JP2001514890A - 精巣−特異的転写因子ｚｇｃｌ−１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規ZGCL-1転写因子ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び関連する組成物及び方法が開示される。ポリペプチド、アゴニスト及びアンタゴニストが、精巣細胞の増殖及び／又は分化を促進するための方法内で使用され得、そしてまた、男性特異的避妊薬及び不妊処理の開発にも使用され得る。、そしてまた、男性特異的避妊薬及び不妊処理の開発にも使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 多細胞生物の細胞の増殖及び分化は、ホルモン及びペプチド成長因子により調
節される。それらの拡散性分子は、細胞のお互いの連絡を可能にし、そして器官
を形成し、そして損傷を受けた組織を修復し、そして再生するために協力して作
用する。ホルモン及び成長因子の例は、ステロイドホルモン（たとえばエストロ
ゲン、テストステロン）、副甲状腺ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インターロイ
キン、血小板由来成長因子（PDGF）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球−マクロ
ファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、及びカルシ
トニンを包含する。 ホルモン及び成長因子は、受容体に結合することによって細胞代謝に影響を及
ぼす。受容体は、細胞内のシグナル経路、たとえば第２メッセンジャー系に関連
する内在膜タンパク質であり得る。他の種類の受容体は、可溶性分子、たとえば
転写因子である。

【０００２】 転写因子は、他の転写因子及びＲＮＡポリメラーゼと相互作用することによっ
て細胞における遺伝子の転写を調節する。転写因子は、それらのＤＮＡ−結合ド
メイン及びそれらの転写活性化ドメインにより特徴づけられる。ＤＮＡ結合ドメ
イン内に、転写因子へのＤＮＡ結合を介在するよう作用するいくつかの異なった
モチーフが同定されている。それらは、システイン−ヒスチジン亜鉛フィンガー
及び複数−システイン亜鉛フィンガーモチーフ、ホメオボックス(homeobox) モ
チーフ、翼のあるヘリックスモチーフ、ロイシン−ジッパーモチーフ、及びヘリ
ックス−ループ−ヘリックスモチーフを包含する。活性化ドメインは、１つの表
面上に示されるその負の電荷を伴って両親媒性α―ヘリックスを形成する多くの
酢酸アミノ酸を含むことができる。他はグルタミン又はプロリンに富んでいる領
域を有する。

【０００３】 ＤＮＡ結合に続いて、転写因子は、転写を刺激するために他に因子又はＲＮＡ
ポリメラーゼと相互作用する。転写は、ＤＮＡ結合ドメインに結合できるが、し
かし転写ドメインと相互作用しない分子により阻止され得る。それらのリプレッ
サー分子は、肯定的に作用するＤＮＡ分子の結合を妨げる。

【０００４】 特定の遺伝子により結合される転写因子の位置が、その遺伝子の発現パターン
を制御する。遺伝子が偏在的に発現される転写因子を結合する場合、その遺伝子
発現は同様に存在するであろう。遺伝子が限定された数の細胞においてのみ合成
され又は活性である転写因子を結合する場合、遺伝子発現はより細胞特異的であ
ろう。遺伝子発現の調節は、ほとんどの場合、転写因子により制御される。この
調節は、正しい遺伝子が、発生のための正確な時点で適切な細胞において活性化
されることを提供する。転写因子、及びそれらにより調節される遺伝子の同定は
、細胞発生の理解を非常に増強する。結果として、介在方法(intervention meth
od) が、転写に関与する問題を緩和するために開発され得る。本発明は、新規転
写因子、及び関連する組成物及び方法を提供することによって、この必要性と取
り組む。

【０００５】 発明の要約 本発明は、新規の精巣特異的転写因子、並びに関連する組成物及び方法を提供
する。 1 つの観点においては、配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸におい
て少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリ
ペプチドが提供され、ここで前記配列は配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８
に対応するＰＯＺドメインを含んで成る。１つの態様においては、ポリペプチド
は配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも９０％
同一であり、ここで前記配列は配列番号２のアミノ酸残基61〜1782対応するＰＯ
Ｚドメインを含んで成る。もう１つの態様においては、ポリペプチドは、親和性
標識、トキシン、放射性ヌクレオチド、酵素及び蛍光団から成る群から選択され
た成分にアミノ末端又はカルボキシ末端において共有結合されている。

【０００６】 もう１つの観点においては、配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配
列において少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペ
プチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが供給され、ここで前記配列は
配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る
。１つの態様においては、ポリペプチドは、配列番号２の残基１〜４７９に対し
てアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、ここで前記配列は配列番
号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る。

【０００７】 もう１つの観点においては、配列番号4 のヌクレオチド１〜ヌクレオチド１４
３７の配列を含んで成るポリヌクレオチドが提供される。 さらにもう１つの観点においては、配列番号４のポリヌクレオチド又は配列番
号４に対して相補的な配列の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで
成るオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが提供される。

【０００８】 また、本発明によれば、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；
配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０％同
一である、アミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡセ
グメント、ここで前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応する
ＰＯＺドメインを含んで成る；及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクタ
ーが提供される。

【０００９】 1 つの態様においては、ＤＮＡセグメントは、配列番号２の残基１〜４７９に
対してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコード
し、ここで前記配列は配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対するＰＯＺド
メインを含んで成る。もう１つの態様においては、ＤＮＡセグメントは、親和性
標識にアミノ末端又はカルボキシ末端において共有結合されているポリペプチド
をコードする。さらにもう１つの観点においては、ＤＮＡセグメントはさらに、
ポリペプチドに作用可能に連結されている分泌シグナル配列をコードする。

【００１０】 もう１つの観点においては、次の作用可能に連結された要素：転写プロモータ
ー；配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０
％同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮ
Ａセグメント、ここで前記配列は配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応
するＰＯＺドメインを含んで成る；及び転写ターミネーター；を含んで成る発現
ベクターを導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記ポリ
ペプチドを発現する培養された細胞が提供される。

【００１１】 もう１つの観点においては、ポリペプチドを製造するための方法が提供され、
ここで前記方法は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；配列番
号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０％同一であ
る、アミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドをコードするＤＮＡセグメン
ト、ここで前記配列は配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺ
ドメインを含んで成る；及び転写ターミネーター；を含んで成る発現ベクターを
導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコードされる前記ポリペプチドを
発現する細胞を培養し；そして前記発現されたポリペプチドを回収することを含
んで成る。

【００１２】 本明細書に提供されるもう１つの観点は、配列番号２の残基１〜４７９に対し
てアミノ酸配列において少なくとも８０％同一である、アミノ酸残基の配列を含
んで成るポリペプチドであって、ここで前記配は配列番号２のアミノ酸残基６１
〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成るポリペプチド；及び医薬的に許
容できるビークル、を含んで成る医薬組成物である。

【００１３】 もう１つの観点は、配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸において少
なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドであっ
て、配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで
成るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体である。 また、配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸において少なくとも８０
％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドであって、配列番号
２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成るポリペプ
チドのエピトープに特異的に結合する結合タンパク質である。

【００１４】 また、患者における遺伝的異常を検出するための方法が提供され、ここでこの
方法は、患者から遺伝的サンプルを得；前記遺伝的サンプルを、配列番号１又は
配列番号１の相補体の少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで成るポ
リヌクレオチドと共に、前記ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列に
ハイブリダイズするであろう条件下でインキュベートすることにより第１反応生
成物を生成せしめ；対照の反応生成物と前記第１反応生成物とを比較することを
含んで成り、ここで前記第反応生成物と前記対照の反応生成物との間の差異が患
者における遺伝的異常性の表示であることを特徴とする。 本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載及び添付図面から明らかに
なるであろう。

【００１５】 発明の特定の記載 本発明を詳細に記載する前、次の用語を定義することが本発明の理解を助ける
ことができる： “親和性標識”（affinity tag）とは、第２のポリペプチドの精製又は検出を
提供し、又は基質への第２のポリペプチドの結合のための部位を供給するために
、第２のポリペプチドに結合され得るポリペプチドセグメントを示すために本明
細書において使用される。原理的には、それに対する抗体又は他の特異的結合剤
が入手可能なあらゆるペプチドもしくはタンパク質が、親和性標識として使用さ
れ得る。

【００１６】 親和性標識は、ポリ−ヒスチジントラクト、プロテインA(Nilsson など., EM
BO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991),
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Smis and Johnson, Gene67; 31, 1988）
、Glu-Glu 親和性標識（Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:
7952-4, 1985 ）, サブスタンスＰ、Flag(TM) ペプチド（Hoppなど., Biotec
hnology 6: 1204-1210, 1988; Eastman Kodak Co., New Haven , CT から入手で
きる）、ストレプトアビジン結合ペプチド、又は他の抗原性エピトープ又は結合
ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Pur
ification 2:95-107, 1991を参照のこと。親和性標識をコードするDNA は、商品
供給者（たとえばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ ）から入手できる。

【００１７】 “対立遺伝子変異体”（allelic variant)：同じ染色体遺伝子座を占める遺伝
子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれか。対立遺伝子変異は、突然変異を通し
て天然で生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子
突然変異は、サイレントであり( コードされたポリペプチドにおける変化がない
) 、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができ
る。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードさ
れるタンパク質を示すために本明細書において使用される。また、対立遺伝子突
然変異により対照アミノ酸配列とは異なる同じ種からの同じタンパク質も包含さ
れる。対立遺伝子突然変異は、所定のタンパク質をコードする遺伝子における個
人間での天然に存在する差異を意味する。

【００１８】 “アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド及びタンパ
ク質内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である
場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチド又はタ
ンパク質の特定の配列又は一部に関して使用される。たとえば、タンパク質内の
対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対象配列のカルボ
キシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なタンパク質のカルボキシル末端
であることは必ずしも必要ではない。

【００１９】 “相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有結合的に会合される
安定した対を形成する非同一性成分を示す。たとえば、ビオチン及びアビジン(
又はストレプトアビジン) は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。
他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原( 又は
ハプテン又はエピトープ) 対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対、及び
同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、そ
の相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜10^-9M の結合親和性を有する。

【００２０】 “ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、相補的塩基配列、及び対象配列に比
較して逆の配向を有するポリペプチド分子である。たとえば、配列5' ATGCACGGG
3' は、5' CCCGTGCAT 3' に対して相補的である。 “Contig”とは、ポリヌクレオチドであって、そのセグメントがもう１つのポ
リヌクレオチド配列のセグメントに対してヌクレオチド配列において同等である
ようなポリヌクレオチドを示す。“contigアセンブリー”とは、十分な長さ又は
一部のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含むより大き
なポリヌクレオチドセグメントを定義するＥＳＴcontigの集まりを示す。

【００２１】 “縮重”とは、ヌクレオチド配列、たとえばプローブ又はプライマーに適用さ
れる場合、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列（ポリペプチドを
コードする対照ポリヌクレオチドに比較して）を示す。縮重コドンは、ヌクレオ
チドの異なったトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（
すなわち、ＧＡＵ及びＧＡＣトリプレットはそれぞれＡｓｐをコードする）。

【００２２】 “発現ベクター”は、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結
された注目のポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状DN
A 分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター
及びターミネーター配列及び任意には、１または複数の複製起点、１又は複数の
選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含
する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNA から誘導され、又
は両者の要素を含むことができる。

【００２３】 “単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチド
がその天然の遺伝的環境から取り出され、そして従って、他の無関係な又は不所
望のコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成系内での
使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、そ
れらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクローンを含む分子であ
る。本発明の単離されたDNA 分子は、通常関連しない他の遺伝子を含まないが、
しかし天然において存在する5'及び3' 非翻訳領域、たとえばプロモーター及び
ターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかで
あろう( たとえば、Dynan and Tijan, Nature 316: 774−78, 1985を参照のこと
) 。

【００２４】 “単離された”ポリペプチド又はタンパク質は、その生来の環境以外の条件、
たとえば血液及び動物組織とは別の条件下で見出されるポリペプチド又はタンパ
ク質である。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプ
チド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された
形、すなわち９５％以上の純度、より好ましくは９９％以上の純度でポリペプチ
ドを供給することが好ましい。この情況下で使用される場合、用語“単離された
”とは、他の物理的形、たとえばダイマー形又は他のグリコシル化された又は誘
導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。

【００２５】 “作用可能に連結された”とは、ヌクレオチドセグメントに適用される場合、
前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、たとえば
転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネ
ーターに進行するよう配列されることを示す。 “オルト体”（orthology ）とは、異なった種からのポリペプチド又はタンパ
ク質の機能的相対物である、１つの種から得られるポリペプチド又はタンパク質
を示す。オルト体間の配列の差異は、種形成（speciation) の結果である。 “パラ体”(paralog) とは、生物により生産される、異なっているが、しかし
構造的に関連しているタンパク質である。パラ体とは、遺伝子複製を通して生ず
ると思われる。たとえば、α―グロブリン、β−グロブリン及びミオグロブリン
はお互いパラ体である。

【００２６】 “ポリヌクレオチド”は、5'末端から3'末端に読み取られるデオキシリボヌク
レオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌ
クレオチドは、RNA 及びDNA を包含し、そして天然源から単離され、又はインビ
トロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌ
クレオチドのサイズは、塩基対( 略語“bp”) 、ヌクレオチド（“nt”）、又は
キロ塩基（“kb”）として表される。

【００２７】 ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖であるポリヌクレオチドを記
載する。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すため
に使用され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本
鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端
が酵素分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、
二本鎖ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そ
のような対になっていない末端は、長さ20ntを超えない。

【００２８】 “ポリペプチド”は、天然において生成され又は合成的に生成された、ペプチ
ド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約１０個以下のアミノ
酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及される。 “プロモーター”は、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA
配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモータ
ー配列は通常、遺伝子の5' 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそう
ではない。

【００２９】 “タンパク質”は、1 又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。
タンパク質はまた、非ペプチド成分、たとえば炭水化物基を含むことができる。
炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加
され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸
主鎖により本明細書において定義され；置換基、たとえば炭水化物基は一般的に
、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。

【００３０】 “受容体”は、生物活性分子( すなわち“リガンド”) に結合し、そして細胞
上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質又はそのようなタンパク質の
ポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞における
エフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体（及び、
多くの場合、受容体多重化、すなわち同一又は異なった受容体サブユニットの会
合）における変化をもたらす。それらの相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導す
る。

