JP2003527076A - 骨形態形成タンパク質 - Google Patents
骨形態形成タンパク質Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、新規ヒトＢＭＰポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域を含む単離された核酸に関する。ＢＭＰとは、骨、軟骨、腱および骨に存在する他の組織の形成および修復を担う骨形態形成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を示す。ヒトＢＭＰポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法もまた提供される。本発明はさらに、これらの新規ヒトＢＭＰポリペプチドに関する障害を診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規の骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に関する。より詳細には、
新規なＢＭＰポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。新規
なＢＭＰポリペプチドおよびこれらのペプチドに結合する抗体が提供される。ヒ
トＢＭＰポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチを産生するためのベクター
、宿主細胞、および組換えおよび合成方法もまた提供される。本発明はさらに、
これらの新規なＢＭＰポリペプチドに関連した障害を診断、処置、予防、および
／または予後の判定に有用な診断的および治療的方法に関連する。本発明はさら
に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴ
ニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、本発明
のポリペプチドの産生および機能を阻害するための方法および／組成物に関する
。
新規なＢＭＰポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。新規
なＢＭＰポリペプチドおよびこれらのペプチドに結合する抗体が提供される。ヒ
トＢＭＰポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチを産生するためのベクター
、宿主細胞、および組換えおよび合成方法もまた提供される。本発明はさらに、
これらの新規なＢＭＰポリペプチドに関連した障害を診断、処置、予防、および
／または予後の判定に有用な診断的および治療的方法に関連する。本発明はさら
に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴ
ニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、本発明
のポリペプチドの産生および機能を阻害するための方法および／組成物に関する
。
【０００２】
（発明の背景）
（発明）
本発明は、骨、軟骨、腱および骨に存在する他の組織の形成および修復を担う
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に関する。骨形態形成タンパク質ファミリーの
メンバーは、軟骨および骨の形成の誘導に有用である。例えば、ＢＭＰ−２は、
ラット異所性インプラントモデル（例えば、米国特許第５，０１３，６４９号を
参照のこと）、イヌの下顎骨欠損（例えば、Ｔｏｒｉｕｍｉら、Ａｒｃｈ．Ｏｔ
ｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．、１１７：１１０１〜１
１１２（１９９１））；ヒツジの大腿分節欠損（Ｇｅｒｈａｒｔら、Ｔｒａｎｓ
Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ Ｓｏｃ、１６：１７２（１９９１））において、新し
い軟骨および／または骨組織のインビボでの形成を誘導し得る。ＢＭＰファミリ
ーの他のメンバーはまた、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７を含む骨形
成活性を有する（例えば、Ｗｏｚｎｅｙ，Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ Ｂｏｎｅ、１３１〜１６７頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１
９９３）を参照のこと）。ＢＭＰタンパク質はさらに、軟骨、腱、靭帯、神経組
織を含む種々の他の組織における誘導性および／または分化増強活性を実証する
。
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）に関する。骨形態形成タンパク質ファミリーの
メンバーは、軟骨および骨の形成の誘導に有用である。例えば、ＢＭＰ−２は、
ラット異所性インプラントモデル（例えば、米国特許第５，０１３，６４９号を
参照のこと）、イヌの下顎骨欠損（例えば、Ｔｏｒｉｕｍｉら、Ａｒｃｈ．Ｏｔ
ｏｌａｒｙｎｇｏｌ Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．、１１７：１１０１〜１
１１２（１９９１））；ヒツジの大腿分節欠損（Ｇｅｒｈａｒｔら、Ｔｒａｎｓ
Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ Ｓｏｃ、１６：１７２（１９９１））において、新し
い軟骨および／または骨組織のインビボでの形成を誘導し得る。ＢＭＰファミリ
ーの他のメンバーはまた、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７を含む骨形
成活性を有する（例えば、Ｗｏｚｎｅｙ，Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉ
ｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
，ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏ
ｆ Ｂｏｎｅ、１３１〜１６７頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１
９９３）を参照のこと）。ＢＭＰタンパク質はさらに、軟骨、腱、靭帯、神経組
織を含む種々の他の組織における誘導性および／または分化増強活性を実証する
。
【０００３】
ＢＭＰは、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）の大きなスーパ
ーファミリーの一部を形成する。このファミリーは、胚形成、内分泌機能調節因
子、広範な調節因子、および細胞の増殖および分化に特異的な調節因子を含む。
ＴＧＦ−βは、このファミリーの基本型である。ＴＧＦ−βは、ジスルフィド架
橋によりともに保持される２つの同一の１１２アミノ酸の鎖の二量体である。各
鎖は、分泌ポリペプチドの特徴を有する約３９０のアミノ酸のより長い前駆体か
ら開始され合成され、分子の分泌のために分泌ペプチドとして機能するべきであ
るＮ末端領域における疎水性配列を示す。次いで、この前駆体は、特定のペプチ
ダーゼによる切断によりその成熟形態へとプロセシングされる。このペプチダー
ゼは、生物学的活性ドメインの直ぐ前の４つの塩基性アミノ酸を切断する。前駆
体領域は、今日までに未成熟の生物学的活性ペプチドが組換えＤＮＡ技術により
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて産生されることが公知である程度ま
で、インビボでの成熟部分の正確な折り畳みにおいて必須の役割を果たす。
ーファミリーの一部を形成する。このファミリーは、胚形成、内分泌機能調節因
子、広範な調節因子、および細胞の増殖および分化に特異的な調節因子を含む。
ＴＧＦ−βは、このファミリーの基本型である。ＴＧＦ−βは、ジスルフィド架
橋によりともに保持される２つの同一の１１２アミノ酸の鎖の二量体である。各
鎖は、分泌ポリペプチドの特徴を有する約３９０のアミノ酸のより長い前駆体か
ら開始され合成され、分子の分泌のために分泌ペプチドとして機能するべきであ
るＮ末端領域における疎水性配列を示す。次いで、この前駆体は、特定のペプチ
ダーゼによる切断によりその成熟形態へとプロセシングされる。このペプチダー
ゼは、生物学的活性ドメインの直ぐ前の４つの塩基性アミノ酸を切断する。前駆
体領域は、今日までに未成熟の生物学的活性ペプチドが組換えＤＮＡ技術により
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて産生されることが公知である程度ま
で、インビボでの成熟部分の正確な折り畳みにおいて必須の役割を果たす。
【０００４】
ＢＭＰは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからヒトまでの種々の動物種において公知で
ある。それらの配列は、進化を通して広い範囲で維持されている。種々のポリペ
プチド間での配列相同性は、通常、特にＣ末端領域において高い。配列の同一性
の程度は、種々のファミリーメンバー間において２５〜９０％の間で変動する。
相同領域において、７〜９の間のシステインは、通常、メンバー間に保存される
。これらは、アミノ酸の鎖間のジスルフィド結合の形成に関与する。ＢＭＰは、
これらは、軟骨の一過性形成、続いて造血骨髄との骨の蓄積を達成する走化性、
増殖応答および分化応答を誘導する。
ある。それらの配列は、進化を通して広い範囲で維持されている。種々のポリペ
プチド間での配列相同性は、通常、特にＣ末端領域において高い。配列の同一性
の程度は、種々のファミリーメンバー間において２５〜９０％の間で変動する。
相同領域において、７〜９の間のシステインは、通常、メンバー間に保存される
。これらは、アミノ酸の鎖間のジスルフィド結合の形成に関与する。ＢＭＰは、
これらは、軟骨の一過性形成、続いて造血骨髄との骨の蓄積を達成する走化性、
増殖応答および分化応答を誘導する。
【０００５】
ＢＭＰの活性は、脱塩した骨マトリクスと連結され、そして変性剤で抽出可能
である。ＢＭＰは、種々の種（ヒト、サル、ウシ、ラットおよびマウスを含む）
から抽出されている（Ｓａｍｐａｔｈ，Ｔ．Ｋ．、Ｒｅｄｄｉ，Ａ．Ｈ．１９８
３、ＰＮＡＳ ８０、６５９１〜６５９５；Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｄ．ら、１９７９
、ＰＮＡＳ ７６、１８２８〜１８３２）。大部分の研究は、豊富でかつ入手が
容易な供給源であるウシの骨由来のＢＭＰにおいて実施された。１９８８年に、
Ｗｏｚｎｅｙら（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
２、１５２８〜１５３４）は、非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動
により検出され得たウシの骨から約３０ｋＤの生物学的活性タンパク質画分を回
収した。化学方法によるジスルフィド架橋の還元後、３０ｋＤ、１８ｋＤおよび
１６ｋＤのポリペプチドが得られた（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ら、１９８８、ＰＮＡ
Ｓ ８５、９４８４〜９４８８）。このタンパク質画分をトリプシンで消化し、
そして得られたペプチドをＨＰＬＣにより分離し、そして配列決定した。この情
報は、種々の因子をコードするウシゲノム配列を同定するために使用するＤＮＡ
プローブの合成において使用した。プローブとしてのこれらの配列の一部を使用
して、相同因子をコードするヒト配列を得た。現在これらの因子について多くが
公知である（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９０、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓ
ｕｐｐｌ．１３、１４９〜１５６；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．、１９８９、Ｐｒｏ
ｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６
７〜２８０）。いくつかは、組換えＤＮＡ技術を介して得られた。組換えＤＮＡ
技術によって得られた上記のクラスに属する増殖因子に対する参考文献のいくつ
かの例としては、ＥＰ４０９４７２、ＷＯ９０１１３６６、ＷＯ８８００２０５
、ＥＰ２１２４７４、ＷＯ９１０５８６３、および米国特許第４，７４３，６７
９号が挙げられる。
である。ＢＭＰは、種々の種（ヒト、サル、ウシ、ラットおよびマウスを含む）
から抽出されている（Ｓａｍｐａｔｈ，Ｔ．Ｋ．、Ｒｅｄｄｉ，Ａ．Ｈ．１９８
３、ＰＮＡＳ ８０、６５９１〜６５９５；Ｕｒｉｓｔ，Ｍ．Ｄ．ら、１９７９
、ＰＮＡＳ ７６、１８２８〜１８３２）。大部分の研究は、豊富でかつ入手が
容易な供給源であるウシの骨由来のＢＭＰにおいて実施された。１９８８年に、
Ｗｏｚｎｅｙら（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
２、１５２８〜１５３４）は、非還元条件下のポリアクリルアミドゲル電気泳動
により検出され得たウシの骨から約３０ｋＤの生物学的活性タンパク質画分を回
収した。化学方法によるジスルフィド架橋の還元後、３０ｋＤ、１８ｋＤおよび
１６ｋＤのポリペプチドが得られた（Ｗａｎｇ，Ｅ．Ａ．ら、１９８８、ＰＮＡ
Ｓ ８５、９４８４〜９４８８）。このタンパク質画分をトリプシンで消化し、
そして得られたペプチドをＨＰＬＣにより分離し、そして配列決定した。この情
報は、種々の因子をコードするウシゲノム配列を同定するために使用するＤＮＡ
プローブの合成において使用した。プローブとしてのこれらの配列の一部を使用
して、相同因子をコードするヒト配列を得た。現在これらの因子について多くが
公知である（Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９０、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．Ｓ
ｕｐｐｌ．１３、１４９〜１５６；Ｗｏｚｎｅｙ，Ｊ．Ｍ．、１９８９、Ｐｒｏ
ｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１，２６
７〜２８０）。いくつかは、組換えＤＮＡ技術を介して得られた。組換えＤＮＡ
技術によって得られた上記のクラスに属する増殖因子に対する参考文献のいくつ
かの例としては、ＥＰ４０９４７２、ＷＯ９０１１３６６、ＷＯ８８００２０５
、ＥＰ２１２４７４、ＷＯ９１０５８６３、および米国特許第４，７４３，６７
９号が挙げられる。
【０００６】
従って、新規なＢＭＰを同定し、開発する必要が明らかに存在する。構造的に
関連しているものの、このようなタンパク質は、種々の細胞および組織型におい
て多様で多面的な機能を有し得る。発明的な精製されたＢＭＰポリペプチドは、
軟骨、腱、靭帯、および／または神経組織を含む種々の他の組織における誘導増
強活性または分化増強活性に関するさらなるタンパク質の同定、特徴付け、およ
び精製に有用な研究ツールである。さらに、新規なＢＭＰポリペプチドの同定は
、核酸およびタンパク質レベルでのある範囲の誘導体、アゴニストおよびアンタ
ゴニストの開発を可能にし、次いで、これは、多くの状態のうち、癌、炎症、神
経学的な障害および異常な細胞増殖のような範囲の状態の処置および診断におけ
る用途を有する。
関連しているものの、このようなタンパク質は、種々の細胞および組織型におい
て多様で多面的な機能を有し得る。発明的な精製されたＢＭＰポリペプチドは、
軟骨、腱、靭帯、および／または神経組織を含む種々の他の組織における誘導増
強活性または分化増強活性に関するさらなるタンパク質の同定、特徴付け、およ
び精製に有用な研究ツールである。さらに、新規なＢＭＰポリペプチドの同定は
、核酸およびタンパク質レベルでのある範囲の誘導体、アゴニストおよびアンタ
ゴニストの開発を可能にし、次いで、これは、多くの状態のうち、癌、炎症、神
経学的な障害および異常な細胞増殖のような範囲の状態の処置および診断におけ
る用途を有する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、配列表に開示されるか、および／または表１に記載されるヒトｃＤ
ＮＡプラスミド中に含まれ、かつアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）に寄託されたポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる
単離された核酸分子を含む。これらの核酸分子のフラグメント、改変体、および
誘導体もまた、本発明により包含される。本発明はまた、ＢＭＰポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸
分子を含む。本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドによりコードされるＢ
ＭＰポリペプチドを含む。配列表に開示される、および／または表１に記載され
るヒトｃＤＮＡプラスミドによりコードされ、かつＡＴＣＣに寄託されたＢＭＰ
ポリペプチドを含むか、あるいはそれらからなるアミノ酸配列が、さらに提供さ
れる。これらのポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明により含まれる。こ
れらのアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメント、改変体、および誘導体もま
た、これらのポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを結合する抗体をコード
するポリヌクレオチドと同様に、本発明により包含される。
ＮＡプラスミド中に含まれ、かつアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）に寄託されたポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる
単離された核酸分子を含む。これらの核酸分子のフラグメント、改変体、および
誘導体もまた、本発明により包含される。本発明はまた、ＢＭＰポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸
分子を含む。本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドによりコードされるＢ
ＭＰポリペプチドを含む。配列表に開示される、および／または表１に記載され
るヒトｃＤＮＡプラスミドによりコードされ、かつＡＴＣＣに寄託されたＢＭＰ
ポリペプチドを含むか、あるいはそれらからなるアミノ酸配列が、さらに提供さ
れる。これらのポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明により含まれる。こ
れらのアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメント、改変体、および誘導体もま
た、これらのポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを結合する抗体をコード
するポリヌクレオチドと同様に、本発明により包含される。
【０００８】
（詳細な説明）
（表）
表１は、本出願に関してＡＴＣＣになされた寄託物のＡＴＣＣ寄託証、寄託日
、およびＡＴＣＣ受託番号を要約する。
、およびＡＴＣＣ受託番号を要約する。
【０００９】
表２は、公共のＥＳＴを示し、これら公共のＥＳＴ配列のうちの任意の１つ以
上のうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または１０以上が、必
要に応じて、本発明の特定の実施形態から除外される。
上のうちの、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または１０以上が、必
要に応じて、本発明の特定の実施形態から除外される。
【００１０】
（定義）
以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
めに提供される。
【００１１】
本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、ある
いは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、そのベクタ
ー、組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないから
である。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリ
ー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動に
より分離されたものおよびブロットにトランスファーされたものを含む）、せん
断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物あるいは、当該分野が本発明のポリヌクレオ
チド／配列の際立った特徴を示せない他の組成物をいわない。
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、ある
いは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、そのベクタ
ー、組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないから
である。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリ
ー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動に
より分離されたものおよびブロットにトランスファーされたものを含む）、せん
断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物あるいは、当該分野が本発明のポリヌクレオ
チド／配列の際立った特徴を示せない他の組成物をいわない。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、配列番号Ｘ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列（表１の欄５に記載される）を有する
分子、またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ（表１の欄３に記載され、かつＡＴＣＣに
寄託されたプラスミドのプール内に含まれる）をいう。例えば、このポリヌクレ
オチドは、５’および３’非翻訳配列、天然もしくは人工のシグナル配列を含む
かもしくは含まないコード領域、タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメ
イン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペ
プチド」とは、広く定義されるように、本発明のポリヌクレオチドによりコード
されるアミノ酸配列を有する分子（ｃＤＮＡに対応する配列のポリＡテイルの翻
訳から生じるポリフェニルアラニンまたはポリリジンのペプチド配列は明らかに
除かれる）をいう。
Ｑ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列（表１の欄５に記載される）を有する
分子、またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ（表１の欄３に記載され、かつＡＴＣＣに
寄託されたプラスミドのプール内に含まれる）をいう。例えば、このポリヌクレ
オチドは、５’および３’非翻訳配列、天然もしくは人工のシグナル配列を含む
かもしくは含まないコード領域、タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメ
イン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペ
プチド」とは、広く定義されるように、本発明のポリヌクレオチドによりコード
されるアミノ酸配列を有する分子（ｃＤＮＡに対応する配列のポリＡテイルの翻
訳から生じるポリフェニルアラニンまたはポリリジンのペプチド配列は明らかに
除かれる）をいう。
【００１３】
本発明において、配列番号Ｘの配列を含む代表的なプラスミドは、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に
寄託され、そして／または表１に記載される。表１に示されるように、各々のプ
ラスミドは、ｃＤＮＡクローンＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）およびＡＴＣＣ受
託番号（ＡＴＣＣ受託番号Ｚ）によって同定される。単一の寄託として、プール
され、そして受託されるプラスミドは、同じＡＴＣＣ受託番号を有する。ＡＴＣ
Ｃは、アメリカ合衆国、バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌ
ｅｖａｒｄ大学 １０８０１に位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のた
めの微生物の寄託の国際承認に係るブダペスト条約の条項によって行われた。
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に
寄託され、そして／または表１に記載される。表１に示されるように、各々のプ
ラスミドは、ｃＤＮＡクローンＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）およびＡＴＣＣ受
託番号（ＡＴＣＣ受託番号Ｚ）によって同定される。単一の寄託として、プール
され、そして受託されるプラスミドは、同じＡＴＣＣ受託番号を有する。ＡＴＣ
Ｃは、アメリカ合衆国、バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌ
ｅｖａｒｄ大学 １０８０１に位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のた
めの微生物の寄託の国際承認に係るブダペスト条約の条項によって行われた。
【００１４】
本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、またはその相補体（例えば、本明
細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの任意の１、２、３、４、ま
たはそれ以上の補体）、および／またはｃＤＮＡ プラスミドＺに含まれる配列
（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの１、２、３
、４、またはそれ以上の補体）にハイブリダイズし得る、それらのポリヌクレオ
チドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリ
ウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０
％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液
中での４２℃での一晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃
にてフィルターを洗浄することをいう。
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、またはその相補体（例えば、本明
細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの任意の１、２、３、４、ま
たはそれ以上の補体）、および／またはｃＤＮＡ プラスミドＺに含まれる配列
（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの１、２、３
、４、またはそれ以上の補体）にハイブリダイズし得る、それらのポリヌクレオ
チドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリ
ウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０
％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液
中での４２℃での一晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃
にてフィルターを洗浄することをいう。
【００１５】
より低い、ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で、本発明のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明の「ポリヌクレオ
チド」に含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナ
ル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミド
が、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じ
て達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２
０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション
；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さら
に、なおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳ
Ｃ）で行われ得る。
リヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明の「ポリヌクレオ
チド」に含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナ
ル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミド
が、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じ
て達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２
０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション
；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さら
に、なおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳ
Ｃ）で行われ得る。
【００１６】
上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１７】
もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを使用して産生される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイ
ブリダイズするからである。
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを使用して産生される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイ
ブリダイズするからである。
【００１８】
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、ハイブリッド分子（一本鎖、もしくはより代表的には二本鎖、または一
本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含む）から
構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲ
ＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチド
はまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変さ
れた塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基とし
ては、例えば、トリチル化された塩基、およびイノシンのような普通でない塩基
が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがっ
て、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態
を含む。
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、ハイブリッド分子（一本鎖、もしくはより代表的には二本鎖、または一
本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含む）から
構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲ
ＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチド
はまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変さ
れた塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基とし
ては、例えば、トリチル化された塩基、およびイノシンのような普通でない塩基
が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがっ
て、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態
を含む。
【００１９】
特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５の
、少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１００の、少なくとも１２
５の、少なくとも５００の、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチド
であるが、３００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、
１５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、７．５ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、
２．０ｋｂ未満、または１ｋｂ未満の長さである。さらなる実施形態においては
、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されたコード配列の一部を含
むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含むわけではない。別の実施形態に
おいては、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムの隣接遺伝子のコード
配列（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対する５’または３’）を含ま
ない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００
、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以
上のゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
、少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１００の、少なくとも１２
５の、少なくとも５００の、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチド
であるが、３００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、
１５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、７．５ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、
２．０ｋｂ未満、または１ｋｂ未満の長さである。さらなる実施形態においては
、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されたコード配列の一部を含
むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含むわけではない。別の実施形態に
おいては、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムの隣接遺伝子のコード
配列（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対する５’または３’）を含ま
ない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００
、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以
上のゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【００２０】
「配列番号Ｘ」とは、表１のカラム５に記載されるポリヌクレオチド配列をい
うが、「配列番号Ｙ」とは、表１のカラム１０に記載されるポリペプチド配列を
いう。配列番号Ｘは、表１のカラム６において特定される整数によって同定され
る。配列番号Ｙのポリペプチド配列は、配列番号Ｘのポリヌクレオチドによって
コードされる翻訳されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。ポリ
ヌクレオチド配列は、配列表に示され、直ちに全てのポリペプチド配列が続く。
従って、配列番号１のポリヌクレオチド配列に対応するポリペプチド配列は、配
列表に示される第１のポリペプチド配列である。第２のポリペプチド配列は、配
列番号２などとして示されるポリヌクレオチド配列に対応する。
うが、「配列番号Ｙ」とは、表１のカラム１０に記載されるポリペプチド配列を
いう。配列番号Ｘは、表１のカラム６において特定される整数によって同定され
る。配列番号Ｙのポリペプチド配列は、配列番号Ｘのポリヌクレオチドによって
コードされる翻訳されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。ポリ
ヌクレオチド配列は、配列表に示され、直ちに全てのポリペプチド配列が続く。
従って、配列番号１のポリヌクレオチド配列に対応するポリペプチド配列は、配
列表に示される第１のポリペプチド配列である。第２のポリペプチド配列は、配
列番号２などとして示されるポリヌクレオチド配列に対応する。
【００２１】
本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改変
され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、なら
びに多くの研究文献に十分に記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
、およびアミノ末端またはカルボキシル末端、を含むポリペプチドのどこにでも
生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環
状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳
後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変として
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、
脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の
形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔ
ｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セ
レノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランス
ファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴ
ＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡ
ＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改変
され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、なら
びに多くの研究文献に十分に記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
、およびアミノ末端またはカルボキシル末端、を含むポリペプチドのどこにでも
生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環
状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳
後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変として
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、
脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の
形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔ
ｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セ
レノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランス
ファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴ
ＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡ
ＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。そのようなポリ
ペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生成さ
れたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
み合わせによって生成されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチ
ドを調製するための手段は、当該分野において十分に理解されている。
ペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生成さ
れたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
み合わせによって生成されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチ
ドを調製するための手段は、当該分野において十分に理解されている。
【００２３】
ポリペプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、ま
たはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部であり得る（下記
を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製において補助す
る配列（例えば、多重のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のた
めのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利であ
る。
たはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部であり得る（下記
を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製において補助す
る配列（例えば、多重のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のた
めのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利であ
る。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。ポリペプチドの組換え的に生成されたバージョン（
分泌ポリペプチドを含む）は、本明細書中で記載される技術か、または当該分野
で別の公知の技術を使用して（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅ
ｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））により記載される１工程方法によって）
、実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中で記載され
る技術、または当該分野における他の周知の方法を使用して（例えば、当該分野
で周知の方法で本発明のポリペプチドに対して惹起された本発明の抗体を使用す
ることによって）、天然の供給源、合成的な供給源または組換え供給源から精製
され得る。
しくは実質的に精製される。ポリペプチドの組換え的に生成されたバージョン（
分泌ポリペプチドを含む）は、本明細書中で記載される技術か、または当該分野
で別の公知の技術を使用して（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅ
ｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））により記載される１工程方法によって）
、実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中で記載され
る技術、または当該分野における他の周知の方法を使用して（例えば、当該分野
で周知の方法で本発明のポリペプチドに対して惹起された本発明の抗体を使用す
ることによって）、天然の供給源、合成的な供給源または組換え供給源から精製
され得る。
【００２５】
「機能的活性」を示すポリペプチドとは、本発明の全長（完全）タンパク質と
関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。この
ような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合
する（または結合することについて、ポリペプチドと競合する）能力］、免疫原
性（本発明のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプ
チドとマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターま
たはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。この
ような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合
する（または結合することについて、ポリペプチドと競合する）能力］、免疫原
性（本発明のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプ
チドとマルチマーを形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターま
たはリガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、特定のアッセイ（例えば、生物学
的アッセイのような）で測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても
、本発明のポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同
一ではない活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペ
プチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと
比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち
、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示
すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして
最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。
的アッセイのような）で測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても
、本発明のポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同
一ではない活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペ
プチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと
比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち
、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示
すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして
最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。
【００２７】
ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナ
ログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
ログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【００２８】
例えば、全長ポリペプチドの抗体への結合について本発明の全長ポリペプチド
に結合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする場合、１つの実
施形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このよう
なアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセ
イ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素
または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッ
セイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免
疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのよ
うな技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定さ
れない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することに
よって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する
二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形
態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合
の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
に結合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする場合、１つの実
施形態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このよう
なアッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセ
イ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、金コロイド、酵素
または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッ
セイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免
疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのよ
うな技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定さ
れない。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することに
よって検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する
二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形
態では、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合
の検出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００２９】
別の実施形態では、リガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチドフ
ラグメント、改変体、または誘導体がマルチマー化する能力が評価される場合、
結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィ
ニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような
当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋ
ｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を
参照のこと。別の実施形態では、その基質への本発明のポリペプチドの結合の生
理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
ラグメント、改変体、または誘導体がマルチマー化する能力が評価される場合、
結合が、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィ
ニティークロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような
当該分野で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋ
ｙ、Ｅ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を
参照のこと。別の実施形態では、その基質への本発明のポリペプチドの結合の生
理学的相関（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００３０】
さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそれらのフラグメント
、改変体、誘導体、およびアナログが、ポリペプチドの生物学的活性に関連した
関連の生物学的活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力
を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、
そして本発明の範囲内である。
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそれらのフラグメント
、改変体、誘導体、およびアナログが、ポリペプチドの生物学的活性に関連した
関連の生物学的活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力
を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、
そして本発明の範囲内である。
【００３１】
（本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
（遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子の翻訳産物は、骨形成の制御に関与すると考えられるヒト骨形態形
成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）
（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜１７９５００を参照のこと）と配列相同性を共
有する。本発明において好ましいドメインとして、ＥＧＦ様ドメインが含まれる
。これは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定された。ＥＧＦ様ドメインは、
ジスルフィド結合に関与することが（ＥＧＦにおいて）示されている６システイ
ン残基を含む。主な構造は、２つの鎖（ｔｗｏ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）のβシート
、続いてＣ末端の短い２つの鎖のシートへのループである。５番目のシステイン
と６番目のシステインとの間の領域は、２つの保存されたグリシンを含み、これ
らのうち少なくとも１つは、最もＥＧＦ様であるドメインに存在する。２つのコ
ンセンサス配列が、ＥＧＦ様ドメインを同定するために開発された。そして以下
に記載する：Ｃ−ｘ−Ｃ−ｘ（５）−Ｇ−ｘ（２）−ＣまたはＣ−ｘ−Ｃ−ｘ（
２）−［ＧＰ］−［ＦＹＷ］−ｘ（４，８）−Ｃ’Ｃ’。保存されたシステイン
は、ジスルフィド結合に関与する。「Ｇ」：頻繁に保存されるグリシン。本発明
の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：ＣＡＣＬＡＧＹＴＧＱＲＣ（
配列番号１４）を含むか、あるいはこれからなる。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明により含まれる。配列番号１４のＥＧＦ
ドメインおよび配列番号８の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５
０または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドは、さらに好
ましい。さらなる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様ドメインに対してＮ末端か
またはＣ末端であり得る。あるいは、更なる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様
ドメインに対してＮ末端およびＣ末端の両方であり得、ここでＮ末端およびＣ末
端の連続するアミノ酸残基の合計は、特定の数に等しい。上記の好ましいポリペ
プチドドメインは、ＥＧＦドメインに対して特異的なサインの指標であり、これ
は、典型的に、分泌タンパク質または膜結合タンパク質の細胞外ドメインである
。さらに、これらのドメインは、カルシウム結合および／またはタンパク質−タ
ンパク質相互作用に関与し得る。
成タンパク質（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）
（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜１７９５００を参照のこと）と配列相同性を共
有する。本発明において好ましいドメインとして、ＥＧＦ様ドメインが含まれる
。これは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定された。ＥＧＦ様ドメインは、
ジスルフィド結合に関与することが（ＥＧＦにおいて）示されている６システイ
ン残基を含む。主な構造は、２つの鎖（ｔｗｏ−ｓｔｒａｎｄｅｄ）のβシート
、続いてＣ末端の短い２つの鎖のシートへのループである。５番目のシステイン
と６番目のシステインとの間の領域は、２つの保存されたグリシンを含み、これ
らのうち少なくとも１つは、最もＥＧＦ様であるドメインに存在する。２つのコ
ンセンサス配列が、ＥＧＦ様ドメインを同定するために開発された。そして以下
に記載する：Ｃ−ｘ−Ｃ−ｘ（５）−Ｇ−ｘ（２）−ＣまたはＣ−ｘ−Ｃ−ｘ（
２）−［ＧＰ］−［ＦＹＷ］−ｘ（４，８）−Ｃ’Ｃ’。保存されたシステイン
は、ジスルフィド結合に関与する。「Ｇ」：頻繁に保存されるグリシン。本発明
の好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：ＣＡＣＬＡＧＹＴＧＱＲＣ（
配列番号１４）を含むか、あるいはこれからなる。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明により含まれる。配列番号１４のＥＧＦ
ドメインおよび配列番号８の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５
０または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドは、さらに好
ましい。さらなる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様ドメインに対してＮ末端か
またはＣ末端であり得る。あるいは、更なる連続するアミノ酸残基は、ＥＧＦ様
ドメインに対してＮ末端およびＣ末端の両方であり得、ここでＮ末端およびＣ末
端の連続するアミノ酸残基の合計は、特定の数に等しい。上記の好ましいポリペ
プチドドメインは、ＥＧＦドメインに対して特異的なサインの指標であり、これ
は、典型的に、分泌タンパク質または膜結合タンパク質の細胞外ドメインである
。さらに、これらのドメインは、カルシウム結合および／またはタンパク質−タ
ンパク質相互作用に関与し得る。
【００３２】
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｄａｔａは、この遺伝子が、胎盤組織および心臓組織、そ
してより少ない程度で、脳組織において発現されることを示す。さらに、この遺
伝子は、子宮内膜間質細胞および骨髄間質細胞において発現される。
してより少ない程度で、脳組織において発現されることを示す。さらに、この遺
伝子は、子宮内膜間質細胞および骨髄間質細胞において発現される。
【００３３】
従って、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、生物学的試料中に
存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下を含むがこれらに
限定されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である：血管および
心血管の疾患および／または障害、骨組織および血管組織の発達障害ならびに癌
。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織また
は細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供することに有用である。
上記組織または細胞の多くの障害、特に血管系および心血管系、骨格系および発
達系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さ
ない個体からの健常組織の発現レベルに対して有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の
組織（例えば、血管組織、心血管組織、骨格組織、発達組織、癌組織および創傷
組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、ま
たは他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される。
存在する組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下を含むがこれらに
限定されない疾患および状態の診断のための試薬として有用である：血管および
心血管の疾患および／または障害、骨組織および血管組織の発達障害ならびに癌
。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織また
は細胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供することに有用である。
上記組織または細胞の多くの障害、特に血管系および心血管系、骨格系および発
達系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さ
ない個体からの健常組織の発現レベルに対して有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個体から採取された特定の
組織（例えば、血管組織、心血管組織、骨格組織、発達組織、癌組織および創傷
組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）、ま
たは他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される。
【００３４】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号８中で残基：
【００３５】
【化１】
として示されるタンパク質の免疫原性エピトープの、１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１６全て
を含むか、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明に
より含まれる。
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１６全て
を含むか、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明に
より含まれる。
【００３６】
血管組織、心血管組織、胎盤組織および発達組織におけるこの組織分布、およ
び骨形態形成タンパク質に対する相同性は、このクローンの翻訳産物が、骨格系
、血管系および心血管系、ならびに発達系（例えば、発達骨格系）の疾患および
／または障害の診断、検出および／または処置に有用であることを示す。胎盤の
ような血管富化組織におけるこの遺伝子産物の発現は、この遺伝子産物が内皮細
胞中または循環内でより一般的に産生され得ることを示す。このような場合、新
血管形成のような血管機能におてより一般的な役割を果たし得る。この遺伝子産
物はまた、管脈構造においても産生され得、そして造血細胞のような循環内の他
の細胞に効果を有する。造血細胞および身体にわたる他の細胞の増殖、生存、活
性化および／または分化を促進するように機能する。骨形態形成タンパク質に対
するこの遺伝子の翻訳産物の相同性は、この遺伝子の翻訳産物が、適切な骨形成
に関与する障害の診断および／または処置、ならびに炎症、慢性関節リウマチ、
変形性関節症を含むがこれらに限定されない結合組織、特定の滑膜の疾患、なら
びに軟骨断裂および物理的傷害の処置および／または診断に有用であることを示
唆する。さらに、この遺伝子の翻訳産物は、骨粗しょう症のような状態における
骨質量に影響を与えることにおいて有用であり得るか、または、結合組織を冒す
障害（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉ
ａ）および炎症）の検出および処置（例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢
性関節リウマチ、狼瘡、硬皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、
および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成
異常、家族性関節炎、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全）の診断または処置）に有
用である。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙され
た組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的として有用性を示し得
る。
び骨形態形成タンパク質に対する相同性は、このクローンの翻訳産物が、骨格系
、血管系および心血管系、ならびに発達系（例えば、発達骨格系）の疾患および
／または障害の診断、検出および／または処置に有用であることを示す。胎盤の
ような血管富化組織におけるこの遺伝子産物の発現は、この遺伝子産物が内皮細
胞中または循環内でより一般的に産生され得ることを示す。このような場合、新
血管形成のような血管機能におてより一般的な役割を果たし得る。この遺伝子産
物はまた、管脈構造においても産生され得、そして造血細胞のような循環内の他
の細胞に効果を有する。造血細胞および身体にわたる他の細胞の増殖、生存、活
性化および／または分化を促進するように機能する。骨形態形成タンパク質に対
するこの遺伝子の翻訳産物の相同性は、この遺伝子の翻訳産物が、適切な骨形成
に関与する障害の診断および／または処置、ならびに炎症、慢性関節リウマチ、
変形性関節症を含むがこれらに限定されない結合組織、特定の滑膜の疾患、なら
びに軟骨断裂および物理的傷害の処置および／または診断に有用であることを示
唆する。さらに、この遺伝子の翻訳産物は、骨粗しょう症のような状態における
骨質量に影響を与えることにおいて有用であり得るか、または、結合組織を冒す
障害（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉ
ａ）および炎症）の検出および処置（例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢
性関節リウマチ、狼瘡、硬皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、
および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成
異常、家族性関節炎、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全）の診断または処置）に有
用である。タンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙され
た組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的として有用性を示し得
る。
【００３７】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号２に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号２の１〜２２４５の間の任意の整数であり、ｂは１５〜２２
５９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号２に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号２に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号２の１〜２２４５の間の任意の整数であり、ｂは１５〜２２
５９の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号２に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【００３８】
（遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子の翻訳産物は、リジルオキシダーゼ関連タンパク質（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ登録番号ＡＡＢ４９６９７を参照のこと）との配列相同性を共有し、これは、
細胞接着において重要であると考えられている。本発明の実施形態は、以下のア
ミノ酸は列を含むか、あるいはこれらからなる：
ｋ登録番号ＡＡＢ４９６９７を参照のこと）との配列相同性を共有し、これは、
細胞接着において重要であると考えられている。本発明の実施形態は、以下のア
ミノ酸は列を含むか、あるいはこれらからなる：
【００３９】
【化２】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。
される。
【００４０】
この遺伝子は、主に、骨芽細胞および破骨細胞、そしてより低い程度には、好
中球および創傷治癒において発現されることが開示された。
中球および創傷治癒において発現されることが開示された。
【００４１】
従って、本発明の核酸は、生物学的試料中に存在する組織または細胞型の示差
的同定のため、ならびに以下の障害および状態の診断のための試薬として有用で
ある：骨格障害、ならびに創傷治癒および免疫系に関連する疾患および状態。同
様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細
胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供することに有用である。上記
組織または細胞の多くの障害、特に骨格系および免疫系の多くの障害について、
標準的な遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さない個体からの健常組織の発
現レベルに対して有意により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、
このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、骨格組織、免
疫組織、癌組織および創傷組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、
尿、滑液および髄液）、または他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される
。
的同定のため、ならびに以下の障害および状態の診断のための試薬として有用で
ある：骨格障害、ならびに創傷治癒および免疫系に関連する疾患および状態。同
様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細
胞型の示差的同定のための免疫学的プローブを提供することに有用である。上記
組織または細胞の多くの障害、特に骨格系および免疫系の多くの障害について、
標準的な遺伝子発現レベル、すなわち、障害を有さない個体からの健常組織の発
現レベルに対して有意により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、
このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、骨格組織、免
疫組織、癌組織および創傷組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、
尿、滑液および髄液）、または他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される
。
【００４２】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号９中で残基：
【００４３】
【化３】
として示されるタンパク質の免疫原性エピトープの、１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６全てを含む
か、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明により含
まれる。
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６全てを含む
か、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明により含
まれる。
【００４４】
骨芽細胞および破骨細胞におけるこの組織分布、およびリジルオキシダーゼ関
連タンパク質に対する相同性は、このクローンのタンパク質産物が、骨格傷害の
研究、検出および／または処置に有用であることを示す。骨芽細胞および破骨細
胞におけるこの遺伝子産物の上昇したレベルの発現は、この遺伝子産物が骨芽細
胞および／または破骨細胞の生存、増殖および／または成長において役割を果た
し得る。従って、この遺伝子産物は、骨粗しょう症のような状態における骨質量
に影響を与えることにおいて有用であり得るか、または、結合組織を冒す障害（
例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）お
よび炎症）の検出および処置（例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢性関節
リウマチ、狼瘡、硬皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、および
特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成異常、
家族性関節炎、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐ
ｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全）の診断または処置）に有用であ
り得る。さらに、好中球における組織分布は、この遺伝子の翻訳産物が免疫系に
関連する傷害の検出および／または処置のために有用であり得ることを示す。タ
ンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙された組織に対す
る腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的として有用性を示し得る。
連タンパク質に対する相同性は、このクローンのタンパク質産物が、骨格傷害の
研究、検出および／または処置に有用であることを示す。骨芽細胞および破骨細
胞におけるこの遺伝子産物の上昇したレベルの発現は、この遺伝子産物が骨芽細
胞および／または破骨細胞の生存、増殖および／または成長において役割を果た
し得る。従って、この遺伝子産物は、骨粗しょう症のような状態における骨質量
に影響を与えることにおいて有用であり得るか、または、結合組織を冒す障害（
例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）お
よび炎症）の検出および処置（例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢性関節
リウマチ、狼瘡、硬皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、および
特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成異常、
家族性関節炎、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐ
ｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全）の診断または処置）に有用であ
り得る。さらに、好中球における組織分布は、この遺伝子の翻訳産物が免疫系に
関連する傷害の検出および／または処置のために有用であり得ることを示す。タ
ンパク質ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙された組織に対す
る腫瘍マーカーおよび／または免疫療法標的として有用性を示し得る。
【００４５】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号３の１〜１７６７の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１７
８１の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号３に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号３の１〜１７６７の間の任意の整数であり、ｂは１５〜１７
８１の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号３に示されるヌクレオチ
ド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上
のポリヌクレオチドが除外される。
【００４６】
（遺伝子番号３によってコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子の翻訳産物は、マウスｍａｔｒｉｌｉｎ−２前駆体（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ登録番号ＡＡＣ５３１６３を参照のこと）との配列相同性を共有し、これは、
組織の細胞外マトリックス構築において重要であると考えられ、そして軟骨マト
リックスタンパク質（ＣＭＰ）と相同性を共有する。発生骨格エレメントにおけ
るｍａｔｒｉｌｉｎ−２の免疫局在化は、軟骨膜および海綿質の骨芽細胞層にお
いて反応性を示した。さらに、この遺伝子の翻訳産物はまた、マウスＥ２ａ−Ｐ
ｂｘ１タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ５１０３８を参照のこと）と
配列相同性を共有し、これは、直系特異的分化に関連する遺伝子の発現において
重要であると考えられる。本発明において好ましいドメインとして、カルシウム
結合ドメインが含まれる。これは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定された
。カルシウム結合は、多数のタンパク質−タンパク質相互作用に重大であり得、
そしてカルシウム結合部位は、いくつかのＥＧＦ様ドメインのＮ末端に位置する
ことが見出されている。これらのカルシウム結合ドメインを同定するために、以
下のコンセンサス配列パターンが開発された（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）：［ＤＥＱＮ］−ｘ−［ＤＥＱＮ］（
２）−Ｃ−ｘ（３，１４）−Ｃ−ｘ（３，７）−Ｃ−ｘ−［ＤＮ］−ｘ（４）−
［ＦＹ］−ｘ−Ｃ。本発明の実施形態は、以下のアミノ酸は列を含むか、あるい
はこれらからなる：ＤＥＮＥＣＥＱＮＮＧＧＣＳＥＩＣＶＮＬＫＮＳＹＲＣ（配
列番号２５）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明により包含される。配列番号２５のカルシウム結合ドメインを含むポリペプ
チドおよび配列番号１０の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０
または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドは、さらに好ま
しい。さらなる連続するアミノ酸残基は、カルシウム結合ドメインに対してＮ末
端かまたはＣ末端であり得る。あるいは、更なる連続するアミノ酸残基は、カル
シウム結合ドメインに対してＮ末端およびＣ末端の両方であり得、ここでＮ末端
およびＣ末端の連続するアミノ酸残基の合計は、特定の数に等しい。上記の好ま
しいポリペプチドドメインは、カルシウム結合ドメインに対して特異的なサイン
の指標である。
ｋ登録番号ＡＡＣ５３１６３を参照のこと）との配列相同性を共有し、これは、
組織の細胞外マトリックス構築において重要であると考えられ、そして軟骨マト
リックスタンパク質（ＣＭＰ）と相同性を共有する。発生骨格エレメントにおけ
るｍａｔｒｉｌｉｎ−２の免疫局在化は、軟骨膜および海綿質の骨芽細胞層にお
いて反応性を示した。さらに、この遺伝子の翻訳産物はまた、マウスＥ２ａ−Ｐ
ｂｘ１タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ５１０３８を参照のこと）と
配列相同性を共有し、これは、直系特異的分化に関連する遺伝子の発現において
重要であると考えられる。本発明において好ましいドメインとして、カルシウム
結合ドメインが含まれる。これは、ＰｒｏＳｉｔｅ分析ツール（Ｓｗｉｓｓ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を用いて同定された
。カルシウム結合は、多数のタンパク質−タンパク質相互作用に重大であり得、
そしてカルシウム結合部位は、いくつかのＥＧＦ様ドメインのＮ末端に位置する
ことが見出されている。これらのカルシウム結合ドメインを同定するために、以
下のコンセンサス配列パターンが開発された（Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）：［ＤＥＱＮ］−ｘ−［ＤＥＱＮ］（
２）−Ｃ−ｘ（３，１４）−Ｃ−ｘ（３，７）−Ｃ−ｘ−［ＤＮ］−ｘ（４）−
［ＦＹ］−ｘ−Ｃ。本発明の実施形態は、以下のアミノ酸は列を含むか、あるい
はこれらからなる：ＤＥＮＥＣＥＱＮＮＧＧＣＳＥＩＣＶＮＬＫＮＳＹＲＣ（配
列番号２５）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明により包含される。配列番号２５のカルシウム結合ドメインを含むポリペプ
チドおよび配列番号１０の少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、５０
または７５のさらなる連続するアミノ酸残基を含むポリペプチドは、さらに好ま
しい。さらなる連続するアミノ酸残基は、カルシウム結合ドメインに対してＮ末
端かまたはＣ末端であり得る。あるいは、更なる連続するアミノ酸残基は、カル
シウム結合ドメインに対してＮ末端およびＣ末端の両方であり得、ここでＮ末端
およびＣ末端の連続するアミノ酸残基の合計は、特定の数に等しい。上記の好ま
しいポリペプチドドメインは、カルシウム結合ドメインに対して特異的なサイン
の指標である。
【００４７】
この遺伝子は、主に、胎児肝臓／脾臓組織、ヒト胎盤組織、胎児心臓組織、胚
組織、乳児脳組織および破骨細胞組織において発現されることが発見されている
。
組織、乳児脳組織および破骨細胞組織において発現されることが発見されている
。
【００４８】
従って、本発明の核酸は、生物学的試料中に存在する組織または細胞型の示差
的同定のため、ならびに以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用で
ある：免疫系、骨格および発達系の障害。同様に、ポリペプチドおよびこれらの
ポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的
プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害、特に
免疫系、骨格系および発達系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベル
、すなわち、障害を有さない個体からの健常組織の発現レベルに対して有意によ
り高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個
体から採取された特定の組織（例えば、免疫組織、骨格組織、発達組織、癌組織
および創傷組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および
髄液）、または他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される。
的同定のため、ならびに以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用で
ある：免疫系、骨格および発達系の障害。同様に、ポリペプチドおよびこれらの
ポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の示差的同定のための免疫学的
プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害、特に
免疫系、骨格系および発達系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベル
、すなわち、障害を有さない個体からの健常組織の発現レベルに対して有意によ
り高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を有する個
体から採取された特定の組織（例えば、免疫組織、骨格組織、発達組織、癌組織
および創傷組織）もしくは体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および
髄液）、または他の組織もしくはサンプルで慣用的に検出される。
【００４９】
本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号１０中で残基：
【００５０】
【化４】
として示されるタンパク質の免疫原性エピトープの、１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６全てを含む
か、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明により含
まれる。
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６全てを含む
か、あるいはこれらからなる。これらポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、１つ以上のこれらのペプチドに結合する抗体として、本発明により含
まれる。
【００５１】
免疫系、骨格系および発生系における組織分布、およびマトリリン−２（ｍａ
ｔｒｉｌｉｎ−２）タンパク質およびＥ２ａ−Ｐｂｘ１タンパク質の両方に対す
る相同性は、このクローンのタンパク質産物が、免疫系、骨格系、および発生系
を含む、障害の検出および／または処置に有用であることを示唆する。さらに、
ネズミマトリリン−２タンパク質に対する相同性は、このクローンの翻訳産物が
他の組織（例えば、骨格系を含む組織のような）の細胞外マトリックス集合体に
おける類似機能をおそらく行うことを示唆する。従って、このクローンの翻訳産
物は、骨格系に発症する障害および状態（特に、骨粗しょう症ならびに結合組織
（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）
および炎症）に影響する障害の検出および／または処置のため、例えば、種々の
自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、狼瘡、強皮症、および皮膚筋炎、な
らびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すな
わち、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔ
ｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形
成不全））の診断または処置に有用である。タンパク質、およびタンパク質に対
して指向される抗体は、腫瘍マーカーおよび／または上記に列挙された組織に対
する免疫治療標的として有用性を示し得る。
ｔｒｉｌｉｎ−２）タンパク質およびＥ２ａ−Ｐｂｘ１タンパク質の両方に対す
る相同性は、このクローンのタンパク質産物が、免疫系、骨格系、および発生系
を含む、障害の検出および／または処置に有用であることを示唆する。さらに、
ネズミマトリリン−２タンパク質に対する相同性は、このクローンの翻訳産物が
他の組織（例えば、骨格系を含む組織のような）の細胞外マトリックス集合体に
おける類似機能をおそらく行うことを示唆する。従って、このクローンの翻訳産
物は、骨格系に発症する障害および状態（特に、骨粗しょう症ならびに結合組織
（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）
および炎症）に影響する障害の検出および／または処置のため、例えば、種々の
自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、狼瘡、強皮症、および皮膚筋炎、な
らびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すな
わち、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔ
ｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形
成不全））の診断または処置に有用である。タンパク質、およびタンパク質に対
して指向される抗体は、腫瘍マーカーおよび／または上記に列挙された組織に対
する免疫治療標的として有用性を示し得る。
【００５２】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号４に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号４の１〜２３０１の任意の整数であり、ｂは１５〜２３１５
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号４に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号４に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号４の１〜２３０１の任意の整数であり、ｂは１５〜２３１５
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号４に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
【００５３】
（遺伝子番号４によりコードされるタンパク質の特徴）
この遺伝子の翻訳産物は、プロコラーゲンＣプロテイナーゼエンハンサータン
パク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ６１９４９を参照のこと）と配列相同性
を共有し、これは、Ｉ型プロコラーゲンのＣＯＯＨ末端プロペプチドに対して結
合して、そしてプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性を増強する糖タンパク質
である。さらにこのクローンの翻訳産物はまた、ニワトリ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号ｇｉ｜２８５２１２１を参照のこと）およびＸｅｎｏｐｕｓ（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ登録番号ｇｉ｜４０６５４１を参照のこと）由来の骨形態形成タンパク質と相
同性を共有する。開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第３染色体上にあ
ると考えられている。従って、本発明に関連するポリヌクレオチドは、第３染色
体の連鎖分析におけるマーカーとして有用である。本発明の実施形態は、以下の
アミノ酸配列含むか、あるいは以下のアミノ酸からなる：
パク質（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ６１９４９を参照のこと）と配列相同性
を共有し、これは、Ｉ型プロコラーゲンのＣＯＯＨ末端プロペプチドに対して結
合して、そしてプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼ活性を増強する糖タンパク質
である。さらにこのクローンの翻訳産物はまた、ニワトリ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号ｇｉ｜２８５２１２１を参照のこと）およびＸｅｎｏｐｕｓ（Ｇｅｎｂａｎ
ｋ登録番号ｇｉ｜４０６５４１を参照のこと）由来の骨形態形成タンパク質と相
同性を共有する。開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝子は、第３染色体上にあ
ると考えられている。従って、本発明に関連するポリヌクレオチドは、第３染色
体の連鎖分析におけるマーカーとして有用である。本発明の実施形態は、以下の
アミノ酸配列含むか、あるいは以下のアミノ酸からなる：
【００５４】
【化５】
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明によって包
含される。
含される。
【００５５】
この遺伝子は、主に胎児肝臓／脾臓組織、妊娠子宮組織、滑膜組織、および骨
肉腫組織において発現されることが発見されている。
肉腫組織において発現されることが発見されている。
【００５６】
従って、本発明の核酸は、生物学的試料において存在する組織または細胞型の
差示的同定のためならびに以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用
である：免疫障害、発生障害、および骨格障害。同様に、ポリペプチドおよびこ
れらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差次的同定のための免
疫学的プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害
、特に免疫系、発生系、および骨格系の多くの障害について、標準的な遺伝子発
現レベル、すなわち，障害を有さない個体からの正常組織中の発現レベルに対し
て、このような障害を有する個体から採取された、特定の組織（例えば、免疫組
織、発生組織、骨格組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）中で、有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が検出され得る。
差示的同定のためならびに以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用
である：免疫障害、発生障害、および骨格障害。同様に、ポリペプチドおよびこ
れらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差次的同定のための免
疫学的プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害
、特に免疫系、発生系、および骨格系の多くの障害について、標準的な遺伝子発
現レベル、すなわち，障害を有さない個体からの正常組織中の発現レベルに対し
て、このような障害を有する個体から採取された、特定の組織（例えば、免疫組
織、発生組織、骨格組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）中で、有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が検出され得る。
【００５７】
本発明の好ましいポリペプチドは、残基：Ｇｌｕ−２４〜Ｔｙｒ−３２、Ｐｒ
ｏ−４０〜Ａｌａ−５６、Ｇｌｕ−８２〜Ｔｙｒ−９１として配列番号１１にお
いて示されるタンパク質の免疫原性エピトープのうち１つ、２つ、３つ、または
３つ全てを含むか、あるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた本発明によって包含され、１つ以上のこれらのペプチ
ドを結合する抗体も同様に包含される。
ｏ−４０〜Ａｌａ−５６、Ｇｌｕ−８２〜Ｔｙｒ−９１として配列番号１１にお
いて示されるタンパク質の免疫原性エピトープのうち１つ、２つ、３つ、または
３つ全てを含むか、あるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドもまた本発明によって包含され、１つ以上のこれらのペプチ
ドを結合する抗体も同様に包含される。
【００５８】
滑膜組織および骨肉腫組織のける組織分布、ならびにいくつかの種由来のプロ
コラーゲンＣプロテイナーゼエンハンサータンパク質および骨形態形成タンパク
質に対する相同性は、このクローンのタンパク質産物が、骨格系、特に骨粗しょ
う症に関係する障害、ならびに結合組織（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟
化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）および炎症）に影響する障害の検出およ
び／または処置、例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、狼
瘡、強皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異
常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性
関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ Ｉ
Ｉ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全））の診断または処置に有用であること
を示唆する。免疫組織および発生組織における組織分布はまた、このクローンの
翻訳産物が、免疫障害および発生障害の検出および／または処置に有用であり得
ることを示唆する。タンパク質、およびこのタンパク質に対する抗体は、上記に
列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的としての有用
性を示し得る。
コラーゲンＣプロテイナーゼエンハンサータンパク質および骨形態形成タンパク
質に対する相同性は、このクローンのタンパク質産物が、骨格系、特に骨粗しょ
う症に関係する障害、ならびに結合組織（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟
化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍａｌａｃｉａ）および炎症）に影響する障害の検出およ
び／または処置、例えば、種々の自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチ、狼
瘡、強皮症、および皮膚筋炎、ならびに小人症、脊椎変形、および特定の関節異
常、ならびに軟骨形成不全（すなわち、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性
関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ Ｉ
Ｉ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不全））の診断または処置に有用であること
を示唆する。免疫組織および発生組織における組織分布はまた、このクローンの
翻訳産物が、免疫障害および発生障害の検出および／または処置に有用であり得
ることを示唆する。タンパク質、およびこのタンパク質に対する抗体は、上記に
列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的としての有用
性を示し得る。
【００５９】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号５に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号５の１〜１７９２の任意の整数であり、ｂは１５〜１８０６
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号５に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号５に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号５の１〜１７９２の任意の整数であり、ｂは１５〜１８０６
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号５に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
【００６０】
（遺伝子番号５によりコードされるタンパク質の特徴）
このクローンの翻訳産物は、ヒトトロイド様（Ｔｌｌ）タンパク質とと配列相
同性を共有し、これらは、細胞外マトリックス前駆体の高分子構造への成熟を促
進するのに重要であると考えられている（ＰＣＴ番号ＷＯ９７４５５２８−Ａ２
を参照のこと）。さらに、このクローンの翻訳産物は、λＵ２ＯＳ−１のヒト骨
形態形成タンパク質−１と配列相同性を共有する（ＰＣＴ番号ＷＯ８８００２０
５−Ａを参照のこと）。感覚神経細胞株に対して試験される場合、この遺伝子を
含む細胞から除去された上清は、ＥＧＲ１アッセイを活性化した。従って、この
遺伝子は、感覚ニューロンおよび、より少ない程度で他の細胞を、シグナルトラ
ンスダクション経路を介して、活性化するようである。初期成長応答１（ＥＧＲ
１）は、活性化に関する種々の組織および細胞型を誘導する特定の遺伝子に関連
するプロモーターであり、分化および増殖を行う細胞を導く。
同性を共有し、これらは、細胞外マトリックス前駆体の高分子構造への成熟を促
進するのに重要であると考えられている（ＰＣＴ番号ＷＯ９７４５５２８−Ａ２
を参照のこと）。さらに、このクローンの翻訳産物は、λＵ２ＯＳ−１のヒト骨
形態形成タンパク質−１と配列相同性を共有する（ＰＣＴ番号ＷＯ８８００２０
５−Ａを参照のこと）。感覚神経細胞株に対して試験される場合、この遺伝子を
含む細胞から除去された上清は、ＥＧＲ１アッセイを活性化した。従って、この
遺伝子は、感覚ニューロンおよび、より少ない程度で他の細胞を、シグナルトラ
ンスダクション経路を介して、活性化するようである。初期成長応答１（ＥＧＲ
１）は、活性化に関する種々の組織および細胞型を誘導する特定の遺伝子に関連
するプロモーターであり、分化および増殖を行う細胞を導く。
【００６１】
この遺伝子は、主に心臓組織、滑膜低酸素組織、および骨巨細胞腫組織におい
て発現されることが発見されている。
て発現されることが発見されている。
【００６２】
従って、本発明の核酸は、生物学的試料中に存在する組織または細胞型の差次
的同定のため、および以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用であ
る：骨格系、および心臓血管系に関係する障害。同様に、ポリペプチドおよびこ
れらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差次的同定のための免
疫学的プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害
、特に骨格系および心臓血管系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベ
ル、すなわち，障害を有さない個体からの健常組織中の発現レベルに対して、こ
のような障害を有する個体から採取された、特定の組織または細胞型（例えば、
骨格組織、心臓血管組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）中で、有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が検出され得る。
的同定のため、および以下の疾患および状態の診断のための試薬として有用であ
る：骨格系、および心臓血管系に関係する障害。同様に、ポリペプチドおよびこ
れらのポリペプチドに対する抗体は、組織または細胞型の差次的同定のための免
疫学的プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の多くの障害
、特に骨格系および心臓血管系の多くの障害について、標準的な遺伝子発現レベ
ル、すなわち，障害を有さない個体からの健常組織中の発現レベルに対して、こ
のような障害を有する個体から採取された、特定の組織または細胞型（例えば、
骨格組織、心臓血管組織、癌性組織および創傷組織）または体液（例えば、リン
パ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）中で、有意により高いまたはより低いレ
ベルのこの遺伝子の発現が検出され得る。
【００６３】
本発明の好ましいポリペプチドは、残基：Ｐｒｏ−３２〜Ｌｙｓ−４９、Ｇｌ
ｕ−６６〜Ａｌａ−７２として配列番号１２に示されるタンパク質の免疫原性エ
ピトープのうち１つ、２つ、または両方含むか、あるいはそれらからなる。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含され、
これらのペプチドの１つ以上を結合する抗体もまた同様に包含される。
ｕ−６６〜Ａｌａ−７２として配列番号１２に示されるタンパク質の免疫原性エ
ピトープのうち１つ、２つ、または両方含むか、あるいはそれらからなる。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含され、
これらのペプチドの１つ以上を結合する抗体もまた同様に包含される。
【００６４】
ヒトトロイド（ｔｏｌｌｏｉｄ）様（Ｔｌｌ）タンパク質およびヒト骨形態形
成タンパク質−１に対する相同性と関連して、滑膜組織および骨巨細胞腫組織に
おける組織分布は、このクローンのタンパク質産物が骨格障害の研究、検出およ
び／または処置に有用であることを示唆する。さらに、ＥＧＲ１生物学的活性は
、この遺伝子の翻訳産物が特定の細胞型（特に感覚ニューロン）の活性化および
／または分化における役割を果たし得る。さらに、滑膜におけるこの遺伝子産物
の発現は、骨格系に発症する障害および状態（特に骨粗しょう症および結合組織
に発症する障害（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍ
ａｌａｃｉａ）および炎症））の検出および／または処置、例えば、種々の自己
免疫障害（例えば、リウマチ様動脈炎、狼瘡、強皮症、および皮膚筋炎、ならび
に小人症、脊椎変形、および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち
、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌ
ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不
全））の診断および／または処置に有用である。あるいは、心臓組織中の組織分
布は、このクローンの翻訳産物が、心臓血管系障害の検出および／または処置に
有用であることを示唆する。タンパク質、およびこのタンパク質に対する抗体は
、上記に列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的とし
ての有用性を示し得る。
成タンパク質−１に対する相同性と関連して、滑膜組織および骨巨細胞腫組織に
おける組織分布は、このクローンのタンパク質産物が骨格障害の研究、検出およ
び／または処置に有用であることを示唆する。さらに、ＥＧＲ１生物学的活性は
、この遺伝子の翻訳産物が特定の細胞型（特に感覚ニューロン）の活性化および
／または分化における役割を果たし得る。さらに、滑膜におけるこの遺伝子産物
の発現は、骨格系に発症する障害および状態（特に骨粗しょう症および結合組織
に発症する障害（例えば、関節炎、外傷、腱炎、軟骨軟化症（ｃｈｒｏｎｄｏｍ
ａｌａｃｉａ）および炎症））の検出および／または処置、例えば、種々の自己
免疫障害（例えば、リウマチ様動脈炎、狼瘡、強皮症、および皮膚筋炎、ならび
に小人症、脊椎変形、および特定の関節異常、ならびに軟骨形成不全（すなわち
、先天性脊椎骨端形成異常、家族性変形性関節症、ＩＩ型骨形成不全（Ａｔｅｌ
ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）、シュミット型骨幹端軟骨形成不
全））の診断および／または処置に有用である。あるいは、心臓組織中の組織分
布は、このクローンの翻訳産物が、心臓血管系障害の検出および／または処置に
有用であることを示唆する。タンパク質、およびこのタンパク質に対する抗体は
、上記に列挙された組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的とし
ての有用性を示し得る。
【００６５】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号６に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号６の１〜１４２６の任意の整数であり、ｂは１５〜１４４０
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号６に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号６に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号６の１〜１４２６の任意の整数であり、ｂは１５〜１４４０
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号６に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
【００６６】
【表１】
表１は、上記の各「遺伝番号」に対応する情報を要約する。「ＮＴ配列番号Ｘ」
として同定されるヌクレオチド配列は、表１で同定される「ｃＤＮＡクローン番
号」から得られる部分的相同（「重複」）配列から、そしていくつかの場合には
、さらなる関連ＤＮＡクローンからアセンブルされた。この重複配列は、高い重
複性の（通常各ヌクレオチド位置で３〜５の重複配列）単一の連続配列にアセン
ブルされ、配列番号Ｘとして同定される最終配列を生じた。
として同定されるヌクレオチド配列は、表１で同定される「ｃＤＮＡクローン番
号」から得られる部分的相同（「重複」）配列から、そしていくつかの場合には
、さらなる関連ＤＮＡクローンからアセンブルされた。この重複配列は、高い重
複性の（通常各ヌクレオチド位置で３〜５の重複配列）単一の連続配列にアセン
ブルされ、配列番号Ｘとして同定される最終配列を生じた。
【００６７】
ｃＤＮＡクローン番号は、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ受託番号Ｚ
および日付」に列挙された対応する受託番号を得た。いくつかの寄託物は、同じ
遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」は、ｃＤＮＡクロ
ーン番号に含まれるベクターの型について言及する。
および日付」に列挙された対応する受託番号を得た。いくつかの寄託物は、同じ
遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」は、ｃＤＮＡクロ
ーン番号に含まれるベクターの型について言及する。
【００６８】
「総ＮＴ配列」は、「遺伝子番号」により同定されるコンティグ中のヌクレオ
チドの総数をいう。寄託されたプラスミドは、配列番号Ｘの「クローン配列の５
’ＮＴ」および「クローン配列の３’ＮＴ」として示されるヌクレオチド位置に
より反映される、これらの配列のすべてを含む。推定のメチオニン開始コドン（
存在する場合）の配列番号Ｘのヌクレオチド位置は、「開始コドンの５’ＮＴ」
として同定される。同様に、推定されるシグナル配列の配列番号Ｘのヌクレオチ
ド位置（存在する場合）は、「シグナルペプチドの最初のＡＡの５’ＮＴ」とし
て同定される。
チドの総数をいう。寄託されたプラスミドは、配列番号Ｘの「クローン配列の５
’ＮＴ」および「クローン配列の３’ＮＴ」として示されるヌクレオチド位置に
より反映される、これらの配列のすべてを含む。推定のメチオニン開始コドン（
存在する場合）の配列番号Ｘのヌクレオチド位置は、「開始コドンの５’ＮＴ」
として同定される。同様に、推定されるシグナル配列の配列番号Ｘのヌクレオチ
ド位置（存在する場合）は、「シグナルペプチドの最初のＡＡの５’ＮＴ」とし
て同定される。
【００６９】
ポリヌクレオチド配列の最初の翻訳されたコドンで始まる、翻訳されたアミノ
酸配列は、「ＡＡ配列番号Ｙ」として同定されるが、その他の読み取り枠もまた
、公知の分子生物学技法を用いて容易に翻訳され得る。これらの代替のオープン
リーディングフレームにより産生されるポリペプチドは、本発明によって特に意
図される。
酸配列は、「ＡＡ配列番号Ｙ」として同定されるが、その他の読み取り枠もまた
、公知の分子生物学技法を用いて容易に翻訳され得る。これらの代替のオープン
リーディングフレームにより産生されるポリペプチドは、本発明によって特に意
図される。
【００７０】
配列番号Ｘ（ここでＸは、配列表に開示される任意のポリヌクレオチド配列で
あり得る）、および翻訳された配列番号Ｙ（ここでＹは、配列表に開示された任
意のポリペプチド配列であり得る）は、十分に正確であり、そして他に当該分野
で周知であり、かつさらに以下に記載の種々の使用に適切である。例えば、配列
番号Ｘは、以下に挙げられる使用を有するがこれらに限定されない：配列番号Ｘ
に含まれる核酸配列または寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡを検出す
る、核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計することにおける使用。これら
のプローブはまた、生物学的試料中の核酸分子にハイブリダイズし、それによっ
て、本発明の種々の法医学的方法および診断方法を可能にする。同様に、配列番
号Ｙから同定されるポリペプチドは、表１で同定されるｃＤＮＡクローンにより
コードされる分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を生成することを含むがそ
れに限定されない使用を有する。
あり得る）、および翻訳された配列番号Ｙ（ここでＹは、配列表に開示された任
意のポリペプチド配列であり得る）は、十分に正確であり、そして他に当該分野
で周知であり、かつさらに以下に記載の種々の使用に適切である。例えば、配列
番号Ｘは、以下に挙げられる使用を有するがこれらに限定されない：配列番号Ｘ
に含まれる核酸配列または寄託されたプラスミド中に含まれるｃＤＮＡを検出す
る、核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計することにおける使用。これら
のプローブはまた、生物学的試料中の核酸分子にハイブリダイズし、それによっ
て、本発明の種々の法医学的方法および診断方法を可能にする。同様に、配列番
号Ｙから同定されるポリペプチドは、表１で同定されるｃＤＮＡクローンにより
コードされる分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を生成することを含むがそ
れに限定されない使用を有する。
【００７１】
それにもかかわらず、配列決定反応により生成されるＤＮＡ配列は、配列決定
誤りを含み得る。この誤りは、生成されたＤＮＡ配列において、誤同定されたヌ
クレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤
って挿入または欠失されたヌクレオチドは、推定されたアミノ酸配列の読み取り
枠においてフレームシフトを生じる。これらの場合、推定されるアミノ酸配列は
、たとえ生成されたＤＮＡ配列が実際のＤＮＡ配列と９９．９％の同一性よりも
大きくあり得ても（例えば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレー
ム中の１塩基の塩基挿入または欠失）、実際のアミノ酸配列とは異なる。
誤りを含み得る。この誤りは、生成されたＤＮＡ配列において、誤同定されたヌ
クレオチドとして、またはヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤
って挿入または欠失されたヌクレオチドは、推定されたアミノ酸配列の読み取り
枠においてフレームシフトを生じる。これらの場合、推定されるアミノ酸配列は
、たとえ生成されたＤＮＡ配列が実際のＤＮＡ配列と９９．９％の同一性よりも
大きくあり得ても（例えば、１０００塩基を超えるオープンリーディングフレー
ム中の１塩基の塩基挿入または欠失）、実際のアミノ酸配列とは異なる。
【００７２】
従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列中の正確さを必要とする適用に
は、本発明は、配列番号Ｘとして同定される生成されたヌクレオチド配列および
配列番号Ｙとして同定される推定の翻訳アミノ酸配列のみならず、表１に提示さ
れるようなＡＴＣＣに寄託された本発明のヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ
の試料もまた提供する。各寄託されたプラスミドのヌクレオチド配列はまた、公
知の方法に従って寄託されたプラスミドを配列決定することにより容易に決定さ
れ得る。
は、本発明は、配列番号Ｘとして同定される生成されたヌクレオチド配列および
配列番号Ｙとして同定される推定の翻訳アミノ酸配列のみならず、表１に提示さ
れるようなＡＴＣＣに寄託された本発明のヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ
の試料もまた提供する。各寄託されたプラスミドのヌクレオチド配列はまた、公
知の方法に従って寄託されたプラスミドを配列決定することにより容易に決定さ
れ得る。
【００７３】
次いで、推定されたアミノ酸配列は、このような寄託物から確認され得る。さ
らに、特定のクローンによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ペプチ
ド配列決定によるか、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中で
このタンパク質を発現すること、このタンパク質を回収すること、およびその配
列を決定することにより直接決定され得る。
らに、特定のクローンによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、ペプチ
ド配列決定によるか、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中で
このタンパク質を発現すること、このタンパク質を回収すること、およびその配
列を決定することにより直接決定され得る。
【００７４】
また、ｃＤＮＡプラスミドを含むベクターの名前を表１に提供する。各ベクタ
ーは、当該分野において、慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、利便性
のために提供される。
ーは、当該分野において、慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、利便性
のために提供される。
【００７５】
ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６
：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．および
Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：９４９
４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｔ
ｒａｔｅｇｉｅｓ、５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ
Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販されてい
る。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマイシン耐
性遺伝子を含む。ファージミドｐＢＳは、Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐベクターおよび
Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲベクターから切り出され得、そしてファージミドｐＢＫは
、Ｚａｐ発現ベクターから切り出され得る。両方のファージミドとも、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能で
ある）に形質転換され得る。
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６
：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．および
Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：９４９
４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｔ
ｒａｔｅｇｉｅｓ、５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ
Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販されてい
る。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマイシン耐
性遺伝子を含む。ファージミドｐＢＳは、Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐベクターおよび
Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲベクターから切り出され得、そしてファージミドｐＢＫは
、Ｚａｐ発現ベクターから切り出され得る。両方のファージミドとも、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能で
ある）に形質転換され得る。
【００７６】
ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ１．０、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２
．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ６００９，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８
９７から入手した。全てのＳｐｏｒｔベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含
み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．
Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターラフミ
ド（ｌａｆｍｉｄ）ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｏｌｏｕｍｂｉａ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を
含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクター
ｐＣＲ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１６００ Ｆａｒａｄａｙ
Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８から入手可能）は、アン
ピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒ
ｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６８６（１
９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９
９１）を参照のこと。
．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ６００９，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８
９７から入手した。全てのＳｐｏｒｔベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含
み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．
Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターラフミ
ド（ｌａｆｍｉｄ）ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｏｌｏｕｍｂｉａ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を
含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクター
ｐＣＲ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１６００ Ｆａｒａｄａｙ
Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８から入手可能）は、アン
ピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒ
ｋ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６８６（１
９８８）およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９
９１）を参照のこと。
【００７７】
本発明はまた、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／または寄託されたプラスミ
ド（ｃＤＮＡプラスミド：Ｚ）に対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、
本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る
。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する
工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅す
る工程を包含するが、これらに限定されない。
ド（ｃＤＮＡプラスミド：Ｚ）に対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、
本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る
。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する
工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅す
る工程を包含するが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オルトログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知である
手順は、本明細書中で開示された配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンから
の情報を用いて、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／またはｃＤＮＡプラスミド
：Ｚに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライス改変体、全
長コード部分、オルトログ、および／または種ホモログを得るために使用され得
る。例えば、対立遺伝子改変体および／または種ホモログは、本明細書中に提供
される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改
変体および／または所望のホモログについて適切な核酸供給源をスクリーニング
することにより単離および同定され得る。
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知である
手順は、本明細書中で開示された配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンから
の情報を用いて、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／またはｃＤＮＡプラスミド
：Ｚに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライス改変体、全
長コード部分、オルトログ、および／または種ホモログを得るために使用され得
る。例えば、対立遺伝子改変体および／または種ホモログは、本明細書中に提供
される配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改
変体および／または所望のホモログについて適切な核酸供給源をスクリーニング
することにより単離および同定され得る。
【００７９】
本発明は、配列番号Ｘの核酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚを含
むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はま
た、配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチ
ド、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドを提供する。
配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、
および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドはまた、本発明により包含される。本発明はさらに、配列番号Ｘの
核酸配列の相補体、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡのコー
ド鎖の相補体を含むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを包含
する。
むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はま
た、配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチ
ド、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドを提供する。
配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、
および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドはまた、本発明により包含される。本発明はさらに、配列番号Ｘの
核酸配列の相補体、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡのコー
ド鎖の相補体を含むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを包含
する。
【００８０】
多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の
前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリ
ヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙する
ことは、本出願の開示では非常に煩わしい。従って、好ましくは、配列番号Ｘは
、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号Ｘの
１と配列番号Ｘの最終ヌクレオチド−１５との間の任意の整数であり、ｂは１５
〜配列番号Ｘの最終ヌクレオチドの整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列
番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４
以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
、そして配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の
前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリ
ヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙する
ことは、本出願の開示では非常に煩わしい。従って、好ましくは、配列番号Ｘは
、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号Ｘの
１と配列番号Ｘの最終ヌクレオチド−１５との間の任意の整数であり、ｂは１５
〜配列番号Ｘの最終ヌクレオチドの整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列
番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４
以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００８１】
（全長遺伝子の回収のためのＲＡＣＥプロトコル）
部分的ｃＤＮＡクローンは、Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）に記載
されたｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）手順を利用することにより全長を作
製し得る。５’末端または３’末端のいずれかが欠失しているｃＤＮＡクローン
は、翻訳の開始コドンまたは終止コドンのそれぞれに伸長する欠失塩基対を含む
ように再構築され得る。いくつかの場合において、ｃＤＮＡは、そのために翻訳
の開始を欠失している。以下に、この本来の５’ＲＡＣＥ手順の改変を簡単に記
載する。ポリＡ＋または全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ）およびｃＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスプライマーまたは相補
的プライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応から除去する。次いで、第
１鎖ｃＤＮＡを、ｄＡＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、添付する（ｔａｉｌ）。従って、アンカー配
列を産生し、これは、ＰＣＲ増幅のために必要である。第２鎖をｄＡ−テイル含
有ＰＣＲ緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、５’末端で３つの隣接制限部位（ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ
）を含むオリゴｄＴプライマーならびにこれらの制限部位を正しく含むプライマ
ーから合成する。この２本鎖ｃＤＮＡを同じプライマーならびにネスティッドｃ
ＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーを用いて４０サイクルでＰＣＲ増幅する。
このＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドアガロースゲル上でサイズ分離し、そ
して欠失しているタンパク質コードＤＮＡの推定サイズのｃＤＮＡ産物を含むゲ
ルの領域を取り出す。ｃＤＮＡをＭａｇｉｃ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩまたはＳａｌＩを用
いて制限消化し、そしてプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩ
Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位で連結する
。このＤＮＡを細菌に形質転換し、そしてこのプラスミドクローンを配列決定し
て、正確なタンパク質コード挿入物を同定する。正確な５’末端を、推定的に同
定されたホモログを有するこの配列と部分的ｃＤＮＡクローンを有する重複を比
較することにより確認する。当該分野において公知の同様の方法および／または
市販のキットを使用して、増幅し、そして３’末端を回収する。
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）に記載
されたｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）手順を利用することにより全長を作
製し得る。５’末端または３’末端のいずれかが欠失しているｃＤＮＡクローン
は、翻訳の開始コドンまたは終止コドンのそれぞれに伸長する欠失塩基対を含む
ように再構築され得る。いくつかの場合において、ｃＤＮＡは、そのために翻訳
の開始を欠失している。以下に、この本来の５’ＲＡＣＥ手順の改変を簡単に記
載する。ポリＡ＋または全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ）およびｃＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスプライマーまたは相補
的プライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応から除去する。次いで、第
１鎖ｃＤＮＡを、ｄＡＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、添付する（ｔａｉｌ）。従って、アンカー配
列を産生し、これは、ＰＣＲ増幅のために必要である。第２鎖をｄＡ−テイル含
有ＰＣＲ緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅ
ｔｕｓ）、５’末端で３つの隣接制限部位（ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ
）を含むオリゴｄＴプライマーならびにこれらの制限部位を正しく含むプライマ
ーから合成する。この２本鎖ｃＤＮＡを同じプライマーならびにネスティッドｃ
ＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーを用いて４０サイクルでＰＣＲ増幅する。
このＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドアガロースゲル上でサイズ分離し、そ
して欠失しているタンパク質コードＤＮＡの推定サイズのｃＤＮＡ産物を含むゲ
ルの領域を取り出す。ｃＤＮＡをＭａｇｉｃ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩまたはＳａｌＩを用
いて制限消化し、そしてプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩ
Ｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））にＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位で連結する
。このＤＮＡを細菌に形質転換し、そしてこのプラスミドクローンを配列決定し
て、正確なタンパク質コード挿入物を同定する。正確な５’末端を、推定的に同
定されたホモログを有するこの配列と部分的ｃＤＮＡクローンを有する重複を比
較することにより確認する。当該分野において公知の同様の方法および／または
市販のキットを使用して、増幅し、そして３’末端を回収する。
【００８２】
いくつかの、品質制御キットが購入のために市販されている。上記のそれらと
同様の試薬および方法は、全長遺伝子を回収をするための５’ ＲＡＣＥおよび
３’ＲＡＣＥの両方について、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからキットの形態で供給され
る。第２のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。このキットは、Ｄ
ｕｍａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５２２７−３２（
１９９１）により開発された、関連技術の改変（ＳＬＩＣ（一本鎖ｃＤＮＡへの
、一本鎖の連結））である。手順における主な違いは、ＲＮＡを、逆転写後にア
ルカリ加水分解し、そしてＲＮＡリガーゼを使用して、第１鎖ｃＤＮＡに、制限
部位を含むアンカープライマーを連結することである。これは、過去に配列決定
をするのが困難なポリＴの伸長を生じるｄＡテーリング反応における必要性を除
去する。
同様の試薬および方法は、全長遺伝子を回収をするための５’ ＲＡＣＥおよび
３’ＲＡＣＥの両方について、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからキットの形態で供給され
る。第２のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。このキットは、Ｄ
ｕｍａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５２２７−３２（
１９９１）により開発された、関連技術の改変（ＳＬＩＣ（一本鎖ｃＤＮＡへの
、一本鎖の連結））である。手順における主な違いは、ＲＮＡを、逆転写後にア
ルカリ加水分解し、そしてＲＮＡリガーゼを使用して、第１鎖ｃＤＮＡに、制限
部位を含むアンカープライマーを連結することである。これは、過去に配列決定
をするのが困難なポリＴの伸長を生じるｄＡテーリング反応における必要性を除
去する。
【００８３】
ＲＮＡからの５’ｃＤＮＡまたは３’ｃＤＮＡを産生する代替は、ｃＤＮＡラ
イブラリー二本鎖ＤＮＡを使用することである。非対称性ＰＣＲ増幅アンチセン
スｃＤＮＡ鎖は、アンチセンスｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプラスミドアン
カープライマーを用いて合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称Ｐ
ＣＲ反応を、ネストしたｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミ
ドアンカープライマーを用いて実施する。
イブラリー二本鎖ＤＮＡを使用することである。非対称性ＰＣＲ増幅アンチセン
スｃＤＮＡ鎖は、アンチセンスｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプラスミドアン
カープライマーを用いて合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称Ｐ
ＣＲ反応を、ネストしたｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミ
ドアンカープライマーを用いて実施する。
【００８４】
（全長遺伝子を得るために５’または３’末端配列を生成するためのＲＮＡリ
ガーゼプロトコル） 一旦、目的の遺伝子を同定すると、もとのｃＤＮＡプラスミドに存在しないか
もしれない遺伝子の５’部分または３’部分の同定のために、いくつかの方法が
利用可能である。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィル
タープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン濃縮、および５’および
３’ＲＡＣＥと類似のプロトコルおよび同一のプロトコル。全長遺伝子がこのラ
イブラリー中に存在し得、そして探索により同定され得るが、５’または３’末
端を生成するのに有用な方法は、もとのｃＤＮＡからの既存の配列情報を使用し
て欠失する情報を生成することである。５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の
全長遺伝子の欠失する５’末端を生成するために利用可能である（この方法は、
Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（
