JP2002516069A - Ｔｎｆ関連死リガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦ関連死リガンド(ＴＲＤＬ)とここに命名された新規な腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)同族体に関する。ＴＲＤＬをコードする単離核酸分子が提供される。また、ＴＲＤＬ活性の作動薬および拮抗薬を同定する方法のようにＴＲＤＬポリペプチドも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ＴＮＦ関連死リガンド(ＴＮＦ-ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇ
ａｎｄ)(ＴＲＤＬ)とここに命名された新規な腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)同族体に関
する。

【０００２】 （発明の背景） 腫瘍を収縮させるその能力から命名された腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)は、免疫系細
胞によって作られ、免疫調節、炎症および癌において重要な役割を有するサイト
カインの新たな族のメンバーである。その族は、ＴＮＦに加えて、分子のＣ末端
部分に制限される限定された配列相同性を共有する７つのメンバーを含む。ＴＮ
Ｆ-βを除いて、これらの各リガンドの各々は、対応する標的細胞から効果を誘
導するには細胞表面提示を必要とするタイプIIの膜に関連した蛋白質である。(
Ｗｉｌｅｙ、Ｓ.Ｒ.、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ、Ｋ.、Ｓｍｏｌａｋ、Ｐ.Ｊ.、Ｄｉｎ
、Ｗ.Ｓ.、Ｈｕａｎｇ、Ｃ-Ｐ.、Ｎｉｃｈｏｌｌ、Ｊ.Ｋ.、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎ
ｄ、Ｇ.Ｒ.、Ｄａｖｉｓ Ｓｍｉｔｈ、Ｔ.、Ｒａｕｃｈ、Ｃ.、Ｓｍｉｔｈ、Ｃ.
Ａ.およびＧｏｏｄｗｉｎ、Ｒ.Ｇ.(１９９５) Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ
ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ.
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ３、６７３-６８２)。このサイトカイン族は、複雑なシグナ
リング戦略およびしばしば矛盾した生物学的効果のある、増大するリストの標的
膜貫通受容体と相互作用する(Ｗｉｌｅｙ、Ｓ.Ｒ.、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ、Ｋ.、Ｓ
ｍｏｌａｋ、Ｐ.Ｊ.、Ｄｉｎ、Ｗ.Ｓ.、Ｈｕａｎｇ、Ｃ-Ｐ.、Ｎｉｃｈｏｌｌ、
Ｊ.Ｋ.、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｇ.Ｒ.、Ｄａｖｉｓ Ｓｍｉｔｈ、Ｔ.、Ｒａｕ
ｃｈ、Ｃ.、Ｓｍｉｔｈ、Ｃ.Ａ.およびＧｏｏｄｗｉｎ、Ｒ.Ｇ.(１９９５) Ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃ
ｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ.Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ３、６７３-６８２)。

【０００３】 ＴＮＦ-αとＴＮＦＲ-１受容体との相互作用は、ＴＮＦリガンド受容体族の生
物学的多様性を類型化する。ＴＮＦＲ-１の連結は、ＮＦ-κＢを活性化し、種々
の細胞型において炎症応答を誘導する(Ｂｅｇ、Ａ.Ａ.およびＢａｌｔｉｍｏｒ
ｅ、Ｄ.(１９９６) Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＮＦ−κＢ ｉ
ｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８２-７８４. Ｗａｎｇ、Ｃ-Ｙ.、Ｍａｙｏ、Ｍ.Ｗ.
およびＢａｌｄｗｉｎ、Ａ.Ｓ. Ｊｒ.(１９９６) ＴＮＦ-ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ
ｔｈｅｒａｐｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏ
ｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７
８４-７８７. ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ、Ｄ.Ｊ.、Ｍａｒｔｉｎ、Ｓ.Ｊ.、Ｋａｆ
ｒｉ、Ｔ.、Ｇｒｅｅｎ、Ｄ.Ｒ.およびＶｅｒｍａ、Ｉ.Ｍ.(１９９６) Ｓｕｐｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ Ｎ
Ｆ−κＢ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８７-７８９)。

【０００４】 あるいは、ＴＮＦＲ-１活性化はアポトーシスも誘導できる(Ｐａｎ、Ｇ.,Ｏ'
Ｒｏｕｒｋｅ、Ｋ.、Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ、Ａ.Ｍ.、Ｇｅｎｔｚ、Ｒ.、Ｅｂｎ
ｅｒ、Ｒ.、Ｎｉ、Ｊ.およびＤｉｘｉｔ、Ｖ.(１９９７) Ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｉｇａｎｄ ＴＲＡＩＬ. Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ. ２７６、１１１-１１３)。これらの２つの経路および最終的な細胞内の
結末を調節するメカニズムは不明のままであるが、治療介入について注目すべき
見通しを提供する。ヒト疾患におけるこの生死バランスの重要性は、ＴＮＦが多
くの型の癌細胞を効果的に殺せないという観察に見ることができる(Ｗａｎｇ、
Ｃ-Ｙ.、Ｍａｙｏ、Ｍ.Ｗ.およびＢａｌｄｗｉｎ、Ａ.Ｓ. Ｊｒ.(１９９６) Ｔ
ＮＦ-ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉ
ｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ.
Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８４-７８７. Ｂａｉｃｈｗａｌ、Ｖ.Ｒ.およびＢ
ａｅｕｅｒｌｅ、Ｐ.Ａ.(１９９７) Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：Ａｃｔｉｖａｔｅ Ｎ
Ｆ−κＢ ｏｒ ｄｉｅ? Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ. ７、Ｒ９４-Ｒ９６)
。最近の証拠は、ＴＮＦが、アポトーシス経路を遮断できるキー分子であるＮＦ
-κＢを活性化することによってそれ自体を蝕むことを示唆する(Ｂｅｇ、Ａ.Ａ.
およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ.(１９９６) Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ
ｆｏｒ ＮＦ−κＢ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ＴＮＦ−α-ｉｎｄｕｃｅｄ
ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８２-７８４. Ｗａｎｇ、Ｃ
-Ｙ.、Ｍａｙｏ、Ｍ.Ｗ.およびＢａｌｄｗｉｎ、Ａ.Ｓ. Ｊｒ.(１９９６) ＴＮ
Ｆ-ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
：ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ. Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８４-７８７. ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ、Ｄ.Ｊ.、Ｍａ
ｒｔｉｎ、Ｓ.Ｊ.、Ｋａｆｒｉ、Ｔ.、Ｇｒｅｅｎ、Ｄ.Ｒ.およびＶｅｒｍａ、
Ｉ.Ｍ.(１９９６) Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃｅｄ ａ
ｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＮＦ−κＢ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８７-７８９.
Ｌｉｕ、Ｚ-Ｇ.、Ｈｓｕ、Ｈ.、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｄ.およびＫａｒｉｎ、Ｍ.(
１９９６) Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １ ｅ
ｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ＪＮＫ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｓ ｎｏ
ｔ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｗｈｉｌｅ ＮＦ−κＢ ａｃｔｉｖ
ａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｃｅｌｌ. ８７、５６５-
５７６. Ｗｕ、Ｍ.、Ｌｅｅ、Ｈ.、Ｂｅｌｌａｓ、Ｒ.Ｅ.、Ｓｃｈａｕｅｒ、Ｓ
.Ｌ.、Ａｒｓｕｒａ、Ｍ.、Ｋａｔｚ、Ｄ.、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ、Ｍ.Ｊ.、Ｒ
ｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｔ.Ｌ.、Ｓｈｅｒｒ、Ｄ.Ｈ.およびＳｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、
Ｇ.Ｅ.(１９９６) Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ/Ｒｅｌ ｉｎｄｕｃ
ｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｂ ｃｅｌｌｓ. ＥＭＢＯ Ｊ. １
５、４６８２-４６９０)。この遮断は、腫瘍細胞を免疫監視に対して抵抗性にで
き、腫瘍細胞のアポトーシスにたよる化学療法的アプローチを混乱できる。従っ
て、この保護メカニズムの崩壊は、ＴＮＦ媒介殺傷に細胞を感作できる(Ｂｅｇ
、Ａ.Ａ.およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ.(１９９６) Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＮＦ-κＢ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃ
ｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８２-７８４. Ｗａｎ
ｇ、Ｃ-Ｙ.、Ｍａｙｏ、Ｍ.Ｗ.およびＢａｌｄｗｉｎ、Ａ.Ｓ. Ｊｒ.(１９９６)
ＴＮＦ-ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓ
ｉｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ
. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８４-７８７. ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ、Ｄ.Ｊ.、
Ｍａｒｔｉｎ、Ｓ.Ｊ.、Ｋａｆｒｉ、Ｔ.、Ｇｒｅｅｎ、Ｄ.Ｒ.およびＶｅｒｍ
ａ、Ｉ.Ｍ.(１９９６) Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃｅ
ｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＮＦ−κＢ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８７-７
８９)。

【０００５】 ＴＮＦシグナリングの理解における最近の進歩は、ＴＮＦに応答する細胞内で
、ＮＦ-κＢ活性化およびアポトーシスの潜在的な遮断に対する、別々の分子標
的を解明した。(Ｂｅｇ、Ａ.Ａ.およびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｄ.(１９９６) Ａ
ｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＮＦ−κＢ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎ
ｇ ＴＮＦ−α-ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４
、７８２-７８４. Ｗａｎｇ、Ｃ-Ｙ.、Ｍａｙｏ、Ｍ.Ｗ.およびＢａｌｄｗｉｎ
、Ａ.Ｓ. Ｊｒ.(１９９６) ＴＮＦ-ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ-ｉｎ
ｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂ
ｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４、７８４-７８７. Ｖａ
ｎＡｎｔｗｅｒｐ、Ｄ.Ｊ.、Ｍａｒｔｉｎ、Ｓ.Ｊ.、Ｋａｆｒｉ、Ｔ.、Ｇｒｅ
ｅｎ、Ｄ.Ｒ.およびＶｅｒｍａ、Ｉ.Ｍ.(１９９６) Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏ
ｆ ＴＮＦ-α-ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ＮＦ−κＢ. Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ. ２７４、７８７-７８９.Ｗｕ、Ｍ.、Ｌｅｅ、Ｈ.、Ｂｅｌｌａｓ、Ｒ.
Ｅ.、Ｓｃｈａｕｅｒ、Ｓ.Ｌ.、Ａｒｓｕｒａ、Ｍ.、Ｋａｔｚ、Ｄ.、Ｆｉｔｚ
Ｇｅｒａｌｄ、Ｍ.Ｊ.、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｔ.Ｌ.、Ｓｈｅｒｒ、Ｄ.Ｈ.およ
びＳｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｇ.Ｅ.(１９９６) Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ
−κＢ/Ｒｅｌ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ Ｂ ｃ
ｅｌｌｓ. ＥＭＢＯ Ｊ. １５、４６８２-４６９０)。これらの応答は、活性化
ＴＮＦ受容体へのシグナリング蛋白質の補充によって促進される。ＴＲＡＤＤ(
ＴＮＦＲ１関連死ドメイン蛋白質)、ＴＲＡＦ２(ＴＮＦＲ関連蛋白質-２)および
ＲＩＰ(受容体相互作用プロテインキナーゼ)を含めたこれらシグナリング蛋白質
のいくつかは、ＮＦ-κＢの活性化を開始するようである。Ｃｈｉｎｎａｉｙａ
ｎ、Ａ.Ｍ.、Ｏ'Ｒｏｕｒｋｅ、Ｋ.、Ｙｕ、Ｇ-Ｌ.、Ｌｙｏｎｓ、Ｒ.Ｈ.、Ｇａ
ｒｇ、Ｍ.、Ｄｕａｎ、Ｄ.Ｒ.、Ｘｉｎｇ、Ｌ.、Ｇｅｎｔｚ、Ｒ.、Ｎｉ、Ｊ.お
よびＤｉｘｉｔ、Ｖ.Ｍ.(１９９６) Ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙ ＤＲ３、ａ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｃｅｐ
ｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＴＮＦＲ-１ ａｎｄ ＣＤ９５. Ｓｃｉｅｎｃｅ.
２７４、９９０-９９２。ＦＡＤＤ(Ｆａｓ関連死ドメイン蛋白質)およびＦＬＩ
ＣＫ(ＦＡＤＤ様インターロイキン変換酵素)を含めた他の蛋白質の補充は、アポ
トーシスを誘導する(Ｂｏｌｄｉｎ、Ｍ.Ｐ.、Ｇｏｎｃｈａｒｏｖ、Ｔ.Ｍ.、Ｇ
ｏｌｔｓｅｖ、Ｙ.Ｖ.および Ｗａｌｌａｃｈ、Ｄ.(１９９６) Ｉｎｖｏｌｖｅ
ｍｅｎｔ ｏｆ ＭＡＣＨ、ａ ｎｏｖｅｌ ＭＯＲＴ１/ＦＡＤＤ-ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ｉｎ Ｆａｓ/ＡＰＯ-１-ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅ
ｐｔｏｒ-ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｃｅｌｌ. ８５、８０３-８１
５. Ｍｕｚｉｏ、Ｍ.、Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ、Ａ.Ｍ.、Ｋｉｓｃｈｋｅｌ、Ｆ.
Ｃ.、Ｏ'Ｒｏｕｒｋｅ、Ｋ.、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ、Ａ.、Ｎｉ、Ｊ.、Ｓｃａ
ｆｆｉｄｉ、Ｃ.、Ｂｒｅｔｚ、Ｊ.Ｄ.、Ｚｈａｎｇ、Ｍ.、Ｇｅｎｔｚ、Ｒ.、
Ｍａｎｎ、Ｍ.、Ｋｒａｍｍｅｒ、Ｐ.Ｈ.、Ｐｅｔｅｒ、Ｍ.Ｅ.およびＤｉｘｉ
ｔ、Ｖ.(１９９６) ＦＬＩＣＥ、ａ ｎｏｖｅｌ ＦＡＤＤ-ｈｏｍｏｌｏｇｏｕ
ｓ ＩＣＥ/ＣＥＤ-３-ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ、ｉｓ ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ
ｔｏ ｔｈｅ ＣＤ９５(Ｆａｓ/ＡＰＯ-１) ｄｅａｔｈ-ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｉ
ｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ. Ｃｅｌｌ. ８５、８１７-８２７)。