【００３１】 受容体−リガンド相互作用に関連結する代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、
脱リン酸化、細胞増殖、AMP 生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代
謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含す
る。一般的に、受容体は、膜結合され、細胞質性又は核性であり；モノマー( た
とえば甲状腺刺激ホルモン受容体、β−アドレナリン性受容体) 、又はマルチマ
ー( たとえばPDGF受容体、成長ホルモン受容体、IL−３受容体、GM−CSF 受容体
、G −CSF 受容体、エリトロポイエチン受容体及びIL−6 受容体) であり得る。

【００３２】 “分泌シグナル配列”は、それが合成される細胞の分泌経路を通してより大き
なポリペプチドを、そのポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“
分泌ペプチド”）をコードするDNA 配列を示す。前記のより大きなポリペプチド
は、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される
。 “可溶性受容体又はリガンド”：細胞膜に結合されない受容体又はリガンドポ
リペプチド。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブランドメイン及び
細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性
リガンドは、最も通常には、トランスメンブランドメイン及び細胞質ドメインを
欠いている受容体−結合ポリペプチドである。

【００３３】 可溶性受容体又はリガンドは、追加のアミノ酸残基、たとえばポリペプチドの
精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位を提供する親和性
標識を含んで成る。多くの細胞−表面受容体及びリガンドは、タンパク質加水分
解により、又は交互にスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳される天然に存在
する可溶性相対物を有する。受容体及びリガンドポリペプチドは、それがそれぞ
れ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するための、それらのセグ
メントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブランドメイン及び細胞内
ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。

【００３４】 不正確な分析方法（たとえば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分
子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値
が“約”Ｘ又は“おおよそ”Ｘとして表される場合、その言及されたＸの値は、
正確には±１０％であることが理解されるであろう。 本明細書に引用されるすべての引例は、それらのすべてにおいて引用により組
み込まれる。

【００３５】 本発明は、“生殖細胞不足”（germ cell-less）ショウジョウバエ遺伝子に対
する相同性を有する新規ＤＮＡ配列（配列番号１）及び対応するポリペプチド配
列（配列番号２）の発見に一部、基づいている（Jongens など., Cell 70: 569-
584, 1992 ）。この新規ＤＮＡに対応するｍＲＮＡの組織分布の分析は、精巣に
おける選択的発現を示し、これは、リガンドが精巣に対して独特である前駆細胞
増殖及び進化、たとえば精子形成の過程を仲介することを示す。このリガンドは
、ZGCL-1と命名されている。

【００３６】 本発明の新規ZGCL-1 ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、始め、発現され
る配列標識（expesred sequence tag)（ＥＳＴ）データベースを調べることによ
って同定された。この情報を用いて、新規な1469bpのヒトｃＤＮＡフラグメント
（配列番号１）が得られた。配列番号２により示されるような、ZGCL-1 の推定
されるアミノ酸配列の配列分析は、PROSITE モチーフ“ASN-GLYCOSYLATION ”に
より示されるように、配列番号２のアミノ酸残基２５６〜２５９における可能性
あるＮ−グリコシル化部位の存在を示す。

【００３７】 ZGCL-1はまた、PROSITE モチーフ“CAMP-PHOSPHO-SITE ”により示されるよう
に、配列番号２のアミノ酸残基２〜４、１６〜１９、１７〜２０及び３９６〜３
９９における４個の可能性あるｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナ
ーゼのリン酸化部位を含む。ZGCL-1は、PROSITE モチーフ“PKC-PHOSPHO-SITE”
により示されるように、配列番号２のアミノ酸残基９〜１１、１３〜１５、４８
〜５０、５７〜５９及び１０３〜１０５における５個の可能性あるタンパク質キ
ナーゼＣリン酸化部位を含む。本発明のタンパク質は、配列番号２に対して少な
くとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る。本発明の一定の態様
においては、配列は、配列番号２に対して少なくとも９０％又は９５％同一であ
る。

【００３８】 ZGCL-1はまた、ZIN, BTB, 又はBR-C/TTKドメインとしても言及されるＰＯＺド
メインを含む（Chenなど，Mol. Cell. Biol. 15: 3424-39, 1995; Dongなど，Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 3634-29, 1996; Albagli など，Biochem. Bioph
ys. Res. Comm. 220: 911-15, 1996; Chang など，Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93: 6947-52, 1996, 及びKaplan and Calame, Nucleic Acid Research 25: 110
8-16, 1997）。

【００３９】 このドメインは、配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８間にほぼ位置する。
ＰＯＺドメインは、ショウジョウバエにおいて、多くの亜鉛フィンガー含有タン
パク質に見出され、ＰＯＺドメインは、Tramtrack ( Harrison and Travers, EM
BO J. 9: 207-1990), Broad-複合体（Dibello など., Genetics 129: 385-97, 1
991 ）、及びKelch (Xue and Cooley, Cell 72: 681-93, 1993) に見出される。
最初の２種の遺伝子は発達（developmental)レギュレーターであり、そして最後
の遺伝子はアクチン結合タンパク質をコードする。ＰＯＺはまた、ＰＯＸウィル
ス遺伝子、たとえば Myxoma ウィルスMAP1 (Upton など., Virology 179: 618
-31, 1990) 及びワクシニアウィルスタンパク質ａ５５（Genbank 受託番号第P2
4768号）にも見出される。

【００４０】 ＰＯＺはまた、次の少数のヒト遺伝子にも見出される：ＫＵＰ（Chardin など
., Nuckeic Acid Research 19: 1431-36,1991 ）、ＺＩＤ（Bardwell and Treis
man, Gene Dev. 8: 1664-77, 1994 ）、及びPLZF(Chem など., EMBO J. 12: 116
1-67, 1994) 、ＰＯＺドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介する
と思われる。特徴づけられたＰＯＺドメインのほとんどは、ヘテロマー相互作用
を形成するＰＯＺドメイン（Ttk 及びGAGA）の少数の例が存在するけれども、ホ
モマー相互作用を形成する。

【００４１】 ＰＯＺドメインは、ＤＮＡ結合亜鉛フィンガーを含む転写レギュレーター及び
タンパク質に関与しているが、しかしながら、非亜鉛−フィンガーＰＯＺドメイ
ンタンパク質、たとえばKelch のいくつかの例が存在する。Kelch のように、ZG
CL- １はいずれの亜鉛−フィンガモチーフも含まず、そして興味あることには、
Kelch は卵子形成に関与する。当業者は、それらのドメイン境界が近似的なもの
であり、そして既知タンパク質との整列（alignment)及びタンパク質折りたたみ
の予測に基づいていることを認識するであろう。

【００４２】 ショウジョウバエ生殖細胞不足（germ cell-less）遺伝子の推定されるアミノ
酸配列（配列番号１３）とZGCL-1推定アミノ酸配列（配列番号２に示されるよう
な）との比較が図に示されている。ZGCL-1は、ショウジョウバエ“生殖細胞不足
”（germ cell-less）遺伝子と35％のアミノ酸同一性を共有する（Jongens など
., Cell 79: 569-1992）。配列番号１により示されるＤＮＡ配列は、ショウジョ
ウバエ“生殖細胞不足”遺伝子のヒト相同体であると思われる。

【００４３】 種々のヒト組織のノザンブロット分析は、200bp のＤＮＡプローブ（配列番号
３）を用いて実施された。ZGCL-1に対応する３．２ｋｂの転写体が検出された。
高レベルの転写が精巣に検出され、そして低レベルの転写が甲状腺、脊髄、胃、
リンパ節及び気管に検出された。胎盤及び膵臓において低レベルの転写に対応す
る４．５ｋｂの第２転写体もまた検出された。

【００４４】 放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳類染色体の高い解像度の同一限界内の
地図を構成するために開発された体細胞遺伝子技法である（Cox など., Science
250: 245-250, 1990 ）。遺伝子配列の部分的又は十分な知識は、染色体放射線
ハイブリットマッピングパネルと共に使用するために適切なＰＣＲプライマーの
設計を可能にする。完全なヒトゲノムをカバーする市販の放射線ハイブリットマ
ッピングパネル、たとえば、Stanford G3 PH Panel及びGene Bridge 4H Panel (
Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)が入手できる。それらのパネルは、
興味ある領域内の遺伝子、配列−標識化された部位（sequence-tagged site）（
ＳＴＳ）並びに他の非多型性−及び多型性マーカーの、急速な、ＰＣＲに基づく
染色体位置決定及び順序付け（ordering）を可能にする。

【００４５】 これは、注目の新しく発見された遺伝子とすでにマッピングされたマーカーと
の間の直接的に比例する物理的距離の確立を包含する。遺伝子位置の正確な知識
は、１）配列が存在するcontigの一部であるかどうかを決定し、そして種々の、
たとえばＹＡＣ−，ＢＡＣ−又はｃＤＮＡクローンの形での追加の周囲の遺伝子
配列を得ること、２）同じ染色体領域への連鎖を示す遺伝性疾病のための可能な
候補体遺伝子を提供すること、及び３）特定遺伝子がいかなる機能を有するかを
決定することを助けるのに有益であるモデル生物、たとえばマウスを相互参照す
ること、を包含する多くの手段において有用であり得る。

【００４６】 ZGCL- １〜5q35.3の染色体位置決定が、放射線ハイブリットキメラを用いて決
定された。ヒト5q34-q35遺伝子は、A5-B1 及びA1-B1 領域においてマウス染色体
１１に対して主に位置決定されている。マウス“生殖細胞不足”遺伝子、すなわ
ちＧＣＤ遺伝子座はA2-A3 領域における染色体１１上に位置する（Duncan など
.,Hamm. Genome 6:697-9, 1995）。生殖細胞不足（germ cell less）は、胚成長
の間、始原生殖細胞の不適切な移動及び／又は増殖を導き、成熟マウスに不妊症
をもたらす。この突然変異を有するマウスは、ヒト生殖障害、早熟卵巣不全及び
セルト−リ細胞唯一症候群のための動物モデルであると仮定されてきた。

【００４７】 ZGCL-1の高度に保存されたアミノ酸又はアミノ酸ドメインをコードするポリヌ
クレオチド配列は、新規ファミリーメンバーを同定するための手段として使用さ
れ得る。たとえば、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、種々の組織源
又は細胞系から得られたＲＮＡからの、上記に記載され、そして図に示される、
ドメイン又は保存された領域をコードする配列を増幅するために使用され得る。
特に、ZGCL-1配列から設計された高縮重のプライマーがこの目的のために有用で
ある。

【００４８】 本発明はまた、ポリヌクレオチド分子、たとえば本明細書に開示されるZGCL−
１ポリペプチドをコードするDNA 及びRNA 分子を提供する。当業者は、遺伝子コ
ードの縮重の観点から、相当の配列変動がそれらのポリヌクレオチド分子間で可
能であることを容易に認識するであろう。配列番号４は、配列番号２のZGCL−１
ポリペプチドをコードするすべてのDNA を包含する縮重DNA 配列である。当業者
はまた、配列番号４の変性配列がU （ウラシル）とT （チミン）とを置換するこ
とによって、配列番号２をコードするすべてのRNA 配列も提供することを理解す
るであろう。

【００４９】 従って、配列番号４のヌクレオチド1 -1437 を含んで成るZGCL−１ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド及びそれらのRNA 相当物は、本発明により包含
される。表１は、縮重ヌクレオチド位置を示すために、配列番号４内に使用され
る1 文字コードを示す。“解”は、コード文字により示されるヌクレオチドであ
る。“相補体”とは、相補的ヌクレオチドのためのコードを示す。たとえば、コ
ードY はC （チミン）又はT のいずれかを示し、そしてその相補体R はA （アデ
ノシン）又はG （グアニン）を示し、A はT に対して相補的であり、そしてG は
C に対して相補的である。

【００５０】

【表１】 与えられたアミノ酸のためのすべての可能なコドンを包含する配列番号４に使
用される縮重コドンが表２に示される。

【００５１】

【表２】

【００５２】 当業者は、いくらかのあいまいさが、個々のアミノ酸をコードするすべての可
能なコドンの代表である縮重コドンの決定において導入されることを理解するで
あろう。たとえば、セリン（WSN ）のための縮重コドンは、ある環境下で、アル
ギニン（AGR ）をコードすることができ、そしてアルギニン（MGN ）のための縮
重コドンは、ある環境下で、セリン（AGY ）をコードすることができる。類似す
る関係が、フェニルアラニン及びロイシンをコードするコドン間に存在する。従
って、縮重配列により包含されるいくつかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ
酸配列をコードすることができるが、しかし当業者は、配列番号2 のアミノ酸配
列への参照によりそのような変異体配列を容易に同定することができる。変異体
配列は、本明細書に記載のようにして官能性について容易に試験され得る。

【００５３】 当業者はまた、異なった種が“選択的コドン使用”を示すことも理解するであ
ろう。一般的には、Grantham, など., Nuc. Acids Res. 8: 1893−912, 1980; H
aas, など., Curr. Biol. 6: 315 −24, 199 ６; Wain−Hobson、など.,Gene
13：355 −64，1981；Grosjean and Fiera ，Gene 18：199 −209 、1982；
holm,Nuc．Acids Res ．14：3075−87、1986；Ikemura ，Ｊ．Mol ．Biol．15
8 ：573 −97，1982を参照のこと。

【００５４】 本明細書において使用される場合、用語、“選択的コドン使用”又は“選択的
コドン”とは、一定の種の細胞に最も頻繁に使用され、従って個々のアミノ酸を
コードする可能なコドンの１又は少数の代表を好むタンパク質翻訳コドンを意味
する技術的用語である( 表２を参照のこと) 。たとえば、アミノ酸トレオニン（
Ｔｈｒ）は、ＡＣＡ，ＡＣＣ、ＡＣＧ、又はＡＣＴによりコードされるが、しか
し哺乳類細胞においては、ＡＣＣが最も通常に使用されるコドンであり；他の種
においては、たとえば昆虫細胞、酵母、ウィルス又は細菌においては、異なった
Ｔｈｒコドンが好ましい。特定の種のための選択的コドンは、当業界において知
られている種々の方法により、本発明のポリヌクレオチド中に導入され得る。

