JPH05236965A

JPH05236965A - ｔｒｋＣタンパク質

Info

Publication number: JPH05236965A
Application number: JP4181162A
Authority: JP
Inventors: Mariano Barbacid; マリアーノ・バーバシッド; Fabienne Lamballe; ファビエンヌ・ランベール
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co; ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co; ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1991-07-08
Filing date: 1992-07-08
Publication date: 1993-09-17
Also published as: EP0522530A3; US5348856A; EP0522530A2; CA2073378A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコー
ドする核酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチ
ド分子の製造方法を提供することを目的とする【構成】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコー
ドする核酸配列からなる核酸分子(とりわけＤＮＡ配
列)、該配列と相補的なＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分
子、該ＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、該発現ベク
ターを含有する宿主細胞、これらを用いた方法、ｔｒｋ
Ｃタンパク質の全部または一部からなるポリペプチド分
子、および該ポリペプチド分子の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ｔｒｋＣタンパク質の
全部または一部をコードする核酸配列からなることを特
徴とする、単離核酸分子、該配列に相補的なＤＮＡ配列
を有するＤＮＡ分子、該ＤＮＡ配列を含む発現ベクタ
ー、該発現ベクターを有する原核または真核宿主細胞、
該宿主細胞を培養することを特徴とするｔｒｋＣタンパ
ク質の全部または一部からなるポリペプチド分子の製造
方法、およびｔｒｋＣタンパク質の全部または一部から
なる単離ポリペプチド分子に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】癌遺
伝子の存在は、長い間知られていた。癌遺伝子は、その
タンパク産物がある種の宿主細胞中に存在するときに該
細胞を癌の表現型に形質転換させ得る遺伝子として大ま
かに定義することができる。一方、癌原遺伝子は、活性
化させると癌遺伝子を生成し得る正常な遺伝子として大
まかに定義することができる。最初に発見された癌遺伝
子は、ある種の腫瘍ウイルスの形質転換遺伝子であっ
た。その後、癌遺伝子は、種々の真核細胞中にも存在す
ることが発見された。これら癌遺伝子の中には、ｔｒｋ
として表されるものも含まれる。

【０００３】ｔｒｋの遺伝子座はまずヒト結腸癌で同定
されたが、その際、該遺伝子座は、染色体の再配列によ
りその経膜ドメインおよび触媒ドメインが非筋肉トロポ
ミオシン遺伝子由来の配列の一部(subset)と融合するこ
とによって癌遺伝子として活性化された[マーチン・ザ
ンカ(Martin−Zanca,Ｄ.)ら、Nature３１９、７４３〜
７４８(１９８６)]。トロポミオシン以外の活性化配列
を有する他のｔｒｋ癌遺伝子は、遺伝子移動アッセイ中
に生成された[コズマ(Kozma)ら、ＥＭＢＯＪ.９、１４
７〜１５４(１９８８)；オスカム(Oskam)ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.９、２９６４〜２９６８(１９８８)]。ｔｒ
ｋ癌原遺伝子は、チロシンプロテインキナーゼ活性を有
する細胞表面レセプターをコードし、三叉神経節および
ある種の後根神経節で特異的に発現される。

【０００４】ｔｒｋ癌原遺伝子に関連するｔｒｋＢと称
される遺伝子は、最近、マウス脳のｃＤＮＡライブラリ
ーから単離された[クライン(Klein,Ｒ.)ら、ＥＭＢＯ
Ｊ.８、３７０１〜３７０９(１９８９)]。ｔｒｋＢ癌原
遺伝子もまた、チロシンプロテインキナーゼ活性を有す
る細胞表面レセプターをコードしている。これら両遺伝
子の変異した対立遺伝子(癌遺伝子)は、悪性の形質転換
を引き起こし得る。本発明は、ｔｒｋ癌原遺伝子に関連
する第三の遺伝子、すなわちｔｒｋＣの発見を含む。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、ｔｒｋＣタン
パク質の全部または一部をコードする核酸配列からなる
単離核酸分子に関する。好ましくは、この核酸分子はＤ
ＮＡ(デオキシリボ核酸)分子であり、この核酸配列はＤ
ＮＡ配列である。さらに好ましくは、実質的に図２〜図
５(配列番号１)に示すヌクレオチド配列の全部または一
部を有するＤＮＡ配列である。本発明はさらに、ｔｒｋ
Ｃタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列
を含む発現ベクターに関する。

【０００６】本発明はさらに、ｔｒｋＣタンパク質の全
部または一部をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクタ
ーを有する原核または真核宿主細胞に関する。本発明は
また、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコードす
る核酸配列または関連核酸配列の検出方法に関する。本
発明はさらに、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部か
らなるポリペプチド分子に関する。

【０００７】以下、図面を詳細に説明する。図１〜図５
は、ブタｔｒｋＣ遺伝子のｃＤＮＡクローンであるｐＦ
Ｌ１９の２５２６ｂｐの長さの挿入物のヌクレオチド配
列分析を示す。図１は、ｐＦＬ１９の模式図である。太
い棒は、開始コドン(ＡＴＧ)および終止コドン(ＴＡＧ)
により挟まれたコード配列を表す。推定シグナルペプチ
ド(ＳＰ、斑点)ドメイン、経膜(ＴＭ、黒く塗りつぶし
てある)ドメインおよびチロシンキナーゼ(ＴＫ、斜線を
施してある)ドメインを示す。他の記号は、細胞外ドメ
イン中に存在するシステイン残基(黒点)および共通Ｎ−
グリコシル化部位(逆三角形)を示す。細い棒は、５'お
よび３'非コード配列を示す。

【０００８】図２〜図５は、上記ｐＦＬ１９の２５２６
ｂｐ挿入物のヌクレオチド配列およびそれから導かれた
アミノ酸配列を示す。推定シグナルペプチド(アミノ酸
１〜３１)は、点線の箱で囲んである。ｐＦＬ１９中に
ｐＦＬ７およびｐＦＬ１５を融合するのに用いる唯一の
ＮａｅＩ部位には、上に模様の線を引いてある。共通Ｎ
−グリコシル化部位には、棒で下線を引いてある。細胞
外ドメイン中のシステイン残基は丸で囲んである。推定
経膜ドメイン(アミノ酸４３０〜４５３)には黒線で下線
を引いてある。推定チロシンキナーゼ触媒ドメイン(ア
ミノ酸５４４〜８１０)には水平矢印で印を付してあ
る。インフレームの終止コドンＴＡＧ(アミノ酸２５０
７〜２５０９)には点を付してある。

【０００９】図６は、ｔｒｋＣ産物の同定を示す。(Ａ)
発現プラスミドｐＦＬ２０でトランスフェクションした
ＮＩＨ３Ｔ３細胞、(Ｂ)ｔｒｋ癌原遺伝子産物を発現す
るＮＩＨ３Ｔ３細胞および(Ｃ)親ＮＩＨ３Ｔ３細胞の[
³⁵Ｓ]メチオニン標識細胞抽出物を、１０μｇ／ｍｌの
ツニカマイシンの不在下(−)または存在下(＋)で増殖さ
せ、免疫前(Ｐ)に、またはｔｒｋ癌原遺伝子産物の１４
カルボキシ末端アミノ酸に対応するペプチドに対して産
生させた血清で免疫して(Ｉ)免疫沈降分析に供した。グ
リコシル化されたｇｐ１４５／１２０^trkCおよびｇｐ１
４０／１１０^trk分子およびそれらの対応ポリペプチド
骨格ｐ９０^trkCおよびｐ８０^trkを矢印で示してある。
一緒に電気泳動に供した分子量マーカーには、ミオシン
(２０,０００)、ホスホリラーゼＢ(９２,５００)、ウシ
血清アルブミン(６９,０００)および卵アルブミン(４
３,０００)が含まれている。

【００１０】図７および図８は、成体マウス組織中での
ｔｒｋＣ転写物の分布を示す。図７では、所定組織から
単離したポリ(Ａ)選択ＲＮＡ(４μｇ)を１.２％アガロ
ース−ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動にかけ、ニト
ロセルロース膜に移し、厳密な条件下(下記実験手順を
参照)、ｐＦＬ１９のヌクレオチド３６３〜９３３(図２
〜図５参照)に対応するｐＦＬ１６マウスｔｒｋＣｃＤ
ＮＡクローンの[³²Ｐ]標識５７０ｂｐＡｃｃＩＤＮＡ
断片とハイブリダイズさせた。図８では、同じフィルタ
ーを[³²Ｐ]標識β−アクチンプローブとハイブリダイズ
させて、各レーン中に負荷したＲＮＡの量について制御
した。ハイブリダイズしたブロットを増感スクリーンの
助けをかりてコダックＸ−ＯＭＡＴフィルムに−７０℃
で１５日間(図７)または８時間(図８)暴露した。ｔｒｋ
Ｃおよびβ−アクチン転写物のそれぞれのサイズを示し
てある。ＲＮＡサイズマーカーには、サッカロミセス・
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の２８Ｓおよび
１８ＳリボソームＲＮＡおよび大腸菌の２３Ｓおよび１
６ＳリボソームＲＮＡが含まれていた。

【００１１】図９は、生体マウス脳の中央矢状縫合(mid
−sagittal)切片におけるｔｒｋＣ発現を示す。(Ａ)ｔ
ｒｋＣ特異的アンチセンスｃＲＮＡプローブおよび(Ｂ)
ｔｒｋＣセンスｃＲＮＡプローブ(下記実験手順参照)で
ハイブリダイズした隣接する切片の暗野視を示す。ｐｙ
は海馬の錐体細胞層、ｄｇは歯状回、ｃｃは大脳皮質、
ｔは視床、ｇｃｌは小脳の顆粒細胞層を示す。

【００１２】本発明は、ｔｒｋＣタンパク質の全部また
は一部をコードする核酸配列からなる単離核酸分子に関
する。好ましくは、該核酸分子はＤＮＡ分子であり、該
核酸配列はＤＮＡ配列である。さらに好ましくは、実質
的に図２〜５(配列番号１)に示すヌクレオチド配列の全
部または一部を有するＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列
に相補的なＤＮＡ配列である。ｔｒｋＣタンパク質の一
部をコードするヌクレオチド配列(たとえば、ＤＮＡ配
列)の場合は、該ヌクレオチド配列は長さが少なくとも
約１５ヌクレオチドであることが好ましい。本発明のＤ
ＮＡ配列は種々の採取源から単離することが可能である
が、現在のところ好ましい配列はブタおよびマウスのｃ
ＤＮＡライブラリーから単離されている。生成したポリ
ペプチド分子の正確なアミノ酸配列は、最初のＤＮＡ配
列により変わるであろう。