【０００６】 この新たな生物学は、とりわけ癌、炎症疾患および神経変性疾患における潜在
的な治療介入について、研究者間にかなりの注目を創造して来た。かくして、当
業者ならば、アポトーシスおよびＮＦ-κＢの活性化に包含される炎症性サイト
カインのＴＮＦ族の新規なメンバーの継続的な要求が存在することは明らかであ
ろう。

【０００７】 （情報の開示） Ｗｉｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３、６７３-６８２(１９９５)。 Ｂｅｇ、Ａ.Ａ.およびＤ. Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、７
８２-７８４(１９９６)。 Ｗａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、７８４-７８７(１９９６)。 ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、７８７-７８９(１９９６)
。 Ｐａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６、１１１-１１３(１９９７)。 Ｂａｉｃｈｗａｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７、Ｒ９４-Ｒ９６(１
９９７)。 Ｌｉｕら、Ｃｅｌｌ ８７、５６５-５７６(１９９６)。 Ｗｕら、ＥＭＢＯ Ｊ １５、４６８２-４６９０(１９９６)。 Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、９９０-９９２(１９９６)
。 Ｂｏｌｄｉｎら、Ｃｅｌｌ ８５、８０３-８１５(１９９６)。 Ｍｕｚｉｏら、Ｃｅｌｌ ８５、８１７-８２７(１９９６)。 Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏ. ２１５、４０３-４１０(１９９０
). Ｉｄｚｉｏｒｅｋら、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏ. Ｍｅｔｈ. １８５：２４９-２５
８(１９９５)。 Ｘ.Ｍ. Ｗａｎｇら、 Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：２６４(１９９３)。

【０００８】 （発明の概要） 本発明は、本明細書中でＴＲＤＬと命名された新規なＴＮＦ同族体をコードす
るポリヌクレオチドを含む単離核酸分子またはその断片を提供する。本発明のＴ
ＲＤＬポリペプチドは、図３および４に示されるアミノ酸配列(各々、配列番号
：２および配列番号：４)を有する、本明細書中でＴＲＤＬ-１１およびＴＲＤＬ
-１４と命名されたＴＲＤＬの２つの別々なスプライス変異体を含む。ＴＲＤＬ
の好ましい断片は、ＴＲＤＬ-１１およびＴＲＤＬ-１４の細胞外部分を含む。 好ましい具体例において、該核酸分子は、配列番号：１または配列番号：３の
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。他の態様において、本発明
は、ストリンジェント条件下、ＴＲＤＬ-１１またはＴＲＤＬ-１４をコードする
ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子ま
たはその断片を提供する。

【０００９】 また、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター、かかるベクターが導
入された宿主細胞、および上記の宿主細胞を培養し、ＴＲＤＬポリペプチドを単
離することを特徴とするＴＲＤＬポリペプチドを得る組換え方法を提供する。 他の態様において、本発明は、単離ＴＲＤＬポリペプチドならびにその断片を
提供する。好ましい具体例において、ＴＲＤＬポリペプチドは、配列番号：２ま
たは配列番号：４のアミノ酸配列を有する。また、ＴＲＤＬポリペプチドに特異
的に結合するポリクローナルおよびモノクローナルの双方の単離抗体が提供され
る。

【００１０】 また、本発明は、ＴＲＤＬに高親和性受容体を有する細胞の同定法であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の 細胞とを接触させ； (ｃ)工程(ｂ)で得られた細胞を洗浄して未結合のＴＲＤＬを除去し；次いで (ｄ)工程(ｃ)で得られた洗浄された細胞中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの 存在を測定し； それによって、工程(ｃ)で得られた洗浄された細胞中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドの存在が細胞上のＴＲＤＬについての高親和性受容体の存在を示すことを特徴
とする該方法を提供する。

【００１１】 他の具体例において、本発明はＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害する薬剤
の同定法であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の 細胞とを接触させ、 (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄して、未結合ＴＲＤＬを除去し、 (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄された細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄された細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と、(ｄ)
(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドのより低量は、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害したことを示す
ことを特徴とする該方法に関する。

【００１２】 他の具体例において、本発明はＴＲＤＬのその受容体への結合を増強する薬剤
の同定法であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の細胞 とを接触させ、 (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄し、 (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄された細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄された細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と、 (ｄ)(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドのより高量は、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を増強することを示す
ことを特徴とする該方法に関する。

【００１３】 他の具体例において、本発明はＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシス
を受ける細胞系の同定法であって、 (ａ)哺乳動物細胞系の培養細胞を試験培養物および対照培養物とに分け； (ｂ)ＴＲＤＬポリペプチドと工程(ａ)の試験培養物とを接触させ； (ｃ)アポトーシスを受けた、 (ｉ)工程(ｂ)で得られた試験培養物；および (ii)工程(ａ)の対照培養物； の細胞の量を測定し；次いで (ｄ)工程(ｃ)(ｉ)の試験培養物中のアポトーシスを受けたと判断された細胞の 量と、工程(ｃ)(ii)の対照培養物中のアポトーシスを受けたと判断された 細胞の量とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が該対照培養物
よりも高いという決定は、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、該哺乳動物細胞系が
アポトーシスを受けることを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００１４】 さらに他の具体例において、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻
害できる薬剤の同定法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻
害することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００１５】 さらに他の具体例において、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増
強できる薬剤の同定法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト
ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増
強することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００１６】 さらに他の具体例において、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻
害できる薬剤の同定法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻
害することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００１７】 さらに他の具体例において、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増
強できる薬剤の同定法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増
強することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００１８】 （詳細な記載） 本発明は、本明細書中でＴＲＤＬ-１１およびＴＲＤＬ-１４と命名され、図４
および５に示されたアミノ酸配列(各々、配列番号：２および配列番号：４)を有
するＴＲＤＬペプチドの２つの別々なスプライス変異体をコードすることを特徴
とする単離核酸分子を提供する。特に断りのない限りは、ＴＲＤＬに対する全て
の言及は、ＴＲＤＬ-１１またはＴＲＤＬ-１４のいずれかに言及するものと理解
されるべきである。

【００１９】 本発明のＴＲＤＬポリペプチドは、ＴＮＦ−α、ＦａｓＬおよびＴＲＡＩＬを
含むサイトカイン族と配列相同性を持つ。ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬの
ような分子との配列保存は、カルボキシ末端から１００アミノ酸以内の２つの短
いストレッチに第一義的には制限される。ＴＮＦ−α、ＦａｓＬおよびＴＲＡＩ
Ｌに対するＴＲＤＬのＣ末端ドメインの全パーセント同一性は、各々、１７％、
１７％および１２％である。顕著ではないが、このレベルの相同性は、ＴＮＦサ
イトカイン族には典型的である。比較すると、ＴＲＡＩＬは、ＦａｓＬに対して
わずかに２８％の相同性、ＴＮＦαに対して２３％の相同性およびリンホトキシ
ンβに対して２２％の相同性である。これらの族のメンバーと同様に、ＴＲＤＬ
は、細胞表面上のこの分子の適当な存在が必要であるらしいＮ末端近くの推定膜
貫通セグメントを含む。Ｗｉｌｅｙ、Ｓ.Ｒ.、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ、Ｋ.、Ｓｍｏ
ｌａｋ、Ｐ.Ｊ.、Ｄｉｎ、Ｗ.Ｓ.、Ｈｕａｎｇ、Ｃ−Ｐ.、Ｎｉｃｈｏｌｌ、Ｊ.
Ｋ.、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｇ.Ｒ.、Ｄａｖｉｓ Ｓｍｉｔｈ、Ｔ.、Ｒａｕｃ
ｈ、Ｃ.、Ｓｍｉｔｈ、Ｃ.Ａ.およびＧｏｏｄｗｉｎ、Ｒ.Ｇ.(１９９５) Ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃ
ｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ. Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ３、 ６７３−６８２。

【００２０】 本発明のＴＲＤＬポリペプチドの構造ドメインは、Ｔｒａｎｓｍｅｍプログラ
ム(Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ)を介して
予測された。かくして、そのアミノ酸配列が 配列番号：２で与えられるＴＲＤ
Ｌ-１１の構造ドメインは、約アミノ酸残基１ないし約アミノ酸残基２３に対応
するＮ末端細胞質ドメイン、約アミノ酸残基２４ないし約アミノ酸残基５２に対
応する膜貫通領域、および約アミノ酸残基５３ないし約アミノ酸残基２３４に対
応するＣ末端細胞外ドメインを含むと予測される。そのアミノ酸配列が 配列番
号：４で与えられるＴＲＤＬ-１４の構造ドメインは、約アミノ酸残基１ないし
約アミノ酸残基２３に対応するＮ末端細胞質ドメイン、約アミノ酸残基２４ない
し約アミノ酸残基５２に対応する膜貫通領域、および約アミノ酸残基５３ないし
約アミノ酸残基２４７に対応するＣ末端細胞外ドメインを含むと予測される。か
くして、本発明は、ＴＲＤＬ-１１またはＴＲＤＬ-１４のいずれかの細胞内、膜
貫通領域または細胞外領域をコードする核酸分子も提供する。

【００２１】 当業者に理解されるであろうように、上記の各ＴＲＤＬポリペプチドの膜貫通
領域は、疎水性ドメインの型を同定するための慣用的基準により同定される。も
ちろん、膜貫通領域の正確な境界線は、上記のものからわずかに変更できる。か
くして、ＴＲＤＬの膜貫通ドメインのＮ末端境界線は、示された境界線に対して
５アミノ酸残基Ｎ末端側またはＣ末端側で始まることができ、ＴＲＤＬの膜貫通
ドメインのＣ末端は、示された境界線に対して５アミノ酸残基Ｎ末端側またはＣ
末端側で始まることができる。もちろん、膜貫通領域の現実の境界線が上記のご
とくシフトする場合、細胞内ドメインのＣ末端境界線および細胞外ドメインのＮ
末端境界線における対応するシフトにも見出されるであろう。

【００２２】 配列番号：１および配列番号：３で与えられたヌクレオチド配列は、各々、Ｔ
ＲＤＬ-１１およびＴＲＤＬ-１４をコードするヌクレオチド配列に対応する。Ｔ
ＲＤＬをコードするＤＮＡの単離および配列決定は以下の実施例１で記載する。
(ＴＲＤＬ-１４をコードする)配列番号：３のＤＮＡと比較して、(ＴＲＤＬ-１
１をコードする)配列番号：１のＤＮＡは、配列番号：３(ＴＲＤＬ-１４)のＤＮ
Ａからの約１６アミノ酸(ＴＲＤＬ-１４の約残基１１１ないし約残基１２７)を
コードする約４８塩基対のインフレーム欠失を含む。(ＴＲＤＬ-１１をコードす
る)配列番号：１のＤＮＡと比較して、(ＴＲＤＬ-１４をコードする)配列番号：
３のＤＮＡは、配列番号：１(ＴＲＤＬ-１１)のＤＮＡからの末端コドン付近の
約１８３塩基対を欠く(図５参照)。

【００２３】 実施例１に記載のごとく、自動配列決定法を用いて、ＴＲＤＬのヌクレオチド
配列を得た。本発明のＴＲＤＬヌクレオチド配列を両ＤＮＡ鎖について得、正確
に１００％であると考えられる。しかしながら、当該技術分野において知られて
いるように、かかる自動方法によって得られたヌクレオチド配列は、いくつかの
誤りを含むかも知れない。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、典型
的には、所与の核酸分子の実際のヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％
同一、より典型的には、少なくとも約９５％同一ないし少なくとも約９９.９％
同一である。実際の配列は、当該技術分野でよく知られるマニュアル配列決定法
を用いてより正確に決定できる。当該技術分野で知られるように、１以上のヌク
レオチドの挿入または欠失をもたらす配列の誤りの結果、予測アミノ酸配列が変
異点で開始する核酸分子の実際のヌクレオチド配列から予測されるものとは異な
るであろうように翻訳においてフレームシフトを生じさせるであろう。

【００２４】 本発明のＴＲＤＬのＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによ
って単離されたＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびその組合せを含む。ゲノムＴＲＤＬ
のＤＮＡは、本明細書中に記載されたＴＲＤＬ ｃＤＮＡでゲノムライブラリー
をスクリーニングすることによって得ることができる(実施例３、セクション(ｅ
) 参照)。また、ＴＲＤＬ ＤＮＡから転写されたＲＮＡも、本発明に包まれる。

【００２５】 遺伝暗号の縮重のために、２つのＤＮＡ配列は異なるが同一のアミノ酸配列を
依然としてコードできる。かくして、本発明は、本発明のいずれかのＴＲＤＬポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を有する単離核酸分子を提供し、
ここに、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号：２または配列番号：４の完全な
アミノ酸配列またはその断片を有するＴＲＤＬポリペプチドをコードする。

【００２６】 また、組換え体および非組換え体の精製ＴＲＤＬポリペプチドも本明細書中で
提供される。ＴＲＤＬのいずれかの生物学的活性を保持する天然のＴＲＤＬ蛋白
質の変異体および誘導体も本発明の範囲内にある。ＴＲＤＬの一つの生物学的活
性は、アポトーシスを誘導する能力である。標的細胞のアポトーシスを検出する
ためのアッセイ手順はよく知られている。これらは、Ｗｉｌｅｙら(ＷＯ ９７/
０１６３３)によって記載されたＤＮＡラダーリング・アポトーシスアッセイお
よび細胞溶解アッセイを含む。

【００２７】 ＴＲＤＬ変異体は、例えば、天然のＴＲＤＬをコードするヌクレオチド配列の
変異によって得ることができる。本明細書で言及するＴＲＤＬ変異体は、アミノ
酸配列中の１以上の欠失、挿入または置換のために、天然のＴＲＤＬのものとは
異なるアミノ酸配列を有する以外は天然のＴＲＤＬと実質的に相同性のあるポリ
ペプチドである。変異体のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、天然のＴＲＤＬ
配列に対して、好ましくは、少なくとも約８０％の同一性があり、より好ましく
は、少なくとも約９０％の同一性があり、最も好ましくは、少なくとも約９５％
の同一性がある。天然および変異体ＴＲＤＬ配列間の、相同性とも呼ばれる配列
同一性のパーセンテージは、例えば、この目的に通常用いられる、Ｂｅｓｔｆｉ
ｔプログラムのごときいずれかのコンピュータープログラムを用いて、２つの配
列を比較することによって決定できる(Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ)、それは、Ｓｍｉｔ
ｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム(Ａｄｖ. Ａｐｐｌ. Ｍａｔｈ. ２：
４８２-４８９(１９８１))を用いる。