【００５５】 たとえば、組換えＤＮＡ中への選択的コドン配列の導入は、特定の細胞型又は
種内でタンパク質の翻訳により効果的にすることによって、そのタンパク質の生
成を増強する。従って、配列番号４に開示される縮重コドン配列は、当業界にお
いて通常使用され、そして本明細書において開示される種々の細胞型及び種にお
いてポリペプチドの発現を最適化するための鋳型として作用する。選択コドンを
含む配列は、種々の種における発現について試験され、そして本明細書に開示さ
れる官能性について試験され得る。

【００５６】 本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号
１の類似するサイズの領域又はそれに対して相補的な配列に対して、緊縮条件下
でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度
及びｐＨで、特定の配列のための熱溶融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるよう選
択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が好ましく適合されたプローブに対してハ
イブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びｐＨ下で）である。典型的な
緊縮条件は、塩濃度がｐＨ７で約０．０３Ｍまでであり、そして温度が少なくと
も約６０℃である条件である。前で示されたように、本発明の単離されたポリヌ
クレオチドは、DNA 及びRNA を包含する。

【００５７】 ＤＮＡ及びＲＮＡを調製するための方法は、当業界においてよく知られている
。一般的に、ＤＮＡはまた他の組織からのＲＮＡを用いて調製され、又はゲノム
ＤＮＡとして単離され得るが、精巣からＲＮＡを単離することが好ましい。全RN
A は、グアニジウム ＨＣｌ抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離によ
る単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18: 52 −94, 1979）
。ポリ（A ）+ RNA は、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 140
8 −1412, 1972 )の方法を用いて全RNA から調製される。相補的DNA （ｃDNA ）
は、既知の方法を用いて、ポリ（A ）+ RNA から調製される。次に、ZGCL−１
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、たとえばハイブリダイゼーショ
ン又はPCR により同定され、そして単離される。

【００５８】 当業者は、配列番号１に開示される配列がヒトZGCL−１遺伝子の単一の対立遺
伝子を表し、そして対立遺伝子及び他のスプライシング、すなわち“スプライス
変異体”の存在が予測されることを理解するであろう。配列番号１に示されるＤ
ＮＡ配列の対立遺伝子変異体、たとえばサイレント突然変異を含むそれらの変異
体、及び突然変異がアミノ酸配列変化をもたらすそれらの変異体は、配列番号２
の対立遺伝子変異体であるタンパク質である場合、本発明の範囲内である。スプ
ライス変異体は、遺伝子から転写されるＲＮＡの他の形を示すために本明細書に
おいて使用される。

【００５９】 スプライス変異は、転写されたＲＮＡ分子内の又はまれではあるが、別々に転
写されたＲＮＡ分子間の他のスプライシング部位の使用を通して天然において発
生し、そして同じ遺伝子から転写されたいくつかのｍＲＮＡをもたらすことがで
きる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードすることができる。ZGCL-1ポリペプチドの性質を保持する、他のスプライス
されたｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡは、そのようなｃＤＮＡ及びｍＲＮＡに
よりコードされるポリペプチドである場合、本発明の範囲内に包含される。それ
らの配列の対立遺伝子変異体及びスプライス変異体は、当業界において知られて
いる標準の方法に従って、異なった個人又は組織からのｃＤＮＡ又はゲノム ラ
イブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。

【００６０】 本発明はさらに、他の種からの相対物リガンド（オルト体）及びポリヌクレオ
チドを供給する。それらのオルト体ポリヌクレオチドは、中でも、それぞれのオ
ルト体タンパク質を調製するために使用され得る。これらの種は、哺乳類、鳥類
、両性類、ハ虫類、魚類、昆虫及び他の脊椎及び無脊椎動物種を包含するが、但
しそれらだけには限定されない。特に興味あるものは、他の哺乳類種、たとえば
ネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類リガンドからのZGCL−１
リガンドである。

【００６１】 ヒトZGCL−１のオルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明によ
り供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。たとえば、ｃDNA は
、リガンドを発現する組織又は細胞型から得られるｍRNA を用いてクローン化さ
れ得る。ｍRNA の適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプロー
ブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライ
ブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNA から調製される。次に、ZGCL−１コー
ドｃDNA が種々の方法、たとえば完全な又は部分的なヒトｃDNA により、または
前記開示される配列に基づく１又は複数の縮重プローブにより、プローブするこ
とによって単離され得る。

【００６２】 ｃDNA はまた、本明細書に開示される配列から設計されたプライマーを用いて
、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202 号）を用
いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNA ライブラリーが宿
主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あ
るｃDNA の発現がZGCL−１に対する抗体により検出され得る。類似する技法がま
た、ゲノムクローンの単離に適用され得る。

【００６３】 本発明はまた、配列番号２のリガンドポリペプチドに対して実質的に相同であ
る単離されたリガンドポリペプチドも提供する。“単離された”とは、その生来
の環境、たとえば血液及び動物組織以外の条件下に見出されるタンパク質又はポ
リペプチドを意味する。好ましい形においては、単離されたタンパク質又はポリ
ペプチドは、他のタンパク質又はポリペプチド、特に動物起源の他のタンパク質
又はポリペプチドを実質的に有さない。高く精製された形、すなわち９５％以上
の純度、より好ましくは９９％以上の純度の形でタンパク質又はポリペプチドを
供給することが好ましい。

【００６４】 用語“実質的に類似する”とは、配列番号２に示される配列に対して少なくと
も６０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％の配
列同一性を有するタンパク質又はポリペプチド又はそれらのオルト体を示すため
に、本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、配列番号２又は
そのオルト体に対して、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、そして最
も好ましくは９５％同一であろう。

【００６５】 ％配列同一性は、従来の方法により決定される。たとえば、Altschulなど., B
ull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986 及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl
. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992 を参照のこと。手短に言及するば、
２種のアミノ酸配列が、１０のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ拡張ペ
ナルティー、及び表３（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示さ
れるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum 62 ”評点マトリックス
を用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次の
ようにして計算される：

【００６６】

【数１】

【００６７】

【表３】

【００６８】 ポリヌクレオチド分子の配列同一性が、上記に開示されるような割合を用いて
、類似する方法により決定される。 実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドが１又は複数のアミノ酸置換、欠
失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、
保存性アミノ酸置換（表４を参照のこと）及びタンパク質及びポリペプチドの折
りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的に
は１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端
の延長、たとえばアミノ−末端メチオニン残基、又は約２０〜２５個までの残基
の小さなリンカーペプチドの延長、又は親和性標識の延長である。親和性標識を
含んで成るポリペプチドはさらに、ZGCL−１ポリペプチドと親和性標識との間に
タンパク質分解部位を含む。好ましいそのような部位は、トロンビン分解部位及
び第Xa因子分解部位を含む。

【００６９】

【表４】

【００７０】 本発明のタンパク質はまた、非天然アミノ酸残基を含んで成ることができる。
非天然アミノ酸は、トランス−３−メチルプロリン、２, ４−メタノロリン、シ
ス−４−ヒドロキシプロリン、トランス−４−ヒドロキシプロリン、N −メチル
−グリシン、アロ−トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシエチルシステイ
ン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピ
ペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチル
プロリン、３, ３−ジメチルプロリン、tert−ロイシン、ノルバリン、２−アザ
フェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニルアラニン、及
び４−フルオロフェニルアラニンを包含する。

【００７１】 非天然アミノ酸残基をタンパク質中に導入するためのいくつかの方法が当業界
において知られている。たとえばナンセンス突然変異が化学的にアミノアシル化
されたサプレッサーtRNAを用いて抑制されるインビトロ系が使用され得る。アミ
ノ酸を合成し、そしてｔRNA をアミノアシル化するための方法は、当業者におい
て知られている。ナンセンス突然変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E.コ
リS30 抽出物及び市販の酵素及び他の試薬の含んで成る無細胞系において実施さ
れる。

【００７２】 タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製される。たとえば、Rovertson
など，J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellmanなど，Meth. Enzymol. 202:
301,1991; Chung など，Science 259: 806−09, 1993; 及びChung など，Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145−49, 1993を参照のこと。第２の方法において
は、翻訳は、突然変異誘発されたｍRNA 及び化学的にアミノアミル化されたサプ
レッサ−ｔRNA のマイクロインジェクションによりアフリカツメガエル卵母細胞
において行われる( Turcatti など., J. Biol. Chem. 271: 1991 −98, 1996 )
。

【００７３】 第３の方法においては、E.コリ細胞が、置換される予定である天然のアミノ酸
（たとえば、フェニルアラニン）の不在下で及び所望の非天然アミノ酸（たとえ
ば、２−アザフェニルアラニン、３−アザフェニルアラニン、４−アザフェニル
アラニン又は４−フルオロフェニルアラニン）の存在下で培養される。非天然ア
ミノ酸は、その天然の相対物の代わりにタンパク質中に導入される。Koide など
，Biochem. 33: 7470 −46, 1994を参照のこと。天然に存在するアミノ酸残基は
、インビトロ化学的に修飾により非天然的に存在する種に転換され得る。化学的
修飾は、置換の範囲をさらに拡張するために特定部位の突然変異誘発と組み合わ
され得る（Wynn and Richards,Protein Sci. 2: 395 −403, 1993)。

【００７４】 限定された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ
酸、非天然アミノ酸、及び非自然のアミノ酸が、ZGCL−１アミノ酸のために置換
され得る。 本発明のポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている
方法、たとえば部位特定突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同
定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081 −1085, 1989; Bassな
ど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991 ）。後者の技法におい
ては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得ら
れる変異体分子が、前記分子の活性に対して必須であるアミノ酸残基を同定する
ために、下記に開示されるようして、生物学的活性について試験される。

【００７５】 また、Hiltonなど., J. Biol. Chem. 271: 4699 −5708, 1996を参照のこと。
リガンド−受容体相互作用の部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異
に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性ラベリングのような技法
により決定され得る。たとえば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992;
Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899 −904, 1992; Wlodaver など., FEBS
Lett. 309: 59 −64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連するリ
ポカリンによる相同体の分析からも推定され得る。

【００７６】 複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、たとえば
Reidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53 −57, 1988）又はBowie and Sa
uer （ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方
法を用いて行われ、そして試験される。手短に言及すれば、それらの著者は、ポ
リペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスク
リーニングし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、
突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用さ
れ得る他の方法は、ファージ表示（たとえば、Lowman など., Biochem. 30 : 1
0832−10837,1991; Ladner など、アメリカ特許第5,223,409 号; Huse, WIPO公
開WO 92 ／06204 号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など
，Gene 46 : 145, 1986; Nerなど，DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。

【００７７】 開示されたZGCL−１ DNA及びポリペプチド配列の変異体は、Stemmer, Nature
370 : 389 −91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747 −51
, 1994及びWIPO公開WI97／20078 により開示されるように、DNA シャフリングを
通して生成され得る。手短に言及すれば、変異体DNA が、ランダムに導入された
点突然変異をもたらす、親DNA のランダム断片化、続く、PCR を用いてのアセン
ブリーによるインビトロ相同組換えにより生成される。この技法は、前記工程中
に追加の変動性を導入するために、親DNA のファミリー、たとえば異なった種か
らの対立遺伝子変異体又はDNA を用いて改良され得る。所望の活性の選択又はス
クリーニング、突然変異誘発及びアッセイの続くさらなる相互作用が、有害な変
化に対して同時に選択しながら、所望の突然変異について選択することによって
、配列の急速な“進化”を提供する。

【００７８】 上記に開示されるような突然変異誘発方法は、クローン化された突然変異誘発
リガンドの活性を検出するために高処理量の自動化されたスクリーニング方法と
組み合わされ得る。活性リガンドをコードする突然変異誘発されたDNA 分子が、
宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それ
らの方法は、注目のポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な
決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。

【００７９】 上記に論ぜられた方法を用いて、当業者は、配列番号２又はその対立遺伝子変
異体に対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質の転写介在特性を保
持する種々のポリペプチドを同定し、そして／又は調製することができる。その
ようなポリペプチドは、親和性標識及び同様のものを包含する。そのようなポリ
ペプチドはまた、一般的には上記に開示されるように、追加のポリペプチドセグ
メントを含むことができる。

【００８０】 本発明のZGCL−１ポリペプチド、たとえば十分な長さのポリペプチド、フラグ
メント（たとえば、ＤＮＡ−結合フラグメント）及び融合ポリペプチドは、従来
の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿
主細胞は、外因性DNA により形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養
において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養
された高等真核細胞を包含する。

【００８１】 真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたDN
A 分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNA を導入するための技法は
次の文献に開示される：Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
, NY, 1989, 及びAusubel など., eds., Current Protocol in Molecular Biolo
gy, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1987.