７）：１６８３−１６８４（１９９３）によって公開された）。簡潔には、特定
のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をおそらく含むＲＮＡ
の集団の５’末端に連結する。そして、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに
特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の既知の配列に特異的なプライマーを含
む、プライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅す
る。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全長遺伝
子を生成し得る。この方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開
始する。ポリＡ ＲＮＡを使用し得るが、これは、この手順の必須要件ではない
。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理して、後のＲＮＡ
リガーゼ工程を妨害し得る分解ＲＮＡまたは損傷ＲＮＡ上の５’リン酸基を排除
し得る。次いで、使用した場合は、このホスファターゼを不活化し、そしてこの
ＲＮＡを、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去する
ために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理する。この反応は、次いでＴ
４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャッ
プ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。次いで、この改変型ＲＮＡ調製
物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のため
のテンプレートとして使用し得る。次いで、第一鎖合成反応物を、連結されたＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的のＢＭＰの既知の配列
に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のためのテンプレ
ートとして使用し得る。次いで、得られた産物を配列決定し、そして分析してそ
の５’末端配列が関連するＢＭＰに属することを確認する。
ガーゼプロトコル） 一旦、目的の遺伝子を同定すると、もとのｃＤＮＡプラスミドに存在しないか
もしれない遺伝子の５’部分または３’部分の同定のために、いくつかの方法が
利用可能である。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィル
タープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン濃縮、および５’および
３’ＲＡＣＥと類似のプロトコルおよび同一のプロトコル。全長遺伝子がこのラ
イブラリー中に存在し得、そして探索により同定され得るが、５’または３’末
端を生成するのに有用な方法は、もとのｃＤＮＡからの既存の配列情報を使用し
て欠失する情報を生成することである。５’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の
全長遺伝子の欠失する５’末端を生成するために利用可能である（この方法は、
Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（
７）：１６８３−１６８４（１９９３）によって公開された）。簡潔には、特定
のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をおそらく含むＲＮＡ
の集団の５’末端に連結する。そして、連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに
特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の既知の配列に特異的なプライマーを含
む、プライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣＲ増幅す
る。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して全長遺伝
子を生成し得る。この方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開
始する。ポリＡ ＲＮＡを使用し得るが、これは、この手順の必須要件ではない
。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理して、後のＲＮＡ
リガーゼ工程を妨害し得る分解ＲＮＡまたは損傷ＲＮＡ上の５’リン酸基を排除
し得る。次いで、使用した場合は、このホスファターゼを不活化し、そしてこの
ＲＮＡを、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去する
ために、タバコ酸ピロホスファターゼを用いて処理する。この反応は、次いでＴ
４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャッ
プ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。次いで、この改変型ＲＮＡ調製
物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のため
のテンプレートとして使用し得る。次いで、第一鎖合成反応物を、連結されたＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的のＢＭＰの既知の配列
に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のためのテンプレ
ートとして使用し得る。次いで、得られた産物を配列決定し、そして分析してそ
の５’末端配列が関連するＢＭＰに属することを確認する。
【００８５】
（ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリペプチドフラグメント）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（核酸）の、ポリヌクレオチドフラ
グメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、
以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドをいう：ｃＤＮＡプラスミドＺに
含まれるｃＤＮＡの一部か、もしくはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部；配列番号Ｘもし
くはその相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部；配列番号Ｙのポリペプチ
ドの一部をコードするポリヌクレオチド配列；あるいは配列番号Ｘによりコード
されるポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列。本発明のヌクレ
オチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好まし
くは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そし
てなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくと
も約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔ、または少な
くとも約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」の
フラグメントは、例えばｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ配列に含まれる配列ま
たは配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖由来の２０以上
の連続する塩基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」
は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）の
ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのヌクレオチドフラグ
メントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとし
ての使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きな
フラグメント（例えば、少なくとも１５０、１７５、２００、２５０、５００、
６００、１０００または２０００のヌクレオチドの長さ）もまた、本発明に含ま
れる。
グメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、
以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドをいう：ｃＤＮＡプラスミドＺに
含まれるｃＤＮＡの一部か、もしくはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部；配列番号Ｘもし
くはその相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部；配列番号Ｙのポリペプチ
ドの一部をコードするポリヌクレオチド配列；あるいは配列番号Ｘによりコード
されるポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列。本発明のヌクレ
オチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好まし
くは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そし
てなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくと
も約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔ、または少な
くとも約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」の
フラグメントは、例えばｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ配列に含まれる配列ま
たは配列番号Ｘに示されるヌクレオチド配列もしくはその相補鎖由来の２０以上
の連続する塩基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」
は、特に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）の
ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのヌクレオチドフラグ
メントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとし
ての使用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きな
フラグメント（例えば、少なくとも１５０、１７５、２００、２５０、５００、
６００、１０００または２０００のヌクレオチドの長さ）もまた、本発明に含ま
れる。
【００８６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
以下の配列番号Ｘ、またはその相補鎖のおおよそのヌクレオチド数の配列を含む
か、あるいはそれからなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００
、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１
〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０
、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００
〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１
０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２
０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４０
０、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１
〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、
１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１
９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１
０１〜２１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３０
０、および／または２３０１〜２３１５。この文脈において、「おおよそ（約）
」は、特に記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端において
、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、ま
たは小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、その配列が一部
であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの、機能的活性（例え
ば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これ
らのフラグメントは、本明細書中、議論されるようにプローブまたはプライマー
として使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または
より低いストリンジェンシー条件下でこれらのフラグメントの１つ以上にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドまたはフラグメントも同様に含まれる。
以下の配列番号Ｘ、またはその相補鎖のおおよそのヌクレオチド数の配列を含む
か、あるいはそれからなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００
、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１
〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０
、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００
〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１
０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２
０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４０
０、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１
〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、
１７５１〜１８００、１８０１〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１
９５０、１９５１〜２０００、２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１
０１〜２１５０、２１５１〜２２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３０
０、および／または２３０１〜２３１５。この文脈において、「おおよそ（約）
」は、特に記載された範囲、またはいずれかの末端もしくは両方の末端において
、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、ま
たは小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、その配列が一部
であるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの、機能的活性（例え
ば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これ
らのフラグメントは、本明細書中、議論されるようにプローブまたはプライマー
として使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下または
より低いストリンジェンシー条件下でこれらのフラグメントの１つ以上にハイブ
リダイズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチ
ドによりコードされるポリペプチドまたはフラグメントも同様に含まれる。
【００８７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖
の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいはそれからなるフラ
グメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２
００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４
０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７
００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９
０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、
１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１
３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４
５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５
０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１
〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、
２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２
２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、および／または２３０１〜
２３１５。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、あ
るいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３
、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。好ま
しくは、これらのフラグメントは、ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌ
クレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能的活性（例えば、生物
学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのフラ
グメントは、本明細書中で議論されるように、プローブまたはプライマーとして
使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低
いストリンジェンシー条件下で１つ以上のこれらのフラグメントにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドまた
はフラグメントによりコードされるポリペプチドもまた、含まれる。
ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖
の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいはそれからなるフラ
グメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２
００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４
０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７
００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９
０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、
１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１
３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４
５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５
０、１６５１〜１７００、１７０１〜１７５０、１７５１〜１８００、１８０１
〜１８５０、１８５１〜１９００、１９０１〜１９５０、１９５１〜２０００、
２００１〜２０５０、２０５１〜２１００、２１０１〜２１５０、２１５１〜２
２００、２２０１〜２２５０、２２５１〜２３００、および／または２３０１〜
２３１５。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、あ
るいはいずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３
、２、または１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。好ま
しくは、これらのフラグメントは、ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌ
クレオチド配列によってコードされるポリペプチドの機能的活性（例えば、生物
学的活性）を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、これらのフラ
グメントは、本明細書中で議論されるように、プローブまたはプライマーとして
使用され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低
いストリンジェンシー条件下で１つ以上のこれらのフラグメントにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドもまた本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドまた
はフラグメントによりコードされるポリペプチドもまた、含まれる。
【００８８】
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
アミノ酸配列の一部、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列の一部、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列をいう。タンパク質（ポ
リペプチド）フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」で
あり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分また
は領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得
る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列
番号Ｙのコード領域の、以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列を含むか、
あるいは以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙
げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１
０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２
００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、２
８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４０、３４１〜３６０、３６１〜３
８０、３８１〜４００、４０１〜４２０、４２１〜４４０、４４１〜４６０、４
６１〜４８０、４８１〜５００、５０１〜５２０、５２１〜５４０、５４１〜５
６０、および／または５６１〜５７０。さらに、本発明のポリペプチドフラグメ
ントは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０
、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０
、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸の長さであり得る。この文脈におい
て、「約（おおよそ）」とは、特に記載された範囲または値、あるいはいずれか
の末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１
）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな、範囲または値を含む。これらのポリペ
プチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
アミノ酸配列の一部、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列の一部、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列をいう。タンパク質（ポ
リペプチド）フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」で
あり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分また
は領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得
る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列
番号Ｙのコード領域の、以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列を含むか、
あるいは以下のおおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列からなるフラグメントが挙
げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０、６１〜８０、８１〜１００、１
０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６０、１６１〜１８０、１８１〜２
００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４１〜２６０、２６１〜２８０、２
８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４０、３４１〜３６０、３６１〜３
８０、３８１〜４００、４０１〜４２０、４２１〜４４０、４４１〜４６０、４
６１〜４８０、４８１〜５００、５０１〜５２０、５２１〜５４０、５４１〜５
６０、および／または５６１〜５７０。さらに、本発明のポリペプチドフラグメ
ントは、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０
、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０
、１３０、１４０、または１５０のアミノ酸の長さであり得る。この文脈におい
て、「約（おおよそ）」とは、特に記載された範囲または値、あるいはいずれか
の末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、または１
）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さな、範囲または値を含む。これらのポリペ
プチドフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００８９】
タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、マルチマー化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持さ
れ得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘
導する短縮型ムテインの能力および／またはその抗体に結合する短縮型ムテイン
の能力は、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基
が、Ｎ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチド
のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持する
かどうかは、本明細書中に記載され、そしてさもなくば当該分野において公知の
慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基
を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る
ようである。実際に、６つ程度に少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しば
しば免疫応答を惹起し得る。
上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、マルチマー化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持さ
れ得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘
導する短縮型ムテインの能力および／またはその抗体に結合する短縮型ムテイン
の能力は、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基
が、Ｎ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチド
のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持する
かどうかは、本明細書中に記載され、そしてさもなくば当該分野において公知の
慣用的な方法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基
を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持し得る
ようである。実際に、６つ程度に少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しば
しば免疫応答を惹起し得る。
【００９０】
従って、本発明のポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質ならび
に成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、
アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失し
た残基を有する分泌タンパク質、もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意
の数のアミノ酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のい
ずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０
の範囲）が、分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得
る。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせ
は好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌク
レオチドもまた好ましい。
に成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、
アミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失し
た残基を有する分泌タンパク質、もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意
の数のアミノ酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のい
ずれかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０
の範囲）が、分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得
る。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせ
は好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌク
レオチドもまた好ましい。
【００９１】
本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙのポリ
ペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチド）のアミノ酸配列のアミノ末端から、欠失した１つ以上の
残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式
ｍ−ｑによって記載され得、ここでｑは、本発明のポリペプチド（例えば、配列
番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミノ酸残基の総数を表す全整数で
あり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
ペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチド）のアミノ酸配列のアミノ末端から、欠失した１つ以上の
残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式
ｍ−ｑによって記載され得、ここでｑは、本発明のポリペプチド（例えば、配列
番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミノ酸残基の総数を表す全整数で
あり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００９２】
また、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、
他の機能的活性（例えば、生物学的活性、マルチマー化する能力、リガンドに結
合する能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または
成熟形態を認識する抗体を誘導する短縮型ムテインの能力および／またはこの抗
体に結合する短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペ
プチドの大部分より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保
持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、この
ような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法
、およびさもなくば当該分野において公知の方法によって容易に決定され得る。
多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活
性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つ程度に少ないアミ
ノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でさえ、
他の機能的活性（例えば、生物学的活性、マルチマー化する能力、リガンドに結
合する能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または
成熟形態を認識する抗体を誘導する短縮型ムテインの能力および／またはこの抗
体に結合する短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペ
プチドの大部分より少ない残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保
持される。完全なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、この
ような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法
、およびさもなくば当該分野において公知の方法によって容易に決定され得る。
多数の欠失したＣ末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活
性または免疫原性活性を保持し得るようである。実際に、６つ程度に少ないアミ
ノ酸残基からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００９３】
従って、本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号
Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のカルボキシ末端由来の、１つ
以上の残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、
一般式１−ｎによって記載され得、ここでｎは、６〜ｑ−１の範囲の任意の全整
数であり、そしてここでｎは、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位
置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明により含まれる。
Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のカルボキシ末端由来の、１つ
以上の残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｃ末端の欠失は、
一般式１−ｎによって記載され得、ここでｎは、６〜ｑ−１の範囲の任意の全整
数であり、そしてここでｎは、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位
置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明により含まれる。
【００９４】
さらに、上記のＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、Ｎ末端
およびＣ末端欠失型ポリペプチドを産生し得る。本発明はまた、アミノ末端およ
びカルボキシ末端の両方から欠失した１つ以上のアミノ酸を有するポリペプチド
を提供し、このポリペプチドは、一般的に、配列番号Ｘ（例えば、配列番号Ｙと
して開示される好ましいポリペプチドを含むが、これらに限定されない）および
／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡ、ならびに／あるいはそれらの相補
鎖によってコードされるポリペプチドの、残基ｍ−ｎを有するとして記載され得
、ここでｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
およびＣ末端欠失型ポリペプチドを産生し得る。本発明はまた、アミノ末端およ
びカルボキシ末端の両方から欠失した１つ以上のアミノ酸を有するポリペプチド
を提供し、このポリペプチドは、一般的に、配列番号Ｘ（例えば、配列番号Ｙと
して開示される好ましいポリペプチドを含むが、これらに限定されない）および
／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡ、ならびに／あるいはそれらの相補
鎖によってコードされるポリペプチドの、残基ｍ−ｎを有するとして記載され得
、ここでｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００９５】
配列番号Ｙのポリペプチドに含まれる任意のポリペプチド配列、配列番号Ｘと
して記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド
配列、またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされる任意のポ
リペプチド配列は、そのポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するために、
分析され得る。例えば、配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡの
ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｄ
ＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８
Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ；ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）のデフォルトパラメーターを使用
して、分析され得る。
して記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる任意のポリペプチド
配列、またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされる任意のポ
リペプチド配列は、そのポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するために、
分析され得る。例えば、配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡの
ポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｄ
ＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２８
Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ；ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）のデフォルトパラメーターを使用
して、分析され得る。
【００９６】
ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを使用して慣用的に得られ得るポ
リペプチドの領域としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領
域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの
α−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可
撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆの領域。この点で、本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に
、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３
または４））と組み合わされる領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドがある。
リペプチドの領域としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領
域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの
α−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可
撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆの領域。この点で、本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に
、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３
または４））と組み合わされる領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドがある。
【００９７】
さらに、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｍｉ
ｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（
すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメターを使用
して同定されるような、１．５以上の抗原性指標を有する、４つ以上の連続する
アミノ酸を含む）を慣用的に使用して、抗原性に対する高い程度の可能性を示す
ポリペプチドの領域を決定し得る。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始プロセ
スにおいて、抗原認識が生じ得る環境中のポリペプチドの表面上に曝されるよう
であるポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、ＤＮＡＳＴＡＲ分
析によるデータから決定される。
ｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（
すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメターを使用
して同定されるような、１．５以上の抗原性指標を有する、４つ以上の連続する
アミノ酸を含む）を慣用的に使用して、抗原性に対する高い程度の可能性を示す
ポリペプチドの領域を決定し得る。高い抗原性の領域は、免疫応答の開始プロセ
スにおいて、抗原認識が生じ得る環境中のポリペプチドの表面上に曝されるよう
であるポリペプチドの領域を表す値を選択することによって、ＤＮＡＳＴＡＲ分
析によるデータから決定される。
【００９８】
本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメ
ントであるポリペプチド配列の、機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すア
ミノ酸配列を含むか、または代替的に、これらからなるフラグメントである。「
機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長タンパク質と関連した１つ以上の公
知の機能的活性（例えば、前述のような、生物学的活性、抗原性、免疫原性、お
よび／またはマルチマー化のような）を示し得るポリペプチドを意味する。
ントであるポリペプチド配列の、機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すア
ミノ酸配列を含むか、または代替的に、これらからなるフラグメントである。「
機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長タンパク質と関連した１つ以上の公
知の機能的活性（例えば、前述のような、生物学的活性、抗原性、免疫原性、お
よび／またはマルチマー化のような）を示し得るポリペプチドを意味する。
【００９９】
他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントとは、本発明のポリペプチドの活性に対し
て、類似する活性を示すフラグメントであるが、同一である必要はない。このフ
ラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望ましく
ない活性を含み得る。
ある。生物学的に活性なフラグメントとは、本発明のポリペプチドの活性に対し
て、類似する活性を示すフラグメントであるが、同一である必要はない。このフ
ラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望ましく
ない活性を含み得る。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプ
チドの１、２、３、４、５またはそれ以上の抗原性フラグメントか、またはその
部分を含むか、または代替的にそれらからなる。これらのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
チドの１、２、３、４、５またはそれ以上の抗原性フラグメントか、またはその
部分を含むか、または代替的にそれらからなる。これらのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１０１】
本発明は、配列番号Ｙに示されるポリペプチド配列のエピトープ、またはｃＤ
ＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピトー
プ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下または代替的により低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺに
含まれるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズする、ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、または代替的
に、それらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプ
チド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号Ｘ
に開示される配列のような）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチ
ド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下または代替的に、より低いストリ
ンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、この相補鎖にハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列を含む。
ＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピトー
プ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下または代替的により低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーショ
ン条件下で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺに
含まれるエピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズする、ポリヌクレオチ
ドによってコードされるポリペプチド配列のエピトープを含むか、または代替的
に、それらからなる、ポリペプチドを含む。本発明はさらに、本発明のポリペプ
チド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号Ｘ
に開示される配列のような）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチ
ド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下または代替的に、より低いストリ
ンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、この相補鎖にハイブリダイズ
するポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
本発明において用いる場合、用語「エピトープ」は、動物、好ましくは哺乳動
物、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有する
ポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープ
およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含
む。本明細書中において用いる場合、「免疫原性エピトープ」とは、当該分野に
おいて公知の任意の方法により（例えば、以下に記載の抗体を産生するための方
法によって）決定されるような動物における抗体応答を誘発するタンパク質の一
部分と定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明
細書中において用いる場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野において
周知の任意の方法により（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイよっ
て）決定されるような、タンパク質の一部分の抗原に免疫特異的に結合し得る抗
体に対する、タンパク質の一部分として定義される。免疫特異的な結合は、非特
異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性を必ずしも除外しない。抗原性
エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
物、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または免疫原性活性を有する
ポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明は、エピトープ
およびこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリペプチドを含
む。本明細書中において用いる場合、「免疫原性エピトープ」とは、当該分野に
おいて公知の任意の方法により（例えば、以下に記載の抗体を産生するための方
法によって）決定されるような動物における抗体応答を誘発するタンパク質の一
部分と定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。本明
細書中において用いる場合、用語「抗原性エピトープ」とは、当該分野において
周知の任意の方法により（例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイよっ
て）決定されるような、タンパク質の一部分の抗原に免疫特異的に結合し得る抗
体に対する、タンパク質の一部分として定義される。免疫特異的な結合は、非特
異的結合を除外するが、他の抗原との交差反応性を必ずしも除外しない。抗原性
エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【０１０３】
エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の手段により作製され
得る（例えば、米国特許番号第４，６３１，２１１号にさらに記載されるＨｏｕ
ｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２
：５１３１〜５１３５（１９８５）を参照のこと）。
得る（例えば、米国特許番号第４，６３１，２１１号にさらに記載されるＨｏｕ
ｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２
：５１３１〜５１３５（１９８５）を参照のこと）。
【０１０４】
本発明において、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４個、少なく
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。免疫原性ま
たは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１
５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらなる
非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書中に開示された抗原性エピト
ープ、ならびに、その一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、このエピトー
プと特異的に結合する抗体（モノクロナール抗体を含む）を惹起するために有用
である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示された抗原性エピトー
プ、ならびに、これらの抗原性エピトープの２、３、４、５、またはそれ以上の
任意の組み合わせを含む。抗原性エピトープはイムノアッセイにおける標的分子
として用いられ得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７
８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６
６６（１９８３）を参照のこと）。
とも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、
少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少
なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少
なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、そ
して最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の配列を含む。免疫原性ま
たは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０、１
５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７
５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さらなる
非排他的な好ましい抗原性エピトープは、本明細書中に開示された抗原性エピト
ープ、ならびに、その一部を含む。抗原性エピトープは、例えば、このエピトー
プと特異的に結合する抗体（モノクロナール抗体を含む）を惹起するために有用
である。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示された抗原性エピトー
プ、ならびに、これらの抗原性エピトープの２、３、４、５、またはそれ以上の
任意の組み合わせを含む。抗原性エピトープはイムノアッセイにおける標的分子
として用いられ得る（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７
８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６
６６（１９８３）を参照のこと）。
【０１０５】
同様に、例えば、当該分野において周知の方法に従って抗体を誘導するために
免疫原性エピトープが用いられ得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エ
ピトープとしては、本明細書中で開示された免疫原性エピトープ、ならびに、こ
れらの免疫原性エピトープの２、３、４、５、またはそれ以上の任意の組み合わ
せが挙げられる。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、アルブ
ミンのようなキャリアタンパク質とともに抗体応答を誘発するために動物系（例
えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得るか、またはそのポリペプチド
が十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリペプチドはキャリア
なしに、提示され得る。しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピト
ープは、少なくとも変性ポリペプチドにおける直鎖状エピトープと結合可能であ
る抗体を惹起させるのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッ
ティングにおいて）。
免疫原性エピトープが用いられ得る（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗ
ｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エ
ピトープとしては、本明細書中で開示された免疫原性エピトープ、ならびに、こ
れらの免疫原性エピトープの２、３、４、５、またはそれ以上の任意の組み合わ
せが挙げられる。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプチドは、アルブ
ミンのようなキャリアタンパク質とともに抗体応答を誘発するために動物系（例
えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得るか、またはそのポリペプチド
が十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリペプチドはキャリア
なしに、提示され得る。しかし、わずか８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピト
ープは、少なくとも変性ポリペプチドにおける直鎖状エピトープと結合可能であ
る抗体を惹起させるのに十分であることが示された（例えば、ウエスタンブロッ
ティングにおいて）。
【０１０６】
本発明のエピトープ保有ポリぺプチドは、当該分野で周知の方法（インビボで
の免疫化、インビトロでの免疫化、ファージディスプレイ法を含むが、これらに
限定されない）に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌ
ｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ
での免疫化が使用される場合、動物は、遊離したペプチドによって免疫化され得
る；しかし、抗ペプチド抗体力価は高分子キャリア（例えば、キーホールリンペ
ットへモシニアン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）へのペプチドの結合によ
ってブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、リンカー（
例えば、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ
ｅｓｔｅｒ）（ＭＢＳ））を使用してキャリアに結合され得るが、他のペプチド
はより一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用してキャリアに結
合され得る。動物（例えば、ウサギ、ラットおよびマウス）は、免疫応答を刺激
するために、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパクおよびフ
ロイントアジュバントまたは他の任意の公知のアジュバンドを含むエマルジョン
の腹腔内注射および／または皮内注射によって遊離のペプチドまたはキャリア結
合ペプチドのいずれかで免疫される。何回かのブースター注射が、例えば、約２
週間間隔で、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要であり得、この
力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセ
イによって検出され得る。免疫化した動物由来の血清中における抗ペプチド抗体
の力価は、抗ペプチド抗体の選択により（例えば、当該分野で周知の方法に従う
固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出によって）増加し
得る。
の免疫化、インビトロでの免疫化、ファージディスプレイ法を含むが、これらに
限定されない）に従って抗体を誘導するために使用される。例えば、Ｓｕｔｃｌ
ｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ
．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）を参照のこと。インビボ
での免疫化が使用される場合、動物は、遊離したペプチドによって免疫化され得
る；しかし、抗ペプチド抗体力価は高分子キャリア（例えば、キーホールリンペ
ットへモシニアン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）へのペプチドの結合によ
ってブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプチドは、リンカー（
例えば、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍａ
ｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ
ｅｓｔｅｒ）（ＭＢＳ））を使用してキャリアに結合され得るが、他のペプチド
はより一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を使用してキャリアに結
合され得る。動物（例えば、ウサギ、ラットおよびマウス）は、免疫応答を刺激
するために、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパクおよびフ
ロイントアジュバントまたは他の任意の公知のアジュバンドを含むエマルジョン
の腹腔内注射および／または皮内注射によって遊離のペプチドまたはキャリア結
合ペプチドのいずれかで免疫される。何回かのブースター注射が、例えば、約２
週間間隔で、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために必要であり得、この
力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離ペプチドを使用するＥＬＩＳＡアッセ
イによって検出され得る。免疫化した動物由来の血清中における抗ペプチド抗体
の力価は、抗ペプチド抗体の選択により（例えば、当該分野で周知の方法に従う
固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出によって）増加し
得る。
【０１０７】
当業者が理解するように、そして上記に議論されるように、本発明のポリペプ
チドならびにその免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原性エピト
ープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明の
ポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、または
それらの一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその任意の組み合わせおよびそ
れらの一部）の定常ドメインと融合され得、キメラポリペプチドを生じる。これ
らの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期を増加
させ得る。これは、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺
乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキ
メラタンパク質について示されてきた。例えば、ＥＰ ３９４，８２７：Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこ
と。上皮バリヤーを横切っての抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまた
はＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ
９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３を参照のこと）に結合体化し
た抗原（例えば、インシュリン）に対して実証された。ＩｇＧ部分のジスルフィ
ド連結に起因してジスルフィド連結ダイマー構造を有するＩｇＧ融合タンパク質
はまた、他の分子の結合および中和において、モノマーポリペプチド単独または
そのフラグメント単独もより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９
９５）参照のこと。
チドならびにその免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原性エピト
ープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明の
ポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）、または
それらの一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはその任意の組み合わせおよびそ
れらの一部）の定常ドメインと融合され得、キメラポリペプチドを生じる。これ
らの融合タンパク質は、精製を容易にし、そしてインビボにおける半減期を増加
させ得る。これは、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺
乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキ
メラタンパク質について示されてきた。例えば、ＥＰ ３９４，８２７：Ｔｒａ
ｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照のこ
と。上皮バリヤーを横切っての抗原の免疫系への増強された送達は、ＩｇＧまた
はＦｃフラグメントのようなＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ
９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３を参照のこと）に結合体化し
た抗原（例えば、インシュリン）に対して実証された。ＩｇＧ部分のジスルフィ
ド連結に起因してジスルフィド連結ダイマー構造を有するＩｇＧ融合タンパク質
はまた、他の分子の結合および中和において、モノマーポリペプチド単独または
そのフラグメント単独もより効果的であることが見出された。例えば、Ｆｏｕｎ
ｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９
９５）参照のこと。
【０１０８】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ４６４ ５３３（カナダ国対応物２０４５８６９）は、
別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の種
々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２，２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ま
しくあり得る。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用さ
れる場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発において、
例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニスト
を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆ
ｃタンパク質と融合された。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参
照のこと）。
別のヒトタンパク質またはその一部と一緒に免疫グロブリン分子の定常領域の種
々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合において、融合タンパク
質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば、改良さ
れた薬物動態学的な特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２，２６２）。あるいは
、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分の欠損は、好ま
しくあり得る。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用さ
れる場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の開発において、
例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタゴニスト
を同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆ
ｃタンパク質と融合された。（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏ
ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参
照のこと）。
【０１０９】
さらに、本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチドの精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８４）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な別のペプチドタグ（「ＨＡ」タグ）は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク
質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１
９８４））。
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８４）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な別のペプチドタグ（「ＨＡ」タグ）は、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク
質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１
９８４））。
【０１１０】
従って、これらの上記の融合物のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドを使用して操作され得る。
はポリペプチドを使用して操作され得る。
【０１１１】
上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、赤血球
凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ）として目的の遺伝子と組換えられ
て、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋ
ｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株において発現される非変性の
融合タンパク質の即座の精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７（１９９１））
。この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドにサブクロー
ン化され、それによって、この遺伝子のオープンリーディングフレームは、６つ
のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合される。このタグは、
融合タンパク質のためのマトリックス結合ドメインとしても役立つ。組換えワク
シニアウイルスに感染された細胞からの抽出液は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガ
ロースカラムにロードされ、そしてヒスチジン標識されたタンパク質は、イミダ
ゾール含有緩衝液で選択的に溶出され得る。
凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ）として目的の遺伝子と組換えられ
て、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋ
ｎｅｃｈｔらによって記載される系は、ヒト細胞株において発現される非変性の
融合タンパク質の即座の精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７（１９９１））
。この系において、目的の遺伝子は、ワクシニア組換えプラスミドにサブクロー
ン化され、それによって、この遺伝子のオープンリーディングフレームは、６つ
のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合される。このタグは、
融合タンパク質のためのマトリックス結合ドメインとしても役立つ。組換えワク
シニアウイルスに感染された細胞からの抽出液は、Ｎｉ２＋ニトリロ酢酸−アガ
ロースカラムにロードされ、そしてヒスチジン標識されたタンパク質は、イミダ
ゾール含有緩衝液で選択的に溶出され得る。
【０１１２】
本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【０１１３】
（ポリヌクレオチド改変体およびポリペプチド改変体）
本発明はまた、ＢＭＰ改変体を含む。本発明は、配列番号Ｘに開示されるポリ
ヌクレオチド配列の改変体またはそれらに対する相補鎖の改変体、および／また
はｃＤＮＡプラスミドＺ中に含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
ヌクレオチド配列の改変体またはそれらに対する相補鎖の改変体、および／また
はｃＤＮＡプラスミドＺ中に含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
【０１１４】
本発明はまた、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド配列の改変体、配列番号
Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の改変体およ
び／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ド配列の改変体を含む。
Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の改変体およ
び／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ド配列の改変体を含む。
【０１１５】
「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが
それらの特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一
般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
それらの特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一
般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【０１１６】
従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子か、あるいはその代わ
りに以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
からなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列表に示さるようなアミノ酸
配列を有するＢＭＰポリペプチドをコードし、そして配列番号ＸまたはｃＤＮＡ
プラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に
示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるよ
うなアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤ
ＮＡに記載されるようなアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの生物学的に
活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されそし
て配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるアミノ酸配列
を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチド配
列；（ｅ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒト
ｃＤＮＡプラスミドによってコードされる完全アミノ酸配列を含むＢＭＰポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラス
ミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるア
ミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（
ｇ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮ
Ａプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの
生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号
ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミド
によってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグ
メントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列。
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子か、あるいはその代わ
りに以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
からなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列表に示さるようなアミノ酸
配列を有するＢＭＰポリペプチドをコードし、そして配列番号ＸまたはｃＤＮＡ
プラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に
示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるよ
うなアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列；（ｃ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤ
ＮＡに記載されるようなアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの生物学的に
活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されそし
て配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるアミノ酸配列
を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチド配
列；（ｅ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒト
ｃＤＮＡプラスミドによってコードされる完全アミノ酸配列を含むＢＭＰポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラス
ミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるア
ミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（
ｇ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮ
Ａプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの
生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号
ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミド
によってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグ
メントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列。
【０１１７】
本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むかあるいはその代わりにこれらからなる、核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、または代わりにこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下でこれらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた
、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発
明によって含まれ得る。
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むかあるいはその代わりにこれらからなる、核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、または代わりにこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下でこれらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた
、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発
明によって含まれ得る。
【０１１８】
本発明の別の局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはその代わりに以下からなる群より選択さ
れるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子
を提供する：（ａ）配列表に示されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列
を有するＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に示
されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列表に示されそして表１に記載され
るようなアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの生物学的に活性なフラグメ
ントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されそして表１に記載さ
れるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグメントをコードす
るヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤ
ＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列を含む
ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ寄託物に含
まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコード
されるアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｇ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド
中のヒトｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチ
ドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴ
ＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡ
によってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグ
メントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列。
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはその代わりに以下からなる群より選択さ
れるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子
を提供する：（ａ）配列表に示されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列
を有するＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列表に示
されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列表に示されそして表１に記載され
るようなアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの生物学的に活性なフラグメ
ントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示されそして表１に記載さ
れるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグメントをコードす
るヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤ
ＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコードされる完全アミノ酸配列を含む
ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ寄託物に含
まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコード
されるアミノ酸配列を有する成熟ＢＭＰポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｇ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド
中のヒトｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチ
ドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴ
ＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡ
によってコードされるアミノ酸配列を有するＢＭＰポリペプチドの抗原性フラグ
メントをコードするヌクレオチド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列。
【０１１９】
本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはその代わりにこれらからなる核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、あるいはこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条件下で
これらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これ
らのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によ
って含まれる。
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはその代わりにこれらからなる核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、あるいはこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条件下で
これらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これ
らのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によ
って含まれる。
【０１２０】
本発明はまた、例えば、配列番号Ｙで示されるポリペプチド配列、配列番号Ｘ
のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列、ｃＤＮＡプラスミ
ドＺのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、および／またはこれら
のポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメント（例えば、本明細書に開
示されるフラグメント）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、
あるいは代わりにこれらからなる、ポリペプチドに関する。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下あるいはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下で、これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドによってコードされる
ポリペプチドと同様に、本発明によって含まれる。
のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列、ｃＤＮＡプラスミ
ドＺのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、および／またはこれら
のポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメント（例えば、本明細書に開
示されるフラグメント）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、
あるいは代わりにこれらからなる、ポリペプチドに関する。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下あるいはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下で、これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドによってコードされる
ポリペプチドと同様に、本発明によって含まれる。
【０１２１】
本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸とは、そのヌクレオチド配列がそのポリペプチド
をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点
変異を含み得ることを除いて、その核酸のヌクレオチド配列が、参照配列に対し
て同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少な
くとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、その参照配列
のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換
され得るか、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌク
レオチドが、その参照配列に挿入され得る。問い合わせ配列は、表１中に参照さ
れる全体配列（ＯＲＦ（読取り枠））、または本明細書中で記載されるような特
定の任意のフラグメントであり得る。
ヌクレオチド配列を有する核酸とは、そのヌクレオチド配列がそのポリペプチド
をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点
変異を含み得ることを除いて、その核酸のヌクレオチド配列が、参照配列に対し
て同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少な
くとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、その参照配列
のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換
され得るか、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌク
レオチドが、その参照配列に挿入され得る。問い合わせ配列は、表１中に参照さ
れる全体配列（ＯＲＦ（読取り枠））、または本明細書中で記載されるような特
定の任意のフラグメントであり得る。
【０１２２】
実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来どおり決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法（全体的配列整
列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６
：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュ
ータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列
および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換す
ることによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセン
トである。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列に
おいて使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ
−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔ
ｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ
Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００また
は対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来どおり決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法（全体的配列整
列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６
：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュ
ータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い合わせ配列
および対象配列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換す
ることによって比較され得る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセン
トである。同一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列に
おいて使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ
−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔ
ｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ
Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００また
は対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１２３】
対象配列が、５’または３’欠失が理由で（内部欠失が理由ではなく）、問い
合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。
これは、同一性パーセントを算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配
列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。問い合わせ配列に対して、
５’末端または３’末端で短縮化された対象配列については、同一性パーセント
は、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、整合／整列されない対象配列
の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を算定することによって補正
される。ヌクレオチドが整合／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結
果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用い
て上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し
引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコア
が、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される
場合、問い合わせ配列と整合／整列されいていない、対象配列の５’塩基および
３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
で算定される。
合わせ配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。
これは、同一性パーセントを算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配
列の５’および３’の短縮を考慮しないからである。問い合わせ配列に対して、
５’末端または３’末端で短縮化された対象配列については、同一性パーセント
は、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、整合／整列されない対象配列
の５’および３’である問い合わせ配列の塩基の数を算定することによって補正
される。ヌクレオチドが整合／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結
果によって決定される。次いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用い
て上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パーセントから差し
引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補正されたスコア
が、本発明の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される
場合、問い合わせ配列と整合／整列されいていない、対象配列の５’塩基および
３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
で算定される。
【０１２４】
例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１２５】
本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【０１２６】
実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列またそのフラグメントに対して、配列番号Ｘのヌクレオチド配列によっ
てコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対して、あるいはｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列またはそのフ
ラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を
決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方と
もアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同
一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパ
ラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔ
ｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄ
ｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒ
ｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚ
ｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
ノ酸配列またそのフラグメントに対して、配列番号Ｘのヌクレオチド配列によっ
てコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対して、あるいはｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列またはそのフ
ラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を
決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方と
もアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同
一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパ
ラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔ
ｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄ
ｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒ
ｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚ
ｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１２７】
対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０１２８】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１２９】
改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて、
５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２
５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加され
る改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、
特定の宿主についてのコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを
、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のた
めに、生成され得る。
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて、
５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２
５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加され
る改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、
特定の宿主についてのコドン発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを
、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のた
めに、生成され得る。
【０１３０】
天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０１３１】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、本明細書中で議論されるように、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実
質的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失さ
れ得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１
９９３）の著者らは、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失
させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した
。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１
０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏ
ｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８
））。
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、本明細書中で議論されるように、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実
質的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失さ
れ得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１
９９３）の著者らは、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失
させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した
。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１
０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏ
ｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８
））。
【０１３２】
さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【０１３３】
さらに、本明細書中で議論されるように、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端
からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失
を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌
される形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合
に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定
のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的
な方法によって容易に決定され得る。
からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失
を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌
される形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合
に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定
のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的
な方法によって容易に決定され得る。
【０１３４】
従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチドの機能的活性（例えば、生物
学的活性）を示すポリぺプチド改変体を含み、これらは、本発明のポリペプチド
の改変体である。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さ
ないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、
挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
学的活性）を示すポリぺプチド改変体を含み、これらは、本発明のポリペプチド
の改変体である。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さ
ないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、
挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
【０１３５】
本出願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、Ｎ末端および／または
Ｃ末端の欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）に対し
て、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％または１００％同一な核酸分子に関し、これらが機能的活性を有するポリぺ
プチドをコードするか否かに拘らない。これはなぜなら、特定の核酸分子が機能
的活性を有するポリぺプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を
、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマーとしてどのように使用するかを理解するからである。機能的活性
を有するポリぺプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわ
け、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中の遺伝子またはその対立
遺伝子改変体あるいはそのスプライス改変体の単離；（２）遺伝子の正確な染色
体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリ
ダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載され
る）；および（３）特定の組織におけるｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザン
ブロット分析。
Ｃ末端の欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）に対し
て、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％または１００％同一な核酸分子に関し、これらが機能的活性を有するポリぺ
プチドをコードするか否かに拘らない。これはなぜなら、特定の核酸分子が機能
的活性を有するポリぺプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を
、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマーとしてどのように使用するかを理解するからである。機能的活性
を有するポリぺプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわ
け、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中の遺伝子またはその対立
遺伝子改変体あるいはそのスプライス改変体の単離；（２）遺伝子の正確な染色
体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリ
ダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載され
る）；および（３）特定の組織におけるｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザン
ブロット分析。
【０１３６】
しかし、本明細書中で開示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であ
る配列を有する核酸分子が好ましく、これらは事実、本発明のポリペプチドの機
能的活性を有するポリぺプチドをコードする。
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であ
る配列を有する核酸分子が好ましく、これらは事実、本発明のポリペプチドの機
能的活性を有するポリぺプチドをコードする。
【０１３７】
当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、例えば、ｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡの核酸配列、表１に示される核酸配列（配列番号
Ｘ）またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を有する
多くの核酸分子が、「機能的活性を有する」ポリぺプチドをコードすることを即
座に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の任意の縮重改変体は全て、同
じポリぺプチドをコードするので、このことは、多くの場合、たとえ上記した比
較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体ではない核
酸分子に関しては、その相当数がまた、機能的活性を有するポリぺプチドをコー
ドすることが、当該分野においてさらに認識される。これはなぜなら、以下にさ
らに記載されるように、当業者は、タンパク質機能にあまり有意に影響を及ぼし
そうにないか、または有意に影響を及ぼしそうにないかのいずれかのアミノ酸置
換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸と置換する）を十分に
認識しているからである。
Ａプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡの核酸配列、表１に示される核酸配列（配列番号
Ｘ）またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を有する
多くの核酸分子が、「機能的活性を有する」ポリぺプチドをコードすることを即
座に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の任意の縮重改変体は全て、同
じポリぺプチドをコードするので、このことは、多くの場合、たとえ上記した比
較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体ではない核
酸分子に関しては、その相当数がまた、機能的活性を有するポリぺプチドをコー
ドすることが、当該分野においてさらに認識される。これはなぜなら、以下にさ
らに記載されるように、当業者は、タンパク質機能にあまり有意に影響を及ぼし
そうにないか、または有意に影響を及ぼしそうにないかのいずれかのアミノ酸置
換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸と置換する）を十分に
認識しているからである。
【０１３８】
例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
が、Ｂｏｗｉｅら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸
配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する
。
が、Ｂｏｗｉｅら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸
配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する
。
【０１３９】
第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存さ
れるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機
能について重要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容さ
れたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを
示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生
物学的活性をなおも維持する。
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存さ
れるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機
能について重要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容さ
れたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを
示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生
物学的活性をなおも維持する。
【０１４０】
第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の全ての残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８
５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され
得る。
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の全ての残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８
５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され
得る。
【０１４１】
著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。
【０１４２】
保存的なアミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存
的なアミノ酸残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードに
よってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増
加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチ
ドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペ
プチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列のよう
な）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
的なアミノ酸残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードに
よってコードされるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい
、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉ
ｉｉ）別の化合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増
加するための化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチ
ドの融合、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペ
プチド、またはリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列のよう
な）とのポリぺプチドの融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細
書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。
【０１４３】
例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【０１４４】
本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有する本発明のアミノ酸配列を
含むポリペプチドに関する。もちろん、好ましさの増大する順番に、少なくとも
１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または
１を超えないアミノ酸置換を含む、配列番号Ｙのポリヌクレオチドのアミノ酸配
列、配列番号Ｘによりコードされるアミノ酸配列、および／またはｃＤＮＡプラ
スミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有
するポリペプチドが非常に好ましい。特定の実施形態において、配列番号Ｙまた
はそのフラグメント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフ
ラグメント）のアミノ酸配列、配列番号Ｘまたはそのフラグメントによりコード
されるアミノ酸配列、ならびに／あるいはｃＤＮＡプラスミドＺまたはそのフラ
グメントによりコードされるアミノ酸配列における付加、置換、および／または
欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０
〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。本明細書中で議論される場合
、本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得
る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２のタンパク質と融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ポリペプチドに結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出する
ために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナ
ルに基づいて標的化するので、分泌されることが示されている本発明のポリペプ
チドは、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有する本発明のアミノ酸配列を
含むポリペプチドに関する。もちろん、好ましさの増大する順番に、少なくとも
１つのアミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または
１を超えないアミノ酸置換を含む、配列番号Ｙのポリヌクレオチドのアミノ酸配
列、配列番号Ｘによりコードされるアミノ酸配列、および／またはｃＤＮＡプラ
スミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有
するポリペプチドが非常に好ましい。特定の実施形態において、配列番号Ｙまた
はそのフラグメント（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフ
ラグメント）のアミノ酸配列、配列番号Ｘまたはそのフラグメントによりコード
されるアミノ酸配列、ならびに／あるいはｃＤＮＡプラスミドＺまたはそのフラ
グメントによりコードされるアミノ酸配列における付加、置換、および／または
欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、または５０
〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。本明細書中で議論される場合
、本発明の任意のポリペプチドは、融合タンパク質を産生するために使用され得
る。例えば、本発明のポリペプチドは、第２のタンパク質と融合される場合、抗
原性タグとして使用され得る。本発明のポリペプチドに対して惹起される抗体は
、ポリペプチドに結合することによって、第２のタンパク質を間接的に検出する
ために使用され得る。さらに、分泌されるタンパク質は、細胞位置を輸送シグナ
ルに基づいて標的化するので、分泌されることが示されている本発明のポリペプ
チドは、他のタンパク質に一旦融合されると標的化分子として使用され得る。
【０１４５】
本発明のポリペプチドと融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列のみ
ならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
ならず、また他の異種機能性領域をも含む。融合は、必ずしも直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１４６】
特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ポリペプチドがＮ
末端および／またはＣ末端欠失変異体である融合タンパク質を含む。好ましい実
施形態において、本出願は、特定のＮ末端およびＣ末端欠失変異体のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関す
る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によっ
て含まれる。
末端および／またはＣ末端欠失変異体である融合タンパク質を含む。好ましい実
施形態において、本出願は、特定のＮ末端およびＣ末端欠失変異体のアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードする核酸配列に少なくとも８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸分子に関す
る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明によっ
て含まれる。
【０１４７】
さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改良するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良
するためにポリペプチドのＮ末端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を
容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ポリペプチ
ドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするための
ペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる慣用の技術である。
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主
細胞からの精製または続く取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改良
するためにポリペプチドのＮ末端へ付加され得る。また、ペプチド部分は精製を
容易にするためにポリペプチドへ付加され得る。このような領域は、ポリペプチ
ドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを容易にするための
ペプチド部分の付加は、当該分野でよく知られる慣用の技術である。
【０１４８】
当業者が理解するように、上記の本発明の本発明のポリペプチドおよびそのエ
ピトープ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わされ得る。例え
ば、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列と組み合され得、例えば、
本発明のポリペプチド（フラグメント、そして特にエピトープを含む）は、免疫
グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの
部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わせ（ドメイン全
体およびそれらの部分の両方を含む））の一部と組み合わせられ、キメラポリぺ
プチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボ
における増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチ
ドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖
の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有す
る融合タンパク質もまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント
単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆ
ｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４
（１９９５））。
ピトープ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わされ得る。例え
ば、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列と組み合され得、例えば、
本発明のポリペプチド（フラグメント、そして特にエピトープを含む）は、免疫
グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの
部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意の組み合わせ（ドメイン全
体およびそれらの部分の両方を含む））の一部と組み合わせられ、キメラポリぺ
プチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、そしてインビボ
における増大した半減期を示す。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチ
ドの最初の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖
の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ
Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−
８６（１９８８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有す
る融合タンパク質もまた、単量体分泌タンパク質またはタンパク質フラグメント
単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさらに効率的であり得る（Ｆ
ｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４
（１９９５））。
【０１４９】
（ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成）
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例えば、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損で
あり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完性の宿主細胞においての
み起こる。
組換え技術によるポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例えば、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損で
あり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、補完性の宿主細胞においての
み起こる。
【０１５０】
本発明のポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含
むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈澱のような沈澱、または荷電した脂質との複合体において導入される。このベ
クターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビト
ロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈澱のような沈澱、または荷電した脂質との複合体において導入される。このベ
クターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビト
ロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１５１】
そのポリヌクレオチドインサートは、例えば、いくつかの名前を挙げると、フ
ァージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、および
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に連
結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構
築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域
において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現さ
れる転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めの翻訳
開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（
ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
ァージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、および
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に連
結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構
築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域
において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現さ
れる転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めの翻訳
開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（
ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０１５２】
示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵
母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７
８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９
３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが
、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は
当該分野で公知である。
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵
母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７
８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９
３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが
、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は
当該分野で公知である。
【０１５３】
細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中に
は、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。酵母系での使
用のための、好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ
１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂ
ａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な
ベクターは、当業者に容易に明らかである。
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中に
は、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。酵母系での使
用のための、好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ
１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂ
ａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な
ベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１５４】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリペプチドは、組換え
ベクターを欠如する宿主細胞により実際に発現され得ることが具体的に意図され
る。
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリペプチドは、組換え
ベクターを欠如する宿主細胞により実際に発現され得ることが具体的に意図され
る。
【０１５５】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために用いられる。
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために用いられる。
【０１５６】
本発明のポリペプチドはまた、以下から収集され得る：天然の供給源からの精
製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれにせよ、体液、組
織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順にお
いて用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されて
いてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリ
ペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された
開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされて
いるＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核生物細胞において翻訳後に任
意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知である。
大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、大部分の原核生物において効
率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プロセス
は、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的
である。
製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれにせよ、体液、組
織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順にお
いて用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されて
いてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリ
ペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された
開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされて
いるＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核生物細胞において翻訳後に任
意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知である。
大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、大部分の原核生物において効
率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プロセス
は、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的
である。
【０１５７】
１つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、
真核生物系において、本発明のポリペプチドを発現する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓは、メチル栄養性酵母であり、その唯一の炭素源としてメタノールを
代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ2を使用するホルムア
ルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダー
ゼにより触媒される。その唯一の炭素源としてメタノールを代謝するために、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキシダーゼの比較
的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レベルで産生しなけ
ればならない。結果的に、主な炭素源としてメタノールに依存する増殖培地にお
いて、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうちの１つ（ＡＯＸ１）のプロモ
ーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から
産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおい
て全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ
．Ｊら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ
．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参
照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転写調節下で
、本発明のポリヌクレオチドのような異種コード配列は、メタノール存在下で増
殖されたＰｉｃｈｉａ酵母中に例外的に高レベルで発現される。
真核生物系において、本発明のポリペプチドを発現する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓは、メチル栄養性酵母であり、その唯一の炭素源としてメタノールを
代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ2を使用するホルムア
ルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダー
ゼにより触媒される。その唯一の炭素源としてメタノールを代謝するために、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキシダーゼの比較
的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レベルで産生しなけ
ればならない。結果的に、主な炭素源としてメタノールに依存する増殖培地にお
いて、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうちの１つ（ＡＯＸ１）のプロモ
ーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から
産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおい
て全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ，Ｐ
．Ｊら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ，Ｊ．Ｆ
．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８７）を参
照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転写調節下で
、本発明のポリヌクレオチドのような異種コード配列は、メタノール存在下で増
殖されたＰｉｃｈｉａ酵母中に例外的に高レベルで発現される。
【０１５８】
１つの例において、本明細書中に記載されたように、プラスミドベクターｐＰ
ＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，
Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に本質的に記載されたように本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクロー
ニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファ
ターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強
力なＡＯＸ１プロモーターの効果により本発明のポリペプチドの発現および分泌
を可能にする。
ＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｅａ酵母系において、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，
Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に本質的に記載されたように本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクロー
ニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファ
ターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強
力なＡＯＸ１プロモーターの効果により本発明のポリペプチドの発現および分泌
を可能にする。
【０１５９】
多くの他の酵母ベクターが、当業者が容易に理解するように、提案された発現
構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグ
ナル（必要な場合、インフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ
９Ｋの代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹ
Ｄ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧ
ＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐ
ＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。
構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグ
ナル（必要な場合、インフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ
９Ｋの代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹ
Ｄ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧ
ＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐ
ＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。
【０１６０】
別の実施形態において、例えば、本発明のポリヌクレオチドのような異種コー
ド配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺ
αなど）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングすることならびにメタ
ノール非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る。
ド配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺ
αなど）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングすることならびにメタ
ノール非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る。
【０１６１】
本明細書中で議論されるベクター構築物を含有する宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の、一次、二次、および不
死化宿主細胞を含み、それは、内在性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失
または置換するように、そして／または遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチ
ド配列）を含むように操作されており、この遺伝物質は、本発明のポリヌクレオ
チドと作動可能に結合されており、そして内在性のポリヌクレオチドを活性化、
変化、および／または増幅させる。例えば、当該分野で公知の技術が使用されて
、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエ
ンハンサー）と内在性ポリヌクレオチド配列とを作動可能に結合し得る（例えば
、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９
６年９月２６日に公開された国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８
月４日に公開された国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９
８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（
１９８９）を参照のこと、これらの各々の開示はその全体が参考として援用され
る）。
て、本発明はまた、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の、一次、二次、および不
死化宿主細胞を含み、それは、内在性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失
または置換するように、そして／または遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチ
ド配列）を含むように操作されており、この遺伝物質は、本発明のポリヌクレオ
チドと作動可能に結合されており、そして内在性のポリヌクレオチドを活性化、
変化、および／または増幅させる。例えば、当該分野で公知の技術が使用されて
、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエ
ンハンサー）と内在性ポリヌクレオチド配列とを作動可能に結合し得る（例えば
、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９
６年９月２６日に公開された国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８
月４日に公開された国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９
８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（
１９８９）を参照のこと、これらの各々の開示はその全体が参考として援用され
る）。
【０１６２】
さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して化学的に
合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ
．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポ
リペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザー
の使用によって合成され得る。さらに、所望される場合、非古典的アミノ酸また
は化学的アミノ酸アナログが、ポリペプチド配列に置換または付加として導入さ
れ得る。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−
ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸
、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪
酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロ
キシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−
ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メ
チルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的
なアミノ酸アナログが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は
、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ
．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポ
リペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザー
の使用によって合成され得る。さらに、所望される場合、非古典的アミノ酸また
は化学的アミノ酸アナログが、ポリペプチド配列に置換または付加として導入さ
れ得る。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−
ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸
、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪
酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロ
キシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−
ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メ
チルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的
なアミノ酸アナログが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は
、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１６３】
本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の
保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子また
は他の細胞リガンドとの結合などによって、翻訳の間または翻訳後に示差的に修
飾される本発明のポリペプチドを含む。任意の多数の化学修飾が公知の技術（臭
化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢ
Ｈ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマ
イシンの存在下での代謝的合成などが含まれるがこれらに限定されない）によっ
て実行され得る。
保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子また
は他の細胞リガンドとの結合などによって、翻訳の間または翻訳後に示差的に修
飾される本発明のポリペプチドを含む。任意の多数の化学修飾が公知の技術（臭
化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢ
Ｈ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマ
イシンの存在下での代謝的合成などが含まれるがこれらに限定されない）によっ
て実行され得る。
【０１６４】
本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型また
はＯ結合型の炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原
核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が、
例えば挙げられる。このポリペプチドはまた、酵素標識、蛍光標識、同位元素標
識、またはアフィニティー標識のような検出可能な標識で修飾され、タンパク質
の検出および単離を可能にし得る。
はＯ結合型の炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原
核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が、
例えば挙げられる。このポリペプチドはまた、酵素標識、蛍光標識、同位元素標
識、またはアフィニティー標識のような検出可能な標識で修飾され、タンパク質
の検出および単離を可能にし得る。
【０１６５】
本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこ
の分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分
を含み得る。
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこ
の分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分
を含み得る。
【０１６６】
このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつ
かの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを
示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時
間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポ
リエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得
る。
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつ
かの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを
示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時
間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポ
リエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得
る。
【０１６７】
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。
【０１６８】
Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分
子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタ
ンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、およ
び選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調
製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分
離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製
により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタ
ンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ
末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切
な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質
の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
ールを本発明の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分
子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタ
ンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、およ
び選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調
製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分
離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製
により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタ
ンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ
末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切
な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質
の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１６９】
本発明のポリペプチドは、単量体またはマルチマー（すなわち、二量体、三量
体、四量体およびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、単量
体およびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製物およびそれらを含
む組成物（好ましくは治療剤）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペ
プチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のマルチマーは、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なく
とも四量体である。
体、四量体およびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は、単量
体およびマルチマーの本発明のポリペプチド、それらの調製物およびそれらを含
む組成物（好ましくは治療剤）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペ
プチドは、単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のマルチマーは、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なく
とも四量体である。
【０１７０】
本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列ま
たは配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列もしくは配列番号Ｘの相補体
、および／あるいはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるアミノ酸配列に対
応するポリペプチドのみを含むマルチマー（本明細書中に記載されるフラグメン
ト、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質に対応するフラグメ
ント、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む）をいう。
これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明
のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むマルチマーであ
る。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモ二量体（例えば、同一ま
たは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）またはホモ三量体（例え
ば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）であ
る。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモ
二量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列ま
たは配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列もしくは配列番号Ｘの相補体
、および／あるいはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるアミノ酸配列に対
応するポリペプチドのみを含むマルチマー（本明細書中に記載されるフラグメン
ト、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質に対応するフラグメ
ント、改変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む）をいう。
これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形態では、本発明
のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むマルチマーであ
る。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモ二量体（例えば、同一ま
たは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）またはホモ三量体（例え
ば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）であ
る。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモ
二量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。
【０１７１】
本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプ
チド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘ
テロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプ
チド）を含むマルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では
、本発明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘ
テロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
【０１７２】
本発明のマルチマーは、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合
性の結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間
接的に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例え
ば、ホモ二量体またはホモ三量体など）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互
いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー
（例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体など）は、本発明のポリペプチドが
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形成される。
他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、および
／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような
共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号Ｙに列挙されるか、または配
列番号Ｘおよび／もしくはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプ
チド中に含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含
み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）
ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残
基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操
作の結果である。あるいは、このような共有結合は、融合タンパク質中の異種ポ
リペプチド配列において含まれる、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では
、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合
は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる
異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、
共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテ
ゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／
４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参
照のこと）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある。別の実施形態では、２
以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して連結される。例とし
ては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）
に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てら
れた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術
を用いて生成され得る。
性の結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間
接的に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例え
ば、ホモ二量体またはホモ三量体など）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互
いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマー
（例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体など）は、本発明のポリペプチドが
、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質におけ
る異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形成される。
他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のポリペプチドとの、および
／または本発明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような
共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号Ｙに列挙されるか、または配
列番号Ｘおよび／もしくはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプ
チド中に含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含
み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）
ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残
基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操
作の結果である。あるいは、このような共有結合は、融合タンパク質中の異種ポ
リペプチド配列において含まれる、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では
、共有結合は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合
は、（本明細書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる
異種配列間にある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、
共有結合したマルチマーを形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテ
ゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／
４９３０５号（この内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参
照のこと）など）由来の異種ポリペプチド配列間にある。別の実施形態では、２
以上の本発明のポリペプチドは、ペプチドリンカーを介して連結される。例とし
ては、米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）
に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てら
れた本発明の複数のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術
を用いて生成され得る。
【０１７３】
本発明のマルチマーポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッ
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来、種々の異なるタンパク
質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中でも、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中にダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明の可溶性ポリペプ
チドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得ら
れる可溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上
清から回収される。
パーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合され
た本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロ
イシンジッパードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー
形成を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮ
Ａ結合タンパク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１７５９、（１９８８））、そしてそれ以来、種々の異なるタンパク
質において見出されている。公知のロイシンジッパーの中でも、ダイマー形成ま
たはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘導体がある。本
発明の可溶性マルチマータンパク質を生成するために適切なロイシンジッパード
メインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／１０
３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中にダイマー形成ま
たはトリマー形成をするポリペプチド配列に融合された本発明の可溶性ポリペプ
チドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得ら
れる可溶性マルチマー融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を用いて培養上
清から回収される。
【０１７４】
本発明のトリマーポリペプチドは、増強された生物学的活性という利点を提供
し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを
優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏ
ｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および
米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタント
プロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するト
リマータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製
において用いられ得る。
し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、トリマーを
優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として援用されるＨｏ
ｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９９４））および
米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サーファクタント
プロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天然に存在するト
リマータンパク質由来の他のペプチドは、本発明のトリマーポリペプチドの調製
において用いられ得る。
【０１７５】
別の例では、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明の会合タンパ
ク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプ
チド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配
列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明の会合タンパ
ク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプ
チド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
【０１７６】
本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポ
リペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポ
リペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。
【０１７７】
あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野において公知の遺伝子工学技術を
用いて生成され得る。１つの実施形態においては、本発明のマルチマーに含まれ
るポリペプチドは、本明細書中に記載されるか、そうでなければ当該分野におい
て公知の融合タンパク質技術を用いて組換え産生される（例えば、本明細書中に
その全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこ
と）。特定の実施形態においては、本発明のホモダイマーをコードするポリヌク
レオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リン
カーポリペプチドをコードする配列と連結し、次いでさらに、このポリペプチド
の翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドを、元のＣ末端からＮ末端への逆
の配向で連結する（リーダー配列を欠く）ことにより生成される（例えば、本明
細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を
参照のこと）。別の実施形態においては、本明細書中に記載されるか、そうでな
ければ当該分野において公知の組換え技術は、膜貫通ドメイン（または、疎水性
（ｈｙｒｏｐｈｏｂｉｃ）ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、そして
膜構築技術によってリポソームに組み込まれ得る本発明の組換えポリペプチドを
生成するために適用される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用さ
れる、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
用いて生成され得る。１つの実施形態においては、本発明のマルチマーに含まれ
るポリペプチドは、本明細書中に記載されるか、そうでなければ当該分野におい
て公知の融合タンパク質技術を用いて組換え産生される（例えば、本明細書中に
その全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこ
と）。特定の実施形態においては、本発明のホモダイマーをコードするポリヌク
レオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リン
カーポリペプチドをコードする配列と連結し、次いでさらに、このポリペプチド
の翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオチドを、元のＣ末端からＮ末端への逆
の配向で連結する（リーダー配列を欠く）ことにより生成される（例えば、本明
細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を
参照のこと）。別の実施形態においては、本明細書中に記載されるか、そうでな
ければ当該分野において公知の組換え技術は、膜貫通ドメイン（または、疎水性
（ｈｙｒｏｐｈｏｂｉｃ）ペプチドもしくはシグナルペプチド）を含み、そして
膜構築技術によってリポソームに組み込まれ得る本発明の組換えポリペプチドを
生成するために適用される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用さ
れる、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１７８】
（抗体）
本発明のさらなるポリペプチドは、抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ
）に関する。この抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、免疫特異的に
、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたは配列番号Ｙの改変体
および／あるいはエピトープに結合する（特異的抗体−抗原結合をアッセイする
ための、当該分野で周知のイムノアッセイにより決定される場合）。本発明の抗
体には、以下が含まれるが、それらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単
鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラ
リーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例
えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記の任意のエピ
トープ結合フラグメント。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免
疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、免
疫特異的に抗原に結合する、抗原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グ
ロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ
およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、
ＩｇＡ１ならびにＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る
。
）に関する。この抗体およびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、免疫特異的に
、本発明のポリペプチド、ポリペプチドフラグメントまたは配列番号Ｙの改変体
および／あるいはエピトープに結合する（特異的抗体−抗原結合をアッセイする
ための、当該分野で周知のイムノアッセイにより決定される場合）。本発明の抗
体には、以下が含まれるが、それらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単
鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラ
リーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例
えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記の任意のエピ
トープ結合フラグメント。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免
疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分（すなわち、免
疫特異的に抗原に結合する、抗原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グ
ロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ
およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、
ＩｇＡ１ならびにＩｇＡ２）または免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る
。
【０１７９】
最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨド
メインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。単
鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全
体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣ
Ｈ３ドメイン。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
の任意の組み合わせも含む抗原結合フラグメントもまた本発明に含まれる。本発
明の抗体は、任意の動物起源（鳥類および哺乳動物を含む）に由来し得る。好ま
しくは、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ウサギ
（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ
である。本明細書中で使用されるように、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリ
ンのアミノ酸配列を有する抗体、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離され
た抗体、または前述、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国
特許第５，９３９，５９８号に記載されるように、１つ以上のヒト免疫グロブリ
ンについて、トランスジェニックの動物および内因性免疫グロブリンを発現しな
い動物から単離された抗体が挙げられる。
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦ
ｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨド
メインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。単
鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下の全
体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣ
Ｈ３ドメイン。可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン
の任意の組み合わせも含む抗原結合フラグメントもまた本発明に含まれる。本発
明の抗体は、任意の動物起源（鳥類および哺乳動物を含む）に由来し得る。好ま
しくは、抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ウサギ
（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリ
である。本明細書中で使用されるように、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリ
ンのアミノ酸配列を有する抗体、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離され
た抗体、または前述、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる、米国
特許第５，９３９，５９８号に記載されるように、１つ以上のヒト免疫グロブリ
ンについて、トランスジェニックの動物および内因性免疫グロブリンを発現しな
い動物から単離された抗体が挙げられる。
【０１８０】
本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドの両方および異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチド）、もしくは固体支持体物質に特異
的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８
０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９
３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、第５，５７３，
９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ
．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドの両方および異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチド）、もしくは固体支持体物質に特異
的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８
０２；ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０〜６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９
３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、第５，５７３，
９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ
．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１８１】
本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明の
ポリペプチドのエピトープまたは部分の点で記載されるかまたは特定され得る。
このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置
により、または連続するアミノ酸残基におけるサイズにより、本明細書中に記載
されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチド
に特異的に結合する抗体はまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリ
ペプチドを特異的に結合し、そしてこれの排除を可能にする抗体を含む。
ポリペプチドのエピトープまたは部分の点で記載されるかまたは特定され得る。
このエピトープまたはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置
により、または連続するアミノ酸残基におけるサイズにより、本明細書中に記載
されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチド
に特異的に結合する抗体はまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリ
ペプチドを特異的に結合し、そしてこれの排除を可能にする抗体を含む。
【０１８２】
本発明の抗体はまた、これらの交差反応性の点で記載されるかまたは特定され
得る。本発明のポリペプチドのいかなる他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログとも結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチド
と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％
、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％
、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野において公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドと結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、
本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、ラットホモログおよび／ま
たはウサギホモログならびにそれに対応するエピトープと交差反応する。本発明
のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未
満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同
一性（当該分野において公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて
計算される場合）を有するポリペプチドと結合しない抗体はまた、本発明に含ま
れる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、任意の単一特異的抗原性
ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドあるいは２、３、４、５以上の特異的
抗原の組合わせ、ならびに／もしくは本明細書中に記載の免疫原性ポリペプチド
に関する。本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本
明細書中に記載される）で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとのみ結合する抗体が、さらに含
まれる。本発明の抗体はまた、これらの本発明のポリペプチドとの結合親和性の
点で記載されるかまたは特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０ -2 Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０ -5 Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０ -8 Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１
０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、
５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍまたは１０-15Ｍ未満の解離定数すな
わちＫｄを伴う結合親和性が挙げられる。
得る。本発明のポリペプチドのいかなる他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）またはホモログとも結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチド
と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％
、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％
、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野において公知の
方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算される場合）を有するポリ
ペプチドと結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態において、
本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、ラットホモログおよび／ま
たはウサギホモログならびにそれに対応するエピトープと交差反応する。本発明
のポリペプチドと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未
満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同
一性（当該分野において公知の方法および本明細書中に記載される方法を用いて
計算される場合）を有するポリペプチドと結合しない抗体はまた、本発明に含ま
れる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、任意の単一特異的抗原性
ポリペプチドまたは免疫原性ポリペプチドあるいは２、３、４、５以上の特異的
抗原の組合わせ、ならびに／もしくは本明細書中に記載の免疫原性ポリペプチド
に関する。本発明には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本
明細書中に記載される）で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドによりコードされるポリペプチドとのみ結合する抗体が、さらに含
まれる。本発明の抗体はまた、これらの本発明のポリペプチドとの結合親和性の
点で記載されるかまたは特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０ -2 Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０ -5 Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０ -8 Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１
０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、
５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍまたは１０-15Ｍ未満の解離定数すな
わちＫｄを伴う結合親和性が挙げられる。
【０１８３】
本発明はまた、競合的結合を決定するための、当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書に記載のイムノアッセイ）によって決定されるような、抗体の
本発明のエピトープへの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施
形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも
８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも
６０％または少なくとも５０％までのエピトープへの結合を、競合的に阻害する
。
例えば、本明細書に記載のイムノアッセイ）によって決定されるような、抗体の
本発明のエピトープへの結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施
形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも
８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも
６０％または少なくとも５０％までのエピトープへの結合を、競合的に阻害する
。
【０１８４】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンド相互作用を、部分的
にまたは全体的にのどちらかで、本発明のポリペプチドで中断する抗体を含む。
好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性エピトープかまた
はその一部に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的
抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンドの結合は妨げないが、レセプ
ターの活性化を妨げる、レセプター特異的抗体を、特徴とする。レセプター活性
化（すなわち、シグナリング）は、本明細書中に記載されるか、そうでなければ
当該分野において公知である技術により決定され得る。例えば、レセプターの活
性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）
、あるいは（例えば、前述のように）免疫沈降に続くウエスタンブロット分析に
より、その基質を検出することによって、決定され得る。特定の実施形態におい
て、抗体は、抗体の非存在下における活性の、少なくとも９５％、少なくとも９
０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７
０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％までのリガンド活性あるいはレ
セプター活性の阻害を提供する。
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンド相互作用を、部分的
にまたは全体的にのどちらかで、本発明のポリペプチドで中断する抗体を含む。
好ましくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性エピトープかまた
はその一部に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的
抗体の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンドの結合は妨げないが、レセプ
ターの活性化を妨げる、レセプター特異的抗体を、特徴とする。レセプター活性
化（すなわち、シグナリング）は、本明細書中に記載されるか、そうでなければ
当該分野において公知である技術により決定され得る。例えば、レセプターの活
性化は、レセプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）
、あるいは（例えば、前述のように）免疫沈降に続くウエスタンブロット分析に
より、その基質を検出することによって、決定され得る。特定の実施形態におい
て、抗体は、抗体の非存在下における活性の、少なくとも９５％、少なくとも９
０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７
０％、少なくとも６０％または少なくとも５０％までのリガンド活性あるいはレ
セプター活性の阻害を提供する。
【０１８５】
本発明はまた、リガンド結合およびレセプターの活性化、ならびにレセプター
−リガンド複合体を認識する抗体、および好ましくは非結合レセプターまたは非
結合リガンドを特異的を特異的に認識しない抗体の両方を妨げるレセプター特異
的抗体を特徴とする。同様に、リガンドに結合し、そしてレセプターに対するリ
ガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、これにより、レセ
プター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合するのを妨げない抗体が
含まれる。さらに、本発明において、レセプターを活性化する抗体が含まれる。
これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得る（すなわち、リガンド
媒介レセプター活性化（例えば、レセプターの二量体化を誘導することによる）
の、全てのまたはサブセットのいずれかの生物学的活性を増強するか、または活
性化する）。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生
物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはイン
バースアゴニストとして、特定され得る。この上記抗体アゴニストは当該分野に
おいて公知である方法を用いて作成され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／
４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（
６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒ
ａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８
）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１
７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）
：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎ
ｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅ
ｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記参考文献は
、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
−リガンド複合体を認識する抗体、および好ましくは非結合レセプターまたは非
結合リガンドを特異的を特異的に認識しない抗体の両方を妨げるレセプター特異
的抗体を特徴とする。同様に、リガンドに結合し、そしてレセプターに対するリ
ガンドの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、これにより、レセ
プター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合するのを妨げない抗体が
含まれる。さらに、本発明において、レセプターを活性化する抗体が含まれる。
これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得る（すなわち、リガンド
媒介レセプター活性化（例えば、レセプターの二量体化を誘導することによる）
の、全てのまたはサブセットのいずれかの生物学的活性を増強するか、または活
性化する）。この抗体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生
物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アンタゴニストまたはイン
バースアゴニストとして、特定され得る。この上記抗体アゴニストは当該分野に
おいて公知である方法を用いて作成され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９６／
４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（
６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．
５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１５）：３２０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒ
ａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８
）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１
７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）
：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎ
ｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅ
ｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）（上記参考文献は
、その全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１８６】
本発明の抗体は、例えば、本発明のポリペプチドを精製し、検出し、そして標
的にするため（しかし、これらに限定されない）に使用され得、これは、インビ
トロおよびインビボの両方における診断および治療方法を含む。例えば、この抗
体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量
的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第
２版、１９８８）（その全体を参考として援用する）を参照のこと。
的にするため（しかし、これらに限定されない）に使用され得、これは、インビ
トロおよびインビボの両方における診断および治療方法を含む。例えば、この抗
体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量
的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有する。例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第
２版、１９８８）（その全体を参考として援用する）を参照のこと。
【０１８７】
以下でより詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の組成物
との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、そのＮ末端もし
くはＣ末端で異種ポリペプチドと組換え的に融合され得るか、またはポリペプチ
ドもしくは他の組成物と化学的に結合され得る（共有結合および非共有結合を含
む）。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子お
よびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒
素）と組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８
４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４
，９９５；およびＥＰ ３９６，３８７を参照のこと。
との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、そのＮ末端もし
くはＣ末端で異種ポリペプチドと組換え的に融合され得るか、またはポリペプチ
ドもしくは他の組成物と化学的に結合され得る（共有結合および非共有結合を含
む）。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子お
よびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒
素）と組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８
４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４
，９９５；およびＥＰ ３９６，３８７を参照のこと。
【０１８８】
本発明の抗体は、改変される（すなわち、抗体が、抗イデオタイプ反応を生じ
るのを妨げない共有結合のような、抗体に対する分子の任意の型の共有結合によ
り）誘導体を含む。例えば、限定するわけではないが、抗体誘導体は、改変され
ている抗体（例えば、グリコシル化，アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化
、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞
性リガンドまたは他のタンパク質に対する連結など）を含む。任意の多くの任意
の化学的改変が、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって行なわ
れ得る：特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下にお
ける代謝的合成など。さらに、誘導体は、１つ以上の非分類アミノ酸を含み得る
。
るのを妨げない共有結合のような、抗体に対する分子の任意の型の共有結合によ
り）誘導体を含む。例えば、限定するわけではないが、抗体誘導体は、改変され
ている抗体（例えば、グリコシル化，アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化
、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞
性リガンドまたは他のタンパク質に対する連結など）を含む。任意の多くの任意
の化学的改変が、以下を含むがこれらに限定されない公知の技術によって行なわ
れ得る：特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシン存在下にお
ける代謝的合成など。さらに、誘導体は、１つ以上の非分類アミノ酸を含み得る
。
【０１８９】
本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得、抗
原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。宿主の
種に依存する、免疫学的応答を増加するために使用され得る種々のアジュバント
としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：フロイント（完全およ
び不完全）アジュバント、無機質ゲルアジュバント（例えば、水酸化アルミニウ
ム、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、多価ポリオール、ポリアニオン、ペプ
チド、油エマルジョン、キーホールリンベットヘモシニアン、ジニトロフェノー
ル）、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌ
ｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））ならびにｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｐａｒｖｕｍアジュバント。そのようなアジュバントはまた、当該分野で
周知である。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、種々の宿主動物（ウサギ、
マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない）に投与され得、抗
原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。宿主の
種に依存する、免疫学的応答を増加するために使用され得る種々のアジュバント
としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：フロイント（完全およ
び不完全）アジュバント、無機質ゲルアジュバント（例えば、水酸化アルミニウ
ム、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、多価ポリオール、ポリアニオン、ペプ
チド、油エマルジョン、キーホールリンベットヘモシニアン、ジニトロフェノー
ル）、および潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌ
ｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））ならびにｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ ｐａｒｖｕｍアジュバント。そのようなアジュバントはまた、当該分野で
周知である。
【０１９０】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクロ
ーナル抗体が生成される方法ではない。
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてモノクロ
ーナル抗体が生成される方法ではない。
【０１９１】
ハイブリドーマ技術を用いて特定の抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、慣用的であり、そして当該分野で周知であり、そして実施例に詳細に議論さ
れる。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはその
ようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦、免疫応答が検出さ
れる（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウス
の脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によって任
意の適切なメラノーマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由
来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限定希釈によって選択およびクロー
ン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得
る抗体を分泌する細胞について当該分野で公知の方法によってアッセイする。一
般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハ
イブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る
。
は、慣用的であり、そして当該分野で周知であり、そして実施例に詳細に議論さ
れる。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはその
ようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦、免疫応答が検出さ
れる（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウス
の脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、脾細胞を周知の技術によって任
意の適切なメラノーマ細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由
来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限定希釈によって選択およびクロー
ン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得
る抗体を分泌する細胞について当該分野で公知の方法によってアッセイする。一
般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハ
イブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る
。
【０１９２】
従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、産生す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させることによって
、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクロ
ーンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによ
って産生される。
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、産生す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させることによって
、次いで本発明のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクロ
ーンについて、融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによ
って産生される。
【０１９３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって産生さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するための）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１９４】
例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から
発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合
する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され
得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉さ
れた抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的に
は、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質
のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化され
たＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ド
メインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本
発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例として
は、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔ
ｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８
（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂ
ｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１
−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ
公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４
７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８
２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第
５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号
；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０
４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１
６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５
，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細
書中でその全体が参考として援用される）。
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から
発現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合
する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され
得る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉さ
れた抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的に
は、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質
のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化され
たＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ド
メインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本
発明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例として
は、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔ
ｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８
（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂ
ｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１
−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ
公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４
７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８
２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第
５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号
；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０
４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１
６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５
，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細
書中でその全体が参考として援用される）。
【０１９５】
上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０１９６】
単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体
が参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６，３９７
号を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される
）。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）および
ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結
合する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域
内のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合
を変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応
残基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によ
って同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するための
ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置
における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば
、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体
が参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知
の種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３
９，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５
３９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤ
リング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉ
ｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８
（１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ
９１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａ
ｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１９７】
完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０１９８】
ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体
を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニック
マウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）
を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハ
イブリドーマ技術を用いて免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。
トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細
胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を
受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、
ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生
するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉ
ｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそ
のような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９
６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４
１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号
；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７
７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本
明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒ
ｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のよ
うな企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗
体を提供することに従事し得る。
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を発展させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次に、キメラマウスを、ヒト抗体
を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニック
マウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分）
を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハ
イブリドーマ技術を用いて免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る。
トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細
胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異を
受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体、
ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産生
するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉ
ｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。
ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびにそ
のような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、
ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０９
６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，４
１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第
５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号
；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，７
７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が本
明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒ
ｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のよ
うな企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗
体を提供することに従事し得る。
【０１９９】
選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０２００】
さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合
を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化ドメインおよび／また
は結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、
そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中
和する。このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａ
ｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメ
ンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリ
ペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するた
めに使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合
を競合的に阻害する抗体が、ポリペプチドのマルチマー化ドメインおよび／また
は結合ドメインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、
そして結果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中
和する。このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａ
ｂフラグメントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメ
ンに使用され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリ
ペプチドに結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するた
めに使用され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０２０１】
（抗体をコードするポリヌクレオチド）
本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０２０２】
ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０２０３】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０２０４】
一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０２０５】
特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０２０６】
さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０２０７】
あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０２０８】
（抗体を産生する方法）
本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０２０９】
本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０２１０】
この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０２１１】
種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換
えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；
タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された植物細胞系または抗体をコード
する配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形
質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモータ
ー（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来
するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイ
ルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系
（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に
、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現の
ために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子
プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハム
スターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発
現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏ
ｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換
えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；
タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染された植物細胞系または抗体をコード
する配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形
質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモータ
ー（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来
するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイ
ルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系
（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に
、組換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現の
ために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子
プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハム
スターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発
現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏ
ｃｋｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０２１２】
細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、
多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
存して有利に選択され得る。例えば、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、
多量のこのようなタンパク質が産生されるべき場合、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０２１３】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２１４】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０２１５】
さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節するか、
または所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする
。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング
（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞
は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、
特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される異種
タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化
の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用さ
れ得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ
、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４
８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、
ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺
細胞株、を含むがこれらに限定されない。
または所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする
。タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング
（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞
は、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、
特徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される異種
タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
この目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化
の正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用さ
れ得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ
、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４
８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、
ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺
細胞株、を含むがこれらに限定されない。
【０２１６】
組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外
来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色
体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はク
ローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分
子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作さ
れた細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリー
ニングおよび評価において、特に有用であり得る。
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外
来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色
体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はク
ローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分
子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作さ
れた細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリー
ニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０２１７】
多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎ
ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２
１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ
技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に
適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ
−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これ
らはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎ
ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２
１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ
技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に
適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ
−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これ
らはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０２１８】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと
）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細
胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子の
コピーの数を増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生
もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（
１９８３））。
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと
）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細
胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子の
コピーの数を増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生
もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（
１９８３））。
【０２１９】
宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。
【０２２０】
一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０２２１】
本発明は、組換えにより融合されるか、または化学的に本発明のポリペプチド
（もしくはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３
０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって
、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗
体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、
インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法におい
て使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／
２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉ
ｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと
。これらは、その全体が参考として援用される。
（もしくはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３
０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に結
合されて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成す
る抗体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介し
て起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましく
はこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、
８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例
えば、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを
特定の細胞表面レセプターに特異的な抗体に融合または結合させることによって
、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを標的にするために、抗
体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結合される抗体はまた、
インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使用する精製方法におい
て使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／
２１２３２；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅ
ｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉ
ｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅｌｌら
、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）を参照のこと
。これらは、その全体が参考として援用される。
【０２２２】
本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。この抗体の本発明の
ポリぺプチドに融合された部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分任
意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合
または結合され得、マルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を形成する。例えば、本発
明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結
合を通して二量体を形成し得る。より高度のマルチマー形態は、ポリぺプチドを
ＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポ
リぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において
公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２
９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７
，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７
，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋ
ｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５
３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：
５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参
考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。この抗体の本発明の
ポリぺプチドに融合された部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分任
意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合
または結合され得、マルチマー（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）を形成する。例えば、本発
明のポリぺプチドに融合されたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結
合を通して二量体を形成し得る。より高度のマルチマー形態は、ポリぺプチドを
ＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融合させることによって作製され得る。本発明のポ
リぺプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は、当該分野において
公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２
９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７
，８５１号；同第５，１１２，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７
，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ９６／０４３８８；ＷＯ９１／０６５７０；Ａｓｈｋ
ｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５
３５−１０５３９（１９９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：
５５９０−５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参
考文献はその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０２２３】
上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号Ｙの変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセ
イにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに
、配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して
、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初
の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領
域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，
８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８
８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合
または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさら
に効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７
０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部
分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動
態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパ
ク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させること
が望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場
合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、
ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する
ための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
列番号Ｙの変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセ
イにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに
、配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して
、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初
の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領
域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，
８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８
８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合
または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさら
に効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７
０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部
分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動
態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパ
ク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させること
が望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場
合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、
ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する
ための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０２２４】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記
載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提
供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定
されない。
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記
載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提
供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定
されない。
【０２２５】
本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所与の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して、連結または結合され得
る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属
イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素
の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分
子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオ
チンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセ
イン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニル
アミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；
発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ル
シフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放
射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げ
られる。
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所与の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して、連結または結合され得
る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属
イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素
の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分
子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオ
チンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセ
イン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニル
アミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；
発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ル
シフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放
射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げ
られる。
【０２２６】
さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒また
は細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリ
タキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化
エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐ
ｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン
、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａ
ｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン
、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、な
らびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（
例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラ
ビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメ
チン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラ
ムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ
Ｕ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびに
ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサ
イクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビ
シン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブ
レオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃ
ｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビ
ンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒また
は細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリ
タキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化
エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐ
ｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン
、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａ
ｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン
、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、な
らびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（
例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラ
ビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメ
チン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラ
ムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ
Ｕ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびに
ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサ
イクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビ
シン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブ
レオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃ
ｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビ
ンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０２２７】
本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、アポトーシス薬（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照
のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６
７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号）
）、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンド
スタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキ
ン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロ
イキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ
−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因
子）、が挙げられ得る。
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、アポトーシス薬（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照
のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６
７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号）
）、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンド
スタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキ
ン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロ
イキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ
−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因
子）、が挙げられ得る。
【０２２８】
抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２２９】
このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２３０】
あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２３１】
単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２３２】
（免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ））
本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２３３】
これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０２３４】
（抗体結合についてのアッセイ）
本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
【０２３５】
免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２３６】
ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエ
スタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエ
スタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２３７】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２３８】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２３９】
（治療用途）
本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２４０】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２４１】
本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２４２】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２４３】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4 Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7 Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０- 10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ
、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4 Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7 Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０- 10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ
、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２４４】
（遺伝子治療）
特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２４５】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２４６】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２４７】
好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。
【０２４８】
核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２４９】
特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２５０】
特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２５１】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２５２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２５３】
遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２５４】
この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２５５】
得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２５６】
遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２５７】
好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
己である。
【０２５８】
遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２５９】
特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能で
ある。
領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発
現は、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能で
ある。
【０２６０】
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明
するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対す
る化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合
物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよ
び細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され
得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するため
に用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙
げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして
化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプル
に対するそのような化合物の効果が観察される。
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性を証明
するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対す
る化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合
物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよ
び細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され
得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するため
に用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙
げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして
化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプル
に対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２６１】
（治療的／予防的な投与および組成物）
本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明のポリペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を
提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その
効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）
。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような
動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動
物であり、そして最も好ましくはヒトである。
は本発明のポリペプチドまたは抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を
提供する。好ましい局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その
効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）
。被験体は好ましくは、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどのような
動物が挙げられるがそれらに限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動
物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０２６２】
化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２６３】
種々の送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム中でのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル
、この化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるがそれらに限定されない。化
合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス
注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜な
ど）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一
緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の
薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射
を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取
り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入
することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール
化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
いられ得る（例えば、リポソーム中でのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル
、この化合物の発現が可能な組換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口の経路が挙げられるがそれらに限定されない。化
合物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス
注射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜な
ど）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一
緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の
薬学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射
を包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取
り付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入
することが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール
化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２６４】
特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料のインプラントであ
る）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与す
る場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければ
ならない。
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料のインプラントであ
る）により達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与す
る場合、タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければ
ならない。
【０２６５】
別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２６６】
さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：
３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５
（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放
出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎ
ｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：
５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５
７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：
３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５
（１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放
出システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部
のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２６７】
他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２６８】
本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、特定の実施形態におい
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に進入する
ことが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば
、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１
８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタ
ンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、
細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内
に組み込まれ得る。
て、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そしてそ
れが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクター
の使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接注
射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔ
ｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプターも
しくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に進入する
ことが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば
、Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１
８６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタ
ンパク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、
細胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内
に組み込まれ得る。
【０２６９】
本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用について、連邦規制当局もしくは州政府により許可されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起
源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油
、鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的
組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液
、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な
溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては
、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小
麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリ
セロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリ
コール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、
少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は
、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの
形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキ
ャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニ
トール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ
ウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適
切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。この
ような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な
量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処
方物は、投与形態に適するべきである。
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、
用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにおけ
る使用について、連邦規制当局もしくは州政府により許可されたか、または米国
薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に収載されたことを意味する。用語
「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤
、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石油起
源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大豆油
、鉱油、ごま油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬学的
組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水溶液
、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可能な
溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤としては
、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、小
麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリ
セロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリ
コール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるならば、
少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は
、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物などの
形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのようなキ
ャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級のマンニ
トール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリ
ウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得る。適
切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。この
ような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、適切な
量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供する。処
方物は、投与形態に適するべきである。
【０２７０】
好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、単位投薬形態において別々にかまたは一
緒に混合してのいずれかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小
袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉体または水を含ま
ない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組
成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され
得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るよう
に、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、単位投薬形態において別々にかまたは一
緒に混合してのいずれかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小
袋（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密容器中の乾燥した凍結粉体または水を含ま
ない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組
成物は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され
得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るよう
に、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２７１】
本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩の
ようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニ
ウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２
−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩のような
カチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２７２】
本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する疾患または
障害の処置、阻害および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、最適な投薬量の範囲の同定を補助するために使用され得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線か
ら外挿され得る。
障害の処置、阻害および予防において効果的である本発明の化合物の量は、標準
的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要に応じ
て、最適な投薬量の範囲の同定を補助するために使用され得る。処方において使
用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さに
依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである
。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線か
ら外挿され得る。
【０２７３】
抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体のより低い投薬量およびより少ない頻度投与は、し
ばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投薬量および投与頻度は、改変（例
えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）など）による（例えば、脳への）抗体の
取り込みおよび組織浸透を増強することにより低減され得る。
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体のより低い投薬量およびより少ない頻度投与は、し
ばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投薬量および投与頻度は、改変（例
えば、脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）など）による（例えば、脳への）抗体の
取り込みおよび組織浸透を増強することにより低減され得る。
【０２７４】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて付随し得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて付随し得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２７５】
（診断および画像化）
目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程であって、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされ
たポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す、工程
を包含する。
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または状態を検出、診
断またはモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出を
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程であって、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされ
たポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す、工程
を包含する。
【０２７６】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程であって、これに
よって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝
子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す、工程を包含する。癌に関
して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生
についての素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出する
ための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段
を使用させること、またはより早期に積極的に処置させることを可能にし得、こ
れにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程であって、これに
よって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺伝
子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す、工程を包含する。癌に関
して、個体由来の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生
についての素因を示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出する
ための手段を提供し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段
を使用させること、またはより早期に積極的に処置させることを可能にし得、こ
れにより、癌の発生またはさらなる進行を予防する。
【０２７７】
本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な
抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１
Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１
１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノー
ル）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならび
にビオチンが挙げられる。
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な
抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例えば、
グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１
Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１
１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミノー
ル）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、ならび
にビオチンが挙げられる。
【０２７８】
本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後
、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ
）この被験体中の標識化分子を検出する工程であって、その結果、このバックグ
ラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプチド
の異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す、工程を包含
する。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な
値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決
定され得る。
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与後
、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；およびｄ
）この被験体中の標識化分子を検出する工程であって、その結果、このバックグ
ラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプチド
の異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す、工程を包含
する。バックグラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な
値と、検出された標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決
定され得る。
【０２７９】
被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断画像を生成するため
に必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解さ
れる。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は
、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識化抗
体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞位置に優先的
に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅ
ｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕ
ｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１３章，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．
Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８
２）において、記載される。
に必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解さ
れる。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量は
、通常、約５〜２０ミリキュリーの９９ｍＴｃの範囲である。次いで、標識化抗
体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞位置に優先的
に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉ
ｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅ
ｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕ
ｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、第１３章，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．
Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８
２）において、記載される。
【０２８０】
使用する標識の型および投与様式を含む、いくつかの変数に依存して、標識化
分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合し
ていない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の時
間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別の
実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間であ
る。
分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合し
ていない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の時
間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別の
実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間であ
る。
【０２８１】
１つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
【０２８２】
標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュータ断層撮影
法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層
撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診断法を含むが
、これらに限定されない。
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発明
の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュータ断層撮影
法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）射出断層
撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診断法を含むが
、これらに限定されない。
【０２８３】
特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射線応答性
外科的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ
ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０
号）を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で
標識し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実
施形態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法
を使用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識
で標識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応性である。好ましくは、本発明のキットは、
目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の
実施形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検
出するための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍
光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか
、または１次抗体を認識する２次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）
。
外科的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ
ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０
号）を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で
標識し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実
施形態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法
を使用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識
で標識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応性である。好ましくは、本発明のキットは、
目的のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の
実施形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検
出するための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍
光化合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか
、または１次抗体を認識する２次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）
。
【０２８４】
本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性である。
さらに、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための
手段を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーに
より検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特
定の実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原また
は化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原
はまた、固体支持体に付着され得る。
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性である。
さらに、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための
手段を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーに
より検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特
定の実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原また
は化学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原
はまた、固体支持体に付着され得る。
【０２８５】
より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
【０２８６】
さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性の実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、２次の標識化モノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原
を含み得る。
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性の実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、２次の標識化モノクロナー
ル抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原
を含み得る。
【０２８７】
１つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。この試薬に対する特定の抗原抗体の結合、
および結合していない血清成分の、洗浄による除去の後、この試薬をレポーター
標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に比
例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合し
ていない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決定
する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質、
発光性基質または比色性基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下
で固相をインキュベートすることにより検出される。
抗原を有する固相試薬と反応させる。この試薬に対する特定の抗原抗体の結合、
および結合していない血清成分の、洗浄による除去の後、この試薬をレポーター
標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に比
例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合し
ていない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決定
する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質、
発光性基質または比色性基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下
で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２８８】
上記アッセイにおいて、固体表面試薬は、固体支持体物質（例えば、ポリマー
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）へタンパク
質物質を付着することについての公知の技術によって調製される。これらの付着
法としては、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着または固体支持体上
の化学的反応基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、もしくはア
ルデヒド基）に対するタンパク質の共有結合（代表的に、遊離のアミン基を介す
る）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンコートプレートが、ビオチン
化抗原との結合体化において使用され得る。
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）へタンパク
質物質を付着することについての公知の技術によって調製される。これらの付着
法としては、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着または固体支持体上
の化学的反応基（例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、もしくはア
ルデヒド基）に対するタンパク質の共有結合（代表的に、遊離のアミン基を介す
る）が挙げられる。あるいは、ストレプトアビジンコートプレートが、ビオチン
化抗原との結合体化において使用され得る。
【０２８９】
従って、本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを
提供する。このキットは、一般に、表面に結合した組換え抗原を有する支持体、
および表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体
を含む。
提供する。このキットは、一般に、表面に結合した組換え抗原を有する支持体、
および表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体
を含む。
【０２９０】
（ポリヌクレオチドの使用）
本明細書中で同定された各ポリヌクレオチドは、試薬として多数の方法におい
て使用され得る。以下の説明は、例示とみなされるべきであり、公知の技術を利
用する。
て使用され得る。以下の説明は、例示とみなされるべきであり、公知の技術を利
用する。
【０２９１】
本発明のポリヌクレオチドは、染色体の同定のために有用である。新たな染色
体マーカーを同定する必要性が継続して存在する。なぜなら、実際の配列データ
（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、ほとんど利用可能ではな
いからである。各配列は、特異的に標的化され、そして個々のヒト染色体上の特
定の部位にハイブリダイズ可能である。従って本発明の各々のポリヌクレオチド
は、当該分野で公知の技術を使用して染色体のマーカーとして慣習的に使用され
得る。
体マーカーを同定する必要性が継続して存在する。なぜなら、実際の配列データ
（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、ほとんど利用可能ではな
いからである。各配列は、特異的に標的化され、そして個々のヒト染色体上の特
定の部位にハイブリダイズ可能である。従って本発明の各々のポリヌクレオチド
は、当該分野で公知の技術を使用して染色体のマーカーとして慣習的に使用され
得る。
【０２９２】
簡潔には、配列は、配列番号Ｘに示された配列からＰＣＲプライマー（好まし
くは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５ｂｐ））を調製することにより
、染色体にマッピングされ得る。プライマーがゲノムＤＮＡにおいて１より多い
推定のエキソンにまたがらないように、コンピューター分析を用いてプライマー
を任意に選択し得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。配列番号
Ｘに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグ
メントを産生する。
くは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５ｂｐ））を調製することにより
、染色体にマッピングされ得る。プライマーがゲノムＤＮＡにおいて１より多い
推定のエキソンにまたがらないように、コンピューター分析を用いてプライマー
を任意に選択し得る。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含有
する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。配列番号
Ｘに対応するヒト遺伝子を含むこれらのハイブリッドのみが、増幅されたフラグ
メントを産生する。
【０２９３】
同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体にポリヌクレオチドをＰＣＲマ
ッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用して、１
日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチドの
下位の位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグメ
ントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングストラ
テジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別
した染色体での予備スクリーニング、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによる予備選択、およびコンピューターマッ
ピング技術（例えば、Ｓｈｕｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
６：４５６〜４５９（１９９８）（その全体が参考として本明細書中に援用され
る）を参照のこと）が挙げられる。
ッピングする迅速な方法を提供する。単一のサーマルサイクラーを使用して、１
日あたり３つ以上のクローンが割り当てられ得る。さらに、ポリヌクレオチドの
下位の位置決め（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体フラグメ
ントのパネルを用いて達成され得る。使用され得る他の遺伝子マッピングストラ
テジーとしては、インサイチュハイブリダイゼーション、標識されたフロー選別
した染色体での予備スクリーニング、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築
するためのハイブリダイゼーションによる予備選択、およびコンピューターマッ
ピング技術（例えば、Ｓｈｕｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １
６：４５６〜４５９（１９９８）（その全体が参考として本明細書中に援用され
る）を参照のこと）が挙げられる。
【０２９４】
ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッドの蛍光イ
ンサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、達成され得る。
この技術は、５００または６００塩基程度の短いポリヌクレオチドを使用する；
しかし、２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。この技術
の概説については、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
ンサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、達成され得る。
この技術は、５００または６００塩基程度の短いポリヌクレオチドを使用する；
しかし、２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが好ましい。この技術
の概説については、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照のこと。
【０２９５】
染色体マッピングについて、ポリヌクレオチドは個々に（単一の染色体または
その染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位および
／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
その染色体上の単一部位をマークするために）またはパネルで（複数部位および
／または複数染色体をマークするために）使用され得る。
【０２９６】
従って、本発明はまた、染色体の局在化のための方法を提供し、この方法は、
（ａ）表１および配列番号Ｘにおけるポリヌクレオチド配列に由来するＰＣＲプ
ライマーの調整および（ｂ）個々の染色体を含む体細胞ハイブリッドのスクリー
ニングに関する。
（ａ）表１および配列番号Ｘにおけるポリヌクレオチド配列に由来するＰＣＲプ
ライマーの調整および（ｂ）個々の染色体を含む体細胞ハイブリッドのスクリー
ニングに関する。
【０２９７】
本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射ハイブリッドマッピング、ＨＡＰ
ＰＹマッピング、および長い範囲の制限マッピングに有効である。これらの技術
の総説および当該分野で公知の他の技術は、例えば、Ｄｅａｒ、「Ｇｅｎｏｍｅ
Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（
１９９７））；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９４（１９
９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３−４９２（
１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０９−
４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．６２−２６５−２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ，Ｊ．Ｈｅｒｅ
ｄ．９０：６８−７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考として本
明細書中に援用される）を参照のこと。
ＰＹマッピング、および長い範囲の制限マッピングに有効である。これらの技術
の総説および当該分野で公知の他の技術は、例えば、Ｄｅａｒ、「Ｇｅｎｏｍｅ
Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ（
１９９７））；Ａｙｄｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９４（１９
９９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３−４９２（
１９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０９−
４２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．６２−２６５−２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ，Ｊ．Ｈｅｒｅ
ｄ．９０：６８−７０（１９９９）（これらの各々は、その全体が参考として本
明細書中に援用される）を参照のこと。
【０２９８】
一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマッピングされると、そのポリ
ヌクレオチドの物理的な位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、
染色体位置と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
）を確立する（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅ
ｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐ
ｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒ
ｙからオンラインで入手可能である）に見出される）。１メガ塩基のマッピング
分解能および２０ｋｂにつき１遺伝子と仮定すると、疾患と関連づけられた染色
体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子
のうちの１つであり得る。
ヌクレオチドの物理的な位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、
染色体位置と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ
）を確立する（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅ
ｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐ
ｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒ
ｙからオンラインで入手可能である）に見出される）。１メガ塩基のマッピング
分解能および２０ｋｂにつき１遺伝子と仮定すると、疾患と関連づけられた染色
体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝子
のうちの１つであり得る。
【０２９９】
従って、一旦同時遺伝が確立されると、罹患個体と非罹患個体との間の本発明
のポリヌクレオチドおよび対応遺伝子における差異が試験され得る。第１に、染
色体における目に見える構造変化（例えば、欠失または転座）が染色体スプレッ
ドにおいてまたはＰＣＲにより試験される。構造的変化が存在しない場合は、点
変異の存在を確認する。幾人かまたは全ての罹患個体で観察されるが、正常個体
では観察されない変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを示す。し
かし、幾人かの正常個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子の完全な配列
決定は、この変異を多型と区別するために必要である。新たな多型が同定される
と、この多型ポリペプチドは、さらなる連鎖分析のために使用され得る。
のポリヌクレオチドおよび対応遺伝子における差異が試験され得る。第１に、染
色体における目に見える構造変化（例えば、欠失または転座）が染色体スプレッ
ドにおいてまたはＰＣＲにより試験される。構造的変化が存在しない場合は、点
変異の存在を確認する。幾人かまたは全ての罹患個体で観察されるが、正常個体
では観察されない変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを示す。し
かし、幾人かの正常個体由来のポリペプチドおよび対応する遺伝子の完全な配列
決定は、この変異を多型と区別するために必要である。新たな多型が同定される
と、この多型ポリペプチドは、さらなる連鎖分析のために使用され得る。
【０３００】
さらに、非罹患個体と比較した罹患個体の遺伝子の増加または減少した発現が
、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（変
化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカー
として使用され得る。
、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価され得る。任意のこれらの変化（変
化した発現、染色体再配置、または変異）は、診断マーカーまたは予後マーカー
として使用され得る。
【０３０１】
従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０３０２】
なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／またはガン性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキット
を含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌク
レオチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、この
キットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオ
チドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー
末端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
および／またはガン性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキット
を含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと
特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌク
レオチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、この
キットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオ
チドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー
末端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメ
ラーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０３０３】
関連した障害の診断（例えば、腫瘍の診断を含む）が既に従来方法によって行
われている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによっ
て増強または抑制された本発明のポリヌクレオチド発現を示す患者が、標準レベ
ルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験
する。
われている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによっ
て増強または抑制された本発明のポリヌクレオチド発現を示す患者が、標準レベ
ルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験
する。
【０３０４】
「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本
発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク
質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対
的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定ま
たは評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連した
障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは
関連した障害を有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定さ
れる。当該分野で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍ
ＲＮＡレベルが公知になれば、これを、比較のための標準として反復して用い得
る。
発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対のタンパク
質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相対
的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定ま
たは評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポリ
ペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連した
障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまたは
関連した障害を有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定さ
れる。当該分野で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたはｍ
ＲＮＡレベルが公知になれば、これを、比較のための標準として反復して用い得
る。
【０３０５】
「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたは対応するｍＲＮ
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意
の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発
明のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液お
よび髄液）、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された他の組織
供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野
で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供
給源である。
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意
の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発
明のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液お
よび髄液）、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された他の組織
供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野
で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供
給源である。
【０３０６】
上記で提供された方法は好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適
用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，
８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載さ
れる、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明
のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、本発明の単
離されたポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチド
との間の多型性を同定し得る。このような多型性の知見（すなわち、それらの位
置ならびにそれらの存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫障害、筋肉
障害、生殖傷害、胃腸傷害、肺障害、心臓血管傷害、腎臓障害、増殖傷害、およ
び／または癌性疾患ならびに状態）についての疾患の遺伝子座を同定する際に有
益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号および同第５，
８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、その全体が本明細
書中に参考として援用される。
はポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに適
用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７，
８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載さ
れる、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに、本発明
のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、本発明の単
離されたポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌクレオチド
との間の多型性を同定し得る。このような多型性の知見（すなわち、それらの位
置ならびにそれらの存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫障害、筋肉
障害、生殖傷害、胃腸傷害、肺障害、心臓血管傷害、腎臓障害、増殖傷害、およ
び／または癌性疾患ならびに状態）についての疾患の遺伝子座を同定する際に有
益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６５９号および同第５，
８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許は、その全体が本明細
書中に参考として援用される。
【０３０７】
本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支
持体または、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として
役立つ。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤ
ＮＡアナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについ
てのモノマー単位が市販される（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導
体）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，
Ｒ．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４
９７（１９９７）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．
Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ
．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開
示されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し
、そしてヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結
合するよりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥
力が存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これ
によって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のスト
リンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより
容易にする。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用
いられ得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マ
ーにおける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４
℃〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させる
からである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーシ
ョンが、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を
減少させることを意味する。
現された）または当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポリ
ヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体支
持体または、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として
役立つ。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤ
ＮＡアナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについ
てのモノマー単位が市販される（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｃｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導
体）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，
Ｒ．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４
９７（１９９７）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃ
ｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．
Ｄｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ
．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開
示されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し
、そしてヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結
合するよりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥
力が存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これ
によって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のスト
リンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより
容易にする。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用
いられ得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイ
ブリダイゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マ
ーにおける単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４
℃〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させる
からである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーシ
ョンが、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を
減少させることを意味する。
【０３０８】
本発明は、哺乳動物における癌の検出を含むが、これらに限定されない使用を
有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増
殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性
骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血
病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨
髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好まし
い哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒト
である。
有する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増
殖新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性
骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血
病、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨
髄性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好まし
い哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ
、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒト
である。
【０３０９】
病理学的細胞増殖障害はしばしば、プロト癌遺伝子の非適切な活性化に関連す
る（Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕ
ｔｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｖｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖ
ｉｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１
８２（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性
に転写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正
常な細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じ
ると考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変
更された発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因
と関与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形
成に関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例
において増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
る（Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら，「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕ
ｔｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｖｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖ
ｉｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」，Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１
８２（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性
に転写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正
常な細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じ
ると考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変
更された発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因
と関与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形
成に関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例
において増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０３１０】
例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開第ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’末
端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタンパ
ク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍＲ
ＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起こ
すことが示されている（国際公開第ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔｒｏ
ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８）；
Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７９（
１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々の起
源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞およ
び組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開第ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’末
端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタンパ
ク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍＲ
ＮＡの翻訳をブロックし、処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引き起こ
すことが示されている（国際公開第ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓｔｒｏ
ｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８８）；
Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３７９（
１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種々の起
源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血性の細胞およ
び組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０３１１】
前記に加えて、本発明のポリヌクレオチドは、三重らせん形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するために使用され得る。
アンチセンス技術は例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６
０（１９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察さ
れる。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１
：１３６０（１９９１）に考察される。両方の方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技術に関して、好ましいポ
リヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして
転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６
０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ
−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒ
ａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、
最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブ
リダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。上記の
オリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、このアンチセンスＲ
ＮＡまたはＤＮＡは、本発明の抗原のポリペプチドの産生を阻害するためにイン
ビボで発現され得る。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本
明細書に開示される情報は、疾患を処置するための試みにおいて、アンチセンス
または三重らせんポリヌクレオチドを設計するために、特に増殖疾患および／ま
たは状態の処置のために使用され得る。
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡによって遺伝子発現を制御するために使用され得る。
アンチセンス技術は例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６
０（１９９１），「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎ
ｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ」，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察さ
れる。三重らせん形成は例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１
：１３６０（１９９１）に考察される。両方の方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａへのポリヌクレオチドの結合に依存する。これらの技術に関して、好ましいポ
リヌクレオチドは通常、２０〜４０塩基長のオリゴヌクレオチドであり、そして
転写に関与する遺伝子領域（三重らせん−Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：
４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６
０（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ
，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ
−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒ
ａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８））のいずれかに相補的である。三重らせん形成は、
最適にはＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を生じるが、アンチセンスＲＮＡハイブ
リダイゼーションは、ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。上記の
オリゴヌクレオチドはまた、細胞に送達され得、その結果、このアンチセンスＲ
ＮＡまたはＤＮＡは、本発明の抗原のポリペプチドの産生を阻害するためにイン
ビボで発現され得る。両方の技術は、モデル系において効果的であり、そして本
明細書に開示される情報は、疾患を処置するための試みにおいて、アンチセンス
または三重らせんポリヌクレオチドを設計するために、特に増殖疾患および／ま
たは状態の処置のために使用され得る。
【０３１２】
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療において有用である。遺伝子治
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中に新しい形質を生成することである。
療の１つの目標は、遺伝欠損を修正する試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
へ正常遺伝子を挿入することである。本発明に開示されるポリヌクレオチドは、
高度に正確な様式でこのような遺伝欠損を標的とする手段を提供する。別の目標
は、宿主ゲノム中には存在しなかった新しい遺伝子を挿入し、それによって宿主
細胞中に新しい形質を生成することである。
【０３１３】
ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的サンプルから個体を同定するために
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
ＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバン
ドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識
票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれた
りすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない
。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て使用され得る。
有用である。例えば、米国軍は、その職員を同定するために制限フラグメント長
の多型性（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術において、個体のゲノム
ＤＮＡは１つ以上の制限酵素で消化され、そして職員を同定するため固有なバン
ドを生じるためのサザンブロットについてプローブされる。この方法は、「認識
票（Ｄｏｇ ｔａｇ）」（これは、失われたり、交換されたり、または盗まれた
りすることにより、ポジティブな同定を困難にし得る）の現在の限界を受けない
。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのためのさらなるＤＮＡマーカーとし
て使用され得る。
【０３１４】
本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の実際の塩
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離
するためのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択さ
れたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有する
ので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベー
スが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡してい
ようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプル
からなされ得る。
基ごとのＤＮＡ配列を決定することによって、ＲＦＬＰに対する代替物として使
用され得る。これらの配列は、このような選択されたＤＮＡを増幅しそして単離
するためのＰＣＲプライマーを調製するために使用され得、次いで、この選択さ
れたＤＮＡは、配列決定され得る。各個体が固有のセットのＤＮＡ配列を有する
ので、この技術を使用して、個体が同定され得る。一旦、固有のＩＤデータベー
スが個体について確立されると、その個体が生存していようとまたは死亡してい
ようとにかかわらず、その個体のポジティブ同定が、極めて小さな組織サンプル
からなされ得る。
【０３１５】
法医学生物学もまた、本明細書に開示されるようなＤＮＡに基づく同定技術を
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐ
ｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな
生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについ
てのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医
学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
使用して利益を得る。組織（例えば、髪または皮膚）、または体液（例えば、血
液、唾液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ、肺痰（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓｐ
ｕｔｕｍ）またはサーファクタント、尿、糞便物質など）のような非常に小さな
生物学的サンプルから得られたＤＮＡ配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。
ある先行技術において、ＤＱａクラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子のような多型性遺伝子
座から増幅された遺伝子配列は、個体を同定するための法医学生物学において使
用される。（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））。一旦、これらの特異的多型性遺伝子座が
増幅されると、これらは１つ以上の制限酵素で消化される。これは、ＤＱａクラ
スＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブされたサザンブロットについ
てのバンドの同定セットを生じる。同様に、本発明のポリヌクレオチドは、法医
学的目的のための多型性マーカーとして使用され得る。
【０３１６】
また、特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性が存在する。例
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、ＤＮＡプローブ
またはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、種および／または器
官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物につい
て組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
えば、未知の起源の組織が提供される場合、法医学においてこのような必要性が
生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製される、ＤＮＡプローブ
またはプライマーを含み得る。このような試薬のパネルは、種および／または器
官型によって組織を同定し得る。同様の様式で、これらの試薬は、夾雑物につい
て組織培養物をスクリーニングするために使用され得る。
【０３１７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、生物学的サンプル中に存在する組織または
細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。同様に、本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織
（例えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセ
イ）の差示的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。さらに、上記
組織または細胞の多くの障害に関して、「標準の」遺伝子発現レベル（すなわち
、障害を有さない個体由来の健常組織中の発現レベル）に対して有意により高い
かまたはより低いレベルの本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの遺伝子発
現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明
のポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを発現する組織ならびに／ま
たは癌性組織および／もしくは創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿
、滑液または髄液）において検出され得る。
細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。同様に、本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織
（例えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセ
イ）の差示的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。さらに、上記
組織または細胞の多くの障害に関して、「標準の」遺伝子発現レベル（すなわち
、障害を有さない個体由来の健常組織中の発現レベル）に対して有意により高い
かまたはより低いレベルの本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの遺伝子発
現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明
のポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを発現する組織ならびに／ま
たは癌性組織および／もしくは創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿
、滑液または髄液）において検出され得る。
【０３１８】
従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体
の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺
伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レ
ベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示
す、工程。
の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺
伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レ
ベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示
す、工程。
【０３１９】
少なくとも、本発明のポリヌクレオチドは、サザンゲルでの分子量マーカーと
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして
、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」す
るためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるため
のオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体
を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
して、特定の細胞型における特定のｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして
、新規なポリヌクレオチドを発見するプロセスでの公知の配列を「差し引き」す
るためのプローブとして、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着させるため
のオリゴマーを選択および作製するため、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体
を惹起させるため、および免疫応答を誘発する抗原として、使用され得る。
【０３２０】
（ポリペプチドの使用）
本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され
得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利
用する。
得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利
用する。
【０３２１】
本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織（例えば
、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））
または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的
プローブを提供するために有用である。
、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））
または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的
プローブを提供するために有用である。
【０３２２】
抗体は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サン
プル中の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのレベルを
アッセイし得る。（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の
遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ
（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で
公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位
体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35 Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉ
ｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウ
ム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセ
ノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140 Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ
、97Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フル
オレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
プル中の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのレベルを
アッセイし得る。（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の
遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ
（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で
公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位
体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35 Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉ
ｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウ
ム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセ
ノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140 Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ
、97Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フル
オレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０３２３】
生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
【０３２４】
放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、 121
Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115m
Ｉｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ
）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ
）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、 177 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186
Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核
磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識され
た、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物に（例えば、非
経口的、皮下、または腹腔内に）導入され、免疫系の障害について検査される。
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために
必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部
分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99mＴｃ
の約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フ
ラグメントは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発
現する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕ
ｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒ
ａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒ
ｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ
）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、 177 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186
Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核
磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識され
た、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物に（例えば、非
経口的、皮下、または腹腔内に）導入され、免疫系の障害について検査される。
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために
必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部
分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99mＴｃ
の約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フ
ラグメントは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発
現する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕ
ｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒ
ａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒ
ｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０３２５】
１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細
胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治
療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において
、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本
鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し
得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供す
る。
本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細
胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治
療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において
、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本
鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し
得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供す
る。
【０３２６】
別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連
する本発明のポリペプチドを投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、
腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
する本発明のポリペプチドを投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、
腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０３２７】
「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条
件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分
子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の
方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞
傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有
部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン
、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モ
モルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウ
イルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素のような）。
「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金
属イオン（例えば、α−放射体（例えば、213Ｂｉ））もしくは他の放射性同位
体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32
Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓ
ｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウ
ム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセ
インおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条
件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分
子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の
方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞
傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有
部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン
、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モ
モルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウ
イルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素のような）。
「毒素」はまた、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金
属イオン（例えば、α−放射体（例えば、213Ｂｉ））もしくは他の放射性同位
体（例えば、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32
Ｐ、35Ｓ、90Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓ
ｎ、90イットリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウ
ム）；発光標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセ
インおよびローダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０３２８】
当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチド（抗体を含む）を標識
化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（
例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５
，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；
同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３
９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４
，５６０号；および５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、
本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定され
ない。
化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（
例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５
，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；
同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３
９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４
，５６０号；および５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、
本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定され
ない。
【０３２９】
従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液における本発明のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工
程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチ
ドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイさ
れたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に
関しては、個体由来の生検組織中の比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発症
の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出
するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家が
早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる
進行を防ぐことを可能にし得る。
の細胞または体液における本発明のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工
程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチ
ドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイさ
れたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に
関しては、個体由来の生検組織中の比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発症
の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾患を検出
するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健専門家が
早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症またはさらなる
進行を防ぐことを可能にし得る。
【０３３０】
さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患または状態（例えば、神経障害、
免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、
増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。
例えば、患者は、ポリペプチドの不在またはレベルの減少を元に戻すこと（例え
ば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充するこ
と（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、Ｄ
ＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子
または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプ
ターに結合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合
させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を
低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもた
らすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の
増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドを投与され得る。
免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、
増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。
例えば、患者は、ポリペプチドの不在またはレベルの減少を元に戻すこと（例え
ば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を補充するこ
と（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、Ｄ
ＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば、癌遺伝子
または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例えば、レセプ
ターに結合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプターと競合
させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例えば、炎症を
低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の応答をもた
らすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の
増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドを投与され得る。
【０３３１】
同様に、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、疾患
（上記、および本明細書中の他の箇所に記載されるような）を処置し得る。例え
ば、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを
結合し得、そして／またはポリペプチドを中和し得、そして／またはポリペプチ
ドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結合したポリ
ペプチド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
（上記、および本明細書中の他の箇所に記載されるような）を処置し得る。例え
ば、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを
結合し得、そして／またはポリペプチドを中和し得、そして／またはポリペプチ
ドの過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結合したポリ
ペプチド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【０３３２】
少なくとも、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いてＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され
得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ポリペプチドがまた用いられ
て、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用されて、組換え細胞からのタンパ
ク質発現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドが使用されて、以下の生物
学的活性を試験し得る。
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され
得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ポリペプチドがまた用いられ
て、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用されて、組換え細胞からのタンパ
ク質発現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドが使用されて、以下の生物
学的活性を試験し得る。
【０３３３】
（遺伝子治療方法）
本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝
子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のポリペプチドの発現を達成
するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの発
現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような
遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中
に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のポリペプチドの発現を達成
するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの発
現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような
遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中
に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
【０３３４】
従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）を用いて操作され、次いで、操作された細胞は、本発明のポリペプチドを用
いて処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野において周
知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．８５：１０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ
．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３
）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６
０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａ
ｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９
６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２
４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これ
らは、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作さ
れる細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直
接的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
と作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）を用いて操作され、次いで、操作された細胞は、本発明のポリペプチドを用
いて処置されるべき患者に提供される。このような方法は、当該分野において周
知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｉｎｓｔ．８５：１０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ
．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３
）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６
０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ
６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａ
ｔｏ，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９
６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２
４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これ
らは、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作さ
れる細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直
接的な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０３３５】
以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可
能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る
。
能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る
。
【０３３６】
１つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオ
チドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡと
は、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる
送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチ
ンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌク
レオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中お
よびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、
米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５
８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される
。
チドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡと
は、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる
送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチ
ンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌク
レオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中お
よびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、
米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５
８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される
。
【０３３７】
遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ま
しくは、宿主ゲノム中に組み込まれず、また複製を可能にする配列を含まない構
築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；なら
びにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、
およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に
明らかである。
しくは、宿主ゲノム中に組み込まれず、また複製を可能にする配列を含まない構
築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐ
ＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；なら
びにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、
およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容易に
明らかである。
【０３３８】
当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、ポリヌクレオチド配列の発現を
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌク
レオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプ
ロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロ
モーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；ＲＳウイ
ルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモータ
ー、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプ
ロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチ
ミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホ
ルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明のポリヌク
レオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３３９】
他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３４０】
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空
間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維、血管または室
の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維間の細胞間の液体ムコ多糖
類基質、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ
ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同
じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリン
パ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論
される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細
胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオ
チド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてそ
の細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分
化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成
され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現
する能力において、特に適格である。
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間隙空
間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維、血管または室
の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維間の細胞間の液体ムコ多糖
類基質、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ
ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の裂孔中の同
じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャンネルのリン
パ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、以下で議論
される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、これらの細
胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポリヌクレオ
チド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され、そしてそ
の細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分
化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成
され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そして発現
する能力において、特に適格である。
【０３４１】
裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。当然ながら、当業者が認
識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適
切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状
態および投与経路に依存し得る。
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。当然ながら、当業者が認
識するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適
切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状
態および投与経路に依存し得る。
【０３４２】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３４３】
裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３４４】
この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３４５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調製物中で
複合体化している。本発明において使用するためのリポソーム調製物は、カチオ
ン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含
する。しかし、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電
複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リ
ポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として
援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考とし
て援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本明
細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示され
ている。
複合体化している。本発明において使用するためのリポソーム調製物は、カチオ
ン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含
する。しかし、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で強固な荷電
複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リ
ポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で参考として
援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６）；ｍＲＮＡ（本明細書中で参考とし
て援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ（１９８９）８６：６０７７〜６０８１）；および精製された転写因子（本明
細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
９０）２６５：１０１８９〜１０１９２）の細胞内送達を媒介することが示され
ている。
【０３４６】
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より
入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６をもまた参照のこと、）より
入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３４７】
当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと
。類似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得
る。
【０３４８】
同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。
そのような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、
ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた
、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され
得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知で
ある。
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して容易に調製され得る。
そのような物質としては、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、
ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰ
Ｃ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた
、ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され
得る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知で
ある。
【０３４９】
例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用して、コ
レステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って
、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣ
の各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。こ
のサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして翌日、脱イオン水で水和する。次
いで、水槽を１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用して、コ
レステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って
、例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣ
の各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。こ
のサンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして翌日、脱イオン水で水和する。次
いで、水槽を１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイプ
）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器を
使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。ある
いは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得る
か、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し出
すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公知
でありそして利用可能である。
【０３５０】
このリポソームとしては、多重膜小胞（ＭＬＶ）、小さな単膜小胞（ＳＵＶ）
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１０１：５１２〜５２７を参照の
こと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラス管の壁面にリン脂質の薄膜を堆
積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和することによっ
て調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソ
ームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸
濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使
用する場合、乾燥した脂質フィルムを、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｎａ
Ｃｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、
次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポ
ソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常
に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見
出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用さ
れる方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌ
ｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８
３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒ，ＤおよびＢａｎｇｈａｍ，Ａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）
；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；
および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａ
ｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（
１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９８２）２１５：１６６（これらの文献は本明細書中で参考として援用され
る））が挙げられる。
または大きな単膜小胞（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好ましい。当該分野で
周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調製される。例えば、
本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）１０１：５１２〜５２７を参照の
こと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラス管の壁面にリン脂質の薄膜を堆
積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質の溶液で水和することによっ
て調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理により調製され、単膜リポソ
ームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を、予め形成されたＭＬＶの懸
濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン性脂質を含むリポソームを使
用する場合、乾燥した脂質フィルムを、滅菌水または１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｎａ
Ｃｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中に再懸濁し、超音波処理し、
次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接混合する。正に荷電したリポ
ソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リポソームおよびＤＮＡは非常
に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラグメントを用いての用途を見
出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法により調製される。一般に使用さ
れる方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌ
ｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８
３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；エーテル注入（Ｄｅ
ａｍｅｒ，ＤおよびＢａｎｇｈａｍ，Ａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）
；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈ，Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐ．、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；
および逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；Ｓｚｏｋａ，Ｆ．およびＰａｐａｈａ
ｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（
１９７８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９８２）２１５：１６６（これらの文献は本明細書中で参考として援用され
る））が挙げられる。
【０３５１】
一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３５２】
米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３５３】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３５４】
このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）において記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、Ｐ
Ａ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、Ｇ
Ｐ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これ
らに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッ
ケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限
定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターを
リポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得
る。
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）において記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、Ｐ
Ａ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、Ｇ
Ｐ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これ
らに限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッ
ケージング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレー
ション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限
定されない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターを
リポソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得
る。
【０３５５】
このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３５６】
特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれるポリヌク
レオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイル
スは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そしてそれを発現し、そして同
時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化される
ように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染
色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発に関する懸念が軽
減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れ
た安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４
）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８）。最終的に
、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットの肺への
α−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証さ
れている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５
２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９９２）、６８：１
４３〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因因子としてアデノウイルスを確立
しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：６６０６）。
レオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデノウイル
スは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そしてそれを発現し、そして同
時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化される
ように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞染
色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発に関する懸念が軽
減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして優れ
た安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ら（１９７４
）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３−２３８）。最終的に
、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラットの肺への
α−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例において実証さ
れている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５
２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ（１９９２）、６８：１
４３〜１５５）。さらに、ヒト癌における原因因子としてアデノウイルスを確立
しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：６６０６）。
【０３５７】
本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：
１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
ｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４
号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、ア
デノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され
得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌ
ａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の
産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、
他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、
本発明において有用である。
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：
１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
ｔ．Ｔｈｅｒ．４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ
３６５：６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４
号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば、ア
デノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖され
得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的にＥｌ
ａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝子の
産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加えて、
他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もまた、
本発明において有用である。
【０３５８】
好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３５９】
特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の
中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基
対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得る
が、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡ
Ｖの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１
３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第
５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号
および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、非分裂細胞の
中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００塩基
対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み得る
が、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのようなＡＡ
Ｖの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，１
３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、同第
５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４５号
および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３６０】
例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフ
ェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意
の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに
感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイ
ルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、
またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェ
クトおよび感染されると、それらはポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶ
ウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、こ
れらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞
は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明の
ポリペプチドを発現する。
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフ
ェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意
の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに
感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイ
ルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、
またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェ
クトおよび感染されると、それらはポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶ
ウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、こ
れらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質導入細胞
は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして本発明の
ポリペプチドを発現する。
【０３６１】
遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコード
している）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在し
ているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで
発現する、遺伝子の活性化を含む。
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコード
している）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に存在し
ているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレベルで
発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３６２】
当該分野で公知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３６３】
このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に異なる制限
酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロ
モーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’
末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅された
プロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に異なる制限
酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロ
モーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’
末端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅された
プロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３６４】
裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されたような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と組合せてのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と組合せてのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３６５】
プロモーター標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。構築物と内因性
配列との間の相同組換えが生じ、その結果、内因性配列は、プロモーターの制御
下に配置される。次いで、このプロモーターは、内因性配列の発現を駆動する。
配列との間の相同組換えが生じ、その結果、内因性配列は、プロモーターの制御
下に配置される。次いで、このプロモーターは、内因性配列の発現を駆動する。
【０３６６】
好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、タンパ
ク質の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含む。代表的には、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域に配置されて、このコード領域の５’末端
に対して、または５’末端に発現される。このシグナル配列は、目的のポリヌク
レオチドに対して同種でも異種でもよく、そしてトランスフェクトされる細胞に
対して同種でも異種でもよい。さらにシグナル配列は、当該分野で公知の方法を
用いて化学的に合成され得る。
ク質の分泌を容易にする分泌シグナル配列を含む。代表的には、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域に配置されて、このコード領域の５’末端
に対して、または５’末端に発現される。このシグナル配列は、目的のポリヌク
レオチドに対して同種でも異種でもよく、そしてトランスフェクトされる細胞に
対して同種でも異種でもよい。さらにシグナル配列は、当該分野で公知の方法を
用いて化学的に合成され得る。
【０３６７】
上記の任意のポリヌクレオチド構築物の投与の任意の態様は、この態様が治療
的効果を提供するに十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用され得
る。これには、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、微粒子注射器（ｂｉｏ
ｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポー、他の市販のデポー物質、浸透圧ポンプ（例えば、
Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤固体（錠剤または丸剤）薬学的処方物、
および手術中の傾瀉適用または局所的適用が挙げられる。例えば、裸のリン酸カ
ルシウム沈澱したプラスミドをラット肝臓およびラット脾臓へ、またはタンパク
質コーティングしたプラスミドを門脈へ直接注射することにより、ラット肝臓で
の外来遺伝子の遺伝子発現が生じた（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３
：３７５（１９８９））。
的効果を提供するに十分な量で１つ以上の分子の発現を生じる限り、使用され得
る。これには、直接針注射、全身注射、カテーテル注入、微粒子注射器（ｂｉｏ
ｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポー、他の市販のデポー物質、浸透圧ポンプ（例えば、
Ａｌｚａミニポンプ）、経口または坐剤固体（錠剤または丸剤）薬学的処方物、
および手術中の傾瀉適用または局所的適用が挙げられる。例えば、裸のリン酸カ
ルシウム沈澱したプラスミドをラット肝臓およびラット脾臓へ、またはタンパク
質コーティングしたプラスミドを門脈へ直接注射することにより、ラット肝臓で
の外来遺伝子の遺伝子発現が生じた（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３
：３７５（１９８９））。
【０３６８】
局所的投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達
ビヒクルと複合体化された本発明の組換え分子は、動脈の領域へ直接注射される
か、またはその領域内に局所的に投与される。動脈の領域内に組成物を局所的投
与することは、動脈内の数センチメートルおよび好ましくは数ミリメートルで組
成物を注射することをいう。
ビヒクルと複合体化された本発明の組換え分子は、動脈の領域へ直接注射される
か、またはその領域内に局所的に投与される。動脈の領域内に組成物を局所的投
与することは、動脈内の数センチメートルおよび好ましくは数ミリメートルで組
成物を注射することをいう。
【０３６９】
局所的投与の別の方法は、外科的創傷にまたはその周辺に、本発明のポリヌク
レオチド構築物を接触させることである。例えば、患者は、手術を受け得、そし
てこのポリヌクレオチド構築物が、創傷内部の組織の表面にコーティングされ得
るか、またはこの構築物が創傷内部の組織の領域に注射され得る。
レオチド構築物を接触させることである。例えば、患者は、手術を受け得、そし
てこのポリヌクレオチド構築物が、創傷内部の組織の表面にコーティングされ得
るか、またはこの構築物が創傷内部の組織の領域に注射され得る。
【０３７０】
全身投与において有用な治療的組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクル
に複合体化された、本発明の組換え分子を含む。全身的投与での使用のために適
切な送達ビヒクルは、特定の部位にこのビヒクルを標的化するためのリガンドを
含むリポソームを含む。
に複合体化された、本発明の組換え分子を含む。全身的投与での使用のために適
切な送達ビヒクルは、特定の部位にこのビヒクルを標的化するためのリガンドを
含むリポソームを含む。
【０３７１】
全身的投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口送達およ
び経皮（局所的）送達が挙げられる。静脈内注射は、当該分野で標準的な方法を
用いて行われ得る。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を用いて行
われ得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１（１９９２）（これは、本明細
書中に参考として援用される）を参照のこと）。経口送達は、動物の消化管中の
消化酵素による消化に抵抗し得るキャリアに、本発明のポリヌクレオチド構築物
を複合体化することにより行われ得る。このようなキャリアの例としては、可塑
性のカプセル剤または錠剤（例えば、当該分野で公知のもの）が挙げられる。局
所的送達は、皮膚内へ透過し得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と、本発明の
ポリヌクレオチド構築物とを混合することにより行われ得る。
び経皮（局所的）送達が挙げられる。静脈内注射は、当該分野で標準的な方法を
用いて行われ得る。エアロゾル送達もまた、当該分野で標準的な方法を用いて行
われ得る（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１（１９９２）（これは、本明細
書中に参考として援用される）を参照のこと）。経口送達は、動物の消化管中の
消化酵素による消化に抵抗し得るキャリアに、本発明のポリヌクレオチド構築物
を複合体化することにより行われ得る。このようなキャリアの例としては、可塑
性のカプセル剤または錠剤（例えば、当該分野で公知のもの）が挙げられる。局
所的送達は、皮膚内へ透過し得る親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と、本発明の
ポリヌクレオチド構築物とを混合することにより行われ得る。
【０３７２】
送達される物質の有効量を決定することは、多くの因子に依存し得、これらの
因子としては、例えば、物質の化学的構造および生物学的活性、動物の年齢およ
び重量、処置を必要とする正確な状態およびその重篤度、ならびに投与経路が挙
げられる。処置の頻度は、多くの因子（例えば、用量あたりで投与されるポリヌ
クレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康状態および病歴）に依存する。用
量の正確な数量、回数および投薬のタイミングは、主治医または獣医師により決
定される。
因子としては、例えば、物質の化学的構造および生物学的活性、動物の年齢およ
び重量、処置を必要とする正確な状態およびその重篤度、ならびに投与経路が挙
げられる。処置の頻度は、多くの因子（例えば、用量あたりで投与されるポリヌ
クレオチド構築物の量、ならびに被験体の健康状態および病歴）に依存する。用
量の正確な数量、回数および投薬のタイミングは、主治医または獣医師により決
定される。
【０３７３】
本発明の治療的組成物は、任意の動物に（好ましくは、哺乳動物およびトリに
）投与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられるが、特にヒトが好まし
い。
）投与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられるが、特にヒトが好まし
い。
【０３７４】
（生物学的活性）
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストをアッセイにおいて使用して、一つ以上の生物学的活性について試
験し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示した場合、これらの分
子は、おそらくその生物学的活性と関連する疾患と関連し得る。従って、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを使
用して、関連する疾患を処置し得る。
ンタゴニストをアッセイにおいて使用して、一つ以上の生物学的活性について試
験し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示した場合、これらの分
子は、おそらくその生物学的活性と関連する疾患と関連し得る。従って、ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを使
用して、関連する疾患を処置し得る。
【０３７５】
（免疫活性）
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化または動員（走化性）を活性化または阻
害することにより、免疫系の不全または障害の処置において有用であり得る。免
疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを通して発達し、これは、多能性幹細胞由来
の骨髄細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）ならびにリンパ系
細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生する。これらの免疫不全または障害
の病因論は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、
後天性（例えば化学療法または毒素による）あるいは感染性であり得る。さらに
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーもしくは検出因子とし
て使用され得る。
ンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化または動員（走化性）を活性化または阻
害することにより、免疫系の不全または障害の処置において有用であり得る。免
疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを通して発達し、これは、多能性幹細胞由来
の骨髄細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）ならびにリンパ系
細胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を産生する。これらの免疫不全または障害
の病因論は、遺伝的、体細胞性（例えば、癌またはいくつかの自己免疫障害）、
後天性（例えば化学療法または毒素による）あるいは感染性であり得る。さらに
、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーもしくは検出因子とし
て使用され得る。
【０３７６】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストは、造血細胞の不全または障害の処置または検出において有用であ
り得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストま
たはアンタゴニストを使用して、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に
関連する障害を処置するための試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分
化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症候群の例には、以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン
血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不
全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不
全症候群、リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩ
Ｄ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素
尿。
ンタゴニストは、造血細胞の不全または障害の処置または検出において有用であ
り得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストま
たはアンタゴニストを使用して、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に
関連する障害を処置するための試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分
化および増殖を増加させ得る。免疫学的な不全症候群の例には、以下が挙げられ
るがそれらに限定されない：血液タンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン
血症、低ガンマグロブリン血症）、毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不
全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不
全症候群、リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩ
Ｄ）、ヴィスコット−オールドリッチ障害、貧血、血小板減少症、または血色素
尿。
【０３７７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストはまた、止血活性（出血を停止する）または血栓崩壊活性
（血餅の形成）を調節するために使用され得る。例えば、止血または血栓崩壊活
性を増加させることによって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、血液凝固障害（例えば、無フィブ
リノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、また
は外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。
あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、本発明のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、
凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作、また
は瘢痕の処置に重要であり得る。
またはアンタゴニストはまた、止血活性（出血を停止する）または血栓崩壊活性
（血餅の形成）を調節するために使用され得る。例えば、止血または血栓崩壊活
性を増加させることによって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、血液凝固障害（例えば、無フィブ
リノーゲン血症、因子欠乏）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、また
は外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置するために使用され得る。
あるいは、止血活性または血栓崩壊活性を減少させ得る、本発明のポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、
凝固を阻害または溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作、また
は瘢痕の処置に重要であり得る。
【０３７８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストはまた、自己免疫障害を処置または検出するのに有用であり得る。
多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来物質として不適切に認識
することからもたらされる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応
答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻
害し得る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストま
たはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得
る。
ンタゴニストはまた、自己免疫障害を処置または検出するのに有用であり得る。
多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来物質として不適切に認識
することからもたらされる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊を導く免疫応
答を生じる。それゆえ、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻
害し得る本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストま
たはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害を予防するのに有効な治療であり得
る。
【０３７９】
処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、以下が挙げられるが、そ
れらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節
リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候
群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼結膜炎、水疱性類
天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群
、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバ
レー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。
れらに限定されない：アディソン病、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、慢性関節
リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候
群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼結膜炎、水疱性類
天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑、ライター病、スティッフマン症候群
、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギヤンバ
レー症候群、インスリン依存性糖尿病、および自己免疫炎症性眼病。
【０３８０】
同様に、例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）または他の呼吸問題のような
アレルギー性反応および状態はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストにより処置され得る。さらに、
これらの分子を用いて、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または
血液型不適合を処置し得る。
アレルギー性反応および状態はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストにより処置され得る。さらに、
これらの分子を用いて、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または
血液型不適合を処置し得る。
【０３８１】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストはまた、器官拒絶もしくは対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置お
よび／または予防するために用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応
答を介して移植された組織を破壊することにより生じる。同様に、免疫応答はま
た、ＧＶＨＤに関与しているが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組
織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタ
ゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得
る。
ンタゴニストはまた、器官拒絶もしくは対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を処置お
よび／または予防するために用いられ得る。器官拒絶は、宿主免疫細胞が免疫応
答を介して移植された組織を破壊することにより生じる。同様に、免疫応答はま
た、ＧＶＨＤに関与しているが、この場合、外来の移植された免疫細胞は宿主組
織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性を阻害する本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタ
ゴニストの投与は、器官拒絶またはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療であり得
る。
【０３８２】
同様に、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストはまた、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これら
の分子は、以下を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態）を処置するため
に使用され得る：慢性前立腺炎、肉芽腫性の前立腺炎およびマラコプラキア、感
染に関連した炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答
症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流障害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超
急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、
クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生
からもたらされる状態。
またはアンタゴニストはまた、炎症を調節するために用いられ得る。例えば、本
発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これら
の分子は、以下を含む炎症状態（慢性および急性の両方の状態）を処置するため
に使用され得る：慢性前立腺炎、肉芽腫性の前立腺炎およびマラコプラキア、感
染に関連した炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答
症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再灌流障害、内毒素死亡、関節炎、補体媒介性超
急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺傷害、炎症性腸疾患、
クローン病、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生
からもたらされる状態。
【０３８３】
（過剰増殖性障害）
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストは、新生物を含む過剰増殖性障害を処置または検出するために使用
され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して障害の
増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の
細胞を増殖させ得る。
ンタゴニストは、新生物を含む過剰増殖性障害を処置または検出するために使用
され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニスト
またはアンタゴニストは、直接的相互作用または間接的相互作用を介して障害の
増殖を阻害し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、
あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、過剰増殖性障害を阻害し得る他の
細胞を増殖させ得る。
【０３８４】
例えば、免疫応答を増加させることによって、特に過剰増殖性障害の抗原性の
質を上げることによって、またはＴ細胞の増殖、分化、もしくは移動によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強させる
かまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇され得る。ある
いは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する方
法であり得る。
質を上げることによって、またはＴ細胞の増殖、分化、もしくは移動によって、
過剰増殖性障害は処置され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強させる
かまたは新たな免疫応答を開始させるかのいずれかによって上昇され得る。ある
いは、免疫応答の減少はまた、化学療法剤のような過剰増殖性障害を処置する方
法であり得る。
【０３８５】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはアゴニストまたはア
ンタゴニストにより処置または検出され得る過剰増殖性障害の例には、以下に位
置する新生物が含まれるがこれらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化
器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸
腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤
、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器。
ンタゴニストにより処置または検出され得る過剰増殖性障害の例には、以下に位
置する新生物が含まれるがこれらに限定されない：結腸、腹部、骨、乳房、消化
器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸
腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤
、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器。
【０３８６】
同様に、他の過剰増殖性障害もまた、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得
る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定
されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症
、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロ
ブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増殖性疾患、加
えて上記に列挙した器官系に位置する新生物。
プチド、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得
る。このような過剰増殖性障害の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定
されない：高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、パラプロテイン血症
、紫斑、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロ
ブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過剰増殖性疾患、加
えて上記に列挙した器官系に位置する新生物。
【０３８７】
１つの好ましい実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明、
および／またはタンパク質融合物もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
および／またはタンパク質融合物もしくはそのフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
【０３８８】
従って、本発明は、異常に増殖している細胞に、本発明のポリヌクレオチドを
挿入することにより細胞増殖障害を処置するための方法を提供する。ここで、上
記のポリヌクレオチドは、上記の発現を抑制する。
挿入することにより細胞増殖障害を処置するための方法を提供する。ここで、上
記のポリヌクレオチドは、上記の発現を抑制する。
【０３８９】
本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖障害を処置する方法を提供し
、この方法は、異常に増殖している細胞に本発明の１つ以上の活性な遺伝子コピ
ーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドは、上記のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効
な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物を細胞に挿入
して、レトロウイルス（または、より好ましくは、アデノウイルスベクター）を
利用して処置する（参考として本明細書中に援用される、Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら
、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６を参照のこと）。最も好ましい実
施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして非増殖細胞を形
質転換せず、増殖細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形態において
、増殖している細胞に、単独で、または他のポリヌクレオチドとともに、もしく
は他のポリヌクレオチドと融合してのいずれかで挿入される本発明のポリヌクレ
オチドは、次いで、外部刺激（すなわち、磁性、特定の低分子、化学物質、また
は薬物投与など）により調節され得る。この刺激は、上記のポリヌクレオチドの
上流にあるプロモーターに作用して、コードされたタンパク質産物の発現を誘導
する。このようにして、本発明の有益な治療効果は、上記の外部刺激に基づいて
、明らかに調節され得る（すなわち、本発明の発現を増加、減少、または阻害す
るために）。
、この方法は、異常に増殖している細胞に本発明の１つ以上の活性な遺伝子コピ
ーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドは、上記のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効
な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物を細胞に挿入
して、レトロウイルス（または、より好ましくは、アデノウイルスベクター）を
利用して処置する（参考として本明細書中に援用される、Ｇ Ｊ．Ｎａｂｅｌら
、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６を参照のこと）。最も好ましい実
施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして非増殖細胞を形
質転換せず、増殖細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形態において
、増殖している細胞に、単独で、または他のポリヌクレオチドとともに、もしく
は他のポリヌクレオチドと融合してのいずれかで挿入される本発明のポリヌクレ
オチドは、次いで、外部刺激（すなわち、磁性、特定の低分子、化学物質、また
は薬物投与など）により調節され得る。この刺激は、上記のポリヌクレオチドの
上流にあるプロモーターに作用して、コードされたタンパク質産物の発現を誘導
する。このようにして、本発明の有益な治療効果は、上記の外部刺激に基づいて
、明らかに調節され得る（すなわち、本発明の発現を増加、減少、または阻害す
るために）。
【０３９０】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質
をコードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパク質
の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧ
Ｆ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来の内皮細胞増殖因
子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖
因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロフ
ァージコロニー刺激因子、および一酸化窒素シンターゼが挙げられるが、これら
に限定されない。
をコードする他のポリヌクレオチドと一緒に投与され得る。脈管形成タンパク質
の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧ
Ｆ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよびβ、血小板由来の内皮細胞増殖因
子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖
因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロフ
ァージコロニー刺激因子、および一酸化窒素シンターゼが挙げられるが、これら
に限定されない。
【０３９１】
本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」により、遺伝子の転写の抑
制、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分
解、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後
修飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する
。
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」により、遺伝子の転写の抑
制、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分
解、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後
修飾の妨げ、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する
。
【０３９２】
異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、または裸の
ポリヌクレオチドとして、あるいは本明細書中全体を通して記載される任意の他
の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、
公知の遺伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌ
ｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス系（Ｃｈ
ａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５
））または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：
８１２（１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参考文献
は、例示にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増殖して
いる細胞に特異的に送達するか、またはそれをトランスフェクトし、そして非分
裂細胞を残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデ
ノウイルス（例えば、当該分野および本明細書中の他の箇所で記載される）送達
系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウイルス
ＤＮＡが必要であるので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要と
されるレトロウイルス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリ
ヌクレオチドのために、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺
伝子および構築物を、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正
常細胞を残す。
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、または裸の
ポリヌクレオチドとして、あるいは本明細書中全体を通して記載される任意の他
の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、
公知の遺伝子送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉｌ
ｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８５：３０１４）；ワクシニアウイルス系（Ｃｈ
ａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１９８５
））または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：
８１２（１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参考文献
は、例示にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増殖して
いる細胞に特異的に送達するか、またはそれをトランスフェクトし、そして非分
裂細胞を残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスまたはアデ
ノウイルス（例えば、当該分野および本明細書中の他の箇所で記載される）送達
系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウイルス
ＤＮＡが必要であるので、このレトロウイルスは、その生活環についての必要と
されるレトロウイルス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明のポリ
ヌクレオチドのために、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上記の遺
伝子および構築物を、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂性の正
常細胞を残す。
【０３９３】
本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時に
疾患部位に投与され得る。
【０３９４】
「細胞増殖性障害」により、任意のヒトもしくは動物の疾患または障害が、器
官、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒して
いることを意味される。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群
、もしくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
官、腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒して
いることを意味される。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群
、もしくは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
【０３９５】
本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置細胞の増殖に対して
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」により、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増
殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的
の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞の成長、動物および細胞
培養物における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価するこ
と、あるいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の１つよ
り多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能である。「
生物学的に阻害性の」により、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞の増
殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、標的
の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞の成長、動物および細胞
培養物における腫瘍成長に対する本発明のポリヌクレオチドの効果を評価するこ
と、あるいは当業者に公知の任意の他の方法により決定され得る。
【０３９６】
本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、上記の障害の１つ以
上を処置するために、哺乳動物患者（好ましくはヒト患者）に抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体）を生成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。この
ような抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように
薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
上を処置するために、哺乳動物患者（好ましくはヒト患者）に抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗
体および抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体）を生成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。この
ような抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように
薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３９７】
本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、例えば、補体（ＣＤＣ）
もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるように、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるように、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下により詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を知る。
【０３９８】
詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖性障害および／または分化障害を有するか、または発症し
ている被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量または
複数用量の抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、または結合体を投与する
工程を包含する。
れるように、細胞増殖性障害および／または分化障害を有するか、または発症し
ている被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量または
複数用量の抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、または結合体を投与する
工程を包含する。
【０３９９】
本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０４００】
本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に関する障害に関するイムノアッセイおよびその治療
の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ま
しくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×
１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×
１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ
、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、お
よび１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性を含む。
領域に対して、高親和性および／または強力なインビボ阻害抗体および／または
中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に関する障害に関するイムノアッセイおよびその治療
の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ま
しくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×
１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×
１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ
、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、お
よび１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性を含む。
【０４０１】
さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の
阻害を通じて、間接的に達成され得る（本明細書中に参考として援用される、Ｊ
ｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：
１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ
得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参
照のこと）。
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロファージ）の
阻害を通じて、間接的に達成され得る（本明細書中に参考として援用される、Ｊ
ｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）：
１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生じ
得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を参
照のこと）。
【０４０２】
本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
【０４０３】
本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物を含む）、またはその
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０４０４】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例え
ば、ポリペプチドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核
酸、毒素、またはプロドラッグを含む組成物）を、本発明のポリペプチドを発現
する、標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッ
グと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて
結合され得る。
ば、ポリペプチドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核
酸、毒素、またはプロドラッグを含む組成物）を、本発明のポリペプチドを発現
する、標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまた
はポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッ
グと、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて
結合され得る。
【０４０５】
本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、またはそのフラグメ
ントは、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドが「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答する
ように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公
知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のい
ずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強
する際に有用である。
ントは、増殖性抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドが「ワクチン接種」された場合、上記の抗原および免疫原に対して応答する
ように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公
知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のい
ずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強
する際に有用である。
【０４０６】
（心臓血管障害）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、末梢動脈疾患（例えば、足の虚血）を含む心臓血管
障害を処置し得る。
アンタゴニストを使用して、末梢動脈疾患（例えば、足の虚血）を含む心臓血管
障害を処置し得る。
【０４０７】
心臓血管障害には、心臓血管の異常（例えば、動脈−動脈フィステル（ａｒｔ
ｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉｓｔｕｌａ））、大脳動静脈奇形、先天性心
臓欠陥、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群が挙げられる。先天性心臓疾患
には、大動脈縮窄症、三房心、冠状管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ
ａｎｏｍａｒｙ）、交差心、右胸心、動脈管、エブスタイン奇形、アイゼンメン
ガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、
両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残および心臓中隔欠損（ｈｅａｒ
ｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床
欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室中隔欠損（ｖｅｎｔｒ
ｉｃｕｌａｒ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ））が挙げられる。
ｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉｓｔｕｌａ））、大脳動静脈奇形、先天性心
臓欠陥、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群が挙げられる。先天性心臓疾患
には、大動脈縮窄症、三房心、冠状管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ
ａｎｏｍａｒｙ）、交差心、右胸心、動脈管、エブスタイン奇形、アイゼンメン
ガー複合体、左心室発育不全症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、
両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残および心臓中隔欠損（ｈｅａｒ
ｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損、心内膜床
欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファロー三徴症、心室中隔欠損（ｖｅｎｔｒ
ｉｃｕｌａｒ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ））が挙げられる。
【０４０８】
心臓欠陥障害にはまた、例えば、以下の心臓疾患が挙げられる：不整脈、カル
チノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出量、心臓タンポナーデ、心内膜炎（細菌
を含む）、心動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困
難、心臓性水腫、心肥大、うっ血性心不全、左心室肥大、右心室肥大、梗塞形成
後破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心
室中隔破裂（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｅｐｔａｌ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心臓
弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性心外膜炎および
結核性心外膜炎を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性
心疾患、心室不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、シミター症候群、心血管
梅毒および心臓血管結核。
チノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出量、心臓タンポナーデ、心内膜炎（細菌
を含む）、心動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困
難、心臓性水腫、心肥大、うっ血性心不全、左心室肥大、右心室肥大、梗塞形成
後破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｈｅａｒｔ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心
室中隔破裂（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｓｅｐｔａｌ ｒｕｐｔｕｒｅ）、心臓
弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内膜液浸出、心外膜炎（梗塞性心外膜炎および
結核性心外膜炎を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、右心疾患、リウマチ性
心疾患、心室不全、充血、心臓血管妊娠合併症（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、シミター症候群、心血管
梅毒および心臓血管結核。
【０４０９】
不整脈には、以下が挙げられる：洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、
期外収縮、アダムス−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長
症候群（ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−
レヴァイン症候群、マハイム型早期興奮症候群、ウォルフ−パーキンソン−ホワ
イト症候群、洞不全症候群、頻脈および心室性細動。頻脈には以下が挙げられる
：発作性頻脈、上室性頻拍症、加速性心室固有調律、房室接合部性再入頻拍症、
異所性心房性頻脈、異所性接合部性頻拍症、洞房結節再入頻拍症、洞性頻脈、ト
ルサード ド ポアント（Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ Ｐｏｉｎｔｅｓ）および心
室性頻脈。
期外収縮、アダムス−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、ＱＴ延長
症候群（ｌｏｎｇ ＱＴ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、副収縮、ローン−ギャノング−
レヴァイン症候群、マハイム型早期興奮症候群、ウォルフ−パーキンソン−ホワ
イト症候群、洞不全症候群、頻脈および心室性細動。頻脈には以下が挙げられる
：発作性頻脈、上室性頻拍症、加速性心室固有調律、房室接合部性再入頻拍症、
異所性心房性頻脈、異所性接合部性頻拍症、洞房結節再入頻拍症、洞性頻脈、ト
ルサード ド ポアント（Ｔｏｒｓａｄｅｓ ｄｅ Ｐｏｉｎｔｅｓ）および心
室性頻脈。
【０４１０】
心臓弁疾患には以下が挙げられる：大動脈弁不全、大動脈弁狭窄症、心雑音（
ｈｅａｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、
僧帽弁閉鎖不全症、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁閉鎖不全症、肺動
脈弁狭窄症、三尖弁閉鎖症、三尖弁閉鎖不全症および三尖弁狭窄症。
ｈｅａｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、
僧帽弁閉鎖不全症、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁閉鎖不全症、肺動
脈弁狭窄症、三尖弁閉鎖症、三尖弁閉鎖不全症および三尖弁狭窄症。
【０４１１】
心筋疾患には以下が挙げられる：アルコール性心筋症、先天性心筋症、肥大型
心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャー
ガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌
流障害および心筋炎。
心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャー
ガス心筋症、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌
流障害および心筋炎。
【０４１２】
心筋虚血には以下が挙げられる：例えば、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠
動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞および気絶心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患。
動脈血栓症、冠動脈血管痙攣、心筋梗塞および気絶心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
ｓｔｕｎｎｉｎｇ）のような冠動脈疾患。
【０４１３】
心臓血管疾患には例えば、以下のような血管疾患もまた挙げられる：動脈瘤、
血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダウ疾患（病）、
クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管
運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈
閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈
炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症塞栓症、血栓症、先端紅痛
症、痔、肝静脈閉塞病（ｈｅｐａｔｉｃ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉ
ｓｅａｓｅ）、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞病（
ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、レー
ノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜血管閉塞、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、
毛細血管拡張失調症（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性
出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎および
静脈不全。
血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症状、ヒッペル−リンダウ疾患（病）、
クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管
運動神経性水腫、大動脈疾患、高安動脈炎、大動脈炎、ルリーシュ症候群、動脈
閉塞疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈
炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症塞栓症、血栓症、先端紅痛
症、痔、肝静脈閉塞病（ｈｅｐａｔｉｃ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉ
ｓｅａｓｅ）、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管疾患、静脈炎、肺静脈閉塞病（
ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、レー
ノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜血管閉塞、上大静脈症候群、毛細血管拡張症、
毛細血管拡張失調症（ａｔａｃｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ）、遺伝性
出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎および
静脈不全。
【０４１４】
動脈瘤には以下が挙げられる：解離性動脈瘤、偽性動脈瘤、感染性動脈瘤（ｉ
ｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｅｕｒｙｓｍ）、破裂性大動脈瘤、大動脈瘤、大脳動脈瘤
、冠動脈瘤、心臓動脈瘤（ｈｅａｒｔ ａｎｅｕｒｙｓｍ）および腸骨動脈瘤。
ｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｅｕｒｙｓｍ）、破裂性大動脈瘤、大動脈瘤、大脳動脈瘤
、冠動脈瘤、心臓動脈瘤（ｈｅａｒｔ ａｎｅｕｒｙｓｍ）および腸骨動脈瘤。
【０４１５】
動脈閉塞疾患には以下が挙げられる：動脈硬化、間欠性跛行、頸動脈狭窄、線
維筋性形成異常、腸間膜血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞およ
び閉塞性血栓性血管炎。
維筋性形成異常、腸間膜血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞およ
び閉塞性血栓性血管炎。
【０４１６】
脳血管障害には以下が挙げられる：頸動脈疾患、脳のアミロイドアンギオパチ
ー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾
患、大脳塞栓症、および大脳血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク
症候群、脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎ
ｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞形成、脳虚血（一過性脳虚血を含む
）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛および椎骨脳底
動脈循環不全症（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆｃｉｅｎｃｙ）
。
ー、大脳動脈瘤、大脳無酸素症、大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾
患、大脳塞栓症、および大脳血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク
症候群、脳出血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎ
ｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、大脳梗塞形成、脳虚血（一過性脳虚血を含む
）、鎖骨下動脈盗血症候群、脳室白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛および椎骨脳底
動脈循環不全症（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆｃｉｅｎｃｙ）
。
【０４１７】
塞栓症には以下が挙げられる：空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓
症、爪先チアノーゼ（ｂｌｕｅ ｔｏｅ）塞栓症、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症お
よび血栓閉塞症。血栓症には以下が挙げられる：冠状動脈血栓症、肝動脈血栓症
、網膜血管閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群および血栓性
静脈炎。
症、爪先チアノーゼ（ｂｌｕｅ ｔｏｅ）塞栓症、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症お
よび血栓閉塞症。血栓症には以下が挙げられる：冠状動脈血栓症、肝動脈血栓症
、網膜血管閉塞、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群および血栓性
静脈炎。
【０４１８】
虚血には以下が挙げられる：大脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群、前仕切
り症候群、心筋虚血、再灌流障害および末梢肢虚血。脈管炎には以下が挙げられ
る：大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔｓ）症候群、チャーグ−ス
トラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎
、シェーンライン−ヘノッホ紫斑病、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナ
ー肉芽腫症。
り症候群、心筋虚血、再灌流障害および末梢肢虚血。脈管炎には以下が挙げられ
る：大動脈炎、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔｓ）症候群、チャーグ−ス
トラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎
、シェーンライン−ヘノッホ紫斑病、アレルギー性皮膚血管炎およびヴェーゲナ
ー肉芽腫症。
【０４１９】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリぺプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、臨界肢虚血および冠状動脈疾患の処置に特に有効である。
アンタゴニストは、臨界肢虚血および冠状動脈疾患の処置に特に有効である。
【０４２０】
ポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない当該分野で公知の任意の
方法を用いて投与され得る：送達部位での直接的な針での注入、静脈内注入、局
所投与、カテーテル注入、微粒子銃ち注射器（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃ
ｔｏｒ）、粒子促進剤、ゲル状スポンジ貯蔵、他の市販の貯蔵物質、浸透ポンプ
、経口または坐剤用固体薬学的処方物、傾しゃまたは局所適用薬物手術、エアロ
ゾル送達。このような方法は当該分野で公知である。ポリペプチドは、以下によ
り詳細に記載される、薬学的処方物の部分として投与され得る。ポリヌクレオチ
ドを送達する方法が以下により詳細に記載される。
方法を用いて投与され得る：送達部位での直接的な針での注入、静脈内注入、局
所投与、カテーテル注入、微粒子銃ち注射器（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃ
ｔｏｒ）、粒子促進剤、ゲル状スポンジ貯蔵、他の市販の貯蔵物質、浸透ポンプ
、経口または坐剤用固体薬学的処方物、傾しゃまたは局所適用薬物手術、エアロ
ゾル送達。このような方法は当該分野で公知である。ポリペプチドは、以下によ
り詳細に記載される、薬学的処方物の部分として投与され得る。ポリヌクレオチ
ドを送達する方法が以下により詳細に記載される。
【０４２１】
（抗新脈管形成活性）
新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て起こるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
は、阻害影響が優勢である平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５
６：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下におい
て起こるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プ
ロセス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的
に定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）
の下において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は
病的になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する
。多くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼
の障害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏ
ｓｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎ
ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；
Ａｕｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１
（１９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ
．Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌ
ｋｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説
を参照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状
態に寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する
有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０４２２】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態およ
び転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに
当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ
ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限
定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置
の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処置の必要な個体
に投与する工程を包含する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために
、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アン
タゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺
癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌
、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲
状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫
；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾
患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限
定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび
／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のよ
うな癌を処置するために、局所送達され得る。
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態およ
び転移性状態には、本明細書に記載の悪性疾患、固形腫瘍、および癌、ならびに
当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ
ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限
定されない。従って、本発明は、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置
の方法を提供し、この方法は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを、その処置の必要な個体
に投与する工程を包含する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に処置するために
、種々のさらなる方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アン
タゴニストおよび／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺
癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌
、胆管癌、結腸癌、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲
状腺癌を含む固形腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；膠芽腫；カポージ肉腫
；平滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾
患；および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限
定されない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび
／またはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のよ
うな癌を処置するために、局所送達され得る。
【０４２３】
なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを
介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよう
に、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本
明細書中において議論される。
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを
介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよう
に、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本
明細書中において議論される。
【０４２４】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫
瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫
）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜
症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒ
ｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；
子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮
症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成
；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生
血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創
傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫
瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫
）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜
症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒ
ｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；
子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮
症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成
；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生
血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創
傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０４２５】
例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０４２６】
本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイドの発生を生じることが知られている状態（例えば、やけど）の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）の後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始
される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新
生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄
斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイドの発生を生じることが知られている状態（例えば、やけど）の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）の後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前に開始
される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、角膜新
生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖および黄
斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０４２７】
さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症
、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、
および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａ
ｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧ
ａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８
）による総説を参照のこと。
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟網膜症
、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍、
および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍａ
ｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）およびＧ
ａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７８
）による総説を参照のこと。
【０４２８】
従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織
である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢か
ら角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁され
るようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａ
ｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例え
ば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、
単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロ
セス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカ
リやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならび
にコンタクトレンズを装着することの合併症として。
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が、提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織
である。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢か
ら角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁され
るようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａ
ｃｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例え
ば、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、
単純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロ
セス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカ
リやけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならび
にコンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０４２９】
特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物に
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、そ
の純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記の
ように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい
実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーと
ともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形
成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治
療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有す
ることが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合に
おいて、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を
予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され得、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、そ
の純粋な形態で調製され得、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記の
ように調製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい
実施形態において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーと
ともに調製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形
成組成物は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治
療はまた、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有す
ることが公知である角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合に
おいて、処置（おそらくステロイドと組み合わせられる）は、その後の合併症を
予防するのを補助するために直ちに開始され得る。
【０４３０】
他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下
で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。
で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。
【０４３１】
本発明の別の局面において、患者に対して、血管の形成を阻害するように、治
療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはア
ゴニストを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法
が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態
を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、
前房角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によっ
て移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続
的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、
患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含
する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはア
ゴニストを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法
が提供される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態
を処置するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、
前房角（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によっ
て移植され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続
的に放出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、
患者に、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリ
ペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含
する、増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０４３２】
本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０４３３】
本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、患者に、治療有
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
効量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニ
ストを眼に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法
が、提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を
介して局所投与され得る。
【０４３４】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷
治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェー
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、
および血管接着。
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷
治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェー
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、
および血管接着。
【０４３５】
さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角
膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞
腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｃｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈
管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ
、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔ
ｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−
ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血
管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化
症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防す
ることによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍ
ｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ
ｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する
疾患。
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、黄斑変性、角
膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞
腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｃｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、脈
管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコーマ
、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔ
ｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー−
ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、血
管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬化
症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防す
ることによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍ
ｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ
ｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有する
疾患。
【０４３６】
産児制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供す
る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは
また、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置に
おける腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供す
る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは
また、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置に
おける腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０４３７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０４３８】
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を含む外科メッシュレーデン（ｌａｄｅ
ｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を
放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る
。
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュが、外科メ
ッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成組成物を含む外科メッシュレーデン（ｌａｄｅ
ｎ）は、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子を
放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得る
。
【０４３９】
本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血
管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫
瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラ
ッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切
除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、
投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態
において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手
術後に適用される。
管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫
瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラ
ッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切
除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、
投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態
において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手
術後に適用される。
【０４４０】
本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、
その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、
その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０４４１】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０４４２】
より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステ
ン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
ン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０４４３】
バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０４４４】
タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０４４５】
広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫
酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製され
る）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）
；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ス
テロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によっ
て、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリ
ンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チ
アプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）
；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトト
レキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリ
ン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキスト
リンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（
Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリ
ンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲ
ナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（
Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａ
ｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋ
ｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９
２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カ
ルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ
）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
。代表的な例としては、以下が挙げられる：血小板因子４；硫酸プロタミン；硫
酸化キチン誘導体（クイーンクラブ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の殻から調製され
る）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９１）
；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、ス
テロイド（例えば、エストロゲン）およびクエン酸タモキシフェンの存在によっ
て、増強され得る）；スタウロスポリン；基質代謝の調節因子（例えば、プロリ
ンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チ
アプロリン、α，α−ジピリジル，アミノプロピオニトリルフマレートを含む）
；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトト
レキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリ
ン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１７３２１〜１７３２６、１９９２）；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５〜４８０、１９９２）；シクロデキスト
リンテトラデカサルフェート；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（
Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５〜５５７、１９９０）；チオリ
ンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ、Ｊ．Ｃ
ｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０〜１４４６、１９８７）；アンチコラゲ
ナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２（４）：１６５９〜１６６４、１９８７）；ビサントレン（Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリウム（
Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏｒｏａ
ｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウム、すなわち「ＣＣＡ」；Ｔａｋ
ｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２〜３１６、１９９
２）；サリドマイド；Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カ
ルボキシアミノイミダゾール（ｃａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ
）；およびメタロプロテイナーゼインヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０４４６】
（細胞レベルでの疾患）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアンタゴニストもし
くはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポト
ーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を
有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵
臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、
神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨
肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、
これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫
関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘル
ペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植
片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施
形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアンタ
ゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍ
ｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
くはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポト
ーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を
有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、膵
臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌、
神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨
肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが、
これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレン
症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄ
ｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免疫
関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘル
ペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植
片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実施
形態において、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアンタ
ゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移（ｍ
ｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０４４７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下の
ような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉
腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リ
ンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、
横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細
胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、
ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経
膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫
、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されな
い）。
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下の
ような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉
腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リ
ンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、
横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細
胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、
ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経
膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫
、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されな
い）。
【０４４８】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連す
る疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイ
マー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および
脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シ
ェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅ
ｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス
および免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（
例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作お
よび再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓
傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）
および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるよう
なもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連す
る疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイ
マー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性および
脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シ
ェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅ
ｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデス
および免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群（
例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作お
よび再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝臓
傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害）
および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるよう
なもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４４９】
（創傷治癒および上皮細胞増殖）
本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例え
ば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激する
ため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するため
のプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、お
よびアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激すること
において臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮お
よび表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病
性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露ま
たは化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄
養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物お
よび代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症）。本発明のポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮
膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
ペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例え
ば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激する
ため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するため
のプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、お
よびアゴニストもしくはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激すること
において臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮お
よび表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病
性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露ま
たは化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄
養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物お
よび代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症）。本発明のポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮
膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０４５０】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増大
するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下
は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴ
ニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自
家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表
皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌ
ａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植
片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種
移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒ
ａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、
層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網
移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移
植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善す
るために使用され得る。
アンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増大
するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以下
は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴ
ニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：自
家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己表
皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕｌ
ａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移植
片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異種
移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇｒ
ａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片、
層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大網
移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層移
植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片。
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改善す
るために使用され得る。
【０４５１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａ
ｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化を
生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および
アゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏ
ｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅ
ｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺
、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本発明
のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニスト
は、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る
。
アンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍａ
ｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化を
生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および
アゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅｂｏ
ｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐｎｅ
ｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚、肺
、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本発明
のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニスト
は、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し得る
。
【０４５２】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の
毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細
胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
およびアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染
から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
アンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の
毒性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細
胞保護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
およびアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染
から生じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０４５３】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における
皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のよ
うな他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、表皮水
疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性
の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用
され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘
膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の
再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン
病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を
生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌ
ｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患
の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管
全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を
、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置す
るために使用され得る。
アンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における
皮膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のよ
うな他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、表皮水