【００１３】本発明のＤＮＡ配列は、当業者によく知ら
れた種々の方法を用いて得ることができる。少なくとも
３つの主要な方法を用いることができる。 (１)ゲノムＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡ配列の単離または
該配列を有する相補的ＤＮＡ(ｃＤＮＡ)からの該配列の
単離； (２)該ＤＮＡ配列の化学合成；および (３)複製連鎖反応(ＰＣＲ)による該ＤＮＡ配列の化学合
成。

【００１４】第一の方法では、ｔｒｋＣタンパク質の全
部または一部をコードするＤＮＡ配列を同定するために
ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングする。たとえば、ｔｒｋＣタンパク質
の全部または一部をコードするＤＮＡ配列を同定するた
めにブタまたはマウスのｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングすることができる。種々のブタまたはマウスｃ
ＤＮＡライブラリー、たとえば脳ｃＤＮＡライブラリー
を用いることができる。ゲノムＤＮＡライブラリーまた
はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためには
種々の方法を用いることができる。

【００１５】たとえば、ｔｒｋＣタンパク質の全部また
は一部をコードする目的ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ中
に存在する配列と重複する配列を有する標識一本鎖ＤＮ
Ａプローブを用い、一本鎖の形態に変性しておいたゲノ
ムＤＮＡまたはｃＤＮＡのクローニングコピー上でＤＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを行うことができ
る。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡはまた、イムノブロッ
ティング法を用いてｔｒｋＣタンパク質の全部または一
部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡについてス
クリーニングすることもできる。

【００１６】イムノブロッティング法またはハイブリダ
イゼーション法のいずれかに適した典型的なスクリーニ
ング法においては、まずゲノムＤＮＡライブラリー(通
常、λｇｔ１１などのベクター中に含まれる)またはｃ
ＤＮＡライブラリーをアガロースプレート上に広げ、つ
いで得られたクローンをフィルターメンブラン、たとえ
ばニトロセルロースメンブランに移す。ついで、これら
クローンにＤＮＡプローブをハイブリダイズさせるか、
または抗体を結合させて、ｔｒｋＣタンパク質の全部ま
たは一部をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含
むクローンを同定する。

【００１７】第二の方法においては、ｔｒｋＣタンパク
質の全部または一部をコードする本発明のＤＮＡ配列を
化学的に合成することができる。たとえば、ｔｒｋＣタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列を一連の１００塩基オ
リゴヌクレオチドとして合成し、ついで、これらヌクレ
オチドを順番に(適当な末端制御部位を介して)ライゲー
トして正しい直線状のヌクレオチド配列を生成させるこ
とができる。

【００１８】第三の方法においては、ｔｒｋＣタンパク
質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲ法
を用いて合成することができる。簡単に説明すると、目
的ＤＮＡ配列の反対の鎖にハイブリダイズする長さが少
なくとも１５塩基の１対の合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド(ＰＣＲプライマー)を用い、該目的配列上のＤＮＡの
介在領域を酵素的に増幅させる。鋳型の熱変性、プライ
マーのアニールおよびアニールしたプライマーの３'末
端のＤＮＡポリメラーゼによる伸長からなるサイクルを
繰り返すことにより、これらＰＣＲプライマーの５'末
端により定められるセグメントが増幅される[米国特許
第４,６８３,１９５号および同第４,６８３,２０２号各
明細書参照]。

【００１９】本発明のＤＮＡ配列は、本発明に従った種
々の方法により用いることができる。たとえば、ｔｒｋ
Ｃタンパク質に関連するタンパク質をコードする他のＤ
ＮＡ配列をハイブリダイゼーションにより選択すること
ができるように、他のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノ
ムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのＤＮ
Ａプローブとして用いることができる。加えて、ｔｒｋ
Ｃタンパク質の全部または一部をコードする本発明のＤ
ＮＡ配列はまた、他のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノ
ムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためにＤＮ
Ａプローブとして用い、ブタまたはマウス以外の生物か
らのｔｒｋＣタンパク質分子をコードするＤＮＡ配列を
ハイブリダイゼーションによって選択することができ
る。

【００２０】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコ
ードする本発明のＤＮＡ配列はまた、種々の変異を調製
するため修飾する(すなわち、変異させる)こともでき
る。そのような変異は、縮退している、すなわち変異し
たコドンによってコードされるアミノ酸配列に変化が起
こらないか、または縮退していない、すなわち変異した
コドンによってコードされるアミノ酸配列に変化が起こ
るかいずれかである。このような修飾されたＤＮＡ配列
は、たとえば、変異の結果、コードされるポリペプチド
中の１または２以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆
位または付加が生じるように、種々の公知方法を用いて
ｔｒｋＣタンパク質のＤＮＡ配列を変異させることによ
って調製することができる。

【００２１】たとえば、テイラー(Taylor,Ｊ.Ｗ.)らのN
ucl.Acids Res.１３、８７４９〜８７６４(１９８５)お
よびクンケル(Kunkel,Ｊ.Ａ.)のProc.Natl.Acad.Sci.US
A８２、４８２〜４９２(１９８５)に記載されているよ
うな部位特異的突然変異誘発法を用いることができる。
部位特異的突然変異誘発のためのキットは市販業者から
購入することができる。たとえば、部位特異的突然変異
誘発を行うためのキットは、アマーシャム(Amersham Co
rp.、アーリントンハイツ、イリノイ州)から購入するこ
とができる。縮退および非縮退変異の両方とも、本発明
のポリペプチドを製造または使用する上で有利である。
たとえば、これら変異により、一層高レベルの製造、一
層容易な精製が可能となり、また別の制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位が得られる。そのような修飾ＤＮＡｓ
(およびそれによりコードされるポリペプチド分子)は、
すべて本発明の範囲に含まれる。

【００２２】本明細書において「修飾」とは、ヌクレオチ
ド配列またはポリペプチド配列について言及する場合
に、天然に存在する野生型配列とは異なるヌクレオチド
配列またはポリペプチド配列を意味する。本発明はま
た、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコードする
ＤＮＡ配列を含む発現ベクターに関する。本発明の発現
ベクターは、実質的に図２〜図５(配列番号１)に示すヌ
クレオチド配列を有するＤＮＡ配列の全部または一部を
含んでいるのが好ましい。また、ｔｒｋＣタンパク質の
全部または一部をコードするＤＮＡ配列に機能的に連結
した１または２以上の制御ＤＮＡ配列を含む発現ベクタ
ーがさらに好ましい。本明細書において「機能的に連結
した」とは、該制御ＤＮＡ配列が、ｔｒｋＣタンパク質
の全部または一部をコードするＤＮＡ配列の複製および
／または発現を指令することができることを意味する。

【００２３】本発明において有用な発現ベクターは、し
ばしば「プラスミド」の形態であり、これは環状の二本鎖
ＤＮＡｓを意味し、そのベクターの形態では染色体には
結合しない。しかしながら、本発明は、同等の機能を有
し、その後当該技術分野で知られるようになった他の形
態の発現ベクターをも包含する。

【００２４】本発明において有用な発現ベクターは、一
般に、複製開始点、該ＤＮＡ配列の前(すなわち上流)に
位置するプロモーターとそれに続くｔｒｋＣタンパク質
の全部または一部をコードするＤＮＡ配列、転写終止配
列および残りのベクターからなる。本発明の発現ベクタ
ーはまた、当該技術分野で知られた他のＤＮＡ配列、た
とえば、発現産物に安定性を付与する安定性リーダー配
列、発現産物を分泌させる分泌リーダー配列、調節すべ
き(たとえば、増殖培地中の栄養物質または他の誘発因
子の存在または不存在によって)構造遺伝子の発現を可
能にする配列、形質転換した宿主細胞の表現型の選択を
可能にするマーキング配列、および制限エンドヌクレア
ーゼによる開裂のための部位を提供する配列などを含ん
でいてもよい。

【００２５】実際に使用する発現ベクターの特徴は、使
用する宿主細胞と適合するものでなければならない。た
とえば、哺乳動物細胞系でクローニングする場合は、発
現ベクターは、哺乳動物細胞のゲノムから単離したプロ
モーター(たとえば、マウスメタロチオネインプロモー
ターなど)、またはこれら細胞中で成育するウイルスか
ら単離したプロモーター(たとえば、ワクシニアウイル
スの７.５Ｋプロモーターなど)を含んでいなければなら
ない。

【００２６】本発明における発現ベクターは、少なくと
も、本発明のＤＮＡ配列の複製、好ましくは発現を指令
し得るものでなければならない。適当な複製開始点とし
ては、たとえば、ｐＭＢ１のＣｏｌＥ１誘導体からの複
製開始点Ｏｒｉが挙げられる。適当なプロモーターとし
ては、たとえば、モロニー肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウ
イルスおよびマウス乳癌ウイルスのＬＴＲ(long termin
al repeats)、並びにＳＶ４０およびポリオーマウイル
スの初期領域などが挙げられる。選択マーカーとして
は、抗生物質のネオマイシンおよびＧ４１８(ｎｅｏ)、
プロマイシン(ｐｕｒ)またはヒグロマイシン(ｈｙｇｒ
ｏ)に対する耐性をコードする細菌遺伝子、またはチミ
ジンキナーゼをコードする哺乳動物遺伝子などを用いる
ことができる。これら物質はすべて当該技術分野で知ら
れており、市販されている。

【００２７】特に好ましいのは下記に記載するｐＦＬ１
９と称する発現ベクター(ｔｒｋＣタンパク質をコード
するＤＮＡ配列を含む)、またはｐＦＬ１９の同定特性
を有する発現ベクターである。プラスミドｐＦＬ１９
は、ブダペスト条約下、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(ロックビル、メリーランド州)に１９
９１年７月３日に寄託してあり、そのＡＴＣＣ受託番号
は７５０４６である。ｐＦＬ１９は、全コード配列にわ
たるｔｒｋＣタンパク質のｃＤＮＡクローンを含んでい
る。所望のコード配列および制御配列を含む適当な発現
ベクターは、当該技術分野で公知の標準組換えＤＮＡ法
を用いて構築することができ、その多くはマニアティス
(Maniatis,Ｔ.)らのモレキュラー・クローニング：ア・
ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、
ニューヨーク(１９８２)に記載されている。