【００８２】 一般的に本発明のZGCL−１ポリペプチドをコードするDNA 配列は、その発現の
ために必要とされる他の遺伝子的要素、たとえば一般的に、発現ベクター内の転
写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、
通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製起点を含むであろうが、
しかし当業者は、一定の系内で、選択マーカーが別のベクター上で供給され得、
そして外因性DNA の複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得るこ
とを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクタ
ー及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのその
ような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。

【００８３】 ZGCL−１ポリペプチドを、宿主細胞の分泌経路中に方向づけるためには、分泌
シグナル配列（または、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配
列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は
、ZGCL−１ポリペプチドの配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質
（たとえば t−PA）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、
ZGCL−１DNA 配列に作用可能に連結され、すなわち２つの配列は正しくオープン
リーディングフレームを整合して連結され、そして宿主細胞の分泌経路に新しく
合成されたポリヌクレオチドを方向づけるように配置される。

【００８４】 分泌シグナル配列は通常、注目のポリペプチドをコードするDNA 配列の5'側に
位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、注目のDNA 配列の他の場所に位置
することもできる（たとえば、Welch など.,アメリカ特許第5,037,743 号；Holl
and など., アメリカ特許第5,143,830 号を参照のこと）。

【００８５】 培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNA を哺
乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフ
ェクション（Wiglerなど，Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somati
c Cell Genetics 7 :603, 1981; Grahamなど，Virology 52; 456, 1973）, エレ
クトロポレーション( Neumann など，EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE −デ
キストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など、前記）、及びリポソーム
−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など，Focus 15: 73, 1993;
Ciccarone など，Focus 15: 80, 1993）を包含する。

【００８６】 培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、たとえばlevins
on など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など、アメリカ特許第4,784,
950 号; Palmiter など、アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメ
リカ特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、
COS −1 （ATCC No. CRL 165）、COS −7 （ATCC No. CRL 1651 ）、BHK （ATCC
No. CRL 1632 ）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293 （ATCC No. CRL 1
573 ; Graham など，J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977）、及びチャイニーズハ
ムスター卵巣( たとえば CHO −K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。

【００８７】 追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託機関、
たとえば American Type Culture Collection, Rockville, Maryland から入手
できる。一般的に、強い転写プロモーター、たとえばSV−40 またはサイトメガ
ロウィルスからのプロモーターが好ましい。たとえば、アメリカ特許第4,956,28
8 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からの
プロモーター（アメリカ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウ
ィルス主要後期プロモーターを包含する。

【００８８】 薬物選択は一般的に、外来性DNA が挿入されている、培養された哺乳類細胞を
選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”
として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある
遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として
言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコ
ードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、たとえばG −418 又は同
様のもの存在下で実施される。

【００８９】 “増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現
レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトラ
ンスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベル
で生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。
好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジ
ヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子( たとえば、ヒグロマイシ
ン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ) もま
た、使用され得る。

【００９０】 変更された表現型を導入する他のマーカー、たとえば緑色蛍光タンパク質、又
は細胞表面たんぱく質、たとえばCD4, CD8,クラスI MHC 、胎盤アルカリ ホ
スファターゼが、FACS 分類又は磁気ビース分離技法のような手段により、トラ
ンスフェクトされていない細胞とトランスフェクトされた細胞とを分類するため
に使用され得る。

【００９１】 他の高等真核細胞、たとえば昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞もまた、宿主と
して使用され得る。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチド
の生成は、Guarino など、アメリカ特許第5,162,222 号；及びWIPO公開WO94／06
463 により公開される。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとし
てのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は
、Sinkarなど、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47 −58, 1987 により総説され
ている。昆虫細胞は、オートグラファ・カリホルニカ（ Autographa californic
a ）核多角体病ウィルス（AcNPV ）に通常由来する組換えバキュロウィルスによ
り感染され得る。

【００９２】 King, L. A. and Possee, R.D., The Baculovirus Exprossion System: A Lab
oratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D. R. ., Baculovirus Ex
pression Vector: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press.
, 1994; 及びRichardson, C. D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Me
thods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照のこと。
組換えZGCL−１ バキュロウィルスを製造するための第２の方法は、Luckow ( L
uckow, VA, など，J. Virol 67: 4566 −79, 1993 )により記載されるトランス
ポゾンに基づく系を利用する。トランスファーベクターを利用するこの系は、Ba
c −to−Bac ( TM )キット（Life Technologies, Rockville, MD）として市販
されている。

【００９３】 この系は、“bacmid" と呼ばれる大きなプラスミドとして、E.コリに維持され
るバキュロウィルスゲノム中に、ZGCL−１ポリペプチドをコードするDNA を移動
せしめるために、Tn7 トランスポゾンを含むトランスファーベクター、pFastBac
I (TM ) (Life Technologies )を利用する。Hill−Perkins, M.S. and Possee,
R.D., J. Gen. Virol. 71: 971−6, 1990; Bonning, B.C. など., J. Gen. Vir
ol. 75: 1551−6, 1994; 及びChazenbalk, G. D., and Rapoport, B., J. Bio
l Chem. 270: 1543 −9,1995 を参照のこと。さらに、トランスファーベクター
は発現されたZGCL−１ポリペプチドのC −又はN −末端でエピトープ標識、たと
えばGlu −Glu エピトープ標識をコードするDNA とのイン−フレーム融合体を
含むことができる（Grussenmeyer, T. など., Peoc. Natl. Acad. Sci. 82: 79
52−6, 1985 ）。

【００９４】 当業界において知られている技法を用いて、ZGCL−１を含むトランスファーベ
クターにより、E.コリが形質転換され、そして組換えバキュロウィルスの表示で
ある断続的lacZ遺伝子を含むbacmida についてスクリーンされる。組換えバキュ
ロウィルス ゲノムを含むbacmida DNA が、通常の技法を用いて単離され、そし
てスポドプテラ フルギペルダ（ Spodoptera frugiperda ）細胞、たとえばSf
9 細胞をトランスフェクトするために使用される。Zlipolを発現する組換えウィ
ルスが結果的に生成される。組換えウィルス ストックは、当業者において通常
使用される方法により製造される。

【００９５】 組換えウィルスは、宿主細胞、典型的には、アワヨトウの幼虫、スポドプテラ
フルギペルダに由来する細胞系を感染せしめるために使用される。一般的には
、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applicati
on of Recombinant DNA, ASM Prss, Washington, D.C., 1994 を参照のこと。も
う１つの適切な細胞系は、トリコプルシア ニ（Trichoplusia ni ）に由来する
High FiveO(TM) 細胞系〈Invitrogen〉である（アメリカ特許第5,300,435 号）
。市販の血清フリー培地が、細胞を増殖し、そして維持するために使用される。

【００９６】 適切な培地は、Sf9 細胞のためには、SF900II(TM) (Life Technologies),又は
EST 921(TM)(Expression Systems);及びT. ni 細胞のためには、Ex−CellO405
(TM)（JRH Biosciences, Lenza, KS）又はExpress FiveO(TM)(Life Technologie
s ) である。細胞は、約２〜５×１０⁵ 個の細胞〜１〜２×１０⁶ 個の細胞の接
種密度から増殖され、この時点で、組換えウィルスストックが、0.1 〜10, より
典型的にはほぼ３の感染多重度（MCI ）で添加される。使用される方法は一般的
に、入手できる実験用マニュアルに記載されている（King, L. A. and Possee,
R. D., 前記; O'Reilly, D. R. など、前記；Richardson, C. D., 前記）。上
清液からのZGCL−１ポリペプチドの続く精製は、本明細書に記載される方法を用
いて達成され得る。

【００９７】 菌類細胞、たとえば酵母細胞もまた、本発明内で使用され得る。これに関して
、特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cere
visiae）, ピチア・パストリス（Pichia pastoris ）及びピチア・メタノリカ(p
ichia methanolica) を包含する。外因性DNA によりS. セレビシアエ細胞を形
質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、たとえ
ばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311 号；Kawasaki など., アメリカ特許第
4,931,373 号；Brake, アメリカ特許第4,870,008 号；Welch など., アメリカ
特許第5,037,743 号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075 号により
開示される。

【００９８】 形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は特定の栄養物（
たとえばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択
される。サッカロミセス・セレビシアエへの使用のための好ましいベクター系は
、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にす
る、Kawasaki など. ( アメリカ特許第4,931,373 号) により開示されるPOT １
ベクター系である。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネータ
ーは、解糖酵素遺伝子（たとえば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311 号；Ki
ngsmanなど., アメリカ特許第4,615,974 号；及びBitter, アメリカ特許第4,97
7,092 号を参照のこと）及びアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包
含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154 号；第5,139,936 号
；及び第4,661,454 号を参照のこと。

【００９９】 他の酵素、たとえばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シ
ゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe）、クルイベリミセス
・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluy
veromyces fragilis）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・
パストリス（ Pichia pastoris）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillerm
ondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換系は
、当業界において知られている。

【０１００】 たとえば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459 −3465, 1986 及
びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、
Mcknight など、アメリカ特許第4,935,349 号の方法に従って使用され得る。ア
クレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための
方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228 号により開示される。ニューロス
ポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第
4,486,533 号により開示される。

【０１０１】 組換えタンパク質の生成のための宿主としてのピチア・メタノリカの使用は、
WIPO公開WO97／17450, WO97 ／17451 、WO98／02536 及びWO９８／02565 に開示
される。P.メタノリカの形質転換に使用するためのDNA 分子は通常、形質転換の
前、好ましくは線状化される、二本鎖の環状プラスミドとして調製されるであろ
う。P.メタノリカにおけるポリペプチド生成のためには、プラスミドにおけるプ
ロモーター及びターミネーターは、P.メタノリカ遺伝子、たとえばP.メタノリカ
のアルコール利用遺伝子（AUG １又はAUG ２）のものであることが好ましい。

【０１０２】 他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ギ酸
デヒドロゲナーゼ（FMD ）、及びカタラーゼ（CAT ）遺伝子のものを包含する。
宿主染色体中へのDNA の組み込みを促進するためには、宿主DNA 配列を両端に有
するプラスミドの完全な発現セグメントを有することが好ましい。ピチア・メタ
ノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、アデニンの不在下でade2宿主
細胞の増殖を可能にする、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシ
ラーゼ（AIRC; EC. 4.1.1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。メ
タノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業方法のためには、両メ
タノール利用遺伝子（AUG １及びAUG ２）が欠失されている宿主細胞を使用する
ことが好ましい。

【０１０３】 分泌されたタンパク質の生成のためには、液胞プロテアーゼ遺伝子（PEP ４及
びPRB １）を欠いている宿主細胞が好ましい。エレクトロポレーションが、P.メ
タノリカ細胞中への、興味あるポリペプチドをコードするDNA を含むプラスミド
の導入を促進するために使用される。2.5 〜4.5kV/cm, 好ましくは約3.75kV/cm
の電場の強さ、及び1 〜40m 秒、最も好ましくは約20m 秒の時定数を有する、指
数的に減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP.
メタノリカ細胞を形質転換することが好ましい。

【０１０４】 原核宿主細胞、たとえば細菌E.コリ、バシラス及び他の属の菌株はまた、本発
明において有用な宿主細胞である。それらの宿主を形質転換し、そしてそこにク
ローン化される外来性DNA 配列を発現するための技法は、当業界において良く知
られている（たとえば、Sambrookなど., 前記を参照のこと）。細菌、たとえば
E.コリにおいてZGCL−１ポリペプチドを発現する場合、そのポリペプチドは、典
型的には不溶性顆粒として細胞質に保持され得、又は細菌の分泌配列によりペリ
プラズム空間に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして顆粒が回収
され、そしてたとえばグアニジンイソチオシアネート又は尿素を用いて変性され
る。

【０１０５】 次に、変性されたポリペプチドが再生され、そしてたとえば尿素、及び還元さ
れた及び酸化されたグルタチオンの組み合わせの溶液に対する透析、続く緩衝溶
液に対する透析により、前記変成体を希釈することによって２量体化され得る。
後者の場合、ポリペプチドは、ペリプラズム空間の内容物を開放するために細胞
を破壊し（たとえば、音波処理又は浸透ショックにより）、そしてタンパク質を
回収することによって、細胞周辺腔から可溶性及び機能性形で回収され、それに
より、変性及び再生のための必要性を回避することができる。

【０１０６】 形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞
の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来
の方法に従って培養される。種々の適切な培地、たとえば定義された培地及び複
合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、
必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長
因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に
付加されたDNA を含む細胞を、たとえば発現ベクター上に担持される選択マーカ
ーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物に
おける薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。

【０１０７】 P.メタノリカ細胞は適切な炭素源、窒素源及び微量栄養物を含んでなる培地に
おいて、約２５℃〜３５℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、た
とえば小さなフラスコの振盪又は発酵器のスパージングにより十分なエアレーシ
ョンを提供される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％D −
グルコース、２％のBacto(TM) ペプトン（Difco Laboratories, Detroit, MI ）
, 1%のBacto(TM) 酵母抽出物（Difco Laboratories）, 0.004%のアデニン及び
0.006 ％のL −ロイシン）である。

【０１０８】 発現された組換え体ZGCL−１ ポリペプチド（又はキメラZGCL−１ポリペプチ
ド）は、分別及び／又は従来の精製方法及び媒体を用いて精製され得る。硫酸ア
ンモニウム沈殿及び酸又はカオトロピック剤抽出がサンプルの分別のために使用
され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び
逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なクロマトグラフィー用媒
体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルア
ミド、特別なシリカ及び同様のものを包含する。PEI 、DEAE、QAE 及びQ 誘導体
が好ましい。

【０１０９】 典型的なクロマトグラフィー用媒体は、フェニル、ブチル又はオクチル基によ
り誘導体化されたもの、たとえばフェニル−Sepharose FF(pharmacia),Toyopear
l ブチル650 （Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−Sepharrose (Ph
armacia)及び同様のもの；又はポリアクリル樹脂、たとえばAmberchrom CG71 (T
oso Haas) 及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シ
リカ基材の樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビ
ーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂及びそれらが使
用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。

【０１１０】 それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基及び／又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基よ
り変性され得る。カップリング化学物質の例は、臭化シアン活性化、N −ヒドロ
キシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラ
ジド活性化及びカルボジイミドカップリング化学物質のためのカルボキシル及び
アミノ誘導体を包含する。

【０１１１】 それらの及び他の固体媒体は当業界において良く知られており、そして広く使
用されており、そして商業的供給者から入手できる。支持媒体にリガンド又は受
容体ポリペプチドを結合するための方法は当業界において良く知られている。特
定方法の選択は、通常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部
決定される。たとえば、Affinity Chromatograpy: Principles & Methods, Phar
macia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。

【０１１２】 本発明のポリペプチドは、それらの物理的性質の利用により単離され得る。
たとえば、固定された金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィーが、ヒスチジ
ンに富んでいるタンパク質、及びポリヒスチジン標識を含んでなるそれらのタン
パク質を精製するために使用され得る。手短に言及すれば、ゲルがまず、二価金
属イオンにより荷電され、キレートが形成される( Sulkowski, Trends in Bioch
em. 3: 1−7, 1985)。ヒスチジンに富んでいるタンパク質が、使用される金属イ
オンに依存して、異なった親和性を有するこのマトリックスに吸着され、そして
競争溶出、ｐH の低下、又は強いキレート化剤の使用により溶出されるであろう
。

【０１１３】 他の精製方法は、レクチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマト
グラフィーによるグリコシル化されたタンパク質の精製を包含する（Methods in
Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, ( ed
.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529 −39）。本発明のさらなる態様に
おいては、興味あるポリペプチド、及び親和性標識（たとえばGlu −Glu 親和性
標識、FLAG標識、マルトース−結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融
合体が、精製を促進するために構成され得る。

【０１１４】 タンパク質再生（及び任意には、再酸化）方法が好都合には、使用され得る。
タンパク質を８０％の純度、より好ましくは９０％以上の純度、さらに好ましく
は９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして汚染性高分子、特に他の
タンパク質及び核酸に対して、99.9％以上の純度であり、そして感染性及び発熱
性剤を有さない医薬的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、精製されたタ
ンパク質は、他のタンパク質、特に動物起源の他のタンパク質を実質的に有さな
い。

