JP2002537810A - ヒトセルピンタンパク質 - Google Patents

ヒトセルピンタンパク質

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JP2002537810A
JP2002537810A JP2000602772A JP2000602772A JP2002537810A JP 2002537810 A JP2002537810 A JP 2002537810A JP 2000602772 A JP2000602772 A JP 2000602772A JP 2000602772 A JP2000602772 A JP 2000602772A JP 2002537810 A JP2002537810 A JP 2002537810A
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polypeptide
sequence
antibody
polynucleotide
seq
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スティーブン エム． ルーベン，
ジャン ニイ
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Human Genome Sciences Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規ヒトセルピンタンパク質、およびそのようなポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域を含む、単離された核酸に関する。ヒトセルピンポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、抗体、および組換え方法がまた、本発明において提供される。本発明はさらに、これらの新規ヒトセルピンタンパク質に関する障害を診断および処置するために有用な診断方法および治療方法に関する。本発明はさらに、このポリペプチドに対する結合パートナーを同定するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、タンパク質のセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン（Ｓｅｒ
ｐｉｎ））スーパーファミリーの新規なメンバーに関する。より詳細には、セル
ピンポリペプチドをコードする単離された核酸分子が、提供される。セルピンポ
リペプチドおよびこれらのポリペプチドに結合する抗体が、提供される。ヒトセ
ルピンポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを産生するための、ベクタ
ー、宿主細胞、ならびに組換え方法および合成方法もまた、提供される。本発明
はさらに、これらの新規なセルピンポリペプチドに関する障害の診断、処置、予
防および／または予後のために有用な診断方法および治療方法に関する。本発明
はさらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのアゴニストおよびア
ンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、
本発明のポリペプチドの産生および機能を阻害するための方法および／または組
成物に関する。
【０００２】 （発明の背景） 哺乳動物セリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）は、およそ３７０〜４
２０個のアミノ酸の保存された構造を含み、かつ一般に、５０ｋＤａと１００ｋ
Ｄａとの間の分子量に及ぶ単鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）タンパク質のスー
パーファミリーである。α1−抗トリプシン（α1−プロテイナーゼインヒビター
としても公知）は、その同族プロテアーゼ、好中球（白血球）エラスターゼと堅
固な１：１の複合体を形成することによって機能し、その後に、ゆっくりと解離
して、活性酵素および不活性な切断されたインヒビターを生じる、およそ４００
個のアミノ酸残基の単鎖糖タンパク質であるという点で、セルピンファミリーの
特徴的なメンバーである（Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ ５２：５２７〜５３５（１９８７））。セルピンの反応中心は、代
表的には、標的セリンプロテアーゼに対する基質として作用するＸ−Ｓｅｒによ
って形成され：α1−抗トリプシンは、メチオニン残基とともにＭｅｔ−Ｓｅｒ
反応中心を有し、これは、好中球エラスターゼについての推定切断部位を提供す
る。
【０００３】 セルピンの大部分は、プロテアーゼインヒビターとして機能し、それによりい
くつかのプロテイナーゼ活性化生理学的プロセスの調節（例えば、血液凝固、フ
ィブリン溶解、補体活性化、細胞外マトリクスの代謝回転、細胞移動、およびプ
ロホルモン活性化に関与する（Ｐｏｔｅｍｐａ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈ
ｅｍ．２６９：１５９５７〜１９５６０（１９９４））。留意されるように、セ
ルピンは、それらの同族プロテイナーゼの活性部位と１：１の化学量論的複合体
（これは、変性剤に対して耐性である）を形成することによってタンパク質分解
事象を阻害する（Ｃｏｈｅｎ，Ａ．Ｂ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：
３９２〜４００（１９８７））。セルピンとしては、α1−抗トリプシン（α1−
プロテイナーゼインヒビター）、抗トロンビンＩＩＩ、プラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）、プラスミノーゲンアクチベーターイン
ヒビター２（ＰＡＩ−２）、α1−抗キモトリプシン、およびα2−抗プラスミン
が挙げられるがこれらに限定されない（ Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．およびＣａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２８：８９５１〜８９６６（１９８９）。
【０００４】 従って、新規なセルピンファミリーメンバーを同定し、かつ利用するための明
白な必要性が存在する。構造的に関連するが、このようなタンパク質は、種々の
細胞型および組織型において、多様かつ多面的な機能を保有し得る。本発明の精
製されたセルピンポリペプチドは、血液凝固、フィブリン溶解、補体活性化、細
胞外マトリクスの代謝回転、細胞移動およびプロホルモン活性化に関与するさら
なる分子の同定、特徴づけ、および精製のための有用な研究ツールとして有用で
ある。さらに、新しいセルピンポリペプチドの同定は、核酸レベルおよびタンパ
ク質レベルで、誘導体、アゴニストおよびアンタゴニストの範囲の開発を可能に
し、次いで、状態の範囲（例えば、血液凝固、フィブリン溶解、補体活性化、細
胞外マトリクスの代謝回転、細胞移動、およびプロホルモン活性化）の処置およ
び診断における適用を有する。
【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、配列表に開示されるか、および／または表１に記載されるヒトｃＤ
ＮＡプラスミド中に含まれ、かつアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａ
ＴＣＣ）に寄託されたポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはそれらからなる
単離された核酸分子を含む。これらの核酸分子のフラグメント、改変体、および
誘導体もまた、本発明により包含される。本発明はまた、セルピンポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核
酸分子を含む。本発明はさらに、これらのポリヌクレオチドによりコードされる
セルピンポリペプチドを含む。配列表に開示される、および／または表１に記載
されるヒトｃＤＮＡプラスミドによりコードされ、かつＡＴＣＣに寄託されたセ
ルピンポリペプチドを含むか、あるいはそれらからなるアミノ酸配列が、さらに
提供される。これらのポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明により含まれ
る。これらのアミノ酸配列のポリペプチドのフラグメント、改変体、および誘導
体もまた、これらのポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを結合する抗体を
コードするポリヌクレオチドと同様に、本発明により包含される。
【０００６】 （詳細な説明） （表） 表１は、本出願に関してＡＴＣＣになされた寄託物のＡＴＣＣ寄託証、寄託日
、およびＡＴＣＣ寄託番号を要約する。
【０００７】 （定義） 以下の定義は、本明細書を通して使用される特定の用語の理解を容易にするた
めに提供される。
【０００８】 本発明において、「単離された（単離した）」とは、その本来の環境（例えば
、それが天然に存在する場合は天然の環境）から取り出された物質をいい、した
がって、その天然の状態から「人間の手によって」変更されている。例えば、単
離されたポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物の一部であり得るか、ある
いは細胞中に含まれ得、そしてなお「単離されている」。なぜなら、そのベクタ
ー、組成物、または特定の細胞は、ポリヌクレオチドの本来の環境ではないから
である。用語「単離された」は、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリ
ー、丸ごとの細胞全体またはｍＲＮＡ調製物、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動に
より分離されたものおよびブロットにトランスファーされたものを含む）、せん
断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物あるいは、当該分野が本発明のポリヌクレオ
チド／配列の際立った特徴を示せない他の組成物をいわない。
【０００９】 本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」とは、配列番号Ｘ（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：Ｘ）に含まれる核酸配列（表１の欄５に記載される）を有する
分子、またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ（表１の欄３に記載され、かつＡＴＣＣに
寄託されたプラスミドのプール内に含まれる）をいう。例えば、このポリヌクレ
オチドは、５’および３’非翻訳配列、天然もしくは人工のシグナル配列を含む
かもしくは含まないコード領域、タンパク質コード領域を含む全長ｃＤＮＡ配列
のヌクレオチド配列、ならびにこの核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメ
イン、および改変体を含み得る。さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペ
プチド」とは、広く定義されるように、本発明のポリヌクレオチドによりコード
されるアミノ酸配列を有する分子（ｃＤＮＡに対応する配列のポリＡテイルの翻
訳から生じるポリフェニルアラニンまたはポリリジンのペプチド配列は明らかに
除かれる）をいう。
【００１０】 本発明において、配列番号Ｘの配列を含む代表的なプラスミドは、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）に
寄託され、そして／または表１に記載される。表１に示されるように、各々のプ
ラスミドは、ｃＤＮＡクローンＩＤ（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）およびＡＴＣＣ受
託番号（ＡＴＣＣ寄託番号Ｚ）によって同定される。単一の寄託として、プール
され、そして受託されるプラスミドは、同じＡＴＣＣ受託番号を有する。ＡＴＣ
Ｃは、アメリカ合衆国、バージニア２０１１０−２２０９、マナサス、Ｂｏｕｌ
ｅｖａｒｄ大学 １０８０１に位置する。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続の目的のた
めの微生物の寄託の国際承認に係るブダペスト条約の条項によって行われた。
【００１１】 本発明の「ポリヌクレオチド」はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で、配列番号Ｘに含まれる配列、またはその相補体（例えば、本明
細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの任意の１、２、３、４、ま
たはそれ以上の補体）、および／またはｃＤＮＡ プラスミドＺに含まれる配列
（例えば、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドフラグメントの１、２、３
、４、またはそれ以上の補体）にハイブリダイズし得る、それらのポリヌクレオ
チドを含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％
ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％
硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中
での４２℃での一晩インキュベーション、次いで０．１×ＳＳＣ中で約６５℃に
てフィルターを洗浄することをいう。
【００１２】 より低い、ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で、本発明のポ
リヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明の「ポリヌクレオ
チド」に含まれる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナ
ル検出の変化は、主として、ホルムアミド濃度（より低い百分率のホルムアミド
が、低下したストリンジェンシーを生じる）；塩条件、または温度の操作を通じ
て達成される。例えば、より低いストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２
０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4；０．０２Ｍ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌ
サケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション
；次いで１×ＳＳＰＥ、０．１％ ＳＤＳを用いた５０℃での洗浄を含む。さら
に、なおより低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション後に行われる洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳ
Ｃ）で行われ得る。
【００１３】 上記の条件における変化が、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラ
ウンドを抑制するために使用される代替的なブロッキング試薬の含有および／ま
たは置換によって達成され得ることに留意すること。代表的なブロッキング試薬
としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、お
よび市販の専売処方物が挙げられる。特異的ブロッキング試薬の含有は、適合性
の問題に起因して、上記のハイブリダイゼーション条件の改変を必要とし得る。
【００１４】 もちろん、ポリＡ＋配列（例えば、配列表に示されるｃＤＮＡの任意の３’末
端ポリＡ＋領域（ｔｒａｃｔ））に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的スト
レッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の
定義に包含されない。なぜなら、このようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）ス
トレッチまたはその相補体を含む任意の核酸分子（例えば、プライマーとしてオ
リゴｄＴを使用して産生される、事実上任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）にハイ
ブリダイズするからである。
【００１５】 本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキ
シリボヌクレオチドから構成され得、これは、非改変ＲＮＡもしくは非改変ＤＮ
Ａまたは改変ＲＮＡもしくは改変ＤＮＡであり得る。例えば、ポリヌクレオチド
は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ
、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物である
ＲＮＡ、ハイブリッド分子（一本鎖、もしくはより代表的には二本鎖、または一
本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含む）から
構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲ
ＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチド
はまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つ以上の改変さ
れた塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変された」塩基とし
ては、例えば、トリチル化された塩基、およびイノシンのような普通でない塩基
が挙げられる。種々の改変が、ＤＮＡおよびＲＮＡに対して行われ得；したがっ
て、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に改変された形態
を含む。
【００１６】 特定の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１５の
、少なくとも３０の、少なくとも５０の、少なくとも１００の、少なくとも１２
５の、少なくとも５００の、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチド
であるが、３００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、
１５ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、７．５ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２．５ｋｂ未満、
２．０ｋｂ未満、または１ｋｂ未満の長さである。さらなる実施形態においては
、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書中に開示されたコード配列の一部を含
むが、任意のイントロンの全てまたは一部を含むわけではない。別の実施形態に
おいては、コード配列を含むポリヌクレオチドは、ゲノムの隣接遺伝子のコード
配列（すなわち、ゲノムにおける目的の遺伝子に対する５’または３’）を含ま
ない。他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１０００、５００
、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２または１以
上のゲノム隣接遺伝子のコード配列を含まない。
【００１７】 「配列番号Ｘ」とは、表１のカラム５に記載されるポリヌクレオチド配列をい
うが、「配列番号Ｙ」とは、表１のカラム１０に記載されるポリペプチド配列を
いう。配列番号Ｘは、表１のカラム６において特定される整数によって同定され
る。配列番号Ｙのポリペプチド配列は、配列番号Ｘのポリヌクレオチドによって
コードされる翻訳されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。ポリ
ヌクレオチド配列は、配列リストに示され、直ちに全てのポリペプチド配列が続
く。従って、配列番号１のポリヌクレオチド配列に対応するポリペプチド配列は
、配列リストに示される第１のポリペプチド配列である。第２のポリペプチド配
列は、配列番号２などとして示されるポリヌクレオチド配列に対応する。
【００１８】 本発明のポリペプチドは、ペプチド結合または改変されたペプチド結合、すな
わち、ペプチドアイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）によって互いに連結したアミ
ノ酸から構成され得、そして遺伝子がコードする２０個のアミノ酸以外のアミノ
酸を含み得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセスに
よって、または当該技術分野で周知の化学的改変技術のいずれかによって、改変
され得る。このような改変は、基本テキスト、およびより詳細な研究論文、なら
びに多くの研究文献に十分に記載される。改変は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖
、およびアミノ末端またはカルボキシル末端、を含むポリペプチドのどこにでも
生じ得る。同じ型の改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同じま
たは種々の程度で存在し得ることが理解される。また、所定のポリペプチドは多
くの型の改変を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として
分枝状であり得、そしてそのポリペプチドは、分枝を含むかまたは含まない、環
状であり得る。環状、分枝状および分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳
後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。改変として
は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結
合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、
脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈ
ｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形
成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の
形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、
水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔ
ｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セ
レノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸のトランス
ファーＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴ
ＩＥＳ、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎ
ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡ
ＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴ
ＥＩＮＳ、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、１−１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【００１９】 本発明のポリペプチドは、任意の適切な様式で調製され得る。そのようなポリ
ペプチドとしては、単離された天然に存在するポリペプチド、組換え的に生成さ
れたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組
み合わせによって生成されたポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチ
ドを調製するための手段は、当該分野において十分に理解されている。
【００２０】 ポリペプチドは、分泌タンパク質の形態（成熟形態を含む）であり得るか、ま
たはより大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部であり得る（下記
を参照のこと）。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製において補助す
る配列（例えば、多重のヒスチジン残基）、または組換え生成の間の安定性のた
めのさらなる配列を含むさらなるアミノ酸配列を含むことは、しばしば有利であ
る。
【００２１】 本発明のポリペプチドは、好ましくは単離された形態で提供され、そして好ま
しくは実質的に精製される。ポリペプチドの組換え的に生成されたバージョン（
分泌ポリペプチドを含む）は、本明細書中で記載される技術か、または当該分野
で別の公知の技術を使用して（例えば、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅ
ｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））により記載される１工程方法によって）
、実質的に精製され得る。本発明のポリペプチドはまた、本明細書中で記載され
る技術、または当該分野における他の周知の方法を使用して（例えば、当該分野
で周知の方法で本発明のポリペプチドに対して惹起された本発明の抗体を使用す
ることによって）、天然の供給源、合成的な供給源または組換え供給源から精製
され得る。
【００２２】 「機能的活性」を示すポリペプチドとは、本発明の全長（完全）タンパク質と
関連した１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意味する。この
ような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体に結合
する（または結合することについて、ポリペプチドと競合する）能力］、免疫原
性（本発明のポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本発明のポリペプ
チドと多量体を形成する能力、およびポリペプチドについてのレセプターまたは
リガンドに結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】 「機能的活性を有するポリペプチド」とは、特定のアッセイ（例えば、生物学
的アッセイのような）で測定した場合、用量依存性を伴なっても伴なわなくても
、本発明のポリペプチド（成熟形態を含む）の活性と類似であるが、必ずしも同
一ではない活性を示すポリペプチドをいう。用量依存性が存在する場合、ポリペ
プチドの用量依存性と同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと
比較した場合に、所定の活性における用量依存性に実質的に類似する（すなわち
、候補ポリペプチドは、本発明のポリペプチドと比較して、より大きな活性を示
すか、または約１／２５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性、そして
最も好ましくは約１／３以上の活性を示す）。
【００２４】 ポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、改変体、誘導体、およびアナ
ログの機能的活性は、種々の方法によってアッセイされ得る。
【００２５】 例えば、全長ポリペプチドの抗体への結合について本発明の全長ポリペプチド
に結合するか、またはそれと競合する能力についてアッセイする、１つの実施形
態では、当該分野で公知の種々の免疫アッセイが、用いられ得る。このようなア
ッセイとしては、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）
、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、ゲル拡散沈降反応、
免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素また
は放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ
（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍
光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどのような
技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されな
い。１つの実施形態では、抗体結合が、一次抗体上の標識を検出することによっ
て検出される。別の実施形態では、この一次抗体は、この一次抗体に対する二次
抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態で
は、この二次抗体が標識される。多くの手段が、免疫アッセイにおける結合の検
出について当該分野で公知であり、そして本発明の範囲内である。
【００２６】 別の実施形態では、同定されたリガンド、または本発明のポリペプチドフラグ
メント、改変体、または誘導体が多量体化する能力が評価される場合、結合が、
例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティー
クロマトグラフィー、ならびにアフィニティーブロッティングのような当該分野
で周知の手段によって、アッセイされ得る。一般には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ、Ｅ．
ら、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３を参照のこと
。別の実施形態では、その基質への本発明のポリペプチドの結合の生理学的相関
（シグナル伝達）がアッセイされ得る。
【００２７】 さらに、本明細書中に記載のアッセイ（実施例を参照のこと）および当該分野
で公知の他のアッセイは、本発明のポリペプチドならびにそれらのフラグメント
、改変体、誘導体、およびアナログが、ポリペプチドの生物学的活性に関連した
関連の生物学的活性を（インビトロまたはインビボのいずれかで）惹起する能力
を測定するために、慣用的に適用され得る。他の方法は、当業者に公知であり、
そして本発明の範囲内である。
【００２８】 （本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド） （遺伝子番号１によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、肝臓の再生において重要であると考えられるラット
ＲＡＳＰ１（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｓｅｒｐｉｎ
−１）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ｇｉ｜１３９７２４１を参照のこと）と配列相
同性を共有する。この相同性に基づいて、これらのタンパク質は、少なくとも生
物学的活性を共有することが予測される。開示されたｃＤＮＡをコードする遺伝
子は、第１４染色体上に位置すると考えられる。従って、本発明に関連するポリ
ヌクレオチドは、第１４染色体に対する連鎖分析におけるマーカーとして有用で
ある。
【００２９】 このｃＤＮＡは、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーより単離された。加えて、こ
の遺伝子は、主に始原樹状細胞、活性化されたＴ細胞、骨髄組織、子宮内膜腫瘍
組織、拒絶された腎組織、膵臓腫瘍細胞、好中球、ポリＩ／Ｃを用いて刺激され
たｐＢＭＣ、および卵巣組織、そしてより低い程度には、種々の正常な細胞型お
よび形質転換された細胞型において発現されることが発見されている。
【００３０】 従って、本発明の核酸は、生物学的試料中に存在する肝臓、免疫および腎臓の
組織または細胞型の示差的同定のため、ならびに以下の疾患および状態の診断の
ための試薬として有用である：肝臓障害、免疫系障害、腎障害、癌および他の増
殖障害。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、セ
ルピンプロテアーゼインヒビターとして、および組織または細胞型の示差的同定
のための免疫学的プローブを提供することに有用である。上記組織または細胞の
多くの障害、特に免疫系および腎臓系の多くの障害について、標準的な遺伝子発
現レベル、すなわち、障害を有さない個体からの健常組織の発現レベルに対して
有意により高いまたはより低いレベルのこの遺伝子の発現が、このような障害を
有する個体から採取された特定の組織（例えば、免疫、腎臓、癌、および創傷組
織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液および髄液）で慣用的
に検出される。本発明の好ましいポリペプチドとしては、配列番号４中で残基：
Ｇｌｕ−１〜Ｇｌｙ−６、Ｓｅｒ−４９〜Ａｓｐ−５４、Ａｓｎ−６４〜Ａｒｇ
−７０、Ｌｙｓ−７８〜Ｌｙｓ−８３、Ｐｈｅ−１４６〜Ａｒｇ−１５１、Ａｓ
ｎ−１９４〜Ａｓｎ−１９９、Ｐｈｅ−２０７〜Ｌｙｓ−２１２、として示され
る免疫原性エピトープが挙げられる。これらポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた提供される。
【００３１】 免疫組織、肝臓組織および腎臓組織におけるこの組織分布、およびＲＡＳＰ１
（セルピン）に対する相同性は、このクローンのタンパク質産物が、免疫系障害
、肝臓系障害、腎臓系障害、癌および他の増殖障害の診断および／または処置に
有用であることを示す。肝細胞において活性なセルピンに対する組織分布および
相同性は、このクローンのタンパク質産物が、肝臓障害および癌（例えば、胚芽
細胞腫、黄疸、肝炎、肝臓代謝病および肝細胞の祖先細胞の分化に起因する条件
）の検出および処置に有用であることを示す。さらに、腎臓における組織分布は
、この遺伝子または遺伝子産物が、腎臓疾患（腎不全、腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｕ
ｓ），尿細管性アシドーシス、蛋白尿、膿尿、水腫、腎盂腎炎、水腎、ネフロー
ゼ症候群、圧挫症候群、糸球体腎炎、血尿、腎仙痛および腎臓結石、ならびにウ
ィルムス腫疾患、および馬蹄腎、多発性嚢胞腎およびファンコーニ症候群のよう
な先天的腎臓異常を含む）の処置および／または検出に有用であることを示唆す
る。あるいは、免疫組織における組織分布は、このクローンのタンパク質産物が
、種々の免疫系障害の診断および処置に有用であることを示す。扁桃におけるこ
の遺伝子産物の発現は、以下の調節における役割を示唆する：増殖；生存；分化
；および／または血液幹細胞を含む、潜在的に全ての造血細胞系統の活性化。こ
の遺伝子産物は、サイトカイン生成、抗原提示、または癌の処置における有用性
を示し得る他のプロセス（例えば、免疫応答をブーストすることによって）の調
節に関与し得る。この遺伝子は、リンパ球由来の細胞において発現されるので、
この遺伝子、またはタンパク質、ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上に
列挙した組織に対する腫瘍マーカーおよび／または免疫療法の標的としての有用
性を示し得る。従って、それはまた、免疫学的障害（関節炎、ぜん息、ＡＩＤＳ
のような免疫不全疾患、白血病、リウマチ様関節炎、炎症、腸疾患、敗血症、挫
瘡および乾癬を含む）に対する薬剤としても使用され得る。加えて、この遺伝子
産物は、幹細胞および種々の血液系統の関連した前駆体の増大における、そして
種々の細胞型の分化および／または増殖における商業的な有用性を有し得る。タ
ンパク質、ならびにそのタンパク質に対する抗体は、上に列挙した組織に対する
腫瘍マーカーおよび／または免疫療法の標的としての有用性を示し得る。
【００３２】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号２に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号２の１〜１６１８の任意の整数であり、ｂは１５〜１６３２
の整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号２に示されるヌクレオチド残
基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４以上である）を含む１つ以上のポ
リヌクレオチドが除外される。
【００３３】 （遺伝子番号２によってコードされるタンパク質の特徴） この遺伝子の翻訳産物は、ヒトトロンビンインヒビター（Ｇｅｎｂａｎｋ登録
番号ｇｉ｜２９７４１２を参照のこと）、（セルピン（セリンプロテアーゼイン
ヒビター）ファミリーのメンバー）との配列相同性を共有し、これは、アポトー
シス（プログラム化された細胞死）において重要であると考えられている。相同
性に基づいて、これらのタンパク質は、少なくともいくつかの生物学的活性を共
有することが予測される。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、
以下のアミノ酸配列を含む：
【００３４】
【化１】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドは、以下の配列を含む：
【００３５】
【化２】 さらに特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
は、以下の配列を含む：
【００３６】
【化３】 ここで、Ｎは、１〜９の量の任意のヌクレオチドを示し、そしてＸは、１〜３の
量の任意のアミノ酸を示すので、この遺伝子のオープンリーディングフレーム中
に存在し得る任意のフレームシフトを、克服し得る。これらのポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【００３７】 この遺伝子は、主に腹部創傷組織（切開後、７０分および９０分）、ヒト副腎
腫瘍組織、およびマクロファージ−ｏｘＬＤＬを治癒する際に、発現され、そし
てより少ない程度では、ＫＭＨ２およびＴＮＦ誘導羊膜細胞において発現される
。
【００３８】 従って、本発明の核酸は、生物学的サンプル中に存在する組織または細胞型の
差示的同定のため、ならびに以下の疾患および状態の診断のための試薬として有
用である：癌および増殖性障害。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプ
チドに対する抗体は、組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブ
の提供に有用である。上記組織または細胞、特に免疫系の多くの障害に関して、
標準の遺伝子発現レベル（すなわち、障害を有さない個体由来の健常組織中の発
現レベル）に対して有意に高いまたは低いレベルのこの遺伝子の発現が、このよ
うな障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、増殖性障害、癌性組
織および創傷組織）または体液（例えば、リンパ、血清、血漿、尿、滑液もしく
は髄液）中で検出され得る。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号５にお
いて残基：Ｐｈｅ−３２〜Ｌｅｕ−４０、Ｔｈｒ−１２４〜Ｌｙｓ−１２９、Ａ
ｓｐ−１４３〜Ｖａｌ−１５１として示される免疫原性エピトープを含む。この
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた提供される。
【００３９】 副腎腫瘍組織における組織分布、およびセルピン（セリンプロテアーゼインヒ
ビター）ファミリーのメンバーに対する相同性は、このクローンのタンパク質産
物が、癌および他の増殖性障害の診断および／または処置のために有用であるこ
とを示唆する。同様に、増殖細胞により特徴付けられた細胞供給源での発現は、
このタンパク質が細胞分裂の調節において役割を果たし得、そして癌および他の
増殖性障害の診断および処置において有用性を示し得ることを示唆する。同様に
、アポトーシスに関与するセルピンファミリーのメンバーであるヒトトロンビン
インヒビターに対する相同性は、このタンパク質がまた、アポトーシスまたは組
織分化に関与し得、そしてまた、癌治療において有用であり得ることを示唆する
。タンパク質、ならびにこのタンパク質に対する抗体は、上記に列挙した組織に
ついての腫瘍マーカーおよび／または免疫治療標的としての有用性を示し得る。
【００４０】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能である。これらの配列のいくつ
かは、配列番号３に関連し、そして本発明の着想の前に公に利用可能であったか
もしれない。好ましくは、このような関連するポリヌクレオチドは、本発明の範
囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙することは煩わしい。従って、好
ましくは、本発明からは、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（こ
こで、ａは配列番号３の１〜６９２の任意の整数であり、ｂは１５〜７０６の整
数であり、ここでａおよびｂの両方は配列番号３に示されるヌクレオチド残基の
位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１以上である）を含む１つ以上のポリヌク
レオチドが除外される。
【００４１】
【表１】 表１は、上記の各「遺伝子番号」に対応する情報を要約する。「ヌクレオチド
配列番号Ｘ」として同定されるヌクレオチド配列は、表１において同定される「
ｃＤＮＡクローンＩＤ」から、およびいくつかの場合において、さらなる関連の
ＤＮＡクローンから得られる、部分的に相同な（「重複する」）配列から構築さ
れた。重複する配列は、高い冗長性の単一の連続した配列に構築され（通常、各
ヌクレオチド位置で３〜５個の重複する配列）、配列番号Ｘとして同定される最
終的な配列を得た。
【００４２】 ｃＤＮＡクローンＩＤは、その日付に寄託され、そして「ＡＴＣＣ寄託番号Ｚ
および日付」において列挙される対応する寄託番号が与えられた。寄託物のいく
つかは、同じ遺伝子に対応する複数の異なるクローンを含む。「ベクター」は、
ｃＤＮＡクローンＩＤにおいて含まれるベクターの型をいう。
【００４３】 「総ヌクレオチド配列」は、「遺伝子番号」によって同定されるコンティグに
おけるヌクレオチドの総数をいう。寄託されたプラスミドは、これらの配列の全
てを含み得、この配列は、配列番号Ｘの「クローン配列の５’ヌクレオチド」お
よび「クローン配列の３’ヌクレオチド」として示されるヌクレオチドの位置に
よって反映される。推定メチオニン開始コドンの配列番号Ｘのヌクレオチドの位
置は（存在する場合）、「開始コドンの５’ヌクレオチド」として同定される。
同様に、推定シグナル配列の配列番号Ｘのヌクレオチドの位置は（存在する場合
）、「シグナルペプチドの第一のアミノ酸の５’ヌクレオチド」として同定され
る。
【００４４】 翻訳されたアミノ酸配列は、ポリヌクレオチド配列の第１翻訳コドンで始まり
、「アミノ酸配列番号Ｙ」として同定されるが、他のリーディングフレームもま
た、公知の分子生物学技術を使用して容易に翻訳され得る。これらの代替的オー
プンリーディングフレームによって産生されるポリペプチドは、本発明によって
具体的に意図される。
【００４５】 配列番号Ｘ（ここで、Ｘは、配列表に開示されたポリヌクレオチド配列のいず
れかであり得る）および翻訳される配列番号Ｙ（ここで、Ｙは、配列表に開示さ
れたポリペプチド配列のいずれかであり得る）は、十分に正確であり、そしてそ
うでなければ、当該分野において周知でありかつ以下でさらに記載される種々の
使用に適切である。例えば、配列番号Ｘは、配列番号Ｘにおいて含まれる核酸配
列または寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡを検出する核酸ハイブリダイ
ゼーションプローブを設計することを含む使用を有するが、これらに限定されな
い。これらのプローブはまた、生物学的サンプル中の核酸分子にハイブリダイズ
し、それによって本発明の種々の法医学の方法、および診断の方法を可能にする
。同様に、配列番号Ｙから同定されるポリぺプチドは、表１において同定された
ｃＤＮＡクローンによりコードされる分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を
産生することを含むが、これらに限定されない使用を有する。
【００４６】 それにもかかわらず、配列決定反応によって生じるＤＮＡ配列は、配列決定の
エラーを含み得る。エラーは、誤って同定されたヌクレオチドとして、または生
じたＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの挿入または欠失として存在する。誤って
挿入されたか、または欠失されたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列のリーディ
ングフレームにおいてフレームシフトを引き起こす。これらの場合において、生
じたＤＮＡ配列は、実際のＤＮＡ配列と９９．９％（例えば、１０００塩基を超
えるオープンリーディングフレームにおける１塩基の挿入または欠失）を超えて
同一であり得るにもかかわらず、推定アミノ酸配列は、実際のアミノ酸配列とは
異なる。
【００４７】 従って、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における正確さを必要とするこ
れらの適用のために、本発明は、配列番号Ｘとして同定された作製されたヌクレ
オチド配列、および配列番号Ｙとして同定された推定の翻訳されたアミノ酸配列
のみではなく、表１において記載されるような、ＡＴＣＣに寄託された本発明の
ヒトｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのサンプルもまた提供する。各々の寄託さ
れたプラスミドのヌクレオチド配列は、公知の方法に従って寄託されたプラスミ
ドの配列決定により容易に決定され得る。
【００４８】 次いで、推定アミノ酸配列は、このような寄託物から証明され得る。さらに、
特定のプラスミドによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列はまた、ペプチ
ド配列決定により、または寄託されたヒトｃＤＮＡを含む適切な宿主細胞中でタ
ンパク質を発現し、このタンパク質を収集し、そしてその配列を決定することに
より、直接的に決定され得る。
【００４９】 また、ｃＤＮＡプラスミドを含むベクターの名前を表１に提供する。各ベクタ
ーは、当該分野において、慣用的に使用される。以下のさらなる情報は、利便性
のために提供される。
【００５０】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
． １６：７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ
．およびＳｈｏｒｔ，Ｊ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７
：９４９４（１９８９））ならびにｐＢＫ（Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ，Ｍ．Ａ．
ら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ５：５８−６１（１９９２））は、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０１１ Ｎ．Ｔｏｒ
ｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９２０３７から市販
されている。ｐＢＳは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてｐＢＫはネオマ
イシン耐性遺伝子を含む。ファージミドｐＢＳは、λＺａｐベクターおよびＵｎ
ｉ−Ｚａｐ ＸＲベクターから切り出され得、そしてファージミドｐＢＫは、Ｚ
ａｐ発現ベクターから切り出され得る。両方のファージイミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ
株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（これもまた、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能である
）に形質転換され得る。
【００５１】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ １．０、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ
２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ ６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ
２０８９７から得られた。全てのＳｐｏｒｔベクターはアンピシリン耐性遺伝
子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（これもまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｇｒｕｂ
ｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５：５９（１９９３）を参照のこと。ベクタ
ーｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉ株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形質転換され得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．
１（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、
Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００８から入手可能である）は、アンピシリン耐
性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓから入手可能である）に形質転換され得る。例えば、Ｃｌａｒｋ，Ｊ
．Ｍ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９６７７−９６８６（１９８８）
およびＭｅａｄ，Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）を
参照のこと。
【００５２】 本発明はまた、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／または寄託されたプラスミ
ド（ｃＤＮＡプラスミド：Ｚ）に対応する遺伝子に関する。対応する遺伝子は、
本明細書中に開示される配列情報を使用して、公知の方法に従って単離され得る
。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する
工程、およびゲノム物質の適切な供給源から対応する遺伝子を同定または増幅す
る工程を包含するが、これらに限定されない。
【００５３】 本発明においてまた提供されるものは、対立遺伝子改変体、オルトログ（ｏｒ
ｔｈｏｌｏｇ）、および／または種相同体である。当該分野において公知である
手順は、本明細書中で開示された配列またはＡＴＣＣに寄託されたクローンから
の情報を用いて、配列番号Ｘ、配列番号Ｙ、および／またはｃＤＮＡプラスミド
：Ｚに対応する遺伝子の全長遺伝子、対立遺伝子改変体、スプライス改変体、全
長コード部分、オルトログ、および／または種相同体を得るために使用され得る
。例えば、対立遺伝子改変体および／または種相同体は、本明細書中に提供され
る配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、そして対立遺伝子改変体
および／または所望の相同体について適切な核酸供給源をスクリーニングするこ
とにより単離および同定され得る。
【００５４】 本発明は、配列番号Ｘの核酸配列および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚを含
むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はま
た、配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチ
ド、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポ
リペプチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドを提供する。
配列番号Ｙのポリペプチド配列、配列番号Ｘによりコードされるポリペプチド、
および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペ
プチドを含むか、または代替的にこれらからなるポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドはまた、本発明により包含される。本発明はさらに、配列番号Ｘの
核酸配列の相補体、および／またはｃＤＮＡプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡのコー
ド鎖の相補体を含むか、または代替的にこれらからなるポリヌクレオチドを包含
する。
【００５５】 多くのポリヌクレオチド配列（例えば、ＥＳＴ配列）は、公に利用可能であり
、そして配列データベースを通してアクセス可能であり、そして本発明の着想の
前に公に利用可能であったかもしれない。好ましくは、このような関連するポリ
ヌクレオチドは、本発明の範囲から特に除外される。全ての関連配列を列挙する
ことは、本出願の開示では非常に煩わしい。従って、好ましくは、配列番号Ｘは
、一般式ａ−ｂにより記載されるヌクレオチド配列（ここで、ａは配列番号Ｘの
１と配列番号Ｘの最終ヌクレオチド−１５との間の任意の整数であり、ｂは１５
〜配列番号Ｘの最終ヌクレオチドの整数であり、ここでａおよびｂの両方は配列
番号Ｘに示されるヌクレオチド残基の位置に対応し、そしてここでｂはａ＋１４
以上である）を含む１つ以上のポリヌクレオチドが除外される。
【００５６】 （全長遺伝子の回収のためのＲＡＣＥプロトコル） 部分的ｃＤＮＡクローンは、Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８９９８−９００２（１９８８）に記載
されたｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）手順を利用することにより全長を作
製し得る。５’末端または３’末端のいずれかが欠失しているｃＤＮＡクローン
は、翻訳の開始コドンまたは終止コドンのそれぞれに伸長する欠失塩基対を含む
ように再構築され得る。いくつかの場合において、ｃＤＮＡは、そのために翻訳
の開始を欠失している。以下に、この本来の５’ＲＡＣＥ手順の改変を簡単に記
載する。ポリＡ＋または全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｇｉｂｃ
ｏ／ＢＲＬ）およびｃＤＮＡ配列に特異的なアンチセンスプライマーまたは相補
的プライマーを用いて逆転写する。そのプライマーを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて反応から除去する。次いで、第
１鎖ｃＤＮＡを、ｄＡＴＰおよび末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて、添付する。このように、アンカー配列を産生
し、これは、ＰＣＲ増幅のために必要である。第２鎖をｄＡ−テイル含有ＰＣＲ
緩衝液、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）
、５’末端で３つの隣接制限部位（ＸｈｏＩ、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ）を含む
オリゴｄＴプライマーならびにこれらの制限部位を正しく含むプライマーから合
成する。この２本鎖ｃＤＮＡを同じプライマーならびにネスティッドｃＤＮＡ特
異的アンチセンスプライマーを用いて４０サイクルでＰＣＲ増幅する。このＰＣ
Ｒ産物を、エチジウムブロマイドアガロースゲル上でサイズ分離し、そして欠失
しているタンパク質コードＤＮＡの推定サイズのｃＤＮＡ産物を含むゲルの領域
を取り出す。ｃＤＮＡをＭａｇｉｃ ＰＣＲ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を用いてアガロースゲルから精製し、ＸｈｏＩまたはＳａｌＩを用いて制限
消化し、そしてプラスミド（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ））にＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位で連結する。このＤ
ＮＡを細菌に形質転換し、そしてこのプラスミドクローンを配列決定して、正確
なタンパク質コード挿入物を同定する。正確な５’末端を、推定的に同定された
相同体を有するこの配列と部分的ｃＤＮＡクローンを有する重複を比較すること
により確認する。当該分野において公知の同様の方法および／または市販のキッ
トを使用して、増幅し、そして３’末端を回収する。
【００５７】 いくつかの、品質制御キットが購入のために市販されている。上記のそれらと
同様の試薬および方法は、全長遺伝子を回収をするための５’ ＲＡＣＥおよび
３’ＲＡＣＥの両方について、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬからキットの形態で供給され
る。第２のキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。このキットは、Ｄ
ｕｍａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９：５２２７−３２（
１９９１）により開発された、関連技術の改変（ＳＬＩＣ（一本鎖ｃＤＮＡへの
、一本鎖の連結））である。手順における主な違いは、ＲＮＡを、逆転写後にア
ルカリ加水分解し、そしてＲＮＡリガーゼを使用して、第１鎖ｃＤＮＡに、制限
部位を含むアンカープライマーを連結することである。これは、過去に配列決定
をするのが困難なポリＴの伸長を生じるｄＡテーリング反応における必要性を除
去する。
【００５８】 ＲＮＡからの５’ｃＤＮＡまたは３’ｃＤＮＡを産生する代替は、ｃＤＮＡラ
イブラリー二本鎖ＤＮＡを使用することである。非対称性ＰＣＲ増幅アンチセン
スｃＤＮＡ鎖は、アンチセンスｃＤＮＡ特異的プライマーおよびプラスミドアン
カープライマーを用いて合成する。これらのプライマーを除去し、そして対称Ｐ
ＣＲ反応を、ネストしたｃＤＮＡ特異的アンチセンスプライマーおよびプラスミ
ドアンカープライマーを用いて実施する。
【００５９】 （５’末端配列または３’末端配列を産生し、全長遺伝子を得るための、ＲＮ
Ａリガーゼのプロトコル） 一旦、目的の遺伝子が同定されると、本来のｃＤＮＡプラスミド中には存在し
ないかもしれない遺伝子の５’部分または３’部分の同定のためのいくつかの方
法が利用可能になる。これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フ
ィルタープローブ探索、特異的プローブを使用するクローン富化、５’ ＲＡＣ
Ｅおよび３’ＲＡＣＥと類似および同一のプロトコル。全長遺伝子は、ライブラ
リー中に存在し得、そして探索によって同定され得るが、一方、５’末端または
３’末端を生成するために有用な方法は、欠けている情報を生成するために、本
来のｃＤＮＡからの既存の配列情報を、使用することである。５’ＲＡＣＥに類
似する方法は、所望の全長遺伝子の欠けている５’末端を生成するために利用可
能である（この方法は、Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３）によって発
表された）。簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ
転写物をおそらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結し、そして連結されたＲＮ
Ａオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に
特異的なプライマーを含むプライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５
’部分をＰＣＲ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこ
れを使用して全長遺伝子を生成し得る。この方法は、所望の供給源から単離され
た総ＲＮＡを用いて開始し、この手順における必要条件ではないが、ポリＡ Ｒ
ＮＡを使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスファターゼで処理
して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解または損傷ＲＮＡの５’リン酸
基を排除し得る。次いで、使用された場合、ホスファターゼを不活化し、そして
ＲＮＡをメッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在するキャップ構造を除去するた
めに、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処理する。この反応は、次いでＴ
４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチドに連結され得る、キャッ
プ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基を残す。次いで、この改変型ＲＮＡ調製
物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第一鎖ｃＤＮＡ合成のため
のテンプレートとして使用し得る。次いで、第一鎖合成反応物を、連結されたＲ
ＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的のセルピン（Ｓｅｒｐ
ｉｎ）の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増