【００２８】本発明はさらに、ｔｒｋＣタンパク質の全
部または一部をコードするＤＮＡ配列を有する発現ベク
ターを含む宿主細胞に関する。本発明の宿主細胞は、好
ましくは、実質的に図２〜図５(配列番号１)に示すヌク
レオチド配列を有するＤＮＡ配列の全部または一部を有
する発現ベクターを含む。さらに好ましいのは、ｔｒｋ
Ｃタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配列
の複製および／または発現を指令することができ、該配
列に機能的に連結した１または２以上の制御ＤＮＡ配列
を含む発現ベクターを有する宿主細胞である。適当な宿
主細胞には、原核および真核の両方の細胞が含まれる。
適当な原核宿主細胞としては、たとえば、ＤＨ５α、Ｃ
６００およびＬＬ１などの大腸菌の種々の株が挙げられ
る。適当な真核宿主細胞としては、たとえば、マウスの
ＮＩＨ３Ｔ３およびＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、ラットのＲａ
ｔ−２細胞、サルのＣＯＳ細胞、ヒトのＨｅｌａ細胞お
よびハムスターのＣＨＯ細胞などが挙げられる。宿主細
胞として好ましいのは、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞であ
る。

【００２９】発現ベクターの宿主細胞中への導入は、当
該技術分野で公知の種々の方法により行うことができ
る。たとえば、発現ベクターによる宿主細胞のトランス
フェクションはリン酸カルシウム沈降法により行うこと
ができる。しかしながら、発現ベクターを宿主細胞中へ
導入する他の方法、たとえば、エレクトロポレーション
法、バイオリスティック(biolistic)融合、リポソーム
融合、核注入およびウイルスおよびファージ感染などを
用いることもできる。

【００３０】発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入さ
れたら、所望のポリペプチド(本発明の場合はｔｒｋＣ
タンパク質の全部または一部からなるポリペプチド分
子)を大量に発現できる条件下で該宿主細胞を培養す
る。そのようなポリペプチドは、ｔｒｋＣタンパク質の
特性、たとえば発癌における役割などの研究において有
用である。そのようなポリペプチドはまた、抗癌剤とし
て使用できる薬剤の同定に使用することもできる。たと
えば、ｔｒｋＣタンパク質に結合するかまたは該タンパ
ク質の機能を抑制し得る化合物は、有効な癌の化学療法
剤である。

【００３１】さらに、ｔｒｋＣタンパク質は、神経栄養
性因子、たとえばニューロトロフィン−３(ＮＴ−３)の
アゴニストおよびアンタゴニストを検出するのに用いる
ことができる。ｔｒｋＣタンパク質はＮＴ−３の主要な
レセプターであり、ＮＴ−３はｔｒｋＣタンパク質のリ
ン酸化を誘発し、ｔｒｋＣタンパク質はＮＴ−３のマイ
トジェン活性を媒介する。

【００３２】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコ
ードするＤＮＡ配列を有する発現ベクターを含む宿主細
胞は、つぎの４つの一般法の１または２以上により同定
することができる；(ａ)ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション、(ｂ)マーカー遺伝子機能の存在または不存
在、(ｃ)宿主細胞中でのｔｒｋＣタンパク質ｍＲＮＡ転
写物の産生により測定される転写レベルの評価、および
(ｄ)遺伝子産物の免疫学的検出。第一の方法において
は、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコードする
ＤＮＡ配列の存在を該ＤＮＡ配列に相補的なプローブを
用いたＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダ
イゼーションにより検出することができる。

【００３３】第二の方法においては、ある種のマーカー
遺伝子機能(たとえば、チミジンキナーゼ活性、抗生物
質に対する耐性など)の存在または不存在に基づいて、
組換え発現ベクター宿主系を同定および選択することが
できる。マーカー遺伝子は、ｔｒｋＣタンパク質をコー
ドする配列の制御に用いたのと同じかまたは異なるプロ
モーターの制御下、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一
部をコードするＤＮＡ配列と同じプラスミド中に入れる
ことができる。誘発または選択に応じたマーカー遺伝子
の発現は、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコー
ドするＤＮＡ配列の発現を示す。

【００３４】第三の方法においては、ｔｒｋＣタンパク
質のｍＲＮＡ転写物の産生をハイブリダイゼーションア
ッセイにより評価することができる。たとえば、ポリア
デニル化ＲＮＡを単離し、該ＲＮＡ配列に相補的なプロ
ーブを用いたノーザンブロッティングまたはヌクレアー
ゼ保護アッセイにより分析することができる。別法とし
て、宿主細胞の全核酸を抽出し、上記プローブに対する
ハイブリダイゼーションについてアッセイすることもで
きる。第四の方法では、ｔｒｋＣタンパク質の全部また
は一部の発現を免疫学的に、たとえばウエスタンブロッ
ティングにより評価することができる。

【００３５】本発明の発現ベクター、プラスミドまたは
ＤＮＡ分子のＤＮＡ配列は、当該技術分野で公知の種々
の方法により決定することができる。たとえば、サンガ
ー(Sanger)らのProc.Natl.Acad.Sci.USA７４、５４６３
〜５４６７(１９７７)に記載されているチェインターミ
ネーター法、またはProc.Natl.Acad.Sci.USA７４、５６
０〜５６４(１９７７)に記載されているマクサム−ギル
バート法を用いることができる。

【００３６】もちろん、発現ベクターおよびＤＮＡ制御
配列のすべてが本発明のＤＮＡ配列を同じように首尾よ
く発現するように機能するのではないことは理解する必
要がある。同様に、すべての宿主細胞が同じ発現系に対
して同じように首尾よく機能するわけではない。しかし
ながら、当業者であれば、不当な実験をすることなく、
また本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書の手
引きに従い、発現ベクター、ＤＮＡ制御配列および宿主
細胞を選択することができるであろう。

【００３７】本発明はまた、ｔｒｋＣタンパク質の全部
または一部をコードする核酸配列または関連する核酸配
列の検出法であって、該核酸配列の少なくとも一部に特
異的に結合する検出可能なマーカーに該核酸配列を接触
させ、ついで結合したマーカーを検出することを特徴と
する方法に関する。結合マーカーの存在は、目的核酸配
列の存在を示す。該核酸配列は、実質的に図２〜図５
(配列番号１)に示すヌクレオチド配列の全部または一部
を有するＤＮＡ配列であるのが好ましい。また、該ＤＮ
Ａ配列がゲノムＤＮＡ配列である方法も好ましい。該Ｄ
ＮＡ配列を含有するＤＮＡ試料は、当該技術分野でよく
知られた種々のＤＮＡ単離法を用いて単離することがで
きる。たとえば、ゲノムＤＮＡ試料を組織から単離する
には、ＤＮＡを単離しようとする組織を迅速に凍結乾燥
し、この組織を破砕して容易に消化できる組織片とし、
この破砕した組織をプロテイナーゼＫおよびドデシル硫
酸ナトリウムの溶液中に入れ、ついで得られた溶液を細
胞性タンパク質の大部分が分解されるまでインキュベー
トすればよい。ついで、得られた消化物をフェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に抽出
し、エタノール沈澱により回収し、乾燥させ、緩衝液中
に再懸濁する。

【００３８】核酸配列がＲＮＡ配列である方法もまた好
ましい。該ＲＮＡ配列はｍＲＮＡ配列であるのが好まし
い。同様に好ましいのは、該ＲＮＡ配列が組織試料の細
胞中に存在するＲＮＡ配列である方法である。該ＲＮＡ
配列を含有するＲＮＡ試料は、当該技術分野でよく知ら
れた種々のＲＮＡ単離法を用いて単離することができ
る。たとえば、ＲＮＡ試料を培養細胞から単離するに
は、まず培地を含まない細胞を洗浄し、ついで４Ｍグア
ニジウム溶液中に入れることにより細胞を溶解する。こ
の溶解液を２０ゲージの針に通すことにより、得られた
溶液の粘度を下げる。ついで、ＣｓＣｌ₂段階勾配によ
りＲＮＡをペレット化し、該勾配から上澄み液を注意深
く取り、ペレット中に存在するＲＮＡを混入ＤＮＡおよ
びタンパク質から完全に分離させる。

【００３９】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコ
ードする核酸配列または関連核酸配列を検出するのに有
用な検出可能なマーカーは、ｔｒｋＣタンパク質の全部
または一部をコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部に
相補的なヌクレオチド配列を有する標識ＤＮＡ配列(標
識ｃＤＮＡ配列を含む)である。検出可能なマーカーは
また、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコードす
るＤＮＡ配列の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド
配列を有する標識したセンスまたはアンチセンスＲＮＡ
配列であってもよい。本発明の検出可能なマーカーは、
一般に用いられている³²Ｐや³⁵Ｓなどの放射性標識で標
識することができるが、ビオチンや水銀などの他の標識
を用いることもできる。検出可能なマーカーを標識する
ため、当業者によく知られた種々の方法を用いることが
できる。たとえば、ランダムプライマー法を用い、³²Ｐ
または³⁵ＳでＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列を標識するこ
とができる。

【００４０】適当な検出可能なマーカーが得られたら、
当業者によく知られた種々の方法を用い、該検出可能な
マーカーを目的試料と接触させることができる。たとえ
ば、当該技術分野で公知の標準法を用い、ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ−ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイ
ゼーションを行うことができる。ゲノムＤＮＡ中のｔｒ
ｋＣタンパク質の全部または一部をコードするＤＮＡ配
列を検出するための典型的なＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダ
イゼーション法においては、まずゲノムＤＮＡを公知方
法により単離し、ついで１または２以上の制限酵素で消
化する。得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル
上で分離し、その場で変性させる。プレハイブリダイゼ
ーションを行って非特異的なハイブリダイゼーションを
減らした後、固定化したＤＮＡフラグメントに放射性標
識した核酸プローブをハイブリダイズさせる。ついでフ
ィルターを洗浄して結合していないまたは弱く結合した
プローブを除去し、ついでオートラジオグラフにかけて
プローブとハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを同
定する。

【００４１】結合した検出可能なマーカーの存在は、当
業者によく知られた種々の方法により検出することがで
きる。たとえば、検出可能なマーカーが放射性標識され
ている場合は、オートラジオグラフィーを用いることが
できる。使用した標識に応じて分光測光法を用いること
もできる。ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコー
ドする核酸配列に関連する核酸配列も本明細書に記載し
た方法により検出することができることも理解すべきで
ある。たとえば、ｔｒｋＣタンパク質の保存された領域
に基づいたＤＮＡプローブを用いて、該関連するＤＮＡ
配列(たとえば、他の生物からのｔｒｋＣタンパク質を
コードするＤＮＡ配列など)を検出および単離すること
ができる。そのような方法もすべて本発明の範囲に含ま
れる。