【００２８】 天然のアミノ酸配列の改変は、多数の公知技術のいずれかによって達成できる
。例えば、突然変異は、Ｗａｌｄｅｒら(Ｇｅｎｅ ４２：１３３(１９８６))；
Ｂａｕｅｒら(Ｇｅｎｅ ３７：７３(１９８５))；Ｃｒａｉｋ(ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ、Ｊａｎｕａｒｙ １９８５、ｐｐ. １２-１９)；Ｓｍｉｔｈら(Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ(１９８１))；および米国特許第４,５１８,５
８４号および第４,７３７,４６２号によって記載される、オリゴヌクレオチド指
向された突然変異のごとき、当業者によく知られた手順によって特定の位置に導
入できる。

【００２９】 本発明の範囲内のＴＲＤＬ変異体は、ＴＲＤＬポリペプチドの１以上のアミノ
酸残基が、ＴＲＤＬポリペプチドの二次および/または三次構造を変更しない異
なる残基によって置換されることを意味する保存的置換した配列を含むことがで
きる。かかる置換は、１つの脂肪族残基(Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ)
をもう一つの代わりに置換すること、または塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ、酸
性残基ＧｌｕおよびＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎおよびＡｓｎ、ヒドロキシル残基
ＳｅｒおよびＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換ごとく、類
似の物理化学的性質を有する残基によるアミノ酸の置換を含むことができる。

【００３０】 表現型的にサイレントなアミノ酸交換の作成に関するさらなる情報は、Ｂｏｗ
ｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６-１３１０(１９９０)に見出すことが
できる。ＴＲＤＬの生物学的活性を実質的に保持できた他のＴＲＤＬ変異体は、
アミノ酸置換が蛋白質の機能領域外のエリア、例えば、受容体結合部位の外にあ
る領域においてなされるものである。

【００３１】 他の態様において、本発明は、上記の核酸分子の一部、例えば、前記の核酸分
子のうちの１つの、少なくとも約１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２
０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、およびさらに
より好ましくは少なくとも約３０ないし少なくとも約１００ヌクレオチドに、ス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸
分子を提供する。記載された長さを有する核酸分子のかかる一部とは、例えば、
参照核酸分子の少なくとも約１５隣接ヌクレオチドをいう。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件とは、６×ＳＳＣ/０.１％ ＳＤＳ中での約２.５時
間約４２℃にての一晩のインキュベーション、続いての０.１％ ＳＤＳ、６５℃
にて１.０×ＳＳＣでのフィルター洗浄を示す。

【００３２】 本明細書中のＴＲＤＬをコードする核酸分子ならびに(ＴＲＤＬ-１、ＴＲＤＬ
-１１およびＴＲＤＬ-１４のいずれかの細胞内、膜貫通領域または細胞外領域を
コードする断片を含めた)かかる核酸分子にハイブリダイズできるポリヌクレオ
チドの断片をポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)におけるプローブまたはプライマーと
して用いることができる。かかるプローブを用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
アッセイならびにサザーンおよびノーザンブロットにてＴＲＤＬ核酸の存在を検
出できる。ＴＲＤＬを発現する細胞型も、かかるプローブの使用によって同定で
きる。かかる手順は、よく知れれ、当業者ならば、特定の適用に適当な長さのプ
ローブを選択できるであろう。ＰＣＲでは、所望のＴＲＤＬ核酸分子の末端に対
応する５'および３'プライマーを使用して通常の技術を用いてその配列を単離し
、増幅する。

【００３３】 ＴＲＤＬ核酸分子の他の有用な断片は、(センス鎖を用いて)標的ＴＲＤＬ ｍ
ＲＮＡ配列または(アンチセンス鎖を用いて)ＴＲＤＬ ＤＮＡ配列に結合できる
一本鎖核酸配列を含むアンチセンスおよびセンスヌクレオチドである。

【００３４】 他の態様において、本発明は、関連した天然パターンのグリコシル化が有り無
しのＴＲＤＬポリペプチドを含む。酵母または哺乳動物の発現系(以下に記載)に
おいて発現したＴＲＤＬは、分子量およびグリコシル化パターンにおいて天然の
ＴＲＤＬポリペプチドと同様か、またはかなり異なる。細菌発現系におけるＴＲ
ＤＬの発現は、非グリコシル化ＴＲＤＬを供するであろう。

【００３５】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離形態において供され、好ましくは実
質的に精製される。ＴＲＤＬポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノー
ル沈澱、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースク
ロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマ
トグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロ
マトグラフィーを含めたよく知られた方法によって組換え細胞培養物から回収で
き、精製できる。好ましい具体例において、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰ
ＬＣ)を精製のために使用する。

【００３６】 また、本発明は、本発明のポリヌクレオチド分子を含むベクター、ならびにか
かるベクターで形質転換した宿主細胞に関する。本発明のいずれかのポリヌクレ
オチド分子は、宿主における増殖のために、選択マーカーおよび複製起点を一般
的に含むベクターと結合できる。また、本発明は、上記のポリヌクレオチド分子
から発現したＴＲＤＬポリペプチドを供するため、ＴＲＤＬの発現用ベクターが
好ましい。該ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子から誘
導されるもののごとき適当な転写または翻訳調節配列に作動可能に連結した、上
記または下記のいずれかのＴＲＤＬポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。調
節配列の例は、転写プロモーター、オペレーターまたはエンハンサー、ｍＲＮＡ
リボソーム結合部位、および転写および翻訳を制御する適当な配列を含む。ヌク
レオチド配列は、調節配列がＴＲＤＬをコードするＤＮＡに機能的に関係する場
合に作動可能に結合する。かくして、プロモーターのヌクレオチド配列は、もし
プロモーターヌクレオチド配列がＴＲＤＬ配列の転写を指示するならば、ＴＲＤ
ＬのＤＮＡ配列に作動可能に結合する。

【００３７】 ＴＲＤＬをコードするポリヌクレオチド分子のクローニングに用いられるべき
、またはＴＲＤＬポリペプチドの発現用の適当なベクターの選択は、該ベクター
がその中で形質転換されるであろう宿主細胞、および適用可能な場合、ＴＲＤＬ
ポリペプチドがそれから発現されるべき宿主細胞にもちろん依存するであろう。
ＴＲＤＬポリペプチド発現用の適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞およびよ
り高級な真核細胞を含み、それらの各々は以下に記載される。

【００３８】 また、かかる宿主細胞において発現されるべきＴＲＤＬポリペプチドは、異種
蛋白質からの領域を含む融合蛋白質である。かかる領域は、例えば、ポリペプチ
ドの分泌、改良された安定性または精製促進を可能とするために含ませる。例え
ば、適当なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターに取り込むことが
できる。シグナルペプチド用ＤＮＡ配列(分泌型リーダー(ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ
ｌｅａｄｅｒ))は、ＴＲＤＬがシグナルペプチドを含む融合蛋白質として翻訳さ
れるようにＴＲＤＬ配列にインフレームで融合できる。意図した宿主細胞で機能
するシグナルペプチドは、ＴＲＤＬポリペプチドの細胞外分泌を増進する。好ま
しくは、該シグナル配列は、細胞からのＴＲＤＬの分泌に際してＴＲＤＬポリペ
プチドから切断されるであろう。本発明を実施するのに用いることができるシグ
ナル配列の非限定的例は、酵母α因子およびｓｆ９昆虫細胞のミツバチメラチン
リーダー(ｍｅｌａｔｉｎ ｌｅａｄｅｒ)を含む。

【００３９】 好ましい具体例において、該ＴＲＤＬポリペプチドは、ポリペプチドの精製を
促進するのに用いられる異種領域を含む融合蛋白質であろう。かかる機能に用い
られた多くの利用可能なペプチドは、結合パートナーに対する融合蛋白質の選択
的結合を可能とする。例えば、該ＴＲＤＬポリペプチドは、結合パートナーまた
はペプチドタグに特異的に結合する融合蛋白質を形成するためのペプチドを含む
ように修飾することができる。かかるペプチドタグの非限定的例は、６−Ｈｉｓ
タグ、チオレドキシンタグ、赤血球凝集素タグ、ＧＳＴタグおよびＯｍｐＡシグ
ナル配列タグを含む。当業者によって理解されるであろうように、ペプチドを認
識し、ペプチドに結合する結合パートナーは、金属イオン(例えば、金属アフィ
ニティーカラム)、抗体またはその断片を含むいずれの分子または化合物、およ
びＦＬＡＧタグのごときペプチドを結合するいずれの蛋白質またはペプチドでも
あり得る。

【００４０】 ＴＲＤＬポリペプチドの発現用の適当な宿主細胞は、原核細胞、酵母細胞およ
びより高度な真核細胞を含む。ＴＲＤＬの発現に用いるべき適当な原核生物宿主
は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属およびＳａｌｍｏｎｅｌｌ
ａ属の細菌、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属
およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属のメンバーを含む。例えば、Ｅ.ｃｏｌ
ｉにおける発現では、ＴＲＤＬポリペプチドは、原核生物宿主において、Ｎ末端
メチオニン残基を含んで組換えポリペプチドの発現を促進できる。次いで、Ｎ末
端のＭｅｔは、発現したＴＲＤＬポリペプチドから所望により切断できる。 原核生物宿主で用いる発現ベクターは、一般的に１以上の表現型の選択マーカ
ー遺伝子を含む。かかる遺伝子は、例えば、抗生物質抵抗性を与えるか、または
栄養要求性を供する蛋白質をコードする。非常に様々なかかるベクターは、商業
的入手源から容易に入手できる。例は、ｐＳＰＯＲＴベクター、ｐＧＥＭベクタ
ー(Ｐｒｏｍｅｇａ)、ｐＰＲＯＥＸベクター(ＬＴＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ
ＮＡ)、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)およびｐＱＥベ
クター(Ｑｉａｇｅｎ)を含む。

【００４１】 また、ＴＲＤＬは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＫｌｕ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓを含めた属からの酵母宿主細胞において発現できる。好まし
い酵母宿主は、Ｓ. ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰ. ｐａｓｔｏｒｉｓである。
酵母ベクターは、2μ酵母プラスミドからの複製起点配列、自律複製の配列(ＡＲ
Ｓ)、プロモーター領域、ポリアデニル化用配列、転写終止用配列、および選択
マーカー遺伝子をしばしば含むであろう。酵母およびＥ. ｃｏｌｉ双方において
複製可能なベクター(シャトルベクターという)も用いることができる。上記の特
徴の酵母ベクターに加えて、シャトルベクターは、Ｅ. ｃｏｌｉにおける複製お
よび選択のための配列も含む。酵母宿主において発現したＴＲＤＬポリペプチド
の直接的分泌は、ＴＲＤＬをコードするヌクレオチド配列の５'端にて酵母α因
子リーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含ませることによって達成でき
る。

【００４２】 また、昆虫宿主細胞培養系は、ＴＲＤＬポリペプチドの発現に用いることがで
きる。バキュロウイルスにおけるＴＲＤＬポリペプチドの発現は、以下の実施例
４に記載される。昆虫細胞における異種蛋白質の発現についてのバキュロウイル
ス系の使用に関してのさらなる情報は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂ
ｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７(１９８８)に概説されている。

【００４３】 好ましい具体例において、ＴＲＤＬポリペプチドを哺乳動物宿主細胞において
発現させる。適当な哺乳動物細胞系の非限定的例は、サル腎臓細胞のＣＯＳ-７
系(Ｇｌｕｚｍａｎら、Ｃｅｌｌ ２３：１７５(１９８１))およびチャイニーズ
ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含む。ＣＨＯ細胞におけるＴＲＤＬポリペプチド
発現は、以下の実施例４に記載される。

【００４４】 ＴＲＤＬポリペプチドの発現用の適当な発現ベクターの選択は、用いられるべ
き具体的な哺乳動物宿主細胞にもちろん依存し、当業者の技量内であろう。適当
な発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)およびｐＳＶＬ(
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ)を含む。哺乳動物宿主細胞で用いられる発
現ベクターは、ウイルスゲノム由来の転写および翻訳制御配列を含む。本発明に
おいて用いることができる、通常に使用されるプロモーター配列およびエンハン
サー配列は、限定されるものではないが、ヒト・サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)
、アデノウイルス２、ポリオーマウイルスおよびシミアンウイルス４０(ＳＶ４
０)由来のものを含む。哺乳動物発現ベクターの構築方法は、例えば、Ｏｋａｙ
ａｍａおよびＢｅｒｇ(Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. ３：２８０(１９８３))；
Ｃｏｓｍａｎら(Ｍｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. ２３：９３５(１９８６))；Ｃｏｓｍ
ａｎら(Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８(１９８４))；ＥＰ-Ａ-０３６７５６６；
およびＷＯ ９１/１８９８２に開示されている。

【００４５】 また、本発明のポリペプチドを用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル
抗体を生起させることができ、それはＴＲＤＬポリペプチド発現を検出するため
の診断的アッセイに有用である。かかる抗体は慣用的技術によって調製できる。
例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｄ(編)、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ.Ｙ.、(１
９８８)；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅ
ｓ、Ｋｅｎｎｅｔら(ｅｄｓ.)、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ(１
９８０)参照。

【００４６】 また、本発明のＴＲＤＬ核酸分子は、ヒト染色体上の特定の位置とハイブリダ
イズできる(実施例４に記載)ので、染色体同定について価値が有る。実際の配列
データ(繰り返し多型)に基づく染色体マーキング試薬は染色体位置をマーキング
するのに現在ほとんど入手できないので、染色体上の特定の部位を同定する必要
が現在ある。一旦配列が正確な染色体位置にマップされたならば、染色体上の該
配列の物理的位置は、遺伝子地図データと相関させることができる。次いで、同
一の染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との間の関係は、連鎖解析を通
して同定でき、ここに、物理的に隣接する遺伝子の共遺伝が測定される。次いで
、特定の疾患に関連するらしい遺伝子が事実疾患の原因であるか否かは、罹患し
たおよび罹患していない個人間の核酸配列を比較することにより決定できる。