幅のためのテンプレートとして使用し得る。次いで、得られた生成物を配列決定
し、そして分析して５’末端配列が直接的に関連するセルピンに属することを確
認する。
【００６０】 （ポリヌクレオチドフラグメントおよびポリペプチドフラグメント） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド（核酸）の、ポリヌクレオチドフラ
グメントに関する。本発明において、「ポリヌクレオチドフラグメント」とは、
以下である核酸配列を有するポリヌクレオチドをいう：ｃＤＮＡプラスミドＺに
含まれるｃＤＮＡの一部か、もしくはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡ
によりコードされるポリペプチドをコードするｃＤＮＡの一部；配列番号Ｘもし
くはその相補鎖におけるポリヌクレオチド配列の一部；配列番号Ｙのポリペプチ
ドの一部をコードするポリヌクレオチド配列；あるいは配列番号Ｘによりコード
されるポリペプチドの一部をコードするポリヌクレオチド配列。本発明のヌクレ
オチドフラグメントは、好ましくは、少なくとも約１５ｎｔ、そしてより好まし
くは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そし
てなおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくと
も約７５ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約１２５ｎｔ、または少な
くとも約１５０ｎｔの長さである。例えば、「少なくとも約２０ｎｔの長さ」の
フラグメントは、ｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ配列に含まれる配列または配
列番号Ｘもしくはその相補鎖に示されるヌクレオチド配列由来の２０以上の連続
する塩基を含むことが意図される。この文脈において「約（おおよそ）」は、特
に記載された値、あるいはそれより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレ
オチドだけ大きいかまたは小さな値を含む。これらのヌクレオチドフラグメント
は、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーとしての使
用を含むが、それらに限定されない使用を有する。もちろん、より大きなフラグ
メント（例えば、少なくとも１５０、１７５、２００、２５０、５００、６００
、１０００または２０００のヌクレオチドの長さ）もまた、本発明に含まれる。
【００６１】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
以下の配列番号Ｘ、またはその相補鎖のおおよそのヌクレオチド数の配列を含む
か、あるいは以下からなるフラグメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００
、１０１〜１５０、１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１
〜３５０、３５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０
、５５１〜６００、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００
〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１
０５０、１０５１〜１１００、１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２
０１〜１２５０、１２５１〜１３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４０
０、１４０１〜１４５０、１４５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１
〜１６００、１６０１〜１６５０、１６５１〜１７００および１７０１〜１７１
０。この文脈において、「おおよそ（約）」は、特に記載された範囲、またはい
ずれかの末端もしくは両方の末端において、これより数個（５、４、３、２、ま
たは１）のヌクレオチドだけ大きいか、または小さな範囲を含む。好ましくは、
これらのフラグメントは、配列の一部であるポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドの、機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチド
をコードする。より好ましくは、これらのフラグメントは、本明細書中、上記で
議論されるようにプローブまたはプライマーとして使用され得る。ストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条件下
でこれらのフラグメントの１つ以上にハイブリダイズするポリヌクレオチドもま
た本発明に含まれ、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
またはフラグメントも同様に含まれる。
【００６２】 さらに、本発明のポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては、例えば、
ｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列、またはその相補鎖
の以下のおおよそのヌクレオチド数の配列を含むか、あるいは以下からなるフラ
グメントが挙げられる：１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２
００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜４００、４
０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、６５１〜７
００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜８５０、８５１〜９００、９
０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１〜１０５０、１０５１〜１１００、
１１０１〜１１５０、１１５１〜１２００、１２０１〜１２５０、１２５１〜１
３００、１３０１〜１３５０、１３５１〜１４００、１４０１〜１４５０、１４
５１〜１５００、１５０１〜１５５０、１５５１〜１６００、１６０１〜１６５
０、１６５１〜１７００および１７０１〜１７１０。この文脈において、「おお
よそ（約）」は、特に記載された範囲、あるいはいずれかの末端もしくは両方の
末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のヌクレオチドだけ
大きいか、または小さな範囲を含む。好ましくは、これらのフラグメントは、ｃ
ＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡヌクレオチド配列によってコードされる
ポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコ
ードする。より好ましくは、これらのフラグメントは、本明細書中で議論される
ように、プローブまたはプライマーとして使用され得る。ストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシー条件下で１つ以
上のこれらのフラグメントにハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた本発明
に含まれ、これらのポリヌクレオチドまたはフラグメントによりコードされるポ
リペプチドもまた、含まれる。
【００６３】 本発明において、「ポリペプチドフラグメント」とは、配列番号Ｙに含まれる
アミノ酸配列の一部、配列番号Ｘのポリヌクレオチド配列によってコードされる
アミノ酸配列の一部、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによっ
てコードされるアミノ酸配列の一部であるアミノ酸配列をいう。タンパク質（ポ
リペプチド）フラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」で
あり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド（このフラグメントが、部分また
は領域（最も好ましくは単一の連続した領域として）を形成する）内に含まれ得
る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、以下の配列
番号Ｙのコード領域の、おおよそのアミノ酸数のアミノ酸配列を含むか、あるい
は以下からなるフラグメントが挙げられる：１〜２０、２１〜４０、４１〜６０
、６１〜８０、８１〜１００、１０２〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６
０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２２１〜２４０、２４
１〜２６０、２６１〜２８０、２８１〜３００、３０１〜３２０、３２１〜３４
０、３４１〜３６０、３６１〜３８０、３８１〜４００、４０１〜４２０および
４２１〜４３５。さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、少なくとも約
１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、
７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、ま
たは１５０のアミノ酸の長さであり得る。この文脈において、「約（おおよそ）
」とは、特に記載された範囲または値、あるいはいずれかの末端もしくは両方の
末端において、これより数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大き
いかまたは小さな、範囲または値を含む。これらのポリペプチドフラグメントを
コードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００６４】 タンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以
上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の機能的活性（例えば、生
物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合する能力）は、なお保持され得
る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟形態を認識する抗体を誘導す
るおよび／または抗体に結合する、短縮型ムテインの能力は、完全なポリペプチ
ド、または成熟ポリペプチドの大部分より少ない残基が、Ｎ末端から除去される
場合には、一般的に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定の
ポリペプチドが、このような免疫原性活性を保持するかどうかは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の別の方
法によって容易に決定され得る。多数の欠失したＮ末端アミノ酸残基を有するム
テインは、いくつかの生物学的活性または免疫源性活性を保持し得るようである
。実際に、６つと同じくらい少ないアミノ酸残基からなるペプチドは、しばしば
免疫応答を惹起し得る。
【００６５】 従って、本発明のポリペプチドフラグメントとしては、分泌タンパク質および
成熟形態が挙げられる。さらに好ましいポリペプチドフラグメントとしては、ア
ミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方から、連続した一連の欠失した
残基を有する分泌タンパク質、もしくは成熟形態が挙げられる。例えば、任意の
数のアミノ酸（１〜６０の範囲）は、分泌ポリペプチドもしくは成熟形態のいず
れかのアミノ末端から欠失され得る。同様に、任意の数のアミノ酸（１〜３０の
範囲）が、分泌タンパク質もしくは成熟形態のカルボキシ末端から欠失され得る
。さらに、上記のアミノ末端およびカルボキシ末端の欠失の任意の組み合わせは
好ましい。同様に、これらのポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレ
オチドもまた好ましい。
【００６６】 本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号Ｙのポリ
ペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡによりコー
ドされるポリペプチド）のアミノ酸配列のアミノ末端から、１つ以上の欠失した
残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｎ末端の欠失は、一般式
ｍ−ｑによって記載され得、ここでｑは、本発明のポリペプチド（例えば、配列
番号Ｙに開示されるポリペプチド）におけるアミノ酸残基の総数を表す全整数で
あり、そしてｍは、２〜ｑ−６の範囲の任意の整数として定義される。これらの
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００６７】 さらに、上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失
が、このタンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、
他の機能的活性（例えば、生物学的活性、多量体化する能力、リガンドに結合す
る能力）は、なお保持され得る。例えば、ポリペプチドの完全な形態または成熟
形態を認識する抗体を誘導するおよび／またはこの抗体に結合する、短縮型ムテ
インの能力は、完全なポリペプチド、または成熟ポリペプチドの大部分より少な
い残基が、Ｃ末端から除去される場合には、一般的に保持される。完全なポリペ
プチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫原性活性を保
持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法、およびそうでなければ
当該分野において公知の他の方法によって容易に決定され得る。多数の欠失した
Ｃ末端アミノ酸残基を有するムテインは、いくつかの生物学的活性または免疫源
性活性を保持し得るようである。実際に、６つと同じくらい少ないアミノ酸残基
からなるペプチドは、しばしば免疫応答を惹起し得る。
【００６８】 従って、本発明は、本明細書中で開示されるポリペプチド（例えば、配列番号
Ｙのポリペプチド、配列番号Ｘに含まれるポリヌクレオチド配列によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から、１つ以
上の欠失した残基を有するポリペプチドを、さらに提供する。特に、Ｃ末端の欠
失は、一般式１−ｎによって記載され得、ここでｎは、６〜ｑ−１の範囲の任意
の全整数であり、そしてここでｎは、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸残
基の位置に対応する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た、本発明により含まれる。
【００６９】 さらに、上記のＮ末端またはＣ末端の欠失のいずれかを組み合わせて、Ｎ末端
およびＣ末端欠失型ポリペプチドを産生し得る。本発明はまた、アミノ末端およ
びカルボキシ末端の両方から１つ以上の欠失したアミノ酸を有するポリペプチド
を提供する。このポリペプチドは、一般的に、配列番号Ｘ（例えば、好ましくは
配列番号Ｙとして開示されるポリペプチドを含むが、これに限定されない）およ
び／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡ、ならびに／あるいはそれらの相
補鎖によってコードされるポリペプチドの、残基ｍ−ｎを有する場合に記載され
得、ここでｎおよびｍは、上記のような整数である。これらのポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００７０】 配列番号Ｙのポリペプチドに含まれる任意のポリペプチド配列、配列番号Ｘと
して記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、任意のポリペプチ
ド配列、またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされる任意の
ポリペプチド配列は、そのポリペプチドの特定の好ましい領域を決定するために
、分析され得る。例えば、配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡ
のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、
ＤＮＡＳＴＡＲコンピュータアルゴリズム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，１２２
８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ；ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ／）のデフォルトパラメーターを使
用して、分析され得る。
【００７１】 ＤＮＡＳＴＡＲコンピューターアルゴリズムを使用して慣用的に得られ得るポ
リペプチドの領域としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ターン領域、およびコイル領
域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、およびターン領域、Ｋｙｔ
ｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの
α−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可
撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ
−Ｗｏｌｆの領域。この点で、本発明の非常に好ましいポリヌクレオチドの中に
、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいくつか（例えば、１、２、３
または４））と組み合わされる領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドがある。
【００７２】 従って、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領域および疎水性領域、Ｅｍｉ
ｎｉ表面形成領域、ならびに高い抗原性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域（
すなわち、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆプログラムのデフォルトパラメターを使用
して同定されるような、１．５より大きいか、または１．５に等しい抗原性指標
を有する、４つ以上の連続するアミノ酸を含む）を慣用的に使用して、抗原性に
対する高い程度の潜在性を表すポリペプチドの領域を決定する。高い抗原性の領
域は、免疫応答の開始プロセスにおいて、抗原認識が生じ得る環境中のポリペプ
チドの表面上に曝されるようであるポリペプチドの領域を表す値を選択すること
によって、ＤＮＡＳＴＡＲ分析によるデータから決定される。
【００７３】 本発明の好ましいポリペプチドフラグメントは、そのアミノ酸配列がフラグメ
ントであるポリペプチド配列の、機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すア
ミノ酸配列を含むか、またはあるいは、これらからなるフラグメントである。「
機能的活性」を示すポリペプチドとは、全長タンパク質と関連した１つ以上の公
知の機能的活性（例えば、前述のような、生物学的活性、抗原性、免疫原性、お
よび／または多量体化など）を示し得るポリペプチドを意味する。
【００７４】 他の好ましいポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントで
ある。生物学的に活性なフラグメントとは、本発明のポリペプチドの活性に対し
て、同一である必要はないが、類似する活性を示すフラグメントである。このフ
ラグメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または低下した望ましく
ない活性を含み得る。
【００７５】 好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号Ｙのポリペプ
チドの１、２、３、４、５以上の抗原性フラグメントか、またはその部分を含む
か、またはあるいはそれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドもまた、本発明に含まれる。
【００７６】 本発明は、以下のポリペプチドを含むか、またはあるいは以下からなるポリペ
プチドを含む：配列番号Ｙに示されるポリペプチド配列のエピトープ、またはｃ
ＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列のエピト
ープ、あるいは前述で定義されるように、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下
で、配列番号Ｘのエピトープコード配列またはｃＤＮＡプラスミドＺに含まれる
エピトープコード配列の相補鎖にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドによっ
てコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明はさらに、本発明のポリ
ペプチド配列のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番
号Ｘに開示される配列など）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチ
ド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、および前記で定義されるように、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより低いストリンジェンシ
ー条ハイブリダイゼーション件下で、この相補鎖にハイブリダイズするポリヌク
レオチド配列を含む。
【００７７】 用語「エピトープ」とは、本明細書中で使用される場合、動物において、好ま
しくは哺乳動物において、そして最も好ましくはヒトにおいて抗原性活性または
免疫原性活性を有するポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、
本発明は、エピトープを含むポリペプチド、およびこのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを含む。「免疫原性エピトープ」とは、本明細書中で使用さ
れる場合、当該分野で公知の任意の方法によって決定されるような（例えば、下
記に記載される抗体を産生するための方法による）、動物における抗体応答を誘
発するタンパク質の一部として定義される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３
）を参照のこと）。用語「抗原性エピトープ」とは、本明細書中で使用される場
合、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記載される免疫アッセ
イによる）によって決定されるような、抗体がその抗原に免疫特異的に結合し得
るタンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合は除外
するが、他の抗原との交差反応を除外する必要はない。抗原性エピトープは、免
疫原性である必要はない。
【００７８】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る。（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。こ
れはさらに、米国特許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【００７９】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なく
とも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含
み、そして最も好ましくは約１５アミノ酸と約３０アミノ酸との間の配列を含む
。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチド
は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５
、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基
の長さである。さらなる非排他的に好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で
開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む。抗原性エピトープは、有用
である（例えば、エピトープに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含
む）を惹起するため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される
抗原性エピトープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任
意の組合わせを含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子
として使用され得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７
７８（１９８４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−
６６６（１９８３）を参照のこと）。
【００８０】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
本明細書で開示される免疫原性および２、３、４、５以上のこれらの免疫原性エ
ピトープの任意の組合せを含む。１つ以上の免疫原性エピトープを含むポリペプ
チドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）とともに動物系（例えば、
ウサギまたはマウス）に対する抗体応答を誘発するために提示され得るし、また
はこのポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）、そのポリ
ペプチドはキャリアなしで提示され得る。しかし、８〜１０個程度の少なさのア
ミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖状エ
ピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが示されている（例え
ば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【００８１】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出、およ
びＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用
いて免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチ
ドを結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペ
プチドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｍ
ＢＳ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプ
チドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリア
に結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチ
ドまたはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、約１００μｇのペ
プチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバントまたは免疫応答
を刺激することが公知である他のアジュバントを含むエマルジョンを腹腔内注射
および／または皮内注射することにより免疫される。いくつかのブースター注射
が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間隔で
、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチドを
用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中の抗
ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の方法
に従う固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による）に
より上昇し得る。
【００８２】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、本発明のポリペ
プチドおよびその免疫原性エピトープフラグメントおよび／または抗原性エピト
ープフラグメントは、他のポリペプチド配列に融合され得る。例えば、本発明の
ポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ド
メインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの任意の組
み合わせ、およびこれらの部分）と融合し得、これがキメラポリペプチドを生じ
る。このような融合タンパク質は、精製を容易にし得、そしてインビボにおける
半減期を増加し得る。このことは、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメ
インおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメ
インからなるキメラタンパク質について示された。例えば、ＥＰ ３９４，８２
７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８６（１９８８）
を参照のこと。上皮の関門を横切っての免疫系への抗原の増強された送達は、Ｆ
ｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたはＦｃフラグメント（
例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９９／０４８１３を参
照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）について実証されている
。ジスルフィド架橋二量体構造を有するＩｇＧ融合タンパク質はまた、そのＩｇ
Ｇ部分ジスルフィド結合に起因して、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグ
メント単独よりも、他の分子の結合および中和において効果的であることが見出
された。例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０
：３９５８−３９６４（１９９５）を参照のこと。
【００８３】 同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ国対応出願２０４５８６９）
は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子の定常領域
の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質
中のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、例えば改善され
た薬物動態学的特性を生じ得る（ＥＰ−Ａ ０２３２ ２６２）。あるいは、融
合タンパク質が発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失され得るこ
とが望ましい。例えば、融合タンパク質が、免疫の抗原として使用される場合、
そのＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物探索において、例えばｈＩＬ
−５のようなヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための
高処理能力スクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。
（Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
８：５２−５８（１９９５）；Ｋ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。） さらに、本発明のポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を容易にす
るペプチドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において
、このマーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉ
ｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９
１３１１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり
、それらの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載される
ように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製
に有用な他のペプチドタグである「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７
６７（１９８４））。
【００８４】 従って、これら上記の任意の融合物は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを用いて操作され得る。
【００８５】 上記のエピトープをコードする核酸はまた、エピトープタグ（例えば、血球凝
集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の
遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチドの検出および精製を補助し得る。
例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載された系は、ヒト細胞株において発
現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７
（１９９１））。この系において、目的の遺伝子は、遺伝子の読み取り枠が、６
つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳で融合されるように、ワクシ
ニア組換えプラスミド中にサブクローンされる。このタグは、融合タンパク質に
ついての基質結合ドメインとしてはたらく。組換えワクシニアウイルスに感染し
た細胞由来の抽出物は、Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸アガロースカラムに充填され、
そしてヒスチジンタグ化したタンパク質が、イミダゾール含有緩衝液を用いて選
択的に溶出され得る。
【００８６】 本発明のさらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッ
フリング、エキソンシャッフリング、および／またはコドンシャッフリング（総
称して「ＤＮＡシャッフリング」といわれる）の技術を通じて生成され得る。Ｄ
ＮＡシャッフリングを使用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、この
ような方法を用いて、変化した活性を有するポリペプチド、ならびにそのポリペ
プチドのアゴニストおよびアンタゴニストを生成し得る。一般には、米国特許第
５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号
；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにＰａ
ｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−
３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１６（２）：７６−８２（１９９８）；Ｈａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２８７：２６５−７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏおよびＢｌａ
ｓｃｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）
（これらの特許および刊行物の各々は、本明細書によってその全体が参考として
援用される）を参照のこと。１つの実施形態において、配列番号Ｘに対応するポ
リヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプ
チドの改変は、ＤＮＡシャッフリングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリン
グは、相同組換えまたは部位特異的組換えにより、２つ以上のＤＮＡセグメント
をアセンブリして、ポリヌクレオチド配列における変化を産生することを含む。
別の実施形態において、本発明のポリヌクオチドまたはコードされるポリペプチ
ドは、組換え前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他
の方法による、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の
実施形態において、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの１つ
以上の成分、モチーフ、セクション（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラ
グメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、セクション
、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。
【００８７】 （ポリヌクレオチド改変体およびポリペプチド改変体） 本発明はまた、Ｓｅｒｐｉｎ改変体を含む。本発明は、配列番号Ｘに開示され
るポリヌクレオチド配列の改変体またはそれらに対する相補鎖の改変体、および
／またはｃＤＮＡプラスミドＺ中に含まれるｃＤＮＡ配列の改変体に関する。
【００８８】 本発明はまた、配列番号Ｙに開示されるポリペプチド配列の改変体、配列番号
Ｘのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列の改変体および／
またはｃＤＮＡプラスミドＺ中のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配
列の改変体を含む。
【００８９】 「改変体」とは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが
それらの特性は保持している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。一
般的に、改変体は全体的に非常に類似しており、そして、多くの領域において、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。
【００９０】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子か、あるいはその代わ
りに以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
からなる単離された核酸分子を提供する：（ａ）配列表に示さるようなアミノ酸
配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドをコードし、そして配列番号Ｘまたはｃ
ＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなヌクレオチド配列；（ｂ）配
列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載さ
れるようなアミノ酸配列を有する成熟Ｓｅｒｐｉｎポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｃ）配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラス
ミドＺのｃＤＮＡに記載されるようなアミノ酸配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペ
プチドの生物学的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）
配列表に示されそして配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡに記載
されるアミノ酸配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの抗原性フラグメントを
コードするヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺの
ｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされる完全アミノ
酸配列を含むＳｅｒｐｉｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）
配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプ
ラスミドによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｓｅｒｐｉｎポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミ
ドＺのｃＤＮＡ中に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸
配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｈ）配列番号ＸまたはｃＤＮＡプラスミドＺのｃＤ
ＮＡ中に含まれるヒトｃＤＮＡプラスミドによってコードされるアミノ酸配列を
有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ
）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００９１】 本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むかあるいはその代わりにこれらからなる、核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、または代わりにこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下でこれらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた
、これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発
明によって含まれ得る。
【００９２】 本発明の別の局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドを含むか、あるいはその代わりに以下からなる群より選択さ
れるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドからなる、単離された核酸分子
を提供する：（ａ）配列表に示されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列
を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列
表に示されそして表１に記載されるようなアミノ酸配列を有する成熟Ｓｅｒｐｉ
ｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）配列表に示されそして表
１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの生物学
的に活性なフラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）配列表に示され
そして表１に記載されるアミノ酸配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの抗原
性フラグメントをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれ
かつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコードされ
る完全アミノ酸を含むＳｅｒｐｉｎポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
；（ｆ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中の
ヒトｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟Ｓｅｒｐｉｎポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｇ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表
１に記載されるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコードされるアミ
ノ酸配列を有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを
コードするヌクレオチド配列；（ｈ）ＡＴＣＣ寄託物に含まれかつ表１に記載さ
れるｃＤＮＡプラスミド中のヒトｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を
有するＳｅｒｐｉｎポリペプチドの抗原性フラグメントをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｉ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ
）または（ｈ）における任意のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【００９３】 本発明はまた、例えば上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ
）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中の任意のヌクレオチド配列に少なくとも８０
％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％
同一であるヌクレオチド配列を含むか、あるいはその代わりにこれらからなる核
酸分子に関する。これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、
本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）中のポリ
ヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはその
代わりに低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
を含むか、あるいはこれらからなる、核酸分子を含む。ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件下またはその代わりに低いストリンジェンシー条件下で
これらの核酸分子の相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドもまた、これ
らのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様に、本発明によ
って含まれる。
【００９４】 本発明はまた、例えば、配列番号Ｙで示されるポリペプチド配列、配列番号Ｘ
のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列、ｃＤＮＡプラスミ
ドＺのｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド配列、および／またはこれら
のポリペプチドのいずれかのポリペプチドフラグメント（例えば、本明細書に開
示されるフラグメント）に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、
あるいは代わりにこれらからなる、ポリペプチドに関する。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件下あるいはその代わりに低いストリンジェンシー条
件下で、これらのポリペプチドをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズ
するポリヌクレオチドもまた、これらのポリヌクレオチドによってコードされる
ポリペプチドと同様に、本発明によって含まれる。
【００９５】 本発明の参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」である
ヌクレオチド配列を有する核酸とは、そのヌクレオチド配列がそのポリペプチド
をコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点
変異を含み得ることを除いて、その核酸のヌクレオチド配列が、参照配列に対し
て同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少な
くとも９５％同一のヌクレオチド配列を有する核酸を得るために、その参照配列
のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか、または別のヌクレオチドで置換
され得るか、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオチドの５％までの数のヌク
レオチドが、その参照配列に挿入され得る。照会配列は、表１中に参照される全
体配列（ＯＲＦ（読取り枠））、または本明細書中で記載されるような特定の任
意のフラグメントであり得る。
【００９６】 実際問題として、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログ
ラムを使用して従来どおり決定され得る。照会配列（本発明の配列）と対象配列
との間の最適な全体の整合を決定するための好ましい方法（全体的配列整列とも
いわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３
７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピューター
プログラムを使用して決定され得る。配列整列において、照会配列および対象配
列は、両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによっ
て比較され得る。上記の全体的配列整列の結果は、同一性パーセントである。同
一性パーセントを算定するためにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用さ
れる好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ
＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕ
ｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ
Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレ
オチド配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【００９７】 対象配列が、５’または３’欠失が理由で（内部欠失が理由ではなく）、照会
配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならない。これは
、同一性パーセントを算定する場合に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５
’および３’の短縮を考慮しないからである。照会配列に対して、５’末端また
は３’末端で短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、照会配列
の総塩基のパーセントとして、整合／整列されない対象配列の５’および３’で
ある照会配列の塩基の数を算定することによって補正される。ヌクレオチドが整
合／整列されるか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次
いで、このパーセントは、特定のパラメーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプロ
グラムによって算定された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パ
ーセントのスコアに到達する。この補正されたスコアが、本発明の目的に使用さ
れるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列によって示される場合、照会配列と整合／整
列されいていない、対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、同
一性パーセントのスコアを手動で調整する目的で算定される。
【００９８】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために１００塩
基の問い合わせ配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従って
、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列を示さない。１
０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および３’末端での塩
基の数／問い合わせ配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、ＦＡＳＴＤ
Ｂプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。
残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは９０％で
ある。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の問い合わせ配列と比較
される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、問い合わせと一致／整
列しない対象配列の５’または３’に塩基が存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤ
Ｂによって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、問い合わ
せ配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正さ
れる。他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００９９】 本発明の問い合わせアミノ酸配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」であ
るアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列
は、対象ポリぺプチド配列が、問い合わせアミノ酸配列の各１００個のアミノ酸
あたり５つまでのアミノ酸の変更を含み得ることを除いて、問い合わせ配列に同
一であることが意図される。換言すれば、問い合わせアミノ酸配列に少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るために、対象配列に
おけるアミノ酸残基の５％までが、挿入、欠失、（消えない（ｉｎｄｅｌｓ））
または別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸
配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位置で生じ得るか、またはそれらの末
端位置の間のどこにでも生じ得、参照配列中の残基間で個々に、または参照配列
内の１つ以上の連続する群においてのいずれかで、散在される。
【０１００】 実際問題として、任意の特定のポリぺプチドが、例えば、表１に示されるアミ
ノ酸配列またそのフラグメントに対して、配列番号Ｘのヌクレオチド配列によっ
てコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントに対して、あるいはｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚまたはそのフラグメント中のｃＤＮＡによってコードされるア
ミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、従来的に、公知のコンピュー
タープログラムを使用して決定され得る。問い合わせ配列（本発明の配列）と対
象配列との間での最良の全体的な一致（全体的配列整列としても参照される）を
決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏ
ｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤ
Ｂコンピュータープログラムを使用して決定され得る。配列整列において、問い
合わせ配列および対象配列は、両方ともヌクレオチド配列であるかまたは両方と
もアミノ酸配列であるかのいずれかである。上記の全体的配列整列の結果は、同
一性パーセントで示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に用いられる好ましいパ
ラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔ
ｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄ
ｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒ
ｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ ＝ 配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝
５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚ
ｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ（どちらかより短い方）である。
【０１０１】 対象配列が、Ｎ末端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）問
い合わせ配列よりも短い場合、手動の補正が結果に対してなされなけらばならな
い。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する
場合に、対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないからである。Ｎ末
端およびＣ末端で短縮されている対象配列について、問い合わせ配列に対して、
同一性パーセントは、問い合わせ配列の総塩基のパーセントとして、対応する対
象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である問い合わせ配
列の残基の数を計算することによって補正される。残基が一致／整列されている
か否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパー
セントは、同一性パーセントから差し引かれ、上記のＦＡＳＴＤＢプログラムに
よって特定のパラメーターを使用して計算され、最終的な同一性パーセントのス
コアに到達する。この最終的な同一性パーセントのスコアは、本発明の目的で使
用されるものである。問い合わせ配列と一致／整列していない対象配列のＮ末端
およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整する目的
のために考慮される。すなわち、問い合わせ残基のみが、対象配列の最も遠いＮ
末端およびＣ末端残基の外側に位置する。
【０１０２】 例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために
１００残基の問い合わせ配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そ
してそれゆえＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端での最初の１０残基の一致／整列を示
さない。１０個の不対合残基は、配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ
末端での残基の数／問い合わせ配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴ
ＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し
引かれる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００残基の問い合わ