【００４２】本明細書において「関連(する)」とは、ｔｒ
ｋＣタンパク質のヌクレオチド配列に基づいたオリゴヌ
クレオチドプローブにハイブリダイズすることができる
核酸配列を意味する。本発明はさらに、ｔｒｋＣタンパ
ク質の全部または一部からなるポリペプチド分子に関
し、該ポリペプチド分子は実質的に図２〜図５(配列番
号２)に示すアミノ酸配列の全部または一部を有するの
が好ましい。

【００４３】本発明のポリペプチドは、合成手段によ
り、すなわち当業者に公知の方法により、その成分アミ
ノ酸からポリペプチドを化学合成することにより得るこ
とができる。たとえば、ヒュートン(Houghton)らのPro
c.Natl.Acad.Sci.８２、５１３５(１９８５)に記載され
た固相法を用いることができる。本発明のポリペプチド
は、ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部をコードする
ＤＮＡ配列を発現する原核または真核宿主細胞中での産
生により、またはｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡの
インビトロ翻訳により得るのが好ましい。たとえば、実
質的に図２〜図５(配列番号１)に示すＤＮＡ配列を上記
ＰＣＲ法により合成し、適当な発現ベクター中に挿入
し、該ベクターを適当な宿主細胞に形質転換させる。つ
いで、得られた組換え宿主細胞を培養してｔｒｋＣタン
パク質を産生させる。これら方法によるポリペプチドの
製造技術は当該技術分野で公知であり、本明細書に記載
してある。

【００４４】ついで、このようにして産生されたポリペ
プチドを単離し、種々のタンパク質精製法を用いてある
程度まで精製する。たとえば、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよびイムノアフ
ィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ
ー法を用いることができる。本発明のポリペプチドは、
広範囲に使用することができる。たとえば、公知方法に
従い、該ポリペプチドに結合することができるポリクロ
ーナル抗体またはモノクローナル抗体を調製するのに用
いることができる。これら抗体は、逆に、イムノアッセ
イ法、たとえばラジオイムノアッセイ法やエンザイムイ
ムノアッセイ法を用い、試料(たとえば細胞試料)中に存
在する本発明のポリペプチドを検出するのに用いること
ができる。これら抗体はまた、本発明のポリペプチドを
精製し、または種々の採取源から単離するためのアフィ
ニティークロマトグラフィーに用いることができる。

【００４５】本発明のポリペプチドは、決定されたＤＮ
Ａおよびそれから導かれたアミノ酸シークエンシングに
より定められる。遺伝暗号の縮退により、図２〜図５
(配列番号２)に示すアミノ酸配列と同じ配列をコードす
る他のＤＮＡ配列も、本発明のポリペプチドを製造する
のに用いることができる。さらに、これらＤＮＡ配列お
よびアミノ酸配列における対立遺伝子変化(allelic var
iations)も存在するし、また当該技術分野で公知の方法
を用いて意図的に導入することができることも理解され
るであろう。これら変化は、全配列中の１または２以上
のアミノ酸の相違、または該配列中の１または２以上の
アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加により示
される。

【００４６】そのようなアミノ酸の置換は、たとえば、
関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性お
よび／または両親媒性の類似性に基づいて行われる。た
とえば、負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸およ
びグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸にはリ
ジンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有す
る非荷電の極性頭部基または非極性頭部基を有するアミ
ノ酸には以下のものが含まれる；ロイシン、イソロイシ
ン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グル
タミン；セリン、スレオニン；フェニルアラニン、チロ
シン。他の態様としては、上記ポリペプチドの塩および
エステル、並びに上記ポリペプチドの前駆体、たとえば
メチオニン、Ｎ−ホルミルメチオニンおよびリーダー配
列などのＮ−末端置換基を有する前駆体が挙げられる。
これらすべての態様は本発明の範囲に含まれる。

【００４７】

【実施例】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳し
く説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１Ｉ．実験手順：Ａ．ｃＤＮＡクローンの単離成体雄ブタ脳から調製したλｇｔ１０ｃＤＮＡライブ
ラリー(１.５×１０⁶ファージ)[クローンテック・ラボ
ラトリーズ(Clontech Laboratories,Inc.)]を、大腸菌
Ｃ６００Ｈｆ１の芝(lawn)上にプレーティングした。フ
ァージをニトロセルロースフィルター上に吸着させ、溶
解した。それらＤＮＡを、ｐＤＭ１７(ＡＴＣＣ４１０
５５)の１.２ｋｂＢａｌＩ−ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片に
由来するニックトランスレーションした³²Ｐ−標識プロ
ーブと緩やかな条件下(５×ＳＳＣ、４０％ホルムアミ
ド、１×デンハルト溶液および１０％硫酸デキストラン
中、４２℃で４８時間)でハイブリダイズさせた。

【００４８】この挿入物には、ｔｒｋの全チロシンプロ
テインキナーゼ触媒ドメインが含まれていた[マーチン
−ザンカ(Martin−Zanca,D.)ら、Mol.Cell.Biol.９、２
４〜３３(１９８９)]。フィルターを２×ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳ中、室温にて３回、０.１×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ中、４２℃にて１回洗浄し、−７０℃にて増感スク
リーンに３日間暴露した。ついで、これらフィルターを
２.５ｍＭトリス(ｐＨ８.０)、０.１ｍＭＥＤＴＡ、
０.０２５％ピロリン酸ナトリウムおよび０.００１％デ
ンハルト溶液中、７０℃で３時間洗浄した。

【００４９】上記ライブラリーを、厳格な条件下、ｐＦ
ＲＫ４６、すなわち３'側の非翻訳領域を欠く全長マウ
スｔｒｋＢｃＤＮＡ[クライン(Klein,R.)ら、EMBO Jou
rnal８、３７０１〜３７０９(１９８９)参照]か、また
はｐＤＭ１７のいずれかに由来するニックトランスレー
ションした³²Ｐ−標識プローブで再スクリーニングし
た。これらプローブのいずれかとの強いハイブリダイゼ
ーションシグナルを示したファージは廃棄した。弱いハ
イブリダイゼーションを示したファージを取り、上記マ
ニアチスらの文献に記載の方法に従ってプラーク精製し
た。得られた挿入物をpBluescript[ストラタジーン(Str
atagene)]中にサブクローニングした。最長のｃＤＮＡ
挿入物を有するプラスミドをｐＦＬ７とした。

【００５０】リガンド結合領域と完全な経膜ドメインお
よびチロシンキナーゼ触媒ドメインとを含有する部分ｃ
ＤＮＡクローンであるｐＦＬ７の５'末端に対応しＰＣ
Ｒ法によって調製したニックトランスレーションした³²
Ｐ−標識プローブ(３００ｂｐ)で上記ライブラリーを再
スクリーニングすることにより、５'ｔｒｋＣ配列を含
有するｃＤＮＡクローンを単離した。このプローブは、
ブタｔｒｋＣ産物の細胞外ドメインのカルボキシル末端
および全経膜ドメインをコードする配列(図２〜図５に
おけるヌクレオチド１０８６〜１６００)に対応する。
この場合は、ハイブリダイゼーションは厳格な条件下
(５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１×デンハルト溶
液および１０％硫酸デキストラン中、４２℃にて４８時
間)で行った。陽性クローンを上記(マーチン−ザンカら
の上記文献)のようにしてプラーク精製した。その２.２
ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物をpBluescript(ストラタジーン)
中にサブクローニングしてｐＦＬ１５を得た。

【００５１】成体マウス脳ｃＤＮＡライブラリー[シト
リ(Citri M.)ら、Nature３２６、４２〜４７(１９８
７)]からマウスｔｒｋＣｃＤＮＡクローンを単離し
た。２×１０⁶のファージを大腸菌ＬＥ３９２の芝上に
プレーティングし、ニトロセルロースフィルター上に吸
着させ、緩やかな条件下(上記)でｐＦＬ７の３１５ｂｐ
ＳａｌＩ³²Ｐ−標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせ
た。２.４ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入物(最長の挿入物)をpBl
uescript中にサブクローニングしてｐＦＬ１６を得た。
ｐＦＬ１６の部分ヌクレオチド配列(配列の約８０％；
最も５'側寄りのヌクレオチドは示していない)(配列番
号３)およびそれから導かれた部分アミノ酸配列(配列の
約８０％；最もＮ末端寄りのアミノ酸は示していない)
(配列番号４)を下記に示す。プラスミドｐＦＬ１６は、
ブダペスト条約の下、１９９１年７月３日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(ロックビル、メ
リーランド州)にＡＴＣＣ受託番号７５０４５にて寄託
してある。

【００５２】Ｂ．ヌクレオチドシークエンシング唯一のＮａｅＩ部位を用い、ｐＦＬ１５のｃＤＮＡ配列
の５'末端をｐＦＬ７のｃＤＮＡ配列に連結してｐＦＬ
１９を調製した。シークエンシングは、二本鎖プラスミ
ドＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドおよび修飾Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ(シークエナーゼ；ＵＳバイオケミカル
ズ)を用いたチェインターミネーター法により行った。

【００５３】Ｃ．ノーザンブロッティング分析ＲＮＡｚｏｌ法[シンナ／バイオテックス(ＣＩＮＮＡ
／ＢＩＯＴＥＣＸＬａｂ.Ｉｎｔ.,Ｉｎｃ)]を用い、Ｂ
ａｌｂ／ｃマウスの成体組織から全細胞ＲＮＡを調製し
た。オリゴ(ｄＴ)−セルロースカラム[コラボラティブ
・リサーチ(Collaborative Research)]上でアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行うことにより、ポリ(Ａ)−
含有フラクションを単離した。４μｇのポリ(Ａ)ＲＮＡ
を１.２％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気
泳動にかけ、ニトロセルロースフィルターに移し、マウ
スｔｒｋＣの外部ドメインの一部に対応するｐＦＬ１６
の５７０ｂｐ ³²Ｐ−標識ＡｃｃＩフラグメントと厳格
な条件下(５×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１×デン
ハルト溶液および１０％硫酸デキストラン中、４２℃に
て４８時間)でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ
したフィルターを２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中、室温
で１５分間(３回)、ついで０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ中、６０℃で３０分間(１回)洗浄し、乾燥させ、暴露
した。