【００４７】 ＴＲＤＬは、ＦａｓリガンドおよびＴＲＡＩＬのごとき、ＴＤＲＬおよびＴＮ
Ｆ族のメンバー間の配列相同性によって示されるごとき炎症性サイトカインのＴ
ＮＦ族の新しいメンバーであるので、ＴＲＤＬは、同様な生物学的応答を誘導す
るらしい。これらは、細胞のアポトーシスの活性化およびＮＦ-κＢの活性化を
含む。ある種の疾患状態は、該疾患に罹っていない個人に起こるアポトーシスの
レベルと比較して低いアポトーシスのレベルを示す。かかる疾患は、例えば、ｐ
５３突然変異を持つ癌、ホルモン依存性腫瘍、自己免疫疾患およびウイルス感染
を含む。さらにまた、以下の実施例２において記載されるごとく、ある種の組織
型は、腫瘍組織より正常組織において高レベルのＴＲＤＬ発現を示す。かくして
、ＴＲＤＬについての１つの用途は、個人に対してＴＲＤＬを投与するまたは該
個人に対してＴＲＤＬ活性を減少させる薬剤(すなわち、ＴＲＤＬ作動薬)を投与
することを特徴とするＴＲＤＬ活性の増加を必要とする個人を治療する方法に関
する。ＴＲＤＬまたはＴＲＤＬ作動薬の投与は、所望のプログラムされた細胞死
に導くことができる。

【００４８】 さらに、ある種の疾患は、該疾患に罹っていない個人に生じるアポトーシスの
レベルと比較して増加したレベルのアポトーシスを含む。ＴＲＤＬまたはＴＲＤ
Ｌ活性を減少させる薬剤(すなわち、ＴＲＤＬ拮抗薬)の投与は、従って、かかる
個人においてアポトーシスのレベルを低下できる。かかる疾患は、例えば、ＡＩ
ＤＳ、神経変性疾患、脊髄異形成疾患および虚血性損傷を含む。かくして、ＴＲ
ＤＬの一つの用途は、個人に対してＴＲＤＬ活性を減少できる薬剤(すなわち、
ＴＲＤＬ拮抗薬)を該個人に投与することを特徴とする、ＴＲＤＬの減少を必要
とする個人を治療する方法に関する。ＴＲＤＬ拮抗薬の投与は、所望のプログラ
ムされた細胞死に導くことができる。

【００４９】 かくして、他の具体例において、本発明は、ＴＲＤＬ作動薬および拮抗薬の同
定におけるＴＲＤＬポリペプチドの使用に関する。ＴＲＤＬポリペプチドの一つ
のかかる用途は、後記の実施例５に記載される。この実施例において、高親和性
のＴＲＤＬ受容体を担う細胞は、標識したＴＲＤＬと異なる細胞系とを組合せる
ことによって同定される。次いで、高レベルのＴＲＤＬ結合を発現する細胞系は
、後記されるごとくＴＲＤＬ作動薬および拮抗薬について高処理量のスクリーニ
ングアッセイにおいて用いられる。かくして、該細胞系に結合するＴＲＤＬを増
加させる薬剤はＴＲＤＬ作動薬であり、一方、ＴＲＤＬ結合を減少させる薬剤は
ＴＲＤＬ拮抗剤でる。ＴＲＤＬ用の適当な標識は、ビオチン、¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³⁵
Ｓおよび³Ｈのごとき放射性同位体、フルオロセインおよびローダミンのごとき
蛍光標識、および酵素標識を含む。

【００５０】 かくして、本発明は、ＴＲＤＬに対して高親和性受容体を有する細胞の同定法
であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の 細胞とを接触させ； (ｃ)工程(ｂ)で得られた細胞を洗浄して未結合のＴＲＤＬを除去し；次いで (ｄ)工程(ｃ)で得られた洗浄された細胞中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの 存在を測定し； それによって、工程(ｃ)で得られた洗浄された細胞中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドの存在が細胞上のＴＲＤＬに対する高親和性受容体の存在を示すことを特徴と
する該方法を提供する。

【００５１】 他の具体例において、本発明はＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害する薬剤
の同定法であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の 細胞とを接触させ、 (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄して未結合ＴＲＤＬを除去し； (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄された細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄された細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と、(ｄ)
(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドのより低量は、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害することを示す
ことを特徴とする該方法に関する。

【００５２】 他の具体例において、本発明はＴＲＤＬのその受容体への結合を増強する薬剤
の同定法であって、 (ａ)単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた標識ＴＲＤＬポリペプチドと、哺乳動物細胞系の細胞
と を接触させ、 (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄して未結合ＴＲＤＬを除去し； (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄された細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄された細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と、(ｄ)
(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリペプチ
ドのより高量は、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を増強することを示す
ことを特徴とする該方法に関する。

【００５３】 さらにまた、上記のごとく、ＴＲＤＬは、アポトーシスの誘導またはアポトー
シスの予防のごとき、サイトカインのＴＮＦ族に共通する活性を示すであろう。
アポトーシスを受けた細胞の定量で用いるべきアッセイ法は、当該技術分野にお
いてよく知られている(例えば、Ｗｉｌｅｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：６７３-
６８２(１９９５)；Ｉｄｚｉｏｒｅｋら、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏ. Ｍｅｔｈ. １８５
：２４９-２５８(１９９５)；Ｘ.Ｍ. Ｗａｎｇら、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
３７：２６４(１９９３)参照)。かくして、Ｗｉｌｅｙらが記載したＤＮＡラダ
ーリングアポトーシスアッセイまたはパーセント生存率アッセイ、またはＩｄｚ
ｉｏｒｅｋらの細胞死アッセイ(実施例６参照)のごときアッセイを用いることに
よって、様々な細胞型におけるアポトーシス誘導または予防に対するＴＲＤＬの
効果を試験し、ＴＲＤＬとの相互作用に際してプログラムされた細胞死を受ける
細胞型、およびＴＲＤＬとの相互作用に際してプログラムされた細胞死を受ける
ことが妨げられる細胞型の同定を可能とすることができるであろう。

【００５４】 従って、本発明はＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受ける細胞
系の同定法であって、 (ａ)哺乳動物細胞系の培養細胞を試験培養物および対照培養物とに分け； (ｂ)ＴＲＤＬポリペプチドと工程(ａ)の試験培養物とを接触させ； (ｃ)アポトーシスを受けた、 (ｉ)工程(ｂ)で得られた試験培養物；および (ii)工程(ａ)の対照培養物； の細胞の量を測定し；次いで (ｄ)工程(ｃ)(ｉ)の試験培養物中のアポトーシスを受けたと判断された細胞の 量と、工程(ｃ)(ii)の対照培養物中のアポトーシスを受けたと判断された 細胞の量とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が該対照培養物
よりも高いという決定は、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、該哺乳動物細胞系が
アポトーシスを受けたことを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００５５】 次いで、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けた上記の方法に
よって同定された哺乳動物細胞系は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻害ま
たは増強できる薬剤を同定するのに用いることができる。従って、本発明は、ア
ポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻害できる薬剤の同定法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻
害することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００５６】 また、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増強できる薬剤の同定法
であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増
強することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００５７】 サイトカインのＴＮＦ族のある種のメンバーによって示される他の活性は、ア
ポトーシスの防止である。一つの例は、腫瘍壊死因子とＴＮＦ受容体２(ＴＮＦ
Ｒ２)との相互作用において見出すことができる。その相互作用の結果、活性化
されると、アポトーシスから細胞を保護する転写因子であるＮＦκＢの阻害が取
り除かれる。

【００５８】 従って、本発明はＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けること
を防止する細胞系の同定法であって、 (ａ)哺乳動物細胞系の培養細胞を試験培養物および対照培養物とに分け； (ｂ)ＴＲＤＬポリペプチドと工程(ａ)の試験培養物とを接触させ； (ｃ)アポトーシスを受けた、 (ｉ)工程(ｂ)で得られた試験培養物；および (ii)工程(ａ)の対照培養物； の細胞の量を測定し；次いで (ｄ)工程(ｃ)(ｉ)の試験培養物中のアポトーシスを受けたと判断された細胞の 量と、工程(ｃ)(ii)の対照培養物中のアポトーシスを受けたと判断された 細胞の量とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が該対照培養物
よりも低いという決定は、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、該哺乳動物細胞系が
アポトーシスを受けることから妨げられることを示すことを特徴とする該方法を
提供する。

【００５９】 次いで、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることを防止す
べき上記の方法によって同定された哺乳動物細胞系は、アポトーシスのＴＲＤＬ
媒介防止を阻害または増強できる薬剤の同定において用いることができる。従っ
て、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻害できる薬剤の同定法であ
って、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻
害することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００６０】 また、本発明は、アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増強できる薬剤の同定法
であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増
強することを示すことを特徴とする該方法を提供する。

【００６１】 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は以下の実施例を参照することによ
ってより容易に理解され、これは例示のために供するもので、限定を意図するも
のではない。

【００６２】 （実施例） 実施例１：ＴＲＤＬをコードする遺伝子の単離および配列決定 材料および方法 (ａ)ＩｎｃｙｔｅデータベースのＢＬＡＳＴ検索：Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳ
ｅｑデータベースを基本的局所的整列検索ツール(ＢＬＡＳＴ)および質問として
完全ヒトＴＮＦ−α ｃＤＮＡ配列(受入れ番号Ｍ１０９８８)を用いて検索した(
Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ.Ｆ.、Ｇｉｓｈ、Ｗ.、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｗ.、Ｍｙｅｒｓ、
Ｅ.Ｗ.およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ.Ｊ.(１９９０) Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉ
ｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏ. ２１５、４０３-
４１０)。Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ.Ｆ.、Ｇｉｓｈ、Ｗ.、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｗ.、Ｍ
ｙｅｒｓ、Ｅ.Ｗ.およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ.Ｊ.(１９９０)Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａ
ｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏ. ２１５
、４０３-４１０。

【００６３】 (ｂ)配列解析：全ヌクレオチド配列は、ＡＢＩ３７３Ａフルオセインベースの
配列決定器を用い (Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ/Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＰＥ/ＡＢＤ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ)および
ＴａｑＦＳ^TM ポリメラーゼでのＡＢＩ ＰＲＩＳＭ^TM Ｒｅａｄｙ Ｄｙｅ−Ｄｅ
ｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｋｉｔを用いて直接的に得られた。各ＡＢＩサイ
クル配列決定反応は、約０.５μｇのプラスミドＤＮＡを含んだ。サイクル配列
決定は、最初の９８℃における１分間の変性、続いての９６℃における１５秒間
の３５サイクル、５０℃における１０秒間のアニーリングおよび６０℃における
４分間の伸長を用いて行った。温度サイクルおよび時間は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ
ｍｅｒ ９６００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒによって制御された。伸長産物は、
Ｃｅｎｔｒｉｓｅｐゲル濾過カートリッジ(Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔ
ｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｄｅｌｐｈｉａ、ＮＪ)を用いて精製した。各反応産
物をピペットによってカラム中に負荷し、次いで、それをスイングバケット遠心
(Ｓｏｒｖａｌｌ ｍｏｄｅｌ ＲＴ６０００Ｂ ｔａｂｌｅ Ｔｏｐ ｃｅｎｔｒｉ
ｆｕｇｅ)で室温にて４分間１５００×ｇで遠心した。カラム精製試料を真空下
、約４０分間乾燥させ、次いで、３μｌのＤＮＡ負荷溶液(８３％脱イオン化ホ
ルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび１.６ｍｇ/ｍｌのＢｌｕｅ Ｄｅｘｔｒ
ａｎ)に溶解した。次いで、試料を９０℃まで３分間で加熱し、ＡＢＩ３７３Ａ
シークエンサー(ストレッチ修飾)によって配列解析のためにゲル試料ウェルに負
荷した。配列解析は、シークエンサープログラム(Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ
Ａｒｂｏｒ、ＭＩ)にＡＢＩ３７３Ａファイルを取込むことによって行った。一
般的に、７００ｂｐの配列の読みが得られた。潜在的な配列決定の誤りは、両Ｄ
ＮＡ鎖からの配列情報を得ることによって、および全配列決定のあいまいさを取
り去るまで、異なる位置においてプライマーを用い、異なる領域を再配列決定す
ることによって最小化した。クローン７８２５８を含めたクラスター９９０９２
のクローンについてのＬｉｆｅＳｅｑ Ａｓｓｅｍｂｌｙ機能に沿った上記方法
は、隣接する７０９ｂｐのｃＤＮＡ配列が得られるのを可能とする(図２)。該配
列に含まれるのは、該隣接物中の最もはるか上流にあるクローン７９８２４７で
ある。

【００６４】 結果および考察 質問としてヒトＴＮＦαの全蛋白質コード領域(受入れ番号Ｍ１０９８８)を用
いたＩｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑロングリードデータベースのＢＬＡＳＴ検索
は、統計的関連３０の７個のマッチを同定した(ｐ＜１.０)(１２)。Ａｌｔｓｃ
ｈｕｌ、Ｓ.Ｆ.、Ｇｉｓｈ、Ｗ.、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｗ.、Ｍｙｅｒｓ、Ｅ.Ｗ.およ
びＬｉｐｍａｎ、Ｄ.Ｊ.(１９９０)Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏ. ２１５、４０３-４１０。これ
らのマッチのうち７８２５８Ｒ１は、ＴＮＦαがＦａｓＬ(Ｆａｓリガンド)およ
びＴＲＡＩＬ(ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド)とも相同性である領域にお
いてＴＮＦαと相同性を示した(図１Ａおよび１Ｂ)。クローン７８２５８Ｒ１を
用いた全Ｉｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑデータベースのＢＬＡＳＴ検索は、統計
的関連の２３個のマッチを同定し (ｐ＜１.０)(Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ.Ｆ.、Ｇ
ｉｓｈ、Ｗ.、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｗ.、Ｍｙｅｒｓ、Ｅ.Ｗ.およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ
ＮＡ.Ｊ.(１９９０)Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ
ｔｏｏｌ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏ. ２１５、４０３-４１０)、それのうち８個は、
ヒトＣｐＧアイランドＤＮＡゲノムＭｓｅｌ断片と同定された。２３個のマッチ
の解析は、１６個がクローン７８２５８と同一クラスターに属することを明らか
にした。７８２５８を含むクラスター９９０９２のアセンブリーは、隣接する７
０９塩基対のｃＤＮＡ配列を生じた。この隣接物は、(ｃＤＮＡライブラリーＯ
ＶＡＲＮＯＴ０３、非腫瘍卵巣組織からの)７９８２４７を含めたいくつかの重
複クローンよりなり、それは最も遠い上流に出現し(図２)、ＴＮＦα、ＦａｓＬ
およびＴＲＡＩＬとの相同性を保持した。入手可能な７９８２４７ ＥＳＴ配列
は、２８５ｂｐに限定され、３'端にて停止コドンを含むが、推定の開始メチオ
ニンを欠いた。ＴＮＦα同族体として７９８２４７を確認するために、該クロー
ンを完全配列解析用にＩｎｃｙｔｅから得た。