せ配列と比較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、そのため問い合わせ
配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端またはＣ末端の残基は存在しない。こ
の場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正され
ない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列において示される、問い合わせ配列と一致／整列
しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外の残基位置のみが手動で補正される。
他の手動の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【０１０３】 改変体は、コード領域、非コード領域、またはその両方における変化を含み得
る。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、または欠失を生成するが、
コードされるポリぺプチドの特性または活性を変化させない変化を含むポリヌク
レオチド改変体である。遺伝コードの縮重に起因するサイレントな置換によって
生成されるヌクレオチド改変体が、好ましい。さらに、任意の組合せにおいて、
５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２
５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２アミノ酸が置換、欠失、または付加され
る改変体もまた、好ましい。ポリヌクレオチド改変体は、種々の理由（例えば、
特定の宿主についてのコドン発現を至適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを
、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌宿主によって好ましいコドンに変化させる））のた
めに、生成され得る。
【０１０４】 天然に存在する改変体は、「対立遺伝子改変体」と呼ばれ、そして生物の染色
体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子のいくつかの代替の形態のうちの１つを
いう。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子改変体は、
ポリヌクレオチドレベルおよび／またはポリぺプチドレベルのいずれかで変化し
得、そして本発明に含まれる。あるいは、天然に存在しない改変体は、変異誘発
技術によってまたは直接的な合成によって生成され得る。
【０１０５】 タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の公知の方法を使用して、改変体は、
本発明のポリぺプチドの特性を改善または変化させるために作製され得る。例え
ば、本明細書中で議論されるように、１つ以上のアミノ酸は、生物学的機能の実
質的な欠損を伴わずに、本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失さ
れ得る。Ｒｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２９８４−２９８８（１
９９３）の著者らは、３、８、または２７個のアミノ末端のアミノ酸残基を欠失
させた後でさえもヘパリン結合活性を有する改変体ＫＧＦタンパク質を報告した
。同様に、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１
０個のアミノ酸残基を欠失させた後、１０倍までのより高い活性を示した（Ｄｏ
ｂｅｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８
））。
【０１０６】 さらに、豊富な証拠は、改変体が、天然に存在するタンパク質の生物学的活性
に類似する活性をしばしば保持することを実証する。例えば、Ｇａｙｌｅおよび
共同研究者ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６８：２２１０５−２２１１１（１
９９３））は、ヒトサイトカインＩＬ−１ａの広範囲にわたる変異分析を行った
。彼らは、ランダムな変異誘発を使用して、分子の全長にわたって改変体当たり
平均２．５アミノ酸の変化になる、３，５００個を超える個々のＩＬ−１ａ変異
体を作製した。複数の変異が、全ての潜在的なアミノ酸の位置で試験された。こ
の研究者らは、「分子の大部分は、［結合活性または生物学的活性］のいずれに
対してもほとんど影響を伴わないで変化され得る」ことを見出した。（要約を参
照のこと）。実際、試験された３，５００個を超えるヌクレオチド配列のうち、
わずか２３個の独特なアミノ酸配列が、野生型と活性が有意に異なるタンパク質
を生成した。
【０１０７】 さらに、本明細書中で議論されるように、ポリぺプチドのＮ末端またはＣ末端
からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、１つ以上の生物学的機能の改変または欠失
を生じたとしても、他の生物学的活性はなお保持され得る。例えば、分泌される
形態を認識する抗体を誘導および／または結合する、欠失改変体の能力は、分泌
される形態の大多数より少ない残基が、Ｎ末端またはＣ末端から除去される場合
に保持されるようである。タンパク質のＮ末端またはＣ末端残基を欠損する特定
のポリぺプチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に
記載される慣用的な方法、およびそうでなければ当該分野において公知の慣用的
な方法によって容易に決定され得る。
【０１０８】 従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチドの機能的活性（例えば、生物
学的活性）を示すポリぺプチド改変体を含み、これらは、本発明のポリペプチド
の改変体である。このような改変体としては、活性に対する影響をほとんど有さ
ないように、当該分野において公知の一般的な法則に従って選択される、欠失、
挿入、逆位、反復、および置換が挙げられる。
【０１０９】 本出願は、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、Ｎ末端および／または
Ｃ末端の欠失を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする）に対し
て、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％または１００％同一な核酸分子に関し、これらが機能的活性を有するポリぺ
プチドをコードするか否かに拘らない。これはなぜなら、特定の核酸分子が機能
的活性を有するポリぺプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、核酸分子を
、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマーとしてどのように使用するかを理解するからである。機能的活性
を有するポリぺプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわ
け、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中の遺伝子またはその対立
遺伝子改変体あるいはそのスプライス改変体の単離；（２）遺伝子の正確な染色
体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリ
ダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒ
ｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載され
る）；および（３）特定の組織におけるｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザン
ブロット分析。
【０１１０】 しかし、本明細書中で開示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であ
る配列を有する核酸分子が好ましく、これらは事実、本発明のポリペプチドの機
能的活性を有するポリぺプチドをコードする。
【０１１１】 当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、例えば、ｃＤＮ
Ａプラスミド：Ｚ中のｃＤＮＡの核酸配列、表１に示される核酸配列（配列番号
Ｘ）またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％
、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一な配列を有する
多くの核酸分子が、「機能的活性を有する」ポリぺプチドをコードすることを即
座に認識する。事実、これらのヌクレオチド配列の任意の縮重改変体は全て、同
じポリぺプチドをコードするので、このことは、多くの場合、たとえ上記した比
較アッセイを行わなくても当業者にとって明らかである。縮重改変体ではない核
酸分子に関しては、その相当数がまた、機能的活性を有するポリぺプチドをコー
ドすることが、当該分野においてさらに認識される。これはなぜなら、以下にさ
らに記載されるように、当業者は、タンパク質機能にあまり有意に影響を及ぼし
そうにないか、または有意に影響を及ぼしそうにないかのいずれかのアミノ酸置
換（例えば、ある脂肪族アミノ酸を第二の脂肪族アミノ酸と置換する）を十分に
認識しているからである。
【０１１２】 例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関するガイダンス
が、Ｂｏｗｉｅら，「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０
６−１３１０（１９９０）に提供され、ここで、著者らは変化に対するアミノ酸
配列の寛容性を研究するための２つの主要なストラテジーがあることを指摘する
。
【０１１３】 第１のストラテジーは、進化の過程の間の自然の選択によるアミノ酸置換の寛
容を利用する。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、保存さ
れるアミノ酸が同定され得る。これらの保存されるアミノ酸は、タンパク質の機
能について重要であるようである。対照的に、置換が自然の選択によって寛容さ
れたアミノ酸の位置は、これらの位置がタンパク質の機能に重要ではないことを
示す。従って、アミノ酸置換を寛容する位置は改変され得るが、タンパク質の生
物学的活性をなおも維持する。
【０１１４】 第２のストラテジーは、タンパク質機能に重要な領域を同定するために、クロ
ーン化された遺伝子の特定の位置でアミノ酸変化を導入するための遺伝子工学を
使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（
分子中の全ての残基で１つのアラニン変異の導入）が、使用され得る。（Ｃｕｎ
ｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８
５（１９８９））。次いで、得られた変異分子は生物学的活性について試験され
得る。
【０１１５】 著者らが言及するように、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミ
ノ酸置換に驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化が、タンパク質中の特定のアミノ酸位置で許容されるようであるかを示
す。例えば、（タンパク質の三次構造内に）ほとんど埋もれているアミノ酸残基
は、非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は、一般にほとんど保存されな
い。さらに、寛容される保存的なアミノ酸置換は、脂肪族または疎水性アミノ酸
のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基のＳｅｒお
よびＴｈｒの置換；酸性残基のＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基のＡｓｎ
およびＧｌｎの置換、塩基性残基のＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香
族残基のＰｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ
酸のＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換を含む。保存的なア
ミノ酸置換に加えて、本発明の改変体は、（ｉ）１つ以上の非保存的なアミノ酸
残基との置換、ここでは置換されるアミノ酸残基は、遺伝コードによってコード
されるアミノ酸残基であってもよく、もしくはそうでなくてもよい、または（ｉ
ｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基での置換、または（ｉｉｉ）別の化
合物（例えば、ポリぺプチドの安定性および／もしくは可溶性を増加するための
化合物（例えば、ポリエチレングリコール））との成熟ポリぺプチドの融合、ま
たは（ｉｖ）さらなるアミノ酸（例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチド、また
はリーダーもしくは分泌配列、または精製を容易にする配列）とのポリぺプチド
の融合を含む。このような改変体ポリぺプチドは、本明細書中の教示から、当業
者の範囲内であると考えられる。
【０１１６】 例えば、他の荷電されたアミノ酸または中性のアミノ酸での荷電されたアミノ
酸のアミノ酸置換を含むポリぺプチド改変体は、改善された特性（例えば、より
少ない凝集性）を有するタンパク質を生成し得る。薬学的処方物の凝集は、凝集
体の免疫原活性に起因して、活性の減少およびクリアランスの増加の両方をもた
らす。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：３３１
−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−
８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（
１９９３））。
【０１１７】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含むが、５０
アミノ酸置換を超えず、さらにより好ましくは、４０アミノ酸置換を超えず、な
おより好ましくは、３０アミノ酸置換を超えず、そしてなおさらにより好ましく
は、２０アミノ酸置換を超えないアミノ酸配列を有するポリペプチドのアミノ酸
配列を含むポリペプチドに関する。当然のことながら、ポリペプチドに関して、
配列番号Ｙのポリペプチドのアミノ酸配列、配列番号Ｘによってコードされるア
ミノ酸配列、および／または好ましさの増大する順番に、少なくとも１つのアミ
ノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸
置換を超えないｃＤＮＡプラスミド：ＺにおけるｃＤＮＡによってコードされる
アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい。特定の実施形
態において、配列番号Ｙのアミノ酸配列またはそのフラグメント（例えば、本明
細書に記載の成熟形態および／または他のフラグメント）、配列番号Ｘによって
コードされるアミノ酸配列またはそのフラグメント、および／またはｃＤＮＡプ
ラスミド：Ｚによってコードされるアミノ酸配列またはそのフラグメントにおけ
る付加、置換、および／または欠失の数は、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜
５０、１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい
。本明細書中で議論されるように、本発明の任意のポリペプチドが、融合タンパ
ク質を生成するために使用され得る。例えば、本発明のポリペプチドが、第２の
タンパク質に融合する場合、抗原タグとして使用され得る。本発明のポリペプチ
ドに対して惹起される抗体が使用され、ポリペプチドと結合することにより、第
２のポリペプチドを間接的に検出し得る。さらに、分泌ポリペプチドは、トラフ
ィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）シグナルに基づいて、細胞の位置を標的
化するので、分泌されることが示される本発明のポリペプチドは、一旦他のタン
パク質と融合される標的分子として使用され得る。
【０１１８】 本発明のポリペプチドに融合され得るドメインの例は、異種シグナル配列だけ
ではなく、他の異種機能的領域を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要
はないが、リンカー配列を介して起こり得る。
【０１１９】 特定の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質は、ポリペプチドがＮ
および／またはＣ末端欠失変異体である融合タンパク質を含む。好ましい実施形
態において、この適用は、特定のＮ−およびＣ−末端欠失変異体のアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードする核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５
％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核散分子
に関する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明
に含まれる。
【０１２０】 さらに、融合タンパク質はまた、本発明のポリペプチドの特徴を改善するため
に操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸（特に荷電アミノ酸）の領域は、宿
主細胞からの精製の間、または連続した操作および保存の間に、安定性および持
続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド
部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。このような領域
は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。ポリペプチドの操作を容易に
するためのペプチド部分の付加は、当該分野で精通し、そして慣用的な技術であ
る。
【０１２１】 当業者に理解されるように、本発明のポリペプチドおよび上記のこれらのエピ
トープ保有フラグメントは、異種ポリペプチド配列と組み合わされ得る。例えば
、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド配列と融合され得、例えば、本発
明のポリペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定
常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびそれらの任意
の組み合わせ（ドメイン全体およびそれらの部分の両方を含む））と融合され得
、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易にし、
そしてインビボにおいて増加した半減期を示す。報告例は、ヒトＣＤ４ポリペプ
チドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖
の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（ＥＰ Ａ
３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４−８
６（１９８８）。）ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド連結二量体構造を有する
融合タンパク質はまた、単量体タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よ
りも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る。（Ｆｏｕｎｔ
ｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８−３９６４（１９
９５）。） （ベクター、宿主細胞、およびタンパク質生成） 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、および
組換え技術によるポリペプチドの生成に関する。ベクターは、例えば、ファージ
ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベク
ターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製能があるかまたは複製欠損で
あり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的な宿主細胞においての
み起こる。
【０１２２】 本発明のポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含
むベクターに連結され得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム
沈澱のような沈澱、または荷電した脂質との複合体において導入される。このベ
クターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビト
ロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【０１２３】 そのポリヌクレオチドインサートは、例えば、いくつかの名前を挙げると、フ
ァージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、および
ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウ
イルスＬＴＲのプロモーターなどのような、適切なプロモーターに作動可能に連
結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構
築物は、転写開始のための部位、転写終結のための部位、および転写された領域
において翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現さ
れる転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの始めの翻訳
開始コドンおよび翻訳されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（
ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【０１２４】 示されたように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；酵
母細胞のような真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７
８））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９
３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物細胞が挙げられるが
、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は
当該分野で公知である。
【０１２５】 細菌における使用に好ましいベクターには、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、および
ｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅ
ｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、
ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能）が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中に
は、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ
およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が含まれる。酵母系での使
用のための、好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ
１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰ
ＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ
、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂ
ａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な
ベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１２６】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。本発明のポリペプチドは、組換え
ベクターを欠如する宿主細胞により実際に発現され得ることが具体的に意図され
る。
【０１２７】 本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈澱、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精
製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が
精製のために用いられる。
【０１２８】 本発明のポリペプチドはまた、以下から収集され得る：天然の供給源からの精
製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれにせよ、体液、組
織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿主または真核
生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳
動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え産生手順にお
いて用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されて
いてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリ
ペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、改変された
開始メチオニン残基を含み得る。従って、翻訳開始コドンによってコードされて
いるＮ末端メチオニンは、一般的に、すべての真核生物細胞において翻訳後に任
意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知である。
大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンはまた、大部分の原核生物において効
率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プロセス
は、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非効率的
である。
【０１２９】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、
真核生物系において、本発明のポリペプチドを発現する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓは、メチロトローフィック酵母であり、その唯一の炭素源としてメタ
ノールを代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ2を使用する
ホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコールオ
キシダーゼにより触媒される。その唯一の炭素源としてメタノールを代謝するた
めに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキシダー
ゼの比較的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レベルで産
生しなければならない。結果的に、主な炭素源としてメタノールに依存する増殖
培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうちの１つ（ＡＯＸ１）
のプロモーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺
伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉ
ｓにおいて全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ．Ｂ
．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕ
ｔｚ，Ｐ．Ｊら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐｐ
，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９８
７）を参照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転写
調節下で、本発明のポリヌクレオチドのような異種コード配列は、メタノール存
在下で増殖されたＰｉｃｈｉａ酵母中に例外的に高レベルで発現される。
【０１３０】 １つの例において、本明細書中に記載されたように、プラスミドベクターｐＰ
ＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｉａ酵母系において、「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，
Ｄ．Ｒ．ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に本質的に記載されたように本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクロー
ニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファ
ターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強
力なＡＯＸ１プロモーターの効果により本発明のポリペプチドの発現および分泌
を可能にする。
【０１３１】 多くの他の酵母ベクターが、当業者が容易に理解するように、提案された発現
構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグ
ナル（必要な場合、インフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ
９Ｋの代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹ
Ｄ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧ
ＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐ
ＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。
【０１３２】 別の実施形態において、例えば、本発明のポリヌクレオチドのような異種コー
ド配列の高レベル発現は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺ
αなど）に本発明の異種ポリヌクレオチドをクローニングすることならびにメタ
ノール非存在下で酵母培養物を増殖させることにより達成され得る。
【０１３３】 本明細書中で議論されるベクター構築物を含有する宿主細胞を含むことに加え
て、本発明はまた、脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の、一次、二次、および不
死化宿主細胞を含み、それは、内在性の遺伝物質（例えば、コード配列）を欠失
または置換するように、そして／または遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチ
ド配列）を含むように操作されており、この遺伝物質は、本発明のポリヌクレオ
チドと作動可能に結合されており、そして内在性のポリヌクレオチドを活性化、
変化、および／または増幅させる。例えば、当該分野で公知の技術が使用されて
、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエ
ンハンサー）と内在性ポリヌクレオチド配列とを作動可能に結合し得る（例えば
、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９
６年９月２６日に公開された国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８
月４日に公開された国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９
８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（
１９８９）を参照のこと、これらの各々の開示はその全体が参考として援用され
る）。
【０１３４】 さらに、本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して化学的に
合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ
．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎ
ａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポ
リペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザー
の使用によって合成され得る。さらに、所望される場合、非古典的アミノ酸また
は化学的アミノ酸アナログが、ポリペプチド配列に置換または付加として導入さ
れ得る。非古典的アミノ酸としては、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−
ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸
、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪
酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロ
キシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−
ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラ
ニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、ｂ−メ
チルアミノ酸）、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的
なアミノ酸アナログが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、アミノ酸は
、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１３５】 本発明は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の
保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子また
は他の細胞リガンドとの結合などによって、翻訳の間または翻訳後に示差的に修
飾される本発明のポリペプチドを含む。任意の多数の化学修飾が公知の技術（臭
化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢ
Ｈ4による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマ
イシンの存在下での代謝的合成などが含まれるがこれらに限定されない）によっ
て実行され得る。
【０１３６】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型また
はＯ結合型の炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸骨格へ
の化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、および原
核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が、
例えば挙げられる。このポリペプチドはまた、酵素標識、蛍光標識、放射性同位
元素標識、またはアフィニティー標識のような検出可能な標識で修飾され、タン
パク質の検出および単離を可能にし得る。
【０１３７】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性および循環時間の増加、または免疫原性の減少）を提供し得る、本発明のポ
リペプチドの化学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を
参照のこと）。誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエ
チレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カ
ルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選
択され得る。このポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこ
の分子内の所定の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分
を含み得る。
【０１３８】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつ
かの分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを
示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の持続時
間、存在する場合には生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の
程度または抗原性がないこと、および治療タンパク質またはアナログに対するポ
リエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得
る。
【０１３９】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；遊離のカ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン
酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基もまた、
ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ得る。治
療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン
基での結合である。
【０１４０】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを本発明の例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分
子量、分枝などによって）、反応混合物中でのポリエチレングリコール分子のタ
ンパク質（ポリペプチド）分子に対する比、行われるべきペグ化反応の型、およ
び選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法を選択し得る。Ｎ末端ペグ化調
製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から分
離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精製
により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選択的タンパク質は、特定のタ
ンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジン対Ｎ
末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る。適切
な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタンパク質
の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１４１】 本発明のポリペプチドは、単量体または多量体（すなわち、二量体、三量体、
テトラマーおよびより高度の多量体）であり得る。従って、本発明は、単量体お
よび多量体の本発明のポリペプチド、それらの調製物およびそれらを含む組成物
（好ましくは治療剤）に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは
、単量体、二量体、三量体またはテトラマーである。さらなる実施形態では、本
発明の多量体は、少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくともテト
ラマーである。
【０１４２】 本発明によって含まれる多量体は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。本
明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、配列番号Ｙのアミノ酸配列または
配列番号Ｘによってコードされるアミノ酸配列もしくは配列番号Ｘの相補体、お
よび／あるいはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるアミノ酸配列に対応す
るポリペプチドのみを含む多量体（本明細書中に記載されるフラグメント、改変
体、スプライシング改変体、および融合タンパク質に対応するフラグメント、改
変体、スプライシング改変体、および融合タンパク質を含む）をいう。これらの
ホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。
特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドのみを含む多量体である。別の特定の実施形態では、本発明のホモマーは
、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形
態では、本発明の多量体は、ホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む）またはホモ三量体（例えば、同一および／また
は異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）である。さらなる実施形態
では、本発明のホモマー性多量体は、少なくともホモ二量体、少なくともホモ三
量体または少なくともホモテトラマーである。
【０１４３】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のポリペプチドに
加えて、１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプ
チド）を含む多量体をいう。特定の実施形態では、本発明の多量体は、ヘテロ二
量体、ヘテロ三量体またはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本
発明のヘテロマー性多量体は、少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量
体または少なくともヘテロテトラマーである。
【０１４４】 本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性および／もしくは共有結合性の
結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によって間接的
に連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明の多量体（例えば、ホモ
二量体またはホモ三量体など）は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触
する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロ多量体（例えば、ヘ
テロ三量体またはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペプチドが、溶液中
で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質における異種ポ
リペプチド配列に対する抗体を含む）と接触する場合に、形成される。他の実施
形態では、本発明の多量体は、本発明のポリペプチドとの、および／または本発
明のポリペプチド間での共有結合によって形成される。このような共有結合は、
ポリペプチド配列（例えば、配列番号Ｙに列挙されるか、または配列番号Ｘおよ
び／もしくはｃＤＮＡプラスミドＺによってコードされるポリペプチド中に含ま
れる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例
では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在する）ポリペプチド
において相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイン残基間での架橋
である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換え操作の結果であ
る。あるいは、このような共有結合は、融合タンパク質中の異種ポリペプチド配
列において含まれる、１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合は
、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第５
，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明細
書中に記載されるような）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列間に
ある。別の特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合した
多量体を形成し得る別のタンパク質（例えば、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅ
ｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／４９３０５号（こ
の内容はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）など）
由来の異種ポリペプチド配列間にある。別の実施形態では、２以上の本発明のポ
リペプチドは、ペプチドリンカーを介して連結される。例としては、米国特許第
５，０７３，６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプ
チドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数
のポリペプチドを含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され
得る。
【０１４５】 本発明の多量体ポリペプチドを調製する別の方法は、ロイシンジッパーまたは
イソロイシンジッパーのポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドの使
用を含む。ロイシンジッパードメインおよびイソロイシンジッパードメインは、
発見されたタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッ
パーは、本来、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９（１９８８））において同定され、そしてそれ
以来、種々の異なるタンパク質から見出されている。公知のロイシンジッパーは
、共通して、二量体化または三量体化する天然に存在するペプチド、およびそれ
らの誘導体である。本発明の可溶性多量体タンパク質を産生するための適切なロ
イシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８（本明細書中
で参考として援用される）に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液
中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列と融合した、本発明のポリペ
プチドを含む組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞において発現され、そし
て得られる可溶性多量体融合タンパク質は、当該分野で公知の技術を使用して、
培養上清から回収される。
【０１４６】 本発明の三量体ポリペプチドは、増大した生物学的活性の利点を提供し得る。
好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は、優先的に三量体を形
成するものである。１つの例は、Ｈｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３
４４：１９１，（１９９４））および米国特許出願第０８／４４６，９２２号（
本明細書中で参考として援用される）に記載されるような、肺サーファクタント
タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）から誘導されるロイシンジッパーである。天然に存在す
る三量体タンパク質から誘導される他のペプチドは、本発明の三量体ポリペプチ
ドの調製において使用され得る。
【０１４７】 別の例において、本発明のタンパク質は、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド
配列を含む本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチ
ド配列間の相互作用によって結合される。さらなる実施形態において、本発明の
結合タンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質および抗Ｆｌ
ａｇ（登録商標）抗体に含まれる異種ポリペプチド配列間の相互作用によって結
合される。
【０１４８】 本発明の多量体は、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例えば
、本発明の多量体中に含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分野で公
知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋され得
る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書
中でその全体が参考として援用される）。さらに、本発明の多量体は、多量体中
に含まれることが所望されるポリペプチドの配列中に位置するシステイン残基間
に１つ以上の分子間架橋を形成するために、当該分野で公知の技術を用いて生成
され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本
明細書中でその全体が参考として援用される）。さらに、本発明のポリペプチド
は、そのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付
加によって慣用的に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１つ以上のこ
れらの改変したポリペプチドを含む多量体を生成するために適用され得る（例え
ば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその
全体が参考として援用される）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明の多
量体に含まれることが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成する
ように適用され得る（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、
これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１４９】 あるいは、本発明の多量体は、当該分野で公知の遺伝子工学技術を用いて生成
され得る。１つの実施形態において、本発明の多量体中に含まれるポリペプチド
は、本明細書中に記載されるかまたはさもなくば当該分野で公知の融合タンパク
質技術を用いて組換え的に産生される（例えば、米国特許第５，４７８，９２５
号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援用される）。特
定の実施形態において、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドは、
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプ
チドをコードする配列に連結し、次いで、もともとのＣ末端からＮ末端（リーダ
ー配列を欠く）へと逆方向でポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌク
レオチドに、さらに連結することによって生成される（例えば、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体が参考として援
用される）。別の実施形態において、本明細書中に記載されるかまたはさもなく
ば当該分野で公知の組換え技術が適用されて、膜貫通ドメイン（あるいは疎水性
ペプチドまたはシグナルペプチド）を含む本発明の組換えポリペプチドを生成し
、そしてこれは、膜再構成技術によってリポソームに取り込まれ得る（例えば、
米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと、これは、本明細書中でその全体
が参考として援用される）。
【０１５０】 （抗体） 本発明のさらなるポリペプチドは、本発明の配列番号Ｙのポリペプチド、ポリ
ペプチドフラグメント、もしくは改変体、および／または本発明のエピトープに
免疫特異的に結合する（特異的抗体−抗原結合をアッセイするための当該分野で
周知のイムノアッセイにより決定されるような）抗体およびＴ−細胞抗原レセプ
ター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、単
鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラ
リーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例え
ば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体が挙げられる）、および任意の上記の抗体
のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。本明細
書中で使用される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロ
ブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗
原結合部位を含む分子）をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリ
ン分子の任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、および
ＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ
１およびＩｇＡ２）またはサブクラスの分子であり得る。
【０１５１】 最も好ましくは、抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、そ
してＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単
鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメ
インのいずれかを含むフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。単
鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を、単独であるいは以下：
ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全体また
は部分との組み合わせで含み得る。ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイ
ンおよびＣＨ３ドメインと可変領域の任意の組み合わせをもまた含む抗原結合フ
ラグメントもまた、本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳動物を
含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネズミ（
例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ウサギ（ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤ
ギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。本明細書中で使用され
る場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含
み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グ
ロブリンについてトランスジェニックでかつ内因性免疫グロブリンを発現しない
動物（以下および、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，
９３９，５９８号に記載されるような）から単離された抗体を含む。
【０１５２】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多価の多重
特異的であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピト
ープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異種エピ
トープ（例えば、異種ポリペプチドまたは固体支持体物質）の両方に特異的であ
り得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；
ＷＯ ９１／００３６０；ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；
同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２
０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０１５３】 本発明の抗体は、抗体により認識されるかまたは特異的に結合される本発明の
ポリペプチドのエピトープまたは部分によって記載され得るかまたは特定化され
得る。このエピトープまたはポリペプチド部分は、本明細書中に記載されるよう
に、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置により、または連続するアミノ酸残基のサ
イズにより、特定化され得る。本発明の任意のエピトープまたはポリペプチドを
特異的に結合する抗体はまた排除され得る。従って、本発明は、本発明のポリペ
プチドを特異的に結合し、そしてこのポリペプチドの排除を可能にする抗体を含
む。
【０１５４】 本発明の抗体はまた、その交差反応性によって記載され得るか、または特定化
され得る。本発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログ（ｏｒｔｈ
ｏｌｏｇ）またはホモログを結合しない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチ
ドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくと
も８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくと
も６０％、少なくとも５５％および少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書において記載された方法を用いて計算される場合）を有す
るポリペプチドを結合する抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、本発明の抗体は、ヒトタンパク質のマウスホモログ、ラットホモログおよ
び／またはウサギホモログならびにそれらの対応するエピトープと交差反応する
。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％
未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満および５
０％未満の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書において記載された方
法を用いて計算される場合）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本
発明に含まれる。特定の実施形態において、上記の交差反応性は、任意の単一特
異的な抗原性もしくは免疫原性ポリペプチド、または２、３、４、５もしくはそ
れより多くの本明細書中に開示される特異的な抗原性ポリペプチドおよび／また