【００５４】Ｄ．インシチュハイブリダイゼーション文献記載の方法[ホーガン(Hogan,B.L.M.)ら、マニピュ
レーティング・ザ・マウス・エンブリオ(Manipulating
the Mouse Embryo)、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニュー
ヨーク(１９８６)]に従ってインシチュハイブリダイゼ
ーションを行った。ｐＦＬ１６の５７０ｂｐＡｃｃＩ
断片をｐＧＥＭ−３Ｚｆ(＋)[プロメガ(Promega)]中に
サブクローニングしてｐＦＬ２５を調製した。このＡｃ
ｃＩ挿入物は、マウスｔｒｋＣの細胞外ドメインの一部
に対応する。

【００５５】³⁵Ｓ−標識一本鎖アンチセンスｃＲＮＡプ
ローブを合成するため、ｐＦＬ２５をＳａｃＩで消化し
て直線状にし、³⁵Ｓ−標識ＵＴＰ(＞１０００Ｃｉ／ミ
リモル、デュポン)の存在下、ＳＰ６ＲＮＡポリメラー
ゼ(プロメガ)を用いてインビトロ転写を行った。６〜８
週の成体マウス脳の矢状縫合切片(厚さ５μｍ)をスーパ
ーフロストプラスガラススライド(superfrost plus gla
ss slides)[フィッシャー(Fisher)]上に積載した。厳格
な条件下(５０％ホルムアミド、１×デンハルト溶液、
１０％硫酸デキストラン、０.５ｍｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ
および１０ｍＭＤＴＴ中、５２℃にて１６時間)、アン
チセンスＲＮＡプローブ(６×１０⁵ｃｐｍ)とハイブリ
ダイゼーションを行った。上記スライドを５×ＳＳＣ、
１０ｍＭＤＴＴ中、５２℃で３０分間、ついで５０％ホ
ルムアミド、２×ＳＳＣおよび１０ｍＭＤＴＴを含有
する溶液中、６５℃にて２０分間洗浄した。

【００５６】ついで、上記切片をＲＮＡｓｅＡ(２０μ
ｇ／ｍｌ)およびＲＮＡｓｅＴ₁(２μｇ／ｍｌ)ととも
に３７℃で１時間、ついで５０％ホルムアミド、２×Ｓ
ＳＣおよび１０ｍＭＤＴＴとともに３７℃で３時間イ
ンキュベートした。最後にスライドを２×ＳＳＣ中、３
７℃で１５分間、ついで０.１×ＳＳＣ中、３７℃で１
５分間洗浄した。脱水した後、スライドを空気乾燥し、
ＮＴＢ−２ニュークリアトラックエマルジョン(nuclear
track emulsion)(コダック)中に浸漬し、４℃で７日間
暴露した。コントロールの切片は、ＳｐｈＩで直線状に
したｐＦＬ２５ＤＮＡのＴ７−プロモーターから転写し
た³⁵Ｓ−標識一本鎖センスｃＲＮＡプローブとハイブリ
ダイズした。

【００５７】Ｅ．発現プラスミドおよび遺伝子移動アッ
セイｐＦＬ１９の２,５３８ｂｐｃＤＮＡ挿入物を哺乳動物
発現ベクターｐＭＥＸ−ｎｅｏ[マーチン−ザンカら、M
ol.Cell.Biol.９、２４〜３３(１９８９)]中にサブクロ
ーニングした。得られたプラスミドｐＦＬ２０をＡａｔ
ＩＩ消化により直線状にした。この直線状にしたプラス
ミドでマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞をリン酸カルシウム沈降
法によりトランスフェクションしてＧ４１８耐性Ｒ４−
３１細胞を得た[グラハム(Graham,F.L.)およびファン・
デア・エッブ(van der Eb,A.J.)、Virology５２、４５
６〜４６７(１９７３)]。

【００５８】Ｆ．免疫沈降分析ツニカマイシン(１０μｇ／ｍｌ)の不在下または存在
下、細胞を³⁵Ｓ−標識メチオニン(５０μＣｉ／ｍｌ、
１,２００Ｃｉ／ミリモル)で３時間代謝的に標識した。
導き出されたｔｒｋ癌原遺伝子配列の１４カルボキシル
末端残基に対応する合成ペプチドに対してウサギで産生
させたポリクローナル抗体(４３−４)を用い、すでに記
載された方法[マーチン−ザンカら、Mol.Cell.Biol.
９、２４〜３３(１８８９)]により免疫沈降分析を行っ
た。

【００５９】ＩＩ．結果Ａ．ｔｒｋｃＤＮＡクローンのモレキュラークローニ
ング緩やかなハイブリダイゼーション条件下、ヒトｔｒｋ癌
原遺伝子の触媒領域に対応するプローブを用いて成体ブ
タ脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１０
０以上の組換えファージが陽性であることがわかった。
目的としないｔｒｋまたはｔｒｋＢｃＤＮＡ挿入物を
有するファージを同定するため、上記ファージを厳格な
条件下、ｔｒｋまたはｔｒｋＢ配列のいずれかに特異的
なプローブと再ハイブリダイズさせた(上記実験手順参
照)。これらプローブと弱くしかハイブリダイズしなか
った６つの陽性クローンを単離し、そのＥｃｏＲＩ挿入
物をpBluescript中にサブクローニングし、さらに特徴
付けを行った。

【００６０】これら６つのクローンは、１.９ｋｂｐか
ら２.３ｋｂｐのサイズの重複する挿入物を含有してい
た。これらクローンを部分的なヌクレオチド配列分析に
供した後に制限酵素分析したところ、これらはｔｒｋお
よびｔｒｋＢ癌原遺伝子と高い相関を有しているもの
の、それらとは区別されることがわかった。これらｔｒ
ｋ関連ｃＤＮＡクローンに由来する３２０ｂｐＳｃａ
Ｉ−ＡｐａＩＤＮＡ断片にブタ、マウスおよびヒト由
来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせたところ、ヒト
ｔｒｋおよびマウスｔｒｋＢｃＤＮＡクローンの対応
領域に由来するプローブとはハイブリダイズしない一連
のＤＮＡ断片が同定された(データは示していない)。こ
れら結果は、上記ｃＤＮＡクローンがブタｔｒｋまたは
ｔｒｋＢ遺伝子座には由来しないことを示している。そ
れゆえ、これらは新規なｔｒｋ関連遺伝子(ｔｒｋＣと
称する)によりコードされる転写物に対応するに違いな
い。

【００６１】Ｂ．ｔｒｋＣのヌクレオチド配列およびそ
れから導かれるアミノ酸配列上記クローンは、いずれも推定ｔｒｋＣ遺伝子産物のア
ミノ末端をコードする配列を含有してはいなかった。最
長ｃＤＮＡクローンであるｐＦＬ７の５'末端に由来す
る小さいプローブを用い、ブタｃＤＮＡライブラリーを
再スクリーニングした。２.２ｋｂｐＥｃｏＲＩ挿入物
を有する１つの組換えファージのみが同定された。共通
するＮａｅＩ部位(図２〜図５参照)を用い、この挿入物
(最も５'末端の方へ延びている)をｐＦＬ７挿入物と連
結して単一のｃＤＮＡクローン(ｐＦＬ１９)を調製し
た。ｐＦＬ１９のヌクレオチド配列を図２〜図５(配列
番号１)に示す。

【００６２】ヌクレオチド１〜３１は５'非コード配列
を示すと思われる。ヌクレオチド３２〜２５０６は、８
２５アミノ酸長のポリペプチドをコードする長い(２４
７５ｂｐ)読み取り枠に対応する。予測されるＡＴＧ開
始コドンは、哺乳動物の開始コドンの規範的配列とよく
適合する。さらに、このＡＴＧのすぐ上流にインフレー
ムの終止コドン(ＴＡＡ、ヌクレオチド１１〜１３)が存
在することは、このコドンがｔｒｋＣ遺伝子産物の翻訳
開始点であるという考えを支持している。最後の２０ヌ
クレオチドには、終止コドンＴＡＧおよび１７の３'非
翻訳残基が含まれている。この領域が小さいことおよび
ポリアデニレーションシグナルが存在しないことは、ｐ
ＦＬ１９がｔｒｋＣ転写物の３'非翻訳領域の有意部分
を欠失していることを示唆している。

【００６３】ＦＬ１９によってコードされるブタｔｒｋ
Ｃタンパク質の導かれたアミノ酸配列を図２〜図５(配
列番号２)に示す。この８２５アミノ酸長のポリペプチ
ド(９３,１２９ダルトン)は、シグナルペプチド(アミノ
酸１〜３１)、１４の共通Ｎ−グリコシル化部位(Ａｓｎ
−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ)を含む長い細胞外領域(アミノ酸
３２〜４２９)、単一の経膜ドメイン(アミノ酸４３０〜
４５３)、およびキナーゼ触媒ドメイン(アミノ酸５４４
〜８１０)を含む細胞質領域(アミノ酸４５４〜８２
５)、を含む細胞表面チロシンプロテインキナーゼの特
性を示す。ＡＴＰ結合モチーフのコンセンサス(consens
us)配列は、アミノ酸５４５〜５７２に位置する[ハンク
ス(Hanks,S.K.)ら、Science２４１、４２〜５２(１９８
８)参照]。ｔｒｋＣ産物は、ｔｒｋ遺伝子ファミリーの
他の２つの成員と同様、１５のアミノ酸残基からなる非
常に短いカルボキシル末端領域(カルボキシル末端にお
ける保存された遊離のチロシン残基を含む)を有する。

【００６４】ヒトｔｒｋおよびマウスｔｒｋＢ癌原遺伝
子産物に対するｔｒｋＣタンパク質の全体のホモロジー
は、それぞれ６７％および６８％である。その外部ドメ
インは、５４％(ｔｒｋＣおよびｔｒｋ)および５３％
(ｔｒｋＣおよびｔｒｋＢ)の類似性を示す。これら哺乳
動物ｔｒｋ遺伝子ファミリーの３つの成員の導かれたア
ミノ酸配列を並列すると、ｔｒｋＣ産物の１２の外部シ
ステイン残基がｔｒｋＢタンパク質の対応領域中に存在
し、また１０の残基はｔｒｋ遺伝子産物中にも存在する
ことが示される。さらに、この並列により、高度に保存
された領域(ｔｒｋＣ配列の残基３６８〜３７８)が存在
し、この領域はこれら３つのキナーゼ間で８２％の同一
性を示すことがわかった。興味深いことに、この配列
は、ｔｒｋ５癌遺伝子の悪性化に関与する５１アミノ酸
長の欠失の一部である[オスカム(Oskam,R.)ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA８５、８９１３〜８９１７(１９８
８)；クーリエ(Coulier,F.)ら、Mol.Cell.Biol.１０、
４２０２〜４２１０(１９９０)]。それゆえ、この領域
は、内部キナーゼドメインの触媒活性化を制御する上で
重要な役割を果たしているのかもしれない。