【００６５】 ｐＳＰＯＲＴ(Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤＮＡ)における７９８２４７の配列解析は、１７２
個のアミノ酸の部分的オープンリーデングフレームを含む８２８ｂｐの挿入を同
定した。このクローンは、ＴＮＦαとの相同性の領域を保持するが、７９８２４
７についての配列は、５'端にて推定開始メチオニンを欠いた。この観察は全長
クローンおよび完全な特徴付けを得るにはさらなるクローニング実験を必要とし
た。

【００６６】 ７９８２４７についての２つの全長クローンは、白血球ｃＤＮＡライブラリー
から５×１０⁵プラークをスクリーニングすることによって得た。一次スクリー
ニングは、二連リフトにハイブリダイズする５個のプラークを同定した。５個の
うち４個は、続いてプラーク精製され、挿入サイズは、ＰＣＲによって決定した
。挿入サイズは、１.５および１.８ｋｂ間の範囲であった。ｐＤＲ２(Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ)における２個の該クローン、ＴＲＤＬ-１
４およびＴＲＤＬ-１１の配列解析は、２４８個のアミノ酸の推定オープンリー
ディングフレームを含む１４０８ｂｐの一つの挿入および２３５個のアミノ酸の
推定オープンリーディングフレームを含む１５３７ｂｐのもう一つの挿入を同定
した。クローン１４および１１は、クローン１１には欠けるクローン１４に存在
する１６個のアミノ酸(残基１１１-１２７)をコードする４８塩基対のインフレ
ーム挿入を除いてほぼ同一であった。クローン＃１１および＃１４の配列解析は
、ＴＲＤＬ遺伝子の代替スプライシングから生起するらしい７９８２４７配列と
の様々な差を明らかにした。さらに、１８３塩基対のエクソンは、クローン１１
の３'端に存在し、それはクローン１４に存在しなかった。両クローンは、起源
クローン７９８２４７ならびにＩｎｃｙｔｅクラスター９９０９２および５１７
４８からの隣接アセンブリーとほとんど同一であった。図６は、クローンＴＲＤ
Ｌ-１４およびＴＲＤＬ-１１とＴＮＦ族メンバーとの蛋白質整列を示す。

【００６７】 クローンＴＲＤＬ-１４の全長配列に対するもう一つのＢＬＡＳＴ検索は、起
源隣接の５'端と重複するクローンの第２クラスターを示す。組み立てると、こ
のクラスター(５１７４８)は、３９クローンよりなる６７０ｂｐ隣接を産生した
。２つのクラスターを単一の組立体に入れると、クラスター５１７４８の隣接の
３'端はクラスター９９０９２の隣接の５'端と重複し、１１３６塩基対の新しい
隣接(８８１９５５)を形成し、オリジナル隣接にはないＮ末端を供した。

【００６８】 ＴＲＤＬは、他のＴＮＦ関連リガンドとの限定された配列相同性を保有した。
ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＦａｓＬのような分子との配列保存は、カルボキシ末
端から１００アミノ酸以内の２つの短いストレッチまでにまず制限された。同一
性のこれらの短いＣ末端ストレッチの同定は、貧弱な統計的スコアにも拘らず可
能な候補物としてオリジナルＢＬＡＳＴマッチの選択を可能とした。ＴＮＦα、
ＦａｓＬ およびＴＲＡＩＬに対する全パーセント同一性は、各々、１７％、１
７％および１２％である。著しくはないけれども、このレベルの相同性は、ＴＮ
Ｆサイトカイン族に典型的である。比較によって、ＴＲＡＩＬは、ＦａｓＬとわ
ずか２８％の相同性、ＴＮＦαと２３％の相同性、リンフォトキシンβと２２％
の相同性である。これらの族のメンバーのように、ＴＲＤＬは、細胞表面上にこ
の分子を適切に提示するのに必要であるらしいＮ末端近くの推定膜貫通セグメン
トを含む(Ｗｉｌｅｙ、Ｓ.Ｒ.、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ、Ｋ.、Ｓｍｏｌａｋ、Ｐ.Ｊ.
、Ｄｉｎ、Ｗ.Ｓ.、Ｈｕａｎｇ、Ｃ−Ｐ.、Ｎｉｃｈｏｌｌ、Ｊ.Ｋ.、Ｓｕｔｈ
ｅｒｌａｎｄ、Ｇ.Ｒ.、Ｄａｖｉｓ Ｓｍｉｔｈ、Ｔ.、Ｒａｕｃｈ、Ｃ.、Ｓｍ
ｉｔｈ、Ｃ.Ａ.および Ｇｏｏｄｗｉｎ、Ｒ.Ｇ.(１９９５)Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｍｅｍ
ｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐ
ｔｏｓｉｓ. Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ３、６７３-６８２)。

【００６９】 実施例２：ＴＲＤＬ発現の組織分布 材料および方法 (ａ)ｐＤＲ２/ＴＲＤＬの調製：λＤＲ２から５ｐＤＲ２プラスミドへの変換
は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈプロトコル＃ＰＴ１０１１−１に記載のごとくＡＭ１細胞
において行った。プラスミドＤＮＡはＱｉａｇｅｎ ｍｉｎｉ−またはｍａｘｉ
−ｐｒｅｐ(Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ)によって精製した。

【００７０】 (ｂ)ノーザン分析：Ｉｎｃｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｎｏｒｔｈｅｒｎを
(クラスター９９０９２からの)クローン７９８２４７および(クラスター５１７
４８からの)１７７３９３に対して行った。この機能は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ
Ｎｏｒｔｈｅｒｎを示し、所与の遺伝子が発現されるライブラリーおよび各々に
おけるその豊富さレベルを測定するという２つの目的を有する。ＬｉｆｅＳｅｑ
データベースにおいて、この分析は、マスタークラスターメンバーシップに基づ
いている。クローン１７７３９３はその配列がｐＤＲ２/ＴＲＤＬ−１４の５'端
を表すので選択した。

【００７１】 複数のヒト組織ｍＲＮＡブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ(Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ)から購入した。プラスミドＤＮＡ(ｐＳＰＯＲ
Ｔ/７９８２４７)をＮｏｔＩ＋ＳａｌＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ)によ
って精製し、マルチプライム標識キット(ｍｕｌｔｉｐｒｉｍｅ ｌａｂｅｌｉｎ
ｇ ｋｉｔ)(Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ、Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ)を用いてｏｃ３２ＰｄＣＴＰで標識した。ブロッ
トをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ緩衝液中で(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ
、ＣＡ)中で６８℃にて２.５時間ハイブリダイズさせた。未結合プローブは、室
温にて２×ＳＳＣ、０.０５％ＳＤＳ中で３回すばやくすすぎ、次いで２回、２
０分間洗浄し、続いて５０℃にて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２回、３０
分間洗浄することによって除去した。Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＭＰ(Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ)を−８０℃にて一晩感光させた。

【００７２】 ヒト癌細胞系複数組織ｍＲＮＡブロットはＣｌｏｎｔｅｃｈ(Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ、ＣＡ)から購入した。ｐＤＲ２/ＴＲＤＬ-１４のコード領域の最初の約７０
０ｂｐを、５'-ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＡ-
３'(配列番号：１２)および５'-ＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＣ
ＡＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＣ-３'(配列番号：１３)であるプライマーを用いて
ＰＣＲ増幅した。ゲル精製したＰＣＲ産物をプローブとして用いるために標識し
、該ブロットを上記のごとくハイブリダイズさせた。

【００７３】 (ｃ)ドットブロット分析：腫瘍遺伝子スクリーニング用９６ドット全ＲＮＡド
ットブロットはＢｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ(Ｓａｎ Ｌｅａ
ｎｄｒｏ、ＣＡ)から購入した。該ブロットは、癌細胞系ノーザンブロットを併
用してハイブリダイズさせた。

【００７４】 (ｄ)白血球ライブラリーのスクリーニング：Ｃｌｏｎｔｅｃｈヒト白血球ライ
ブラリーＨＬ１１６９Ｘ(λＤＲ２)のスクリーニングはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａ
ｍｂｄａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ(ＰＲ９２１９２
)に記載のごとく行った。標識７９８２４７プローブはＲｅａｄｙ-ｔｏ-ｇｏ Ｂ
ｅａｄｓ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ)およびα³²ＰｄＣＴＰ(Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ)を用いて生成させた。５ラ１０⁵プラークの一次スクリーニングは、二
連リフトでハイブリダイズした５個のプラークを同定した。５個のうち４個は、
２°および３°スクリーンにてプラーク精製し、挿入サイズはＰＣＲによって決
定した。

【００７５】 結果および考察 クローン７９８２４７および１７７３９３についてのＩｎｃｙｔｅ Ｌｉｆｅ
Ｓｅｑ電子ノーザンの結果を図７に示す。これらの結果は、これらの２つのクロ
ーンによって表されるＤＮＡ配列が、炎症組織、腫瘍および豊富な末梢血液供給
を有する組織において主に発現されることを示す。

【００７６】 ７９８２４７の組織分布は、複数の組織から単離されたｍＲＮＡのノーザン分
析によって決定された。(ｐＳＰＯＲＴ ｗ/ＳａｌＩ ＆ ＮｏｔＩから切り出し
た)全長７９８２４７挿入とのハイブリダイゼーションは、約１.６および１.８
ｋｂにおいて２つのＲＮＡ種を同定した。最高レベルの発現は、肺および末梢血
中白血球において見られ、膵臓、結腸、小腸、前立腺および卵巣においては中間
レベルの発現であった。骨格筋、胸腺および精巣においては、ほとんどまたは検
出不可の発現であった(図８Ａおよび８Ｂ)。

【００７７】 ヒト癌細胞系のノーザンブロットをクローンＴＲＤＬ-１４のコード領域の最
初の約７００ｂｐを用いてハイブリダイズさせた。高度に発現されたＲＮＡ種は
、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞において１.７ｋｂ、２.５ｋｂにて同定した。
４.４ｋｂにおける第三の種は、ＨｅＬａ、ＳＷ４８０、ＨＬ-６０およびＫ-５
６２細胞において中程度に発現された(図９Ａおよび９Ｂ)。

【００７８】 また、腫瘍遺伝子スクリーニングＲＮＡドットブロットは、ＴＲＤＬ-１４ プ
ローブを用いてハイブリダイズさせた。最高レベルの発現は、十二指腸、結腸お
よび膵臓の正常試料と比較して腫瘍試料に見られた。対照的に、発現は、膀胱、
甲状腺、小腸、胸腺、副腎および乳房のごとき組織の腫瘍試料より正常試料にお
いてより高かった(図１０Ａおよび１０Ｂ)。

【００７９】 代替スプライシングについての証拠は、複数のヒト組織から単離されたＲＮＡ
を用いたノーザン分析を介して見られた。肺および末梢血中白血球は、１.６ｋ
ｂの転写体にのみの高レベルの発現を示した。対照的に、低レベルの１.８ｋｂ
転写体は、腎臓、膵臓および前立腺のような組織において出現した。このサイズ
差は、クローンｐＤＲ２/ＴＲＤＬ-１４から抜け落ちた１８３ｂｐのエクソンと
合致し、組織に見られた２つの転写体サイズに対応し得る。また、２つの転写体
は、腫瘍細胞系のノーザン分析においても見られた。この場合、両転写体は、同
一細胞系に存在した。かくして、高発現レベルを有する組織(肺および末梢血中
白血球)は、選択的に１.６ｋｂの転写体を産生するらしい。対照的に、低レベル
のＴＲＤＬ発現を有する組織は、１.８ｋｂメッセージを生じさせる。この異な
る発現は、組織特異的発現および機能的調節についてのメカニズムとしての代替
スプライシングを示唆する。

【００８０】 ＴＲＤＬの発現プロフィールは、他のＴＮＦ関連サイトカインの発現プロフィ
ールと同様であるが同一ではない。例えば、最近記載されたＴＲＡＩＬリガンド
は、他の組織において見られたものと同様である肺および末梢血中白血球におけ
る発現レベルを示した (Ｗｉｌｅｙ、Ｓ.Ｒ.、Ｓｃｈｏｏｌｅｙ、Ｋ.、Ｓｍｏ
ｌａｋ；Ｐ.Ｊ.、Ｄｉｎ、Ｗ.Ｓ.、Ｈｕａｎｇ、Ｃ−Ｐ.、Ｎｉｃｈｏｌｌ、Ｊ.
Ｋ.、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｇ.Ｒ.、Ｄａｖｉｓ Ｓｍｉｔｈ、Ｔ.、Ｒａｕｃ
ｈ、Ｃ.、Ｓｍｉｔｈ、Ｃ.Ａ.およびＧｏｏｄｗｉｎ、Ｒ.Ｇ.(１９９５)Ｉｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃ
ｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ. Ｉｍｍｕｎｉｔｙ. ３、６７３-６８２)。癌細胞系
において、ＴＲＤＬの発現は、ＨｅＬａ(子宮癌)およびＳＷ４８０(結腸直腸癌)
細胞系にまず限定され、再度、この遺伝子の細胞特異的発現の能力を示した。Ｉ
ｎｃｙｔｅデータベースを用いたＴＲＤＬの電子ノーザン分析は、炎症メディエ
ーターとしてこの分子を注目させる発現パターンを明らかにした。ＴＲＤＬに対
応する少なくとも一つのＥＳＴは、４２個の異なるライブラリーにおいて同定さ
れた。これらのうち２４個のＥＳＴは、炎症組織または腫瘍において出現した。
これは、標的疾患状態においてＴＲＤＬの存在を確認する。