は免疫原性ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに本発明には、（本明細書
中に記載されるような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本
発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードさ
れるポリペプチドを結合する抗体が含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポ
リペプチドに対するその結合親和性によって記載または特定され得る。好ましい
結合親和性としては、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×
１０-4Ｍ、１０-4Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×
１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×
１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ
、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、ま
たは１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫdを有する結合親和性が挙げられる。
【０１５５】 本発明はまた、競合的な結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（
例えば、本明細書中に記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、
本発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好
ましい実施形態において、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少な
くとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少な
くとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープに対する結合を競合的に阻
害する。
【０１５６】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、レセプター／リガンドと本発明のポリペプ
チドとの相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好ま
しくは、本発明の抗体は、本明細書中に開示される抗原性のエピトープまたはそ
の部分に結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体
の両方を特徴とする。本発明はまた、リガンド結合を妨げないがレセプターの活
性化を妨げるレセプター特異的抗体を特徴とする。レセプターの活性化（すなわ
ち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載される技術、またはさもなくば当該分
野で公知の技術によって決定され得る。例えば、レセプターの活性化は、（例え
ば、上記されたような）免疫沈降、続いてウエスタンブロット分析によって、レ
セプターのリン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／スレオニン）あるいはそ
の基質を検出することによって決定され得る。特定の実施形態において、抗体の
非存在下の活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少
なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、ま
たは少なくとも５０％リガンド活性またはレセプター活性を阻害する抗体を提供
する。
【０１５７】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプター−リガンド複合体を認識し、そして、好まし
くは、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識
しない抗体を特徴とする。同様に、本発明には、リガンドに結合し、そしてリガ
ンドのレセプターへの結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それ
によってレセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターに結合することは
妨げない抗体が含まれる。さらに本発明に含まれるのは、レセプターを活性化す
る抗体である。これらの抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわ
ち、リガンド媒介のレセプター活性化の生物学的活性のすべてまたはサブセット
（ｓｕｂｓｅｔ）のいずれかを増強または活性化し得る（例えば、レセプターの
二量体化を誘導することによる）。この抗体は、本明細書中に開示される本発明
のペプチドの特定の生物学的活性を含む生物学的活性に対するアゴニスト、アン
タゴニストまたはインバース（ｉｎｖｅｒｓｅ）アゴニストとして特定化され得
る。上記の抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例
えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄ
ｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅ
ｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）
；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９４（
１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０９−３２
１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：３１７０
−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２
）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄら
、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９
９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９
９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７
（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０
（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書において参考として援
用される）を参照のこと。
【０１５８】 本発明の抗体は、例えば、インビトロおよびインビボの両方における診断方法
および治療方法を含めて、本発明のポリペプチドを精製、検出および標的化する
のために使用され得るが、これに限定されない。例えば、この抗体は、生物学的
サンプルにおいて本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定す
るためのイムノアッセイにおいて用途を有する。例えば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版，１９
８８）（その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
【０１５９】 以下により詳細が議論されるように、本発明の抗体は、単独で、または他の組
成物との組み合わせのいずれかで用いられ得る。この抗体は、さらに、Ｎ末端も
しくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融合され得るか、またはポリペプ
チドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）さ
れ得る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子
およびエフェクター分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または
毒素）に組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０
８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１
４，９９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０１６０】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０１６１】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１６２】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてその生成
される方法に由来する抗体ではない。
【０１６３】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される。非限
定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチドまたはそのようなペプ
チドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応用が検出される（例えば
、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と、マウスの脾臓を収集
しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技術によって任意の適切
な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞）に
融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およびクローン化する。次
に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合し得る抗体を分泌
する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセイする。一般的に高い
レベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）が、陽性ハイブリドー
マクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産生され得る。
【０１６４】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０１６５】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１６６】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパー三量
体たはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発
現される抗原結合ドメインを提示するために利用され得る。目的の抗原に結合す
る抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて選択または同定され得
る（例えば、標識した抗体あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉され
た抗原を使用する）。これらの方法において用いられるファージは、代表的には
、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ遺伝子ＶＩＩＩタンパク質の
いずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化された
Ｆｖの抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメ
インを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ）である。本発
明の抗体を作製するために用いられ得るファージディスプレイ方法の例としては
、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔ
ｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（
１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７ ９−１８（１９９７）；Ｂｕ
ｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−
２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公
開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７
；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２
；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５
，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；
同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４
７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６
，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，
７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号（これらの各々は、本明細書
中でその全体が参考として援用される）。
【０１６７】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０１６８】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボにおける使用および
インビトロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗
体またはヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部
分が、異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の
可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体
を産生するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，
８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号
を参照のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）
。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒ
ト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合
する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内
のフレームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を
変化させるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残
基と置換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によっ
て同定され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣ
ＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置に
おける異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、
Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が
参考として本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の
種々の技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９
，４００号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３
９号；同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリ
ング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎ
ｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（
１９９１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９
１：９６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉ
ｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０１６９】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９３、Ｗ
Ｏ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３５、お
よびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本明細書
中に援用される）もまた参照のこと。
【０１７０】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０１７１】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１７２】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０１７３】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号Ｙのアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。
【０１７４】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０１７５】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１７６】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０１７７】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０１７８】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０１７９】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１８０】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０１８１】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０１８２】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０１８３】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロ
モーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスタ
ーの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系
である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋ
ｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１８４】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
べき場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タン
パク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベ
クターには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配
列がｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍ
ｅ）で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ
発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１
９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅ
ｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９
（１９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させる
ために使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そし
て溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着お
よび結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され
得る。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部
位を含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は
、ＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１８５】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０１８６】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーター、な
どの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０１８７】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。タン
パク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例え
ば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は、タ
ンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特徴的
で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された異種タンパ
ク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。この目
的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の正確
なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され得る
。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯ
Ｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８３、
Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、ならび
に、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細胞株
、を含むがこれらに限定されない。
【０１８８】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモー
ター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）
、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得る。異
種ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖させら
れ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能
マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをその染色
体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今度はク
ローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、抗体分
子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような操作さ
れた細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のスクリー
ニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０１８９】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎ
ｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１
７（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２
１５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える
（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ
技術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に
適用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）
；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓ
ｓ、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（
編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ
−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）（これ
らはその全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０１９０】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと
）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが、増幅可能であると、宿主細
胞の培養物に存在するインヒビターのレベルにおける増加は、マーカー遺伝子の
コピーの数を増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生
もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（
１９８３））。
【０１９１】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。
【０１９２】 一旦本発明の抗体分子が、動物によって産生されるか、化学的に合成されるか
、または組換えにより発現されると、当該分野で公知の、免疫グロブリン分子の
精製のための任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、
アフィニティー（特に、プロテインＡの後に特異的抗原に対するアフィニティー
による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、ま
たはタンパク質精製のための任意の他の標準的な技術によって、精製され得る。
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、本明細書中に記載されるかま
たはそうでなければ当該分野において公知の、異種ポリペプチド配列に融合され
得、精製を容易にする。
【０１９３】 本発明は、組換えにより融合され、または化学的に本発明のポリペプチド（も
しくはその部分、好ましくはこのポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、
４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００個のアミノ酸）に結合さ
れて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質を生成する抗
体、を含む。この融合は、直接的である必要はないが、リンカー配列を介して起
こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはその部分、好ましくはこ
のポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０
、９０、もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であり得る。例えば
、インビトロまたはインビボのいずれにおいても、本発明のポリペプチドを特定
の細胞表面のレセプターに特異的な抗体に本発明のポリペプチドに融合または結
合させることによって、特定の細胞のタイプに対して、本発明のポリペプチドを
標的にするために、抗体が使用され得る。本発明のポリぺプチドに融合または結
合される抗体はまた、インビトロ免疫アッセイおよび当該分野で公知の方法を使
用する精製方法において使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、上記、および
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９３／２１２３２号；ＥＰ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕ
ｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許
第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ８９：１４２８−１４３
２（１９９２）；Ｆｅｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５
２（１９９１）を参照のこと。これらは、その全体が参考として援用される。
【０１９４】 本発明はさらに、抗体の可変領域以外のドメインに融合または結合された、本
発明のポリぺプチドを含む組成物を含む。例えば、本発明のポリぺプチドは、抗
体のＦｃ領域、またはその部分に融合または結合され得る。この抗体の本発明の
ポリぺプチドに融合された部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのドメイン全体もしくは部分任
意の組合せを含み得る。これらのポリぺプチドはまた、上記の抗体の部分に融合
または結合され得、多重体を形成する。例えば、本発明のポリぺプチドに融合さ
れたＦｃ部分は、このＦｃ部分の間のジスルフィド結合を通して二量体を形成し
得る。より高度の多重体形態は、ポリぺプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの部分に融
合させることによって作製され得る。本発明のポリぺプチドを抗体部分に融合ま
たは結合させるための方法は、当該分野において公知である。米国特許第５，３
３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第
５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号
；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／
０４３８８号；第ＷＯ９１／０６５７０号；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１
）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１９９
５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９
：１１３３７−１１３４１（１９９２）（前記の参考文献はその全体が参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０１９５】 上で考察されたように、ポリぺプチド、ポリぺプチドフラグメント、または配
列番号Ｙの変異体、に対応するポリぺプチドは、このポリぺプチドのインビボ半
減期を増大させるため、または当該分野で公知の方法を使用する免疫学的アッセ
イにおいて使用するために、上記の抗体部分に融合または結合され得る。さらに
、配列番号Ｙに対応するポリぺプチドを、上記の抗体部分に融合または結合して
、精製を容易にし得る。１つの報告された例は、ヒトＣＤ４ポリペプチドの最初
の２つのドメイン、および哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領
域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載している（ＥＰ ３９４，
８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８
８））。ジスルフィド連結二量体構造（ＩｇＧに起因する）を有する抗体に融合
または結合される、本発明のポリぺプチドもまた、単量体分泌タンパク質または
タンパク質フラグメント単独よりも、他の分子に結合しそして中和するのにさら
に効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７
０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部
分は、治療および診断において有益であり、従って、例えば、改良された薬物動
態学的な特性を生じ得る（ＥＰ Ａ ２３２，２６２）。あるいは、融合タンパ
ク質が発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠失させること
が望ましい。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用される場
合、Ｆｃ部分は、治療および診断を妨害し得る。例えば、薬物の発見において、
ｈＩＬ−５のようなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定する
ための高スループットスクリーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合さ
れてきた（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏ
ｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと）。
【０１９６】 さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするペプチド
のような、マーカー配列に融合され得る。好ましい実施形態において、マーカー
アミノ酸配列は、とりわけヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクタ
ー（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓ
ｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）において提供されるタグ）であり、これらの多
くのマーカーアミノ酸配列が市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記
載されるように、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合の良い精製を提
供する。精製のために有用な別のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素
タンパク質由来のエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌ
ｌ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグを含むが、これに限定
されない。
【０１９７】 本発明は、診断剤または治療剤に結合される、抗体またはそのフラグメントを
さらに含む。抗体は、例えば、臨床上の試験手順（例えば、所与の処置レジメン
（ｒｅｇｉｍｅｎ）の効力を決定するため）の一部として、腫瘍の発生または進
行をモニターするために、診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物
質と連結させることによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種
々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々
の陽電子放射断層撮影を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イ
オン、が挙げられる。この検出可能な物質は、抗体（またはそのフラグメント）
に対して、直接的または間接的のいずれかで、当該分野で公知の技術を使用する
媒介物（例えば、当該分野で公知のリンカー）を介して、連結または結合され得
る。例えば、本発明に従う診断薬としての使用のための抗体に結合され得る金属
イオンに関しては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素
の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分
子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオ
チンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセ
イン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニル
アミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；
発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ル
シフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；ならびに、適切な放
射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９９Ｔｃが挙げ
られる。
【０１９８】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−エミッタ−（例えば２１３Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒また
は細胞毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリ
タキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化
エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐ
ｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン
、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａ
ｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチ
ノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン
、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、な
らびにそのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（
例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラ
ビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメ
チン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラ
ムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮ
Ｕ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファ
ン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびに
ｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサ
イクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビ
シン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブ
レオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃ
ｉｎ）（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビ
ンブラスチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０１９９】 本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば
、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであ
り得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシ
ンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、
腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子、
血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、アポトーシス薬（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参照
のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）、
Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５６
７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号）
）、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエンド
スタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイキ
ン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロ
イキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ
−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因
子）、が挙げられ得る。
【０２００】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０２０１】 このような治療部分を抗体に結合する技術は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ
ら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、２４３−５６頁（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆ
ｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ
ｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、６２３−５３頁（Ｍａｒｃ
ｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐ
ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、４７５−５０６頁（１９８
５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓ
ｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａ
ｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、３０３
−１６頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５）、およびＴｈｏｒｐｅら
、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐ
ｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」
、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。
【０２０２】 あるいは、抗体は２次抗体に結合され、米国特許第４，６７６，９８０号（こ
れは、その全体が本明細書に参考として援用される）におけるＳｅｇａｌによる
記載のような抗体異種結合体（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成し得る
。
【０２０３】 単独、あるいは細胞毒性因子および／またはサイトカインと組み合わせて投与
される、抗体に結合する治療部分を有するかまたは有さない抗体が、治療薬とし
て使用され得る。
【０２０４】 （免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳生成物は、細胞特異的マーカーとして、ある
いはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で差示
的に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的エピトープ、または
エピトープの組み合わせに対して指向されるモノクロナール抗体は、マーカーを
発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発
現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクロナール抗体を用いて利用
され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁
気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パン
ニング」、ならびにフローサイトメトリー（例えば、米国特許第５，９８５，６
６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９
）を参照のこと）が挙げられる。
【０２０５】 これらの技術は、血液学的悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における最少
残留疾患（ｍｉｎｉｍａｌ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）（ＭＲＤ））
および対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）を予防するための移植術における「非自己
」細胞と共に見出され得るような、細胞の特定集団のスクリーニングを可能にす
る。あるいは、これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような増殖お
よび／または分化を受け得る、造血幹細胞および先祖細胞のスクリーニングを可
能にする。
【０２０６】 （抗体結合についてのアッセイ） 本発明の抗体は、当該分野において公知の任意の方法により、免疫特異的結合
についてアッセイされ得る。用いられ得る免疫アッセイとしては、いくつかのも
のについてだけ名称を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免
疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ
イ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテイン
Ａ免疫アッセイのような技術を用いる競合アッセイ系および非競合アッセイ系が
挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは慣用的であり、そ
して当該分野において周知である（例えば、その全体が本明細書中に参考として
援用される、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。例示的な免疫ア
ッセイが、以下に簡潔に記載される（が、これらは限定を目的とすることが意図
されない）。
【０２０７】 免疫沈降プロトコルは、一般に、タンパク質ホスファターゼインヒビターおよ
び／またはプロテアーゼインヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチ
ニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１％ ＮＰ−４０ま
たはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％
ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２
）、１％ Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する
工程、目的の抗体を細胞溶解物に添加する工程、一定時間（例えば、１〜４時間
）４℃でインキュベートする工程、プロテインＡセファロースビーズおよび／ま
たはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加する工程、約１時間以
上４℃でインキュベートする工程、溶解緩衝液中でビーズを洗浄する工程、およ
びＳＤＳ／サンプル緩衝液中でビーズを再懸濁する工程を包含する。目的の抗体
の、特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウエスタンブロット分析により
、アッセイされ得る。当業者は、抗体の抗原への結合を増加するように、そして
バックグラウンドを減少させるように改変され得るパラメータ（例えば、セファ
ロースビーズを用いて細胞溶解物を事前にきれいにする工程）に関して、認め得
る。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら編，１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ
．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．１６．１を参照のこと。
【０２０８】 ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質サンプルを調製する工程、ポ
リアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じた８％〜２０％ ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）中でのそのタンパク質サンプルの電気泳動、そのタンパク質サンプル
をそのポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロン
のような膜に移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡまたは脱脂粉
乳を有するＰＢＳ）中でその膜をブロックする工程、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ ２０）中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希
釈された一次抗体（目的の抗体）を用いてその膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ブロッキング緩衝液中で希釈された酵素基質（例
えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）あるいは放
射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（一次抗体を認
識する、例えば、抗ヒト抗体）を用いて、その膜をブロックする工程、洗浄緩衝
液中でその膜を洗浄する工程、ならびにその抗原の存在を検出する工程を包含す
る。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように、そしてバックグラウン
ドノイズを減少させるように改変され得るパラメータに関して、認め得る。ウエ
スタンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１０．８．１を参照のこと。
【０２０９】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、およびその抗原の存在を検出する工程を包含する。ＥＬＩＳＡにおいて、目的
の抗体は、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能
な化合物に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）が、ウェルに添加され
得る。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコー
ティングされ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コー
ティングされたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は
、検出されるシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該
分野において公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬ
ＩＳＡに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９
４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１１．２．１を参照のこと。
【０２１０】 抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識抗原
（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での、目的の
抗体を用いるインキュベーション、および標識抗原に結合した抗体の検出を含む
。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識の第二の抗体の存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に
結合した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０２１１】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体ベースの治療に関し、この治療は、１つ以上の開示され
た疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ましくは哺乳動物、そし
て最も好ましくはヒトの患者に、本発明の抗体を投与する工程を包含する。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載されるような、それ
らのフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコー
ドする核酸（本明細書中に記載されるような、それらのフラグメント、アナログ
および誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに
限定されない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／ま
たは活性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載される任意の１つ
以上の疾患、障害、または状態を含むがこれらに限定されない）を処置、阻害ま
たは予防するために使用され得る。本発明のポリペプチドの異常な発現および／
または活性に関連した疾患、障害または状態の処置および／または予防は、それ
らの疾患、障害または状態に関連した症状を緩和する工程を含むが、これに限定
されない。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本明細書中に記載
されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０２１２】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の要約は、身体内で局所的にまたは
全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクター細胞
（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、本発明
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これらのアプ
ローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供される教
示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタリング
の目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわかる。
【０２１３】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７のような）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０２１４】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療および抗腫瘍剤）との組み合わせで投与され得る。
一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種である種起源または種反応性の
生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施形態においては、ヒトの抗体、
フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、治療または予防のために、ヒト
の患者に投与される。
【０２１５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（そのフラグメントを含む）に
関する免疫アッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために、本発
明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／または強
力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメント、
またはそれらの領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメント
、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（
そのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性として
は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、１０-4 Ｍ、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7 Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０- 10 Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ
、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍよ
り小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２１６】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０２１７】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０２１８】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；および
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０２１９】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、従って抗体をコードする核酸の染