疱症、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性
の水疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用
され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニスト
もしくはアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘
膜の内層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の
再生による治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン
病および潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を
生じる疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌ
ｆａｃｉｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患
の進行を予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管
全体の粘膜の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を
、摂取されたかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置す
るために使用され得る。
【０４５４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および
治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防
または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（
ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺
胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じ
る）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、本発明の
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニス
トを使用して効果的に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ
型の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における
硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾
患を処置または予防することを助け得る。
もしくはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および
治癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防
または処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（
ｂｒｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺
胞（ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じ
る）および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、本発明の
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニス
トを使用して効果的に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、およびアゴニストもしくはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ
型の増殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における
硝子膜疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾
患を処置または予防することを助け得る。
【０４５５】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニストもしくは
アンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝
臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよ
び毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅ
ｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じ
る肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
アンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝
臓疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよ
び毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅ
ｔｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じ
る肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０４５６】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、およびアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用
され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、い
くつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾患の持
続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使
用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくポリペプチド、および／ま
たはアゴニストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するため
の島細胞移植における補助として使用され得る。
もしくはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用
され得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、い
くつかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、および／またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、その疾患の持
続性の発現を緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使
用され得る。また、本発明のポリヌクレオチドもしくポリペプチド、および／ま
たはアゴニストまたはアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するため
の島細胞移植における補助として使用され得る。
【０４５７】
（神経学的疾患）
本発明のポリヌクレオチド、および／またはポリペプチド、およびアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷または
外傷の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の組成物（例えば
、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニスト）を用い手処置され得る神経系障害には、軸索の切断、ニューロンの減少
もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および、疾患ま
たは障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト
患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置され得る神経系病変には、
以下、または中枢神経系（脊髄、脳を含む）もしくは末梢神経系のいずれかの病
変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（ここで、神経系の
一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳
梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）；（２）外傷病
変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一
部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）；（３）悪性病変（ここで、神経
系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の悪性疾患のいず
れかである悪性組織により破壊または損傷される）；（４）感染性病変（ここで
、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破壊または損傷さ
れるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウ
イルスによる感染と関連するか、ライム病、結核、梅毒に関連する）；（５）変
性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセスの結果として破壊または損傷
され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病また
は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定
されない）；（６）ニューロン疾患または障害に関連する病変（ここで、神経系
の一部分は、ニューロン障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これ
には、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコー
ル弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコー
ル小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連
する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテ
マトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）；（８
）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変；な
らびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊
または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害
、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミ
エリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。
もしくはアンタゴニストは、脳および／または神経系の疾患、障害、損傷または
外傷の診断および／または処置のために使用され得る。本発明の組成物（例えば
、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニスト）を用い手処置され得る神経系障害には、軸索の切断、ニューロンの減少
もしくは変性、または脱髄のいずれかを引き起こす、神経系損傷および、疾患ま
たは障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って、患者（ヒト
患者および非ヒト哺乳動物患者を含む）において処置され得る神経系病変には、
以下、または中枢神経系（脊髄、脳を含む）もしくは末梢神経系のいずれかの病
変が挙げられるが、これらに限定されない：（１）虚血病変（ここで、神経系の
一部における酸素不足により、ニューロンの損傷または死が生じ、これには大脳
梗塞もしくは虚血、または脊髄梗塞もしくは虚血が挙げられる）；（２）外傷病
変（身体的損傷により生じるかまたは手術に関連する病変、例えば、神経系の一
部分を切断する病変、または圧縮損傷を含む）；（３）悪性病変（ここで、神経
系の一部分は、神経系関連悪性疾患もしくは非神経系組織由来の悪性疾患のいず
れかである悪性組織により破壊または損傷される）；（４）感染性病変（ここで
、神経系の一部分は、例えば、膿瘍による感染の結果として、破壊または損傷さ
れるか、あるいはヒト免疫不全ウイルス、帯状ヘルペスもしくは単純ヘルペスウ
イルスによる感染と関連するか、ライム病、結核、梅毒に関連する）；（５）変
性病変（ここで、神経系の一部分は、変性プロセスの結果として破壊または損傷
され、これには、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病また
は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に関連する変性が挙げられるが、これらに限定
されない）；（６）ニューロン疾患または障害に関連する病変（ここで、神経系
の一部分は、ニューロン障害または代謝障害によって破壊または損傷され、これ
には、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ病、タバコ−アルコー
ル弱視、マルキアファーヴァ−ビニャーミ病（脳梁の一次変性）およびアルコー
ル小脳変性が挙げられるが、これらに限定されない）；（７）全身性疾患に関連
する神経性病変（糖尿病（糖尿病性ニューロパシー、ベル麻痺）、全身性エリテ
マトーデス、癌または類肉腫症が挙げられるが、これらに限定されない）；（８
）毒性物質（アルコール、鉛または特定の神経毒を含む）により生じる病変；な
らびに（９）脱髄性病変（ここで、神経系の一部分は、脱髄性執権によって破壊
または損傷され、これには、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害
、横断脊髄障害または種々の病因、進行性多病巣性白質脳障害、および橋中央ミ
エリン溶解が挙げられるが、これらに限定されない）。
【０４５８】
一実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、神経細胞を底酸素症の損傷効果から保護する
ために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、神経細胞を大
脳底酸素症の損傷効果から保護するために用いられる。この実施形態によると、
本発明の組成物は、大脳底酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または予防する
ために用いられる。この実施形態の１つの非排他的な局面において、本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
大脳虚血に関連する神経細胞の損傷を処置または予防するために用いられる。こ
の実施形態の別の非排他的な局面において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳梗塞に関連する神経
細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
ニストもしくはアンタゴニストは、神経細胞を底酸素症の損傷効果から保護する
ために用いられる。さらに好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、
ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、神経細胞を大
脳底酸素症の損傷効果から保護するために用いられる。この実施形態によると、
本発明の組成物は、大脳底酸素症に関連する神経細胞損傷を処置または予防する
ために用いられる。この実施形態の１つの非排他的な局面において、本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
大脳虚血に関連する神経細胞の損傷を処置または予防するために用いられる。こ
の実施形態の別の非排他的な局面において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、大脳梗塞に関連する神経
細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０４５９】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作に関連する神経細胞損傷を処
置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作
に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作に関連する神経細胞損傷を処
置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、発作
に関連する神経細胞損傷を処置または予防するために用いられる。
【０４６０】
別の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、心臓発作に関連する神経細胞損傷
を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
心臓発作に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために使用される。
またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、心臓発作に関連する神経細胞損傷
を処置または予防するために用いられる。特定の実施形態において、本発明のポ
リペプチド、ポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、
心臓発作に関連する大脳神経細胞損傷を処置または予防するために使用される。
【０４６１】
神経系障害を処置または予防するのに有用な本発明の組成物は、ニューロンの
生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選
択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発す
る本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）培地におけるニュ
ーロンの増加した生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増
加した出芽；（３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、
運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコ
リンステラーゼ）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン
機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によ
って測定され得る。好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増
加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分
野で公知の方法（例えば、Ａｒａｋａｗａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３
５０７〜３５１５（１９９０））に記載される方法）を使用して慣用的に測定さ
れ得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔ
ｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢ
ｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１）
）に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生
は、当該分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオア
ッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノザンブロットアッセイなどによって、測定
され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現
（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価すること
によって、測定され得る。
生存または分化の促進における生物学的活性について試験することによって、選
択され得る。例えば、制限する目的ではないが、以下の効果のいずれかを誘発す
る本発明の組成物は、本発明によると有用であり得る：（１）培地におけるニュ
ーロンの増加した生存時間；（２）培地またはインビボにおけるニューロンの増
加した出芽；（３）培地またはインビボにおけるニューロン関連分子（例えば、
運動ニューロンに関して、コリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコ
リンステラーゼ）の増加した産生；あるいは（４）インビボにおけるニューロン
機能障害の軽減した症状。このような効果は、当該分野で公知の任意の方法によ
って測定され得る。好ましくは、非制限的な実施形態において、ニューロンの増
加した生存時間は、本明細書中に記載される方法、またはそうでなければ当該分
野で公知の方法（例えば、Ａｒａｋａｗａら（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：３
５０７〜３５１５（１９９０））に記載される方法）を使用して慣用的に測定さ
れ得；ニューロンの増加した出芽は、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｓｔ
ｒｏｎｋら（Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．７０：６５〜８２（１９８０））またはＢ
ｒｏｗｎら（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：１７〜４２（１９８１）
）に記載される方法）によって検出され得；ニューロン関連分子の増加した産生
は、当該分野で公知の技術を使用し、測定されるべき分子に基づいて、バイオア
ッセイ、酵素アッセイ、抗体結合、ノザンブロットアッセイなどによって、測定
され得；そして運動ニューロンの機能障害は、運動ニューロン障害の物理的発現
（例えば、弱さ、運動ニューロンの伝導速度、または機能障害）を評価すること
によって、測定され得る。
【０４６２】
特定の実施形態において、本発明に従って処置され得る運動ニューロン障害に
は、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、梗
塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、な
らびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症） が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症
、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児
期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならび
に遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられる
が、これらに限定されない。
は、運動ニューロンおよび神経系の他の成分に影響を与え得る障害（例えば、梗
塞、感染、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患、または悪性疾患）、な
らびにニューロンに選択的に影響する障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症） が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこれには、進行性脊髄性筋萎縮症
、進行性球延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮および若年性筋萎縮、小児
期の進行性球麻痺（ファチオ−ロンデ病）、ポリオおよびポリオ後症状、ならび
に遺伝性運動感覚性神経障害（シャルコー−マリー−トゥース病）が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０４６３】
さらに、本発明の組成物は、神経生存；シナプス形成；コンダクタンス；神経
分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明の組成物（ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストを含む）は、それら
の役割（学習および／または認識が挙げられるが、これらに限定されない）に関
連する疾患または障害を診断、および／または処置もしくは予防するために使用
され得る。本発明の組成物はまた、神経変性疾患状態および／または行動傷害の
処置または予防において有用であり得る。このような神経変性疾患状態および／
または行動傷害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツ
レット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、妄想症、強迫性障害、恐慌性障害、学
習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平
衡、および知覚の障害を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに
、本発明の組成物はまた、発生中の胚と関連する発達障害もしくは伴性障害の、
処置、予防および／または検出において役割を果たし得る。
分化などにおいて役割を果たし得る。従って、本発明の組成物（ポリヌクレオチ
ド、ポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニストを含む）は、それら
の役割（学習および／または認識が挙げられるが、これらに限定されない）に関
連する疾患または障害を診断、および／または処置もしくは予防するために使用
され得る。本発明の組成物はまた、神経変性疾患状態および／または行動傷害の
処置または予防において有用であり得る。このような神経変性疾患状態および／
または行動傷害には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ツ
レット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、妄想症、強迫性障害、恐慌性障害、学
習障害、ＡＬＳ、精神病、自閉、および行動変化（栄養補給、睡眠パターン、平
衡、および知覚の障害を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに
、本発明の組成物はまた、発生中の胚と関連する発達障害もしくは伴性障害の、
処置、予防および／または検出において役割を果たし得る。
【０４６４】
従って、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはアゴニストもしく
はアンタゴニストは、以下を含むが、それらに限定されない脳血管性障害関連す
る疾患、損傷、障害または外傷から神経細胞を保護する際に有用であり得る：頸
動脈疾患（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄症、またはモヤモヤ病）、脳のア
ミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳酸素欠乏症、大脳動脈硬化症、大脳
動脈奇形、大脳動脈疾患、大脳狭窄症および血栓症（例えば、頸動脈血栓症、洞
血栓症、またはヴァレンベルク症候群）、脳出血（例えば、硬膜上血腫もしくは
硬膜下血腫、またはクモ膜下出血）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性大脳虚血、鎖
骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞
性痴呆）、白斑性硬化症、室周および血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または偏
頭痛）。
はアンタゴニストは、以下を含むが、それらに限定されない脳血管性障害関連す
る疾患、損傷、障害または外傷から神経細胞を保護する際に有用であり得る：頸
動脈疾患（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄症、またはモヤモヤ病）、脳のア
ミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、大脳酸素欠乏症、大脳動脈硬化症、大脳
動脈奇形、大脳動脈疾患、大脳狭窄症および血栓症（例えば、頸動脈血栓症、洞
血栓症、またはヴァレンベルク症候群）、脳出血（例えば、硬膜上血腫もしくは
硬膜下血腫、またはクモ膜下出血）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性大脳虚血、鎖
骨下動脈盗血症候群、または椎骨脳底不全）、血管性痴呆（例えば、多発脳梗塞
性痴呆）、白斑性硬化症、室周および血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または偏
頭痛）。
【０４６５】
本発明のなおさらなる局面に従って、治療目的のため、例えば、神経学的細胞
増殖および／または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセ
スが提供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニス
トおよび／またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置および／または検出す
るために使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または障害の
マーカーまたはディテクターとして使用され得る。
増殖および／または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセ
スが提供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニス
トおよび／またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置および／または検出す
るために使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または障害の
マーカーまたはディテクターとして使用され得る。
【０４６６】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿
症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒ
ａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新
生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病
、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のよう
な小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ
病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周
囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎の
ようなびまん性脳硬化、脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄および
モヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、
大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およ
びヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血
腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈
盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、室
周白斑症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、群
発性頭痛のような血管性頭痛、偏頭痛、エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アル
ツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツ
ハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のよう
な血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セ
ントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、
急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球
性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣
を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・
間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのよう
な部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持
続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、ダンディ−ウォーカー症候群お
よび正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、
大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ ｐ
ｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患
、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ
痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎の
ような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、大
脳マラリア、クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性
髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステ
リア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性
脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のよう
な真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行
脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろう
のような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病
（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−
シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）大脳トキソプラスマ症、テン
ト下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈
絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜
新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副
腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｅｒｅ
ｂｒａｌ ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、
異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出
血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解
、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビス
ナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化
症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物の
ような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１
５ ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、
ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス
、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ロー
レンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ
病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着
症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラー
ダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬
化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎ
ｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアー
リ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊
椎のような脊髄癒合不全、シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感
覚ニューロン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッ
ヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感
覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候
群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発
作、難聴、部分聴覚欠失および大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび
耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、ブロカ失語症およびヴェル
ニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語
発達障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症の
ような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発
語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状
態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損、
運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオク
ローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群
のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経
麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエー
ン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、
球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻
痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全の
ような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視
覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィ
ン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のよう
な痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天
性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン
筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェ
ルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、
重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性
期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒａｍｙ
ｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端
肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、
Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性
交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系
疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患
、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱
視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋
麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視
および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のよ
うな眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫
、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖
尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー、手根管症候群のような神経圧搾症候
群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、
カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験
的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神
経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例え
ば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺
およびヴェルドニッヒ‐ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー
（先天性痛覚脱失および．家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐
骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
ゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿
症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒ
ａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新
生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病
、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のよう
な小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ
病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周
囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎の
ようなびまん性脳硬化、脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄および
モヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、
大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およ
びヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血
腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈
盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、室
周白斑症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、群
発性頭痛のような血管性頭痛、偏頭痛、エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アル
ツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツ
ハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のよう
な血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セ
ントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、
急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球
性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣
を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・
間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのよう
な部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持
続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、ダンディ−ウォーカー症候群お
よび正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、
大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ ｐ
ｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患
、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ
痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎の
ような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、大
脳マラリア、クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性
髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステ
リア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性
脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のよう
な真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行
脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろう
のような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病
（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−
シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）大脳トキソプラスマ症、テン
ト下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈
絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜
新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副
腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｅｒｅ
ｂｒａｌ ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、
異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出
血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解
、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビス
ナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化
症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物の
ような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１
５ ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、
ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス
、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ロー
レンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ
病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着
症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラー
ダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬
化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎ
ｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアー
リ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊
椎のような脊髄癒合不全、シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感
覚ニューロン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッ
ヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感
覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候
群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発
作、難聴、部分聴覚欠失および大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび
耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、ブロカ失語症およびヴェル
ニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語
発達障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症の
ような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発
語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状
態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損、
運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオク
ローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群
のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経
麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエー
ン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、
球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻
痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全の
ような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視
覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィ
ン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のよう
な痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天
性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン
筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェ
ルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、
重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性
期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒａｍｙ
ｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端
肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、
Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性
交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系
疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患
、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱
視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋
麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視
および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のよ
うな眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫
、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖
尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー、手根管症候群のような神経圧搾症候
群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、
カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験
的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神
経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例え
ば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺
およびヴェルドニッヒ‐ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー
（先天性痛覚脱失および．家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐
骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
【０４６７】
（感染性疾患）
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドならびにアゴニストまたはアン
タゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免
疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖およ
び分化を増加させることによって、感染性疾患が、処置、予防および／または診
断され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増加させるか、または新たな免
疫応答を開始させるかのいずれかにより、増加され得る。あるいは、本発明のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドならびにアゴニストまたはアンタゴニストは
また、必ずしも免疫応答を惹起することなく、その感染因子を直接阻害し得る。
タゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、免
疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖およ
び分化を増加させることによって、感染性疾患が、処置、予防および／または診
断され得る。この免疫応答は、既存の免疫応答を増加させるか、または新たな免
疫応答を開始させるかのいずれかにより、増加され得る。あるいは、本発明のポ
リヌクレオチドまたはポリペプチドならびにアゴニストまたはアンタゴニストは
また、必ずしも免疫応答を惹起することなく、その感染因子を直接阻害し得る。
【０４６８】
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび／あるいは
アゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または症状
を引き起こし得る、感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮ
ＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるが、それらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス
科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱ウイルス、ＥＢ
Ｖ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎ウイルス）、ヘルペ
スウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、帯状疱
疹ウイルス）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パ
ラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイル
ス科（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、お
よびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、
パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡ウ
イルスまたはワクシニアウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）
、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およ
びトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科内に入るウイルスは、
以下を含むがこれらに限定されない、種々の疾患または症状を引き起こし得る：
関節炎、細気管支炎、ＲＳウイルス、脳炎、眼の感染症（例えば、結膜炎、角膜
炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ型
）、日本脳炎、フニン、チクングニヤ、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和
見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻
疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風
疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発
明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタ
ゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれもが、処置または検出され
得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、あ
るいはアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置または検出するために使
用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（Ｂ型肝炎）。さら
なる特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ある
いはアゴニストまたはアンタゴニストは、１つ以上の他の市販の肝炎ワクチンに
応答性でない患者を処置するために使用される。さらに特定の実施形態において
、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、ＡＩＤＳを処置または検出するために使用される。
アゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または症状
を引き起こし得る、感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮ
ＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるが、それらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス
科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱ウイルス、ＥＢ
Ｖ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎ウイルス）、ヘルペ
スウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、帯状疱
疹ウイルス）、モノネガウイルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パ
ラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイル
ス科（例えば、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＢ型ウイルス、お
よびパラインフルエンザウイルス）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、
パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、痘瘡ウ
イルスまたはワクシニアウイルス）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）
、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およ
びトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）。これらの科内に入るウイルスは、
以下を含むがこれらに限定されない、種々の疾患または症状を引き起こし得る：
関節炎、細気管支炎、ＲＳウイルス、脳炎、眼の感染症（例えば、結膜炎、角膜
炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ型
）、日本脳炎、フニン、チクングニヤ、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和
見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻
疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風
疹、性感染病、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発
明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタ
ゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれもが、処置または検出され
得る。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、あ
るいはアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置または検出するために使
用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（Ｂ型肝炎）。さら
なる特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ある
いはアゴニストまたはアンタゴニストは、１つ以上の他の市販の肝炎ワクチンに
応答性でない患者を処置するために使用される。さらに特定の実施形態において
、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストまたはアンタゴ
ニストは、ＡＩＤＳを処置または検出するために使用される。
【０４６９】
同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチドおよび／あるいはアゴニストまたはアンタゴニストによって、処
置または検出され得る、細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性お
よびグラム陽性の細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない
：放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）（例えば、コリネバクテリウム
属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（例えば
、Ａｎｔｈｒａｘ、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ））、バクテ
ロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏ
ｍｙｃｏｓｉｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏ
ｒｒｅｌｉａ）（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブル
セラ（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏ
ｓｉｓ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、Ｄｅｒｍａｔ
ｏｃｙｃｏｓｅｓ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、腸毒性大腸菌および腸出
血性大腸菌）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（クレブ
シエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（
例えば、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、およびパラチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））、エリジペロスリックス属（Ｅ
ｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔ
ｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコプラスマ目
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｅｐｒａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ナイセリア科
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａｃｅａ）感染（例えば、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
）、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザ
Ｂ型）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））、シュードモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、クラ
ミジア科（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ ｓｐｐ．、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｎｉｎｇ
ｉｏｃｏｃｃａｌ、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、および連鎖球菌性
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）））。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定され
ない、以下の疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼の感染症
（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関
連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（
例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パ
ラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、Ａ型およびＢ型
の髄膜炎（ｍｅｎｇｉｔｉｓ））、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パ
ラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩
紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃ
ｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストは、これらの症状もし
くは疾患のいずれかを処置または検出するために使用され得る。特定の実施形態
において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストは、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎
を処置するために使用される。
はポリペプチドおよび／あるいはアゴニストまたはアンタゴニストによって、処
置または検出され得る、細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性お
よびグラム陽性の細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない
：放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）（例えば、コリネバクテリウム
属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ）、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、クリプトコックス・ネオフォルマンス
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、アスペルギルス属（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）（例えば
、Ａｎｔｈｒａｘ、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ））、バクテ
ロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏ
ｍｙｃｏｓｉｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏ
ｒｒｅｌｉａ）（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ブル
セラ（Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏ
ｓｉｓ）、クリプトコックス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、Ｄｅｒｍａｔ
ｏｃｙｃｏｓｅｓ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、腸毒性大腸菌および腸出
血性大腸菌）、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（クレブ
シエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（
例えば、腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、およびパラチフス
菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａ
ｔｉａ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ））、エリジペロスリックス属（Ｅ
ｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ
）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔ
ｏｓｐｉｒｏｓｉｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコプラスマ目
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｌｅｐｒａｅ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ナイセリア科
（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔ
ｏｂａｃｔｅｒ）、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉ
ｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌ
ａｃｅａ）感染（例えば、アクチノバチルス属（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
）、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザ
Ｂ型）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ））、シュードモナス属（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア科（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ）、クラ
ミジア科（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌ
ａ ｓｐｐ．、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｎｉｎｇ
ｉｏｃｏｃｃａｌ、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）、および連鎖球菌性
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）））。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定され
ない、以下の疾患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼の感染症
（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関
連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（
例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パ
ラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、Ａ型およびＢ型
の髄膜炎（ｍｅｎｇｉｔｉｓ））、クラミジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パ
ラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩
紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃ
ｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。本発明のポリヌクレオチドも
しくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニストは、これらの症状もし
くは疾患のいずれかを処置または検出するために使用され得る。特定の実施形態
において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストは、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／またはＢ型髄膜炎
を処置するために使用される。
【０４７０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患あるいは症
状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリーまたはクラスが挙げら
れるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリ
プトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交
疫、外部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕
虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症
、ならびにトリコモナスおよび胞子虫（例えば、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マ
ラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫）。これらの寄生生物
は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る
：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫
症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、
妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの
症状または疾患を処置または検出し得る。
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患あるいは症
状を引き起こす寄生生物性因子としては以下のファミリーまたはクラスが挙げら
れるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリ
プトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交
疫、外部寄生生物症（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫症、蠕
虫症、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症
、ならびにトリコモナスおよび胞子虫（例えば、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マ
ラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫）。これらの寄生生物
は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る
：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫
症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、
妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、任意のこれらの
症状または疾患を処置または検出し得る。
【０４７１】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者か
ら細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして患
者に操作した細胞を戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る
。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原と
して用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
はアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者か
ら細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして患
者に操作した細胞を戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る
。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原と
して用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４７２】
（再生）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織
の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照の
こと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰
瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害
、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、また
は保護し得る。
はアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織
の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照の
こと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰
瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害
、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、また
は保護し得る。
【０４７３】
本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
脈管（脈管およびリンパを含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、お
よび靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生
じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
脈管（脈管およびリンパを含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱、お
よび靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減されて生
じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０４７４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加し得る。例
えば、腱／靭帯再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置
され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損
を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例は、褥瘡性潰瘍、ならびに脈管不全
、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍を含む。
トもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加し得る。例
えば、腱／靭帯再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる。本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。処置
され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯欠損
を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例は、褥瘡性潰瘍、ならびに脈管不全
、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍を含む。
【０４７５】
同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得
る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的およ
び外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏ
ｋｅ））を含む。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例え
ば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神
経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎
縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて処置され得る。
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得
る疾患は、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械的およ
び外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（ｓｔｏ
ｋｅ））を含む。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神経障害（例え
ば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、および中枢神
経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎
縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本発明のポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニスト
を用いて処置され得る。
【０４７６】
（走化性）
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単
球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、および／また
は内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の
部位）に誘引または駆動する。次いで、駆動した細胞は、特定の外傷または異常
性を撃退および／または治癒し得る。
はアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単
球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞、および／また
は内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の
部位）に誘引または駆動する。次いで、駆動した細胞は、特定の外傷または異常
性を撃退および／または治癒し得る。
【０４７７】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの
走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させる
ことによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し
得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引する
ことによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性
分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る
。
はアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの
走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させる
ことによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し
得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引する
ことによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性
分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る
。
【０４７８】
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分
子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走
化性のインヒビターとして使用され得る。
はアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分
子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走
化性のインヒビターとして使用され得る。
【０４７９】
（結合活性）
本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子、またはポリペプチド
が結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと分子
との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化（アゴニスト）、
増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例とし
ては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または
低分子が挙げられる。
が結合する分子をスクリーニングするために使用され得る。ポリペプチドと分子
との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を活性化（アゴニスト）、
増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。そのような分子の例とし
ては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、レセプター）、または
低分子が挙げられる。
【０４８０】
好ましくは、分子は、ポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガンドのフ
ラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模
倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこ
と）。同様に、分子は、ポリペプチドが結合する天然のレセプター、または少な
くともポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、
活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術
を用いて合理的に設計され得る。
ラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは機能的模
倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）： 第５章（１９９１）を参照のこ
と）。同様に、分子は、ポリペプチドが結合する天然のレセプター、または少な
くともポリペプチドによって結合され得るレセプターのフラグメント（例えば、
活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても、分子は、公知の技術
を用いて合理的に設計され得る。
【０４８１】
好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、ポリペプチドを発現
する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、
酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次
いで、ポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細
胞膜）は、好ましくは、ポリペプチドまたは分子のいずれかの結合、刺激、また
は活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触される。
する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動物、
酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる。次
いで、ポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチドを含む細
胞膜）は、好ましくは、ポリペプチドまたは分子のいずれかの結合、刺激、また
は活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験化合物と接触される。
【０４８２】
アッセイは、ポリペプチドへの候補化合物の結合を簡単に試験し得、ここで結
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイにおい
て検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がポリペプチドへの結合によっ
て生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０４８３】
あるいは、アッセイは、細胞を含まない調製物、固体支持体に固定されたポリ
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ポリペプチドを含む溶液を候補化合物と混合する工程、
ポリペプチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分
子の活性または結合を、標準と比較する工程を簡単に包含し得る。
ペプチド／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され
得る。アッセイはまた、ポリペプチドを含む溶液を候補化合物と混合する工程、
ポリペプチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分
子の活性または結合を、標準と比較する工程を簡単に包含し得る。
【０４８４】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはポリペプチドとの基質に対する競合によって、ポ
リペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的な結合のいずれか、またはポリペプチドとの基質に対する競合によって、ポ
リペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０４８５】
さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．１（２）、第
５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングが利用さ
れ、そこでは、ポリアデニル化ＲＮＡが、そのポリペプチドに対して応答性の細
胞（例えば、ＦＧＦファミリータンパク質についての複数のレセプターを含有す
ることが知られるＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞）から調製され、そし
てこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーが、プールに分けられ、そし
てＣＯＳ細胞またはそのポリペプチドに対して応答性ではないその他の細胞をト
ランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトラン
スフェクトした細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露
される。このポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対
する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．１（２）、第
５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングが利用さ
れ、そこでは、ポリアデニル化ＲＮＡが、そのポリペプチドに対して応答性の細
胞（例えば、ＦＧＦファミリータンパク質についての複数のレセプターを含有す
ることが知られるＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞）から調製され、そし
てこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーが、プールに分けられ、そし
てＣＯＳ細胞またはそのポリペプチドに対して応答性ではないその他の細胞をト
ランスフェクトするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトラン
スフェクトした細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露
される。このポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対
する認識部位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０４８６】
固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再トランスフェクトし
て、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再トランスフェクトし
て、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０４８７】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識されたポリペプチドは
、細胞膜、またはレセプター分子を発現する抽出物調製物に光親和性連結され得
る。架橋した材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝
露される。そのポリペプチドのレセプターを含有するその標識した複合体は、切
り出され、ペプチドフラグメントへと分解され、そしてタンパク質微小配列決定
に供され得る。微小配列決定によって得られたそのアミノ酸配列は、縮重オリゴ
ヌクレオチドプローブのセットを設計するために使用され、ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
、細胞膜、またはレセプター分子を発現する抽出物調製物に光親和性連結され得
る。架橋した材料は、ＰＡＧＥ分析によって分解され、そしてＸ線フィルムに曝
露される。そのポリペプチドのレセプターを含有するその標識した複合体は、切
り出され、ペプチドフラグメントへと分解され、そしてタンパク質微小配列決定
に供され得る。微小配列決定によって得られたそのアミノ酸配列は、縮重オリゴ
ヌクレオチドプローブのセットを設計するために使用され、ｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーニングし、推定レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０４８８】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリ
ング」と呼ばれる）の技術は、本発明のポリペプチドの活性を調節するために利
用され得、それにより効果的に、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアン
タゴニストを生成する。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，
８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、お
よび同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈ
ａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６
−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢ
ｌａｓｃｏ，Ｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（
１９９８）を参照のこと（これらの各々の特許および刊行物が、本明細書中に参
考として援用される）。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドおよび対応
するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡ
シャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮ
Ａセグメントを、所望の分子に構築することを含む。別の実施形態において、本
発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがち
の（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方
法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施
形態において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓ
ｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の
１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどと組み換えられ得る。好ましい実施形態において、この異種分子は
、ファミリーメンバーである。さらに好ましい実施形態において、この異種分子
は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ
−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）
、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形態（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈ
ｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭ
Ｐ−６、ＢＭＰ−７．アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）ＡおよびＢ、デカペンタプ
レジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、
ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ
）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｔ
ＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子であ
る。
リング、および／またはコドンシャッフリング（集合的に、「ＤＮＡシャッフリ
ング」と呼ばれる）の技術は、本発明のポリペプチドの活性を調節するために利
用され得、それにより効果的に、本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアン
タゴニストを生成する。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，
８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、お
よび同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈ
ａｒａｙａｍａ，Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６
−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢ
ｌａｓｃｏ，Ｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（
１９９８）を参照のこと（これらの各々の特許および刊行物が、本明細書中に参
考として援用される）。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドおよび対応
するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡ
シャッフリングは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮ
Ａセグメントを、所望の分子に構築することを含む。別の実施形態において、本
発明のポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがち
の（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方
法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施
形態において、本発明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓ
ｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどは、１つ以上の異種分子の
１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどと組み換えられ得る。好ましい実施形態において、この異種分子は
、ファミリーメンバーである。さらに好ましい実施形態において、この異種分子
は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ
−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖因子（ＥＧＦ）
、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形態（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈ
ｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭ
Ｐ−６、ＢＭＰ−７．アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）ＡおよびＢ、デカペンタプ
レジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、
ドルサリン（ｄｏｒｓａｌｉｎ）、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ
）、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｔ
ＧＦ−β５、および神経膠由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子であ
る。
【０４８９】
他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活
性に類似の活性を示すが、必ずしも同一である必要はないフラグメントである。
フラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少された所望
されない活性を含み得る。
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活
性に類似の活性を示すが、必ずしも同一である必要はないフラグメントである。
フラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少された所望
されない活性を含み得る。
【０４９０】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
【０４９１】
別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターを結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターを結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９２】
これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、このポリペプチド／
分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者にお
ける特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、
アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産
生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、このポリペプチド／
分子を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者にお
ける特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、
アッセイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産
生を阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０４９３】
従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する
方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）このポリ
ペプチドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する
方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）このポリ
ペプチドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０４９４】
（標的化送達）
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドのレセプターを発現
する標的化細胞、または細胞結合型の本発明のポリペプチドを発現する細胞に、
組成物を送達する方法を提供する。
する標的化細胞、または細胞結合型の本発明のポリペプチドを発現する細胞に、
組成物を送達する方法を提供する。
【０４９５】
本明細書で議論されるように、本発明のポリペプチドまたは抗体は、疎水性相
互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、および／または共有結合相互作用
を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシン、またはプロドラッグと会合
し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会
合する本発明のポリペプチド（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組
成物の細胞への特定の送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明
は、治療タンパク質を標的化細胞に送達するための方法を提供する。別の例にお
いて、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または
二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームにて複
製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提
供する。
互作用、親水性相互作用、イオン性相互作用、および／または共有結合相互作用
を介して、異種ポリペプチド、異種核酸、トキシン、またはプロドラッグと会合
し得る。１つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会
合する本発明のポリペプチド（抗体を含む）を投与することによる、本発明の組
成物の細胞への特定の送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明
は、治療タンパク質を標的化細胞に送達するための方法を提供する。別の例にお
いて、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または
二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームにて複
製し得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提
供する。
【０４９６】
別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、本発明の
ポリペプチドまたは本発明の抗体）をトキシンまたは細胞傷害性プロドラッグと
組み合わせて投与することによる細胞の特定の破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）
のための方法が提供される。
ポリペプチドまたは本発明の抗体）をトキシンまたは細胞傷害性プロドラッグと
組み合わせて投与することによる細胞の特定の破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）
のための方法が提供される。
【０４９７】
「毒素」により、内因性細胞傷害性エフェクター系を結合および活性化させる
化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触
媒サブユニット、または任意の酵素もしくは酵素が、細胞死を引き起こす規定さ
れた条件下にある細胞に通常は存在しないか、または通常は細胞の表面に存在し
ない、任意の分子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒
素としては、当該分野で公知の放射性同位体、例えば、固有もしくは誘導された
内因性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体のような化合物（またはその補
体結合含有部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡアーゼ、α
毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、
サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇ
ｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａ
ｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「細胞傷
害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在するが、酵素により細胞傷害性化合
物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る
細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミ
ル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビ
ノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導
体が挙げられるが、これらに限定されない。
化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触
媒サブユニット、または任意の酵素もしくは酵素が、細胞死を引き起こす規定さ
れた条件下にある細胞に通常は存在しないか、または通常は細胞の表面に存在し
ない、任意の分子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒
素としては、当該分野で公知の放射性同位体、例えば、固有もしくは誘導された
内因性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体のような化合物（またはその補
体結合含有部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡアーゼ、α
毒素、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、
サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇ
ｅｌｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａ
ｒｃｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「細胞傷
害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在するが、酵素により細胞傷害性化合
物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用され得る
細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミ
ル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビ
ノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導
体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４９８】
（薬物スクリーニング）
本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された
化合物と接触する工程、および結合に続くこれらのポリペプチドの活性をアッセ
イする工程を包含する。
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有することが疑われる選択された
化合物と接触する工程、および結合に続くこれらのポリペプチドの活性をアッセ
イする工程を包含する。
【０４９９】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントの使用によって治療用化合物をスク
リーニングするために特に有用である。このような試験に利用されるポリペプチ
ドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得
、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニング
の１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸を用い
て安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。
薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリー
ニングされる。例えば、試験されている薬物と本発明のポリペプチドとの間の複
合体の処方物を測定し得る。
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントの使用によって治療用化合物をスク
リーニングするために特に有用である。このような試験に利用されるポリペプチ
ドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発現され得
、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリーニング
の１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核酸を用い
て安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利用する。
薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対してスクリー
ニングされる。例えば、試験されている薬物と本発明のポリペプチドとの間の複
合体の処方物を測定し得る。
【０５００】
従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤のためのスクリーニング方法を提供する。これら
の方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペプ
チドもしくはそのフラグメントと接触する工程、およびこの薬剤とこのポリペプ
チドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程
を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤
は、代表的に、標識化される。インキュベーションに続いて、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬剤と分離され、そして遊離または複合体化されていない標
識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
ぼす薬物または任意の他の薬剤のためのスクリーニング方法を提供する。これら
の方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペプ
チドもしくはそのフラグメントと接触する工程、およびこの薬剤とこのポリペプ
チドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする工程
を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる薬剤
は、代表的に、標識化される。インキュベーションに続いて、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬剤と分離され、そして遊離または複合体化されていない標
識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０５０１】
薬物スクリーニングのための別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適切
な結合親和性を有する化合物のための高処理能力スクリーニングを提供し、そし
て欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明
細書中に参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大
量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピン
または何らかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物は、本発明のポ
リペプチドと反応され、そして洗浄される。次いで、結合されたポリペプチドは
、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述
の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接被覆される。さら
に、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそ
れを固定化し得る。
な結合親和性を有する化合物のための高処理能力スクリーニングを提供し、そし
て欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本明
細書中に参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、大
量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピン
または何らかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物は、本発明のポ
リペプチドと反応され、そして洗浄される。次いで、結合されたポリペプチドは
、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述
の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接被覆される。さら
に、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持体上にそ
れを固定化し得る。
【０５０２】
本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０５０３】
（アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト））
特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列またはその相補鎖に、ならびに／あるいは表１において同定されるｃＤ
ＮＡプラスミドＺに含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実
施形態において、アンチセンス配列は、生物によって内部的に作製され、別の実
施形態において、このアンチセンス配列は、別に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏ
ｎｎｏｒ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｃｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセンス技術は、アンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じてか、または三重ヘリックス形成を通じて、遺伝
子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎ
ｏ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｃｙｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔ
ｏｎ、ＦＬ（１９８８）に記載される。三重ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：３０７３（１９７９
）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤ
ｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）に記載される。
これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基
づく。
れる配列またはその相補鎖に、ならびに／あるいは表１において同定されるｃＤ
ＮＡプラスミドＺに含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。１つの実
施形態において、アンチセンス配列は、生物によって内部的に作製され、別の実
施形態において、このアンチセンス配列は、別に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏ
ｎｎｏｒ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｄｅｏ
ｃｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８８）を参照のこと）。アンチセンス技術は、アンチセ
ンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じてか、または三重ヘリックス形成を通じて、遺伝
子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎ
ｏ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｃｙｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏ
ｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔ
ｏｎ、ＦＬ（１９８８）に記載される。三重ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅ
ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６：３０７３（１９７９
）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤ
ｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）に記載される。
これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基
づく。
【０５０４】
例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ ＴＲ
ＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レ
トロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される
（ＷＯ９１／１５５８０）。
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ ＴＲ
ＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レ
トロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される
（ＷＯ９１／１５５８０）。
【０５０５】
例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード領
域は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設
計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝
子の領域に相補的であるように設計され、それによってこのレセプターの転写お
よび産生を妨げる。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボで
ｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてこのｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチ
ドへの翻訳をブロックする。
域は、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設
計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝
子の領域に相補的であるように設計され、それによってこのレセプターの転写お
よび産生を妨げる。このアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボで
ｍＲＮＡにハイブリダイズし、そしてこのｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチ
ドへの翻訳をブロックする。
【０５０６】
１つの実施形態において、本発明のＢＭＰアンチセンス核酸は、外因性配列か
らの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転
写され、このことは、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じる。このよう
なベクターは、アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクター
は、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピソーム
性のままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは
、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは
、脊椎動物細胞における複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスま
たは当該分野において公知の他の物であり得る。本発明のポリペプチドをコード
する配列、またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物細胞（好ましくは、ヒト
細胞）において作用する、当該分野において公知の任意のプロモーターによって
であり得る。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。この
ようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔお
よびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４〜３１０（１９８１）、ラウ
ス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら
、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜７９７（１９８０）、ヘルペスチミジンプロモータ
ー（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７８
：１４４１〜１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒ
ｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２（１９８２））などが挙げ
られるがこれらに限定されない。
らの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転
写され、このことは、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じる。このよう
なベクターは、アンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクター
は、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピソーム
性のままであり得るか、または染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは
、当該分野で標準的な組換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは
、脊椎動物細胞における複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスま
たは当該分野において公知の他の物であり得る。本発明のポリペプチドをコード
する配列、またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物細胞（好ましくは、ヒト
細胞）において作用する、当該分野において公知の任意のプロモーターによって
であり得る。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であり得る。この
ようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔお
よびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４〜３１０（１９８１）、ラウ
ス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら
、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜７９７（１９８０）、ヘルペスチミジンプロモータ
ー（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７８
：１４４１〜１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒ
ｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２（１９８２））などが挙げ
られるがこれらに限定されない。
【０５０７】
本発明のアンチセンス核酸は、本発明の遺伝子のＲＮＡ転写物うちの少なくと
も一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性が好まれるが、必要ではな
い。本明細書中でいわれる、「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列は、Ｒ
ＮＡとハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を有する配
列を意味する；二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が、試験
され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は
、アンチセンス核酸の相補性および長さの両方の程度に依存する。一般に、ハイ
ブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩基のミスマッチが許容
され、それは、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を含み得、なおそ
れを形成し得る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための
標準的な手順の使用によって、ミスマッチの耐容可能な程度を確認し得る。
も一部に相補的な配列を含む。しかし、完全な相補性が好まれるが、必要ではな
い。本明細書中でいわれる、「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列は、Ｒ
ＮＡとハイブリダイズし、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を有する配
列を意味する；二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が、試験
され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は
、アンチセンス核酸の相補性および長さの両方の程度に依存する。一般に、ハイ
ブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩基のミスマッチが許容
され、それは、安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を含み得、なおそ
れを形成し得る。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための
標準的な手順の使用によって、ミスマッチの耐容可能な程度を確認し得る。
【０５０８】
メッセージの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの、およびこれを含む
５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効
率的に作用する。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、
ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが示されている。一般的には、
Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３〜３３５を参照
のこと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５’または３
’の翻訳されない非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、ア
ンチセンスアプローチにおいて内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用され
得る。このｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ
開始コドンの相補物を含む。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従
って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域に
ハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は
、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０
ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、この
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオ
チド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効
率的に作用する。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、
ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが示されている。一般的には、
Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：３３３〜３３５を参照
のこと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５’または３
’の翻訳されない非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、ア
ンチセンスアプローチにおいて内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用され
得る。このｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ
開始コドンの相補物を含む。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドは、翻訳のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従
って使用され得る。本発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域に
ハイブリダイズするように設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は
、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０
ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、この
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオ
チド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０５０９】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラ混
合物または誘導体または改変バージョンの一本鎖または二本鎖であり得る。この
オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを
改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にて改変され得る。この
オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボ
で宿主細胞のレセプターを標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８６、６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８８／
０９８１０（１９８８年１２月１５日に公開）を参照のこと）もしくは血液脳関
門（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日に
公開）を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション
誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６
：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、
１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）を含み得る
。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド
、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発（
ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤など）に結合体化され得る。
合物または誘導体または改変バージョンの一本鎖または二本鎖であり得る。この
オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを
改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にて改変され得る。この
オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボ
で宿主細胞のレセプターを標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８６、６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８８／
０９８１０（１９８８年１２月１５日に公開）を参照のこと）もしくは血液脳関
門（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日に
公開）を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション
誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６
：９５８〜９７６を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ、
１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）を含み得る
。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド
、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発（
ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤など）に結合体化され得る。
【０５１０】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない
群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フル
オロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル
、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒド
ロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリ
ジン、５−カルボキシメチルウアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−
Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−
メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチル
アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ
６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メ
トキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’
−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ
−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブト
キシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２
−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、
ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、
５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプ
ロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フル
オロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル
、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒド
ロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリ
ジン、５−カルボキシメチルウアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−
Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−
メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチル
アデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ
６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メ
トキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’
−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ
−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブト
キシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２
−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、
ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、
５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプ
ロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０５１１】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの改変糖部分を
含み得る。この糖部分は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロ
ース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される。
含み得る。この糖部分は、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロ
ース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない群から選択される。
【０５１２】
なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも
１つの改変リン酸骨格を含む。この改変リン酸骨格は、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホ
ルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホ
ルムアセタール、またはそれらのアナログを含むが、これらに限定されない群か
ら選択される。
１つの改変リン酸骨格を含む。この改変リン酸骨格は、ホスホロチオエート、ホ
スホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホ
ルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホ
ルムアセタール、またはそれらのアナログを含むが、これらに限定されない群か
ら選択される。
【０５１３】
なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲ
ＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のｂ−単位とは反
対に、鎖は、互いに対して平行に進行する（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５：
３２７−３３０）である。
ーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲ
ＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のｂ−単位とは反
対に、鎖は、互いに対して平行に進行する（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕ
ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオ
チドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮＡ
−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５：
３２７−３３０）である。
【０５１４】
本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動
化ＤＮＡ合成器（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓなどから市販される自動化ＤＮＡ合成器）の使用による）によって合成
され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがＳｔｅｉｎらの方
法によって合成され得（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３
２０９）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドが制御孔ガラスポリマー支持
体の使用によって調製され得る（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１）などの使用に
より調製され得る。
化ＤＮＡ合成器（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓなどから市販される自動化ＤＮＡ合成器）の使用による）によって合成
され得る。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがＳｔｅｉｎらの方
法によって合成され得（１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３
２０９）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドが制御孔ガラスポリマー支持
体の使用によって調製され得る（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−７４５１）などの使用に
より調製され得る。
【０５１５】
コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写
された非翻訳領域に対して相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
された非翻訳領域に対して相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０５１６】
本発明による潜在的なアンタゴニストはまた、触媒性ＲＮＡ、またはリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが
ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が
好ましい。ハンマーへッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成す
る隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。ただ１つの要件は、
標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマ
ーヘッドリボザイムの構築および生成は、当該分野で周知であり、そしてＨａｓ
ｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１
９８８）においてより十分に記載されている。配列番号Ｘのヌクレオチド配列内
には、多数の潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する。好ましく
は、このリボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するよう
に、すなわち、効率を増大させ、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を
最少化するように、操作される。
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが
ｍＲＮＡを破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が
好ましい。ハンマーへッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成す
る隣接領域によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。ただ１つの要件は、
標的ｍＲＮＡが以下の２塩基配列５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマ
ーヘッドリボザイムの構築および生成は、当該分野で周知であり、そしてＨａｓ
ｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１
９８８）においてより十分に記載されている。配列番号Ｘのヌクレオチド配列内
には、多数の潜在的なハンマーヘッドリボザイム切断部位が存在する。好ましく
は、このリボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端近傍に位置するよう
に、すなわち、効率を増大させ、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を
最少化するように、操作される。
【０５１７】
アンチセンスアプローチにおけるように、本発明のリボザイムは、改変オリゴ
ヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）で構成され得、そし
てインビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞に送達されるはずである。こ
のリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの
導入について上述したのと同じ様式で、細胞に導入され得る。好ましい送達方法
は、強い構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏ
ｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、このリボザイムを「コードする」
ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクト細胞が、内因性のメッセージを破壊し
、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成することを包含する。
リボザイムは、アンチセンス分子とは異なって触媒性であるので、より低い細胞
内濃度が効率化のために必要とされる。
ヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）で構成され得、そし
てインビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞に送達されるはずである。こ
のリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの
導入について上述したのと同じ様式で、細胞に導入され得る。好ましい送達方法
は、強い構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏ
ｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、このリボザイムを「コードする」
ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクト細胞が、内因性のメッセージを破壊し
、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成することを包含する。
リボザイムは、アンチセンス分子とは異なって触媒性であるので、より低い細胞
内濃度が効率化のために必要とされる。
【０５１８】
アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、
それにより異常な細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ
ｉｏｎ）を（例えば、腫瘍形成または増殖において）遅延または防止する。
する本発明のポリペプチドの細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍のアゴニストを刺激し、
それにより異常な細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔ
ｉｏｎ）を（例えば、腫瘍形成または増殖において）遅延または防止する。
【０５１９】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を阻害し得、そ
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求さ
れ得る。
して水晶体嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術
後の上皮レンズ細胞の増殖を防止する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活
性の防止はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求さ
れ得る。
【０５２０】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
防止し得る。
防止し得る。
【０５２１】
アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。
処置し得る。
【０５２２】
従って、本発明は、障害または疾患（本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に
関連する、本願の全体に渡って列挙される障害または疾患が含まれるが、これら
に限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたアンチセン
ス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたリボザイ
ムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。
関連する、本願の全体に渡って列挙される障害または疾患が含まれるが、これら
に限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたアンチセン
ス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたリボザイ
ムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。
【０５２３】
（他の活性）
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、
血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生
を刺激するための処置において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌク
レオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論される
ように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
は、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、
血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生
を刺激するための処置において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌク
レオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論される
ように新脈管形成および肢の再形成を刺激し得る。
【０５２４】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
を、傷害、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の処置にもまた利
用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞お
よび骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえダメージを受けた組
織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
を、傷害、熱傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の処置にもまた利
用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞お
よび骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえダメージを受けた組
織または疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０５２５】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経
変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複
合体）において生じるニューロンのダメージを処置および予防するために利用し
得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニ
ストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形
成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され
得る。
はまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経
変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＡＩＤＳ関連複
合体）において生じるニューロンのダメージを処置および予防するために利用し
得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニ
ストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、骨および歯周の再形
成を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における補助のために利用され
得る。
【０５２６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する
皮膚の老化を予防し得る。
をまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する
皮膚の老化を予防し得る。
【０５２７】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメ
ンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからであ
る。同じ系列にそって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場
合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
をまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメ
ンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからであ
る。同じ系列にそって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場
合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０５２８】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または始原組織の細胞培養を支
持するために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。
をまた利用して、移植前の器官を維持し得るか、または始原組織の細胞培養を支
持するために使用し得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織
を誘導するために利用され得る。
【０５２９】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増
殖を増加または減少し得る。
はまた、先に議論されるように造血系統に加えて、胚性幹細胞の分化もしくは増
殖を増加または減少し得る。
【０５３０】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組
織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するため
に使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、および
エネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る
。
はまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組
織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するため
に使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、および
エネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る
。
【０５３１】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑
うつ性の障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、ア
クチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レ
ベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことに
よって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
は、バイオリズム、カリカディック（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑
うつ性の障害を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、ア
クチビンまたはインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レ
ベル、食欲、性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことに
よって、哺乳動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０５３２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミ
ン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品
添加物または保存剤として使用され得る。
はまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミ
ン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品
添加物または保存剤として使用され得る。
【０５３３】
上記で引用される適用は、広範な種々の宿主において使用されている。そのよ
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
うな宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、
マウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ ｐｉｇ）、ニワト
リ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられる
が、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサギ
、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌまた
はネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好ま
しい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０５３４】
（他の好ましい実施形態）
本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそ
れに対する相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中の少なくとも約５０
の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配
列を含む、単離された核酸分子を含む。
れに対する相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中の少なくとも約５０
の連続したヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配
列を含む、単離された核酸分子を含む。
【０５３５】
連続するヌクレオチドの上記配列が、表１の配列番号Ｘについて同定される位
置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列中に含まれる、核酸分子もまた好ま
しい。
置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列中に含まれる、核酸分子もまた好ま
しい。
【０５３６】
配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列中の、少なくとも約１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ま
しい。
オチド配列中の、少なくとも約１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ま
しい。
【０５３７】
配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列中の、少なくとも約５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子はさらに好
ましい。
オチド配列中の、少なくとも約５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子はさらに好
ましい。
【０５３８】
さらに好ましい実施形態は、表１の配列番号Ｘについて同定された位置の範囲
で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む、核酸分子である。
で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む、核酸分子である。
【０５３９】
さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃ
ＤＮＡプラスミドＺの完全ヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸配列である。
ＤＮＡプラスミドＺの完全ヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸配列である。
【０５４０】
配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズする、単離された核酸分子もまた好ましい。ここで、ハイブ
リダイズする核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
、Ａ残基のみまたはＴ残基のみから構成されるヌクレオチド配列を有する核酸分
子にハイブリダイズしない。
オチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズする、単離された核酸分子もまた好ましい。ここで、ハイブ
リダイズする核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
、Ａ残基のみまたはＴ残基のみから構成されるヌクレオチド配列を有する核酸分
子にハイブリダイズしない。
【０５４１】
ｃＤＮＡプラスミドＺを含むＤＮＡ分子を含む物質の組成物もまた好ましい。
【０５４２】
ｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の、少なくとも５０の連続するヌ
クレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単
離された核酸分子もまた好ましい。
クレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単
離された核酸分子もまた好ましい。
【０５４３】
少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列が、ｃＤＮＡプラスミドＺによ
りコードされるオープンリーディングフレーム配列のヌクレオチド配列中に含ま
れる、単離された核酸分子もまた好ましい。
りコードされるオープンリーディングフレーム配列のヌクレオチド配列中に含ま
れる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５４４】
ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列中の、少なくとも
１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５４５】
さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレ
オチド配列中の、少なくとも５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なくと
も９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
オチド配列中の、少なくとも５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なくと
も９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０５４６】
さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされる完全ク
レオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸分子である。
レオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸分子である。
【０５４７】
さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列
、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列からなる群
から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプ
ルにおいて検出するための方法である。ここで、この方法は、上記サンプル中の
、少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列と、上記群から選択される配列
とを比較する工程、およびサンプル中の核酸分子の配列が、選択された配列に、
少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列からなる群
から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプ
ルにおいて検出するための方法である。ここで、この方法は、上記サンプル中の
、少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列と、上記群から選択される配列
とを比較する工程、およびサンプル中の核酸分子の配列が、選択された配列に、
少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０５４８】
配列を比較する上記工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記群から選択さ
れる配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度を決定する
工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記工程が
、上記サンプル中の核酸分子から決定されたヌクレオチド配列と、上記群から選
択された配列とを比較することにより行われる、上記方法もまた好ましい。核酸
分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
れる配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度を決定する
工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記工程が
、上記サンプル中の核酸分子から決定されたヌクレオチド配列と、上記群から選
択された配列とを比較することにより行われる、上記方法もまた好ましい。核酸
分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５４９】
さらに好ましい実施形態は、生物学的サンプルの種、組織型または細胞型を同
定するための方法であり、この方法は、このサンプル中の核酸分子（もしあれば
、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミド
Ｚによりコードされるヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少
なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、
ヌクレオチド配列を含む）を検出する工程を包含する。
定するための方法であり、この方法は、このサンプル中の核酸分子（もしあれば
、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミド
Ｚによりコードされるヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少
なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、
ヌクレオチド配列を含む）を検出する工程を包含する。
【０５５０】
生物学的サンプルの種、組織型または細胞型を同定する方法は、少なくとも２
つのヌクレオチド配列のパネルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得る。ここで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上
記群から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に
、少なくとも９５％同一である。
つのヌクレオチド配列のパネルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得る。ここで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上
記群から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に
、少なくとも９５％同一である。
【０５５１】
配列番号Ｘもしくはその相補鎖、またはタンパク質をコードするｃＤＮＡプラ
スミドＺのヌクレオチド配列の異常な構造または発現と関連する病理状態を、被
験体において診断するための方法もまた好ましい。ここで、この方法は、核酸分
子（もしあれば、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤ
ＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少な
くとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、ヌ
クレオチド配列を含む）を、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて
検出する工程を包含する。
スミドＺのヌクレオチド配列の異常な構造または発現と関連する病理状態を、被
験体において診断するための方法もまた好ましい。ここで、この方法は、核酸分
子（もしあれば、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤ
ＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少な
くとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、ヌ
クレオチド配列を含む）を、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて
検出する工程を包含する。
【０５５２】
病理状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネ
ルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得る。こ
こで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の
、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であ
る。
ルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得る。こ
こで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の
、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であ
る。
【０５５３】
上記の核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列の
パネルを含む、単離された核酸分子を含む組成物もまた好ましく、ここで上記の
パネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列中の少
なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である：配
列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖およびｃＤＮＡプラスミ
ド：Ｄによってコードされるヌクレオチド配列。核酸分子は、ＤＮＡ分子または
ＲＮＡ分子を含み得る。
パネルを含む、単離された核酸分子を含む組成物もまた好ましく、ここで上記の
パネル中の少なくとも１つの配列は、以下からなる群から選択される配列中の少
なくとも５０の連続したヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である：配
列番号Ｘのヌクレオチド配列またはそれに対する相補鎖およびｃＤＮＡプラスミ
ド：Ｄによってコードされるヌクレオチド配列。核酸分子は、ＤＮＡ分子または
ＲＮＡ分子を含み得る。
【０５５４】
配列番号Ｙのポリペプチド；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされ
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に、少なくとも９０
％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に、少なくとも９０
％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５５５】
配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされ
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％
同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％
同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５５６】
配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされ
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５
％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
るポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポ
リペプチド中の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５
％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０５５７】
配列番号Ｙの完全なアミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコー
ドされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードさ
れるポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポ
リペプチドはさらに好ましい。
ドされるポリペプチドおよび／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードさ
れるポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポ
リペプチドはさらに好ましい。
【０５５８】
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチドの完全なアミノ酸
配列中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一の
アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
配列中の少なくとも約１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一の
アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０５５９】
上記連続したアミノ酸の配列が、ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされ
る上記ポリペプチド；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペ
プチドおよび／または配列番号Ｙのポリペプチド配列の一部分のアミノ酸配列に
含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
る上記ポリペプチド；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペ
プチドおよび／または配列番号Ｙのポリペプチド配列の一部分のアミノ酸配列に
含まれる、ポリペプチドもまた好ましい。
【０５６０】
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中
の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一のアミノ
酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
の少なくとも約３０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一のアミノ
酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５６１】
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中
の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一のアミ
ノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
の少なくとも約１００の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９５％同一のアミ
ノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５６２】
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好
ましい。
【０５６３】
以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチ
ド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して
特異的に結合する単離された抗体は、さらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチ
ド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよび
ｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。
【０５６４】
生物学的サンプル中で、以下からなる群から選択される配列中の、少なくとも
１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチドを検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配
列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤ
ＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド；この方法は、上記サン
プル中の少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を上記群から選択さ
れた配列と比較する工程、および上記サンプル中のポリペプチド分子の配列が、
少なくとも１０の連続したアミノ酸の上記配列と少なくとも９０％同一であるか
否かを決定する工程を包含する。
１０の連続したアミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチドを検出する方法はさらに好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配
列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤ
ＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド；この方法は、上記サン
プル中の少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を上記群から選択さ
れた配列と比較する工程、および上記サンプル中のポリペプチド分子の配列が、
少なくとも１０の連続したアミノ酸の上記配列と少なくとも９０％同一であるか
否かを決定する工程を包含する。
【０５６５】
上記サンプル中の少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列を、上記
群から選択された配列と比較する上記工程が、上記サンプル中のポリペプチドの
、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０の連続したアミノ酸の
配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと
特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む、上記
の方法もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその
相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：Ｚによっ
てコードされるポリペプチド。
群から選択された配列と比較する上記工程が、上記サンプル中のポリペプチドの
、以下からなる群から選択された配列中の少なくとも１０の連続したアミノ酸の
配列に対して、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドと
特異的に結合する抗体に対する特異的な結合の程度を決定する工程を含む、上記
の方法もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその
相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：Ｚによっ
てコードされるポリペプチド。
【０５６６】
配列を比較する上記工程が、上記サンプル中のポリペプチド分子から決定され
たアミノ酸配列を、上記群から選択された配列と比較することによって行われる
、上記の方法もまた好ましい。
たアミノ酸配列を、上記群から選択された配列と比較することによって行われる
、上記の方法もまた好ましい。
【０５６７】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定するための方法もまた好まし
く、この方法は、上記サンプル中のポリペプチド分子（このポリペプチドは、存
在するならば、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続し
たアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む：配列番号
Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリ
ペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド）を
検出する工程を包含する。
く、この方法は、上記サンプル中のポリペプチド分子（このポリペプチドは、存
在するならば、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続し
たアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む：配列番号
Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリ
ペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド）を
検出する工程を包含する。
【０５６８】
生物学的サンプルの種、組織または細胞型を同定するための上記の方法もまた
好ましく、この方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を包含し、ここで、上記パネル中
の少なくとも１つの配列は、上記群から選択された配列中の少なくとも１０の連
続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
好ましく、この方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を検出する工程を包含し、ここで、上記パネル中
の少なくとも１つの配列は、上記群から選択された配列中の少なくとも１０の連
続したアミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である。
【０５６９】
被験体において、表１において同定された、ポリペプチドをコードする核酸配
列の、異常な構造または発現に関連する病理学的状態を診断するための方法もま
た好ましい。ここで、この方法は、上記被験体から得られた生物学的サンプルに
おいて、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド分子を検出する工程を包含し、ここで、上記パネル中の少なくとも１
つの配列は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続した
アミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのポリペプチド配列
；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド これらの方法のいずれかにおいて、上記ポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用することを包含する。
列の、異常な構造または発現に関連する病理学的状態を診断するための方法もま
た好ましい。ここで、この方法は、上記被験体から得られた生物学的サンプルに
おいて、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネルにおけるアミノ酸配列を含むポ
リペプチド分子を検出する工程を包含し、ここで、上記パネル中の少なくとも１
つの配列は、以下からなる群から選択される配列中の少なくとも１０の連続した
アミノ酸の配列と少なくとも９０％同一である：配列番号Ｙのポリペプチド配列
；配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド これらの方法のいずれかにおいて、上記ポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を使用することを包含する。
【０５７０】
以下からなる群から選択された配列中の、少なくとも１０の連続したアミノ酸
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番
号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラス
ミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。
の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番
号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラス
ミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。
【０５７１】
ポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列が、原核生物宿主での上記ポ
リペプチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ま
しい。
リペプチドの発現について最適化されている、単離された核酸分子もまた、好ま
しい。
【０５７２】
上記ポリペプチドが以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離
された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘま
たはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：
Ｚによってコードされるポリペプチド。
された核酸分子もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘま
たはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡプラスミド：
Ｚによってコードされるポリペプチド。
【０５７３】
上記の単離された核酸分子のいずれかをベクター中に挿入する工程を含む、組
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって産生された組換え
ベクターもまた好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え
宿主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって産生された組換え宿主細胞
もまた好ましい。
換えベクターの作製方法はさらに好ましい。この方法によって産生された組換え
ベクターもまた好ましい。宿主細胞中にベクターを導入する工程を含む、組換え
宿主細胞を作製する方法、ならびにこの方法によって産生された組換え宿主細胞
もまた好ましい。
【０５７４】
単離されたポリペプチドを作製する方法であって、上記ポリペプチドが発現さ
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、および上記ポリペプチ
ドを回収する工程を包含する方法もまた好ましい。単離されたポリペプチドを作
製するこの方法であって、ここで、上記組換え宿主細胞が真核生物細胞であり、
そして上記ポリペプチドが、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む
ヒトタンパク質である、方法もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；
配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡ
プラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。この方法によって産生され
た単離されたポリペプチドもまた好ましい。
れるような条件下でこの組換え宿主細胞を培養する工程、および上記ポリペプチ
ドを回収する工程を包含する方法もまた好ましい。単離されたポリペプチドを作
製するこの方法であって、ここで、上記組換え宿主細胞が真核生物細胞であり、
そして上記ポリペプチドが、以下からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む
ヒトタンパク質である、方法もまた好ましい：配列番号Ｙのポリペプチド配列；
配列番号Ｘまたはその相補鎖によってコードされるポリペプチドおよびｃＤＮＡ
プラスミド：Ｚによってコードされるポリペプチド。この方法によって産生され
た単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５７５】
増加したレベルのタンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた好ま
しく、この方法は、このような個体に、上記個体において上記タンパク質の活性
のレベルを増加させるに有効な本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、免疫原性フラグメントもしくはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗
原結合フラグメントの治療的有効量を投与する工程を包含する。
しく、この方法は、このような個体に、上記個体において上記タンパク質の活性
のレベルを増加させるに有効な本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、免疫原性フラグメントもしくはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗
原結合フラグメントの治療的有効量を投与する工程を包含する。
【０５７６】
減少したレベルのタンパク質活性を必要とする個体を処置する方法もまた好ま
しく、この方法は、このような個体に、上記個体において上記タンパク質の活性
のレベルを減少させるに有効な本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、免疫原性フラグメントもしくはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗
原結合フラグメントの治療的有効量を投与する工程を包含する。
しく、この方法は、このような個体に、上記個体において上記タンパク質の活性
のレベルを減少させるに有効な本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレ
オチド、免疫原性フラグメントもしくはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗
原結合フラグメントの治療的有効量を投与する工程を包含する。
【０５７７】
本発明の具体的な実施形態において、表２の４列目に列挙される「コンティグ
ＩＤ」の各々について、好ましくは、表２の５列目に参照され、そして一般式ａ
−ｂ（ここで、ａおよびｂは、表２の３列目に参照される対応する配列番号Ｘに
ついて独自に決定される）によって記載される、ヌクレオチド配列を含むかまた
はそれらからなる１つ以上のポリヌクレオチドが排除される。さらに具体的な実
施形態は、表２の５列目に参照される１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上
の特定のポリヌクレオチド配列を除くポリヌクレオチド配列に関する。この列挙
は、単に代表的な例であって、この一般式によって除去され得る全ての配列を包
含することを決して意図しない。これらの受託物を通して入手可能な全ての参考
文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
ＩＤ」の各々について、好ましくは、表２の５列目に参照され、そして一般式ａ
−ｂ（ここで、ａおよびｂは、表２の３列目に参照される対応する配列番号Ｘに
ついて独自に決定される）によって記載される、ヌクレオチド配列を含むかまた
はそれらからなる１つ以上のポリヌクレオチドが排除される。さらに具体的な実
施形態は、表２の５列目に参照される１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上
の特定のポリヌクレオチド配列を除くポリヌクレオチド配列に関する。この列挙
は、単に代表的な例であって、この一般式によって除去され得る全ての配列を包
含することを決して意図しない。これらの受託物を通して入手可能な全ての参考
文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０５７８】
【表２】
概して、本発明を記載してきたが、本発明は、例示の目的のために提供され、
そして限定を意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解さ
れる。
そして限定を意図しない以下の実施例を参照することによってより容易に理解さ
れる。
【０５７９】
（実施例）
（実施例１：選択されたｃＤＮＡクローンの寄託されたサンプルからの単離）
引用されるＡＴＣＣ寄託物中の各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター中
に含まれる。表１は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築する
ために使用されたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを構築す
るために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクターで
ある。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各ファー
ジベクターについて関連するプラスミドに相関する。例えば、特定のクローンが
ベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」中に単離されていると表１に示される場合、
対応する寄託されたクローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
に含まれる。表１は、各クローンが単離されたｃＤＮＡライブラリーを構築する
ために使用されたベクターを示す。多くの場合において、ライブラリーを構築す
るために使用されたベクターは、プラスミドが切り出されたファージベクターで
ある。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各ファー
ジベクターについて関連するプラスミドに相関する。例えば、特定のクローンが
ベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」中に単離されていると表１に示される場合、
対応する寄託されたクローンは、「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」である。
【０５８０】
【表３】
ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６
：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａ
ｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５：５８−６１（１９９２）
）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１
１０１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
，９２０３７から市販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、
そしてｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形
質転換され得る。ｐＢＳは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４つの形態で
入荷する。ＳおよびＫとは、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そ
して「Ｋ」とはＫｐｎＩであり、これらは、それぞれのリンカーの各末端での最
初の部位である）に隣接するＴ７プライマー配列およびＴ３プライマー配列に対
するポリリンカーの配向をいう。「＋」または「−」とは、ある方向においてｆ
１ ｏｒｉから開始される一本鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして
他方においてアンチセンスであるようなｆ１複製起点「ｏｒｉ」の配向をいう。
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６
：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａ
ｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５：５８−６１（１９９２）
）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１
１０１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ
，９２０３７から市販されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、
そしてｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を含む。両方とも、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である）に形
質転換され得る。ｐＢＳは、ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳの４つの形態で
入荷する。ＳおよびＫとは、ポリリンカー領域（「Ｓ」とはＳａｃＩであり、そ
して「Ｋ」とはＫｐｎＩであり、これらは、それぞれのリンカーの各末端での最
初の部位である）に隣接するＴ７プライマー配列およびＴ３プライマー配列に対
するポリリンカーの配向をいう。「＋」または「−」とは、ある方向においてｆ
１ ｏｒｉから開始される一本鎖レスキューがセンス鎖ＤＮＡを生成し、そして
他方においてアンチセンスであるようなｆ１複製起点「ｏｒｉ」の配向をいう。
【０５８１】
ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒ
ｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７から入手した。全てのＳ
ｐｏｒｔベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中
に形質転換され得る（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：
５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ
Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｏｌｏｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ）は、アンピ
シリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換
され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１６０
０ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８から
入手可能）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０
Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る
（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６
８６（１９８８）およびＭｅａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９（１９
９１）を参照のこと）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、表１中の特
定のクローンについて同定されるファージベクター配列、ならびに上記に指定さ
れる対応するプラスミドベクター配列を含まない。
ｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ
６００９，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８９７から入手した。全てのＳ
ｐｏｒｔベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中
に形質転換され得る（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：
５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ
Ｓｏａｒｅｓ，Ｃｏｌｏｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ）は、アンピ
シリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換
され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１６０
０ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ ９２００８から
入手可能）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０
Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）中に形質転換され得る
（例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：９６７７−９６
８６（１９８８）およびＭｅａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９（１９
９１）を参照のこと）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、表１中の特
定のクローンについて同定されるファージベクター配列、ならびに上記に指定さ
れる対応するプラスミドベクター配列を含まない。
【０５８２】
任意の所定のｃＤＮＡクローンについて表１に引用されるＡＴＣＣ受託番号を
寄与されたサンプルにおける寄託された材料はまた、各々がこの所定のクローン
とは異なるｃＤＮＡクローンを含む、１以上のさらなるプラスミドを含み得る。
従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表１に同定される各ｃＤＮ
Ａクローンに対する少なくとも１つのプラスミドを含む。代表的に、表１に引用
される各ＡＴＣＣ寄託サンプルは、各々が異なるｃＤＮＡクローンを含む、ほぼ
等量（重量で）の約５０のプラスミドＤＮＡの混合物を含むが；このような寄託
サンプルは、多かれ少なかれ５０のｃＤＮＡクローン、最大約５００のｃＤＮＡ
クローンについてのプラスミドを含み得る。
寄与されたサンプルにおける寄託された材料はまた、各々がこの所定のクローン
とは異なるｃＤＮＡクローンを含む、１以上のさらなるプラスミドを含み得る。
従って、同じＡＴＣＣ受託番号を共有する寄託物は、表１に同定される各ｃＤＮ
Ａクローンに対する少なくとも１つのプラスミドを含む。代表的に、表１に引用
される各ＡＴＣＣ寄託サンプルは、各々が異なるｃＤＮＡクローンを含む、ほぼ
等量（重量で）の約５０のプラスミドＤＮＡの混合物を含むが；このような寄託
サンプルは、多かれ少なかれ５０のｃＤＮＡクローン、最大約５００のｃＤＮＡ
クローンについてのプラスミドを含み得る。
【０５８３】
表１中のクローンについて引用されたプラスミドＤＮＡの寄託したサンプルか
ら特定のクローンを単離するために、２つのアプローチを使用し得る。第一に、
プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用してクロ
ーンをスクリーニングすることによって、直接的に単離する。
ら特定のクローンを単離するために、２つのアプローチを使用し得る。第一に、
プラスミドを、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用してクロ
ーンをスクリーニングすることによって、直接的に単離する。
【０５８４】
特に、３０〜４０ヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドを、報告され
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識し、そして慣用方法に従って精製す
る。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド混
合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技術
または上記に引用される関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）を
用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を、１．５％寒天プレート（適切な選
択薬剤（例えば、アンピシリン）を含有する）に１プレートあたり約１５０の形
質転換体（コロニー）の密度までプレートする。これらのプレートを、細菌コロ
ニースクリーニングについての慣用方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術
に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
ている配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＤＮＡ合成装置
を使用して合成する。オリゴヌクレオチドを、例えば、32Ｐ−γ−ＡＴＰで、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識し、そして慣用方法に従って精製す
る。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））。プラスミド混
合物を、当業者に公知の技術（例えば、ベクター供給者によって提供される技術
または上記に引用される関連の刊行物もしくは特許において提供される技術）を
用いて、上記のような適切な宿主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ））に形質転換する。形質転換体を、１．５％寒天プレート（適切な選
択薬剤（例えば、アンピシリン）を含有する）に１プレートあたり約１５０の形
質転換体（コロニー）の密度までプレートする。これらのプレートを、細菌コロ
ニースクリーニングについての慣用方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第
２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１０４頁）または当業者に公知の他の技術
に従って、ナイロンメンブレンを使用してスクリーニングする。
【０５８５】
あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表１に定義されるクローンの５’ヌ
クレオチドおよび３’ヌクレオチドによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由
来する、１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを
使用して、寄託されたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望
のｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０
．５μｇの上記ｃＤＮＡテンプレートを含む２５μｌの反応混合物中で実施する
。慣用の反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン、各々２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏ
ｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サ
イクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニーリングを１分間；
７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化熱
サイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析
し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣ
Ｒ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって選択
された配列であることを確認する。
クレオチドおよび３’ヌクレオチドによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由
来する、１７〜２０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを
使用して、寄託されたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望
のｃＤＮＡを増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０
．５μｇの上記ｃＤＮＡテンプレートを含む２５μｌの反応混合物中で実施する
。慣用の反応混合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼ
ラチン、各々２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏ
ｌの各プライマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サ
イクルのＰＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニーリングを１分間；
７２℃での伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化熱
サイクラーを用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析
し、そして予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣ
Ｒ産物を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって選択
された配列であることを確認する。
【０５８６】
寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３
’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’
ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の失われた５’末端を作製するた
めに利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン富化、および当該分野で周知である５’および３
’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５’
ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の失われた５’末端を作製するた
めに利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０５８７】
簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含む、プライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣ
Ｒ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して
全長遺伝子を作製し得る。
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含む、プライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣ
Ｒ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して
全長遺伝子を作製し得る。
【０５８８】
この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解ＲＮＡまたは損傷
ＲＮＡ上の５’リン酸基を排除し得る。次いで、このホスファターゼを不活化す
るべきであり、そしてこのＲＮＡを、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在す
るキャップ構造を除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理
するべきである。この反応は、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を
残し、次いで、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、このキャップ切断ＲＮＡをＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドに連結し得る。
、ポリＡ＋ＲＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファ
ターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解ＲＮＡまたは損傷
ＲＮＡ上の５’リン酸基を排除し得る。次いで、このホスファターゼを不活化す
るべきであり、そしてこのＲＮＡを、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在す
るキャップ構造を除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理
するべきである。この反応は、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を
残し、次いで、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼを使用して、このキャップ切断ＲＮＡをＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドに連結し得る。
【０５８９】
この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを使用する第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを使用する、所望の５’末端のＰＣＲ増幅の
ためのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を配列決定し、そし
て分析してその５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを使用する、所望の５’末端のＰＣＲ増幅の
ためのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を配列決定し、そし
て分析してその５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０５９０】
（実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離）
ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを使用するＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを使用するＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋもまた参照のこと）。
【０５９１】
（実施例３：ポリペプチドの組織分布）
本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらによって記載されたノーザンブロット分析についてのプロトコルを使
用して決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって産生されるｃＤＮ
Ａプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造者の指示に従い、32Ｐで標識す
る。標識後、このプローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造者のプ
ロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識プロー
ブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
ｒｏｏｋらによって記載されたノーザンブロット分析についてのプロトコルを使
用して決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって産生されるｃＤＮ
Ａプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造者の指示に従い、32Ｐで標識す
る。標識後、このプローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造者のプ
ロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識プロー
ブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０５９２】
種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を
含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造者のプロトコル番号
ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブを用いて試験する。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄後、このブロットをマウントし、そして−７０℃で一晩フィル
ムに曝露し、そしてこのフィルムを標準的な手順に従って現像する。
含む多重組織ノーザン（ＭＴＮ）ブロットを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、製造者のプロトコル番号
ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブを用いて試験する。ハイブリダイゼー
ションおよび洗浄後、このブロットをマウントし、そして−７０℃で一晩フィル
ムに曝露し、そしてこのフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０５９３】
（実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング）
オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは、約１００ヌクレオチドにわたる
。次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖
反応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクル
を３２回反復し、次いで７０℃で５分間のサイクルを１回行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
って設計する。このプライマーは、好ましくは、約１００ヌクレオチドにわたる
。次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖
反応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクル
を３２回反復し、次いで７０℃で５分間のサイクルを１回行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０５９４】
（実施例５：ポリペプチドの細菌性発現）
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅して、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿
入物を増幅するために使用されるプライマーは、必要に応じて、発現ベクター中
に増幅産物をクローン化するために、好ましくは制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ
およびＸｂａＩ）ならびに開始／終止コドンを含むべきである。例えば、Ｂａｍ
ＨＩおよびＸｂａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ
．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミド
ベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
で調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位
をコードする。
ように、ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅して、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿
入物を増幅するために使用されるプライマーは、必要に応じて、発現ベクター中
に増幅産物をクローン化するために、好ましくは制限部位（例えば、ＢａｍＨＩ
およびＸｂａＩ）ならびに開始／終止コドンを含むべきである。例えば、Ｂａｍ
ＨＩおよびＸｂａＩは、細菌性発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ
．，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）の制限酵素部位に対応する。このプラスミド
ベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ
で調節可能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（Ｒ
ＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位
をコードする。
【０５９５】
ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして、増幅され
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながら、ｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、この連結混合物を、ｌａｃ
Ｉリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプ
ラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑ
ｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それら
がＬＢプレート上で増殖できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナ
マイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析
によって確認する。
たフラグメントを細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながら、ｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで、この連結混合物を、ｌａｃ
Ｉリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプ
ラスミドｐＲＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑ
ｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それら
がＬＢプレート上で増殖できる能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナ
マイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析
によって確認する。
【０５９６】
所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。この細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．
Ｄ．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるまで加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化によりプロモーター／オペレーターの除去（ｃｌｅａｒｉ
ｎｇ）を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。この細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．
Ｄ．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるまで加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩ
リプレッサーの不活化によりプロモーター／オペレーターの除去（ｃｌｅａｒｉ
ｎｇ）を誘導し、遺伝子発現の増加を導く。
【０５９７】
細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
Ｍ 塩酸グアニジン中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（Ｑ
ＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有す
るタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程
手順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（
１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
Ｍ 塩酸グアニジン中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる
。細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてポリペプチドを含む上清を、ニ
ッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（Ｑ
ＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出より入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有す
るタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程
手順で精製され得る（詳細には、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（
１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０５９８】
手短に言えば、上清を、６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ８）のカラムにロードし
、このカラムを、最初に１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ８）で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６）で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ５）で溶出する。
、このカラムを、最初に１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ８）で洗浄し、
次いで１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ６）で洗浄し、最後にポリペプチ
ドを、６Ｍ 塩酸グアニジン（ｐＨ５）で溶出する。
【０５９９】
次いで、精製タンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍ
Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析す
ることにより再生させる。あるいは、このタンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固
定化されている間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の６Ｍ〜１Ｍの尿素の直線勾
配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生
後、タンパク質を２５０ｍＭ イミダゾールの添加によって溶出させる。イミダ
ゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００
ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。この精製タンパク質
を、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析す
ることにより再生させる。あるいは、このタンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固
定化されている間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の６Ｍ〜１Ｍの尿素の直線勾
配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生
後、タンパク質を２５０ｍＭ イミダゾールの添加によって溶出させる。イミダ
ゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００
ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。この精製タンパク質
を、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０６００】
上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結された、ファージのオペレーターエレメントおよびプロモーター
エレメントを含む、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０
９６４５、１９９８年２月２５日に寄託）を含む。このベクターは以下を含む：
１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）
Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃ
オペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペ
ロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９
（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列お
よびオペレーター配列は合成的に作製される。
作動可能に連結された、ファージのオペレーターエレメントおよびプロモーター
エレメントを含む、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクター（ＡＴＣＣ受託番号２０
９６４５、１９９８年２月２５日に寄託）を含む。このベクターは以下を含む：
１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）
Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファージプロモーター配列、４）２つのｌａｃ
オペレーター配列、５）シャイン−ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペ
ロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９
（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に由来する。プロモーター配列お
よびオペレーター配列は合成的に作製される。
【０６０１】
ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８によっ
てベクターを制限処理し、制限産物をゲル上で泳動し、そして大きな方のフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
はずである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。このＤ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）についての制限部位を有するＰＣ
Ｒプライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコールに従って生成す
る。このＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿
入物およびベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
てベクターを制限処理し、制限産物をゲル上で泳動し、そして大きな方のフラグ
メント（スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは約３１０塩基対である
はずである）を単離することによって、ＤＮＡをｐＨＥａに挿入し得る。このＤ
ＮＡ挿入物を、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｈ
ｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）についての制限部位を有するＰＣ
Ｒプライマーを使用して、実施例１に記載のＰＣＲプロトコールに従って生成す
る。このＰＣＲ挿入物を、ゲル精製し、そして適合する酵素で制限処理する。挿
入物およびベクターを標準的なプロトコールに従って連結する。
【０６０２】
操作されたベクターは、上記のプロトコールにおいて、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換され得る。
発現させるために容易に置換され得る。
【０６０３】
（実施例６：封入体からのポリペプチドの精製）
以下の代替法は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されたポリペプチドが封入体の形態で
存在する場合に、このポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定さ
れない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
存在する場合に、このポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定さ
れない場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０６０４】
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．
４）を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸
濁液へと分散させる。
て１５，０００ｒｐｍの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）に
よって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想され
る収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適切
な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．
４）を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な懸
濁液へと分散させる。
【０６０５】
次いで、細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉでこの溶液を通すことによって溶解させ
る。次いで、このホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮ
ａＣｌ溶液と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られた
ペレットを、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４）を使用して再度洗浄する。
Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ
．）に２回、４０００〜６０００ｐｓｉでこの溶液を通すことによって溶解させ
る。次いで、このホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮ
ａＣｌ溶液と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られた
ペレットを、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ７．４）を使用して再度洗浄する。
【０６０６】
得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化させる。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄
し、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧ
ｕＨＣｌ抽出を可能にする。
４時間可溶化させる。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄
し、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧ
ｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０６０７】
不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、この
ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを、激しく攪拌して迅速に混
合することによって、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を再折り畳みさせる。この再
折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合し
ないで４℃で保つ。
ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを、激しく攪拌して迅速に混
合することによって、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を再折り畳みさせる。この再
折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合し
ないで４℃で保つ。
【０６０８】
再折り畳みされたポリペプチド溶液を清澄化にするために、４０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメン
ブレンフィルターを備える、あらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆ
ｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、
Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に
ロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄し、そし
て同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ
ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を
継続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに
分析する。
トリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメン
ブレンフィルターを備える、あらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆ
ｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、
Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に
ロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄し、そし
て同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ
ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を
継続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに
分析する。
【０６０９】
次いで、このポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合す
る。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン交換樹脂（Ｐ
ｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および
弱アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）の直列カラムのセットにロードする。このカラムを４０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸
ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２
０カラムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（
ｐＨ６．５）の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタ
リング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判
明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
る。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン交換樹脂（Ｐ
ｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および
弱アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）の直列カラムのセットにロードする。このカラムを４０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ 酢酸
ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣＭ−２
０カラムを１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（
ｐＨ６．５）の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ280モニタ
リング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判
明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０６１０】
この得られたポリペプチドは、上記の再折り畳み工程および精製工程の後で９
５％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場
合、いかなる主な夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルから観察されないはずである。この精製タンパク質はまた、エンドトキ
シン／ＬＰＳ混入について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬ
アッセイによって、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
５％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる場
合、いかなる主な夾雑バンドも、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルから観察されないはずである。この精製タンパク質はまた、エンドトキ
シン／ＬＰＳ混入について試験され得、そして代表的には、ＬＰＳ含量はＬＡＬ
アッセイによって、０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０６１１】
（実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニング
および発現） この実施例では、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌクレ
オチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベクタ
ーは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（Ａｃ
ＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、
およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「
ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用す
る。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱いＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿
入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイ
ルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウ
イルス配列と両方の側で隣接する。
および発現） この実施例では、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌクレ
オチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベクタ
ーは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（Ａｃ
ＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、
およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「
ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使用す
る。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱いＤ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿
入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイ
ルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのためのウ
イルス配列と両方の側で隣接する。
【０６１２】
他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０６１３】
具体的には、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列を、適切な制限部位
および開始／終止コドンを含むプライマーを用いて、実施例１に記載されるＰＣ
Ｒプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列を使用して分
泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペプチドを必要
としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅ
ｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５（１９８７）により記載される標準的な方法を用い
て、このベクターをバキュロウイルスリーダー配列を含むよう改変し得る（ｐＡ
２ＧＰ）。
および開始／終止コドンを含むプライマーを用いて、実施例１に記載されるＰＣ
Ｒプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列を使用して分
泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペプチドを必要
としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅ
ｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ Ｎｏ． １５５５（１９８７）により記載される標準的な方法を用い
て、このベクターをバキュロウイルスリーダー配列を含むよう改変し得る（ｐＡ
２ＧＰ）。
【０６１４】
増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び
１％アガロースゲルで精製する。
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、フラグメントを適切な制限酵素で消化し、そして再び
１％アガロースゲルで精製する。
【０６１５】
プラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野で公
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る。次
いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離
する。
知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る。次
いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０１
Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１％アガロースゲルから単離
する。
【０６１６】
このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー
由来のＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することに
より同定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって
確認する。
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。プラスミドを含む細菌を、個々のコロニー
由来のＤＮＡを消化し、そして消化産物をゲル電気泳動によって分析することに
より同定する。クローニングしたフラグメントの配列をＤＮＡ配列決定によって
確認する。
【０６１７】
このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ととも
に同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡ
および５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ととも
に同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡ
および５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、
マイクロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌの
リポフェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５
分間インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清グレ
ース培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（
ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して加える。次いでプレートを２７℃で５
時間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除
去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加す
る。次いで培養を２７℃で４日間継続する。
【０６１８】
４日後上清を収集し、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）
の容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養お
よびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッターのチップ
（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そし
て組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種
したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いで４℃に貯蔵する。
されたようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むアガロー
スゲルを、ｇａｌが発現しているクローン（青色に着色したプラークを生ずる）
の容易な同定および単離を可能にするために使用する。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養お
よびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に着色したプラークをマイクロピペッターのチップ
（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を
、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そし
て組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播種
したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集し
、次いで４℃に貯蔵する。
【０６１９】
ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可
能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの 35 Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに
１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパ
ク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラ
ジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
ース培地中でＳｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染多重度（「ＭＯ
Ｉ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスに感染させる。
放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可
能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの 35 Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに
１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタンパ
ク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオートラ
ジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
【０６２０】
精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０６２１】
（実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現）
本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞中で発現させ得る。代表的な哺乳動物
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要な
シグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚａｋ
）配列、および、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接
する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プ
ロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ−Ｉ）由来
の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモ
ーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチン
プロモーター）もまた、使用され得る。
発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タ
ンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要な
シグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚａｋ
）配列、および、ＲＮＡスプライシングのドナーおよびアクセプター部位に隣接
する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プ
ロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＩＶ−Ｉ）由来
の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモ
ーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例えば、ヒトアクチン
プロモーター）もまた、使用され得る。
【０６２２】
本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳ
Ｖｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６
）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、な
らびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動
物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒ
ｋａｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、
Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、
ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳ
Ｖｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６
）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、な
らびにｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動
物宿主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒ
ｋａｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、
Ｃｏｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、
ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０６２３】
あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンまたはハイグ
ロマイシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、
トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシンまたはハイグ
ロマイシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、
トランスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０６２４】
トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０
（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択マー
カーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これら
のマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも
高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた、
増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細
胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０
（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択マー
カーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これら
のマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも
高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた、
増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細
胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０６２５】
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロイン
スリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ４０初期プ
ロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。ベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロイン
スリン遺伝子のポリアデニル化および終結シグナル、ならびに、ＳＶ４０初期プ
ロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０６２６】
具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６は、適切な制限酵素によって消化され
、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）を使用して脱リン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルか
ら単離する。
、次いで当該分野で公知の手順に従って、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）を使用して脱リン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０６２７】
本発明のポリヌクレオチドは、必要であれば、適切な制限部位および開始／終
止コドンを有するプライマーを使用して、実施例１に概説するプロトコルに従っ
て増幅される。分泌のために必要であれば、ベクターは異種シグナル配列を含む
ように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
止コドンを有するプライマーを使用して、実施例１に概説するプロトコルに従っ
て増幅される。分泌のために必要であれば、ベクターは異種シグナル配列を含む
ように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６２８】
増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲル上で精製する。
１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して１％アガロースゲルから
単離する。次いで、フラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再び１％
アガロースゲル上で精製する。
【０６２９】
次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸したベクターを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または
ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入されたフ
ラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸したベクターを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または
ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入されたフ
ラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０６３０】
活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６を、リポフェクチン