【００８１】 実施例３：ＴＲＤＬの異種発現 材料および方法 (ａ)Ｅ. ｃｏｌｉにおけるｐｃＤＮＡ３/ＴＲＤＬ-１４の発現：ポリメラーゼ
鎖反応を利用して、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ修飾プライマーを用いてｐＤＲ
２/ＴＲＤＬ-１４からＴＲＤＬ−１４の全長コード領域を増幅した。用いたプラ
イマーは、Ｇｅｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ.(Ｔｈｅ
Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ)から購入した５'-ＣＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＡＧＣＣ
ＴＣＡ-３'(配列番号：１４)および５'-ＴＡＴＣＣＧＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＴ
ＣＣＣＡＧ-３'(配列番号：１５)であった。１０ｎｇのプラスミドは、以下のＰ
ＣＲ条件下で鋳型として供した：３０サイクル(９４℃にて３０秒間；５５℃に
て１分間；７２℃にて１分間)。該産物は、ＳｕｒｅＣｌｏｎｅキット(Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ)を用いてサブクローニングした。ＤＨ５αコンピテ
ント細胞(ＧＩＢＣＯ-ＢＲＬ)を形質転換させ、プラスミドＤＮＡを精製した(Ｑ
ｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ)。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ消化に
よって挿入を取出し、ｐｃＤＮＡ３(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ
ＣＡ)に移した。ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換させ、陽性コロニーをＰ
ＣＲ分析によって決定した。陽性コロニーからのプラスミドＤＮＡを精製(Ｑｉ
ａｇｅｎ)し、上記のごとくＡＢＩ３７３Ａ蛍光をベースとしたシーケンサーを
用いて挿入配列を確認した。

【００８２】 (ｂ)ＣＨＯ細胞におけるヒトＴＲＤＬの発現：ヒトＴＲＤＬの完全オープンリ
ーディングフレームをＣＭＶ即時型プロモーターの制御下、チャイニーズハムス
ター卵巣(ＣＨＯ)細胞中で発現させた。プラスミドｐＤＲ２/ＴＲＤＬ１４をＸ
ｂａＩおよびＢａｍＨＩで２重消化し、得られたｃＤＮＡ断片をＸｂａＩおよび
ＢａｍＨＩ消化したｐＵＣ１８に連結させて、ｐＵＣ１８-ＴＲＤＬ１４を得た
。ｐＵＣ１８/ＴＲＤＬ１４をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで２重消化し、得ら
れたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化したｐｃＤＮＡ３に連結させ
て、ｐｃＤＮＡ３/ＴＲＤＬ１４を得た。次いで、ｐｃＤＮＡ３/ＴＲＤＬ１４を
用いて、リポフェクタミン(Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ)を使用してＣＨＯ Ｋ
１細胞にトランスフェクトし、安定なトランスフェクタントをネオマイシン選択
(Ｇ４１８ ０.８μｇ/ｍｌ)により単離した。クローン細胞系は限界希釈により
調製した。

【００８３】 ヒトＴＲＤＬ-１１およびヒトＴＲＤＬ-１４の予測細胞外ドメインを、バキュ
ロウイルス導入ベクターｐＡｃＨＬＴ-Ａにおいて、６つのＨｉｓ-タグを持つＮ
Ｈ₂末端融合としての発現のためにＰＣＲによって作成した。ＮｄｅＩ制限部位
を含む共通５'センスオリゴヌクレオチド・プライマー(５'-ＣＡＴＡＴＧＣＡＣ
ＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧ-３'(配列番号：１６)、ＴＲＤＬ
-１４における塩基対２１７-２３９およびＴＲＤＬ-１１における塩基対２２６-
２４８)を、ＰＣＲにおいて、ＴＲＤＬ-１１またはＴＲＤＬ-１４のいずれかに
ついて特異的で、ＫｐｎＩ部位を含む３'アンチセンスプライマー(各々、ＴＲＤ
Ｌ-１４およびＴＲＤＬ-１１における７８１-８０４および７５０-７７４の塩基
対に対応する５'-ＴＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧ-３'(
配列番号：１７)および５'-ＧＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＴＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧ
Ｔ-３'(配列番号：１８))と対合させた。ｐＤＲ２/ＴＲＤＬ１４プラスミドＤＮ
ＡまたはｐＤＲ２/ＴＲＤＬ１１プラスミドＤＮＡ(０.１μｇ)をセンスおよびア
ンチセンスプライマー(１μＭ)およびＰｗｏ耐熱性のポリメラーゼを用いて、次
のサイクル条件下で増幅させた；２０サイクルにわたって、９４℃にて１分間の
変性、６５℃にて２分間のアニーリングおよび７２℃にて３分間の伸長。得られ
た産物は、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩで完全消化し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ消化
されたバキュロウイルス導入ベクターｐＡｃＨＬＴ-Ａに連結させて、ｐＡｃＨ
ＬＴ-Ａ/ＴＲＤＬ１４およびｐＡｃＨＬＴ-Ａ/ＴＲＤＬ１１を得た。両発現プラ
スミドを両鎖に対して完全に配列決定して、オープンリーディングフレームの完
全さを確認した。

【００８４】 (ｃ)バキュロウイルスにおけるヒトＴＲＤＬの発現：ヒトＴＲＤＬ-１１(ｐＡ
ｃＨＬＴ-Ａ/ＴＲＤＬ１１)またはヒトＴＲＤＬ-１４(ｐＡｃＨＬＴ-Ａ/ＴＲＤ
Ｌ１４)のいずれかを含むバキュロウイルス導入ベクターを標準的トランスフェ
クション手法を用いて、Ｓｆ９細胞にＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ^TM ＤＮＡと共にト
ランスフェクトした。細胞内発現は感染中の細胞の代謝的標識、続いてのＳＤＳ
-ＰＡＧＥ分析によって確認した。５個の区別されるウイルスプラークをクロー
ニングし、ＴＲＤＬ発現を分析して、単一の高産生ウイルス単離体を得た。次い
で、増幅されたウイルスストックを用いて、５ＰＦＵ/細胞にてＳｆ９細胞また
はＨｉ５細胞のいずれかのグレース(Ｇｒａｃｅ)の無血清培地/リットルにおい
て約１ラ１０⁹個の細胞を感染させた。振盪フラスコ中の６５時間に続いて、感染
細胞を遠心によって得、細胞溶解物をＮｉアガロースを用いた精製用の出発物質
として供した。

【００８５】 (ｄ)Ｓｆ９細胞からの分泌用の細胞外ドメインの作成：ヒトＴＲＤＬ１１ お
よびヒトＴＲＤＬ１４の予測細胞外ドメインは、バキュロウイルス導入ベクター
ｐＶＴ-Ｂａｃにおけるミツバチメラチン(ｍｅｌａｔｉｎ)リーダー配列とのイ
ンフレーム融合を調製することによって、Ｓｆ９細胞からの分泌のために作成さ
れた(Ｔｅｓｓｉｅｒ、Ｄ.Ｃ.、Ｔｈｏｍａｓ、Ｄ.Ｙ.、Ｋｈｏｕｒｉ、Ｈ.Ｅ.
、Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ、Ｆ.およびＶｅｒｎｅｔ、Ｔ.、Ｇｅｎｅ ９８：１７７-
１８３(１９９１))。ｐＶＴ-Ｂａｃへの指向性クローニング用の制限部位を取込
んだセンスおよびアンチセンスＰＣＲプライマーを用いて、上記のごとく細胞外
ドメインに対応するＴＲＤＬ１１またはＴＲＤＬ１４のコード配列の領域を増幅
させた。次いで、増幅産物を適当な制限エンドヌクレアーセで完全消化し、ｐＶ
Ｔ-Ｂａｃにサブクローニングした。ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡでの共トラン
スフェクションによってｐＶＴ-Ｂａｃ/ＴＲＤＬ１１およびｐＶＴ-Ｂａｃ/ＴＲ
ＤＬ１４の発現を上記のごとく行った。

【００８６】 (ｅ)ヒトＴＲＤＬのゲノムクローンの単離：ヒトＴＲＤＬの部分的ｃＤＮＡク
ローンを用いて、コロニーハイブリダイゼーションによって、細菌性人工染色体
(ＢＡＣ)ゲノムクローンを単離した。ｃＤＮＡ挿入は、α-³²Ｐ-ｄＡＴＰでラン
ダムプライム標識して、それを用いてヒトＢＡＣゲノムライブラリーをスクリー
ニングした。個々のクローンを希釈プレーティングおよび再スクリーニングによ
って単離し、２つのクローン１４８１４および１４８１５を得た。共有エクソン
またはＴＲＤＬ-１４/ＴＲＤＬ-１１エクソンのいずれかに特異的なオリゴヌク
レオチドプライマーを用いたＰＣＲ分析は、両ＢＡＣクローンがヒトＴＲＤＬの
全オープンリーディングフレームを含むことを確認した。

【００８７】 実施例４：ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける蛍光によるヒトＴＲ
ＤＬのヒト染色体マッピング クローン１４８１５からのＤＮＡをニックトランスレーションによってジゴキ
シゲニンｄＵＴＰで標識した。標識プローブを剪断されたヒトＤＮＡと組合せ、
５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストランおよび２×ＳＳＣを含んだ溶液中
の植物凝集素(ＰＨＡ)刺激の末梢血中リンパ球から誘導された正常な中期染色体
にハイブリダイズさせた。特異的ハイブリダイゼーションシグナルを、フルオレ
セイン化抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーション、続いての一つの色試験
についての４',６-ジアミジン-２'-フェニルインドール二塩酸塩(ＤＡＰＩ)で対
比染色した。２つの色試験におけるプローブ検出は、フルオレセイン化抗ジゴキ
シゲニン抗体およびＴｅｘａｓ ｒａｄアビジンとのインキュベーションし、続
いてのＤＡＰＩでの対比染色によって達成した。最初の試験の結果、サイズ、形
態学および結合パターンに基づき、染色体１７であると考えられるグループＥ染
色体の短腕を特異的に標識した。第２の試験を行い、そこでは染色体１７の動原
体領域に特異的なビオチン標識プローブをクローン１４８１５と共にハイブリダ
イズさせた。この試験の結果、赤色で動原体を、緑色で染色体１７の短腕を特異
的に標識した。該１４８１５を示した１０個の特異的に標識された染色体１７の
測定値は、バンド１７ｐ１３.３に対応する領域において動原体から染色体アー
ム１７ｐのテロメアへの距離の７７％である位置にある。合計８０個の中期細胞
は、特異的標識を示す７２個で分析した。

【００８８】 脊椎動物遺伝子の上流配列内に位置するＣｐＧアイランドの過メチル化は、潜
在的な遺伝子サイレンシング結果を有する。いくつかの研究は、両結腸、乳房お
よび前立腺中の正常ＤＮＡに比較して、腫瘍ＤＮＡにおいてヒト染色体１７ｐｌ
３.３に対してＣｐＧアイランドの過メチル化を示した(Ｒｉｂｉｅｒａｓら、Ｊ
. ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６：８６-９６(１９９
４)；Ｍｏｒｔｏｎ、Ｒ.Ａ.ら、Ｊ. Ｕｒｏｌｏｇｙ １５６：５１２-５１６(１
９９６))。Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＮＦ−κＢ ｉｎ ｐｒｅ
ｖｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ. Ｓｃｉｅｎｃｅ. ２７４：７８２-７８
４)。さらに、ＴＲＤＬ遺伝子内のＣｐＧアイランドは、ＣｐＧアイランドとし
ていくつかのＴＲＤＬ ＥＳＴの注釈に導く。かくして、ＴＲＤＬ遺伝子の過メ
チル化および結果として生じた不活性化は、癌を生じる可能性がある。

【００８９】 実施例５：ＴＲＤＬ作動薬および拮抗薬の高処理量スクリーニング 材料および方法 (ａ)放射性標識ヒトＴＲＤＬの調製：ヒトＴＲＤＬの可溶性細胞外ドメインを
上記のごとくバキュロウイルスを用いてアミノ末端６-Ｈｉｓ-タグ融合として発
現させる。感染細胞によって産生された物質は、低張溶解/均質化、続いてＮｉ-
ＮＴＡアガロース上のアフィニティークロマトグラフィーによって細胞から回収
する。次いで、精製蛋白質をイミダゾール含有緩衝液を用いてアフィニティー樹
脂から溶出させ、使用に先立ってアリコートにて凍結貯蔵する。 精製ＴＲＤＬ蛋白質の試料は、ヨードゲンを用い¹²⁵Ｉで放射性標識した。ヨ
ードゲン(ＣＨＣｌ₃中の１.０ｍｇ/ｍｌ溶液の１.０μｌ)を窒素下で蒸発させ、
３０μｌの１.０Ｍ ＫＰＯ₄(ｐＨ７.０)/１０μｌ(１.０ｍＣｉ)のＮａ^{l 25}Ｉと
混合し、氷上で１０分間インキュベートする。この混合物を２０μｌ中１０μｇ
のヒトＴＲＤＬを含む試験管に移し、氷上で５分間反応させる。非取込みＮａ^{l 2 5} ＩをＰＢＳ/０.１％ゼラチンで平衡化したＰＤ１０カラムを用いて除去する。

