応答を発生するために十分な量の単離免疫原ポリペプチド又はそのフ ラグメントを個体に投与することを特徴とする前記方法。 ３６．ＴＮＦ−γ抗原に特異的に結合する抗体の製造方法であって、ＴＮＦ−γ の少なくとも１個のエピトープをコードする配列を含むプラスミドを哺乳動物に 投与することからなり、前記ＴＮＦ−γ配列が配列番号１とそのフラグメント又 は相補体 から構成される群から選択される前記方法。 ３７．ＴＮＦ−γポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む組成物であって 、前記ポリヌクレオチドが配列番号１とそのフラグメント、類似体又は相補体に 対して少なくとも５０％の相同度をもつ前記組成物。 ３８．ＴＮＦ−γによりコードされる少なくとも１個のエピトープを含むポリペ プチドを含む組成物であって、前記ポリペプチドが配列番号２、配列番号３及び そのフラグメントから構成される群から選択される配列に対して少なくとも３５ ％の相同度をもつ前記組成物。 ３９．前記ポリペプチドがＴＮＦ−γタンパク質の可溶性フラグメントであり、 ＴＮＦ−γのレセプターと結合することができる請求項３８に記載の組成物。 ４０．ランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから構成される群から選択さ れる前記試料の採取に有用なツールを入れた容器を更に含む請求項１２に記載の テストキット。 ４１．ランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから構成される群から選択さ れる前記試料の採取に有用なツールを入れた容器を更に含む請求項２５に記載の アッセイキット。 ４２．ランセット、吸収紙、布、スワブ及びカップから構成される群から選択さ れる前記試料の採取に有用なツールを入れた容器を更に含む請求項２７に記載の テストキット。 ４３．配列番号５に対して少なくとも３５％の相同度をもつアミノ酸配列を含む ＴＮＦ−γタンパク質をコードする遺伝子又はそのフラグメント。 ４４．配列番号４に対して少なくとも３５％の相同度をもつＤＮＡを含む遺伝子 又はそのフラグメント。