色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；
Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいはこの
核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはそのフラ
グメントを含む。
【０２２０】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０２２１】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた生成物を産生する。これは、当該分野で公知
の多数の方法（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部分として構築し
、そしてそれを（例えば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウ
イルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いる感染
により）細胞内になるように投与することにより、あるいは、裸のＤＮＡの直接
注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌ
ｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質または細胞表面のレセ
プターでコーティングするか、もしくは薬剤をトランスフェクトすることにより
、あるいは、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル中へのカプセル化に
より、あるいは、それらを核に入ることが公知であるペプチドと結合させて投与
することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合
させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）（レセプターを特異
的に発現する細胞の型を標的にするために用いられ得る）などのいずれかにより
達成され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、こ
こで、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎ
ｉｃ）ウイルス性ペプチドを含み、この核酸がリソゾーム分解を回避することを
可能にする。さらに別の実施形態において、核酸は、特定のレセプターを標的化
することにより、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的化さ
れ得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６
３５号；同第ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ
９３／２０２２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内部に導入され得
、そして相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（
ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））。
【０２２２】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローニングされ、これは、患者内への遺伝子の送達を容易に
する。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉ
ｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療
法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血性幹細胞に送達するた
めの、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療
におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０２２３】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経系
、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染すること
ができるという利点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子治
療の概説を示す。Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３
−１０（１９９４）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移すためのアデノウイ
ルスベクターの使用を示した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の
例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９
９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）
；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２
３４（１９９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。
好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０２２４】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用が提案されて
きた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：
２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０２２５】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を包含する。通常、移入
の方法は、選択可能なマーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入さ
れた遺伝子を取り込みそして発現する細胞を単離するために選沢下に置かれる。
次いで、それらの細胞は患者に送達される。
【０２２６】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されな
い：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクショ
ン、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感
染、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル媒介の遺伝子移入、スフ
ェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入については、当該分野におい
て多数の技術が公知であり（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒおよびＢｅｈｒ，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ，
Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８５）を参照のこと）、
そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機能が破壊されないなら
ば、本発明に従って使用され得る。この技術は、細胞への核酸の安定した移入を
提供するべきであり、その結果、この核酸は、細胞により発現可能であり、好ま
しくは、その細胞の子孫により遺伝性でかつ発現可能である。
【０２２７】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、当業者により決定され得る。
【０２２８】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、
ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単
球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹
細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨髄、臍
帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０２２９】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０２３０】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、そして次いで組み換え細胞は、治療的効果のためにインビボ
で投与される。具体的な実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる
。インビトロで単離され得、そしてインビトロで維持され得る任意の幹細胞およ
び／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（
例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅ
ｒｓｏｎ，Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ
，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔ
ｔｅｌｋｏｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７
７１（１９８６）を参照のこと）。
【０２３１】 具体的な実施形態において、遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コー
ド領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の
発現は、適切な転写誘導因子の存在または不在を制御することにより制御可能で
ある。
【０２３２】 （治療活性または予防活性の証明） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、そして次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試
験される。例えば、化合物または薬学的組成物の、治療有用性または予防有用性
を証明するためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプル
に対する化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対す
る化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセ
イおよび細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決
定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定する
ために用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイ
が挙げられ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養物において増殖し、そ
して化合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サン
プルに対するそのような化合物の効果が観察される。
【０２３３】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
局面において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限するかま
たは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましくは、
ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれらに限
定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましく
はヒトである。
【０２３４】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方および投与
方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方および投与経路は、本明細書中で
以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０２３５】 様々な送達システムが公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用
いられ得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、この化合物の発
現が可能な組換え細胞中でのカプセル化、レセプター媒介エンドサイトーシス（
例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３
２（１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部とし
ての核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下
、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合
物または組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注
射により、上皮または粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および髄腔内注射を
包含し；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０２３６】 具体的な実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必
要な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではない
が、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み
合わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプ
ラント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよ
うな膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、または膠様材料である）により達
成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する際、タンパ
ク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない。
【０２３７】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０２３８】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０２３９】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２４０】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構成し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０２４１】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン
、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望されるな
らば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組
成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方物
などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドのよ
うなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級の
マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン
ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み得
る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇ
ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される
。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、
適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供す
る。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０２４２】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２４３】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０２４４】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。
【０２４５】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０２４６】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０２４７】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０２４８】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０２４９】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１
２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム
（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ））；発光標識（例えば、ルミ
ノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、な
らびにビオチンが挙げられる。
【０２５０】 本発明の１つの局面は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒ
トにおける、目的のポリペプチドの異常な発現と関連する疾患または障害の検出
および診断である。１つの実施形態において、診断は、ａ）目的のポリペプチド
に特異的に結合する有効量の標識化分子を被験体に（例えば、非経口的に、皮下
に、または腹腔内に）投与する工程；ｂ）このポリペプチドが発現する被験体内
の部位でこの標識化分子が優先的に濃縮することを可能にするために（および結
合していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるために）投与
後、時間間隔を待つ工程；ｃ）バックグラウンドレベルを決定する工程；および
ｄ）この被験体中の標識化分子を検出する工程、を包含し、その結果、このバッ
クグラウンドレベルを越える標識化分子の検出は、この被験体が目的のポリペプ
チドの異常な発現と関連する特定の疾患または障害を有することを示す。バック
グラウンドレベルは、特定の系について以前に決定された標準的な値と、検出さ
れた標識化分子の量を比較する工程を包含する種々の方法により決定され得る。
【０２５１】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムが、診断の画像を産生するた
めに必要である画像化部分の量を決定するということは、当該分野において理解
される。放射性同位体部分の場合、ヒト被験体について、注入される放射能の量
は、通常、約５〜２０ｍキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次いで、標識化抗
体または標識化抗体フラグメントは、特定のタンパク質を含む細胞の位置で優先
的に蓄積する。インビボでの腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「
Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌ
ｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔ
ｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ、第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ
．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９
８２）において、記載される。
【０２５２】 使用する標識の型および投与の様式を含む、いくつかの変動に依存して、標識
化分子が被験体中の部位に優先的に濃縮することを可能にするため、および結合
していない標識化分子がバックグラウンドレベルまで除去されるための投与後の
時間間隔は、６〜４８時間もしくは６〜２４時間または６〜１２時間である。別
の実施形態において、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０日間で
ある。
【０２５３】 １つの実施形態において、疾患および障害をモニターすることは、疾患または
障害（ｄｉｓｅａｓｅ）を診断するための方法を繰り返すことによって実施され
る（例えば、最初の診断から１ヶ月後、最初の診断から６ヶ月後、最初の診断か
ら１年後、など）。
【０２５４】 標識化分子の存在は、インビボスキャニングについての当該分野で公知の方法
を使用して患者中で検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依存
する。当業者は、特定の標識を決定するための適切な方法を決定することができ
る。本発明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスは、コンピュー
タ連動断層撮影法（ＣＴ）、体全体のスキャン（例えば、陽子（ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ）放射断層撮影法（ＰＥＴ））、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波診
断法を含むが、これらに限定されない。
【０２５５】 特定の実施形態において、分子を放射性同位体で標識し、そして放射応答外科
的機器（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔ）（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）
を使用して患者中で検出する。別の実施形態において、分子を蛍光化合物で標識
し、そして蛍光応答スキャニング機器を使用して患者中で検出する。別の実施形
態において、分子を陽電子射出金属で標識し、そして陽電子射出断層撮影法を使
用して患者中で検出する。さらに別の実施形態において、分子を常磁性標識で標
識し、そして磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者中で検出する。 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出す
るための手段を備える（例えば、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化
合物、酵素基質、放射性化合物もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、ま
たは一次抗体を認識する二次抗体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０２５６】 本発明の別の特定の実施形態において、キットは、増殖性および／または癌性
のポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスク
リーニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポ
リペプチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エ
ピトープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトー
プは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さら
に、このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段
を備える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより
検出され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の
実施形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化
学的に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はま
た、固体支持体に付着され得る。
【０２５７】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０２５８】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血
清のスクリーニングにおいて使用するための、診断キットを含む。この診断キッ
トは、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応する実
質的に単離された抗体、およびこの抗体へのこのポリヌクレオチド抗原またはポ
リペプチド抗原の結合を検出するための手段を備える。１つの実施形態において
、抗体は、固体支持体に付着される。特定の実施形態において、抗体は、モノク
ロナール抗体であり得る。キットのこの検出手段は、二次標識化モノクロナール
抗体を含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化競合抗原を
含み得る。
【０２５９】 １つの診断構成において、試験血清を、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応させる。特定の抗原抗体とこの試薬との結合、およ
び洗浄することによる結合していない血清成分の除去の後、この試薬をレポータ
ー標識化抗ヒト抗体と反応させて、固体支持体上に、結合した抗抗原抗体の量に
比例して、この試薬にレポーターを結合させる。この試薬を再び洗浄して、結合
していない標識化抗体を除去し、そしてこの試薬と会合するレポーターの量を決
定する。代表的に、レポーターは、酵素であり、この酵素は、適切な蛍光性基質
、発光性基質または比色用基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２６０】 上記アッセイにおいて、固体表面試薬は、固体支持体物質（例えば、ポリマー
ビーズ、ディップスティック、９６ウェルプレートまたは濾過材料）へタンパク
質物質を付着することについての公知の技術によって調製される。これらの付着
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着またはタンパク質の共有結
合性の付着（代表的に、固体支持体上の化学的反応基に対して遊離のアミン基（
例えば、活性化カルボキシル基、ヒドロキシル基、もしくはアルデヒド基）によ
る）を包含する。あるいは、ストレプトアビジンコートプレートが、ビオチン化
抗原と組み合わせて使用され得る。
【０２６１】 従って、本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを
提供する。このキットは、一般に、表面に結合した組換え抗原を有する支持体、
および表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識化抗ヒト抗体
を含む。
【０２６２】 （ポリヌクレオチドの使用） 本明細書中で同定されるポリヌクレオチドの各々は、試薬として多くの方法に
おいて使用され得る。以下の説明は、模範的に考慮され、そして既知の技術を利
用すべきである。
【０２６３】 本発明のポリヌクレオチドは、染色体の同定に有用である。新しい染色体マー
カーを同定する必要性が、現在存在する。なぜなら、実際の配列データ（反復多
型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、ほとんど利用可能ではないからで
ある。各々の配列は、個々のヒトの染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、
そしてこの位置とハイブリダイズし得る。従って、本発明の各々のポリヌクレオ
チドは、当該分野で公知の技術を使用して、染色体マーカーとして慣用的に用い
られ得る。
【０２６４】 簡潔には、配列は、配列番号Ｘにおいて示される配列由来のＰＣＲプライマー
（好ましくは、少なくとも１５ｂｐ（例えば、１５〜２５ｂｐ））を調製するこ
とにより、染色体にマッピングされ得る。プライマーは、コンピュータ分析を使
用して、必要に応じて選択され得、その結果プライマーは、ゲノムＤＮＡにおけ
る１より多くの予期されるエキソンにまたがらない。次いで、これらのプライマ
ーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのた
めに使用される。配列番号Ｘに対応するヒト遺伝子を含むそれらのハイブリッド
のみが、増幅したフラグメントを産生する。
【０２６５】 同様に、体細胞ハイブリッドは、特定の染色体に対するポリヌクレオチドのＰ
ＣＲマッピングの迅速な方法を提供する。３つ以上のクローンが、一日あたり、
１つのサーマルサイクラーを用いて、指定され得る。さらに、ポリヌクレオチド
の下位局在化（ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、特定の染色体のフラグメ
ントのパネルを用いて、達成され得る。用いられ得る他の遺伝子マッピングスト
ラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識フローソート（ｌａｂ
ｅｌｅｄ ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、染色体特
異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選
択、およびコンピューターマッピング技術（例えば、本明細書中で、その全体に
おいて参考として援用される、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ １６：４５６−４５９（１９９８）を参照のこと）を含む。
【０２６６】 ポリヌクレオチドの正確な染色体位置はまた、中期染色体スプレッド（ｓｐｒ
ｅａｄ）の蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）を使用し
て、達成され得る。この技術は、５００塩基または６００塩基ほどの短いポリヌ
クレオチドを使用する；しかし、２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチ
ドが、好ましい。この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、「Ｈｕｍａｎ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ」Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照
のこと。
【０２６７】 染色体マッピングについて、ポリヌクレオチドは、個々に（１つの染色体また
はその染色体における１つの部位をマークするため）使用され得、またはパネル
（多発性（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）部位および／または多発性染色体をマークするた
め）において使用され得る。
【０２６８】 従って、本発明はまた、以下：（ａ）表１および配列番号Ｘのポリヌクレオチ
ド配列からＰＣＲプライマーを調製する工程、ならびに（ｂ）個々の染色体を含
む体細胞のハイブリッドをスクリーニングする工程、を包含する染色体の局在化
のための方法を提供する。
【０２６９】 本発明のポリヌクレオチドは、同様に、放射線ハイブリッドマッピング、ＨＡ
ＰＰＹマッピング、および長距離制限マッピングについて有用である。これらの
技術および公知の他の技術の総説については、例えば、Ｄｅａｒ，「Ｇｅｎｏｍ
ｅ Ｍａｐｐｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（
１９９７）；Ａｙｄｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９４（１９９
９）；Ｈａｃｉａら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３：４８３−４９２（１
９９８）；Ｈｅｒｒｉｃｋら、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ．７：４０９−４
２３（１９９９）；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ
．６２：２６５−２８０（２０００）；および／またはＯｔｔ，Ｊ．Ｈｅｒｅｄ
．９０：６８−７０（１９９９）（これらの各々は、本明細書によって、その全
体において参考として援用される）を参照のこと。
【０２７０】 一旦、ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマッピングされると、ポリヌク
レオチドの物理的な位置は、連鎖分析において使用され得る。連鎖分析は、染色
体位置と特定の疾患の提示との間の同時遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を
確立する（疾患マッピングデータは、例えば、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄ
ｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉ
ｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを
通じてオンラインで利用可能である）に見出される）。１メガベースのマッピン
グ分解能および２０ｋｂあたり１遺伝子と仮定すると、疾患と関連づけられた染
色体領域に正確に位置決めされたｃＤＮＡは、５０〜５００の潜在的な原因遺伝
子のうちの１つであり得る。
【０２７１】 従って、一旦同時遺伝が確立されると、本発明のポリヌクレオチド、および罹
患個体と非罹患個体との間に対応する遺伝子における差異が試験され得る。第１
に、染色体における目に見える構造変化（例えば、欠失または転座）が染色体ス
プレッドにおいてまたはＰＣＲにより試験される。構造的変化が存在しない場合
は、点変異の存在を確認する。いくらかまたは全ての罹患個体で観察されたが、
正常個体では観察されない変異は、この変異がこの疾患を引き起こし得ることを
示す。しかし、ポリペプチドおよびいくらかの正常個体由来の対応する遺伝子の
完全な配列決定は、多型に由来する変異を区別するために必要である。新たな多
型が同定されると、この多型ポリペプチドは、さらなる連鎖分析のために使用さ
れ得る。
【０２７２】 さらに、罹患していない個体と比較した場合に、罹患した個体における増加ま
たは減少した遺伝子の発現は、本発明のポリヌクレオドを用いて評価され得る。
いずれかのこれらの改変（発現の改変、染色体の再構成、または変異）が、診断
マーカーまたは予後マーカーとして使用され得る。
【０２７３】 従って、本発明はまた、障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法
は、個体由来の細胞または体液中の本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測
定する工程、および測定された遺伝子発現レベルをポリヌクレオチド発現レベル
の標準レベルと比較する工程を包含し、これによって、標準と比較して、遺伝子
発現レベルの増加または減少が、障害の指標になる。
【０２７４】 なお別の実施形態では、本発明は、サンプルを、試験被験体に由来する増殖性
および／または癌性のポリヌクレオチドの存在について分析するためのキットを
含む。一般的実施形態において、このキットは、本発明のポリヌクレオチドと特
異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのポリヌクレ
オチドプローブ、および適切な容器を備える。この特定の実施形態では、このキ
ットは、本発明のポリヌクレオチドの内部領域を規定する２つのポリヌクレオチ
ドプローブを含み、ここで各プローブは、この領域に対して内部に３１’マー末
端を含む１つの鎖を有する。さらなる実施形態では、このプローブは、ポリメラ
ーゼ連鎖反応増幅のためのプライマーとして有用であり得る。
【０２７５】 関連する障害の診断（例えば、腫瘍の診断を含む）が既に従来方法に従って行
われている場合、本発明は、予後インジケーターとして有用であり、それによっ
て増強または抑制された本発明のポリヌクレオチド発現を示す患者が、標準レベ
ルにより近いレベルでこの遺伝子を発現する患者と比較して悪い臨床結果を経験
する。
【０２７６】 「本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを測定する（こと）」によって、本
発明のポリペプチドのレベルまたは本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
のレベルを、第１の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパ
ク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または評価することによって）または相
対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡ
レベルに対して比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定
または評価することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のポ
リペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または評価され、そして標準のポ
リペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに対して比較され、この標準は、関連す
る障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サンプルから得られるかまた
は関連する障害を有さない個体の集団由来のレベルを平均することによって決定
される。当該分野で認識されるように、一旦標準的なポリペプチドレベルまたは
ｍＲＮＡレベルが公知になれば、これは、比較のための標準として反復して用い
られ得る。
【０２７７】 「生物学的サンプル」によって、本発明のポリペプチドまたは対応するｍＲＮ
Ａを含む、個体、体液、細胞株、組織培養物または他の供給源から得られる任意
の生物学的サンプルが意図される。示されるように、生物学的サンプルは、本発
明のポリペプチドを含む体液（例えば、精液、リンパ、血清、血漿、尿、滑液お
よび髄液）、および本発明のポリペプチドを発現することが見出された組織供給
源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当該分野で周
知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源
である。
【０２７８】 上記で提供された方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよび／ま
たはポリペプチドが固体支持体に結合される、診断方法および／またはキットに
適用され得る。１つの例示的な方法では、この支持体は、米国特許第５，８３７
，８３２号、同第５，８７４，２１９号および同第５，８５６，１７４号に記載
されるように、「遺伝子チップ」または「生物学的チップ」であり得る。さらに
、本発明のポリヌクレオチドが結合されたこのような遺伝子チップを用いて、本
発明の単離されたポリヌクレオチド配列と、試験被験体から単離されたポリヌク
レオチドとの間の多型性を同定し得る。このような多型性の知見（すなわち、そ
れらの位置ならびにそれらの存在）は、多くの障害（例えば、神経障害、免疫系
障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心臓血管障害、腎臓障害、増殖性
障害および／ならびに癌性疾患および状態のような障害）についての疾患の遺伝
子座を同定する際に有益である。このような方法は、米国特許第５，８５８，６
５９号および同第５，８５６，１０４号に記載される。上記に参照した米国特許
は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０２７９】 本発明は、化学的に合成された（すなわち、ペプチド核酸（ＰＮＡ）として再
現された）かまたは当該分野で公知の他の方法に従って合成された、本発明のポ
リヌクレオチドを包含する。ＰＮＡの使用は、本発明のポリヌクレオチドが固体
支持体、すなわち、遺伝子チップに取り込まれる場合、好ましい形態として役立
つ。本発明の目的のために、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリアミド型のＤＮＡ
アナログであり、そしてアデニン、グアニン、チミンおよびシトシンについての
単量体単位が市販されている（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
。ＤＮＡの特定の成分（例えば、リン、酸化リンまたはデオキシリボース誘導体
）は、ＰＮＡ中に存在しない。Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ
．Ｈ．ＢｅｒｇおよびＯ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４，１４９
７（１９９１）；ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｌ．Ｃｈ
ｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ，Ｄ．Ａ．Ｄ
ｒｉｖｅｒ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｓ．Ｋ．Ｋｉｍ，Ｂ．ＮｏｒｄｅｎおよびＰ．
Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３６５，６６６（１９９３）によって開示
されるように、ＰＮＡは、相補的なＤＮＡ鎖に対して特異的かつ緊密に結合し、
そしてヌクレアーゼによって分解されない。実際、ＰＮＡは、ＤＮＡ自体が結合
するよりも強力にＤＮＡに結合する。これはおそらく、２つの鎖の間に静電斥力
が存在せず、そしてまたポリアミド骨格がより可撓性が高いことによる。これに
よって、ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖よりも広範囲のストリ
ンジェンシー条件下で結合し、多重鎖ハイブリダイゼーションを行うのをより容
易にする。強力な結合に起因して、ＤＮＡを用いてよりも小さいプローブが用い
られ得る。さらに、おそらく、単一の塩基ミスマッチが、ＰＮＡ／ＤＮＡハイブ
リダイゼーションを用いて決定され得る。なぜなら、ＰＮＡ／ＤＮＡの１５マー
における単一のミスマッチは、ＤＮＡ／ＤＮＡの１５マー二重鎖については４℃
〜１６℃であるのに対して、融点（Ｔ．ｓｕｂ．ｍ）を８〜２０℃低下させるか
らである。また、ＰＮＡ中に電荷基が存在しないことは、ハイブリダイゼーショ
ンが、低いイオン強度で行われ得、そして分析の間の塩によって可能な妨害を減
少させることを意味する。
【０２８０】 本発明は、哺乳動物における癌の検出を含むが、これに限定されない使用を有
する。特に、本発明は、以下を含むがこれらに限定されない、病理学的細胞増殖
新形成の診断の間に有用である：急性骨髄性白血病（急性単球性白血病、急性骨
髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性赤白血病
、急性巨核球性白血病、および急性未分化白血病などを含む）；および慢性骨髄
性白血病（慢性骨髄単球性白血病、慢性顆粒球性白血病などを含む）。好ましい
哺乳動物としては、有尾猿（ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（ａｐｅ）、ネコ、イヌ、
ウシ、ブタ、ウマ、ウサギおよびヒトが挙げられる。特に好ましいのは、ヒトで
ある。
【０２８１】 病理学的細胞増殖障害はしばしば、原癌遺伝子の不適切な活性化に関連する（
Ｇｅｌｍａｎｎ，Ｅ．Ｐ．ら、「Ｔｈｅ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｃｕｔｅ
Ｌｅｕｋｅｍｉａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｖｉｒ
ａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
ｔｈｅ Ｂｌｏｏｄ，第１巻，Ｗｉｅｒｎｉｋ、Ｐ．Ｈ．ら編，１６１−１８２
（１９８５））。新形成は現在、ウイルス配列の染色体への挿入、より活性に転
写される領域への遺伝子の染色体転座、または何らかの他の機構による、正常な
細胞遺伝子産物の定性的変化から、または遺伝子発現の定量的改変から生じると
考えられている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。特定の遺伝子の変異または変更さ
れた発現が、他の組織および他の細胞型の中でも、いくつかの白血病の病因と関
与するようである（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。実際、いくつかの動物新形成に
関与する癌遺伝子のヒト対応物は、ヒトの白血病および癌のいくつかの症例にお
いて増幅または転座されている（Ｇｅｌｍａｎｎら、前出）。
【０２８２】 例えば、ｃ−ｍｙｃ発現は、非リンパ球性白血病細胞株ＨＬ−６０において高
度に増幅される。ＨＬ−６０細胞が増幅を止めるように化学的に誘導される場合
、ｃ−ｍｙｃのレベルは、ダウンレギュレートされることが見出される（国際公
開第ＷＯ９１／１５５８０号）。しかし、ｃ−ｍｙｃまたはｃ−ｍｙｂの５’末
端に相補的であるＤＮＡ構築物へのＨＬ−６０細胞の暴露が、ｃ−ｍｙｃタンパ
ク質またはｃ−ｍｙｂタンパク質の発現をダウンレギュレートする対応するｍＲ
ＮＡの翻訳をブロックし、そして処理した細胞の細胞増殖および分化の停止を引
き起こすことが示されている（国際公開第ＷＯ９１／１５５８０号；Ｗｉｃｋｓ
ｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：１０２８（１９８
８）；Ａｎｆｏｓｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３３
７９（１９８９））。しかし、当業者は、増殖表現型を示すことが公知である種
々の起源の多数の細胞および細胞型を考慮すれば、本発明の有用性が造血細胞お
よび組織の増殖性障害の処置に限定されないことを認識する。
【０２８３】 前述に加えて、本発明のポリヌクレオドは、三重らせん体形成またはアンチセ
ンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。
アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５
６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９８）において
議論される。三重らせん体形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９９８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５１；１３６０（１９９１）において議論される。両方の方法は、相補的
なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオドの結合に依存する。これらの技術につ
いて、好ましいポリヌクレオドは、通常、２０〜４０塩基長であり、そして転写
に関与する遺伝子の領域（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４
５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０
（１９９１）を参照のこと）またはｍＲＮＡ自体（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ、
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ、ＦＬ（１９８８））のいずれかに対して相補的であるオリゴヌクレオチ
ドである。三重らせん体形成は、ＤＮＡからのＲＮＡ転写の遮断を最適に生じる
が、一方アンチセンスＲＮＡのハイブリダイゼーションは、ポリペプチドへのｍ
ＲＮＡ分子の翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセ
ンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されて、本発明のポリペプチドの産生
を阻害し得るように細胞に送達され得る。両方の技術は、モデル系において効果
的であり、そして本明細書中に開示された情報を使用して、疾患を処置するため
の試みにおいて、そして特に増殖性の疾患および／または状態の処置のため、ア
ンチセンスのポリヌクレオチドまたは三重らせん体のポリヌクレオドを設計する
ために使用され得る。
【０２８４】 本発明のポリヌクレオドはまた、遺伝子治療に有用である。遺伝子治療の目的
の１つは、遺伝的欠損を補正するための試みにおいて、欠損遺伝子を有する生物
に正常な遺伝子を挿入することである。本発明において開示されるポリヌクレオ
チドは、非常に正確な様式において、そのような遺伝的欠損を標的化する手段を
提供する。別の目的は、宿主のゲノムには存在しなかった新しい遺伝子を挿入し
、それにより宿主細胞において新しい形質を産生することである。
【０２８５】 このポリヌクレオチドはまた、微量の生物学的サンプルから個体を同定するの
に有用である。米国陸軍は、例えば、その個体の識別のために、制限体断片長多
型（ＲＦＬＰ）の使用を考えている。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは
、１つ以上の制限酵素で消化され、そしてサザンブロットでプローブ化されて個
体を識別するための独特のバンドを生じる。この方法は、紛失、入れ替え、また
は盗難され得、ポジティブな識別を困難にする「認識票」の現在の制限に患わさ
れることがない。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＦＬＰのさらなるＤＮＡマー
カーとして使用され得る。
【０２８６】 本発明のポリヌクレオチドはまた、個体のゲノムの選択された部分の塩基ごと
の実際のＤＮＡ配列を決定することにより、ＲＦＬＰの代わりとして使用され得
る。これらの配列を使用して、そのような選択されたＤＮＡを、増幅および単離
するためのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これは配列決定され得る。
この技術を使用して、個体を同定し得る。なぜなら、各個体は独特なＤＮＡ配列
のセットを有するからである。一旦、独特なＩＤデータベースが、個体に対して
確立されると、その個体（生存または死亡している）のポジティブな識別が、非
常に小さな組織サンプルからなされ得る。
【０２８７】 法医学的生物学はまた、本明細書中に開示されるようにＤＮＡに基づく識別技
術を使用することから有益である。非常に小さな生物学的サンプル（例えば、組
織（例えば、髪または皮膚）あるいは体液（例えば、血液、唾液、精液、滑液、
羊水、母乳、リンパ液、肺痰または表面活性物質、尿、糞便など））から得られ
たＤＮＡ配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。１つの先行技術において、多型
座位（例えば、ＤＱａ クラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子）から増幅された遺伝子配列
を法医学的生物学において使用して、個体を識別する（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．、Ｐ
ＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２））
。一旦、これらの特定の多型座位が増幅されれば、それらを１つ以上の制限酵素
で消化して、ＤＱａ クラスＩＩ ＨＬＡ遺伝子に対応するＤＮＡでプローブさ
れた、サザンブロットにおいて識別するバンドのセットを生じる。同様に、本発
明のポリヌクレオチドを、法医学的目的のための多型性マーカーとして使用し得
る。
【０２８８】 特定の組織の供給源を同定し得る試薬についての必要性がまた存在する。例え
ば、起源のわからない組織とともに提示される場合、法医学において、そのよう
な必要性が生じる。適切な試薬は、例えば、本発明の配列から調製されるＤＮＡ
プローブまたはプライマーを含み得る。そのような試薬のパネルは、種および／
または器官の型により組織を同定し得る。同様の様式において、これらの試薬を
使用して、汚染について組織培養物をスクリーニングし得る。
【０２８９】 本発明のポリヌクレオチドはまた、生物学的サンプル中に存在する組織または
細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有用である
。同様に、本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織
（例えば、免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセ
イ）の差示的同定のための免疫学的プローブの提供に有用である。さらに、上記
組織または細胞の多くの障害に関して、「標準の」遺伝子発現レベル（すなわち
、障害を有さない個体由来の健常組織中の発現レベル）に対して有意により高い
かまたはより低いレベルの本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチドの遺伝子発
現が、このような障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、本発明
のポリペプチドおよび／もしくはポリヌクレオチドを発現する組織ならびに／ま
たは癌性組織および／もしくは創傷組織）または体液（例えば、血清、血漿、尿
、滑液または髄液）において検出され得る。
【０２９０】 従って、本発明は、以下の工程を含む障害の診断方法を提供する：（ａ）個体
の細胞または体液中の遺伝子発現レベルをアッセイする工程；（ｂ）標準的な遺
伝子発現レベルと、この遺伝子発現レベルを比較し、それにより、標準の発現レ
ベルと比較して、アッセイされた遺伝子発現レベルの増加または減少が障害を示
す、工程。
【０２９１】 少なくとも、本発明のポリヌクレオドは、サザンブロットのゲル上の分子量マ
ーカーとして、特定の細胞型における特異的ｍＲＮＡの存在についての診断プロ
ーブとして、新規のポリヌクレオドを発見するプロセスにおける「減算した（ｓ
ｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」公知の配列に対するプローブとして、「遺伝子チッ
プ」または他の支持体に付着するためのオリゴマーを選択および作製するために
、ＤＮＡ免疫技術を用いて抗ＤＮＡ抗体を惹起するために、および免疫応答を惹
起する抗原として使用され得る。
【０２９２】 （ポリペプチドの使用） 本明細書中で同定される各々のポリペプチドは、多くの方法において使用され
得る。以下の記述は、例示として考慮されるべきであり、そして公知の技術を利
用する。
【０２９３】 本発明のポリペプチドに指向されるポリペプチドおよび抗体は、組織（例えば
、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼのような免疫組織化学アッセイ（Ｈｓｕら、Ｊ．
Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２９：５７７−５８０（１９８１））
または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）の差次的同定のための免疫学的
プローブを提供するために有用である。
【０２９４】 抗体は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的な方法を用いて、生物学的サン
プル中の本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのレベルを
アッセイし得る。（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１
０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照のこと）。タンパク質の
遺伝子発現を検出するのに有用な、他の抗体に基づく方法には、イムノアッセイ
（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ））が含まれる。適切な抗体アッセイの標識は、当該分野で
公知であり、そして酵素標識（例えば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位
体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35 Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉ
ｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウ
ム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセ
ノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140 Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ
、97Ｒｕ；発光標識（例えば、ルミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フル
オレセインおよびローダミン）ならびにビオチンが挙げられる。
【０２９５】 生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドのレベルをアッセイすることに加
えて、タンパク質はまた、画像化によりインビボで検出され得る。タンパク質の
インビボ画像化のための抗体の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、ま
たはＥＳＲにより検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法のために適切な標識は、放
射性同位体（例えば、バリウムまたはセシウム）を含み、これは検出可能な放射
線を放射するが、被験体に対して明らかに有害ではない。ＮＭＲおよびＥＳＲの
ための適切なマーカーは、検出可能な特徴的なスピンを有するマーカー（例えば
、重水素）を含み、これは、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識する
ことにより抗体中に取り込まれ得る。
【０２９６】 放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、 121 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（115m Ｉｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ
）、タリウム（201Ｔｌ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ
）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、 177 Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186
Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過性物質、または核
磁気共鳴により検出可能な材料のような適切な検出可能な画像化部分で標識され
た、タンパク質特異的抗体または抗体フラグメントは、哺乳動物に（例えば、非
経口的、皮下、または腹腔内に）導入され、免疫系の障害について検査される。
被験体のサイズおよび用いられる画像化システムは、診断画像を生成するために
必要な画像化部分の量を決定することが当該分野で理解される。放射性同位体部
分の場合には、ヒト被験体について、注射される放射能の量は、通常、99mＴｃ
の約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識された抗体または抗体フ
ラグメントは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発
現する細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕ
ｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒ
ａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａ
ｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒ
ｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０２９７】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチドおよび／または抗体）を投与することによる、本発明の組成物の細
胞への特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治
療タンパク質を標的化細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において
、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本
鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込み得るか、またはエピソームにて複製し
得、そして転写され得るＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供す
る。
【０２９８】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグに関連
する本発明のポリペプチドを投与することによる細胞の特異的な破壊（例えば、
腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０２９９】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクタ系、放射性同位体、ホロ毒素（
ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の条
件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の分
子もしくは酵素を結合および活性化する１つ以上の化合物を意味する。本発明の
方法に従って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞
傷害性エフェクタ系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその補体固定含有
部分）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン
、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モ
モルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヤマゴボウ抗ウ
イルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「毒素」は
また、細胞分裂停止剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射活性金属イオン（
例えば、α−放射体（例えば、213Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば
、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、9 0 Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イッ
トリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウム）；発光
標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび
ローダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０３００】 当該分野において公知の技術は、本発明のポリペプチド（抗体を含む）を標識
化するために適用され得る。このような技術としては、二官能性結合剤の使用（
例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５
，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；
同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３
９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４
，５６０号；および５，８０８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、
本明細書中に参考としてその全体を援用する）が挙げられるが、これに限定され
ない。
【０３０１】 従って、本発明は、障害の診断方法を提供し、これは以下を含む：（ａ）個体
の細胞または体液における本発明のポリペプチドの発現レベルをアッセイする工
程；および（ｂ）アッセイされたポリペプチドの発現レベルを標準のポリペプチ
ドの発現レベルと比較し、それによって標準の発現レベルと比較してアッセイさ
れたポリペプチドの発現レベルにおける増加または減少が障害を示す工程。癌に
関しては、個体由来の生検された組織中の相対的に高い量の転写物の存在は、疾
患の発症の素因を示し得るか、または実際の臨床的な症状が明らかとなる前に疾
患を検出するための手段を提供し得る。より決定的なこのタイプの診断は、保健
専門家が早く予防策または積極的な処置を使用し、それによって癌の発症または
さらなる進行を防ぐことを可能にし得る。
【０３０２】 さらに、本発明のポリペプチドを用いて疾患または状態（例えば、神経障害、
免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心血管障害、腎臓障害、
増殖障害ならびに／または癌性疾患および状態など）を処置または予防し得る。
例えば、患者は、本発明のポリペプチドの非存在またはレベルの減少を元に戻す
こと（例えば、インスリン）、異なるポリペプチドの不在またはレベルの減少を
補充すること（例えば、ヘモグロビンＢに対するヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタ
ラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質）、ポリペプチドの活性を阻害すること（例えば
、癌遺伝子または腫瘍抑制因子）、ポリペプチドの活性を活性化すること（例え
ば、レセプターに結合することによって）、遊離リガンドについて膜結合レセプ
ターと競合させることによって膜結合レセプターの活性を減少させること（例え
ば、炎症を低減させる際に用いられる可溶性ＴＮＦレセプター）、または所望の
応答をもたらすこと（例えば、血管の成長の阻害、増殖細胞または組織に対する
免疫応答の増強）の試みにおいて、本発明のポリペプチドが投与され得る。
【０３０３】 同様に、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体もまた用いられ、疾患
（上記、および本明細書中のどこかに記載されるような）を処置し得る。例えば
、本発明のポリペプチドに対して指向される抗体の投与には、ポリペプチドを結
合して、そして／またはポリペプチドを中和し、そして／またはポリペプチドの
過剰産生を低減し得る。同様に、抗体の投与は、例えば、膜に結合したポリペプ
チド（レセプター）へ結合することにより、ポリペプチドを活性化し得る。
【０３０４】 少なくとも、本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いるＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾過カラムの分子量マーカーとして使用され
得る。宿主細胞の形質転換を評価する方法として、ポリペプチドがまた用いられ
、抗体を惹起し得、次いで、この抗体が使用され、組換え細胞からのポリペプチ
ド発現を測定する。さらに、本発明のポリペプチドが使用され、以下の生物学的
活性を試験し得る。
【０３０５】 （遺伝子治療方法） 本発明の別の局面は、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝
子治療方法である。この遺伝子治療方法は、本発明のポリペプチドの発現を達成
するための、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配
列の動物への導入に関する。この方法は、標的組織によるこのポリペプチドの発
現のために必要なプロモータおよび他の任意の遺伝因子と、作動可能に連結した
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような
遺伝子治療および送達技術は当該分野において公知である（例えば、本明細書中
に参考として援用される、ＷＯ９０／１１０９２を参照のこと）。
【０３０６】 従って、例えば、患者由来の細胞は、エキソビボで本発明のポリヌクレオチド
と作動可能に連結したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）を用いて操作され、次いで、操作された細胞は、本発明のポリペプチドを用
いて処置される患者に提供される。このような方法は、当該分野において周知で
ある。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８５：１０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら
、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；
Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４
−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ，Ｔ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６
０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ，Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ
，Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）
；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ，Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６
−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ，Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照のこと。これらは
、本明細書中に参考として援用される。１つの実施形態においては、操作される
細胞は、動脈細胞である。この動脈細胞は、動脈、動脈の周囲の組織への直接的
な注射を介して、またはカテーテル注入を介して患者に再導入され得る。
【０３０７】 以下により詳細に考察されるように、このポリヌクレオチド構築物は、注射可
能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚
、肺、肝臓など）の間質空間への注射）により送達され得る。このポリヌクレオ
チド構築物は、薬学的に受容可能な液体または水性のキャリア中で送達され得る
。
【０３０８】 １つの実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオ
チドとして送達される。用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡと
は、細胞への侵入を補助し、促進し、または容易にするために作用するいかなる
送達ビヒクル（ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチ
ンまたは沈殿剤などを含む）も含まない配列をいう。しかし、本発明のポリヌク
レオチドはまた、当業者に周知の方法により調製され得るリポソーム処方物中お
よびリポフェクチン処方物中などで送達され得る。このような方法は、例えば、
米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，５８９，４６６号および同第５，５
８０，８５９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される
。
【０３０９】 遺伝子治療方法において使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ま
しくは、宿主ゲノム中に組み込まれないかまたは複製を可能にする配列を含まな
い構築物である。適切なベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能
なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；
ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．
１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に容
易に明らかである。
【０３１０】 当業者に公知の任意の強力なプロモーターは、本発明のポリヌクレオチド配列
の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、アデノウ
イルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または
異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター）；
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプ
ロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アル
ブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウ
イルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ
プロモーター）；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；およびヒ
ト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。このプロモーターはまた、本発明の
ポリヌクレオチドについてネイティブなプロモーターであり得る。
【０３１１】 他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入する１つの主
要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。研
究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入されて、６ヶ月までの期間の間、所
望のポリペプチドの産生を提供し得ることが示された。
【０３１２】 本発明のポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝
臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃
、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）
の間隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、器官組織の細網線維間の、
細胞間の液体ムコ多糖類基質、血管または室の壁における弾性線維、線維性組織
のコラーゲン線維、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔ
ｉｓｓｕｅ ｅｎｓｈｅａｔｈｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）内または骨の
裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャン
ネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は、
以下で議論される理由のために好ましい。本発明のポリヌクレオチド構築物は、
これらの細胞を含む組織への注射によって、好都合に送達され得る。本発明のポ
リヌクレオチド構築物は、好ましくは、分化した持続性の非分裂細胞に送達され
、そしてその細胞において発現されるが、送達および発現は、非分化細胞または
完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚線維芽細胞）に
おいて達成され得る。インビボでの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込み、
そして発現する能力において、特に適格である。
【０３１３】 裸の核酸配列注射のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬量は、約０．０５
ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好ましくは、この投薬
量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そしてより好まし
くは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、当業者が認識
するように、この投薬量は、注射の組織部位に応じて変化する。核酸配列の適切
かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そして処置される状態
および投与経路に依存し得る。
【０３１４】 好ましい投与経路は、組織の間隙空間への非経口注射経路による。しかし、他
の非経口経路もまた用いられ得、これには、例えば、特に、肺または気管支の組
織、咽喉または鼻の粘膜への送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる
。さらに、裸のＤＮＡ構築物が、血管形成術の間にこの手順において用いられる
カテーテルによって動脈に送達され得る。
【０３１５】 裸のポリヌクレオチドは、送達部位での直接の針注射、静脈内注射、局所投与
、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」を含むがこれらに限定されない
、当該分野で公知の任意の方法によって送達される。これらの送達方法は、当該
分野で公知である。
【０３１６】 この構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフ
ェクチン、沈殿剤などのような送達ビヒクルを用いて送達され得る。このような
送達方法は、当該分野で公知である。
【０３１７】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチド構築物は、リポソーム調
製物中で複合体化している。本発明にて使用するためのリポソーム調製物は、カ
チオン性（正に荷電した）、アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を
包含する。しかしながら、カチオン性リポソームとポリアニオン性核酸との間で
強固な荷電複合体を形成し得るので、カチオン性リポソームが特に好ましい。カ
チオン性リポソームは、機能的形態において、プラスミドＤＮＡ（本明細書中で
参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７））；ｍＲＮＡ（本明細書
中で参考として援用される、Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：６０７７〜６０８１（１９８９））；および精製された
転写因子（本明細書中で参考として援用される、Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．、２６５：１０１８９〜１０１９２（１９９０））の細胞内送達を媒介
することが示されている。
【０３１８】 カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは特に有用であり、そして登録商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎのもと
にＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．（本明細書中で参
考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１６（１９８７）をもまた参照のこと、）よ
り入手可能である。他の市販のリポソームとしては、トランスフェクテース（ｔ
ｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）が挙げられる。
【０３１９】 当該分野で周知の技術を使用して、他のカチオン性リポソームを、容易に入手
可能な物質より調製し得る。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−
３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記述に関して、例
えばＰＣＴ公開第ＷＯ ９０／１１０９２号（本明細書中で参考として援用され
る）を参照のこと。ＤＯＴＭＡリポソームの調製は文献にて説明されており、例
えば、本明細書中で参考として援用される、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７を参照のこと。類
似した方法を使用して、他のカチオン性脂質物質よりリポソームを調製し得る。
【０３２０】 同様に、アニオン性リポソームおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔ
ｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から容易に
入手可能であり、または容易に入手可能な物質を使用して簡単に調製され得る。
そのような物質としてはとりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホ
スファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ
）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。これらの物質はまた、
ＤＯＴＭＡ出発物資およびＤＯＴＡＰ出発物質と適切な割合において混合され得
る。これらの物質を使用してリポソームを生成する方法は、当該分野で周知であ
る。
【０３２１】 例えば、商業的に、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレ
オイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファ
チジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせにおいて使用し、コレ
ステロールを添加してもしなくても、従来のリポソームを生成し得る。従って、
例えば、超音波処理バイアル中への窒素ガス流下で、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣの
各５０ｍｇを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製し得る。この
サンプルを一晩真空ポンプ下に置き、そして次の日、脱イオン水で水和する。次
いで、水槽を、１５ＥＣで循環させながら、最大設定にて、逆位カップ（浴タイ
プ）プローブを装備したＨｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ モデル３５０超音波処理器
を使用して、このサンプルを栓をしたバイアル中にて２時間超音波処理する。あ
るいは、負に荷電した小胞を、超音波処理なしで調製して多重膜小胞を生成し得
るか、または核孔膜（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を通して押し
出すことにより別々の大きさの単膜小胞を生成し得る。他の方法は、当業者に公
知でありそして利用可能である。
【０３２２】 このリポソームとしては、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）、小さな単膜リポソー
ム（ＳＵＶ）または大きな単膜リポソーム（ＬＵＶ）が挙げられ得、ＳＵＶが好
ましい。当該分野で周知の方法を使用して、種々のリポソーム−核酸複合体が調
製される。例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅ
ｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０１：５１２〜５２７
（１９８３）を参照のこと。例えば、核酸を含有するＭＬＶは、ガラスチューブ
の壁面にリン脂質の薄膜を堆積させ、そしてその後、カプセル化されるべき物質
の溶液で水和することによって調製され得る。ＳＵＶはＭＬＶの長期超音波処理
により調製され、単膜リポソームの均質集団を生成する。封入されるべき物質を
、予め形成されたＭＬＶの懸濁液に添加し、次いで、超音波処理する。カチオン
性脂質を含むリポソームを使用する場合、乾燥した脂質フィルムを、滅菌水また
は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌのような等張性緩衝溶液のような適切な溶液中
に再懸濁し、超音波処理し、次いで、予め形成されたリポソームをＤＮＡと直接
混合する。正に荷電したリポソームのカチオン性ＤＮＡへの結合に起因して、リ
ポソームおよびＤＮＡは非常に安定な複合体を形成する。ＳＵＶは、小核酸フラ
グメントを用いての用途を見出す。ＬＵＶは、当該分野で周知の多くの方法によ
り調製される。一般に使用される方法としては、Ｃａ2+−ＥＤＴＡキレート化（
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ、３９４：４８３（１９７５）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１７：７７（１
９７９））；エーテル注入（Ｄｅａｍｅｒ ＤおよびＢａｎｇｈａｍ Ａ、Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔ
ｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．、（１９７
７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、（１９７９）７６：３３４８）；界面活性剤透析（Ｅｎｏｃｈら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９７９）７６：１４５）；お
よび逆相エバポレーション（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏ
ｐｏｕｌｏｓ Ｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、（１９７
８）７５：１４５；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、（１
９８２）２１５：１６６）が挙げられ、これらの文献は本明細書中で参考として
援用される。
【０３２３】 一般に、ＤＮＡのリポソームに対する割合は約１０：１から約１：１０までで
ある。好ましくは、その割合（ｒａｔｉｏｎ）は約５：１から約１：５までであ
る。より好ましくは、その割合は約３：１から約１：３までである。さらにより
好ましくは、その割合は約１：１である。
【０３２４】 米国特許第５，６７６，９５４号（本明細書中で参考として援用される）はカ
チオン性リポソームキャリアと複合体化された遺伝物質のマウスへの注入につい
て報告する。米国特許第４，８９７，３５５号、同第４，９４６，７８７号、同
第５，０４９，３８６号、同第５，４５９，１２７号、同第５，５８９，４６６
号、同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，
０５５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考と
して援用される）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトする際に
使用するためのカチオン性脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、
同第５，６９３，６２２号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５
５号および国際公開第ＷＯ９４／９４６９号（これらは本明細書中で参考として
援用される）は、ＤＮＡ−カチオン性脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提
供する。
【０３２５】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を含むＲＮ
Ａを含むレトロウイルス粒子を使用して、エキソビボまたはインビボで細胞を操
作する。レトロウイルスプラスミドベクターを誘導し得るレトロウイルスとして
は、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、
ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、
ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０３２６】 このレトロウイルスプラスミドベクターを使用して、パッケージング細胞株を
形質導入し、プロデューサー細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッ
ケージング細胞株の例としては、その全体が本明細書中で参考として援用される
、Ｍｉｌｌｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅａｐｙ、１：５〜１４（１９９
０）にて記載されるようなＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１
２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋
Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに
限定されない。このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により、パッケー
ジング細胞を形質導入し得る。そのような手段としては、エレクトロポレーショ
ン、リポソームの使用、およびＣａＰＯ4沈殿が挙げられるが、それらに限定さ
れない。１つの代替法において、このレトロウイルスプラスミドベクターをリポ
ソームにカプセル化するか、または脂質に結合して、次いで宿主に投与し得る。
【０３２７】 このプロデューサー細胞株は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、そのよう
なレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボのどちら
かにおいて、真核生物細胞を形質導入し得る。この形質導入された真核生物細胞
は、本発明のポリペプチドを発現する。
【０３２８】 特定の他の実施形態において、アデノウイルスベクター中に含まれる本発明の
ポリヌクレオチドを用いて、エキソビボまたはインビボで細胞を操作する。アデ
ノウイルスは、それが本発明のポリペプチドをコードし、そして発現し、それと
同時に通常の溶解性ウイルス生活環にて複製するその能力に関して不活性化され
るように操作され得る。アデノウイルス発現は、そのウイルスＤＮＡの宿主細胞
染色体への組み込み無しに達成され、その結果、挿入性変異誘発についての心配
が軽減される。さらに、アデノウイルスは、何年もの間、腸の生ワクチンとして
優れた安全側面を伴って使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｔ Ａ．Ｒ．ら、
（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１０９：２３３−２３８
）。最終的に、アデノウイルス媒介性遺伝子移入が、コトン（ｃｏｔｔｏｎ）ラ
ットの肺へのα−１−アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移入を含む多くの例に
おいて実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：４３
１〜４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３〜１
５５（１９９２））。さらに、ヒト癌における原因物質としてアデノウイルスを
確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎら Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：６６０６（１９７９））。
【０３２９】 本発明において有用である適切なアデノウイルスベクターが、例えば、Ｋｏｚ
ａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ
．、３：４９９〜５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８
：１４３〜１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９〜７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｇｅｎｅｔ、７：３６２〜３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕ
ｒｅ、３６５:６９１〜６９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２
２４号に記載されており、これらは本明細書中で参考として援用される。例えば
、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、そしてヒト２９３細胞にて増殖
され得る。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、そして構成的に
ＥｌａおよびＥｌｂを発現し、このことは、このベクターから欠失している遺伝
子の産物を提供することによって欠損アデノウイルスを補完する。Ａｄ２に加え
て、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５、およびＡｄ７）もま
た、本発明において有用である。
【０３３０】 好ましくは、本発明において使用されるアデノウイルスは、複製欠損性である
。複製欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するために、ヘルパーウイルス
および／またはパッケージング細胞株の助けを必要とする。得られたウイルスは
、細胞に感染する能力があり、そしてプロモーターに作動可能に連結された目的
のポリヌクレオチドを発現し得るが、ほとんどの細胞にて複製し得ない。複製欠
損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａまたは
Ｌ１からＬ５までのすべてまたは一部のうちの１つ以上にて欠失され得る。
【０３３１】 特定の他の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、エ
キソビボまたはインビボでこの細胞を操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生成す
るためにヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである（
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１５８：９７（１９９２））。ＡＡＶはまた、分裂中ではない細
胞の中にそのＤＮＡを組み込み得る数少ないウイルスの中の１つである。３００
塩基対程度の小さいＡＡＶを含むベクターがパッケージされ得、そして組み込み
得るが、外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに限られる。そのような
ＡＡＶの生成および使用の方法は当該分野で公知である。例えば、米国特許第５
，１３９，９４１号、同第５，１７３，４１４号、同第５，３５４，６７８号、
同第５，４３６，１４６号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４７８，７４
５号および同第５，５８９，３７７号を参照のこと。
【０３３２】 例えば、本発明において使用するために適切なＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製
、キャプシド形成、および宿主細胞組み込みに必要な配列すべてを含む。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９
８９）において見い出される方法のような、標準的クローニング方法を使用して
、ポリヌクレオチド構築物を、このＡＡＶベクターに挿入する。次いで、リポフ
ェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む、任意
の標準的技術を使用して、この組み換えＡＡＶベクターを、ヘルパーウイルスに
感染しているパッケージング細胞にトランスフェクトする。適切なヘルパーウイ
ルスとしては、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシニアウイルス、
またはヘルペスウイルスが挙げられる。一旦パッケージング細胞がトランスフェ
クトおよび感染されると、それらは本発明のポリヌクレオチド構築物を含む感染
性ＡＡＶウイルス粒子を生成する。次いで、エキソビボまたはインビボのいずれ
かで、これらのウイルス粒子を使用して真核生物細胞を形質導入する。この形質
導入細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、そして
本発明のポリペプチドを発現する。
【０３３３】 遺伝子治療の別の方法は、相同組み換え（例えば、米国特許第５，６４１，６
７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、１９
９６年９月２６日公開；国際公開第ＷＯ９４／１２６５０号、１９９４年８月４
日公開；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８
６：８９３２〜８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３４２：４３５〜４３８（１９８９）を参照のこと）を介して、異種制御領
域および内在性ポリヌクレオチド配列（例えば、目的のポリペプチド配列をコー
ドしている配列）を作動可能に連結する工程を含む。この方法は、標的細胞中に
存在しているが、通常はその細胞中で発現しないかまたは所望するよりも低いレ
ベルで発現する、遺伝子の活性化を含む。
【０３３４】 当該分野で既知の標準的技術を使用して、ポリヌクレオチド構築物を作製する
。この構築物は、プロモーターを、そのプロモーターに隣接した標的化配列とと
もに含む。適切なプロモーターが、本明細書中に記載されている。標的化配列は
、内在性配列に対して十分に相補的であり、プロモーター−標的化配列と内在性
配列との相同組換えを可能にする。標的化配列は、所望される内在性ポリヌクレ
オチド配列の５’末端の十分近くに存在し、それゆえ、相同組換えに際して、プ
ロモーターは、内在性配列に作動可能に連結される。
【０３３５】 このプロモーターおよび標的化配列は、ＰＣＲを使用して増幅され得る。好ま
しくは、この増幅されたプロモーターは、５’末端および３’末端に別の制限酵
素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅されたプロモ
ーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末
端は、増幅されたプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。増幅されたプ
ロモーターおよび標的化配列を消化し、そしてともに連結する。
【０３３６】 裸のポリヌクレオチドとしてか、もしくは上記により詳細に記載されるような
リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、ウイルス全体、リポフェクション、
沈殿剤などのようなトランスフェクション促進剤と一緒にかのいずれかで、この
プロモーター−標的化配列構築物を細胞に送達する。直接針注射、静脈内注射、
局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などを含む任意の方法により、Ｐプロモ
ーター−標的化配列を送達し得る。この方法を、下記により詳細に記載する。
【０３３７】 プロモーター−標的化配列構築物は、細胞により取り込まれる。この構築物と
内在性配列との間に相同組換えが起こり、その結果、内在性配列は、このプロモ
ーターの制御下に配置される。次いで、このプロモーターは、内在性配列の発現
を駆動する。
【０３３８】 好ましくは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、そのタ
ンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含む。代表的に、このシグナル配
列は、ポリヌクレオチドのコード領域の５’末端に向かってかまたは５’末端で
発現される、そのポリヌクレオチドのコード領域に位置する。このシグナル配列
は、目的のポリヌクレオチドに対して同種または異種であり得、そしてトランス
フェクトされる細胞に対して同種または異種であり得る。さらに、当該分野で公
知の方法を使用して、このシグナル配列は化学合成され得る。
【０３３９】 その投与様式によって、治療効果を提供するのに十分な量にて１つ以上の分子
が発現される限り、上記の任意のポリヌクレオチド構築物の任意の投与様式が使
用され得る。これは、直接針注入、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティ
ック（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、
ゲルフォームスポンジデポー（ｄｅｐｏｔ）、他の市販デポー（ｄｅｐｏｔ）物
質、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚａミニポンプ）、経口用または坐剤用の固形
（錠剤または丸剤）薬学的処方物、および手術中のデカンティングまたは局所適
用を含む。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのリン酸カルシウム沈殿した
裸のプラスミドの直接注入、または門脈へのタンパク質被覆プラスミド直接注入
は、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現をもたらした（Ｋａｎｅｄａら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：３７５（１９８９））。
【０３４０】 局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビ
ヒクルと複合体を形成した本発明の組換え分子は、動脈領域中に直接注入により
投与されるか、または動脈領域内部に局所投与される。動脈領域内部での組成物
の局所投与とは、その組成物を動脈内に数センチメートル、好ましくは数ミリメ
ートルで注射することをいう。
【０３４１】 局所投与の別の方法は、外科的創傷内またはその周辺に本発明のポリヌクレオ
チド構築物を接触させることである。例えば、患者は手術を経験し得、そしてこ
のポリヌクレオチド構築物を創傷内部の組織表面上に被覆され得るか、またはそ
の構築物を創傷内部の組織領域に注射され得る。
【０３４２】 全身投与に有用な治療組成物は、本発明の標的化された送達ビヒクルと複合体
を形成した本発明の組換え分子を含む。全身投与で使用するために適切な送達ビ
ヒクルは、特定部位に対してそのビヒクルを標的化するリガンドを含むリポソー
ムを含む。
【０３４３】 全身投与の好ましい方法としては、静脈内注射、エアロゾル、経口および経皮
（局所的）送達が挙げられる。当該分野で標準的な方法を使用して、静脈内注射
が実行され得る。当該分野で標準的な方法を使用して、エアロゾル送達もまた実
行され得る（例えば、本明細書中で参考として援用される、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１８９：１１２７７〜１
１２８１（１９９２）を参照のこと）。動物の腸内の消化酵素による分解に耐え
る能力をもつキャリアに対して本発明のポリヌクレオチド構築物が複合体を形成
することにより、経口送達は実行され得る。そのようなキャリアの例としては、
当該分野で公知であるもののような、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げら
れる。皮膚内へ通過可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と本発明のポリヌク
レオチド構築物を混合することによって、局所的送達は実行され得る。
【０３４４】 送達される物質の有効量を決定することは、例えば、その物質の化学構造およ
び生物学的活性、動物の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびそ
の重症度、ならびに投与経路を含む、多数の因子に依存し得る。処置の頻度は、
１用量あたりの投与されるポリヌクレオチド構築物の量ならびに被験体の健康お
よび病歴のような多くの因子に依存する。正確な量、投薬回数および投薬のタイ
ミングは、主治医または主治獣医により決定される。
【０３４５】 本発明の治療的組成物は、任意の動物に、好ましくは哺乳動物および鳥類に投
与され得る。好ましい哺乳動物としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、
ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられ、ヒトが特に好ましい。
【０３４６】 （生物学的活性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをアッセイに使用して、１つ以上の生物学的活性について試験し
得る。本発明のこれらのポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニ
ストもしくはアンタゴニストが特定のアッセイにおいて活性を示す場合、これら
の分子はその生物学的活性に関連した疾患に関与し得るようである。従って、こ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、およびアゴニストまたはアンタゴニス
トを使用して、関連した疾患を処置し得る。
【０３４７】 （免疫活性） 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（走化性）を活性化ま
たは阻害することにより、免疫系の欠損または障害の処置において有用であり得
る。免疫細胞は、造血と呼ばれるプロセスを介して発生し、多能性幹細胞から骨
髄性細胞（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）ならびにリンパ系細
胞（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）を生成する。これら免疫の欠損または障害の
病因は、遺伝的、身体的（ｓｏｍａｔｉｃ）（例えば、癌またはいくつかの自己
免疫障害）、後天的（例えば、化学療法もしくは毒素による）または感染的であ
り得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴ
ニストもしくはアンタゴニストは、特定の免疫系の疾患または障害のマーカーま
たは検出物質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）として使用され得る。
【０３４８】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、造血細胞の欠損または障害の処置または検出において有用で
あり得る。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストは、特定の（または多くの）型の造血細胞の減少に関連
した障害を処置する試みにおいて、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増
殖を増加させるために用いられ得る。免疫学的欠損症候群の例としては、血液タ
ンパク質障害（例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）、
毛細血管拡張性運動失調、分類不能型免疫不全、ディ・ジョージ症候群、ＨＩＶ
感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染、白血球接着不全症候群、リンパ球減少、食細胞殺
細菌機能不全、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、ヴィスコット−オールドリッ
チ障害、貧血、血小板減少、またはヘモグロビン尿症が挙げられるが、これらに
限定されない。
【０３４９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをまた使用して、止血性活性（出血を止めること）また
は血栓崩壊活性（血餅形成）を調節し得る。例えば、止血活性または血栓崩壊活
性を増大にすることにより、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、
またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、血液凝固障害（例えば、
無線維素原血症、因子欠損症）、血液血小板障害（例えば、血小板減少症）、ま
たは外傷、手術もしくは他の原因から生じる創傷を処置し得る。あるいは、止血
活性または血栓崩壊活性を減少させ得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、凝血を阻害ま
たは溶解し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、発作または瘢痕の処置に
おいて、重要であり得る。
【０３５０】 自己免疫障害の処置または検出において、本発明のポリヌクレオチドもしくは
ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストはまた、有用であり得
る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞によって、自己を外来性物質として不適切
に認識することから生じる。この不適切な認識は、宿主組織の破壊をもたらす免
疫応答を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性
を阻害し得る本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニス
トもしくはアンタゴニストの投与は、自己免疫障害の防止において効果的な治療
であり得る。
【０３５１】 処置または検出され得る自己免疫障害の例としては、アディソン病、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸
球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーヴズ病、多発性硬化症、重症筋無力
症、神経炎、眼炎、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌腺症、紫斑病、ライ
ター病、スティッフマン症候群、自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマトーデス
、自己免疫性の肺の炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、お
よび自己免疫炎症性眼疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５２】 同様に、ぜん息（特にアレルギー性ぜん息）または他の呼吸の問題のような、
アレルギー反応およびアレルギー状態もまた、本発明のポリヌクレオチドもしく
はポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置され得る
。さらに、これらの分子を使用して、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過
敏症または血液型不適合性を処置し得る。
【０３５３】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストをまた使用して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）
を処置および／または防止し得る。器官拒絶は、免疫応答を介する移植組織の宿
主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答はＧＶＨＤにもまた関与して
いるが、この場合、外来性の移植免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特
にＴ細胞の増殖、分化または走化性を阻害する、本発明のポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストの投与は、器官拒
絶またはＧＶＨＤの防止において効果的な治療であり得る。
【０３５４】 同様に、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニスト
もしくはアンタゴニストをもまた使用して、炎症を調節し得る。例えば、本発明
のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、炎症応答に関与する細胞の増殖および分化を阻害し得る。これらの分
子を使用して、慢性前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎および肉芽腫性マラコプラキア
、感染に関連する炎症（例えば、敗血症ショック、敗血症、もしくは全身炎症応
答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流傷害に関連する炎症、内毒素致死に関連す
る炎症、関節炎に関連する炎症、補体媒介性超急性拒絶に関連する炎症、腎炎に
関連する炎症、サイトカインまたはケモカインが誘導する肺傷害に関連する炎症
、炎症性腸疾患に関連する炎症、クローン病またはサイトカイン（例えば、ＴＮ
ＦまたはＩＬ−１）の過剰生成から生じる炎症を含む、慢性および急性の両方の
状態の炎症状態を処置し得る。
【０３５５】 （過増殖障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、新生物を含む過増殖障害を処置または検出し得る。
本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはア
ンタゴニストは、直接的または間接的な相互作用を介してこの障害の増殖を阻害
し得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストは、過増殖障害を阻害し得る他の細胞を増殖さ
せ得る。
【０３５６】 例えば、免疫応答を増大させること、特に過増殖障害の抗原性の質を増大させ
ることによって、またはＴ細胞を増殖、分化、もしくは動員することによって、
過増殖障害を処置し得る。既存の免疫応答を増強するか、または新たな免疫応答
を開始するかのいずれかによって、この免疫応答を増大させ得る。あるいは、免
疫応答を減少させることもまた、化学療法剤のような、過増殖障害を処置する方
法であり得る。
【０３５７】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置または検出され得る過増殖障害の例としては、結腸
、腹部、骨、胸、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂
体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭および首、神経（中枢および末梢）、
リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器に位置する
新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５８】 同様に、他の過増殖障害もまた、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る
。このような過増殖障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖障
害、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデンスト
レームマクログロブリン血症、ゴシェ病、組織球増殖症、および任意の他の過増
殖疾患、さらに上記に収載されている器官系に位置している新生物が挙げられる
が、これらに限定されない。
【０３５９】 １つの好ましい実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを利用して、本発明、
および／またはそのタンパク質融合物もしくはフラグメントを用いる遺伝子治療
により、異常な細胞分裂を阻害する。
【０３６０】 従って、本発明は、異常に増殖している細胞に、本発明のポリヌクレオチドを
挿入することにより細胞増殖障害を処置するための方法を提供する。ここで、上
記のポリヌクレオチドは、上記の発現を抑制する。
【０３６１】 本発明の別の実施形態は、個体における細胞増殖障害を処置する方法を提供し
、この方法は、異常に増殖している細胞に本発明の１つ以上の活性な遺伝子コピ
ーを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレ
オチドは、上記のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現する際に有効
な組換え発現ベクターを含むＤＮＡ構築物である。本発明の別の好ましい実施形
態において、本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ構築物は、レトロウ
イルス（または、より好ましくは、アデノウイルスベクター）を利用して、処置
されるべき細胞に挿入される（本明細書中に参考として援用される、Ｇ Ｊ．Ｎ
ａｂｅｌら、ＰＮＡＳ １９９９ ９６：３２４−３２６を参照のこと）。最も
好ましい実施形態において、このウイルスベクターは欠損性であり、そして非増
殖細胞を形質転換せず、増殖細胞のみを形質転換する。さらに、好ましい実施形
態において、増殖している細胞に、単独で、または他のポリヌクレオチドととも
に、もしくは他のポリヌクレオチドと融合してのいずれかで挿入される本発明の
ポリヌクレオチドは、次いで、外部刺激（すなわち、磁性、特定の低分子、化学
物質、または薬物投与など）により調節され得る。この刺激は、上記のポリヌク
レオチドの上流にあるプロモーターに作用して、コードされたタンパク質産物の
発現を誘導する。このようにして、本発明の有益な治療効果は、上記の外部刺激
に基づいて、明らかに調節され得る（すなわち、本発明のポリヌクレオチドの発
現を増加、減少、または阻害するために）。
【０３６２】 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、脈管形成タンパク質
をコードする他のポリヌクレオチドとともに投与され得る。脈管形成タンパク質
の例としては、酸性および塩基性の線維芽細胞増殖因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧ
Ｆ−２、ＶＥＧＦ−３、上皮増殖因子αおよび上皮増殖因子β、血小板由来内皮
細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞増殖因子、インス
リン様増殖因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球
／マクロファージコロニー刺激因子、ならびに一酸化窒素シンターゼが挙げられ
るが、これらに限定されない。
【０３６３】 本発明のポリヌクレオチドは、発癌性遺伝子または抗原の発現を抑制する際に
有用であり得る。「発癌性遺伝子の発現を抑制する」とは、遺伝子の転写の抑制
、遺伝子転写物（前メッセンジャー（ｐｒｅ−ｍａｓｓａｇｅ）ＲＮＡ）の分解
、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後修
飾の妨害、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常機能の阻害を意図する。
【０３６４】 異常に増殖する細胞に対する局所的な投与に関しては、本発明のポリヌクレオ
チドは、当業者に公知の任意の方法により投与され得、この方法としては、トラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のマイクロインジェクション
、例えば、リポソームのようなビヒクルにおいて、リポフェクチン、または裸の
ポリヌクレオチドとして、あるいは本明細書中全体を通して記載される任意の他
の方法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のポリヌクレオチドは、
公知の遺伝子の送達系（例えば、当業者に公知のレトロウイルスベクター（Ｇｉ
ｌｂｏａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５（１９８２）；Ｈｏｃｋｅ，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２０：２７５（１９８６）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系
（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３４０３（１
９８５））または他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３
１３：８１２（１９８５））に限定されない）により送達され得る。これらの参
考文献は、例示にすぎず、そして本明細書中に参考として援用される。異常に増