【００９０】 (ｂ)受容体結合アッセイおよび高処理量スクリーニングの開発：^{l 25}Ｉ-ＴＲＤ
Ｌを用いて高アフィニティー受容体の存在についてヒト細胞系を調査する[Ｕ９
３７、ＴＨＰ-１、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０]。１.０ラ１０⁶細
胞を含む三連の試験管を全容量０.５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地/２％ ＦＣＳ
中の０-１０ｎＭの範囲にわたって量を増加させる未標識ＴＲＤＬの存在または
不存在において、２.０ラ１０⁵ｄｐｍの^{l 25}Ｉ-ＴＲＤＬと共にインキュベートす
る。氷上で２時間後、該細胞を１０ｍｌの新鮮な培地で３回洗浄し、細胞関連Ｔ
ＲＤＬをγカウントによって定量する。

【００９１】 高処理量スクリーニングは、シンチレーション近接アッセイ(ＳＰＡ)を用いて
行う。高レベルのＴＲＤＬ受容体を発現する細胞系から調製された膜を、氷上で
の１時間のインキュベーションによってＳＰＡビーズ上にコートする。膜コート
したＳＰＡビーズを^{l 25}Ｉ-ＴＲＤＬと混合し、室温にて３０分間インキュベート
する。次いで、該ＳＰＡビーズをＰＢＳで洗浄し、シンチレーションをシンチレ
ーション分光光度計を用いて検出する。スクリーニングでは、ＳＰＡ結合アッセ
イを試験化合物(１０μＭ)の存在下または不存在下で行い、これらの条件下で＞
５０％までＳＰＡシグナルを低下させる薬剤を陽性として評点付けした。

【００９２】 実施例６：細胞死の定量用のアッセイ 細胞死アッセイ：細胞死をＤＮＡ結合染料ＹＯＰＲＯ-１(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ、ＯＲ.)を用いて定量する(Ｉｄｚ
ｉｏｒｅｋ、Ｔ.ら.、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏ. Ｍｅｔｈ. １８５：２４９-２５８(１
９９５)。２４ウェルプレート中の密集した、血清枯渇のＭＣＦ７細胞をＵＶま
たはエトポシドのいずれかで１６時間処理する。次いで、１μＭのＹＯＰＲＯ-
１を細胞と共に３７℃にて６０分間インキュベートする。ＹＯＰＲＯ-１取込み
を４６０ｎｍ励起および５８５ｎｍ放射にての蛍光プレートリーダーにおいてプ
レートを読み取ることによって評価する。

【００９３】 本発明は、これまでの記載および実施例において特に記載されたごときとは他
の方法で実施できることは明らかであろう。 本発明の多数の修飾および変形は、上記の教示に徴すると可能であり、従って
、本発明の範囲内にある。 本明細書中に引用した全刊行物の全ての開示を、ここに出典明示して本明細書
の一部とみなす。

【００９４】 （配列表） (1)一般的情報： (i)出願人：ビーンコウスキー、マイケル・ジェイ ミルズ、シンシア・ジェイ ジョーンズ、デイビッド・エイ (ii)発明の名称：ＴＮＦ関連死リガンド (iii)配列数：１８ (iv)通信宛先： (A)宛先：ファルマシア・アップジョン、知的所有権法律部門 (B)街：ヘンリエッタ・ストリート３０１番 (C)市：カラマズー (D)州：ミシガン (E)国：アメリカ合衆国 (F)郵便番号：４９００１ (v)コンピューター判読形式： (A)媒体型：フロッピーディスク (B)コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ互換性 (C)オペレーティングシステム：ＰＣ-ＤＯＳ/ＭＳ-ＤＯＳ (D)ソフトウェア：PatentIn Release #1.0,Version #1.25 (vi)現時の出願データ： (A)出願番号： (B)出願日： (C)分類： (Viii)代理人/代行者情報 (A)氏名：カーバー、ローリー・エル (B)登録番号：第４１,１１３号 (C)参照/明細書番号：６１１１.Ｐ ＣＮ１ (ix)電気通信情報 (A)電話：６１６/８３３-０９７４ (B)ファックス：６１６/８３３-８８９７ (c)テレックス：２２４４０１

【００９５】 (2)配列番号：１ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：１５５０塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１： TTTCAGGTCC CGGATCCGCG CTTGCTACCC CACTCTTGAA ACCACAGCTG TTGGCAGGGT 60 CCCCAGCTCA TGCCAGCCTC ATCTCCTTTC TTGCTAGCCC CCAAAGGGCC TCCAGGCAAC 120 ATGGGGGGCC CAGTCAGAGA GCCGGCACTC TCAGTTGCCC TCTGGTTGAG TTGGGGGGCA 180 GCTCTGGGGG CCGTGGCTTG TGCCATGGCT CTGCTGACCC AACAAACAGA GCTGCAGAGC 240 CTCAGGAGAG AGGTGAGCCG GCTGCAGGGG ACAGGAGGCC CCTCCCAGAA TGGGGAAGGG 300 TATCCCTGGC AGAGTCTCCC GGAGCAGAGT TCCGATGCCC TGGAAGCCTG GGAGAGTGGG 360 GAGAGATCCC GGAAAAGGAG AGCAGTGCTC ACCCAAAAAC AGAAGAATGA CTCCGATGTG 420 ACAGAGGTGA TGTGGCAACC AGCTCTTAGG CGTGGGAGAG GCCTACAGGC CCAAGGATAT 480 GGTGTCCGAA TCCAGGATGC TGGAGTTTAT CTGCTGTATA GCCAGGTCCT GTTTCAAGAC 540 GTGACTTTCA CCATGGGTCA GGTGGTGTCT CGAGAAGGCC AAGGAAGGCA GGAGACTCTA 600 TTCCGATGTA TAAGAAGTAT GCCCTCCCAC CCGGACCGGG CCTACAACAG CTGCTATAGC 660 GCAGGTGTCT TCCATTTACA CCAAGGGGAT ATTCTGAGTG TCATAATTCC CCGGGCAAGG 720 GCGAAACTTA ACCTCTCTCC ACATGGAACC TTCCTGGGGT TTGTGAAACT GTGATTGTGT 780 TATAAAAAGT GGCTCCCAGC TTGGAAGACC AGGGTGGGTA CATACTGGAG ACAGCCAAGA 840 GCTGAGTATA TAAAGGAGAG GGAATGTGCA GGAACAGAGG CGTCTTCCTG GGTTTGGCTC 900 CCCGTTCCTC ACTTTTCCCT TTTCATTCCC ACCCCCTAGA CTTTGATTTT ACGGATATCT 960 TGCTTCTGTT CCCCATGGAG CTCCGAATTC TTGCGTGTGT GTAGATGAGG GGCGGGGACG 1020 GGCGCCAGGC ATTGTCCAGA CCTGGTCGGG CCCACTGGAA GCATCCAGAA CAGCACCACC 1080 ATCTAGCGGC CGCTCGAGGG AAGCACCCGC CGGTTGGCCG AAGTCCACGA AGCCGCCCTC 1140 TGCTAGGGAA AACCCCTGGT TCTCCATGCC ACACCTCTCT CCAGGTGCCC TCTGCCTCTT 1200 CACCCCACAA GAAGCCTTAT CCTACGTCCT TCTCTCCATC TATCGGACCC CAGTTTCCAT 1260 CACTATCTCC AGAGATGTAG CTATTATGCG CCCGTCTACA GGGGGTGCCC GACGATGACG 1320 GTGCCTTCGC AGTCAAATTA CTCTTCGGGT CCCAAGGTTT GGCTTTCACG CGCTCCATTG 1380 CCCCGGCGTG GCAGGCCATT CCAAGCCCTT CCGGGCTGGA ACTGGTGTCG GAGGAGCCTC 1440 GGGTGTATCG TACGCCCTGG TGTTGGTGTT GCCTCACTCC TCTGAGCTCT TCTTTCTGAT 1500 CAAGCCCTGC TTAAAGTTAA ATAAAATAGA ATGAATGATA AAAAAAAAAA 1550

【００９６】 (2)配列番号：２ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２３４アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：配列番号：２： Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu 35 40 45 Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg 50 55 60 Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp 65 70 75 80 Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Ser 85 90 95 Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys 100 105 110 Asn Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg 115 120 125 Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala 130 135 140 Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe 145 150 155 160 Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr 165 170 175 Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr 180 185 190 Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile 195 200 205 Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 210 215 220 His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu 225 230

【００９７】 (2)配列番号：３ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：１４３０塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：３： TTTTATTTCA GGTCCCGGAT CCGCGCTTGA AACCACAGCT GTTGGCAGGG TCCCCAGCTC 60 ATGCCAGCCT CATCTCCTTT CTTGCTAGCC CCCAAAGGGC CTCCAGGCAA CATGGGGGGC 120 CCAGTCAGAG AGCCGGCACT CTCAGTTGCC CTCTGGTTGA GTTGGGGGGC AGCTCTGGGG 180 GCCGTGGCTT GTGCCATGGC TCTGCTGACC CAACAAACAG AGCTGCAGAG CCTCAGGAGA 240 GAGGTGAGCC GGCTGCAGGG GACAGGAGGC CCCTCCCAGA ATGGGGAAGG GTATCCCTGG 300 CAGAGTCTCC CGGAGCAGAG TTCCGATGCC CTGGAAGCCT GGGAGAATGG GGAGAGATCC 360 CGGAAAAGGA GAGCAGTGCT CACCCAAAAA CAGAAGAAGC AGCACTCTGT CCTGCACCTG 420 GTTCCCATTA ACGCCACCTC CAAGGATGAC TCCGATGTGA CAGAGGTGAT GTGGCAACCA 480 GCTCTTAGGC GTGGGAGAGG CCTACAGGCC CAAGGATATG GTGTCCGAAT CCAGGATGCT 540 GGAGTTTATC TGCTGTATAG CCAGGTCCTG TTTCAAGACG TGACTTTCAC CATGGGTCAG 600 GTGGTGTCTC GAGAAGGCCA AGGAAGGCAG GAGACTCTAT TCCGATGTAT AAGAAGTATG 660 CCCTCCCACC CGGACCGGGC CTACAACAGC TGCTATAGCG CAGGTGTCTT CCATTTACAC 720 CAAGGGGATA TTCTGAGTGT CATAATTCCC CGGGCAAGGG CGAAACTTAA CCTCTCTCCA 780 CATGGAACCT TCCTGGGACT TTGATTTTAC GGATATCTTG CTTCTGTTCC CCATGGAGCT 840 CCGAATTCTT GCGTGTGTGT AGATGAGGGG CGGGGGACGG GCGCCAGGCA TTGTTCAGAC 900 CTGGTCGGGG CCCACTGGAA GCATCCAGAA CAGCACCACC ATCTAGCGGC CGCTCGAGGG 960 AAGCACCCGC CGGTTGGCCG AAGTCCACGA AGCCGCCCTC TGCTAGGGAA AACCCCTGGT 1020 TCTCCATGCC ACACCTCTCT CCAGGTGCCC TCTGCCTCTT CACCCCACAA GAAGCCTTAT 1080 CCTACGTCCT TCTCTCCATC TATCGGACCC CAGTTTCCAT CACTATCTCC AGAGATGTAG 1140 CTATTATGCG CCCGTCTACA GGGGGTGCCC GACGATGACG GTGCCTTCGC AGTCAAATTA 1200 CTCTTCGGGT CCCAAGGTTT GGCTTTCACG CGCTCCATTG CCCCGGCGTG GCAGGCCATT 1260 CCAAGCCCTT CCGGGCTGGA ACTGGTGTCG GAGGAGCCTC GGGTGTATCG TACGCCCTGG 1320 TGTTGGTGTT GCCTCACTCC TCTGAGCTCT TCTTTCTGAT CAAGCCCTGC TTAAAGTTAA 1380 ATAAAATAGA ATGAATGATA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1430

【００９８】 (2)配列番号：４ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２４７アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：配列番号：４： Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu 35 40 45 Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg 50 55 60 Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp 65 70 75 80 Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn 85 90 95 Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys 100 105 110 Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys 115 120 125 Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg 130 135 140 Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala 145 150 155 160 Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe 165 170 175 Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr 180 185 190 Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr 195 200 205 Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile 210 215 220 Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 225 230 235 240 His Gly Thr Phe Leu Gly Leu 245

【００９９】 (2)配列番号：５ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２４アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：配列番号：５： Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp 1 5 10 15 Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg 20

【０１００】 (2)配列番号：６ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２４アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：配列番号：６： Tyr Asn Xaa Cys Tyr Xaa Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp 1 5 10 15 Ile Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg 20

【０１０１】 (2)配列番号：７ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：１６アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：配列番号：７： Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys 1 5 10 15

【０１０２】 (2)配列番号：８ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：１６アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ペプチド (xi)配列：配列番号：８： Ile Gln Asp Ala Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Arg Gln Val Leu Phe Gln 1 5 10 15

【０１０３】 (2)配列番号：９ に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２３３アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：配列番号：９： Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230

【０１０４】 (2)配列番号：１０に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２８１アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：配列番号：１０： Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys 20 25 30 Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro 35 40 45 Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 50 55 60 Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly 65 70 75 80 Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly 85 90 95 Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala 100 105 110 Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu 115 120 125 Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg 130 135 140 Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu 145 150 155 160 Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr 165 170 175 Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr 180 185 190 Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser 195 200 205 His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met 210 215 220 Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala 225 230 235 240 Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His 245 250 255 Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser 260 265 270 Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu 275 280

【０１０５】 (2)配列番号：１１に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２８１アミノ酸 (B)型：アミノ酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：蛋白質 (xi)配列：配列番号：１１： Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu 130 135 140 Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly 145 150 155 160 His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile 165 170 175 His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe 180 185 190 Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln 195 200 205 Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys 210 215 220 Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 225 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile 245 250 255 Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala 260 265 270 Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280

【０１０６】 (2)配列番号：１２に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２８塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１２： ATATGGATCC CAGCTCATGC CAGCCTCA 28

【０１０７】 (2)配列番号：１３に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：３５塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１３： AGTAAAGCTT GGAATTATGA CACTCAGAAT ATCCC 35

【０１０８】 (2)配列番号：１４に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：１８塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１４： CAGCTCATGC CAGCCTCA 18

【０１０９】 (2)配列番号：１５に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２３塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１５： TATCCGTAAA ATCAAAGTCC CAG 23

【０１１０】 (2)配列番号：１６に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：３０塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１６： CATATGCACA GAGCTGCAGA GCCTCAGGAG 30