【００６５】最後に、２６７アミノ酸長の触媒ドメイン
は、ヒトｔｒｋと７６％同一であり(８７％の相同性)、
マウスｔｒｋＢキナーゼと８３％同一である(８８％の
相同性)。ｔｒｋＣタンパク質の配列を細胞表面チロシ
ンプロテインキナーゼファミリーの他の成員と比較した
場合、はるかに低い相同性が得られた。ｔｒｋＣ産物の
触媒キナーゼ領域は、ｔｒｋおよびｔｒｋＢチロシンキ
ナーゼの特性を示す[クラインら、EMBO J.８、３７０１
〜３７０９(１９８９)；マーチン−ザンカら、Mol.Cel
l.Biol.９、２４〜３３(１９８９)]。

【００６６】これらキナーゼ領域には、(ｉ)他のすべて
のチロシンプロテインキナーゼ中に存在する(Ｋ５６２
ヒト白血病細胞で発現される推定チロシンキナーゼＪＴ
Ｋ１０を除く)アラニンの代わりにスレオニン残基(アミ
ノ酸６８２)を含み[パータネン(Partanen,J.)ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA８７、８９１３〜８９１７(１９９
０)]；(ｉｉ)推定自己リン酸化(autophosphorylation)
部位(Ｔｙｒ⁷⁰⁹)の次に第二のチロシン残基が続いてお
り(インシュリンレセプター亜群にも認められる特性)；
(ｉｉｉ)簡単なアミノ酸ギャップ(残基５７６と５７７
の間)が存在し；(ｉｖ)７５７位にトリプトファンが存
在し；および(ｖ)８０１位においてヘリックス破壊プロ
リンが欠如している[ハンクスら、Science２４１、４２
〜５２(１９８８)]。最後に、ｔｒｋＣタンパク質は、
ｔｒｋおよびｔｒｋＢキナーゼと同様、特徴的な短いカ
ルボキシル末端尾部を有している。この１５アミノ酸長
の領域には、ｔｒｋおよびｔｒｋＢキナーゼと同一の８
残基(１２の相同)[カルボキシル末端から５番目の残基
に位置するチロシン(Ｔｙｒ⁸²⁰)を含む]が含まれてい
る。

【００６７】Ｃ．ｔｒｋＣ産物ｇｐ１４５^trkCの同定つぎに、ｐＦＬ１９を哺乳動物発現ベクターｐＭＥＸｎ
ｅｏ[マーチン−ザンカら、Mol.Cell.Biol.９、２４〜
３３(１９８９)]中にサブクローニングし、得られたプ
ラスミドｐＦＬ２０を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞をトラン
スフェクションした。幾つかのＧ４１８耐性コロニー単
離し、ｔｒｋタンパク質の１４カルボキシル末端残基に
対応するペプチドに対して産生させたウサギポリクロー
ナル抗体を用いた免疫沈降分析に供した[マーチン−ザ
ンカら、Mol.Cell.Biol.９、２４〜３３(１９８９)]。
図６に示すように、この抗血清は、成熟ｔｒｋＣ産物
(ｇｐ１４５^trkCと称する)に対応すると思われる見掛け
の分子量が１４５,０００の主要なタンパク質を認識し
た。

【００６８】この分子はツニカマイシンの存在下では分
子量９０,０００のタンパク質に対応する一層速い電気
泳動移動度を示すので、糖タンパク質であると思われ
る。この値は、ｔｒｋＣ産物のポリペプチド骨格に対し
て予想されるサイズ(９３ｋＤａからシグナルペプチド
を除いたもの)とよく一致する。ｇｐ１４５^trkCに加え
て、約１２０,０００ダルトンの小さい糖タンパク質も
同定されたが、これは部分的に糖付加された前駆体を示
していると思われる。予想されたように、ｇｐ１４５
^trkCはチロシン残基に対して特異的なインビトロキナー
ゼ活性を示した。

【００６９】Ｄ．ｔｒｋＣは中枢神経系で発現される上記結果は、構造的並びに機能的な類似性により、ｔｒ
ｋＣがｔｒｋおよびｔｒｋＢとともにキナーゼレセプタ
ーの亜群を構成していることを示している。この可能性
を調べるため、一連の成体マウス組織をノーザンブロッ
ティング分析に供した。ｔｒｋ遺伝子ファミリーの他の
成員とのクロスハイブリダイゼーションが起こるのを防
ぐため、マウス脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グすることにより２.４ｋｂｐのマウスｔｒｋＣｃＤＮ
Ａクローンを単離した。図７および図８に示すように、
脳中で６.１ｋｂおよび４.７ｋｂのｔｒｋＣ転写物を容
易に検出することができる。しかしながら、卵巣を例外
として、他の組織では検出可能なレベルのｔｒｋＣ転写
物は認められなかった。これらの結果は、ｔｒｋＣ遺伝
子産物が神経性レセプターとして機能するのかもしれな
いことを示唆している。

【００７０】ｔｒｋＣ遺伝子が発現される脳の構造を決
定するため、成体マウス脳の中央矢状縫合切片のプレ(p
reliminary)インシチュハイブリダイゼーション分析を
行った。図９に示すように、細胞外領域に由来するマウ
スｔｒｋＣプローブは、海馬の錐体細胞層、歯状回およ
び大脳皮質の外層を含む識別される構造にハイブリダイ
ズした。さらに、ｔｒｋＣ転写物は、顆粒細胞層などの
小脳の特定の領域でも同定された。白質またはプルキニ
ェ細胞層中には検出可能なｔｒｋＣ発現を観察すること
はできなかった。以上の結果は、ｔｒｋＣが中枢神経系
の定められた構造中で主として発現されることを示して
いる。

【００７１】実施例２Ｉ．材料および方法Ａ．ｔｒｋＣＫ２およびＫ３ｃＤＮＡクローンの単離上記およびランバルレ(Lamballe,F.)らのCell６６、９
６７〜９７９(１９９１)の記載に従い、ヒトｔｒｋ癌原
遺伝子の全触媒ドメインに対応するプローブ(ｐＤＭ１
７の１.２ＫｂＢａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片)を用いて緩
やかな条件下でハイブリダイズさせることにより、成体
雄ブタ脳ｃＤＮＡライブラリー(クロンテック・ラボラ
トリーズ)から４２ヌクレオチド挿入物を有するｔｒｋ
ＣｃＤＮＡクローンを単離した。弱いハイブリダイゼ
ーションを示した６つのファージをプラーク精製し、そ
のＥｃｏＲＩ挿入物を上記マニアチスらの文献記載に従
い、pBluescript(ストラタジーン)中にサブクローニン
グした。このＥｃｏＲＩ挿入物を、チェインターミネー
ター法により、二本鎖プラスミドＤＮＡ、合成オリゴヌ
クレオチドおよび修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(シーク
エナーゼ、ＵＳＢ)を用いて配列決定した。

【００７２】上記６つのｃＤＮＡの配列を比較すること
により、本発明者らは、そのうちの１つがチロシンキナ
ーゼドメインをコードする領域中に挿入された４２ヌク
レオチドからなる別の配列を含んでいることを発見し
た。このｃＤＮＡ(２.３ＫｂＥｃｏＲＩ断片)をpBluesc
ript中にサブクローニングし、ｐＦＬ６とした。ｐＦＬ
６およびｐＦＬ１９[当初のｔｒｋＣレセプター(本実施
例では「ｔｒｋＣＫ１」と称する)を含有するプラスミ
ド；上記実施例１およびランバルレらのCell６６、９６
７〜９７９(１９９１)参照]のｃＤＮＡをそれらの唯一
のＳａｌＩ部位を用いて組み立てることにより、ｐＦＬ
２２を調製した。

【００７３】ｔｒｋＣＫ３と称するタンパク質をコー
ドする他の新たな配列が、複製連鎖反応(ＰＣＲ)による
増幅によって成体マウス脳のｃＤＮＡから得られた。
５'アンプリマーは、オリゴヌクレオチド：５'−ＣＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＧＡ
ＧＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＧ−３' (作出されたＥｃｏＲＩ部位(下線)を含む)であり、３'
アンプリマーは、オリゴヌクレオチド：５'−ＣＧＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＴＧＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＧＧＴＡＣ−３' (作出されたＸｂａＩ部位(下線)を含む)であった。

【００７４】これらアンプリマーは、上記４２ヌクレオ
チドの挿入物の近接領域をコードする配列に対応する。
得られたＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消
化し、ついでpBluescript中にクローニングした。３つ
のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片をクローニングした(１５
９ｂｐ、２０１ｂｐおよび２３４ｂｐ)。チェインター
ミネーター法並びにpBluescriptのＴ３およびＴ７プラ
イマーを用いてヌクレオチド配列分析を行った。pBlues
cript中にサブクローニングした２３４ｂｐＥｃｏＲＩ
／ＸｂａＩ断片をｐＦＬ２８と称することとし、ブタｔ
ｒｋＣのマウス相同体のチロシンキナーゼドメインの断
片であることがわかったが、上記ｐＦＬ２２の４２ヌク
レオチド挿入物と同じ位置に７５ヌクレオチドからなる
別の配列も挿入されていた。このｐＦＬ２８の２３４ｂ
ｐＤＮＡ断片を制限酵素ＡｃｃＩおよびＦｏｋＩで消
化して１４３ｂｐのＤＮＡ断片を得、ついで、これをｔ
ｒｋＣＫ１レセプターをコードするｃＤＮＡ中に挿入
した。ついで、かくして組み立てたｃＤＮＡを哺乳動物
発現ベクターであるｐＭＥＸｎｅｏ[マーチン−ザンカ
ら、Mol.Cell.Biol.９、２４〜３３(１９８９)]中にサ
ブクローニングしてｐＦＬ３２を得た。

【００７５】Ｂ．ｔｒｋＣＮＣ１およびＮＣ２ｃＤＮ
Ａクローンのクローニング上記およびランバルレらのCell６６、９６７〜９７９
(１９９１)の記載に従い、ｔｒｋＣＫ１レセプターを
コードするｃＤＮＡの５'末端に対応するプローブを用
いて成体ブタ脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
した。このプローブに対しては１つのクローンのみがハ
イブリダイゼーションを示した。このファージをプラー
ク精製した。２.２ＫｂＥｃｏＲＩ挿入物が同定され、
これをpBluescript中にサブクローニングしてｐＦＬ１
５を調製した。細胞外ドメインおよび経膜ドメインの
３'領域をコードする配列に対応する³²Ｐ−標識３１５
ｂｐＳａｌＩＤＮＡ断片を用い、マウス脳ｃＤＮＡラ
イブラリー[シトリら、Nature３２６、４２〜４７(１９
８７)]をスクリーニングした。