殖している細胞に特異的に送達するかまたはその細胞をトランスフェクトし、そ
して非分裂細胞を残す（ｓｐａｒｅ）ために、当業者に公知のレトロウイルスま
たはアデノウイルス（例えば、当該分野および本明細書中他の箇所で記載される
）送達系を利用することが好ましい。宿主ＤＮＡ複製は組み込むためにレトロウ
イルスＤＮＡを必要とするので、このレトロウイルスは、その生活環についての
必要とされるレトロウイルス遺伝子の欠如に起因して自己複製できない。本発明
のポリヌクレオチドのために、このようなレトロウイルス送達系を利用して、上
記の遺伝子および構築物を、異常に増殖している細胞に標的化し、そして非分裂
性の正常細胞を残す。
【０３６５】 本発明のポリヌクレオチドは、疾患部位に直接注射針を導くために使用される
画像化デバイスの使用によって、内部器官、体腔などにおける細胞増殖性障害／
疾患の部位に直接送達され得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、手術介入時
に疾患部位に投与され得る。
【０３６６】 「細胞増殖性疾患」とは、任意のヒトまたは動物の疾患または障害が、器官、
腔、または身体部分のいずれか１つもしくはいずれかの組み合わせを冒している
ことを意味する。この疾患は、良性または悪性に拘わらず、細胞、細胞群、もし
くは組織の単一または複数の局所的な異常な増殖により特徴づけられる。
【０３６７】 本発明のポリヌクレオチドの任意の量は、この量が、処置される細胞の増殖に
対して生物学的に阻害性の効果を有する限り、投与され得る。さらに、本発明の
１つより多くのポリヌクレオチドを、同時に同じ部位に投与することが可能であ
る。「生物学的に阻害性の」とは、部分的または全体的な成長阻害ならびに細胞
の増殖または成長の速度における減少を意味する。生物学的に阻害性の用量は、
標的の悪性または組織培養において異常に増殖している細胞、動物および細胞培
養物における腫瘍成長、あるいは当業者に公知の任意の他の方法に対する本発明
のポリヌクレオチドの効果を評価することにより決定され得る。
【０３６８】 本発明はさらに、抗体に基づく治療に関し、この方法は、記載される障害の１
つ以上を処置するために、哺乳動物患者（特にヒト患者）に抗ポリペプチド抗体
および抗ポリヌクレオチド抗体を投与する工程を包含する。抗ポリペプチド抗体
および抗ポリヌクレオチド抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
）を生成するための方法は、本明細書中の他の箇所に詳細に記載される。このよ
うな抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように薬
学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０３６９】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の概要は、例えば、補体（ＣＤＣ）
もしくはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるように、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチドを、身体において局所的もしくは全身的に、ま
たは抗体の直接的な細胞傷害性により結合させる工程を包含する。これらのアプ
ローチのいくつかは、以下でより詳細に記載される。本明細書中に提供される教
示があれば、当業者は、本発明の抗体を、過度の実験なくして、診断、モニタリ
ングまたは治療の目的のために使用する方法を理解する。
【０３７０】 詳細には、本発明の抗体、フラグメントおよび誘導体は、本明細書中に記載さ
れるように、細胞増殖性障害および／もしくは分化障害を有するか、または発症
している被験体を処置するために有用である。このような処置は、単一用量また
は複数用量の抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは結合体を投与す
る工程を包含する。
【０３７１】 本発明の抗体は、他のモノクローナル抗体もしくはキメラ抗体と組み合わせて
、またはリンホカインもしくは造血増殖因子（例えば、これは、抗体と相互作用
するエフェクター細胞の数または活性が増加するように作用する）と組み合わせ
て、有利に利用され得る。
【０３７２】 本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、そのフラグメントもしくは
領域に対して、高親和性抗体および／または強力なインビボ阻害抗体および／ま
たは中和抗体を使用することは、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ド（そのフラグメントを含む）に関する障害に関するイムノアッセイおよびその
治療の両方のために好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、
好ましくは、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（そのフラグメントを含む
）に対する親和性を有する。好ましい結合親和性は、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、
５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、
５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０- 12 Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ
、および１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性を含む。
【０３７３】 さらに、本発明のポリペプチドは、本明細書中の他の箇所に記載されるように
、単独で、融合タンパク質として、または直接的にもしくは間接的に他のポリペ
プチドとの組み合わせでかのいずれかで、増殖性細胞もしくは組織の脈管形成を
阻害する際に有用である。最も好ましい実施形態において、上記の抗脈管形成効
果は、間接的に、例えば、造血性の腫瘍特異的細胞（例えば、腫瘍関連マクロフ
ァージ）の阻害を通じて、達成され得る（本明細書中に参考として援用される、
Ｊｏｓｅｐｈ ＩＢら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，９０（２１）
：１６４８−５３（１９９８）を参照のこと）。本発明のポリペプチドまたはポ
リヌクレオチドに対する抗体はまた、脈管形成の直接的または間接的な阻害を生
じ得る（本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｔｔｅ Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅ
ｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１７（２）：１５５−６１（１９９８）を
参照のこと）。
【０３７４】 本発明のポリペプチド（タンパク質融合物を含む）、またはそのフラグメント
は、アポトーシスの誘導を通じて増殖性細胞または組織を阻害する際に有用であ
り得る。上記のポリペプチドは、直接的または間接的のいずれかで、増殖性の細
胞および組織のアポトーシスを誘導するように、例えば、死ドメインレセプター
（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター１、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−
１）、ＴＮＦレセプター関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならび
にＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）レセプター１および２（
本明細書中に参考として援用されるＳｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋ，ら、
Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９（１９９８）を参照
のこと））の活性化において作用し得る。さらに、本発明の別の好ましい実施形
態において、上記のポリペプチドは、他の機構を通じて（例えば、アポトーシス
を活性化する他のタンパク質の活性化において）あるいは上記タンパク質の発現
を単独でまたは低分子薬物もしくはアジュバント（例えば、アポプトニン、ガレ
クチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質）と組み合わせてかのいずれかで
刺激することを通じて、アポトーシスを誘導し得る（例えば、本明細書中に参考
として援用される、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５（１
９９８），Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３（１９９
８），Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ．Ａｐｒ ２４；１１１−１１２
；２３−３４（１９９８））、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２
（１９９８），Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５
（１９９８）を参照のこと）。
【０３７５】 本発明のポリペプチド（それに対するタンパク質融合物を含む）、またはその
フラグメントは、増殖性細胞または組織の転移を阻害する際に有用である。阻害
は、本明細書中他の箇所に記載されるように、ポリペプチドまたは上記ポリペプ
チドに対する抗体を投与する工程の直接的結果として、または間接的に（例えば
、転移を阻害することが公知のタンパク質（例えば、α４インテグリン）の発現
を活性化する）生じ得る（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ｃｕｒ
ｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５
−４１を参照のこと）。本発明のこのような治療的影響は、単独で、または低分
子薬物もしくはアジュバントと組み合わせてかのいずれかで達成され得る。
【０３７６】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例え
ば、ポリペプチドまたは異種ポリペプチドに関連するポリペプチド抗体、異種核
酸、毒素、またはプロドラッグを含む組成物）を、本発明のポリペプチドを発現
する標的とされた細胞に送達する方法を提供する。本発明のポリペプチドまたは
ポリペプチド抗体は、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグ
と、疎水性、親水性、イオン性および／または共有結合的な相互作用を通じて会
合し得る。
【０３７７】 本発明のポリペプチド、それに対するタンパク質融合物、またはそのフラグメ
ントは、上記の抗原および免疫原に対して、直接的（例えば、本発明のポリペプ
チドが「ワクチン接種」された場合、増殖性抗原および免疫原に対して応答する
ように免疫応答を生じる）または間接的（例えば、免疫応答を増強することが公
知のタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現を活性化することにおいて）のい
ずれかで、増殖している細胞または組織の免疫原性および／または抗原性を増強
する際に有用である。
【０３７８】 （心臓血管障害） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストを使用して、四肢虚血のような末梢動脈疾患を含む、心臓血管障
害を処置し得る。
【０３７９】 心臓血管障害としては、動動脈瘻（ａｒｔｅｒｉｏ−ａｒｔｅｒｉａｌ ｆｉ
ｓｔｕｌａ）、動静脈瘻、大脳動静脈先天異常、先天性心欠陥（ｃｏｎｇｅｎｉ
ｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｅｆｅｃｔｓ）、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候
群のような心臓血管異常が挙げられる。先天性心欠陥としては、大動脈縮窄、三
房心、冠状脈管奇形（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｖｅｓｓｅｌ ａｎｏｍａｌｉｅｓ）
、交差心、右胸心、開存性動脈管（ｐａｔｅｎｔ ｄｕｃｔｕｓ ａｒｔｅｒｉ
ｏｓｕｓ）、エブスタイン奇形、アイゼンメンガー複合体、左心室発育不全症候
群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転位症、両大血管右室起始症、三尖弁閉鎖
症、動脈管遺残、および心中隔欠損症（ｈｅａｒｔ ｓｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃ
ｔｓ）（例えば、大動脈肺動脈中隔欠損症（ａｏｒｔｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｓ
ｅｐｔａｌ ｄｅｆｅｃｔ）、心内膜床欠損症、リュタンバッシェ症候群、ファ
ロー三徴症、心室心中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｈｅａｒｔ ｓｅｐ
ｔａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ））が挙げられる。
【０３８０】 心臓血管障害としてはまた、不整脈、カルチノイド心臓病、高心拍出量（ｈｉ
ｇｈ ｃａｒｄｉａｃ ｏｕｔｐｕｔ）、低心拍出量（ｌｏｗ ｃａｒｄｉａｃ
ｏｕｔｐｕｔ）、心タンポナーデ（ｃａｒｄｉａｃ ｔａｍｐｏｎａｄｅ）、
心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心
筋症、発作性呼吸困難、心臓水腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心
室肥大、梗塞後心破裂、心室中隔破裂、心臓弁疾患、心筋疾患、心筋虚血、心内
膜液浸出、心外膜炎（梗塞性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候
群、右心障害、リウマチ性心疾患、心室機能不全、充血、心臓血管妊娠合併症（
ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核（ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃｕｌａｒ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような心臓病が挙げられる。
【０３８１】 不整脈としては、洞性不整脈、心房性細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダ
ムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長ＱＴ症候群、副収縮、
ローン−ギャノング−レヴァイン症候群、マヘーム型早期興奮症候群、ウルフ−
パーキンソン−ホワイト症候群、洞不全症候群、頻拍、および心室性細動が挙げ
られる。頻拍としては発作性頻拍、上室性頻拍、心室固有調律促進、房室結節性
再入頻拍、異所心房性頻拍、異所接合部頻拍、洞房結節再入頻拍、洞性頻拍、ト
ルサード・ド・ポワント、および心室性頻拍が挙げられる。
【０３８２】 心臓弁疾患としては、大動脈弁機能不全症、大動脈弁狭窄症、心雑音（ｈｅａ
ｒ ｍｕｒｍｕｒｓ）、大動脈弁逸脱症、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症、僧帽弁
機能不全、僧帽弁狭窄症、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁機能不全、肺動脈弁狭窄症
、三尖閉鎖症、三尖弁機能不全、および三尖弁狭窄症が挙げられる。
【０３８３】 心筋疾患としては、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大型心筋症、弁
下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭搾症、拘束型心筋症、シャーガス心筋症
、心内膜線維弾性症、心内膜心筋線維症、キーンズ症候群、心筋再灌流障害、お
よび心筋炎が挙げられる。
【０３８４】 心筋性虚血としては、狭心症、冠動脈瘤、冠動脈硬化、冠動脈血栓症、冠動脈
血管痙攣、心筋梗塞、および心筋気絶（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｔｕｎｎｉｎ
ｇ）のような冠動脈疾患が挙げられる。
【０３８５】 心臓血管疾患としてはまた、動脈瘤、血管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫
症、ヒッペル−リンダラ疾患、クリペル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタ
ージ−ウェーバー症候群、血管運動神経性水腫、大動脈障害、高安動脈炎、大動
脈炎、ルリーシュ症候群、動脈閉塞障害、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒ
ｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管疾患、障害および／または状態、糖尿
病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞
障害、高血圧、低血圧、虚血、末梢血管障害、静脈炎、肺静脈閉塞障害、レーノ
ー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞、シミター症候群、上大静脈症候群、毛
細血管拡張症、毛細血管拡張性運動失調、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈
瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、脈管炎、および静脈機能不全のような血管疾
患が挙げられる。
【０３８６】 動脈瘤としては、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、感染した動脈瘤、破裂した動脈瘤
、大動脈性動脈瘤、大脳性動脈瘤、冠動脈瘤、心動脈瘤、および腸骨性動脈瘤が
挙げられる。
【０３８７】 動脈閉塞疾患としては、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄症、線維筋性形
成異常、腸間膜性血管閉塞、モヤモヤ病、腎動脈閉塞、網膜動脈閉塞、および閉
塞性血栓性血管炎が挙げられる。
【０３８８】 脳血管障害としては、頸動脈疾患、脳のアミロイド血管症、大脳動脈瘤、大脳
無酸素症、大脳動脈硬化、大脳動静脈先天異常、大脳動脈疾患、大脳の閉塞症お
よび血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、大脳出血、硬膜
上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血（ｓｕｂａｒａｘｈｎｏｉｄ ｈｅｍｏｒｒ
ｈａｇｅ）、大脳梗塞、大脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、室
周白軟化症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、
血管性頭痛、群発性頭痛、片頭痛、および椎骨基部（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉ
ｌａｒ）機能不全が挙げられる。
【０３８９】 塞栓症としては、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、爪先チア
ノーゼ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血
栓症としては、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞、頸動脈血栓症、
洞血栓症、ヴァレンベルク症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０３９０】 虚血としては、大脳虚血、虚血性大腸炎、区画症候群、前区画症候群、心筋虚
血、再灌流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。脈管炎としては、大動脈炎
、動脈炎、ベーチェット（Ｂｅｈｃｅｔ）症候群、チャーグ−ストラウス症候群
、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓性血管炎、過敏性血管炎、シェーンライ
ン紫斑病（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ−Ｈｅｎｏｃｈ ｐｕｒｐｕｒａ）、アレルギ
ー性皮膚血管炎およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０３９１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストは、危険な四肢虚血および冠状動脈疾患の処置に対して特に有効
である。
【０３９２】 ポリペプチドは、当該分野で公知である任意の方法を使用して投与され得、こ
れらの方法としては、送達部位における直接的針注射、静脈内注射、局所投与、
カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射、粒子加速器
、ゲルフォームスポンジデポー、他の市販デポー物質、浸透圧ポンプ、経口また
は坐剤の固形薬学的処方物、手術中のデカンティングまたは局所適用、エアロゾ
ル送達が挙げられるが、これらに限定されない。そのような方法は当該分野で公
知である。ポリペプチドは、下記により詳細に記載される、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ
ｉｃの一部として投与され得る。ポリヌクレオチド送達の方法は本明細書中にて
より詳細に記載される。
【０３９３】 （抗新脈管形成活性） 新脈管形成の内因性の、刺激因子とインヒビターとの間の天然に存在する平衡
は、阻害影響が優勢する平衡である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら、Ｃｅｌｌ ５６
：３４５〜３５５（１９８９）。新生血管形成が正常な生理学的条件下において
生じるまれな場合（例えば、創傷治癒、器官再生、胚発生、および雌性生殖プロ
セス）において、新脈管形成は、厳密に調節され、そして空間的および時間的に
定められる。病的な新脈管形成の条件（例えば、固形腫瘍増殖を特徴付ける）下
において、これらの調節の制御はできない。調節されていない新脈管形成は病的
になり、そして多くの新生物性疾患および非新生物性疾患の進行を維持する。多
くの重篤な疾患は、固形腫瘍の増殖および転移、関節炎、いくつかの型の眼の障
害および乾癬を含む、異常な新生血管形成により支配される。例えば、Ｍｏｓｅ
ｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：６３０〜６３４（１９９１）；Ｆｏｌｋｍａｎら、
Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３３：１７５７〜１７６３（１９９５）；Ａｕ
ｅｒｂａｃｈら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．２９：４０１〜４１１（１
９８５）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７５〜２０３頁（１９８５）；Ｐａｔｚ、Ａｍ．Ｊ
．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．９４：７１５〜７４３（１９８２）；およびＦｏｌｋｍ
ａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９〜７２５（１９８３）による概説を参
照のこと。多くの病的状態において、新脈管形成のプロセスは、その疾患状態に
寄与する。例えば、固形腫瘍の増殖が新脈管形成に依存することを示唆する有意
なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３５：４４２〜４４７（１９８７）。
【０３９４】 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに
本発明のアゴニストまたはアンタゴニストの投与による新生血管形成に関連する
疾患または障害の処置を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて処置し得る悪性状態およ
び転移性状態には、本明細書に記載の悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌、ならびに
当該分野で公知の他のもの（このような障害の総説については、Ｆｉｓｈｍａｎ
ら、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈ
ｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限
定されない。従って、本発明は、治療有効量の、本発明のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストをそれの必要な個体に投
与する工程を包含する、新脈管形成関連疾患および／または障害の処置の方法を
提供する。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／
またはアゴニストは、癌または腫瘍を治療的に予防するために、種々のさらなる
方法で利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび
／またはアゴニストで処置され得る癌としては、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌
、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌
、直腸癌、頸部癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌を含む固形
腫瘍；原発性腫瘍および転移；黒色腫；グリオブラストーマ；カポージ肉腫；平
滑筋肉腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌；進行性（ａｄｖａｎｃｅｄ）悪性疾患；
および血液から生じる腫瘍（例えば、白血病）が挙げられるが、これらに限定さ
れない。例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／ま
たはアゴニストは、皮膚癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍およびカポージ肉腫のような
癌を処置するために、局所送達され得る。
【０３９５】 なお他の局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、例えば膀胱内投与によって膀胱癌の表面形態を処置
するために利用され得る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストお
よび／またはアゴニストは、腫瘍に直接的に、または注射もしくはカテーテルを
介して腫瘍部位付近に送達され得る。当然のことながら、当業者が理解するよう
に、適切な投与様式は、処置されるべき癌によって変化する。他の送達様式は本
明細書中において議論される。
【０３９６】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニスト
は、癌に加えて、他の障害（新脈管形成を含む）を処置する際に有用であり得る
。これらの障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：良性腫
瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫
）；動脈硬化プラーク；眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟網膜
症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシ
ス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ）および眼の翼状片（Ｐｔｅｒ
ｙｇｉａ）（異常な血管増殖））；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延型創傷治癒；
子宮内膜症；脈管形成；顆粒化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮
症；トラコーマ；血管接着；心筋の新脈管形成；冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ
ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢新脈管形成
；オースラー−ウェーバー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ）症候群；プラーク新生
血管形成；毛細血管拡張症；血友病性関節；血管線維腫；線維筋性形成異常；創
傷顆粒化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症。
【０３９７】 例えば、本発明の１つの局面において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを過形成性瘢痕またはケロイド
に投与する工程を包含する、過形成性瘢痕およびケロイドを処置するための方法
が提供される。
【０３９８】 本発明の１つの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタ
ゴニストおよび／またはアゴニストは、過形成性瘢痕またはケロイドに、これら
の病変の進行を妨げるために直接注射される。この治療は、過形成性瘢痕および
ケロイド（例えば、やけど）の発生を生じることが知られている状態の予防処置
において特に価値があり、そして好ましくは、増殖期が進行する時間（最初の傷
害の約１４日後）を有した後であるが、過形成性瘢痕またはケロイドの発生の前
に開始される。上述のように、本発明はまた、眼の新生血管形成疾患（例えば、
角膜新生血管形成、血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜症、水晶体後線維増殖お
よび黄斑変性を含む）を処置するための方法を提供する。
【０３９９】 さらに、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド（アゴニストおよび／
またはアンタゴニストを含む）を用いて処置され得る新生血管形成に関連する眼
の障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血管新生緑内障
、糖尿病網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児網膜
症、黄斑変性、角膜移植新生血管形成、ならびに他の眼の炎症性疾患、眼の腫瘍
、および脈絡膜または虹彩の新生血管形成に関連する疾患。例えば、Ｗａｌｔｍ
ａｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌ．８５：７０４〜７１０（１９７８）および
Ｇａｒｔｎｅｒら、Ｓｕｒｖ．Ｏｐｈｔｈａｌ．２２：２９１〜３１２（１９７
８）による総説を参照のこと。
【０４００】 従って、本発明の１つの局面において、治療有効量の化合物（上記）を患者に
対して、血管の形成が阻害されるように角膜に投与する工程を包含する、角膜新
生血管形成（角膜移植新生血管形成を含む）のような眼の新生血管形成疾患を処
置するための方法が提供される。簡潔には、角膜は、通常には血管を欠く組織で
ある。しかし、特定の病的状態において、毛細血管は、縁の角膜周囲脈管叢から
角膜に伸長し得る。角膜が血管化されるようになる場合、角膜はまた混濁される
ようになり、患者の視力の衰えを生じる。角膜が完全に不透明になる（ｏｐａｃ
ｉｔａｔｅ）場合に、視力喪失が完全になり得る。広範な種々の障害は、例えば
、以下を含む角膜新生血管形成を生じ得る：角膜感染（例えば、トラコーマ、単
純ヘルペス角膜炎、リーシュマニア症およびオンコセルカ症）、免疫学的プロセ
ス（例えば、移植片拒絶およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリ
やけど、外傷、炎症（任意の原因による）、毒性および栄養欠乏状態、ならびに
コンタクトレンズを装着することの合併症として。
【０４０１】 特に好ましい実施形態において、本発明は、生理食塩水（眼に用いる調製物に
おいて一般に使用される任意の保存剤および抗菌剤と組合せて）中で局所投与の
ために調製され、そして点眼剤形態で投与され得る。溶液または懸濁液は、純粋
な形態で調製され、そして１日に数回投与され得る。あるいは、上記のように調
製される抗脈管形成組成物はまた、角膜に直接投与され得る。好ましい実施形態
において、抗脈管形成組成物は、角膜に結合する粘膜接着性ポリマーとともに調
製される。さらなる実施形態において、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物
は、従来のステロイド治療に対する補助剤として利用され得る。局所治療はまた
、脈管形成応答（例えば、化学的やけど）を誘導する高い可能性を有することが
公知の角膜病変において予防的に有用であり得る。これらの場合において、処置
（おそらくステロイドと組み合わされる）は、その後の合併症を予防するのを補
助するために直ちに開始され得る。
【０４０２】 他の実施形態において、上記の化合物は、角膜支質に直接、顕微鏡の案内の下
で眼科医によって注入され得る。好ましい注射部位は、個々の病巣の形態で変化
し得るが、投与の目標は、脈管構造の前進している面に組成物を置くこと（すな
わち、血管と正常な角膜との間に分散される）である。ほとんどの場合において
、これは、前進している血管から角膜を「防御」するための縁周囲（ｐｅｒｉｌ
ｉｍｂｉｃ）角膜注射を含む。この方法はまた、角膜新生血管形成を予防的に防
ぐために、角膜傷害の直後に利用され得る。この状況において、この物質は、角
膜病巣とその所望されない潜在的な血液供給の縁との間に分散して縁周囲角膜に
注射され得る。このような方法はまた、類似の様式で、移植された角膜の毛細血
管浸潤を予防するために利用され得る。徐放形態において、注入は、１年に２〜
３回のみ必要とされ得る。ステロイドもまた、注入溶液に添加され、その注射自
体から生じる炎症を低減し得る。
【０４０３】 本発明の別の局面において、患者に、血管の形成を阻害するように、治療有効
量のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トを眼に投与する工程を包含する、血管新生緑内障を処置するための方法が提供
される。１つの実施形態において、化合物は、血管新生緑内障の早期形態を処置
するために、眼に局所投与され得る。他の実施形態において、化合物は、前方角
（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｈａｍｂｅｒ ａｎｇｌｅ）の領域に注入によって移植
され得る。他の実施形態において、化合物はまた、化合物が眼房水に連続的に放
出されるように、任意の位置に置かれ得る。本発明の別の局面において、患者に
、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼に投与する工程を包含する、
増殖性糖尿病性網膜症を処置するための方法が提供される。
【０４０４】 本発明の特に好ましい実施形態において、増殖性糖尿病性網膜症は、網膜にお
けるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニス
トの局所濃度を増加させるために、眼房水または硝子体への注入によって処置さ
れ得る。好ましくは、この処置は、光凝固を必要とする重篤な疾患の獲得の前に
開始されるべきである。
【０４０５】 本発明の別の局面において、血管の形成が阻害されるように、治療有効量のポ
リヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストを眼
に投与する工程を包含する、水晶体後線維増殖症を処置するための方法が、患者
に提供される。化合物は、硝子体内注射を介して、および／または眼内移植を介
して局所投与され得る。
【０４０６】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害としては、以下が挙げられるが、それらに限定され
ない：血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム性プラーク、遅延型創傷
治癒、顆粒化、血友病性関節、過形成性瘢痕、偽関節骨折、オースラー−ウェー
バー（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ）症候群、化膿性肉芽腫、強皮症、トラコーマ、
および血管接着。
【０４０７】 さらに、このポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはア
ゴニストで処置され得る障害および／または状態としては、以下が挙げられるが
、それらに限定されない：固形腫瘍、血液由来の（ｂｌｏｏｄ ｂｏｒｎ）腫瘍
（例えば、白血病）、腫瘍転移、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫、聴
神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、
乾癬、眼の脈管形成疾患（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、
角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細
胞腫、およびブドウ膜炎（ｕｖｉｅｔｉｓ））、遅延型創傷治癒、子宮内膜症、
脈管形成、顆粒化、過形成性瘢痕（ケロイド）、偽関節骨折、強皮症、トラコー
マ、血管接着、心筋の新脈管形成、冠状側副枝（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａ
ｔｅｒａｌｓ）、大脳側副枝、動静脈奇形、虚血性四肢新脈管形成、オースラー
−ウェーバー症候群、プラーク新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節、
血管線維腫、線維筋性形成異常、創傷顆粒化、クローン病、アテローム性動脈硬
化症、産児制限薬剤（月経を制御する、胎芽着床のために必要な血管新生を予防
することによる）、病原性の結果（例えば、ネコ引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ
ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ）、潰瘍（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙ
ｌｏｒｉ）、バルトネラ症および細菌性血管腫症状）のような新脈管形成を有す
る疾患。
【０４０８】 出産制限方法の１つの局面において、胎芽着床をブロックするに十分な化合物
の量は、性交および受精が起こる前またはその後に投与され、従って産児制限の
有効な方法、おそらく「事後用（ｍｏｒｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ）」方法を提供す
る。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは
また、月経を制御することにおいて使用され得るか、または子宮内膜症の処置に
おける腹膜洗浄液として、もしくは腹膜移植のためのいずれかで投与され得る。
【０４０９】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストは、縫合（ｓｔｉｔｃｈ）肉芽腫を予防するために、外科縫合に組み込まれ
得る。
【０４１０】 ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニストは、
広範な種々の外科手順において利用され得る。例えば、本発明の１つの局面にお
いて、組成物（例えば、スプレーまたはフィルムの形態において）は、悪性組織
から正常な周囲の組織を分離するため、そして／または周囲の組織への疾患の広
がりを予防するために、腫瘍の除去の前に、領域をコートまたはスプレーするた
めに利用され得る。本発明の他の局面において、組成物（例えば、スプレーの形
態において）は、腫瘍をコートするため、または所望の場所において新脈管形成
を阻害するために、内視鏡手順を介して送達され得る。本発明のなお他の局面に
おいて、本発明の抗脈管形成組成物でコートされている外科メッシュレーデン（
ｌａｄｅｎ）が、外科メッシュが利用され得る任意の手順において利用され得る
。例えば、本発明の１つの実施形態において、抗脈管形成組成物を有した外科メ
ッシュは、構造に対する支持を提供するため、そして一定の量の抗脈管形成因子
を放出するために、腹部癌切除手術の間（例えば、結腸切除の後）に利用され得
る。
【０４１１】 本発明のさらなる局面において、癌の局所的再発およびその部位での新しい血
管の形成が阻害されるように、切除後にポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴ
ニストおよび／またはアゴニストを腫瘍の切除縁に投与する工程を包含する、腫
瘍切除部位を処置するための方法が提供される。本発明の１つの実施形態におい
て、抗脈管形成化合物は、腫瘍切除部位に直接投与される（例えば、塗布、ブラ
ッシング（ｂｒｕｓｈｉｎｇ）、または他の方法で抗脈管形成化合物で腫瘍の切
除縁をコートすることによって適用される）。あるいは、抗脈管形成化合物は、
投与前に公知の外科ペーストに組み込まれ得る。本発明の特に好ましい実施形態
において、抗脈管形成化合物は、悪性疾患についての肝切除後および神経外科手
術後に適用される。
【０４１２】 本発明の１つの局面において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニスト
および／またはアゴニストは、広範な種々の腫瘍（例えば、乳房腫瘍、結腸腫瘍
、脳腫瘍および肝腫瘍を含む）の切除縁に投与され得る。例えば、本発明の１つ
の実施形態において、抗脈管形成化合物は、切除後に、神経学的腫瘍の部位に、
その部位での新しい血管の形成が阻害されるように投与され得る。
【０４１３】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアゴニ
ストはまた、他の抗脈管形成因子とともに投与され得る。他の抗脈管形成因子の
代表的な例としては以下が挙げられる：抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその
誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビ
ター、メタロプロテイナーゼ−２の組織インヒビター、プラスミノーゲン活性化
インヒビター−１、プラスミノーゲン活性化インヒビター−２および種々の形態
のより軽い「ｄ群」遷移金属。
【０４１４】 より軽い「ｄ群」遷移金属には、例えばバナジウム、モリブデン、タングステ
ン、チタン、ニオブおよびタンタル種が挙げられる。そのような遷移金属種は、
遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の適切な錯体としては、オキソ遷
移金属錯体が挙げられる。
【０４１５】 バナジウム錯体の代表的な例としては、バナデート錯体およびバナジル錯体の
ようなオキソバナジウム錯体が挙げられる。適切なバナデート錯体としては、例
えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウムおよびオルトバナ
ジン酸ナトリウムのようなメタバナデート錯体およびオルトバナデート錯体が挙
げられる。適切なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネート
および硫酸バナジル（硫酸バナジル一水和物および硫酸バナジル三水和物のよう
な硫酸バナジル水和物を含む）が挙げられる。
【０４１６】 タングステン錯体およびモリブデン錯体の代表的な例としてはまた、オキソ錯
体が挙げられる。適切なオキソタングステン錯体としては、タングステート錯体
およびタングステンオキシド錯体が挙げられる。適切なタングステート錯体とし
ては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン
酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。適切なタングステン
オキシドとしては、タングステン（ＩＶ）オキシドおよびタングステン（ＶＩ）
オキシドが挙げられる。適切なオキソモリブデン錯体としては、モリブデート、
モリブデンオキシドおよびモリブデニル錯体が挙げられる。適切なモリブデート
錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナト
リウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙
げられる。適切なモリブデンオキシドとしては、モリブデン（ＶＩ）オキシド、
モリブデン（ＶＩ）オキシドおよびモリブデン酸が挙げられる。適切なモリブデ
ニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。他
の適切なタングステン錯体およびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール
、酒石酸および糖由来のヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０４１７】 広範な種々の他の抗脈管形成因子もまた、本発明の状況において利用され得る
。代表的な例としては、血小板第４因子；硫酸プロタミン；硫酸化（ｓｕｌｐｈ
ａｔｅｄ）キチン誘導体（ズワイガニ（ｑｕｅｅｎ ｃｒａｂ）の甲羅から調製
される）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２〜２６、１９９
１）；硫酸化ポリサッカライドペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（この化
合物の機能は、エストロゲンのようなステロイドおよびクエン酸タモキシフェン
の存在によって増強され得る）；スタウロスポリン；マトリクス代謝のモジュレ
ーター（例えば、プロリンアナログ、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４
−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル、アミノプロピオニト
リルフマレートが挙げられる）；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（
３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトザントロン；ヘパリン；インタ
ーフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、
Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７３２１−１７３２６，１９９２）；キモス
タチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２８６：４７５−４８０
，１９９２）；シクロデキストリンテトラデカスルフェート；エポネマイシン（
Ｅｐｏｎｅｍｙｃｉｎ）；カンプトテシン（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）；フマ
ギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５−５５７，１９９０）
；チオリンゴ酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ
，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１４４０−１４４６，１９８７）；抗コ
ラーゲナーゼ−血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６２（４）：１６５９−１６６４，１９８７）；ビサントレン（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリット二ナトリ
ウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸（ｃｈｌｏ
ｒｏａｎｔｈｒｏｎｉｌｉｃ ａｃｉｄ）二ナトリウムまたは「ＣＣＡ」；Ｔａ
ｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２−３１６，１９
９２）；サリドマイド；アンゴスタティックステロイド（Ａｎｇｏｓｔａｔｉｃ
ｓｔｅｒｏｉｄ）；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシンアミノルミダゾール（ｃ
ａｒｂｏｘｙｎａｍｉｎｏｌｍｉｄａｚｏｌｅ）；およびメタロプロテイナーゼ
インヒビター（例えば、ＢＢ９４）。
【０４１８】 （細胞レベルでの疾患） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアンタゴニストも
しくはアゴニストによって処置または検出され得る細胞生存の増大あるいはアポ
トーシスの阻害に関連する疾患には、癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異
を有する癌腫、およびホルモン依存性腫瘍、これらは以下：結腸癌、心臓腫瘍、
膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸の癌、精巣癌、胃癌
、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、
骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、前立腺癌、カポージ肉腫および卵巣癌を含むが
、これらに限定されない）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、シェーグレ
ン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ
ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデスおよび免
疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）およびウイルス感染（例えば、ヘ
ルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移
植片病、急性移植片拒絶、ならびに慢性移植片拒絶、が挙げられる。好ましい実
施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはア
ンタゴニストは、特に上記に列挙される、癌の増殖、進行、および／または転移
（ｍｅｔａｓｉｓ）を阻害するために使用される。
【０４１９】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくは
アンタゴニストによって処置あるいは検出され得る細胞生存の増大に関連するさ
らなる疾患または状態には、悪性疾患の進行および／または転移ならびに以下の
ような関連する障害が挙げられるが、これらに限定されない：白血病（急性白血
病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性
、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）を含む）ならびに慢性白血病（例
えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤
血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄
腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、ならびに固形腫瘍（
肉腫および癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉
腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リ
ンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、
横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細
胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌腫、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、
ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経
膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、松果体腫
、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）
、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）を含むが、これらに限定されな
い）。
【０４２０】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストによって処置あるいは検出され得るアポトーシスの増大に関連
する疾患には、以下が挙げられる：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハ
イマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性およ
び脳腫瘍または以前に関連した疾患）；自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、
シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病（Ｂｅｈｃ
ｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、クローン病、多発性筋炎、全身性エリテマトーデ
スおよび免疫関連糸球体腎炎ならびに慢性関節リウマチ）、脊髄形成異常症候群
（例えば、再生不良性貧血）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、発作
および再灌流傷害によって生じるようなもの）、肝臓傷害（例えば、肝炎関連肝
臓傷害、虚血／再灌流傷害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｓｔｏｓｉｓ）（胆管傷害
）および肝臓癌）；毒物誘導性肝臓疾患（アルコールによって引き起こされるよ
うなもの）、敗血症性ショック、悪液質ならびに食欲不振。
【０４２１】 （創傷治癒および上皮細胞増殖） 本発明のなおさらなる局面に従って、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストを、治療目的のため、例
えば、創傷治癒の目的のために上皮細胞増殖および基底ケラチノサイトを刺激す
るため、ならびに毛包産生および皮膚創傷の治癒を刺激するために、利用するた
めのプロセスが提供される。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、な
らびにアゴニストまたはアンタゴニストは、以下を含む創傷治癒を刺激すること
において臨床的に有用であり得る：外科的創傷、切除の創傷、深い創傷（真皮お
よび表皮の損傷を含む）、眼組織の創傷、歯の組織の創傷、口腔の創傷、糖尿病
性潰瘍、皮膚の潰瘍、肘の潰瘍、動脈性の潰瘍、静脈うっ滞潰瘍、熱への曝露ま
たは化学物質による熱傷、および他の異常な創傷治癒状態（例えば、尿毒症、栄
養失調、ビタミン欠乏、ならびにステロイド、放射能療法および抗腫瘍性薬物お
よび代謝拮抗物質を用いる全身性処置に関連する合併症。本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、皮
膚の欠失後の皮膚の回復を促進するために使用され得る。
【０４２２】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、創傷床（ｗｏｕｎｄ ｂｅｄ）への皮膚移植片の付着を増
大するため、および創傷床からの再上皮形成を刺激するために使用され得る。以
下は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、アゴニストまたはアンタ
ゴニストが創傷床への付着を増大するために使用され得る、移植片の型である：
自家移植片、人工皮膚、同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）、自己植皮片、自己
表皮移植片（ａｕｔｏｅｐｄｅｒｍｉｃ ｇｒａｆｔ）、無血管性（ａｖａｃｕ
ｌａｒ）移植片、ブレア−ブラウン移植片、骨移植片、胚胎組織移植片、真皮移
植片、遅延移植片、皮膚移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層皮膚移植片、異
種移植片（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、異種移植片（ｘｅｎｏｇ
ｒａｆｔ）、同種移植片（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒａｆｔ）、増殖性移植片
、層板状の移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリエ−ティールシュ移植片、大
網移植片（ｏｍｅｎｐａｌ ｇｒａｆｔ）、パッチの移植片、茎状移植片、全層
移植片（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｇｒａｆｔ）、分層植皮片、分層皮膚移植片
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、皮膚の強度を助長するため、および高齢の皮膚の外見を改
善するために使用され得る。
【０４２３】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、肝細胞増殖、および肺、乳房、膵臓、胃、小腸（ｓｍ
ａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎｇ）、および大腸における上皮細胞増殖における変化
を生じると考えられる。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、なら
びにアゴニストもしくはアンタゴニストは、上皮細胞（例えば、皮脂細胞（ｓｅ
ｂｏｃｙｔｅ）、毛包、肝実質細胞、肺胞上皮細胞ＩＩ型（ｔｙｐｅ ＩＩ ｐ
ｎｅｕｍｏｃｙｔｅ）、ムチン産生杯細胞、および他の上皮細胞、ならびに皮膚
、肺、肝臓、および胃腸管内に含まれるそれらの先祖）の増殖を促進し得る。本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストもしくはアンタゴニ
ストは、内皮細胞、ケラチノサイト、および基底ケラチノサイトの増殖を促進し
得る。
【０４２４】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはア
ンタゴニストはまた、照射、化学療法処置またはウイルス感染から生じる腸の毒
性の副作用を低減するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、小腸粘膜上で細胞保
護的な効果を有し得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならび
にアゴニストまたはアンタゴニストはまた、化学療法およびウイルス感染から生
じる粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）（口粘膜）の治癒を刺激し得る。
【０４２５】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはア
ンタゴニストは、熱傷を含む、完全なおよび部分的な厚さの皮膚欠損における皮
膚の十分な再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再増殖）、乾癬のよう
な他の皮膚欠損の処置においてさらに使用され得る。本発明のポリヌクレオチド
またはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、表皮水疱症
、これらの損傷の再上皮形成を促進することによる頻繁な開放性かつ疼痛性の水
疱を生じる内在的な真皮への表皮の接着における欠損を処置するために使用され
得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまた
はアンタゴニストはまた、胃潰瘍および十二指腸潰瘍を処置し、そして粘膜の内
層の瘢痕形成ならびにより迅速な腺の粘膜および十二指腸の粘膜の内層の再生に
よる治癒を助けるために使用され得る。炎症性腸疾患（例えば、クーロン病およ
び潰瘍性大腸結腸炎）は、それぞれ、小腸または大腸の粘膜表面の崩壊を生じる
疾患である。従って、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに
アゴニストまたはアンタゴニストは、粘膜表面の再表面化（ｒｅｓｕｌｆａｃｉ
ｎｇ）を促進して、より迅速な治癒を助けるため、および炎症性腸疾患の進行を
予防するために、使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを用いる処置は、胃腸管全体の粘膜
の産生に対して有意な効果を有することが予測され、そして腸粘膜を、摂取され
たかまたは外科手術後の有害な物質から保護するために使用され得る。本発明の
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニス
トは、本発明のポリヌクレオチドの発現下に関連する疾患を処置するために使用
され得る。
【０４２６】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニスト
またはアンタゴニストは、種々の病的状態に起因する肺への損傷を予防および治