を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクト
する（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マ
ーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し
、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５
０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウ
ェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメト
トレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度のメトトレキサート（１μ
Ｍ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移
す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエス
タンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６を、リポフェクチン
を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏとともに同時トランスフェクト
する（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性選択マ
ーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する酵
素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し
、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／
ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプ
レート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜１４日後、
単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５
０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用して、６ウ
ェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメト
トレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度のメトトレキサート（１μ
Ｍ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移
す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで
繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエス
タンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０６３１】
（実施例９：タンパク質融合物）
本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。このポリペプチドはまた、分泌
および細胞内輸送を容易にするために、異種ポリペプチド配列（例えば、ＫＤＥ
Ｌ）に融合され得る。さらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの
融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺプチドに融合した核
局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下局在に標的化し得る。一方、共有
結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または
減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を
作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タ
ンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質
の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプロトコル
、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る
。
の融合タンパク質は、種々の適用について使用され得る。例えば、本発明のポリ
ぺプチドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマ
ルトース結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと
；ＥＰ Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。このポリペプチドはまた、分泌
および細胞内輸送を容易にするために、異種ポリペプチド配列（例えば、ＫＤＥ
Ｌ）に融合され得る。さらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの
融合は、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺプチドに融合した核
局在化シグナルは、タンパク質を特定の細胞下局在に標的化し得る。一方、共有
結合ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、融合タンパク質の活性を増大または
減少させ得る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を
作製し得る。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タ
ンパク質の可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質
の全ての型は、ポリぺプチドのＩｇＧ分子への融合を概説する以下のプロトコル
、または実施例５に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る
。
【０６３２】
簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’および３’
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）、および必要であれ
ば、開始／終止コドンへのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を
有するべきである。
末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマーは
また、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）、および必要であれ
ば、開始／終止コドンへのクローニングを容易にする都合の良い制限酵素部位を
有するべきである。
【０６３３】
例えば、ｐＣ４（受託番号第２０９６４６号）が使用される場合、ヒトＦｃ部
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記
載するＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、この
ＢａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニ
ングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること
。
分は、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊
されるべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが
、ＢａｍＨＩによって再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記
載するＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、この
ＢａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニ
ングされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること
。
【０６３４】
天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０６３５】
【化６】
（実施例１０：ポリペプチドの処方）
ポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、分泌形態ポリペプチド
単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の
因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とす
る「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の
因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とす
る「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０６３６】
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるポリペプチドの合計薬学
的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあ
るが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。より好ましくは、このホル
モンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好
ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間で
ある。連続投与する場合、代表的には、ポリペプチドを約１μｇ／ｋｇ／時間〜
約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注
入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶
液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる
処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあ
るが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。より好ましくは、このホル
モンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も好
ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間で
ある。連続投与する場合、代表的には、ポリペプチドを約１μｇ／ｋｇ／時間〜
約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注
入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶
液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる
処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０６３７】
本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽
内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、
ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔ス
プレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、
半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう
。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸
骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、
ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔ス
プレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、
半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をいう
。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸
骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６３８】
このポリペプチドはまた、徐放系により適切に投与される。徐放性組成物の適
切な例としては、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半
透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては、ポリラク
チド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン
酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒ
ｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅ
ｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌ
ａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９
８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに封入されたポリペプチ
ドを包む。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方
法により調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）
；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０
３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８
，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−
１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４
５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００
〜８００Å）単膜型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロ
ールよりも多く、選択された比率が、最適分泌ポリペプチド治療のために調整さ
れる。
切な例としては、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの成形品の形態の半
透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては、ポリラク
チド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン
酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシ
エチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒ
ｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅ
ｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌ
ａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９
８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに封入されたポリペプチ
ドを包む。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方
法により調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）
；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４０
３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８
，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−
１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４
５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００
〜８００Å）単膜型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロ
ールよりも多く、選択された比率が、最適分泌ポリペプチド治療のために調整さ
れる。
【０６３９】
非経口投与のために、１つの実施形態において、一般的に、このポリペプチド
は、このポリペプチドを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（す
なわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物
の他の成分と適合するもの）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液ま
たは乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好まし
くは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが公知である他の化
合物を含まない。
は、このポリペプチドを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（す
なわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物
の他の成分と適合するもの）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液ま
たは乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好まし
くは、酸化剤、およびポリペプチドに対して有害であることが公知である他の化
合物を含まない。
【０６４０】
一般的に、このポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアある
いはその両方と均一かつ緊密に接触させることによって、この処方物を調製する
。次いで、必要であれば、生成物を所望の処方物へと成形する。好ましくは、キ
ャリアは、非経口的キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張
性である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩
水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオ
レイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書に
おいて有用である。
いはその両方と均一かつ緊密に接触させることによって、この処方物を調製する
。次いで、必要であれば、生成物を所望の処方物へと成形する。好ましくは、キ
ャリアは、非経口的キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張
性である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩
水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオ
レイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書に
おいて有用である。
【０６４１】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、ホスフェート、シトレート、サクシ
ネート、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩類のような緩衝剤；アスコルビ
ン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、
ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グ
ロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；
グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；
セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含
む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マン
ニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオ
ン；ならびに／あるいはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような
非イオン性界面活性剤が挙げられる。
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、ホスフェート、シトレート、サクシ
ネート、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩類のような緩衝剤；アスコルビ
ン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド（例えば、
ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グ
ロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；
グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；
セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含
む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マン
ニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオ
ン；ならびに／あるいはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような
非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０６４２】
このポリペプチドは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好
ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル
中に処方される。前述の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用すること
により、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル
中に処方される。前述の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用すること
により、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０６４３】
治療的投与に用いられるどのポリペプチドも、無菌状態であり得る。滅菌濾過
膜（例えば０．２ミクロン膜）を通して濾過することにより無菌状態は容易に達
成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する
容器（例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液のバッグ
またはバイアル）に配置される。
膜（例えば０．２ミクロン膜）を通して濾過することにより無菌状態は容易に達
成される。一般に、治療用ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する
容器（例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液のバッグ
またはバイアル）に配置される。
【０６４４】
ポリペプチドは、通常、単位用量容器または複数用量容器（例えば、密封した
、アンプルまたはバイアル）に、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物
として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾
過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合
物を凍結乾燥する。凍結乾燥したポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成し
て注入溶液を調製する。
、アンプルまたはバイアル）に、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物
として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾
過した１％（ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合
物を凍結乾燥する。凍結乾燥したポリペプチドを注射用静菌水を用いて再構成し
て注入溶液を調製する。
【０６４５】
本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を満たした一つ以上の
容器を備える、薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製
品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このよう
な容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売に
関する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドを他の治
療用化合物と組み合わせて使用し得る。
容器を備える、薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製
品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このよう
な容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売に
関する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドを他の治
療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０６４６】
（実施例１１：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法）
個体におけるポリペプチドの標準または正常の発現レベルの低下により引き起
こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態および/または
可溶性形態で投与することにより処置され得ることが理解される。従って、本発
明はまた、ポリペプチドのレベルの上昇が必要な個体の処置方法を提供し、この
方法は、このような個体に、このような個体でこのポリペプチドの活性レベルを
上昇させる量のポリペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
こされる状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態および/または
可溶性形態で投与することにより処置され得ることが理解される。従って、本発
明はまた、ポリペプチドのレベルの上昇が必要な個体の処置方法を提供し、この
方法は、このような個体に、このような個体でこのポリペプチドの活性レベルを
上昇させる量のポリペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０６４７】
例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、このポリペプチドを、１日
用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、このポリペ
プチドは分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、
実施例１０に提供されている。
用量０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、このポリペ
プチドは分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、
実施例１０に提供されている。
【０６４８】
（実施例１２：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法）
アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生を阻害する。この技
術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチド（好ましくは分泌形態の
ポリペプチド）のレべルを低下させる方法の１つの例である。
術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチド（好ましくは分泌形態の
ポリペプチド）のレべルを低下させる方法の１つの例である。
【０６４９】
例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、
７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド処
方は、実施例１０に提供されている。
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば、
７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド処
方は、実施例１０に提供されている。
【０６５０】
（実施例１３：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ）
遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する。一般的に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験体から得られる。得られ
た組織を組織培養培地中に配置し、そして小片に分割する。この組織の小塊を組
織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラス
コを倒置し、密封し、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコ
を反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な
培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキ
ュベートする。
植する。一般的に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験体から得られる。得られ
た組織を組織培養培地中に配置し、そして小片に分割する。この組織の小塊を組
織培養フラスコの湿潤表面に置き、ほぼ１０片を各フラスコに置く。このフラス
コを倒置し、密封し、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコ
を反転させ、そして組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮な
培地（例えば、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する
ＨａｍのＦ１２培地）を添加する。次いで、フラスコを３７℃で約１週間インキ
ュベートする。
【０６５１】
この時点で、新鮮な培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週
間培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、さ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
間培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。この単層をトリプシン処理し、さ
らに大きなフラスコにスケールアップする。
【０６５２】
モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃ
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する
。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。
ｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する
。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して精製
する。
【０６５３】
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、実施例１に記載されるような
、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用
して、必要であれば、適切な制限部位および開始／終止コドンを有するプライマ
ーを使用して、増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含
み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウ
ス肉腫ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を
、この二つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次いで、連
結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次いで、それを、ベクター
が正確に挿入している目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナ
マイシンを含む寒天上にプレーティングする。
、それぞれ５’末端配列および３’末端配列に対応するＰＣＲプライマーを使用
して、必要であれば、適切な制限部位および開始／終止コドンを有するプライマ
ーを使用して、増幅し得る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含
み、そして３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、モロニーマウ
ス肉腫ウイルスの線状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を
、この二つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。次いで、連
結混合物を使用し、細菌ＨＢ１０１を形質転換する。次いで、それを、ベクター
が正確に挿入している目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナ
マイシンを含む寒天上にプレーティングする。
【０６５４】
アンフォトロピックなｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を
、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエント
な密度まで増殖させる。次いで、この遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え
、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージ
ング細胞は、この遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパ
ッケージング細胞を、プロデューサー細胞という）。
、１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕ
ｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエント
な密度まで増殖させる。次いで、この遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え
、そしてパッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージ
ング細胞は、この遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、このパ
ッケージング細胞を、プロデューサー細胞という）。
【０６５５】
形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮な培地を添加し、続いて培地を１０
ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイ
ルス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維
芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏ
またはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する
ことが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分
析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
ｃｍプレートのコンフルエントなプロデューサー細胞から採取する。感染性ウイ
ルス粒子を含む使用済み培地をミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去し、次いで、この培地を使用して、線維芽細胞を感染
させる。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そして
プロデューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そし
て新鮮な培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維
芽細胞が感染され、そして選択は必要ではない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏ
またはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する
ことが必要である。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分
析し、タンパク質が産生されているか否かを決定する。
【０６５６】
次いで、操作された線維芽細胞を、単独でか、またはサイトデックス３マイク
ロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植
する。
ロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に移植
する。
【０６５７】
（実施例１４：内因性ＢＭＰ遺伝子を用いる遺伝子治療）
本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６７
０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９
９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月
４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，３４２：４３５−４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換え
を介して内因性ＢＭＰ遺伝子配列とプロモーターとを作動可能に結合させること
を包含する。この方法は、標的細胞中に存在するがこの細胞中において発現され
ないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を含む
。
０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１（１９
９６年９月２６日公開）；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月
４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
、８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，３４２：４３５−４３８（１９８９）に記載されるように、相同組換え
を介して内因性ＢＭＰ遺伝子配列とプロモーターとを作動可能に結合させること
を包含する。この方法は、標的細胞中に存在するがこの細胞中において発現され
ないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を含む
。
【０６５８】
ポリヌクレオチド構築物を、プロモーターおよび標的化配列を含むように作製
する。この標的化配列は、このプロモーターに隣接する内因性ＢＭＰの５’非コ
ード配列に相同である。この標的化配列は、ＢＭＰ遺伝子の５’末端に十分に近
いので、このプロモーターは、相同組換えに際して内因性配列に作動可能に連結
される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。
好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に別個の
制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、この増幅し
たプロモーターの５’末端と同じ制限部位を含み、そして第２の標的化配列の５
’末端は、この増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
する。この標的化配列は、このプロモーターに隣接する内因性ＢＭＰの５’非コ
ード配列に相同である。この標的化配列は、ＢＭＰ遺伝子の５’末端に十分に近
いので、このプロモーターは、相同組換えに際して内因性配列に作動可能に連結
される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。
好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に別個の
制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、この増幅し
たプロモーターの５’末端と同じ制限部位を含み、そして第２の標的化配列の５
’末端は、この増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０６５９】
増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消化し
、続いて、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で共に添加する。得られた
混合物を、その２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。こ
の構築物を、アガロースゲル上でサイズ分画し、次いで、フェノール抽出および
エタノール沈殿によって精製する。
、続いて、仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で共に添加する。得られた
混合物を、その２つのフラグメントを連結するのに適した条件下で維持する。こ
の構築物を、アガロースゲル上でサイズ分画し、次いで、フェノール抽出および
エタノール沈殿によって精製する。
【０６６０】
この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して、裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオ
チド構築物をまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイル
ス配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）と共に投与し得る。このような送達方法は
、当該分野で公知である。
ンを介して、裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオ
チド構築物をまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイル
ス配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）と共に投与し得る。このような送達方法は
、当該分野で公知である。
【０６６１】
一旦、細胞をトランスフェクトすると、プロモーターを内因性ＢＭＰ配列に作
動可能に連結することをもたらす相同組換えが起こる。これは、細胞中のＢＭＰ
の発現を生じる。発現を、免疫学的染色によってか、または当該分野で公知の任
意の他の方法によって、検出し得る。
動可能に連結することをもたらす相同組換えが起こる。これは、細胞中のＢＭＰ
の発現を生じる。発現を、免疫学的染色によってか、または当該分野で公知の任
意の他の方法によって、検出し得る。
【０６６２】
線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。指数関数的に増殖しているかまたは初期定常
相の線維芽細胞を、トリプシン処理し、そして栄養培地でプラスチック表面から
リンスする。細胞懸濁液のアリコートを計数のために取り出し、そして残りの細
胞を遠心分離に供する。この上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクト
ロポレーション緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１３７ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭ デキストロース
）中に再懸濁する。細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／
ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミンを含有するエレクトロポレーション緩衝液
中に再懸濁する。最終細胞懸濁液は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクト
ロポレーションは、再懸濁の直後に実施するべきである。
１０％ウシ胎仔血清中に配置する。指数関数的に増殖しているかまたは初期定常
相の線維芽細胞を、トリプシン処理し、そして栄養培地でプラスチック表面から
リンスする。細胞懸濁液のアリコートを計数のために取り出し、そして残りの細
胞を遠心分離に供する。この上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクト
ロポレーション緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１３７ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭ デキストロース
）中に再懸濁する。細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞を１ｍｇ／
ｍｌのアセチル化ウシ血清アルブミンを含有するエレクトロポレーション緩衝液
中に再懸濁する。最終細胞懸濁液は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクト
ロポレーションは、再懸濁の直後に実施するべきである。
【０６６３】
プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ＢＭＰ遺伝子座
を標的とするプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＮＹ）を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。そ
のＣＭＶプロモーターを、５’末端上にＸｂａＩ部位および３’末端上にＢａｍ
ＨＩ部位を伴って、ＰＣＲによって増幅する。２つのＢＭＰ非コード遺伝子配列
を、ＰＣＲを介して増幅する：一方のＢＭＰ非コード配列（ＢＭＰフラグメント
１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、および３’末端にＸｂａ部位を伴って
増幅する；他方のＢＭＰ非コード配列（ＢＭＰフラグメント２）を、５’末端に
ＢａｍＨＩ部位、および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を伴って増幅する。この
ＣＭＶプロモーターおよびＢＭＰフラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモー
ター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＢＭＰフラグメント１−ＸｂａＩ；ＢＭＰフ
ラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、共に連結する。得られた連結産物を、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミド
と連結する。
を標的とするプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆ
ｅｒｍｅｎｔａｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＮＹ）を、ＨｉｎｄＩＩＩで消化する。そ
のＣＭＶプロモーターを、５’末端上にＸｂａＩ部位および３’末端上にＢａｍ
ＨＩ部位を伴って、ＰＣＲによって増幅する。２つのＢＭＰ非コード遺伝子配列
を、ＰＣＲを介して増幅する：一方のＢＭＰ非コード配列（ＢＭＰフラグメント
１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位、および３’末端にＸｂａ部位を伴って
増幅する；他方のＢＭＰ非コード配列（ＢＭＰフラグメント２）を、５’末端に
ＢａｍＨＩ部位、および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を伴って増幅する。この
ＣＭＶプロモーターおよびＢＭＰフラグメントを、適切な酵素（ＣＭＶプロモー
ター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ＢＭＰフラグメント１−ＸｂａＩ；ＢＭＰフ
ラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、共に連結する。得られた連結産物を、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミド
と連結する。
【０６６４】
プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般に、少なくとも１２０μｇ
／ｍｌである。次いで、０．５ｍｌの細胞懸濁液（約１．５×１０6細胞を含む
）を、このキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を穏や
かに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ、９６
０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧を増加させるにつれて細胞の生
存は減少するが、導入したＤＮＡをそのゲノムへ安定に組み込んだ生存細胞の割
合は、劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、約１４〜２０ｍＳｅ
ｃのパルス時間を観察するはずである。
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般に、少なくとも１２０μｇ
／ｍｌである。次いで、０．５ｍｌの細胞懸濁液（約１．５×１０6細胞を含む
）を、このキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を穏や
かに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ、９６
０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧を増加させるにつれて細胞の生
存は減少するが、導入したＤＮＡをそのゲノムへ安定に組み込んだ生存細胞の割
合は、劇的に増加する。これらのパラメーターを与えると、約１４〜２０ｍＳｅ
ｃのパルス時間を観察するはずである。
【０６６５】
エレクトロポレーションした細胞を、室温にて約５分間保持し、ついでキュベ
ットの内容物を、無菌の移動用ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞を
、１０ｃｍディッシュ中の１０ｍｌの予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を
含むＤＭＥＭ）に直接添加し、そして３７℃にてインキュベートする。翌日、こ
の培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置き換え、そしてさらに１６〜
２４時間インキュベートする。
ットの内容物を、無菌の移動用ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞を
、１０ｃｍディッシュ中の１０ｍｌの予め温めた栄養培地（１５％仔ウシ血清を
含むＤＭＥＭ）に直接添加し、そして３７℃にてインキュベートする。翌日、こ
の培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置き換え、そしてさらに１６〜
２４時間インキュベートする。
【０６６６】
次いで、操作された線維芽細胞を、単独でか、またはサイトデックス３マイク
ロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に注入
する。ここでこの線維芽細胞はタンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽
細胞は、上記のように患者へと導入され得る。
ロキャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで、宿主に注入
する。ここでこの線維芽細胞はタンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽
細胞は、上記のように患者へと導入され得る。
【０６６７】
（実施例１５：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ）
本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療方法は、ＢＭＰポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）のＢＭＰ配列の導入に関す
る。ＢＭＰポリヌクレオチドを、標的組織によるそのＢＭＰポリペプチドの発現
に必要な、プロモーターまたは任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結し
得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知で
あり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６
９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら
、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）、
Ｃｈａｏ Ｊら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（
１９９７）、Ｗｏｌｆｆ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：
３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３
（５）：４０５−４１１（１９９６）、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ，９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参
考として援用される）を参照のこと。
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療方法は、ＢＭＰポリペプチド
の発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、お
よびアンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）のＢＭＰ配列の導入に関す
る。ＢＭＰポリヌクレオチドを、標的組織によるそのＢＭＰポリペプチドの発現
に必要な、プロモーターまたは任意の他の遺伝子エレメントに作動可能に連結し
得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野で公知で
あり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特許第５６
９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂａｔａら
、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９９７）、
Ｃｈａｏ Ｊら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−５２２（
１９９７）、Ｗｏｌｆｆ，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７（５）：
３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３
（５）：４０５−４１１（１９９６）、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ．ら、Ｃｉｒｃｕｌ
ａｔｉｏｎ，９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書中に参
考として援用される）を参照のこと。
【０６６８】
ＢＭＰポリヌクレオチド構築物を、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任
意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間へ
の注射）によって送達し得る。ＢＭＰポリヌクレオチド構築物を、薬学的に受容
可能な液体または水性のキャリア中で送達し得る。
意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙空間へ
の注射）によって送達し得る。ＢＭＰポリヌクレオチド構築物を、薬学的に受容
可能な液体または水性のキャリア中で送達し得る。
【０６６９】
用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、
ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む）
も含まない配列をいう。しかし、ＢＭＰポリヌクレオチドはまた、当業者に周知
の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ａ
ｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１２６−１３９（１９９５）および
Ａｂｄａｌｌａｈら，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８５（１）：１−７（１９９５）で
教示されたもの）中で送達し得る。
、促進または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列、
ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む）
も含まない配列をいう。しかし、ＢＭＰポリヌクレオチドはまた、当業者に周知
の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ａ
ｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７７２：１２６−１３９（１９９５）および
Ａｂｄａｌｌａｈら，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，８５（１）：１−７（１９９５）で
教示されたもの）中で送達し得る。
【０６７０】
遺伝子治療方法において使用されるＢＭＰポリヌクレオチドベクター構築物は
、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含みもしな
い構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターか、ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を
標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合
成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて
、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列を含みもしな
い構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターか、ＤＮＡの発現を
駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を
標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合
成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて
、６ヶ月までの期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０６７１】
ポリヌクレオチド構築物を、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む）の間隙空間に
送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ多糖
マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維
、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ
ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じマトリクス（ｔｈａｔ ｓ
ａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャ
ンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は
、以下に記載の理由のために好ましい。このポリヌクレオチド構築物を、これら
の細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達し得る。このポリヌクレオチ
ド構築物は、好ましくは、持続性の分化した非分裂細胞に送達され、その細胞に
おいて発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化してい
ない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る
。インビボ筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そしてこのポリヌクレオ
チドを発現する能力において、特に適格である。
、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精
巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を含む）の間隙空間に
送達され得る。組織の間隙空間は、細胞間液、器官組織の細網線維間のムコ多糖
マトリクス、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織のコラーゲン線維
、あるいは筋肉細胞を囲む結合組織内の同じマトリクス（ｔｈａｔ ｓａｍｅ
ｍａｔｒｉｘ）または骨の裂孔中の結合組織内の同じマトリクス（ｔｈａｔ ｓ
ａｍｅ ｍａｔｒｉｘ）を含む。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャ
ンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は
、以下に記載の理由のために好ましい。このポリヌクレオチド構築物を、これら
の細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達し得る。このポリヌクレオチ
ド構築物は、好ましくは、持続性の分化した非分裂細胞に送達され、その細胞に
おいて発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または完全には分化してい
ない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）において達成され得る
。インビボ筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、そしてこのポリヌクレオ
チドを発現する能力において、特に適格である。
【０６７２】
裸のＢＭＰポリヌクレオチド注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量
は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは
、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好
ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が
認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変動する。核酸配列の
適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される
状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非
経口注射経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これ
には、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のための
エアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＢＭＰポリヌクレオチド構
築物を、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈
に送達し得る。
は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは
、投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好
ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が
認識するように、この投薬量は、注射の組織部位に従って変動する。核酸配列の
適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される
状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非
経口注射経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用いられ得、これ
には、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉または鼻の粘膜への送達のための
エアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のＢＭＰポリヌクレオチド構
築物を、血管形成術の間にこの手順において用いられるカテーテルによって動脈
に送達し得る。
【０６７３】
インビボでの筋肉における注射されたＢＭＰポリヌクレオチドの用量応答効果
を、以下のようにして決定する。ＢＭＰポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生
成のために適切なＢＭＰ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調
製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または直鎖状のいずれかであり得る）を裸のＤ
ＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかを行う。
次いで、マウスの四頭筋に、多様な量のこの鋳型ＤＮＡを注射する。
を、以下のようにして決定する。ＢＭＰポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生
成のために適切なＢＭＰ鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調
製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または直鎖状のいずれかであり得る）を裸のＤ
ＮＡとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかを行う。
次いで、マウスの四頭筋に、多様な量のこの鋳型ＤＮＡを注射する。
【０６７４】
５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＢＭＰ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
この筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍの位置で膝に、約０．２ｃｍの深さで
注射する。縫合を、将来の位置確認のために注射部位の上で行い、そして皮膚を
ステンレス鋼クリップで閉じる。
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。ＢＭＰ鋳型ＤＮＡを、０．１ｍｌ
のキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって、
この筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍの位置で膝に、約０．２ｃｍの深さで
注射する。縫合を、将来の位置確認のために注射部位の上で行い、そして皮膚を
ステンレス鋼クリップで閉じる。
【０６７５】
適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚目毎の１５μｍ切片を、
ＢＭＰタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＢＭＰタンパク質発現に
ついての時間経過は、異なるマウスから四頭筋を異なる時間に採取すること以外
は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＢＭＰのＤＮＡの持続性を、注射
したマウスおよびコントロールマウスから総細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を
調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験
の結果は、裸のＢＭＰ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投
薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用し得る。
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚目毎の１５μｍ切片を、
ＢＭＰタンパク質発現について組織化学的に染色する。ＢＭＰタンパク質発現に
ついての時間経過は、異なるマウスから四頭筋を異なる時間に採取すること以外
は、同様な様式で行い得る。注射後の筋肉中のＢＭＰのＤＮＡの持続性を、注射
したマウスおよびコントロールマウスから総細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を
調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける上記実験
の結果は、裸のＢＭＰ ＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物において適切な投
薬量および他の処置パラメーターを推定するために使用し得る。
【０６７６】
（実施例１６：抗体の産生）
ａ）ハイブリドーマ技術
本発明の抗体を、種々の方法によって調製し得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ＢＭ
Ｐポリペプチドを発現する細胞を、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導
するために、動物に投与する。好ましい方法において、ＢＭＰポリペプチドの調
製物を調製し、そしてその調製物が、天然の夾雑物を実質的に含まないようにす
るために精製する。ついで、このような調製物を、より大きな比活性のポリクロ
ーナル抗体を産生するために、動物に導入する。
ｔｏｃｏｌｓ、第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、ＢＭ
Ｐポリペプチドを発現する細胞を、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導
するために、動物に投与する。好ましい方法において、ＢＭＰポリペプチドの調
製物を調製し、そしてその調製物が、天然の夾雑物を実質的に含まないようにす
るために精製する。ついで、このような調製物を、より大きな比活性のポリクロ
ーナル抗体を産生するために、動物に導入する。
【０６７７】
ＢＭＰポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術を
使用して調製する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５
）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；
Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａ
ｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜
６８１頁（１９８１））。一般的に、動物（好ましくは、マウス）を、ＢＭＰポ
リペプチドまたはより好ましくは分泌ＢＭＰポリペプチド発現細胞で、免疫する
。このようなポリペプチド発現細胞を、適切な任意の組織培養培地（好ましくは
、１０％ウシ胎仔血清（約６５℃にて不活化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの
非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍ
ｌのストレプトマイシンを補充した、Ｅａｒｌｅ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地）
にて培養する。
使用して調製する（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５
）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）；
Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７６）；Ｈａ
ｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、５６３〜
６８１頁（１９８１））。一般的に、動物（好ましくは、マウス）を、ＢＭＰポ
リペプチドまたはより好ましくは分泌ＢＭＰポリペプチド発現細胞で、免疫する
。このようなポリペプチド発現細胞を、適切な任意の組織培養培地（好ましくは
、１０％ウシ胎仔血清（約６５℃にて不活化）を補充し、そして約１０ｇ／ｌの
非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１００μｇ／ｍ
ｌのストレプトマイシンを補充した、Ｅａｒｌｅ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ’ｓ培地）
にて培養する。
【０６７８】
このようなマウスの脾細胞を抽出し、そして適切な骨髄腫細胞株と融合させる
。適切な任意の骨髄腫細胞株を、本発明に従って使用し得るが、しかし、親骨髄
腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）（ＡＴＣＣから入手可能）を使用することが好ましい。融
合後、生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地にて選択的に維持し、ついで、
Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５〜２３２（１
９８１））により記載されるように、限界希釈によってクローン化する。ついで
、このような選択を介して得たハイブリドーマ細胞をアッセイして、ＢＭＰポリ
ペプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する。
。適切な任意の骨髄腫細胞株を、本発明に従って使用し得るが、しかし、親骨髄
腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）（ＡＴＣＣから入手可能）を使用することが好ましい。融
合後、生じたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地にて選択的に維持し、ついで、
Ｗａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５〜２３２（１
９８１））により記載されるように、限界希釈によってクローン化する。ついで
、このような選択を介して得たハイブリドーマ細胞をアッセイして、ＢＭＰポリ
ペプチドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定する。
【０６７９】
あるいは、ＢＭＰポリペプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタイ
プ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗
体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能
であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用
して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細
胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細
胞は、ＢＭＰタンパク質特異的抗体に結合する能力がＢＭＰポリペプチドによっ
てブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングさ
れる。このような抗体は、ＢＭＰタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイ
プ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＢＭＰタンパク質特異的抗体の形
成を誘導するために使用される。
プ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、抗
体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可能
であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使用
して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾細
胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ細
胞は、ＢＭＰタンパク質特異的抗体に結合する能力がＢＭＰポリペプチドによっ
てブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングさ
れる。このような抗体は、ＢＭＰタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイ
プ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるＢＭＰタンパク質特異的抗体の形
成を誘導するために使用される。
【０６８０】
ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして下記に議論される
（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１
９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃ
ａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｅ
Ｐ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；
Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして下記に議論される
（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１
９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃ
ａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｅ
Ｐ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇ
ｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；
Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０６８１】
（ｂ）ｓｃＦｖのライブラリーからのＢＭＰポリペプチドに対して指向される
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ＢＭＰポリペプチド（ド
ナーは、これらに対して曝露されていても曝露されていなくともよい）に対する
反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第
５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照の
こと）。
抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ＢＭＰポリペプチド（ド
ナーは、これらに対して曝露されていても曝露されていなくともよい）に対する
反応性を含む抗体フラグメントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第
５，８８５，７９３号（その全体が参考として本明細書に援用される）を参照の
こと）。
【０６８２】
（ライブラリーのレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ））
ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから
ｓｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレ
スキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて
、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．
８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ
−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺
伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして
培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３
７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ
．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そし
て一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように
調製する。
ｓｃＦｖのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージをレ
スキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用いて
、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０．
８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ
−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０8ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ遺
伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そして
培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら３
７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．ｍ
．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌア
ンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そし
て一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のように
調製する。
【０６８３】
Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13 形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらに１時
間インキュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ
．ｐ．ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３
００ｍｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。ファージ
粒子を、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地か
ら精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィル
ター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13 形質導入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０６８４】
（ライブラリーのパニング）
Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩コーテ
ィングする。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロ
ックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに
適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキ
ュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００
ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させるこ
とによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とと
もに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０
ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌ
ｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレ
ート上にプレーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のよ
うにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファー
ジを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について
反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−
２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩コーテ
ィングする。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロ
ックし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに
適用し、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキ
ュベートし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１
％Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００
ｍＭトリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させるこ
とによりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とと
もに３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０
ｍｌの対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌ
ｉを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレ
ート上にプレーティングする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のよ
うにΔ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファー
ジを調製する。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について
反復し、３回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−
２０で２０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０６８５】
（バインダーの特徴付け）
第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかでコーティングしたマ
イクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施する。ＥＬＩＳＡにおける陽
性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／
０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。こ
れらの陽性クローンはまた、当業者に公知の技術によって特徴付けされ得る（例
えば、エピトープマッピング、結合アフィニティー、レセプターシグナル変換、
抗体／抗原結合をブロックするか、または競合的に阻害する能力、および競合的
なアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）。
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかでコーティングしたマ
イクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実施する。ＥＬＩＳＡにおける陽
性クローンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／
０１０４７を参照のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。こ
れらの陽性クローンはまた、当業者に公知の技術によって特徴付けされ得る（例
えば、エピトープマッピング、結合アフィニティー、レセプターシグナル変換、
抗体／抗原結合をブロックするか、または競合的に阻害する能力、および競合的
なアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性）。
【０６８６】
（実施例１７：全層関節軟骨修復モデル）
成体ウサギの大腿膝蓋骨関節における全層関節軟骨欠損モデルを用いて、ＢＭ
Ｐの組み合わせが、軟骨および骨の修復に影響を与える能力を評価する。成体ニ
ュージーランド白色ウサギに麻酔をし、そして無菌的手術のために準備をした。
関節軟骨を通り、そしてその下の肋軟骨下骨に達する３．３ｍｍの欠損を、膝関
節の膝蓋骨溝にドリルで開ける。この欠損を空のままにしておくか、またはコラ
ーゲンスポンジ（コントロール）もしくは10μｇ ＢＭＰに浸漬したコラーゲン
スポンジを充填する。切開を閉じ、そして動物を、ケージの中で４週間にわたっ
て自由に運動させる。４週間後、これらの動物を慈悲深く安楽死させ、そして関
節軟骨／肋軟骨下骨の欠損を、修復組織の組織の構造、量および質について組織
学的に評価する。ノーザン分析を、さらなる表現型分類のために行う。
Ｐの組み合わせが、軟骨および骨の修復に影響を与える能力を評価する。成体ニ
ュージーランド白色ウサギに麻酔をし、そして無菌的手術のために準備をした。
関節軟骨を通り、そしてその下の肋軟骨下骨に達する３．３ｍｍの欠損を、膝関
節の膝蓋骨溝にドリルで開ける。この欠損を空のままにしておくか、またはコラ
ーゲンスポンジ（コントロール）もしくは10μｇ ＢＭＰに浸漬したコラーゲン
スポンジを充填する。切開を閉じ、そして動物を、ケージの中で４週間にわたっ
て自由に運動させる。４週間後、これらの動物を慈悲深く安楽死させ、そして関
節軟骨／肋軟骨下骨の欠損を、修復組織の組織の構造、量および質について組織
学的に評価する。ノーザン分析を、さらなる表現型分類のために行う。
【０６８７】
（実施例１８：腱／靭帯様組織形成についてのラットモデルバイオアッセイ
） ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０：６５９１−６５９５（１９８３）に記載される改変版のラット異
所性インプラントアッセイは、ＢＭＰの活性を評価するために用いられる別の方
法である。この改変されたアッセイは、本明細書中では、Ｒｏｓｅｎ改変Ｓａｍ
ｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉアッセイと呼ぶ。このアッセイは、ＢＭＰの骨および軟骨
誘導活性を評価するために広範に用いられている。Ｓａｍｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉ
手順のエタノール沈殿工程は、アッセイされるべき画分を水に対して透析（組成
物が溶液である場合）またはダイアフィルトレーション（組成物が懸濁物である
場合）をすることによって置換される。次いで、この溶液または懸濁液は、０．
１％ ＴＦＡに平衡化される。得られる溶液は、２０ｍｇのラットマトリクスに
添加される。このタンパク質で処理していない偽ラットマトリクスサンプルは、
コントロールとして役立つ。この物質を凍結および凍結乾燥し、そして得られる
粉末を＃５ゼラチンカプセル中に封入する。このカプセルを、２１〜４９日齢の
雄性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの腹部胸郭領域において皮下に移植する。イン
プラントを１０日後に取り出す。各インプラントの切片を固定し、そして組織学
的分析のために処理する。１μｍグリコールメタクリレート切片を、フォン・コ
ッサ染色および酸性フクシン（ｆｕｓｃｈｉｎ）染色して、各インプラント中に
存在する誘導された腱／靭帯様組織形成の量を評価する。
） ＳａｍｐａｔｈおよびＲｅｄｄｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０：６５９１−６５９５（１９８３）に記載される改変版のラット異
所性インプラントアッセイは、ＢＭＰの活性を評価するために用いられる別の方
法である。この改変されたアッセイは、本明細書中では、Ｒｏｓｅｎ改変Ｓａｍ
ｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉアッセイと呼ぶ。このアッセイは、ＢＭＰの骨および軟骨
誘導活性を評価するために広範に用いられている。Ｓａｍｐａｔｈ−Ｒｅｄｄｉ
手順のエタノール沈殿工程は、アッセイされるべき画分を水に対して透析（組成
物が溶液である場合）またはダイアフィルトレーション（組成物が懸濁物である
場合）をすることによって置換される。次いで、この溶液または懸濁液は、０．
１％ ＴＦＡに平衡化される。得られる溶液は、２０ｍｇのラットマトリクスに
添加される。このタンパク質で処理していない偽ラットマトリクスサンプルは、
コントロールとして役立つ。この物質を凍結および凍結乾燥し、そして得られる
粉末を＃５ゼラチンカプセル中に封入する。このカプセルを、２１〜４９日齢の
雄性Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラットの腹部胸郭領域において皮下に移植する。イン
プラントを１０日後に取り出す。各インプラントの切片を固定し、そして組織学
的分析のために処理する。１μｍグリコールメタクリレート切片を、フォン・コ
ッサ染色および酸性フクシン（ｆｕｓｃｈｉｎ）染色して、各インプラント中に
存在する誘導された腱／靭帯様組織形成の量を評価する。
【０６８８】
（実施例１９：骨誘導についてのラットモデルバイオアッセイ）
このアッセイは、同種異系試験サンプルまたは異種試験サンプルを、エーテル
麻酔下のレシピエントラットの皮下部位に移植することからなる。２８日齢〜３
２日齢の雄性Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットを用い得る。垂直な切開（１ｃｍ）を
、無菌条件下で、胸郭領域の上の皮膚において行い、そして平滑（ｂｌｕｎｔ）
解剖によってポケットを調製する。約２５ｍｇのＢＭＰ試験サンプルを、このポ
ケットの中に深く移植し、そしてこの切開を金属皮膚クリップで閉じる。移植の
日を実験１日目と表す。インプラントを１２日目に取り出す。異所性（ｈｅｔｅ
ｒｏｔｒｏｐｉｃ）部位は、垂直向性部位の使用から生じる、あり得る曖昧さを
伴わない、骨誘導の研究を可能にする。
麻酔下のレシピエントラットの皮下部位に移植することからなる。２８日齢〜３
２日齢の雄性Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラットを用い得る。垂直な切開（１ｃｍ）を
、無菌条件下で、胸郭領域の上の皮膚において行い、そして平滑（ｂｌｕｎｔ）
解剖によってポケットを調製する。約２５ｍｇのＢＭＰ試験サンプルを、このポ
ケットの中に深く移植し、そしてこの切開を金属皮膚クリップで閉じる。移植の
日を実験１日目と表す。インプラントを１２日目に取り出す。異所性（ｈｅｔｅ
ｒｏｔｒｏｐｉｃ）部位は、垂直向性部位の使用から生じる、あり得る曖昧さを
伴わない、骨誘導の研究を可能にする。
【０６８９】
骨誘導活性を、移植１２日目のアルカリホスファターゼの比活性およびカルシ
ウム含量によって生化学的に決定する。アルカリホスファターゼの比活性の増加
は、骨形成の開始を示す。一方、カルシウム含量は、インプラントにおいて形成
される骨の量に比例する。それゆえ、骨形成を、ラットにおいて１２日目のイン
プラントのカルシウム含量を決定することにより算出し、そして「骨形成単位」
として表す。ここで、１骨形成単位は、１２日目のインプラントの最大骨形成活
性の半分に必要であるタンパク質量を表す。このアッセイでは比較の目的で、イ
ンタクトな鉱物質除去ラット骨マトリクスによって示される骨誘導は、最大骨分
化活性であるとみなされる。
ウム含量によって生化学的に決定する。アルカリホスファターゼの比活性の増加
は、骨形成の開始を示す。一方、カルシウム含量は、インプラントにおいて形成
される骨の量に比例する。それゆえ、骨形成を、ラットにおいて１２日目のイン
プラントのカルシウム含量を決定することにより算出し、そして「骨形成単位」
として表す。ここで、１骨形成単位は、１２日目のインプラントの最大骨形成活
性の半分に必要であるタンパク質量を表す。このアッセイでは比較の目的で、イ
ンタクトな鉱物質除去ラット骨マトリクスによって示される骨誘導は、最大骨分
化活性であるとみなされる。
【０６９０】
好結果のインプラントは、以下を含むタンパク質誘導軟骨性骨発生の段階を経
る制御された進行を示す：（１）１日目のにおける、多形核白血球による一時的
な浸潤；（２）２日目および３日目における、間葉細胞の移動および増殖；（３
）５日目および６日目における軟骨細胞の出現；（４）７日目における軟骨マト
リクス形成；（５）８日目における軟骨カルシウム沈着；（６）９日目および１
０日目における脈管浸潤、骨芽細胞の出現、および新骨の形成；（７）１２日目
〜１８日目における破骨細胞の出現、骨再造形および移植されたマトリクスの溶
解；ならびに２１日目における小骨における造血骨髄分化。１以上のＢＭＰの量
を増加させることがこの時間経過を加速し得ることが可能である。新骨の形状は
、移植されたマトリクスの形状と同様になる。
る制御された進行を示す：（１）１日目のにおける、多形核白血球による一時的
な浸潤；（２）２日目および３日目における、間葉細胞の移動および増殖；（３
）５日目および６日目における軟骨細胞の出現；（４）７日目における軟骨マト
リクス形成；（５）８日目における軟骨カルシウム沈着；（６）９日目および１
０日目における脈管浸潤、骨芽細胞の出現、および新骨の形成；（７）１２日目
〜１８日目における破骨細胞の出現、骨再造形および移植されたマトリクスの溶
解；ならびに２１日目における小骨における造血骨髄分化。１以上のＢＭＰの量
を増加させることがこの時間経過を加速し得ることが可能である。新骨の形状は
、移植されたマトリクスの形状と同様になる。
【０６９１】
組織学的切片化および染色は、インプラントにおける骨形成の程度を決定する
ために好ましい。インプラントをブワン溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、
そして６μｍ〜８μｍの切片になるように切断する。トルイジンブルーまたはヘ
マトキシリン（ｈｅｍｐｔｏｘｙｌｉｎ）／エオシンでの染色は、軟骨内性骨の
最終的な発生を明確に実証する。１２日目のインプラントは、通常、このインプ
ラントが新たに誘導された骨を含むか否かを決定するために十分である。
ために好ましい。インプラントをブワン溶液中で固定し、パラフィンに包埋し、
そして６μｍ〜８μｍの切片になるように切断する。トルイジンブルーまたはヘ
マトキシリン（ｈｅｍｐｔｏｘｙｌｉｎ）／エオシンでの染色は、軟骨内性骨の
最終的な発生を明確に実証する。１２日目のインプラントは、通常、このインプ
ラントが新たに誘導された骨を含むか否かを決定するために十分である。
【０６９２】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性は、骨形成のマーカーとして用いられ得
る。この酵素活性は、インプラントのホモジナイゼーション後に分光測光法によ
って決定され得る。この活性は、インビボで９日目〜１０日目にピークを迎え、
その後徐々に低下する。組織学によって骨発生が示されなかったインプラントは
、これらのアッセイ条件下ではアルカリホスファターゼ活性をほとんどまたは全
く有さない。このアッセイは、ラットからインプラントが取り出されたすぐ後で
の骨形成の定量および評価の獲得のために有用である。あるいは、骨形成の量を
、インプラントのカルシウム含量を測定することにより決定し得る。
る。この酵素活性は、インプラントのホモジナイゼーション後に分光測光法によ
って決定され得る。この活性は、インビボで９日目〜１０日目にピークを迎え、
その後徐々に低下する。組織学によって骨発生が示されなかったインプラントは
、これらのアッセイ条件下ではアルカリホスファターゼ活性をほとんどまたは全
く有さない。このアッセイは、ラットからインプラントが取り出されたすぐ後で
の骨形成の定量および評価の獲得のために有用である。あるいは、骨形成の量を
、インプラントのカルシウム含量を測定することにより決定し得る。
【０６９３】
軟骨内性骨または他の型の組織形成に関連する遺伝子発現パターンもまた、ノ
ーザンブロット分析のような当業者に公知の手順を用いてｍＲＮＡレベルを定量
することによりモニタリングされ得る。このような発生的遺伝子発現マーカーを
用いて、ＢＭＰ処理後に組織分化経路を経る進行を決定し得る。これらのマーカ
ーとしては、骨再生についての骨芽細胞関連マトリクスタンパク質（例えば、プ
ロコラーゲンα2（Ｉ）、プロコラーゲンα1（Ｉ）、プロコラーゲンα1（ＩＩ
Ｉ）、オステオネクチン、オステオポンチン、ビグリカンおよびアルカリホスフ
ァターゼ）が挙げられる（例えば、Ｓｕｖａら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒ
ｅｓ．，８：３７９−８８（１９９３）；Ｂｅｎａｙａｈｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：６２−７３（１９９４）を参照のこと）。
ーザンブロット分析のような当業者に公知の手順を用いてｍＲＮＡレベルを定量
することによりモニタリングされ得る。このような発生的遺伝子発現マーカーを
用いて、ＢＭＰ処理後に組織分化経路を経る進行を決定し得る。これらのマーカ
ーとしては、骨再生についての骨芽細胞関連マトリクスタンパク質（例えば、プ
ロコラーゲンα2（Ｉ）、プロコラーゲンα1（Ｉ）、プロコラーゲンα1（ＩＩ
Ｉ）、オステオネクチン、オステオポンチン、ビグリカンおよびアルカリホスフ
ァターゼ）が挙げられる（例えば、Ｓｕｖａら，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒ
ｅｓ．，８：３７９−８８（１９９３）；Ｂｅｎａｙａｈｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６：６２−７３（１９９４）を参照のこと）。
【０６９４】
（実施例２０：骨修復についてのネコモデルバイオアッセイ）
大腿骨切術欠損を、外科的に調製する。さらなる介入を伴わずにシミュレーシ
ョンされる骨折欠損は、一貫して進行して、仮関節となる。作製された骨欠損中
に移植されるＢＭＰの組成物およびデバイスの効果を、以下の研究プロトコルに
従って評価する。
ョンされる骨折欠損は、一貫して進行して、仮関節となる。作製された骨欠損中
に移植されるＢＭＰの組成物およびデバイスの効果を、以下の研究プロトコルに
従って評価する。
【０６９５】
１ｃｍおよび２ｃｍの大腿欠損ネコの研究は、ＢＭＰを含むマトリクスを含む
デバイスが以下を行い得ることを実証する：（１）大型動物における重量を保持
する骨欠損を修復すること；（２）移植のすぐ後（２週間より短い）に骨形成を
一貫して誘導すること；および（３）容量／容量を基礎として正常骨と等しい強
さを有する骨を、軟骨内骨化によって誘導すること。さらに、全ての動物は、こ
の研究の間健常なままであり、そして移植されたデバイスに対する臨床的または
組織的実験室反応の証拠を示さない。この骨欠損モデルでは、コントロールの骨
インプラント部位ではほとんどまたは全く治癒が存在しない。この結果は、大き
な仮関節骨欠損を修復するための、本発明のＢＭＰの組成物およびデバイスの好
結果の使用についての証拠を提供する。
デバイスが以下を行い得ることを実証する：（１）大型動物における重量を保持
する骨欠損を修復すること；（２）移植のすぐ後（２週間より短い）に骨形成を
一貫して誘導すること；および（３）容量／容量を基礎として正常骨と等しい強
さを有する骨を、軟骨内骨化によって誘導すること。さらに、全ての動物は、こ
の研究の間健常なままであり、そして移植されたデバイスに対する臨床的または
組織的実験室反応の証拠を示さない。この骨欠損モデルでは、コントロールの骨
インプラント部位ではほとんどまたは全く治癒が存在しない。この結果は、大き
な仮関節骨欠損を修復するための、本発明のＢＭＰの組成物およびデバイスの好
結果の使用についての証拠を提供する。
【０６９６】
手短には、この手順は、以下の通りである：各々１０ｌｂよりも少ない体重の
１６匹の成体のネコは、外側の外科的アプローチを用いて右大腿における１ｃｍ
骨欠損の片側調製を受ける。他の実験では、２ｃｍの骨欠損が作製され得る。こ
の大腿は、８穴プレートの側方配置により直ちに内固定されて、この欠損の正確
な寸法が保存される。
１６匹の成体のネコは、外側の外科的アプローチを用いて右大腿における１ｃｍ
骨欠損の片側調製を受ける。他の実験では、２ｃｍの骨欠損が作製され得る。こ
の大腿は、８穴プレートの側方配置により直ちに内固定されて、この欠損の正確
な寸法が保存される。
【０６９７】
３つの異なる型の材料を、外科的に作製したネコ大腿欠損に移植し得る：I群
は、４Ｍグアニジン−ＨＣｌで処理した（不活化した）ネコの鉱物質除去骨マト
リクス粉末（ＧｕＨＣｌ−ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）のインプラントと同じプレー
ト固定を受けるネガティブコントロール群である；ＩＩ群は、生物学的に活性な
鉱物質除去骨マトリクス粉末（ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）を移植したポジティブコ
ントロール群である；そしてＩＩＩ群およびＩＶ群は、ＧｕＨＣｌ−ＤＢＭキャ
リアサンプルの各々へのＢＭＰ単独（ＩＩＩ群）、ならびに１より多くのＢＭＰ
またはＢＭＰおよび別の適切な因子の組み合わせ（ＩＶ群）を添加して、Ｉ群〜
ＩＩ群と同じ手順を受ける。
は、４Ｍグアニジン−ＨＣｌで処理した（不活化した）ネコの鉱物質除去骨マト
リクス粉末（ＧｕＨＣｌ−ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）のインプラントと同じプレー
ト固定を受けるネガティブコントロール群である；ＩＩ群は、生物学的に活性な
鉱物質除去骨マトリクス粉末（ＤＢＭ）（３６０ｍｇ）を移植したポジティブコ
ントロール群である；そしてＩＩＩ群およびＩＶ群は、ＧｕＨＣｌ−ＤＢＭキャ
リアサンプルの各々へのＢＭＰ単独（ＩＩＩ群）、ならびに１より多くのＢＭＰ
またはＢＭＰおよび別の適切な因子の組み合わせ（ＩＶ群）を添加して、Ｉ群〜
ＩＩ群と同じ手順を受ける。
【０６９８】
全ての動物を、手術後、それらのケージの中で自由に歩かせる。全てのネコに
、骨標識のためにテトラサイクリン（各週２５ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＱ）を４週間
にわたって）を注射する。４匹のＩＩＩ群の動物および４匹のＩＶ群の動物以外
の全ての動物を、大腿骨切り術の４ヵ月後に屠殺する。
、骨標識のためにテトラサイクリン（各週２５ｍｇ／ｋｇ皮下（ＳＱ）を４週間
にわたって）を注射する。４匹のＩＩＩ群の動物および４匹のＩＶ群の動物以外
の全ての動物を、大腿骨切り術の４ヵ月後に屠殺する。
【０６９９】
インビボでの放射性体型測定（ｒａｄｉｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ）研究を
、大腿および骨切り術部位の真の前方−後方図を一貫して生成するために設計さ
れたクッションＸ線ジグ（ｃｕｓｈｉｏｎｅｄ Ｘ−ｒａｙ ｊｉｇ）に配置し
た、軽く麻酔した動物の標準化したＸ線を撮ることにより手術後４、８、１２お
よび１６週間後に直ちに行う。全てのＸ線を正確に同じ様式で、かつ正確に同じ
位置で同じ動物について撮る。骨修復を、ランダムな点分析による鉱化作用の関
数として算出する。切り出した骨の最終標本のＸ線撮影研究を、屠殺後２つの平
面で行う。
、大腿および骨切り術部位の真の前方−後方図を一貫して生成するために設計さ
れたクッションＸ線ジグ（ｃｕｓｈｉｏｎｅｄ Ｘ−ｒａｙ ｊｉｇ）に配置し
た、軽く麻酔した動物の標準化したＸ線を撮ることにより手術後４、８、１２お
よび１６週間後に直ちに行う。全てのＸ線を正確に同じ様式で、かつ正確に同じ
位置で同じ動物について撮る。骨修復を、ランダムな点分析による鉱化作用の関
数として算出する。切り出した骨の最終標本のＸ線撮影研究を、屠殺後２つの平
面で行う。
【０７００】
１６週目に、ＩＩＩ群およびＩＶ群の結合した大腿のパーセントと、Ｉ群〜Ｉ
Ｖ群における平均骨欠損再生パーセントを比較する。Ｉ群ＧｕＨＣｌ−ＤＭＢネ
ガティブコントロールインプラントは、一般に、４週間で骨成長を示さないはず
であり、８週間および１２週間で１０％未満、そして１６週間で約１６％（±１
０％）の骨成長を示すはずである。ＩＩ群ＤＭＢポジティブコントロールインプ
ラントは、一般に、４週間で約１５〜２０％の修復、８週間で３５％、１２週間
で５０％（±１０％）および１６週間までに７０％（±１２％）の修復を示すは
ずである。
Ｖ群における平均骨欠損再生パーセントを比較する。Ｉ群ＧｕＨＣｌ−ＤＭＢネ
ガティブコントロールインプラントは、一般に、４週間で骨成長を示さないはず
であり、８週間および１２週間で１０％未満、そして１６週間で約１６％（±１
０％）の骨成長を示すはずである。ＩＩ群ＤＭＢポジティブコントロールインプ
ラントは、一般に、４週間で約１５〜２０％の修復、８週間で３５％、１２週間
で５０％（±１０％）および１６週間までに７０％（±１２％）の修復を示すは
ずである。
【０７０１】
切り出した試験大腿および正常大腿は、骨デンシトメトリーによって直ちに研
究され得るか、または２層の生理食塩水浸漬タオルに包まれ、シールしたプラス
チック袋中に配置され、そして−２０℃でさらなる研究まで保存され得る。骨修
復強度、荷重欠損（ｌｏａｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）および作業欠損（ｗｏｒ
ｋ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）を、Ｉｎｓｔｒｏｎ試験機械に取り付けられた、特
別に設計したスチールの４点が曲がったジグ上の欠損に荷重をかけることにより
試験して、骨強度、剛性、吸収されるエネルギーおよび欠損の変形を定量する。
試験大腿および正常大腿の研究は、ポンドでの骨強度（荷重）およびジュールで
の作業欠損を生じる。正常な大腿は、96（±１２）ポンドの強度を示す。ＢＭＰ
デバイスを移植した大腿の強度は、骨折の部位での表面積について補正すべきで
ある（骨欠損修復の「砂時計」形状に起因する）。この補正を用いれば、この結
果は、正常な骨強度と密接に関連すはずである。
究され得るか、または２層の生理食塩水浸漬タオルに包まれ、シールしたプラス
チック袋中に配置され、そして−２０℃でさらなる研究まで保存され得る。骨修
復強度、荷重欠損（ｌｏａｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）および作業欠損（ｗｏｒ
ｋ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）を、Ｉｎｓｔｒｏｎ試験機械に取り付けられた、特
別に設計したスチールの４点が曲がったジグ上の欠損に荷重をかけることにより
試験して、骨強度、剛性、吸収されるエネルギーおよび欠損の変形を定量する。
試験大腿および正常大腿の研究は、ポンドでの骨強度（荷重）およびジュールで
の作業欠損を生じる。正常な大腿は、96（±１２）ポンドの強度を示す。ＢＭＰ
デバイスを移植した大腿の強度は、骨折の部位での表面積について補正すべきで
ある（骨欠損修復の「砂時計」形状に起因する）。この補正を用いれば、この結
果は、正常な骨強度と密接に関連すはずである。
【０７０２】
生化学的試験の後、この骨を、２つの長軸方向切片へと欠損部位で直ちにスラ
イスし、計量し、そして容積を測定する。一方の半分を、蛍光染色取り込み評価
を用いる標準的な石灰化骨組織形態計測のために固定し、そして残り半分を脱石
灰されたヘマトキシリン／エオシン染色組織学調製のために固定する。
イスし、計量し、そして容積を測定する。一方の半分を、蛍光染色取り込み評価
を用いる標準的な石灰化骨組織形態計測のために固定し、そして残り半分を脱石
灰されたヘマトキシリン／エオシン染色組織学調製のために固定する。
【０７０３】
骨修復部位からの選択された標本を、冷０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ
ＨＣＯ3、ｐＨ９．０中でＳｐｅｘフリーザーミルによってホモジナイズする。
次いで、上清のアルカリホスファターゼ活性および沈渣の酸可溶性画分の総カル
シウム含量を決定する。
ＨＣＯ3、ｐＨ９．０中でＳｐｅｘフリーザーミルによってホモジナイズする。
次いで、上清のアルカリホスファターゼ活性および沈渣の酸可溶性画分の総カル
シウム含量を決定する。
【０７０４】
（実施例２１：骨修復についてのイヌ尺骨欠損バイオアッセイ）
このアッセイを、本質的にＣｏｏｋら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅ
ｄｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０１：３０２−１１
２（１９９４）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される通
りに行う。手短には、尺骨の分節欠損モデルを用いて、３５〜４５ｋｇの成体雄
性イヌにおける骨治癒を評価する。５００ｍｇの不溶性ウシ骨コラーゲンを含む
実験用コンポジットは、０、６２５、１２００または２５００μｇのいずれかの
ＢＭＰを漸増濃度の１以上のさらなる本発明のＢＭＰまたは他の因子の非存在下
または存在下で用いて再構成される。欠損部位での移植は、１つのキャリアコン
トロールおよび試験される一連の実験的ＢＭＰ濃度で行われる。機械的試験が、
移植の１２週間後に、コンポジットを受けた動物の尺骨について行われる。前肢
のＸ線写真を、この動物を手術の１２週後または１６週後のいずれかで屠殺する
までは毎週撮る。欠損部位および隣接する正常な骨からの組織学的切片を分析す
る。
ｄｉｃｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０１：３０２−１１
２（１９９４）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される通
りに行う。手短には、尺骨の分節欠損モデルを用いて、３５〜４５ｋｇの成体雄
性イヌにおける骨治癒を評価する。５００ｍｇの不溶性ウシ骨コラーゲンを含む
実験用コンポジットは、０、６２５、１２００または２５００μｇのいずれかの
ＢＭＰを漸増濃度の１以上のさらなる本発明のＢＭＰまたは他の因子の非存在下
または存在下で用いて再構成される。欠損部位での移植は、１つのキャリアコン
トロールおよび試験される一連の実験的ＢＭＰ濃度で行われる。機械的試験が、
移植の１２週間後に、コンポジットを受けた動物の尺骨について行われる。前肢
のＸ線写真を、この動物を手術の１２週後または１６週後のいずれかで屠殺する
までは毎週撮る。欠損部位および隣接する正常な骨からの組織学的切片を分析す
る。
【０７０５】
（実施例２２：骨修復についてのサル尺骨および脛骨欠損バイオアッセイ）
アフリカミドリザルにおけるこの骨治癒アッセイを、本質的にＣｏｏｋら，Ｊ
．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，７７Ａ：７３４−５０（１
９９５）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される通りに行
う。手短には、２．０ｃｍの骨骨膜欠損を尺骨長幹の真ん中に作製し、そして漸
増濃度の１以上の本発明のＢＭＰまたは他の因子の非存在下または存在下で１０
００μｇのＢＭＰを含む種々のマトリクスを含むインプラントを充填する。０、
２５０、５００もしくは１０００または２０００μｇのいずれかのＢＭＰで再構
成した種々のマトリクスを含む実験的コンポジットを用いて、脛骨の骨幹におい
て作製した２．０ｃｍのＢＭＰ欠損に充填する。欠損部位での移植は、１つのキ
ャリアコントロールおよび試験される一連の実験的ＢＭＰ濃度で行われる。機械
的試験が、コンポジットを受けた動物の尺骨および脛骨について行われる。欠損
部位および隣接する正常な骨からのＸ線写真および組織学的切片を、Ｃｏｏｋら
に記載される通りに分析する。
．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ，７７Ａ：７３４−５０（１
９９５）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される通りに行
う。手短には、２．０ｃｍの骨骨膜欠損を尺骨長幹の真ん中に作製し、そして漸
増濃度の１以上の本発明のＢＭＰまたは他の因子の非存在下または存在下で１０
００μｇのＢＭＰを含む種々のマトリクスを含むインプラントを充填する。０、
２５０、５００もしくは１０００または２０００μｇのいずれかのＢＭＰで再構
成した種々のマトリクスを含む実験的コンポジットを用いて、脛骨の骨幹におい
て作製した２．０ｃｍのＢＭＰ欠損に充填する。欠損部位での移植は、１つのキ
ャリアコントロールおよび試験される一連の実験的ＢＭＰ濃度で行われる。機械
的試験が、コンポジットを受けた動物の尺骨および脛骨について行われる。欠損
部位および隣接する正常な骨からのＸ線写真および組織学的切片を、Ｃｏｏｋら
に記載される通りに分析する。
【０７０６】
（実施例２３：神経再生および修復についてのラットモデルバイオアッセイ
） マトリクスキャリアを調製する。Ｗａｎｇら（ＷＯ９５／０５８４６）は、Ｃ
ｏｌｌａｓｔａｔ．ＲＴＭ．，コラーゲンスポンジ（Ｖｉｔａｐｈｏｒｅ Ｗｏ
ｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いたが、任意の他の所望のキャリア（
例えば、本明細書中に記載されるキャリア）が適用性について試験され得る。コ
ラーゲンキャリアは、洗浄、凍結乾燥、滅菌および脱気することにより調製され
、次いで例えば、以下のいずれかが充填される：ＢＭＰなし（ネガティブコント
ロール群）、ＢＭＰ単独（Ｉ群）、ＢＭＰの特定の組み合わせまたはＢＭＰと他
の因子との特定の組み合わせ（ＩＩ群）。実験的設計についてのバリエーション
は、種々の条件下で種々の異なるＢＭＰの組み合わせを当業者が試験することを
可能にする。
） マトリクスキャリアを調製する。Ｗａｎｇら（ＷＯ９５／０５８４６）は、Ｃ
ｏｌｌａｓｔａｔ．ＲＴＭ．，コラーゲンスポンジ（Ｖｉｔａｐｈｏｒｅ Ｗｏ
ｕｎｄ Ｈｅａｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を用いたが、任意の他の所望のキャリア（
例えば、本明細書中に記載されるキャリア）が適用性について試験され得る。コ
ラーゲンキャリアは、洗浄、凍結乾燥、滅菌および脱気することにより調製され
、次いで例えば、以下のいずれかが充填される：ＢＭＰなし（ネガティブコント
ロール群）、ＢＭＰ単独（Ｉ群）、ＢＭＰの特定の組み合わせまたはＢＭＰと他
の因子との特定の組み合わせ（ＩＩ群）。実験的設計についてのバリエーション
は、種々の条件下で種々の異なるＢＭＰの組み合わせを当業者が試験することを
可能にする。
【０７０７】
全ての操作を、無菌条件下で行う。充填されるマトリクスを、約１．６×２０
ｍｍの長さの無菌排気型シラスチックチュービングまたは生体分解性チュービン
グ（ステント（ｓｔｅｎｔ））（これは、過剰のチュービングを手術前に切り取
って除去し得る）の内側に配置する。マトリクスを含む、排気型シラスティック
または生体分解性ステントを顕微鏡的に適用し、そして切断された神経末端に吻
合（ａｎａｓｔｏｍｉｚｅ）し、次いでこの神経末端を各末端から約１ｍｍとな
るようにステント中に挿入し、１５ｍｍの「神経欠損」ギャップを残す。ラット
を、移植後、週間単位の時間経過で、機能の電気的回復について試験する。複合
筋肉作用ポテンシャル（ＣＭＡＰ）は、機能の回復程度を評価するための再現性
のある経皮測定を提供する。ＣＭＡＰの振幅および潜伏時間は、再神経支配され
た軸索／運動終末板の数に比例し、それゆえ、ニューロン再生の有用な指標とし
て役立つ。
ｍｍの長さの無菌排気型シラスチックチュービングまたは生体分解性チュービン
グ（ステント（ｓｔｅｎｔ））（これは、過剰のチュービングを手術前に切り取
って除去し得る）の内側に配置する。マトリクスを含む、排気型シラスティック
または生体分解性ステントを顕微鏡的に適用し、そして切断された神経末端に吻
合（ａｎａｓｔｏｍｉｚｅ）し、次いでこの神経末端を各末端から約１ｍｍとな
るようにステント中に挿入し、１５ｍｍの「神経欠損」ギャップを残す。ラット
を、移植後、週間単位の時間経過で、機能の電気的回復について試験する。複合
筋肉作用ポテンシャル（ＣＭＡＰ）は、機能の回復程度を評価するための再現性
のある経皮測定を提供する。ＣＭＡＰの振幅および潜伏時間は、再神経支配され
た軸索／運動終末板の数に比例し、それゆえ、ニューロン再生の有用な指標とし
て役立つ。
【０７０８】
動物を移植後種々の時点で組織病理学的試験のために屠殺し得る。皮下組織内
に移植されたコントロールのステントは、組織化学的コントロールとして作用す
る。
に移植されたコントロールのステントは、組織化学的コントロールとして作用す
る。
【０７０９】
本発明が上記の記載および実施例に特に記載されるものとは異なる方法で実施
され得ることは明白である。本発明の多くの改変および変更が、上記教示に鑑み
て可能であり、それゆえ、添付の請求の範囲の範囲内である。
され得ることは明白である。本発明の多くの改変および変更が、上記教示に鑑み
て可能であり、それゆえ、添付の請求の範囲の範囲内である。
【０７１０】
発明の背景、詳細な説明および実施例において引用される各々の文書（特許、
特許出願、学術誌論文、要約、研究室マニュアル、書籍または他の開示物）の開
示全体が、本明細書において参考として援用される。さらに、本明細書とともに
提出される配列表のハードコピーおよび対応するコンピュータ読み出し可能な形
態の両方は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
特許出願、学術誌論文、要約、研究室マニュアル、書籍または他の開示物）の開
示全体が、本明細書において参考として援用される。さらに、本明細書とともに
提出される配列表のハードコピーおよび対応するコンピュータ読み出し可能な形
態の両方は、その全体が、本明細書において参考として援用される。
【０７１１】
【表４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５３７
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０７１２】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７１３】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０７１４】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０７１５】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５３７ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５３７ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７１６】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７１７】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０７１８】
【表５】
ＡＴＣＣ受託番号２０３９８０
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０７１９】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７２０】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０７２１】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０７２２】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号２０３９８０ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号２０３９８０ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７２３】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７２４】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０７２５】
【表６】
ＡＴＣＣ受託番号２０９５６３
（カナダ）
出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０７２６】
（ノルウェー）
出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７２７】
（オーストラリア）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０７２８】
（フィンランド）
出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０７２９】
（英国）
出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号２０９５６３ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。 ＡＴＣＣ受託番号２０９５６３ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７３０】
（スウェーデン）
出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０７３１】
（オランダ）
出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 1/08 Ａ６１Ｐ 7/04 ４Ｃ０８４
3/10 7/06 ４Ｈ０４５
7/04 9/10
7/06 11/00
9/10 11/06
11/00 13/12
11/06 17/00
13/12 17/02
17/00 19/04
17/02 19/10
19/04 21/04
19/10 25/00
21/04 27/02
25/00 29/00
27/02 １０１
29/00 31/04
１０１ 35/00
31/04 37/00
35/00 37/02
37/00 Ｃ０７Ｋ 14/47
37/02 16/18
Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15
16/18 1/19
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21
1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ
5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ
Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ
33/50 Ａ６１Ｋ 37/02
(31)優先権主張番号 ６０／１３１，６７２
(32)優先日 平成11年４月29日(1999．4．29)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／１３８，６３２
(32)優先日 平成11年６月11日(1999．6．11)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／１４７，０２０
(32)優先日 平成11年８月３日(1999．8．3)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／１５２，９３３
(32)優先日 平成11年９月９日(1999．9．9)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ
)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，
ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，
ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ
Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ
，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，
ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ
Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ
，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，
ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ
Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ
，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ルーベン， スティーブン エム．
アメリカ合衆国 メリーランド 20832，
オルニー， ヘリテイジ ヒルズ ドラ
イブ 18528
(72)発明者 ニ， ジアン
アメリカ合衆国 メリーランド 20853，
ロックビル， マナーフィールド ロー
ド 5502
(72)発明者 コマットソウリス， ジョージ
アメリカ合衆国 メリーランド 20901，
シルバー スプリング， ギャーウッド
ストリート 9518
(72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ．
アメリカ合衆国 メリーランド 20882，
レイトンズビル， ローリング ヒル
ロード 22400
(72)発明者 シ， ヤング
アメリカ合衆国 メリーランド 20878，
ゲイザースバーグ， アパートメント
102， ウエスト サイド ドライブ 437
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA29 AA40 BB03 BB20
CA25 CA26 CB01 CB03 CB13
CB14 CB17 CB21 DA12 DA13
DA14 DA36 DA37 DA77 FB02
FB03
4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 GA11
HA12 HA20
4B063 QA17 QA19 QQ02 QQ42 QR32
QR55 QS34 QX02
4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA01
DA13
4B065 AA93Y AB01 AC14 BA02
CA24 CA25 CA44 CA46
4C084 AA01 AA07 AA13 BA22 BA23
NA14 ZA01 ZA16 ZA33 ZA36
ZA40 ZA45 ZA53 ZA54 ZA55
ZA59 ZA66 ZA68 ZA81 ZA89
ZA94 ZA96 ZA97 ZB05 ZB07
ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26
ZB35 ZC35 ZC55
4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10
CA40 EA28 EA50 FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘとして示されるポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣ受託番号
Ｚに含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号Ｙの生物学的に活性なポリペプチドフラグメント、またはＡＴ
ＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされる生物学的に活性な
ポリペプチドフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、ＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれる
ｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドエピトープをコードする、ポリ
ヌクレオチド； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）において特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに
ストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、こ
こで、該ポリヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列
を有する核酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌ
クレオチド、 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 - 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、可溶性ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。 - 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｙとして同定される配列
、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核
酸分子。 - 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｘのヌクレオチド配列全
体、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の単
離された核酸分子。 - 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項２に記載の
単離された核酸分子。 - 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項３に記載の
単離された核酸分子。 - 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
- 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 【請求項９】 遺伝子発現を制御する異種調節エレメントに作動可能に連結
されている、請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の宿主細胞からコードされたポリペプチド
を発現させる工程および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、ポリペプチ
ドを生成する方法。 - 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙとして示されるポリペプチド、または前記ｃＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチド； （ｂ）配列番号Ｙ、または前記ｃＤＮＡによりコードされたポリペプチドのポ
リペプチドフラグメント； （ｃ）配列番号Ｙ、または前記ｃＤＮＡによりコードされたポリペプチドのポ
リペプチドエピトープ；および （ｄ）配列番号Ｙの改変体、 からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
単離されたポリペプチド。 - 【請求項１２】 配列番号Ｙを有するポリペプチドを含む、請求項１１に記
載の単離されたポリペプチド。 - 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
合する、単離された抗体。 - 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
組換え宿主細胞。 - 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、 （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
ド。 - 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または改善する方法であって、
請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチドの治
療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。 - 【請求項１８】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
る罹患しやすさを診断する方法であって、 （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおいて変異の存在または非存在を
決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
態に対する罹患しやすさを診断する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１９】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
る罹患しやすさを診断する方法であって、 （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
在または量を決定する工程、および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
病理学的状態に対する罹患しやすさを診断する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
を同定する方法であって、 （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドを結合パートナーと接触させる工程；
および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすかどうかを決定す
る工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２１】 請求項１１に記載のポリペプチドの活性を改変する分子を
スクリーニングする方法であって、 （ａ）該ポリペプチドを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する
と疑われる化合物と接触させる工程；および （ｂ）該ポリペプチドの活性をアッセイする工程、 を包含する、方法。
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| US60/130,693 | 1999-04-23 | ||
| US13167299P | 1999-04-29 | 1999-04-29 | |
| US60/131,672 | 1999-04-29 | ||
| US13863299P | 1999-06-11 | 1999-06-11 | |
| US60/138,632 | 1999-06-11 | ||
| US14702099P | 1999-08-03 | 1999-08-03 | |
| US60/147,020 | 1999-08-03 | ||
| US15293399P | 1999-09-09 | 1999-09-09 | |
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| PCT/US2000/009028 WO2000061774A2 (en) | 1999-04-09 | 2000-04-06 | Bone morphogenic proteins |
Publications (1)
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|---|---|---|---|---|
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| ES2278079T3 (es) * | 2001-10-31 | 2007-08-01 | Alcon, Inc. | Proteinas morfogenicas oseas (bmp), receptores de bmp y proteinas de union a bmp y su utilizacion en el diagnostico y en el tratamiento del glaucoma. |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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