【０１１５】 ZGCL-1ポリペプチド又はそのフラグメントは又、化学合成により調製され得る
。ZGCL-1ポリペプチドは、モノマー又はマルチマーであり；グリコシル化されて
もまたはグリコシル化されなくても良く；ペギレート化されても又はペギレート
化されなくても良く；そして開始メチオニンアミノ酸残基を包含しても又はしな
くても良い。

【０１１６】 リガンド−結合受容体（又は抗体、補体／抗−補体対の１つのメンバー）又は
その結合フラグメント、及び市販のバイオセンサー装置（BIAcore(tm), Pharmac
ia Bjiosensor, Piscataway, NJ ）を用いるアッセイシステムが好都合には、使
用され得る。そのような受容体、抗体、補対／抗−補体対のメンバー又はフラグ
メントは、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson,
J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mol.
Biol. 234: 554-63, 1993 により開示される。

【０１１７】 受容体、抗体、メンバー又はフラグメントは、流動細胞内の金フィルムに結合
されるデキストラン フィルムに、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、共
有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンド、エピトープ、又は補
体／抗補体対の反対メンバーがサンプルに存在する場合、それは、それぞれ、固
定化された受容体、抗体又はメンバーに結合し、培地の屈折率の変化を引き起こ
し、これが金フィルムの表面プラスモン共鳴の変化として検出される。このシス
テムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算
され、そして結合の化学量論の評価が行われ得る。

【０１１８】 ZGCL-1に対するインビトロ及びインビボ応答がまた、培養された細胞を用いて
、又は本発明の分子を適切な動物モデルに投与することによって測定され得る。
たとえば、ZGCL-1 トランスフェクトされた発現宿主細胞が、アルギン酸塩環境
下で包埋され、そして受容体動物中に注入（移植）され得る。アルギネート−ポ
リ−L −リシン微小封入、透過性膜封入及び拡散チャンバーは、トランスフェク
トされた哺乳類細胞又は一次哺乳類細胞を捕獲するための手段として記載されて
いる。

【０１１９】 それらのタイプの非免疫原生“封入”又は微環境は、微環境中への栄養物の移
行、及び捕獲された細胞により分泌され又は開放されるタンパク質及び他の高分
子の受容体動物への拡散を可能にする。最も重要なことには、カプセル又は微環
境は、受容体動物の免疫応答から外来性の包埋された細胞をマスクし、そして遮
断する。そのような微環境は、注入される細胞の寿命を、数時間又は数日（裸細
胞）から数週間（包埋された細胞）まで拡張することができる。

【０１２０】 アルギン酸塩糸は、包埋された細胞を生成するための単純且つ迅速な手段を提
供する。アルギン酸塩糸を生成するために必要とされる材料は、容易に入手でき
、そして比較的安価である。製造されると、アルギン酸塩糸は、その糸を用いて
得られるデータに基づけば、インビトロ及びインビボの両者において、比較的強
く且つ耐久力がある。アルギン酸塩糸は容易に操作でき、そしてその方法論は、
多くの糸の調製のために評価できる。典型的な方法においては、３％のアルギン
酸塩が、無菌水において調製され、そして滅菌濾過される。

【０１２１】 アルギン酸塩糸の調製の直前、アルギン酸塩溶液が再び濾過される。約５０％
の細胞懸濁液（１ml当たり約５×１０⁵ 個〜約５×１０⁷ 個の細胞を含む）が３
％アルギン酸塩溶液と共に混合される。１mlのアルギン酸塩／細胞懸濁液が、約
１５分間にわたって、１００mMの滅菌濾過されたCaCl₂ 溶液中に押し出され、“
糸（Thread）”が形成される。押し出された糸は次に、５０mMのCaCl₂ の溶液に
移され、そして次に２５mMのCaCl₂ の溶液に移される。次に、糸が、脱イオン水
によりすすがれ、その後、ポリ−L −リシンの0.01％溶液においてインキュベー
トすることによって糸を被覆する。 最後に、糸は乳酸塩化されたリンガー溶液によりすすがれ、そして注射器（針
のない）中に溶液から抜き取られる。次に大きな孔の針がその注射器につけられ
、そして糸が最少量の乳酸塩化されたリンガー溶液において受容体中の腹腔内注
入される。

【０１２２】 本発明のタンパク質をアッセイするための別のインビボ アプローチは、ウィ
ルス供給システムを包含する。この目的のための典型的なウィルスは、アデノウ
ィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス及びアデノ関連ウィルス（AAV
）を包含する。アデノウィルス、すなわち二本鎖DNA ウィルスは現在、異種拡散
の供給のための最も研究されている遺伝子トランスファーベクターである（T. C
. Becker など., Meth. Cell Bio. 43: 161−89, 1994; 及びJ. T. Douglas an
d D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44 −53, 1997 を参照のこと）。

【０１２３】 アデノウィルス系は次のいくつかの利点を付与する：（ i ）アデノウィルス
は比較的大きなDNA 挿入体を適応せしめることができ；（ ii ）高い力価に増殖
され得；（ iii ）広範囲の哺乳類細胞型を感染せしめ；そして（ iv ）異なっ
たプロモーターを含む多くの入手できるベクターと共に使用され得る。また、ア
デノウィルスは血流において安定しているので、それらは静脈内注射により投与
され得る。アデノウィルス遺伝子供給に関与するいくつかの欠点（特に、遺伝子
療法のための）は、（ｉ）宿主ゲノム中への非常に低い効率の組み込み；（ｉｉ
）主にエピソーム形での存在；及び（ｉｉｉ）アデノウィルス ベクターの再投
与を妨げる、投与されたウィルスに対する宿主免疫応答を包含する。

【０１２４】 アデノウィルスゲノムの一部が欠失されているアデノウィルスベクターを用い
て、異種DNA の大きな挿入体（７kbまでの）が提供され得る。それらの挿入体は
、直接的な連結により、又は同時トランスフェックトされたプラスミドによる相
同組換えによりウィルスDNA 中に導入される。典型的な系においては、必須E1遺
伝子がウィルスベクターから欠失され、そしてウィルスは、E １遺伝子が宿主細
胞（ヒト293 細胞系が典型である）により供給されなければ、複製しないであろ
う。

【０１２５】 損なわれていない動物に静脈内投与される場合、アデノウィルスは主に、肝臓
を標的化する。アデノウィルス供給システムがE １遺伝子欠失を有する場合、ウ
ィルスは宿主細胞において複製することができない。しかしながら、宿主の組織
（すなわち肝臓）は、異種タンパク質を発現し、そしてプロセッシングするので
あろう( そして、分泌シグナル配列が存在する場合、分泌する) 。分泌されたタ
ンパク質は高く血管化された肝臓において循環に入り、そして感染された動物に
対する効果が決定され得る。

【０１２６】 アデノウィルスシステムはまた、インビトロでのタンパク質生成のためにも使
用され得る。アデノウィルス感染された非−293 Ｓ細胞を、その細胞が急速に分
裂しないような条件下で培養することによって、前記細胞は長時間、タンパク質
を生成することができる。たとえば、BHK 細胞は、細胞工場において集密性まで
増殖され、次に興味ある分泌されたタンパク質をコードするアデノウィルス ベ
クターに暴露される。次に、細胞が、有意な細胞分裂を伴わないで、感染された
細胞の数週間の生存を可能にする血清フリー条件下で増殖せしめられる。

【０１２７】 他方では、アデノウィルス ベクター感染された293 Ｓ細胞が、有意な量のタ
ンパク質を生成するために、比較的高い細胞密度で、付着細胞として又は懸濁培
養において増殖せしめられ得る（ Garnier など., Cytotechnol. 15: 145 −55
, 1994 を参照のこと）。いずれかのプロトコールにより、発現され、分泌され
た異種タンパク質が、細胞培養物の上清液から反復して単離され得る。感染され
た293S細胞生成プロトコールにおいては、分泌されていないタンパク質が効果的
に得られる。

【０１２８】 当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、たとえば
馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、ハムスター、テンジュクネズミ
及びラット並びにトランスジェニック羊、ウシ、ヤギ、又はブタを接種すること
から生成され得る。抗体はまた、酵母及び菌類において、変性された形で、及び
哺乳類及び昆虫細胞においても発現され得る。ZGCL-1ポリペプチド又はそのフラ
グメントは、動物を接種し、又は免疫応答を誘発するために抗原（免疫原）とし
て作用する。適切な抗原は、配列番号２のアミノ酸残基１−４７９又は連続した
９−４７９のアミノ酸残基フラグメントからの配列番号２によりコードされるZG
CL-1ポリペプチドを包含する。ZGCL-1ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、
たとえばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全ア
ジュバントの使用により高められ得る。

【０１２９】 免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチド又
は親和性標識との融合体ポリペプチド、たとえばZGCL-1 又はその一部の融合体
を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る
。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化
のために、高分子キャリヤー（たとえば、カサガイ ヘモシアニン（KLH ）、ウ
シ血清アルブミン（BSA ）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され
得る。抗原として使用するための好ましいペプチドは、親水性ペプチド、たとえ
ば疎水性プロットから当業者により予測されるペプチドである。たとえば、Hopp
and Woods (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-8, 1981 ) 及びKyte and Doo
little (J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982) を参照のこと。

【０１３０】 本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性
精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント
、たとえばF(ab')₂ 及びFab タンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子
的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、たとえばキメラ抗体、
Fvフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及び
ポリペプチドもまた包含される。非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒ
トCDR のみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込む
ことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそ
れらのドメインを“おおう（cloaking）”ことによって；ここで結果物は“張り
合わされた”抗体である）、ヒト化され得る。

【０１３１】 多くの場合、ヒト化抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域
フレームワークドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト化抗体を
通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反
応の可能性が低められる。本明細書において有用な抗体を生成し又は選択するた
めの他の技法は、ZGCL−１タンパク質又はペプチドへのリンパ球インビトロ暴露
、及びファージ又は類似するベクターにおける抗原表示ライブラリーの選択（た
とえば、固定された又はラベルされたZGCL−１タンパク質又はペプチドの作用を
通して）を包含する。

【０１３２】 抗体は、それらがZGCL-1 ポリペプチドに結合する場合、10⁶M^-1又はそれ以上
の、好ましくは10⁷M^-1又はそれ以上の、好ましくは10⁸M^-1又はそれ以上の、及び
最も好ましくは10⁹M^-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を伴って、特異的に結合
するものとして定義される。抗体の結合親和性は、当業者により（たとえばScat
chard 分析により）容易に決定され得る。

【０１３３】 本発明において有用な抗体を生成し、又選択するためのもう１つの技法は、ZG
CL-1 タンパク質又はペピチドへのリンパ球のインビトロ暴露、及びファージ又
は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーの選択（たとえば、固定され
、又はラベルされたZGCL-1 タンパク質又はペプチドの使用を通して）を包含す
る。

【０１３４】 可能性あるZGCL-1 ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコード
する遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、たとえばＥ．コリ上に表示
されるランダム・ペプチド・ライブラリーをスクリーニングすることによって得
られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、たと
えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる
。それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチド
であり得る既知の標的物、たとえばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分
子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするため
に使用され得る。

【０１３５】 そのようなランダムペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニン
グするための技法は、当業界において知られており（Ladner など、アメリカ特
許第5,223,409 号; Ladner など、アメリカ特許第4,946,778 号；Ladner など
、アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など、アメリカ特許第5,571,698 号
）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをス
クリーニングするためのキットは、たとえばClontech (Palo Alto, CA), Invitr
ogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及び
Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。

【０１３６】 ランダムペプチド表示ライブラリーは、ZGCL-1 に結合するタンパク質を同定
するために、本明細書に開示されるZGCL-1 配列を用いてスクリーンされ得る。
ZGCL-1 ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合タンパク質は、細胞を標識
するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得
る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接
的に接合され得る。それらの結合タンパク質はまた、分析方法に、たとえば発現
ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するためにも使用され得る
。

【０１３７】 結合タンパック質はまた、ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本
的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性ポリペプチドを検出し又は定量化す
るために、診断アッセイにも使用され得る。それらの結合タンパク質はまた、ZG
CL-1 結合及びシグナル トランスダクションをインビボで阻止するために、ZG
CL-1“アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−ZGCL-1 結合
タンパク質は、ZGCL-1 介在性活性を阻止するために有用である。

【０１３８】 当業者に知られている種々ノアッセイが、ZGCL-1 タンパク質又はペプチドに
特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、An
tibodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbo
r Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代
表的な例は次のものを包含する: 同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラ
ジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ELISA ）、ドットブロット又は
ウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ。及びサンドイッチアッ
セイ。さらに、野生型対変異体のZGCL-1 タンパク質又はペプチドに結合する抗
体がスクリーンされ得る。

【０１３９】 ZGCL-1に対する抗体及び結合タンパク質は、ZGCL-1を発現する細胞を標識する
ために；アフィニティー精製によりZGCL-1を単離するために；ZGCL-1ポリペプチ
ドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学のマー
カーとして可溶性ZGCL-1を検出し又は定量化するために；FACS を使用する分析
方法において；発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗- インディオ
タイプ抗体を生成するために；及びインビトロでZGCL-1介在性活性を阻止するた
めの中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。

【０１４０】 適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビ
ター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間
接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗
−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた
、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合さ
れ得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る
。さらに、ZGCL-1又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、たとえば当
業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変
性されたZGCL-1又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得
る。

【０１４１】 それらの抗体及び結合タンパク質はまた、卵の受精を妨げるための避妊薬とし
ても有用である。そのような抗体は、精子形成及び／又は精子活性化の成分を阻
害することによってアンタゴニストとして作用する。そのような抗体“アンタゴ
ニスト”は、ヒト及び動物、特に家畜における避妊のために使用され得る。たと
えば、抗−ZGCL-1免疫化は、動物において手術形の避妊（たとえば卵巣摘出及び
去勢）の代わりに使用され、そして所望には、それらの動物の未来の繁殖の可能
性を可能にするであろう。