【０１１１】 (2)配列番号：１７に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２５塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１７： TCACAGTTTC ACAAACCCCA GGAAG 25

【０１１２】 (2)配列番号：１８に関する情報： (i)配列の特性： (A)長さ：２４塩基対 (B)型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直鎖状 (ii)配列の種類：ｃＤＮＡ (xi)配列：配列番号：１８： GTAAAATCAA AGTCCCAGGA AGGT 24

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａおよび１Ｂ】 図１Ａおよび１Ｂは、ＴＮＦ同族体についてのＩｎｃｙｔｅ ＬｉｆｅＳｅｑ
データ調査の結果を示す配列比較である。そのデータベースを基本的局在配置ツ
ール(ＢＬＡＳＴ)およびＴＮＦ-α(受入＃Ｍ１０９８８)についての配列を用い
て調査した。クローン７８２５８のコード領域における２つの領域は、ＴＮＦ-
αとの相同性の注目領域を有する。図１Ａは、１つのかかる相同性領域を示す：
クローン７８２５８(配列番号：５)の領域をＴＮＦ-α(配列番号：６)の領域と
比較する。図１Ｂは、もう一つの相同性領域を示す：クローン７８２５８(配列
番号：７)の第二領域をＴＮＦ-α(配列番号：８)の第二領域と比較する。

【図２】 図２は、７０９ｂｐｃＤＮＡ配列内のクローンのクラスターアセンブリおよび
コンセンサスを示す。隣接する７０９ｂｐのｃＤＮＡ配列は、クローン７８２５
８を含めたクラスター９９０９２のクローンについてＬｉｆｅＳｅｑアセンブリ
ー機能を用いて得た。配列にはクローン７９２４７が含まれ、それは該隣接にお
いて最も遠方の上流にある。

【図３】 図３は、ＴＲＤＬ-１１のヌクレオチド配列(配列番号：１)および予測アミノ
酸配列(配列番号：２)を示す。

【図４】 図４は、ＴＲＤＬ-１４のヌクレオチド配列(配列番号：３)および予測アミノ
酸配列(配列番号：４)を示す。

【図５】 図５は、クローンＴＲＤＬ-１１(配列番号：１)およびＴＲＤＬ-１４(配列番
号：３)のヌクレオチド配列のＤＮＡ配列整列を示す。クローン１１および１４
は、クローン１１にないクローン１４に存在する４８塩基対ストレッチおよびク
ローン１４に欠けたクローン１１の３'末端に存在する１８３塩基対５を除外し
てほぼ同一である。

【図６】 図６は、ＴＮＦ族メンバーのＴＮＦ−α(配列番号：９)、ＦａｓＬ(配列番号
：１０)およびＴＲＡＩＬ(配列番号：１１)のアミノ酸配列に対するクローンＴ
ＲＤＬ-１１(配列番号：２)およびＴＲＤＬ-１４(配列番号：４)によってコード
される予測アミノ酸配列の整列を示す。相同性領域は、灰色で強調されている。

【図７】 図７は、クローン１７７３９３および７９８２４７についての電子ノーザンブ
ロットの結果を示す。これらの２つのクローンは、ＴＲＤＬ-１１(配列番号：１
)およびＴＲＤＬ-１４(配列番号：３)についての配列を含む該クラスターの代表
的メンバーである。それらは、炎症組織および豊富な末梢血供給を持つ組織にお
いて主に発現される。

【図８Ａおよび８Ｂ】 図８Ａは、クローン７９８２４７の発現の組織分布を示すノーザンブロットで
ある。複数組織のノーザン分析を、プローブとして全長の７９８２４を用いて行
った。示された組織(１=心臓、２=脳、３=胎盤、４=肺 ５=肝臓、６=骨格筋、７
=腎臓、８=膵臓、９=脾臓、１０=胸腺、１１=前立腺、１２=精巣、１３=卵巣、
１４=小腸、１５=結腸、１６=末梢血中白血球)を表す２つの別々のブロットを平
行して解析した。該プローブは、約１.６および１.８ｋｂにおいてメッセージに
ハイブリダイズした。シグナルをホスホイメージャー(Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇ
ｅｒ)を用いて定量し、相対的燐光としてプロットで示した。図８Ｂは、示され
た組織の型からのノーザンブロットにおける標識７９８２４７プローブの相対的
燐光を示すグラフである。

【図９Ａおよび９Ｂ】 図９Ａは、ヒト癌細胞系におけるＴＲＤＬ-１４発現の分布を示すノーザンブ
ロットである。複数の癌細胞系ノーザン分析(１=ＨＬ-６０、２=ＨｅＬａＳ３、
３=Ｋ-５６２、４=ＭＯＬＴ-４、５=ＢＬ Ｒａｊｉ、６=ＳＷ４８０、７=Ａ５４
９および８=Ｇ３６１)は、プローブとしてＴＲＤＬ-１４のコード領域を用いて
行った。ＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞において、該プローブは、約１.７ｋｂ(
バー１および２)および２.５ｋｂ(バー３および４)においてメッセージにハイブ
リダイズした。４.４ｋｂでの第三ｍＲＮＡ種は、ＨｅＬａ、ＳＷ４８０、ＨＬ
−６０およびＫ−５６２細胞において適度に発現し、ＭＯＬＴ−４、ＢＬ Ｒａ
ｊｉ、Ａ５４９およびＧ３５１細胞(バー５−１２)において低レベルで発現した
。図９Ｂは、示された癌細胞系からのノーザンブロットにおいて標識７９８２４
７の相対的燐光を示すグラフである。

【図１０Ａおよび１０Ｂ】 図１０Ａは、通常の腫瘍組織試料においてＴＲＤＬ-１４発現の分布を示すグ
ラフである。高レベルの発現は、十二脂腸および結腸からの腫瘍試料において見
られた。肺における発現は、正常および腫瘍試料において共に高かった。図１０
Ｂは、正常および腫瘍組織試料におけるＴＲＤＬ-１４発現の分布を示すグラフ
である。高レベルの発現は、膵臓からの腫瘍試料において見られた。発現は、胆
嚢、胸腺、副腎、乳房および甲状腺からの腫瘍試料より正常において高かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 7/00 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デイビッド・エイ・ジョーンズ アメリカ合衆国84108ユタ州ソルト・レイ ク・シティ、イースト・ローガン・アベニ ュー1780番 (72)発明者 マイケル・ジェイ・ビーンコウスキー アメリカ合衆国49024ミシガン州ポーテイ ジ、ハロー・ウッド3431番 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA36 DA78 FB07 4B024 AA01 AA12 BA28 DA02 DA06 DA20 EA02 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ20 QQ79 QR48 QR54 QR66 QR72 QR80 QS03 QS15 4B064 AG07 CA02 CA10 CA19 CC24 DA05 DA14 4B065 AA26X AA90X AA91X AA93Y AA95X AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA42 DA14 EA28 EA51 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 (ａ)配列番号：２または配列番号：４の完全なアミノ酸配列
   を有するＴＲＤＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； (ｂ)配列番号：２の約５３位ないし約２３５位、または配列番号：４の約５３
   位ないし約２４８位にアミノ酸配列を有するＴＲＤＬポリペプチドの細胞外領域
   をコードするヌクレオチド配列；および (ｃ)(ａ)または(ｂ)のヌクレオチド配列に相補性のヌクレオチド配列よりなる
   群から選択される配列に対して少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌクレ
   オチドを含む単離核酸分子。
2. 【請求項２】 請求項１(ａ)記載の該ポリヌクレオチド分子が、配列番号：
   １または配列番号：３で与えられるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核
   酸分子。
3. 【請求項３】 請求項１(ｂ)記載の該ポリヌクレオチド分子が、約２２６ヌ
   クレオチドないし約７７１ヌクレオチドの配列番号：１で与えられるヌクレオチ
   ド配列、または約２１７ヌクレオチドないし約８０１ヌクレオチドの配列番号：
   ３で与えられるヌクレオチド配列を有する請求項１記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項１の(ａ)、(ｂ)または(ｃ)記載のヌクレオチド配列を
   有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポ
   リヌクレオチドを含む単離核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
6. 【請求項６】 請求項１記載の該核酸分子が、ＴＲＤＬポリペプチド発現用
   のプロモーターに作動可能に連結した請求項５記載のベクター。
7. 【請求項７】 請求項５記載のベクターを含む宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載のベクターを含む宿主細胞。
9. 【請求項９】 該宿主が、真核生物の宿主である請求項８記載の宿主細胞。
10. 【請求項１０】 該宿主細胞が、バキュロウイルス細胞である請求項９記載
    の宿主細胞。
11. 【請求項１１】 該宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である請求項９記載の宿主細胞
    。
12. 【請求項１２】 請求項８記載の宿主細胞を培養し、ＴＲＤＬポリペプチド
    を単離することを特徴とするＴＲＤＬポリペプチドを得る方法。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の方法によって生成されるＴＲＤＬポリペ
    プチド。
14. 【請求項１４】 (ａ)配列番号：２または配列番号：４の完全なアミノ酸配
    列； (ｂ)配列番号：２の約５３位ないし約２３５位のアミノ酸配列；および (ｃ)配列番号：４の約５３位ないし約２４８位のアミノ酸配列よりなる群から
    選択される配列に、少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する単離ＴＲＤＬ
    ポリペプチド。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載のＴＲＤＬポリペプチドに特異的に結合す
    る単離抗体。
16. 【請求項１６】 ＴＲＤＬに対する高親和性受容体を有する細胞の同定法で
    あって、 (ａ)請求項１４記載の単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)工程(ａ)で得られた該標識ＴＲＤＬポリペプチドと哺乳動物細胞系の細胞
    とを接触させ； (ｃ)工程(ｂ)で得られた細胞を洗浄して、未結合のＴＲＤＬを除去し；次いで (ｄ)工程(ｃ)で得られた洗浄した細胞中の該標識ＴＲＤＬポリペプチドの存在
    を測定し、それによって、工程(ｃ)で得られた洗浄した細胞中の該標識ＴＲＤＬ
    ポリペプチドの存在が、該細胞上にＴＲＤＬに対する高親和性受容体の存在を示
    すことを特徴とする該方法。
17. 【請求項１７】 ＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害する薬剤の同定法で
    あって、 (ａ)請求項１４記載の単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた該標識ＴＲＤＬポリペプチドと哺乳動物細胞系の細胞とを
    接触させ； (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄して、未結合のＴＲＤＬを除去し； (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄した細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄した細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と工程(
    ｄ)(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より低量の、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリ
    ペプチドは、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を阻害したことを示すこと
    を特徴とする該方法。
18. 【請求項１８】 ＴＲＤＬのその受容体への結合を増強する薬剤の同定法で
    あって、 (ａ)請求項１４記載の単離ＴＲＤＬポリペプチドを標識し； (ｂ)(ｉ)試験薬剤の存在下；および (ii)試験薬剤の不存在下； 工程(ａ)で得られた該標識ＴＲＤＬポリペプチドと哺乳動物細胞系の細胞とを
    接触させ； (ｃ)(ｉ)工程(ｂ)(ｉ)で得られた；および (ii)工程(ｂ)(ii)で得られた； 細胞を洗浄して、未結合のＴＲＤＬを除去し； (ｄ)(ｉ)工程(ｃ)(ｉ)で得られた洗浄した細胞；および (ii)工程(ｃ)(ii)で得られた洗浄した細胞； 中の標識ＴＲＤＬポリペプチドの量を測定し、次いで (ｅ)工程(ｄ)(ｉ)において測定された標識ＴＲＤＬポリペプチドの量と工程(
    ｄ)(ii)において測定されたものを比較し； それによって、試料(ｄ)(ii)中より高量の、試料(ｄ)(i)中の標識ＴＲＤＬポリ
    ペプチドは、該薬剤がＴＲＤＬのその受容体への結合を増強したことを示すこと
    を特徴とする該方法。
19. 【請求項１９】 ＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受ける細
    胞系の同定法であって、 (ａ)哺乳動物細胞系の培養細胞を試験培養物および対照培養物とに分け； (ｂ)ＴＲＤＬポリペプチドと工程(ａ)の試験培養物とを接触させ； (ｃ)アポトーシスを受けた、 (ｉ)工程(ｂ)で得られた試験培養物；および (ii)工程(ａ)の対照培養物； の細胞の量を測定し；次いで (ｄ)工程(ｃ)(ｉ)の試験培養物中のアポトーシスを受けたと判断された細胞の 量と、工程(ｃ)(ii)の対照培養物中のアポトーシスを受けたと判断された 細胞の量とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が該対照培養物
    よりも高いという決定は、ＴＲＤＬとの相互作用に際して、該哺乳動物細胞系が
    アポトーシスを受けることを示すことを特徴とする該方法。
20. 【請求項２０】 アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻害できる薬剤の同定
    法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
    物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を阻
    害することを示すことを特徴とする該方法。
21. 【請求項２１】 アポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増強できる薬剤の同定
    法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポトーシスを受けることがで きる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際して、アポト ーシスを受けることができる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
    物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介誘導を増
    強することを示すことを特徴とする該方法。
22. 【請求項２２】 アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻害できる薬剤の同定
    法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
    物中より高いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を阻
    害することを示すことを特徴とする該方法。
23. 【請求項２３】 アポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増強できる薬剤の同定
    法であって、 (ａ)試験培養物および対照培養物中でアポトーシスを受けた細胞の量を測定し 、ここに、該試験培養物は、試験薬剤の存在下でＴＲＤＬポリペプチドと 接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトーシスを受けるのが妨げら れる哺乳動物細胞を含み、かつ、該対照培養物は、試験薬剤の不存在下で ＴＲＤＬポリペプチドと接触したＴＲＤＬとの相互作用に際してアポトー シスを受けるのが妨げられる哺乳動物細胞を含み；次いで (ｂ)工程(ａ)の試験培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量と 、工程(ａ)の対照培養物中でアポトーシスを受けたと判断された細胞の量 とを比較し； それによって、該試験培養物中のアポトーシスを受けた細胞の量が、該対照培養
    物中より低いという決定は、該試験薬剤がアポトーシスのＴＲＤＬ媒介防止を増
    強することを示すことを特徴とする該方法。