【００７６】６つの陽性ファージを取り出した。サイズ
が０.９Ｋｂから２.５Ｋｂの範囲のＥｃｏＲＩ挿入物を
pBluescript中にサブクローニングした。２.５ＫｂのＥ
ｃｏＲＩ挿入物を有するプラスミドの制限消化により、
このものは、ｔｒｋＣとして同定される他のクローンと
は異なるパターンを示すことがわかった。このプラスミ
ドをｐＦＬ１８とした。ｐＦＬ１５およびｐＦＬ１８の
ヌクレオチド配列の決定を、Ｔ３およびＴ７プライマ
ー、合成オリゴヌクレオチドおよび修飾Ｔ７ＤＮＡポ
リメラーゼ(シークエナーゼ、ＵＳＢ)を用いたチェイン
ターミネーター法により行った。

【００７７】Ｃ．発現プラスミドおよび細胞グラハムよびファン・デア・エッブのVirology５２、４
５６〜４６７(１９７３)に記載のリン酸カルシウム沈降
法を用い、ｐＦＬ２０(ｔｒｋＣＫ１)、ｐＦＬ２３(ｔ
ｒｋＣＫ２)およびｐＦＬ３２(ｔｒｋＣＫ３)でトラ
ンスフェクションすることにより、ＮＩＨ３Ｔ３由来細
胞株としてそれぞれＧ４−６−１１、Ｇ４−８−１１お
よびＦＬ１２−３−６を得た。発現プラスミドｐＦＬ２
０は、上記およびランバルレらのCell６６、９６７〜９
７９(１９９１)に記載されているように、ｔｒｋＣＫ
１ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクターであるｐＭＥＸｎ
ｅｏ中にサブクローニングすることにより調製した。ｐ
ＦＬ２３は、ｔｒｋＣＫ２レセプターをコードするｐ
ＭＥＸｎｅｏ由来の発現プラスミドである。ｐＦＬ２３
を調製するため、ｐＦＬ２２の２５６８ｂｐＥｃｏＲ
Ｉ断片(完全長のｔｒｋＣＫ２ｃＤＮＡに対応する)を
哺乳動物発現ベクターであるｐＭＥＸ−ｎｅｏ中にサブ
クローニングした[マーチン−ザンカら、Mol.Cell.Bio
l.９、２４〜３３(１９８９)]。ｔｒｋＣＫ３レセプタ
ーをコードする発現プラスミドであるｐＦＬ３２は上記
の通りである。

【００７８】ＩＩ．結果Ａ．複数のｔｒｋＣチロシンプロテインキナーゼレセプ
ター本発明者らは、上記でｔｒｋ遺伝子ファミリーの新たな
構成成員を単離しｔｒｋＣと称したが、本実施例ではｔ
ｒｋＣＫ１と称する[上記およびランバルレのCell６
６、９６７〜９７９(１９９１)参照]。本遺伝子の研究
中に、本発明者らはまた第二のｔｒｋＣｃＤＮＡ(ｐＦ
Ｌ６)を単離したが、このものには上記ｔｒｋＣをコー
ドする配列のコドン７１１と７１２に対応するヌクレオ
チド間(ブタｔｒｋＣ遺伝子の全コード領域を包含する
２５２６ｂｐｃＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドで
あるｐＦＬ１９のヌクレオチド２１６４−２１６５間)
[上記およびランバルレらのCell６６、９６７〜９７９
(１９９１)参照]に、チロシンキナーゼドメインをコー
ドする領域内に４２ヌクレオチドの付加配列が挿入され
ていた。このｐＦＬ６ｃＤＮＡクローンの残りの配列
はｐＦＬ１９と同一であることがわかった。

【００７９】以上の観察結果は、触媒チロシンキナーゼ
ドメイン中に１４の付加的アミノ酸残基を有する第二の
ｔｒｋＣレセプターが存在することを示唆している(図
１０参照)。さらに詳細には、これら残基は、インシュ
リンレセプターサブファミリーに特徴的なＹＹＲモチー
フに続いて、サブドメインＶＩＩ[ハンクスら、Science
２４５、４２〜５２(１９８８)]の末端に位置してお
り、その際、第一のチロシンはＳｒｃキナーゼの自己リ
ン酸化部位に対応すると考えられる。本発明者らは、こ
の推定ｔｒｋＣレセプターイソ形をｔｒｋＣＫ２と称
することにした。上記で特徴付けを行ったｔｒｋＣレセ
プターｇｐ１４５^trkC(上記およびランバルレらのCell
６６、９６７〜９７９(１９９１)参照)は、以下、ｔｒ
ｋＣＫ１と称することにする(図１〜図５参照)。

【００８０】上記ｐＦＬ６の４２ヌクレオチド挿入物が
クローニングによる人工産物(artifact)である可能性を
排除するため、本発明者らは、該挿入領域の両側面に位
置するアンプリマーを用いた全成体マウス脳ｃＤＮＡの
複製連鎖反応(ＰＣＲ)による増幅を行った。また、コン
トロールとしてｐＦＬ１９およびｐＦＬ６についても平
行してＰＣＲ増幅を行った。図１０に示すように、増幅
したＤＮＡには３つの区別されるＤＮＡ断片が含まれて
いた。これら断片のうち２つは、ｔｒｋＣＫ１(１５９
ｂｐ)およびｔｒｋＣＫ２(２０１ｂｐ)レセプターイソ
形をそれぞれコードするｃＤＮＡから増幅される配列に
対して期待されるサイズに対応していた。第三のＰＣＲ
生成物は、約２４０ｂｐのＤＮＡ断片に対応する電気泳
動移動度を示したが、このことは他のコード配列を有す
る新たなｔｒｋＣｃＤＮＡが存在することを示唆して
いた(図１０)。

【００８１】これらＰＣＲ生成物の性質を調べるため、
これらをpBluescript中にサブクローニングし、代表的
なクローンについてヌクレオチド配列分析を行った。最
小のＤＮＡ断片に由来するクローンは、すべて上記ｔｒ
ｋＣＫ１に対して期待される配列を示した[ｇｐ１４５
^trkC；上記およびランバルレらのCell６６、９６７〜９
７９(１９９１)参照]。同様に、中位のサイズのＤＮＡ
断片からは、ｐＦＬ６中に存在するのと同じ配列、すな
わち推定ｔｒｋＣＫ２レセプターイソ形をコードする
転写物に対応する配列を有するコロニーが得られた。

【００８２】一層大きなＰＣＲ生成物からのクローンも
ｔｒｋＣ遺伝子の同じ領域に由来する配列を有していた
が、ｐＦＬ６の上記４２ヌクレオチド挿入物と同じ位置
(ｐＦＬ１９のコドン７１０と７１１との間)に７５ヌク
レオチドの挿入物が挿入されていた。これらの観察結果
から、第三のｔｒｋＣレセプターイソ形が存在すること
が示唆され、これをｔｒｋＣＫ３と称することとし
た。これら推定ｔｒｋＣチロシンキナーゼレセプターの
模式図を図１０に示す。

【００８３】上記の結果から、ｔｒｋＣＫ２をコード
するＤＮＡ配列は、下記ＤＮＡ配列：ＣＴＣＴＴＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴ
ＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＧがヌクレオチド２１６４と２１６５との間に付加されて
いる他は図２〜図５に示す配列と同じであるのがわか
る。ブタｔｒｋＣＫ２のアミノ酸配列は、アミノ酸７
１１と７１２との間に図１０(Ｂ)に示す１４のアミノ酸
が付加されている他は図２〜図５に示す配列と同じであ
る。マウスｔｒｋＣＫ２をコードする部分ＤＮＡ配列
およびそれから導かれたアミノ酸配列は、それぞれ配列
番号３および４に示す。

【００８４】マウスｔｒｋＣＫ３をコードする部分Ｄ
ＮＡ配列は、ヌクレオチド１８０１〜１８４２が下記Ｄ
ＮＡ配列：ＧＡＡＧＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴ
ＴＣＡＡＣＧＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧ
ＧＣＴＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡで置換されている他は配列番号３に示した配列と同じで
ある。マウスｔｒｋＣＫ３の部分アミノ酸配列は、アミ
ノ酸６０１〜６１４が図１０（Ｃ)に示す２５のアミノ
酸で置換されている他は配列番号４に示す配列と同じで
ある。マウスｔｒｋＣＫ１をコードする部分ＤＮＡ配
列は、ヌクレオチド１８０１〜１８４２が欠失している
他は配列番号３に示す配列と同じである。マウスｔｒｋ
ＣＫ１の部分アミノ酸配列は、アミノ酸６０１〜６１
４が欠失している他は配列番号４に示す配列と同じであ
る。

【００８５】Ｂ．非触媒ｔｒｋＣレセプターイソ形上記ｔｒｋＣレセプターの新規触媒イソ形に加えて、本
発明物らは、以前に記載されたｇｐ９５^trkBタンパク質
[クラインら、Cell、６１、６４７〜６５６(１９９０)]
と類似の推定非触媒ｔｒｋＣレセプターをコードする２
つのｃＤＮＡを同定した。ｐＦＬ６を得たのと同じ成体
ブタ脳ｃＤＮＡライブラリーをｐＦＬ１９の５'末端に
対応するプローブでスクリーニングしたところ、チロシ
ンキナーゼ触媒ドメインをコードする配列を欠く新たな
２１８１ｂｐ長のｃＤＮＡクローン(ｐＦＬ１５)が得ら
れた。

【００８６】ｐＦＬ１５のヌクレオチド１〜１４８０は
ｐＦＬ１９中に存在するヌクレオチドと同一である[ラ
ンバルレら、Cell６６、９６７〜９７９(１９９１)]。
これらヌクレオチドは、細胞外ドメインおよび経膜ドメ
イン並びにｔｒｋＣＫ１レセプターの細胞質領域の最
初の３０のアミノ酸をコードするヌクレオチドに対応す
る。しかしながら、ｐＦＬ１５とｐＦＬ１９との相同性
は、ヌクレオチド１４８１までである。ｐＦＬ１５は、
インフレームの終止コドン(ＴＡＧ)に続いて２１の付加
的アミノ酸残基をコードし得る非関連ヌクレオチド配列
を示す(図１０)。このｃＤＮＡクローンによってコード
される推定レセプターをｔｒｋＣＮＣ１と称すること
にした(「ＮＣ」とは非触媒を意味する)。このｔｒｋＣ
ＮＣ１の独特の２１アミノ酸残基と３つのｔｒｋキナー
ゼレセプターとの間には相同性は認められなかった。ｐ
ＦＬ１５の３'非翻訳領域(ヌクレオチド１５４６〜２１
８１)もまた、上記で特徴付けたｔｒｋＣｃＤＮＡクロ
ーンと関連性を有しないこともわかった(図１０)。