【０１４２】 ZGCL-1リガンドポリペプチドは、ZGCL-1に結合する遺伝子を固定し、そして特
徴づけるために使用され得る。本発明のタンパク質及びペプチドがカラム上に固
定され、そして膜調製物がそのカラム上に通される（Immobilized Affinity Lig
and Techniques, Hermanson など，eds., Academic Press, San Diego, CA, 199
2, pp.195-202 ）。タンパク質及びペプチドはまた、放射性ラベルされ（Method
s in Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher,
ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737）、又は光親和性ラベルされ（Br
unner など., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993 及びFedan など., Bioch
em. Pharnacol. 33: 1176-1180, 1984）、そして特定の細胞−表面タンパク質が
同定され得る。

【０１４３】 本発明書に開示されるZGCL-1ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは治療
剤として有用である。本発明のポリペプチドは、精巣細胞の増殖又は分化を刺激
するために使用される。増殖及び分化は、培養された精巣細胞を用いて、又は本
発明の分子を適切な動物モデルにインビボ投与することによって測定され得る。
培養された精巣細胞は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn D
rive, Rockville, MD から入手できる、イルカDB1. Tes細胞（CRL-6258）；マウ
スGC-1 spg細胞（CRL- 2053 ）; TM3 細胞（CRL-1714）；TM4 細胞（CRL-1715）
；及びブタＳＴ細胞（CRL-1746）を包含する。

【０１４４】 最初に同定されたＥＳＴは、ヒト心臓腫瘍ライブラリーから誘導された。ZGCL
-1タンパク質及びポリペプチドは、心血管組織の成長、内皮細胞及び心筋細胞の
増殖及び分化において役割を演じることができる。増殖は、培養された心細胞を
用いて、又は本発明の分子を適切な動物モデルに投与することによって、インビ
ボで測定され得る。培養された細胞は、一次培養物からの心線維芽細胞、心筋細
胞、骨格筋細胞、ヒト臍帯内皮細胞を包含する。確立された細胞系は次のものを
包含する：NIH3T 線維芽細胞（ATCC No.CRL- 1658 ）、CHH-サケ心細胞（ATCC N
o.CRL-1680）、H9c2ラット心筋芽細胞（ATCC No.CRL-1446）、Shionogi 乳癌細
胞（Tanaka など., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 8928-89, 1992 ）及びLNCap.
FGC 腺癌細胞（ATCC No.CRL-1740）。

【０１４５】 細胞増殖又は分化を測定するアッセイは、当業者において良く知られている。
たとえば、増殖を測定するアッセイは、次のようなアッセイを包含する：中性赤
色素に対する化学感受性（Caranaugh など，Investigational New Drags 8: 347
-354, 1990; 引用により本明細書に組み込まれる）、放射性ラベルされたヌクレ
オチドの組み込み（CooK など, Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989; 引用に
より本明細書に組み込まれる）、増殖する細胞のＤＮＡへの５- ブロモー２'-デ
オキシウリジン（BrdU）の組み込み（Porstmann など, J. Immunol. Methods 82
: 169-179, 1985;引用により本明細書に組み込まれる）、及びテトラゾリウム塩
の使用（Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley など, Cancer
Res. 48: 589-601, 198; Marshallなど, Growth Reg. 5: 69-84, 1995; 及びSc
udieroなど, Cancer Res. 48: 4827-4833, 1988;すべては引用により本明書に組
み込まれる）。

【０１４６】 分化を測定するアッセイは、たとえば組織の段階−特異的発現に関連する細胞
表面マーカー、酵素活性、官能的活性、又は形態変化の測定を包含する（Watt,
FASEB 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57 : 63-75, 1994; Raes,
Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 1i61-171, 1989; すべては引
用により本明細書に組み込まれる）。

【０１４７】 心臓新生又は過形成を評価するためのインビボ アッセイは、本発明の分子に
よる新生児及び成熟ラットの処理を包含する。動物心臓機能は、左側心室機能を
決定するために、心拍数、血圧及び心臓出力として測定される。心臓の改良を評
価するための死後方法は、次のものをほうがんする：高められた心臓重量、核／
細胞質体積、細胞質アクチン レベルに対する増殖する細胞核抗原（ＰＣＮＡ）
を決定するためへの心臓組織断片の染色（Quaini など, Circulation Res, 75:
1050-63, 1994及びReiss など, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 8630-5, 1996 ）
。

【０１４８】 精巣に対するZGCL-1ポリペプチドの効果を評価するためのインビボアッセイは
、当業界において良く知られている。たとえば、化合物は特定の期間、腹腔内注
射され得る。処理期間の後、動物は殺害され、そして精巣が除去され、そして計
量される。精巣が均質化されそして精子頭の計数が行われる（Meistrich など,
Exp. Cell Res. 99: 72-8, 1976 ）。

【０１４９】 精子形成は連続的過程であり、そして究極的には、生殖細胞が精子に成熟する
輸精管において生じる。成熟工程に影響を及ぼす精巣- 特異的因子は、精子と接
触するSertoli 細胞から直接的に生じ、又はパラクリン又は内分泌因子であり
得る。輸精管外で生成される多くの分子は、輸精管内のSertoli 細胞により発現
される輸送及び結合タンパク質により精子細胞微小環境中に輸送される。

【０１５０】 細胞バリヤーを通過し、そして精子細胞微小環境に入るパラクリン因子は、Le
ydig 細胞から分泌される分子を含む。Leydig 細胞は、輸精管間に見出される
間隙空間に位置し、そして成熟工程において重要な役割を演じると思われるいく
つかの因子、たとえばステトステロン、Leysig 因子、ZGCL-1、インヒビン及び
アクチビンを生成する。それらの及び他の因子の発現は、精子形成サイクルにお
ける特定段階に対して特異的であり得る。

【０１５１】 ZGCL-1発現の組織特異性は、精子形成における役割を示し、そしてこの特異性
の観点においては、アゴニスト及びアンタゴニストはインビトロ及びインビボ適
用において莫大な可能性を有する。ZGCL-1タンパク質及びポリペプチド、及びZG
CL-1アゴニストは、インビトロ及びインビボにおいて標的細胞の増殖及び進化を
刺激するのに有用である。たとえば、アゴニスト化合物は、特定の細胞培養培地
の成分として有用であり、そして細胞培養物に通常使用される血清を置換するた
めに、単独で又はサイトカイン及びホルモンと組み合わせて使用され得る。

【０１５２】 従って、アゴニストは、培養物における精巣―由来の細胞の増殖及び/ 又は進
化を特異的に促進することにおいて有用であるアゴニスト化合物は、ZGCL-1−調
節された遺伝子発現のアップ−レギュレーションを通して細胞分化、増殖又は進
化に影響を及ぼすために使用され得る。アゴニスト及びアンタゴニストまたは、
精子形成及び不妊症の研究において有用であることもわかっている。アゴニスト
は、ZGCL-1転写因子にＤＮＡの部位を特徴ずけるための研究試薬として有用であ
る。アゴニストはまた、ZGCL-1介在性転写を調節するためにも有用である。たと
えば、ZGCL-1アンタゴニストは、男性用避妊薬として有用である。

【０１５３】 ZGCL-1ポリペプチド及びZGCL-1アゴニストは、不妊症を処理するために有用な
治療薬である。従って、本発明のタンパク質は、ヒト及び動物において、助力生
殖の間、受精の増強に利用され得る。そのような助力生殖方法は、当業界におい
て知られており、そして人工授精、インビトロ受精、胚移行及び配偶子卵管移行
を包含する。そのような方法は、天然の受胎を妨げる生理学的又は代謝的障害を
有する男性及び女性を助けるために有用である。そのような方法はまた、他の理
由のために天然においての受胎をできないか又は所望しない女性によっても使用
され得る。

【０１５４】 そのような方法はまた、動物繁殖プログラムにおいて、たとえば家畜、動物、
絶滅の危機にある種又は競争馬繁殖のためにも使用され、そしてトランスジェニ
ック動物の創造のための方法として使用され得る。本発明のタンパク質は、卵の
受精の前、ドナー精子細胞の数を増やすために添加され得る。それは、成功した
受精の見込みを高めるそのような工程の間、精子の数を高めるために好都合であ
る。本発明は、助力された生殖の間、受精を高めるための方法を提供し、ここで
哺乳類ZGCL-1ポリペプチドが、卵の受精の前、又は卵―精子混合の前、精子と共
に組み合わされる。1 つ態様においては、助力された生殖は人口受精である。

【０１５５】 もう1 つの様態においては、助力された生殖は、インビトロ受精である。 本発明のポリペプチドは、低温保存された精子の生存率を高めるために、特に
融解に基づいて、生存する精子の数を高めるために使用され得る。そのような低
温保存された精子は、助力された生殖の方法とともに使用され得る。本発明は、
卵の受精への使用のための低温保存された精子の生存率を高めるための方法を提
供し、個々で哺乳類ZGCL-1ポリペプチドが、受精の前、又は卵−精子混合の前、
添加される。

【０１５６】 ZGCL-1ポリペプチド及び親和性標識（たとえば、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ親和性標識、
FLAG標識、マルトース−結合タンパク質、免疫グロブリンドメイン）の融合体は
、インビトロ受精工程への使用のために特定の成長段階での精子を選択するため
に使用され得る。精子の段階的分類は、所望する精子の数および型を増強し、そ
れにより成功した受精の見込みを高める。

【０１５７】 インビボにおいて、ZGCL-1及びZGCL-1アゴニストは、不妊症、特に男性不妊症
の処理に適用される。生殖年齢の男性の５〜６％が不妊症であり、そして主な原
因が異常な精子数であることが予測される。ZGCL-1ポリペプチド及びタンパク質
は、精子数を増大するために投与され得る。精巣特異的受容体をコードするポリ
ヌクレオチドにより連結されたZGCL-1ポリペプチド又はタンパク質をコードポリ
ヌクレオチドを含む発現ベクターが、精巣組織への供給及びそこでの発現のため
に投与され得る。

【０１５８】 ZGCL-1はまた、ZGCL-1ポリペプチド及びタンパク質の摂取が精巣においてのみ
生じるように、精巣- 特異的受容体によりパッケージされ得る。他方では、ZGCL
-1タンパク質又はポリペプチドは、精巣中に直接的に注入され得る。本発明は不
妊症の処理方法を提供し、ここでは、哺乳類ZGCL-1ポリペプチドが精子数を増大
するために投与される。関連する態様においては、投与は精巣組織において行わ
れる。

【０１５９】 本明細書において使用される場合、アンタゴニストは、ZGCL-1ポリペプチドに
結合するか、又は他方では、ZGCL-1ポリペプチドが結合する遺伝子に結合する分
子であり、それにより、ZGCL-1の機能を阻害し、又は排除する。そのようなZGCL
-1アンタゴニストは、抗体；結合タンパク質；ZGCL-1ポリペプチド又は、関連す
る遺伝子のいずれかに結合するオリゴヌクレオチド；特定遺伝子を結合するが、
しかし転写をもたらさない能力を保持するZGCL-1ポリペプチドの天然又は合成類
似体を包含する。そのような類似体は、ペプチド又はペプチド- 様化合物である
。ZGCL-1ポリペプチドの受容体に結合し、そして転写を妨げる天然又は合成の小
分子はまた、アンタゴニストとして見なされる。

【０１６０】 それらのZGCL-1アンタゴニストは、成功した生殖に誘導する工程を選択的に遮
断することによって受精能力及び避妊に関連する方法において有用な材である。
ZGCL-1アンタゴニストは、精子形成及び精子活性化を阻害するために有用であろ
う。そのようなZGCL-1アンタゴニストは、ヒト及び動物、特に家畜及びペット動
物において避妊のために使用され得、ここでそれらは、究極的には、卵の成功し
た受精を妨げるよう作用する。そのようなアンタゴニストは、たとえば避妊の手
術形（たとえば卵巣切除及び去勢）の代わりに使用され得、そして所望には、ア
ンタゴニストの投与を中断することによって、処理された動物の未来での繁殖の
可能性を可能にするであろう。

【０１６１】 ZGCL-1アンタゴニストは、プロゲステロン アンタゴニストに類似して有用で
あることがわかっている。結合を弱めるが、しかし活性化しない抗プロゲステロ
ンは、プロゲステロンの作用を効果的に阻止し、そして避妊薬として使用される
。本発明は、上記のような哺乳類ZGCL-1ポリペプチドのアンタゴニストが卵の受
精を妨げるために雄受容体に投与される避妊方法を提供する。1 つの態様におい
ては、アンタゴニストは、抗-ZGCL-1 結合タンパク質である。関連する態様にお
いては、アンタゴニストは抗−ZGCL-1−抗体である。

【０１６２】 本発明はまた、単離され、そして精製されたZGCL-1ポリヌクレオチド プロー
ブを提供する。そのようなポリヌクレオチド プローブは、ＲＮＡ又はＤＮＡで
ある得る。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのいずれかであり得る。ポリヌ
クレオチド プローブは一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、一般的には合成オ
リゴヌクレオチドであるが、しかしクローン化されたｃＤＮＡ又はゲノム配列か
ら生成され得、そして一般的には、少なくとも16個のヌクレオチド、しばしば１
７個〜２５個又はそれ以上のヌクレオチド、時々、４０〜６０個のヌクレオチド
、及び多くの場合、実質的な部分、ドメイン又はさらに、完全なZGCL-1遺伝子又
はｃＤＮＡさえも含んで成る。

【０１６３】 本発明の合成オリゴヌクレオチドは、代表的なZGCL-1 ＤＮＡ配列（配列番号
１）又はその補体に対して少なくとも８０％の同一性を有する。プローブを構成
する好ましい領域は、５' 及び/ 又は３' コード配列、ＤＮＡ結合ドメイン、親
和性ドメイン、シグナル配列及び同様のものを含む。ポリヌクレオチドプローブ
を開発するための技法及びハイブリダイゼーション技法は、当業界において知ら
れており、たとえばAusubel など., eds., Current Protocols in Molecular Bi
ology, John Wiley and Sons, Ins., NY, 1991 を参照のこと。

【０１６４】 プローブとしての使用のためには、分子は、検出できるシグナルを供給するた
めに、たとえば酵素、ビオチン、放射性核種、蛍光団、化学発光体、常磁性粒子
及び多くの源、たとえばMolecular Probes, Inc., Eugene, OR, 及びAmersham C
orp., Arlington Heights, IL から市販されている同様のものにより、当業界に
おいて良く知られている技法を用いてラベルされ得る。

【０１６５】 そのようなプローブはまた、サンプル中のZGCL-1遺伝子又はｍＲＮＡ転写体の
存在を検出し、又はその量を定量化するためにハイブリダイゼーションにおいて
使用され得る。ZGCL-1ポリヌクレオチド プローブは、蛍光現場ハイブリダイゼ
ーション（FISH）又は免疫組織化学のような技法を用いて、診断目的のためにＤ
ＮＡ又はＲＮＡ標的物にハイブリダイズするために使用され得る。ポリヌクレオ
チド プローブは、ZGCL-1−様タンパク質をコードする遺伝子を同定するために
使用され得る。たとえば、ZGCL-1ポリヌクレオチドは、他の新規転写因子を同定
するためにＰＣＲ反応においてプライマー及び/ 又は鋳型として使用され得る。

【０１６６】 そのようなプローブはまた、新規転写因子をコードする関連する配列のための
ライブラリーをスクリーンするためにも使用され得る。そのようなスクリーニン
グは、プローブ配列に対して、実質的に相同であるが、しかし完全な相同性を必
要としない配列の同定を可能にする低い緊縮条件下で実施される。そのような方
法及び条件は、当業界において良く知られており、たとえば、Sambrook など.,
Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Ha
rbor, NY,1989 を参照のこと。そのような低い緊縮条件は、４２℃以下のハイブ
リダイゼーション温度、５０％以下のホルムアルデヒド濃度、及び中位〜低い濃
度の塩を包含する。

【０１６７】 ライブラリーは、ゲノムＤＮＡ又はＤＮＡから製造され得る。ポリヌクレオチ
ド プローブはまた、サザン、ノザン、又はスロット ブロット、コロニー及び
プラーク ハイブリダイゼーション及び現場ハイブリダイゼーションのためにも
有用である。スクリーニングシステムにおいては、感度、又は低コピー数の標的
物の検出を高める、異なったZGCL-1ポリペプチド プローブの混合物が調製され
得る。 ZGCL-1ポリペプチドは、診断システムに使用され得る。ZGCL-1に対して
特異的に結合する抗体又は他の剤は、循環ポリペプチドの存在を検出するために
使用され得る。

【０１６８】 そのような検出方法は、当業界において良く知られており、そしてたとえば酵
素結合された免疫吸着アッセイ（ELISA ）及びラジオイムノアッセイを包含する
。免疫組織科学的にラベルされた抗体が、生物学的サンプルにおけるZGCL-1を検
出するために使用され得る。ZGCL-1レベルはまた、RT-PCRのような方法によりモ
ニターされ得、ここでZGCL-1 ｍＲＮＡが検出され、そして定量化され得る。

【０１６９】 そのような方法は、ポリペプチドレベルをモニターし、そして定量化するため
の診断手段として使用され得る。そのような検出方法に由来する情報は、種々の
状態又は疾病における ZGCL-1ポリペプチドの有意性の洞察力、及び変更された
レベルのZGCL-1が有意である状態又は疾病についての診断方法を提供する。変更
されたレベルのZGCL-1リガンド ポリペプチドは、癌、及び心臓及び生殖疾患を
包含する病理学的状態の表示である得る。

【０１７０】 本発明はまた、診断用途に使用できるであろう試薬を提供する。たとえば、ZG
CL-1 ＤＮＡ又はＲＮＡを含んで成るプローブ、又はその配列は、ZGCL-1遺伝子
が染色体５上に存在するかどうか、又は突然変異が生じたかどうかを決定するた
めに使用され得る。ZGCL-1遺伝子座での検出できる染色体異常型は、異数性、遺
伝子コピー数変化、挿入、欠失、制限部位変更及び電位を包含するが、但しそれ
だけには限定されない。

【０１７１】 一般的に、それらの診断方法は、（ａ）患者から遺伝的サンプルを獲得し；（
ｂ）前記遺伝的サンプルと、上記で開示されたようなポリヌクレオチドプローブ
又はプライマーとを、前記ポリヌクレオチドが第１反応生成物を生成するために
、相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう条件下で、イン
キュベートし；そして（ｃ）前記第１反応生成物と対照反応生成物とを比較する
段階を含んで成る。第１反応生成物と対照反応生成物との間の差異は、患者にお
ける遺伝子異常性の表示である。本発明に使用するための遺伝的サンプルは、ゲ
ノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，及びＲＮＡを包含する。

【０１７２】 ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、そ
して配列番号１の一部、配列番号１の補体、又はそれらのＲＮＡ相同物を含んで
成るであろう。これに関する適切なアッセイ方法は、当業界において知られてい
る分子遺伝学技法、たとえば制限フラグメント長さ多型現象（RFLP）分析、ＰＣ
Ｒ技法を用いる短いタンデム反復体（ＳＴＲ）分析、連結鎖反応（Barany, PCR
Methods and Applications 1; 5-16, 1991）、リボヌクレオチド保護アッセイ、
及び当業界において知られている他の遺伝子連鎖分析技法（Sambrook など、前
記；Ausubel ., 前記；Marian, Chest : 255-65, 1995）を包含する。

【０１７３】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ（たとえば、Ausubel など., 前記, ch. 4 ）
は、患者のＲＮＡサンプルへのＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションを包含
し、この後、反応生成物（RNA-RNA ハイブリッド）がＲＮアーゼに暴露される。
ＲＮＡのハイブリダイズされた領域が、消化から保護される。ＲＣＲアッセイに
おいては、患者の遺伝的サンプルが、1 対のポリヌクレオチド プライマーと共
にインキュベートされ、そしてプライマー間の領域が増幅され、そして回収され
る。回収された生成物のサイズ又は量の変化が、患者における突然変異の表示で
ある。使用され得るもう１つのＰＣＲに基づく技法は、単鎖コンホメ- ション多
型現象（ＳＳＣＰ）分析（Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 19
91）である。

【０１７４】 本発明はまた、核酸に基づく治療処理を提供する。哺乳類が突然変異誘発され
たZGCL-1遺伝子を有するか、又はそれを欠いている場合、ZGCL-1遺伝子が哺乳類
の細胞中に導入され得る。1 つの態様においては、ZGCL-1ポリペプチドをコード
する遺伝子がウィルス ベクターにおいてインビボで導入される。そのようなベ
クターは、弱毒化された又は欠陥ＤＮＡウィルス、たとえばヘルペス単純ウィル
ス（ＨＳＶ）、乳頭種ウィルス、エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）、ア
デノウィルス、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）及び同様のものを包含するが、但
しそれらだけには限定されない。

【０１７５】 ウィルス遺伝子を完全に又はほとんど完全に欠いている欠陥ウィルスが好まし
い。欠陥ウィルスは、細胞中への導入の後、感染性ではない。欠陥ウィルスベク
ターの使用は、ベクターが他の細胞を感染することを心配しないで、特定の局在
化された領域における細胞への投与を可能にする。特定のベクターの例は、次の
ものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：欠陥ヘルペスウィルス１
（HSV1）ベクター（Kaplitt など., Molc. Cell. Neurosci. 2: 320-30, 1991）
、弱毒化されたアデノウィルス ベクター、たとえばStratford-Perricaudat な
ど. (J. Clin. Invest. 90: 626-30, 1992) により記載されるベクター、及び欠
陥アデノ−関連ウィルスベクター（Samulski など., J. Virol. 61: 3096-101,
1987; Samulski など., J. Virol. 63: 3822-28,1989 ）。

【０１７６】 もう1 つの態様においては、遺伝子は、次の文献に記載のようにして、レトロ
ウィルスベクターに導入され得る：Anderson など、アメリカ特許第5,399,346
号；Mann など，Cell 33: 153, 1983; Temin など、アメリカ特許第4,650,76
4 号；Temin など、アメリカ特許第4,980,289 号；Markowitz など, J. Virol.
62: 1120, 1988; Temin など、アメリカ特許第5,124,263 号；Dougherty など
, WIPO Publication WO95/07358 号；及びkuo など, Blood 82: 845-52, 1993。

【０１７７】 他方では、ベクターは、リポソームを用いてのインビボ リポフェクションに
より導入され得る。合成カチオン脂質が、マーカーをコードする遺伝子のインビ
ボ トランスフェクションのためのリポソームを調製するために使用され得る（
Felgner など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-17, 1987; 及びMackey
など, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8027-31, 1988）。インビボで特定の器
官中に外因遺伝子を導入するためへのリポフェクションの使用は、一定の実際的
な利点を有する。

【０１７８】 特定細胞へのリポソームの分子標的化は、1 つの領域の利点を表す。特定細胞
へのトランスフェクションの方向づけが1 つの領域の利点を表すことは明白であ
る。特定細胞型へのトランスフェクションの方向づけが、細胞異質性を有する組
織、たとえば膵臓、肝臓、腎臓及び脳において特に好都合であることは明白であ
る。脂質は、標的化のために他の分子に科学的に得られる。標的化されたペプチ
ド、たとえばホルモン又は神経伝達物質、及びタンパク質、たとえば抗体又は非
ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。

【０１７９】 身体から細胞を除去し、そして裸ＤＮＡプラスミドとしてベクターを導入し、
そして次に、身体中に形質転換された細胞を再移植することは可能である。遺伝
子治療のための裸ＤＮＡベクターが、所望する宿主細胞中に、当業界において知
られている方法、たとえばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、DEAEデキストラン、
リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポータ
ーの使用により導入され得る（たとえば、Wuなど, J. Biol. Chem. 267: 963-7,
1992; Wu など, J. Biol. Chem. 263: 14621-24, 1988）。

【０１８０】 ZGCL-1ポリペプチドはまた、医薬使用のために企画される。医薬的有効量の本
発明のZGCL-1ポリペプチド、アゴニスト又はZGCL-1アンタゴニストは、非経口、
経口、鼻腔内、直腸、局所、経皮投与又は同様のものにより、従来の方法に従っ
て配合され得る。配合物は、さらに、１又は複数の希釈剤、充填剤、乳化剤、保
存剤、緩衝剤、腑形剤及び同様のものを含むことができ、そして液体、粉末、エ
マルジョン、坐剤、リポソーム、経皮用パッチ及び錠剤のような形で供給される
。

【０１８１】 多くのバイオポリマー（生物学的基材システム）のいずれかを含む遅延又は延
長された開放性システム、リポソームを用いるシステム、及びポリマー供給シス
テムがまた、ZGCL-1ポリペプチド又はアンタゴニストの連続した又は長期源を提
供するために本明細書に記載される組成物と共に使用され得る。そのような遅延
システムは、経口、局所及び非経口使用のために、配合物に適用でき得る。

【０１８２】 用語“医薬的に許容できるキャリヤー”とは、活性成分の生物学的活性の有効
性を妨害せず、そして宿主又は患者に対して毒性ではないキャリヤー媒体を言及
する。当業者は、本発明の化合物を、適切な態様で、及び許容された実施、たと
えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro (ed.), Mack Publishing
Co., Easton, PA, 1990 に開示されるそれらの実施に従って配合することができ
る。

【０１８３】 本明細書において使用される場合、ZGCL-1ポリペプチド、アゴニスト又はアン
タゴニストの“医薬的に有効な量”は、所望する生物学的結果を誘導するのに十
分な量である。その結果は、疾病の徴候、症状又は原因の解決、又は生物学的シ
ステムのいづれか他の所望する変異であり得る。たとえば、有効量のZGCL-1ポリ
ペプチドは、臨床医又は他の資格のある観察者により示されるように、徴候の主
観的軽減又は客観的に同定できる改良点のいずれかを提供する量のポリペプチド
である。たとえば、そのような有効量のZGCL-1ポリペプチドは、精子数の上昇を
もたらす。

【０１８４】 有効量のZGCL-1ポリペプチドは、処理されるべく疾病又は徴候に依存して、広
く変化することができる。投与されるべきポリペプチドの量、及び配合物におけ
るその濃度は、選択されるビークル、投与の経路、特定のポリペプチドの能力、
患者の臨床学的状態、副作用、及び配合物における化合物の安定性に依存する。
従って、臨床医は、問題の患者又は類似する患者による臨床実験に依存して、配
合物における適切な濃度、及び投与される配合物の量を包含する適切な調製物を
用いるであろう。

【０１８５】 そのような量は、患者の処理される特定の状態、年齢、体重、及び一般的な健
康、及び当業者に明らかな他の要因に一部、依存するであろう。典型的には、用
量は、対象ｋｇ当たり0.1 〜100mg の範囲であろう。特定の化合物のための用量
は、実験動物に基づく研究と組み合わせて、インビトロ又はエクソビボ研究から
決定され得る。インビトロ又はエクソビボで有効であることが見出されている化
合物の濃度が動物研究のためのガイドを提供し、ここで用量が、作用の部位での
類似する濃度を提供するよう計算される。

【０１８６】 本発明を実施するために使用される本発明の化合物の投与量は、所望する効果
をもたらすのに効果的な投与量を包含する。個々の患者のために効果的な適切な
投与量の評価は、医者又は他の適切なヘルスケア- 実施者の範囲内である。ガイ
ドとして、臨床医は、Physician's Desk Reference, 48th Edition, Medical Ec
onomics Data Production Co., Montvale, New Jersey 07645-1742 (1994) から
の装置を、便利には、入手して使用することができる。

【０１８７】 好ましくは、本発明の組成物は、単位投与量形での投与のために提供される。
用語“単位投与形”とは、ヒト対象及び動物のために単位投与されるのに適切な
物理学的に別個の単位を言及し、個々の単位は必要とされる医薬的希釈剤、キャ
リヤー又はビークルと共に、所望する医薬的効果を生成するために計算された、
予定された量の活性材料を含む。

【０１８８】 単位投与形の例は、バイアル、アンプル、錠剤、カプレット、ピル、粉末、顆
粒、眼薬、経口又は眼内溶液又は懸濁液、眼内軟膏、及び水中油型エマルジョン
を包含する。調製、配合及び投与の手段は、当業者に知られており、一般的には
、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Pu
blishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995 を参照のこと。 本発明は、次の非限定的例により、さらに示される。