【００８７】成体マウス脳ｃＤＮＡライブラリーを上記
ブタｐＦＬ１９ｃＤＮＡクローンの５'領域に由来する
プローブでスクリーニングすることにより、推定第二非
触媒ｔｒｋＣレセプターイソ形(「ｔｒｋＣＮＣ２」と称
する)をコードし得る幾つかのｃＤＮＡクローンが認め
られた。最長のｃＤＮＡクローン(ｐＦＬ１８)には２,
３００ｂｐのｃＤＮＡ挿入物が含まれており、そのうち
ヌクレオチド１〜１０６６は、細胞外ドメインのカルボ
キシル末端側半分、経膜領域および細胞質ドメインの最
初の１３のアミノ酸残基をコードするブタｐＦＬ１９
ｃＤＮＡクローンの配列(コドン１１２〜４６６に対応
するヌクレオチド)と広範囲の相同性を示した。しかし
ながら、上記ブタｐＦＬ１５ｃＤＮＡクローンでも示
したように、マウスｐＦＬ１８ｃＤＮＡクローンのヌ
クレオチド１０７７〜２３００は、すべてのブタｃＤＮ
Ａクローンと関連性を有していなかった。これら独特の
配列は、インフレームのＴＡＡ終止コドンに続く３６ア
ミノ酸配列をコードしていた。これら３６アミノ酸残基
は、上記ｔｒｋＣレセプターイソ形のいずれとも相同性
を示さない。これら非触媒ｔｒｋＣレセプター(すなわ
ちｔｒｋＣＮＣ１およびｔｒｋＣＮＣ２)の模式図を
図１０に示す。

【００８８】上記結果から、ブタｔｒｋＣＮＣ１をコ
ードするＤＮＡ配列は図２〜図５に示すヌクレオチド１
〜１４８０からなるが、ヌクレオチド１４８１〜２５２
６の代わりに下記ＤＮＡ配列：ＡＴＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＴ
ＣＡＴＣＡＣＴＧＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣ
ＡＧＴＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡを有することがわかる。ブタｔｒｋＣＮＣ１のアミノ
酸配列は、図２〜図５に示すアミノ酸１〜４８３からな
るが、アミノ酸４８４〜８２５の代わりに図１０(Ｅ)に
示すアミノ酸を有する。

【００８９】マウスｔｒｋＣＮＣ２をコードする部分
ＤＮＡ配列は、配列番号３に示すヌクレオチド１〜１０
６５からなるが、ヌクレオチド１０６６〜２３７６の代
わりに下記ＤＮＡ配列：ＡＡＧＧＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣＡＡＧ
ＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＴＧＡＴ
ＣＡＡＡＡＧＡＴＡＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＡＴＧＣ
ＴＣＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＣＴＧ
ＧＡＣＣＴＴＧＧＴＡＡを有する。マウスｔｒｋＣＮＣ２の部分アミノ酸配列
は、配列番号４に示すアミノ酸１〜３５５からなるが、
アミノ酸３５６〜７２８の代わりに図１０(Ｄ)に示すア
ミノ酸配列を有する。

【配列表】

【００９０】配列番号：１配列の長さ：２５２６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列の特徴： (Ａ)特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ)存在位置：３２....２５０６配列：

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】

【００９１】配列番号：２配列の長さ：８２５配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：タンパク質配列：

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【００９２】配列番号：３配列の長さ：２３７６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直線状配列の種類：ｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏ配列の特徴： (Ａ)特徴を表す記号：ＣＤＳ (Ｂ)存在位置：１....２１８４配列：

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【００９３】配列番号：４配列の長さ：７２８配列の型：アミノ酸トポロジー：直線状配列の種類：タンパク質配列：

【化２２】

【化２３】

【化２４】

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＦＬ１９の模式図。

【図２】ｐＦＬ１９の２５２６ｂｐ挿入物のヌクレオ
チド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列。

【図３】ｐＦＬ１９の２５２６ｂｐ挿入物のヌクレオ
チド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列。

【図４】ｐＦＬ１９の２５２６ｂｐ挿入物のヌクレオ
チド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列。

【図５】ｐＦＬ１９の２５２６ｂｐ挿入物のヌクレオ
チド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列。

【図６】（Ａ)発現プラスミドｐＦＬ２０でトランス
フェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、(Ｂ)ｔｒｋ癌原遺
伝子産物を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞および(Ｃ)親ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞の[³⁵Ｓ]メチオニン標識細胞抽出物を、１
０μｇ／ｍｌのツニカマイシンの不在下(−)または存在
下(＋)で増殖させ、免疫前(Ｐ)に、またはｔｒｋ癌原遺
伝子産物の１４カルボキシル末端アミノ酸に対応するペ
プチドに対して産生させた血清で免疫して(Ｉ)免疫沈降
分析に供した結果を示す電気泳動写真。

【図７】一連の成体マウス組織中でのｔｒｋＣ転写物
の検出を示す電気泳動写真。

【図８】一連の成体マウス組織中でのｔｒｋＣ転写物
の検出を示す電気泳動写真。

【図９】成体マウス脳の中央矢状縫合切片におけるｔ
ｒｋＣ発現を示す組織写真。

【図１０】 (Ａ)ｔｒｋＣＫ１、(Ｂ)ｔｒｋＣＫ２、
(Ｃ)ｔｒｋＣＫ３、(Ｄ)ｔｒｋＣＮＣ１および(Ｅ)ｔ
ｒｋＣＮＣ２遺伝子を示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/85 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (72)発明者ファビエンヌ・ランベールアメリカ合衆国ニュージャージー州ローレンスビル、フィールドクレスト・コート 2223番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部を
コードする核酸配列からなることを特徴とする、単離核
酸分子。
【請求項２】該核酸分子がＤＮＡ分子であり、該核酸
配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】該ＤＮＡ配列が、実質的に図２〜図５
(配列番号１)に示すヌクレオチド配列を有する、請求項
２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】該ＤＮＡ配列が、実質的に図２〜図５
(配列番号１)に示すヌクレオチド配列の一部を有する、
請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】該ＤＮＡ配列が、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに寄託してあるｐＦＬ１６の
２.４ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物のヌクレオチド配列を有す
る、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】該ＤＮＡ配列が、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクションに寄託してあるｐＦＬ１６の
２.４ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物のヌクレオチド配列の一部
を有する、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】請求項３、４、５または６に記載のＤＮ
Ａ配列に相補的なＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子。
【請求項８】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部を
コードするＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
【請求項９】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部を
コードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を指令
することができ、該配列に機能的に連結した１または２
以上の制御ＤＮＡ配列を含む、請求項８に記載の発現ベ
クター。
【請求項１０】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列が、実質的に図２〜図５(配列
番号１)に示すヌクレオチド配列を有する、請求項８に
記載の発現ベクター。
【請求項１１】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列が、実質的に図２〜図５(配列
番号１)に示すヌクレオチド配列の一部を有する、請求
項８に記載の発現ベクター。
【請求項１２】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列が、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託してあるｐＦＬ１６の２.
４ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物のヌクレオチド配列を有す
る、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１３】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列が、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託してあるｐＦＬ１６の２.
４ｋｂＥｃｏＲＩ挿入物のヌクレオチド配列の一部を
有する、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１４】ｐＦＬ１９である、請求項８に記載の
発現ベクター。
【請求項１５】ｐＦＬ１６である、請求項８に記載の
発現ベクター。
【請求項１６】請求項１４または１５に記載の発現ベ
クターの同定特性を有する発現ベクター。
【請求項１７】請求項８に記載の発現ベクターを有す
る原核または真核宿主細胞。
【請求項１８】請求項９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５または１６に記載の発現ベクターを有する原
核または真核宿主細胞。
【請求項１９】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
からなるポリペプチド分子の製造方法であって、請求項
８に記載の宿主細胞を該ポリペプチド分子の発現が可能
な条件下で培養することを特徴とする方法。
【請求項２０】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
をコードする核酸配列または関連核酸配列の検出方法で
あって、該核酸配列を該核酸配列の少なくとも一部に特
異的に結合する検出可能なマーカーと接触させ、ついで
結合したマーカーを検出して該結合したマーカーの存在
により該核酸配列の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２１】ｔｒｋＣタンパク質の全部または一部
からなる単離ポリペプチド分子。
【請求項２２】請求項２に記載のＤＮＡ配列によりコ
ードされた単離ポリペプチド分子。
【請求項２３】実質的に図２〜図５(配列番号２)に示
すアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載のポリペプ
チド分子。
【請求項２４】実質的に図２〜図５(配列番号２)に示
すアミノ酸配列の一部を有する、請求項２１に記載のポ
リペプチド分子。
【請求項２５】アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託してあるｐＦＬ１６の２.４ｋｂＥｃ
ｏＲＩ挿入物によってコードされるアミノ酸配列を有す
る、請求項２１に記載のポリペプチド分子。
【請求項２６】アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに寄託してあるｐＦＬ１６の２.４ｋｂＥｃ
ｏＲＩ挿入物によってコードされるアミノ酸配列の一部
を有する、請求項２１に記載のポリペプチド分子。
【請求項２７】コードされたｔｒｋＣタンパク質がｔ
ｒｋＣＫ１、ｔｒｋＣＫ２、ｔｒｋＣＫ３、ｔｒｋ
ＣＮＣ１またはｔｒｋＣＮＣ２である、請求項２に記
載のＤＮＡ分子。
【請求項２８】コードされたｔｒｋＣタンパク質がｔ
ｒｋＣＫ１、ｔｒｋＣＫ２、ｔｒｋＣＫ３、ｔｒｋ
ＣＮＣ１またはｔｒｋＣＮＣ２である、請求項８に記
載の発現ベクター。
【請求項２９】コードされたｔｒｋＣタンパク質がｔ
ｒｋＣＫ１、ｔｒｋＣＫ２、ｔｒｋＣＫ３、ｔｒｋ
ＣＮＣ１またはｔｒｋＣＮＣ２である、請求項２１に
記載のポリペプチド分子。