【０１８９】 例 例１．ZGCL-1の同定 本発明の新規ZGCL-1リガンド- コードのポリヌクレオチド及びポリペプチドを
、始め、ＥＳＴデータベースを調査することによって同定した。ヒト心臓腫瘍ラ
イブラリーからの最初のＥＳＴを見出した。ヒトＥＳＴに対してヌクレオチド
レベルで８７％同一である、胎児マウスからの第２ＥＳＴを同定した。この情報
を用いて、オリゴヌクレオチド プライマーZC12991 （配列番号５）ZC12992 （
配列番号６）を、ＥＳＴ配列に適合し、そしてプールされたヒト精巣ライブラリ
ーをＰＣＲを用いてスクリーンした。

【０１９０】 ８０の反応を設定し、個々は2.5 μl の10×PCR 反応緩衝液（Boehringer Man
nheim, Indianapolis, IN ）、２μl のdNTP混合物（それぞれ２．５ｍＭ，Perk
inn-Elmer, Foster City, CA）、0.5 μl のセンスプライマー、ZC12,992（20p
モル/ μl のアンチセンス プライマー、ZC12,991（20p モル/ μl ）2.5 μl
のRediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)、0.5 μl のAmpliTaq
(tm) (Perkinn-Elmer Cetus, Norwalk, CT) 、個々の精巣ライブラリー プール
からの約２〜４ngのＤＮＡ、及び２５μl の合計体積のための蒸留水から成る。
反応物を、等量の鉱油により被覆し、そして密封した。

【０１９１】 ＰＣＲサイクラー条件は次の通りであった：９４℃で２０秒間の変性、５５℃
で３０秒間のアニーリング及び７２℃で３０秒間の延長の初期３５サイクル、続
いて、７２℃で１０分間の延長の最終１サイクル。ＰＣＲ生成物を、１％アガロ
ースゲル上で分析し、そして予測される２００bpのＰＣＲ生成物を付与する３種
のプールをＬＢプレート上に再プレートした。コロニーを、遺伝子特異的プライ
マーを用いて、ＰＣＲによりスクリーンした。

【０１９２】 ４種の個々のコロニーを、個々のプールから取り、そして次の成分を含む管に
おいて、その上のコロニーと共につま楊枝をかき混ぜることによって、微小遠心
分離管に添加した：18.5μl の水、2.5 μl の１０×Taq ポリメラーゼ緩衝液（
Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN ）、２μl の10mMのdNTP（Perkin Elm
er）、0.75μl のZC12991 （配列番号５）（20p モル/ μl ）、0.75mlのZC1299
2 （配列番号６）（２０モル/ μl ）、および０．５μl のTaq ポリメラーゼ。

【０１９３】 増幅反応物を、９４℃で１分間インキュベートし、細菌を溶解し、そして血漿
ＤＮＡを暴露し、次に、９４℃で２０分間；５５℃で３０分間；７２℃で３０分
間、２５サイクル行い、クローン化された挿入体を増幅し、続いて７２℃で１０
分間、延長した。生成物を、１％アガロースゲル上での電気泳動により分析した
。単一の200bp の生成物を付与するクローンを陽性として同定し、そして配列を
配列分析により確かめた。

【０１９４】 １つのクローン83.1.3を用いて、その対応するｃＤＮＡを同定した。クローン
を、QIAwell 8 プラスミド キット（Qiagen, Inc., Chatsworth, CA）を用いて
、製造業者の説明書に従って、増幅し、ＬＢ＋５０mg/ml のアンピシクリン中、
５ml の一晩培養物を調整した。鋳型を、製造業者の説明書に従って、ABI PRIS
M(tm) Dye Terminatur Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkinn-Elmer
Corp.) を用いて、Applied Biosystems(tm) モデル373DNA配列決定機（Perkin
-Elmer Cetus, Norwalk, CT ）上で配列決定した。

【０１９５】 オリゴヌクレオチドZC694 （配列番号７）、ZC2681（配列番号８）、ZC12991
（配列番号５）、ZC12992 （配列番号６）、ZC14122 （配列番号９）、ZC14183
（配列番号１０）、ZC14184 （配列番号１１）、ZC14237 （配列番号１２）、ZC
14238 （配列番号１３）、ZC14284 （配列番号１４）及びZC14347 （配列番号１
５）を用いて、クローンから配列決定した。配列決定反応を、Hybaid OmniGene
Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY) におい
て実施した。Sequencher(tm) 3.1 配列分析ソフトウェア（Gene Codes Corpora
tion, Ann Arbor, MI ） を、データ分析のために使用した。その得られる１，
４６７bp の配列は、最初に同定されたＥＳＴ配列を含む配列番号１に開示され
る。

【０１９６】 例２．組織分布 Human Multiple Tissue Northern Blots (MTN I, MTN II, 及びMTN III;Clon
tech ) を、ＥＳＴの配列を含む、約200bp （配列番号１６）のＰＣＲ由来のプ
ローブによりプローブした。プローブを、オリゴヌクレオチド プライマー ZC
12991 （配列番号５）及びZC12992 （配列番号６）を用いて、ヒト心臓Marathon
(tm)-ready cDNAライブラリーから増幅した。Marathon(tm)-ready cDNAライブ
ラリーを、ヒト心臓ポリA+ RNA（Clontech）を用いて、製造業者の説明書（Mara
thon(tm) cDNA Amplification Kit; Clontech, Palo Alto, CA ）に従って調製
した。

【０１９７】 プローブを、次の通りに、ポリメラーゼ鎖反応において増幅した：９４℃で２
０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で３０秒間の３５サイクル、続く７２℃
で１０分間の１サイクル。得られるＤＮＡフラグメントを２％ＧＴＧアガロース
ゲル上で電気泳動し、フラグメントを、QIAquick(tm) 方法（Qiagen, Chatswor
th, CA）を用いて精製し、そして配列を配列分析により確かめた。プローブを、
ランダム プライミング MULTIPRIME ＤＮＡラベリングシステム（Amersham,
Arlington Heights, IL ）を用いて、製造業者の説明書に従って、放射性ラベル
０た。

【０１９８】 プローブを、NUCTRAP プッシュカラム（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて
精製した。ExpressHyb(tm) (Clontech) 溶液をプレハイブリダイゼーションのた
めに、及びノザンブロットのためのハイブリダイジング溶液として使用した。ハ
イブリダイゼーションは、１×１０⁶ cpm/ml のラベルされたプローブを用いて
、６５℃で一晩、実施された。次にブロットを、５０℃で、0.1 ×SSC, 0.1％の
ＳＤＳにより洗浄した。3.2kb の優位な転写体が精巣に検出された。低められた
発現が甲状腺、脊髄、胃、リンパ節及び気管に見出された。弱い転写体が、4.5k
b で胎盤及び膵臓に見出された。

【０１９９】 例３．ZGCL-1の染色体割り当て及び配置 ZGCL-1を、Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research's GeneBri
dge 4 Radiation Hybrid Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)
の市販バージョンを用いて、染色体５上に位置づけられた。GeneGridge 4 Radia
tion Hybrid Panel は、９３の放射線ハイブリッド クローンの個々からのPCRa
ble ＤＮＡ、及び２つの対照DNA (HFLドナー及びＡ２３受容体）を含む、公的に
利用できるWWW サーバー（http: //www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhm
apper.pl）は、GeneBridge 4 Radiation Hybrid Panel により構成されたヒト
ゲノムのWhitehead Institute/MIT Center for Genome Research's放射線ハイブ
リッド地図（“WICGR ”放射線ハイブリッド地図）に関する染色体地図作成を可
能にする。

【０２００】 GeneBridge 4 RH Panel によるZGCL-1の地図作成のためには、２５μl の反応
物が、PCRable ９６−ウェル マイクロタイタープレート（Stratagene, La Jol
la, CA）において設定され、そしてRoboCycler Gradient９６熟サイクラー（St
ratogene）に使用された。個々の95PCR 反応物は、2.5 μｌの10×Klentaq 反応
緩衝液（Clontech）、２μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ2.5 ｍＭ． Perkin-E
lmer）、1.25μｌのセンスプライマー、ZC12992 （配列番号６）、1.25μｌのア
ンチセンス プライマー、ZC12991 （配列番号５）、2.5 μｌのRadiLoad (Rese
arch Genetics ) 、0.5 μｌの５０×Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clon
tech) 、個々のハイブリッド クローン又は対照からの２５ng のＤＮＡ，及び
25μｌの合計体積のための蒸留水から構成された。

【０２０１】 反応物を、等体積の鉱油により被覆し、そして密封した。ＰＣＲサイクラー条
件は次の通りであった：９５℃で５分間の変性の初期１サイクル、９５℃で１分
間の変性、５８℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の延長の３５サ
イクル、続いて、７２℃で７分間の１サイクル。反応物を、３％NuSieve GTG ア
ガロースゲル（ＦＭＣ Bioproducts, Rockland, ME）上での電気泳動により分離
した。

【０２０２】 その結果は、ZGCL-1が、染色体５のWICCR 放射線ハイブリッド地図上の骨格
マーカーWI-6737 から10.09cR に位置することを示した。動原体に関して、その
最も近い近位マーカーはWI-4897 であり、そしてその最も近い遠位マーカーはWI
-14295であった。周囲のマーカーの使用は、組み込まれたＬＤＢ染色体５地図上
の５ｑ３５．３領域におけるZGCL-1の位置を決定する（The Genetic Location D
atabase, University of Southampton, WWW Server: http://cedar. genetics.
ｓoton. ac. uk/public ＿html/ ）。

【０２０３】 ヒト染色体5q34-q35上に位置づけられた遺伝子はA5-B1 及びA1-B1 領域におい
てマウス染色体11に主に位置づけられていた。マウス“生殖細胞欠陥”遺伝子Ｇ
ＣＤは、A2-B3 領域において染色体１１に位置している（Duncan など., Mamm.
Genome 6: 697-9, 1995 ）。生殖細胞欠陥は、肺成長の間、始原生殖細胞の不
適切な移動及び/ 又は増殖を導く。この突然変異を有するマウスは、ヒト生殖障
害、早熟卵巣障害及びセルトーリ細胞唯一症候群のための動物モデルであること
が仮定されてきた。 前述から、本発明の特定の態様が例示の目的のために記載されて来たが、種々
の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発
明は、請求の範囲によってのみ制限される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

図面は、ZGCL-1の推定されるアミノ酸配列（配列番号２）と、ショウジヨウバ
エ遺伝子生殖細胞欠失(dGCL −1)の推定されるアミノ酸配列（配列番号３）との
比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 5/10 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 デイシャー，テレサ エー. アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノースイースト シックスティフ ァースト ストリート 6317

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において
   少なくとも８０％同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリ
   ペプチドであって、前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応す
   るＰＯＺドメインを含んで成る単離されたポリペプチド。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが配列番号２の残基１〜４７９に対してア
   ミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、ここで前記配列が配列番号２
   のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る請求項２記
   載の単離されたポリペプチド。
3. 【請求項３】 親和性標識、トキシン、放射性ヌクレオチド、酵素及び蛍光
   団から成る群から選択された成分にアミノ末端又はカルボキシル末端に共有結合
   されている請求項１記載の単離されたポリペプチド。
4. 【請求項４】 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において
   少なくとも８０％同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドを
   コードする単離されたポリヌクレオチドであって、前記配列が配列番号２のアミ
   ノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る単離されたポリヌ
   クレオチド。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが配列番号２の残基１〜４７９に対してア
   ミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、前記配列が配列番号２のアミ
   ノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る請求項４記載の単
   離されたポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号４のヌクレオチド１〜ヌクレオチド１４３７の配列
   を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 配列番号４のポリヌクレオチド、又は配列番号４に対して相
   補的な配列の、少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで成るオリゴヌ
   クレオチドプローブ又はプライマー。
8. 【請求項８】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０％
   同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチドをコード
   するＤＮＡセグメント、ここで前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７
   ８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る；及び 転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクター。
9. 【請求項９】 前記ＤＮＡセグメントが、配列番号２の残基１〜４７９に対
   してアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードし
   、前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメイン
   を含んで成る請求項８記載の発現ベクター。
10. 【請求項１０】 前記ＤＮＡセグメントが、親和性標識にアミノ末端又はカ
    ルボキシ末端で共有結合されているポリペプチドをコードする請求項８記載の発
    現ベクター。
11. 【請求項１１】 前記ＤＮＡセグメントがさらに、前記ポリペプチドに作用
    可能に連結された分泌シグナル配列をコードする請求項８記載の発現ベクター。
12. 【請求項１２】 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０％
    同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチドをコード
    するＤＮＡセグメント、ここで前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７
    ８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る；及び 転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクターを導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコー
    ドされる前記ポリペプチドを発現する培養された細胞。
13. 【請求項１３】 ポリペプチドを製造するための方法であって、 次の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター； 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列において少なくとも８０％
    同一である、アミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリペプチドをコード
    するＤＮＡセグメント、ここで前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７
    ８に対応するＰＯＺドメインを含んで成る；及び 転写ターミネーター； を含んで成る発現ベクターを導入されている、前記ＤＮＡセグメントによりコー
    ドされる前記ポリペプチドを発現する細胞を培養し；そして 前記発現されたポリペプチドを回収する； ことを含んで成る方法。
14. 【請求項１４】 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸配列におい
    て少なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドで
    あって、ここで前記配列が配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰ
    ＯＺドメインを含んで成るポリペプチド；及び 医薬的に許容できるビークル； を含んで成る医薬組成物。
15. 【請求項１５】 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸において少
    なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドであっ
    て配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで成
    るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体。
16. 【請求項１６】 配列番号２の残基１〜４７９に対してアミノ酸において少
    なくとも８０％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成るポリペプチドであっ
    て、配列番号２のアミノ酸残基６１〜１７８に対応するＰＯＺドメインを含んで
    成るポリペプチドのエピトープに特異的に結合する結合タンパク質。
17. 【請求項１７】 患者における遺伝的異常を検出するための方法であって： 患者から遺伝的サンプルを得； 前記遺伝的サンプルを、配列番号１又は配列番号１の相補体の少なくとも１４
    個の連続したヌクレオチドを含んで成るポリヌクレオチドと共に、前記ポリヌク
    レオチドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするであろう条件下で
    インキュベートすることにより第１反応生成物を生成せしめ； 対照の反応生成物と前記第１反応生成物とを比較する； ことを含んで成り、ここで前記第反応生成物と前記対照の反応生成物との間の差
    異が患者における遺伝的異常の表示である、ことを特徴とする方法。