癒するために使用され得る。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、な
らびにアゴニストまたはアンタゴニストは、急性または慢性の肺損傷を予防また
は処置するために、増殖および分化を刺激し得、そして肺胞および気管支（ｂｒ
ｏｃｈｉｏｌａｒ）上皮の修復を促進し得る。例えば、気管支上皮および肺胞（
ａｖｅｏｌｉ）の壊死を生じる、気腫（これは、肺胞の進行性の損失を生じる）
および吸入損傷（すなわち、煙の吸入および熱傷から生じる）は、本発明のポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを
使用して効果的に処置され得る。また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、肺胞上皮細胞ＩＩ型の増
殖および分化を刺激するために使用され得、これは、未熟な乳児における硝子膜
疾患（例えば、乳児呼吸窮迫症候群および気管支肺異形成症）のような疾患を処
置または予防することを助け得る。
【０４２７】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはア
ンタゴニストは、肝実質細胞の増殖および分化を刺激し得、そして従って、肝臓
疾患および病状（例えば、肝硬変により生じる劇症肝不全、肝炎ウイルスおよび
毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素（ｃａｒｂｏｎ ｔｅｔ
ｒａｈｏｌｏｒｉｄｅ）、および他の当該分野で公知の肝臓毒素）により生じる
肝臓損傷）を緩和または処置するために使用され得る。
【０４２８】 さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニスト
またはアンタゴニストは、真性糖尿病の発症を処置または予防するために使用さ
れ得る。新たにＩ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病と診断された患者において、いく
つかの島細胞機能が残っている場合、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプ
チド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストは、その疾患の持続性の発現を
緩和、遅延または予防するように、その島機能を維持するために使用され得る。
また、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまた
はアンタゴニストは、島細胞機能を改善または促進するための島細胞移植におけ
る補助として使用され得る。
【０４２９】 （神経学的疾患） 本発明のなおさらなる局面に従って、治療目的のため、例えば、神経学的細胞
増殖および／または分化を刺激するために、本発明のポリヌクレオチドまたはポ
リペプチド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストを利用するためのプロセ
スが提供される。従って、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニス
トおよび／またはアンタゴニストは、神経学的疾患を処置および／または検出す
るために使用され得る。さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、あるいはアゴニストまたはアンタゴニストは、特定の神経系疾患または障害の
マーカーまたはディテクターとして使用され得る。
【０４３０】 本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、アゴニストおよび／またはアンタ
ゴニストを用いて処置または検出され得る神経学的疾患の例としては、以下が挙
げられる：脳疾患（例えば、母系フェニルケトン尿症のようなフェニルケトン尿
症を含む代謝性脳疾患）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠乏症、ピルビン酸デヒ
ドロゲナーゼ複合体欠乏症、ヴェルニッケ脳障害、脳水腫、テント下（ｉｎｆｒ
ａｔｅｎｔｏｒｉａｌ）新生物を含む小脳性新生物のような脳新生物、脈絡叢新
生物のような脳室新生物、視床下部性新生物、テント上新生物、キャナヴァン病
、毛細血管拡張性運動失調のような脊髄小脳性退化を含む小脳性運動失調のよう
な小脳疾患、小脳性共同運動障害、フリードライヒ失調症、マチャド−ジョセフ
病、オリーブ橋小脳萎縮、テント下新生物のような小脳性新生物、びまん性軸周
囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、異染性白質萎縮症および亜急性硬化性汎脳炎の
ようなびまん性脳硬化、脳血管障害（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄および
モヤモヤ病を含む頸動脈疾患）、脳のアミロイドアンギオパチー、大脳動脈瘤、
大脳動脈硬化症、大脳動静脈奇形、大脳動脈疾患、頸動脈血栓症、洞血栓症およ
びヴァレンベルク症候群のような脳塞栓症および血栓症、硬膜上血腫、硬膜下血
腫およびクモ膜下出血のような脳出血、脳亀裂骨折、一過性脳虚血、鎖骨下動脈
盗血症候群および椎骨脳底不全（ｖｅｒｔｅｂｒｏｂａｓｉｌａｒ ｉｎｓｕｆ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ）のような脳虚血、多発脳梗塞性痴呆のような血管性痴呆、室
周白斑症（ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ）、群
発性頭痛のような血管性頭痛、偏頭痛、エイズ痴呆複合症のような痴呆症、アル
ツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ病のような初老期痴呆、アルツ
ハイマー病および進行性核上性麻痺のような老年痴呆、多発脳梗塞性痴呆のよう
な血管性痴呆、びまん性軸周囲性脳炎のような脳炎、流行性脳炎、日本脳炎、セ
ントルイス脳炎、マダニ媒介性脳炎および西ナイル熱のようなウイルス性脳炎、
急性播種性脳脊髄炎、ブドウ膜髄膜炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜球
性硬化性汎脳炎のような髄膜脳脊髄炎、室周白斑症のような脳軟化症、点頭痙攣
を含む全身てんかんのようなてんかん、アプサンスてんかん（ａｂｓｅｎｃｅ
ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、ＭＥＲＲＦ症候群を含むミオクローヌスてんかん、強直・
間代てんかん、複雑部分てんかん、前頭葉てんかんおよび側頭葉てんかんのよう
な部分てんかん、外傷後てんかん、持続性部分てんかんのようなてんかん重積持
続状態、ハレルフォルデン−シュパッツ症候群、ダンディ−ウォーカー症候群お
よび正常圧水頭症のような水頭症、視床下部性新生物のような視床下部性疾患、
大脳マラリア、脱力発作を含むナルコレプシー、延髄ポリオ（ｂｕｌｂａｒ ｐ
ｏｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、大脳偽腫瘍、レット症候群、ライ症候群、視床疾患
、大脳トキソプラスマ症、頭蓋内結核腫およびツェルヴェーガー症候群、エイズ
痴呆複合症のような中枢神経系感染、脳膿瘍、硬膜下蓄膿症、ウマの脳脊髄炎の
ような脳脊髄炎、ベネズエラウマ脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、ビスナ、大
脳マラリア、クモ膜炎のような髄膜炎、リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性
髄膜炎のような無菌性髄膜炎、ヘモフィルス髄膜炎を含む細菌性髄膜炎、リステ
リア髄膜炎、ウォーターハウス−フリーデリックセン症候群のような髄膜炎菌性
脳脊髄膜炎、肺炎球菌髄膜炎および髄膜結核症、クリプトコックス髄膜炎のよう
な真菌性髄膜炎、硬膜下滲出、ブドウ膜髄膜脳炎症候群のような髄膜脳炎、横行
脊髄炎（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ）のような脊髄炎、脊髄ろう
のような神経梅毒、延髄ポリオおよびポリオ後症候群を含むポリオ、プリオン病
（例えば、クロイツフェルト−ヤーコプ病、ウシの海綿状脳症、ゲルストコン−
シュトロイスラー症候群、クールー、スクラピー）大脳トキソプラスマ症、テン
ト下新生物のような小脳性新生物を含む脳新生物のような中枢神経系新生物、脈
絡叢新生物、視床下部性新生物およびテント上新生物のような脳室新生物、髄膜
新生物、硬膜外新生物を含む脊髄新生物、キャナヴァン病のような脱髄疾患、副
腎脳白質ジストロフィーを含むびまん性大脳硬化症（ｄｉｆｆｕｓｅ ｃｅｒｅ
ｂｒａｌ ｓｃｅｌｏｒｉｓ）、びまん性軸周囲性脳炎、球様細胞白質萎縮症、
異染性白質萎縮症のようびまん性大脳硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出
血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中央ミエリン溶解
、横行脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前弯症、慢性疲労症候群、ビス
ナ、高圧神経質症候群（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｎ
ｄｒｏｍｅ）、髄膜症、先天性筋無緊張症のような脊髄疾患、筋萎縮性側索硬化
症、ヴェルドニッヒ−ホフマン病のような棘筋萎縮、脊髄圧搾、硬膜外新生物の
ような脊髄新生物、脊髄空洞症、脊髄ろう、スティッフマン症候群、母親由来１
５ ｑ‐１３微少欠損のような精神遅滞、ネコ鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、
ダウン症候群、ガングリオシドーシスＧ（Ｍ１）のようなガングリオシドーシス
、ザントホフ病、テイ−サックス病、ハートナップ病、ホモシスチン尿症、ロー
レンス−ムーン−ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、カエデシロップ
病、フコース蓄積症のようなムコリピドーシス、ニューロンセロイド脂褐素沈着
症、眼脳腎症候群、母系フェニルケトン尿のようなフェニルケトン尿症、プラー
ダー−ヴィリ症候群、レット症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、結節硬
化症、ＷＡＧＲ症候群、全前脳症のような神経系異常、水無能症（ｈｙｄｒａｎ
ｇｅｎｃｅｐｈａｌｙ）を含む無能症のような神経管不全、アルノルト−キアー
リ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊
椎のような脊髄癒合不全、シャルコー−マリー疾患を含む遺伝性の運動および感
覚ニューロン障害、視覚萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ヴェルドニッ
ヒ−ホフマン病、先天性痛覚脱失症および家族性自律神経障害のような遺伝性感
覚および自律性ニューロパシー、神経学的症状発現（例えば、ゲルストマン症候
群を含む失認）、逆向性健忘症のような健忘症、失行症、神経因性膀胱、脱力発
作、難聴、部分聴覚欠失および大声（ｌｕｄｎｅｓｓ）レクルートメントおよび
耳鳴を含む聴覚障害のような情報伝達障害、失書症、ブロカ失語症およびヴェル
ニッケ失語症を含む失語症のような言語障害、急性失読症のような失読症、言語
発達障害、名称失語症、ブロカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症の
ような発語障害、蓄積障害、構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む発
語障害のような情報伝達障害、失声症および嗄声のような発声障害、除脳硬直状
態、せん妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、母親由来１５ ｑ‐１３微少欠損、
運動失調、アテトーシス、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、ミオク
ローヌス、チック、斜頸および振せんのような運動障害、スティッフマン症候群
のような筋肉硬直のような筋肉緊張亢進、筋肉痙性、耳帯状疱疹を含む顔面神経
麻痺のような神経麻痺、胃不全麻痺、片麻痺、複視のような眼筋麻痺、デュエー
ン症候群、ホルナー症候群、キーンズ症候群のような慢性進行性外眼筋麻痺症、
球麻痺、熱帯性痙攣不全対麻痺、ブラウン−セカール症候群、四肢麻痺、呼吸麻
痺および声帯麻痺のような対麻痺、不全麻痺、幻肢、無味覚症および味覚不全の
ような味覚障害、弱視、失明、色覚異常、複視、半盲、視野暗点および準正常視
覚（ｓｕｂｎｏｒｍａｌ ｖｉｓｉｏｎ）のような視覚障害、クライネ−レヴィ
ン症候群、不眠症および夢遊症を含む過眠症のような睡眠障害、開口障害のよう
な痙縮、昏睡、持続性植物状態および失神およびめまいのような意識消失、先天
性筋無緊張症のような神経筋疾患、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン
筋無力症症候群、運動神経疾患、棘筋萎縮、シャルコー−マリー疾患およびヴェ
ルドニッヒ−ホフマン病のような筋萎縮、後ポリオ症候群、筋ジストロフィー、
重症筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリンミオパシー、家族性
期性四肢麻痺、多発性パラミロクローヌス（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐａｒａｍｙ
ｌｏｃｌｏｎｕｓ）、熱帯性痙攣不全対麻痺およびスティッフマン症候群、先端
肢端疼痛症のような末梢神経系疾患、腎アミロイドーシス、アーディー症候群、
Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射性
交感神経性ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群のような自律神経系
疾患、神経線維腫症２を含む聴神経腫のような内耳神経疾患のような脳神経疾患
、顔面神経痛のような顔面神経疾患、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱
視を含む眼球運動性障害、眼振、眼球運動麻痺、デュエーン症候群のような眼筋
麻痺、ホルナー症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺症、内斜視
および外斜視のような斜視、動眼神経麻痺、遺伝性眼萎縮症を含む眼萎縮症のよ
うな眼神経疾患、視神経円板結晶腔、視神経脊髄炎のような視神経炎、乳頭水腫
、三叉神経痛、声帯麻痺、視神経脊髄炎および脊柱前弯症のような脱髄疾患、糖
尿病性足のような糖尿病性ニューロパシー、手根管症候群のような神経圧搾症候
群、足根管症候群、頸肋症候群のような胸郭出口症候群、尺骨神経圧搾症候群、
カウザルギー、頸腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛のような神経痛、実験
的アレルギー性神経炎、眼神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎および神
経根炎（例えば、多発性神経根炎、遺伝性運動および感覚ニューロパシー（例え
ば、シャルコー−マリエ疾患、遺伝性眼萎縮症、レフサム病、遺伝性痙性対麻痺
およびヴェルドニッヒ‐ホフマン病、遺伝性感覚および自律神経ニューロパシー
（先天性痛覚脱失および．家族性自律神経障害を含む）、ＰＯＥＭＳ症候群、坐
骨神経痛、味覚性発汗症候群およびテタニー））のような神経炎。
【０４３１】 （感染性疾患） 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびにアゴニストまたはア
ンタゴニストは、感染因子を処置または検出するために用いられ得る。例えば、
免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞および／またはＴ細胞の増殖お
よび分化を増加させることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、
既存の免疫応答を上昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれ
かにより上昇され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ド、ならびにアゴニストまたはアンタゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発
することなく、感染因子を直接阻害し得る。
【０４３２】 ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに／ある
いはアゴニストまたはアンタゴニストにより処置または検出され得る疾患または
症状を引き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤ
ＮＡおよびＲＮＡのウイルスおよびウイルス科が挙げられるがこれらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、カルシウイルス科、サルコウイルス
科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩ
Ｖ、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例
えば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、ヘルペス帯状疱疹）、モノネガウ
イルス（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹
ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエ
ンザＡ、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス
、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイル
ス科（例えば、痘瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイル
ス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、
およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイル
スは、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得
る：関節炎、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウ
ムウイルス、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、
肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチ
ン出血熱、チングニア、リフトバレー熱、黄熱病、髄膜炎、日和見感染症（例え
ば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下
腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、
皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、およびウイルス血症。本発明のポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用い
て、任意のこれらの症状または疾患が処置または検出され得る。特定の実施形態
において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしく
はアンタゴニストは、以下の処置に使用される：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、お
よび／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さらなる具体的な実施形態において、
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴ
ニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者を処置するために
使用される。さらに具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポ
リペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストは、ＡＩＤＳを処置する
ために使用される。
【０４３３】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつ本発明のポリヌクレオチドまた
はポリペプチド、ならびに／またはアゴニストまたはアンタゴニストによって処
置または検出され得る細菌性因子あるいは真菌性因子は、以下のグラム陰性およ
びグラム陽性細菌および細菌科ならびに真菌を含むがこれらに限定されない：Ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａ
ｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅ
ｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌ
ｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃ
ｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔ
ｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、およびＳａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙ
ｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓ
ｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈ
ｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔ
ｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの感染症（例えば
、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）。これらの細菌または真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾
患または症状を引き起こし得る：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、
ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、
爪周囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳ま
たは蓄膿症）、敗血症、ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中
毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミ
ジア、梅毒、ジフテリア、ライ病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊
疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎
、皮膚真菌症（ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷
感染症。本発明のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、アゴニストもしくは
アンタゴニストを用いて、任意のこれらの症状もしくは疾患を処置または検出し
得る。具体的な実施形態において、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、
アゴニストまたはアンタゴニストは、以下を処置するために使用される：破傷風
、ジフテリア、ボツリヅム、および／またはＢ型髄膜炎。
【０４３４】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、および／またはア
ゴニストもしくはアンタゴニストにより処置または検出され得る、寄生生物性因
子が引き起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げら
れるがこれらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリ
プトスポリジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交
疫、外部寄生生物性、ジアルジア鞭毛虫症、蠕虫症、リーシュマニア症、タイレ
リア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス（Ｔｒｉｃ
ｈｏｍｏｎａｓ）症、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏａｎ）（例えば、Ｐｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｉｕ
ｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏ
ｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに限定されない種々の疾
患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼性感染症、腸疾患（例
えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば
、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラスマ症。本発明の
ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニ
ストを用いて、任意のこれらの症状または疾患を処置または検出し得る。
【０４３５】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、または患者か
ら細胞を取り出して、本発明のポリヌクレオチドをこの細胞に供給し、そして操
作した細胞を患者に戻す（エキソビボ治療）かのいずれかによるものであり得る
。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドはワクチン中の抗原と
して用いられて、感染性疾患に対する免疫応答を惹起し得る。
【０４３６】 （再生） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストを用いて、細胞を分化させ、増殖させ、そして誘引して、組織
の再生を導き得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７（１９９７）を参照の
こと）。組織の再生を用いて、先天性欠損、外傷（創傷、熱傷、切開、または潰
瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎（ｏｓｔｅｏｃａｒｔｈｒ
ｉｔｉｓ）、歯周病、肝不全）、美容形成手術を含む手術、線維症、再灌流傷害
、もしくは全身性サイトカイン損傷により損傷を受けた組織を修復、置換、また
は保護し得る。
【０４３７】 本発明を用いて再生し得る組織としては、以下が挙げられる：器官（例えば、
膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、
血管系（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血、および骨格（骨、軟骨、腱
、および靭帯）の組織。好ましくは、再生は、瘢痕なく、または瘢痕が低減され
て生じる。再生はまた、新脈管形成を含み得る。
【０４３８】 さらに、本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニス
トもしくはアンタゴニストは、治癒するのが困難な組織の再生を増加させ得る。
例えば、腱／靭帯の再生を増大させることによって、損傷後の回復時間が早まる
。本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストはまた、損傷を回避する試みにおいて予防的に使用され得る。
処置され得る特定の疾患は、腱炎、手根管症候群、および他の腱欠損または靭帯
欠損を含む。非治癒創傷の組織再生のさらなる例としては、褥瘡性潰瘍、脈管不
全、外科的創傷、および外傷性創傷に関連する潰瘍が挙げられる。
【０４３９】 同様に、神経および脳組織はまた、神経細胞を増殖および分化させるために本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを使用することによって再生され得る。本方法を用いて処置され得
る疾患としては、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患、神経障害、または機械
的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および発作（
ｓｔｏｋｅ））が挙げられる。詳細には、末梢神経傷害と関連する疾患、末梢神
経障害（例えば、化学療法または他の医学的療法から生じる）、局在神経障害、
および中枢神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチン
トン病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群）はすべて、本
発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはア
ンタゴニストを用いて処置され得る。
【０４４０】 （走化性） 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、走化性活性を有し得る。走化性分子は、細胞（例えば、単
球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または
内皮細胞）を、身体中の特定の部位（例えば、炎症、感染、または過剰増殖の部
位）に誘引または動員する。次いで、動員された細胞は、特定の外傷または異常
性を撃退および／または治癒し得る。
【０４４１】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストは、特定の細胞の走化性活性を増大し得る。次いで、これらの
走化性分子を使用して、身体中の特定の位置に標的化した細胞の数を増加させる
ことによって、炎症、感染、過剰増殖性障害、または任意の免疫系障害を処置し
得る。例えば、走化性分子を使用して、傷害を受けた位置に免疫細胞を誘引する
ことによって、組織に対する創傷および他の外傷を処置し得る。本発明の走化性
分子はまた、線維芽細胞を誘引し得、これは創傷を処置するために使用され得る
。
【０４４２】 本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしく
はアンタゴニストが走化性活性を阻害し得ることもまた意図される。これらの分
子はまた、障害を処置するために使用され得る。従って、本発明のポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチド、ならびにアゴニストもしくはアンタゴニストは、走
化性のインヒビターとして使用され得る。
【０４４３】 （結合活性） 本発明のポリペプチドは、このポリペプチドに結合する分子、またはこのポリ
ペプチドが結合する分子についてスクリーニングするために使用され得る。この
ポリペプチドとこの分子との結合は、結合したポリペプチドまたは分子の活性を
活性化（アゴニスト）、増大、阻害（アンタゴニスト）、または減少させ得る。
そのような分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば
、レセプター）、または低分子が挙げられる。
【０４４４】 好ましくは、この分子は、このポリペプチドの天然のリガンド（例えば、リガ
ンドのフラグメント）、または天然の基質、リガンド、構造的模倣物、もしくは
機能的模倣物に密接に関連する（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：第５章（１９９１）を参
照のこと）。同様に、この分子は、このポリペプチドが結合する天然のレセプタ
ー、または少なくとも、このポリペプチドによって結合され得るレセプターのフ
ラグメント（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合においても
、この分子は、公知の技術を用いて合理的に設計され得る。
【０４４５】 好ましくは、これらの分子についてのスクリーニングは、このポリペプチドを
発現する適切な細胞を産生する工程を包含する。好ましい細胞としては、哺乳動
物、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉ由来の細胞が挙げられる
。次いで、このポリペプチドを発現する細胞（または、発現されたポリペプチド
を含む細胞膜）を、好ましくは、このポリペプチドまたはこの分子のいずれかの
結合、活性の刺激、または活性の阻害を観察するための分子を潜在的に含む試験
化合物と接触させる。
【０４４６】 アッセイは、このポリペプチドへの候補化合物の結合を単純に試験し得、ここ
で結合は、標識によって、または標識された競合物との競合に関するアッセイに
おいて検出される。さらに、アッセイは、候補化合物がこのポリペプチドへの結
合によって生成されるシグナルを生じるか否かを試験し得る。
【０４４７】 あるいは、アッセイは、無細胞調製物、固体支持体に接着されたポリペプチド
／分子、化学ライブラリー、または天然産物の混合物を用いて実施され得る。ア
ッセイはまた、候補化合物を、ポリペプチドを含む溶液と混合する工程、ポリペ
プチド／分子の活性または結合を測定する工程、およびポリペプチド／分子の活
性または結合を、標準と比較する工程を単純に包含し得る。
【０４４８】 好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナル抗体またはポリクローナ
ル抗体を用いて、サンプル（例えば、生物学的サンプル）におけるポリペプチド
のレベルまたは活性を測定し得る。抗体は、ポリペプチドへの直接的もしくは間
接的のいずれかの結合、または基質についてのポリペプチドとの競合によって、
ポリペプチドのレベルまたは活性を測定し得る。
【０４４９】 さらに、本発明のポリペプチドが結合するレセプターは、当業者に公知の多く
の方法（例えば、リガンドパニングおよびＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａ
ｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．，１（２）、
第５章（１９９１））によって同定され得る。例えば、発現クローニングは、ポ
リアデニル化ＲＮＡがこのポリペプチドに応答する細胞から調製される場合に用
いらされ、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（これは、ＦＧＦファミリータンパク質に
対する複数のレセプターを含むことが公知である）、およびＳＣ−３細胞、およ
びこのＲＮＡから作製されたｃＤＮＡライブラリーは、プールに分けられ、そし
てこのポリペプチドに応答性でないＣＯＳ細胞または他の細胞をトランスフェク
トするために使用される。ガラススライド上で増殖しているトランスフェクトさ
れた細胞は、それらを標識化した後に、本発明のポリペプチドに曝露される。こ
のポリペプチドは、種々の手段（部位特異的プロテインキナーゼに対する認識部
位のヨウ素化または封入を含む）によって標識化され得る。
【０４５０】 固定化およびインキュベーション後、スライドは、オートラジオグラフィー分
析に供される。陽性プールを同定し、そしてサブプールを、反復性のサププール
化および再スクリーニングプロセスを使用して調製および再びトランスフェクト
して、最終的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生じる。
【０４５１】 レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識ポリペプチドは、レセ
プター分子を発現する調製物を、細胞膜と光親和性に連結し得るか、または抽出
し得る。架橋された材料は、ＰＡＧＥ分析によって分離され、そしてＸ線フィル
ムに曝露される。ポリペプチドのレセプターを含む標識複合体が切り出され得、
ペプチドフラグメントへと分離され得、そしてタンパク質微小配列決定に供され
得る。微小配列決定から得られるアミノ酸配列を使用して、１組の縮重オリゴヌ
クレオチドプローブを設計してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、推定
レセプターをコードする遺伝子を同定する。
【０４５２】 さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフ
リング、および／またはコドンシャッフリングの技術（集合的に「ＤＮＡシャッ
フリング」という）を利用して、本発明のポリペプチドの活性を調節し得、それ
によって本発明のポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に生
成する。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号
、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３
７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４〜３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａｍａ，
Ｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６〜８２（１９９８
）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５〜７
６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８〜１３（１９９８）（これら
の特許および刊行物の各々は、本明細書において参考として援用される）を参照
のこと。１つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドおよび対応するポ
リペプチドの変更は、ＤＮＡシャッフリングによって達成され得る。ＤＮＡシャ
ッフリングは、相同組換えまたは部位特異的な組換えによる、２つ以上のＤＮＡ
セグメントの、所望の分子への構築を含む。別の実施態様において、ポリヌクレ
オチドおよび対応するポリペプチドは、組換えの前に、誤りがちな（ｅｒｒｏｒ
−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダ
ム変異誘発に供することによって、変更され得る。別の実施態様において、本発
明のポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、フラグ
メントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、
ドメイン、フラグメントなどと組換えられ得る。好ましい実施態様において、こ
の異種分子は、ファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施態様において
、この異種分子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増
殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、表皮増殖
因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形成タンパク
質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチ
ビンＡおよびＢ、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサ
リン、増殖分化因子（ＧＤＦ）、結節（ｎｏｄａｌ）、ＭＩＳ、インヒビン−α
、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５、および神経膠由
来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のような増殖因子である。
【０４５３】 他の好ましいフラグメントは、本発明のポリペプチドの生物学的に活性なフラ
グメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明のポリぺプチドの活
性に類似の活性を示すが、必ずしも同一ではないフラグメントである。このフラ
グメントの生物学的活性は、改善された所望の活性、または減少した所望されな
い活性を含み得る。
【０４５４】 さらに、本発明は、本発明のポリペプチドの作用を調節する化合物を同定する
ために化合物をスクリーニングする方法を提供する。このようなアッセイの例は
、哺乳動物線維芽細胞、本発明のポリペプチド、スクリーニングされるべき化合
物および3[Ｈ]チミジンを、線維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で合わせ
る工程を包含する。コントロールアッセイは、スクリーニングされるべき化合物
の非存在下で実施され得、そしてこの化合物の存在下での線維芽細胞の増殖の量
と比較して、各々の場合における3[Ｈ]チミジンの取り込みの決定によって、こ
の化合物が増殖を刺激するか否かを決定し得る。線維芽細胞の増殖の量は、3[Ｈ
]チミジンの取り込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによ
って測定される。アゴニスト化合物およびアンタゴニスト化合物の両方が、この
手順により同定され得る。
【０４５５】 別の方法において、本発明のポリペプチドに対するレセプターを発現する哺乳
動物細胞または膜調製物は、この化合物の存在下において標識化した本発明のポ
リペプチドとともにインキュベートされる。次いで、この化合物がこの相互作用
を増強またはブロックする能力が、測定され得る。あるいは、スクリーニングさ
れるべき化合物の相互作用に従う既知のセカンドメッセンジャー系の応答および
レセプターが測定され、そしてこの化合物がこのレセプターを結合し、そしてセ
カンドメッセンジャー応答を誘発する能力を測定して、この化合物が潜在的なア
ゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する。このようなセカンドメ
ッセンジャー系には、ｃＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホ
スホイノシチド加水分解が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】 これらの上記のアッセイの全ては、診断マーカーまたは予後マーカーとして使
用され得る。これらのアッセイを用いて発見される分子は、ポリペプチド／分子
を活性化または阻害することによって、疾患を処置するか、または患者における
特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらすために使用され得る。さらに、アッ
セイは、適切に操作された細胞または組織からの本発明のポリペプチドの産生を
阻害または増強し得る因子を発見し得る。
【０４５７】 従って、本発明は、以下の工程を含む本発明のポリペプチドに結合する化合物
を同定する方法を包含する：（ａ）候補結合化合物を本発明のポリペプチドとと
もにインキュベートする工程；および（ｂ）結合が生じたか否かを決定する工程
。さらに、本発明は、以下の工程を含むアゴニスト／アンタゴニストを同定する
方法を包含する：（ａ）候補化合物を本発明のポリペプチドとともにインキュベ
ートする工程、（ｂ）生物学的活性をアッセイする工程、および（ｂ）ポリペプ
チドの生物学的活性が改変されているか否かを決定する工程。
【０４５８】 （標的化された送達） 別の実施形態において、本発明は、組成物を、例えば、本発明のポリペプチド
についてのレセプターを発現する標的化細胞、または本発明のポリペプチドの細
胞結合形態を発現する細胞に送達する方法を提供する。
【０４５９】 本明細書中で議論される場合、本発明のポリペプチドまたは抗体は、異種ポリ
ペプチド、異種核酸、毒素またはプロドラッグと、疎水性、親水性、イオン性お
よび／または共有結合的な相互作用を介して会合し得る。１つの実施形態におい
て、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のポリペプチド（
抗体を含む）を投与することによる、本発明の組成物の細胞への特異的な送達の
ための方法を提供する。１つの例において、本発明は、治療タンパク質を標的化
細胞中へ送達するための方法を提供する。別の例において、本発明は、一本鎖核
酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞
のゲノムに組み込まれ得るか、またはエピソームにて複製し得、そして転写され
得る、ＤＮＡ）を、標的化細胞に送達するための方法を提供する。
【０４６０】 別の実施形態において、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと会合
した本発明のポリペプチド（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体
）を投与することによる細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための
方法を提供する。
【０４６１】 「毒素」とは、内因性の細胞傷害性エフェクター系、放射性同位体、ホロ毒素
（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変型毒素、毒素の触媒サブユニット、または規定の
条件下で細胞死を引き起こす細胞中もしくは細胞表面には通常存在しない任意の
分子もしくは酵素を結合および活性化する化合物を意味する。本発明の方法に従
って使用され得る毒素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
当該分野で公知の放射性同位体、固有のまたは誘導された内因性の細胞傷害性エ
フェクター系に結合する化合物（例えば、抗体（またはその一部を含む補体固定
）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｓｅ、α毒素、リシン、ア
ブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモル
ジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ヨウシュヤマゴボウ
抗ウイルスタンパク質、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）およびコレラ毒素。「細
胞傷害性プロドラッグ」とは、通常細胞内に存在する酵素によって、細胞傷害性
化合物へと変換される非毒性の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用さ
れ得る細胞傷害性プロドラッグとしては、安息香酸マスタードアルキル化剤のグ
ルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシン
アラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミ
ド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６２】 （薬物スクリーニング） 本発明のポリペプチドの活性を改変する分子についてスクリーニングするため
の、本発明のポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドの使用が、さらに意図される。このような方法は、本発明のポリペプチ
ドを、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性を有することが疑われる選択さ
れた化合物と接触させる工程、および結合に続いてこれらのポリペプチドの活性
をアッセイする工程を含む。
【０４６３】 本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、本発明のポリ
ペプチド、またはそれらの結合フラグメントを使用することによって治療用化合
物をスクリーニングするために特に有用である。このような試験に用いられるポ
リペプチドまたはフラグメントは、固体支持体に固定化され得、細胞表面上に発
現され得、溶液中で遊離であり得、または細胞内に局在化され得る。薬物スクリ
ーニングの１つの方法は、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換え核
酸を用いて安定に形質転換される真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞を利
用する。薬物は、競合結合アッセイにおいて、このような形質転換細胞に対して
スクリーニングされる。例えば、試験されている薬物と本発明のポリペプチドと
の間の複合体の形成（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｎ）を測定し得る。
【０４６４】 従って、本発明は、本発明のポリペプチドによって媒介される活性に影響を及
ぼす薬物または任意の他の薬剤についてのスクリーニング方法を提供する。これ
らの方法は、当該分野で周知の方法によって、このような薬剤を本発明のポリペ
プチドもしくはそのフラグメントと接触させる工程、およびこの薬剤とこのポリ
ペプチドもしくはそのフラグメントとの間の複合体の存在についてアッセイする
工程を包含する。このような競合結合アッセイにおいて、スクリーニングされる
薬剤は、代表的に、標識化される。インキュベーション後に、遊離の薬剤は、結
合形態中に存在する薬物から分離され、そして遊離または複合体化されていない
標識の量は、特定の薬剤が本発明のポリペプチドに結合する能力の尺度である。
【０４６５】 薬物スクリーニングについての別の技術は、本発明のポリペプチドに対する適
切な結合親和性を有する化合物に対する高処理能力スクリーニングを提供し、そ
して欧州特許出願８４／０３５６４（１９８４年９月１３日公開）（これは、本
明細書中で参考として援用される）に非常に詳細に記載される。簡潔にいうと、
大量の異なる小さなペプチド試験化合物は、固体基材（例えば、プラスチックピ
ンまたはいくつかの他の表面）上で合成される。ペプチド試験化合物を、本発明
のポリペプチドと反応させ、そして洗浄する。次いで、結合したポリペプチドは
、当該分野で周知の方法によって検出される。精製されたポリペプチドは、前述
の薬物スクリーニング技術での使用のためにプレート上に直接コーディングされ
る。さらに、非中和抗体を使用して、このペプチドを捕捉し得、そして固体支持
体上にそれを固定し得る。
【０４６６】 本発明はまた、競合薬物スクリーニングアッセイの使用を意図し、ここで、本
発明のポリペプチドを結合し得る中和抗体は、ポリペプチドまたはそのフラグメ
ントに対する結合について試験化合物と特異的に競合する。この様式において、
抗体を使用して、本発明のポリペプチドと１つ以上の抗原性エピトープを共有す
る任意のペプチドの存在を検出する。
【０４６７】 （アンチセンスおよびリボザイム（アンタゴニスト）） 特定の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、配列番号Ｘに含ま
れる配列またはその相補鎖に対応する核酸および／あるいは表１において同定さ
れるｃＤＮＡプラスミドＺに含まれるヌクレオチド配列に対応する核酸である。
１つの実施形態において、アンチセンス配列は、生物体により内部で生成され、
別の実施形態において、アンチセンス配列は別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃ
ｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）を参照のこと
）。Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）。アンチセンス技術を使用
して、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通してか、または３重らせんの形成
を通して遺伝子発現を制御し得る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，
Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ
ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａ
ｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）に考察される。３重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅら
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）
；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅ
ｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１３００（１９９１）において考察され
る。これらの方法は、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合
に基づく。
【０４６８】 例えば、非リンパ性白血病細胞株ＨＬ−６０および他の細胞株の増殖を阻害す
るためのｃ−ｍｙｃおよびｃ−ｍｙｂアンチセンスＲＮＡ構築物の使用は、以前
に記載された（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍら（１９８８）；Ａｎｆｏｓｓｉら（１９８
９））。これらの実験は、細胞をオリゴリボヌクレオチドとインキュベーション
することによってインビトロで行われた。インビボ用途のための類似の手順は、
ＷＯ９１／１５５８０に記載される。簡単には、所定のアンチセンスＲＮＡにつ
いてのオリゴヌクレオチドの対は、以下のように生成される：オープンリーディ
ングフレームの最初の１５塩基に相補的な配列を、５末端のＥｃｏＲＩ部位およ
び３末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接させる。次に、オリゴヌクレオチドの対は
、９０℃で１分間加熱され、次いで２×ライゲーション緩衝液（２０ｍＭ ＴＲ
ＩＳ ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）および０．２ｍＭ ＡＴＰ）中でアニーリングされ、次いで、レ
トロウイルスベクターＰＭＶ７のＥｃｏＲ１／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結される
（ＷＯ９１／１５５８０）。
【０４６９】 例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コード部
分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド
を設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相
補的であるように設計され、それにより転写およびレセプターの産生を阻害する
。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダ
イズし、そしてｍＲＮＡ分子のレセプターポリペプチドへの翻訳をブロックする
。
【０４７０】 １つの実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、外来の配列からの転
写により細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその一部が転写され、本
発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。このようなベクターは、アンチ
センス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、それが転写されて
所望のアンチセンスＲＮＡを産生し得る限り、エピソームを保持し得るか、また
は染色体に組込まれ得る。このようなベクターは、当該分野において標準的な組
換えＤＮＡ技術方法により構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞において複
製および発現のために使用される、当該分野で公知のプラスミド、ウイルスなど
であり得る。本発明のポリペプチドをコードする配列またはそのフラグメントの
発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞において作用する、当該分野で公知の任
意のプロモーターにより得る。そのようなプロモーターは、誘導性または構成性
であり得る。このようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅ
ｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４−３１０（１
９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙ
ａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペス
チミジンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン
遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２（
１９８２））などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７１】 本発明のアンチセンス核酸は、少なくとも本発明の遺伝子のＲＮＡ転写物の一
部に相補的な配列を含む。しかし、完全に相補的であることは好ましいが、必要
ではない。本明細書中で言及される「少なくともＲＮＡの一部に相補的な」配列
は、ＲＮＡとハイブリダイズし得るに十分な相補性を有し、安定な二重鎖を形成
する配列を意味し；従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合において、二重鎖Ｄ
ＮＡの一本鎖が試験され得るか、または三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブ
リダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存
する。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩
基ミスマッチを含み得、そしてなお安定な二重鎖（または三重鎖の場合もあり得
る）を形成し得る。当業者は、ハイブリダイズ複合体の融点を決定するために標
準的な手順を使用することによりミスマッチの許容の程度を確認し得る。
【０４７２】 メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＵＧ開
始コドンまででかつＡＵＧ開始コドンを含む５’非翻訳配列）は、翻訳の阻害の
際に最も効率的に働く。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列は、
同様にｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に有効であることが示された。一般的に、Ｗ
ａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５を参照の
こと。従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列の５’−または３
’−の非翻訳非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性
ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチに使用され得る。ｍＲＮＡの
５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補物を
含む。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、翻訳
のあまり効率的でないインヒビターであるが、本発明に従って使用され得る。本
発明のｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするよ
うに設計されるか否かにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレ
オチド長であるべきであり、そして好ましくは６〜約５０ヌクレオチド長にわた
るオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオチドは
、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５
ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０４７３】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、またはキメラ混合物
、あるいはそれらの誘導体もしくは改変バージョン、一本鎖、または二本鎖であ
り得る。このオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸
骨格で改変され、分子の安定性、ハイブリダーゼーションなどを改善し得る。こ
のオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基（例えば、インビボにお
いて宿主細胞レセプターを標的化するために）、または細胞膜を通した輸送を促
進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ
ら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２
；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０（１９８８年１２月１５日公開）を参照
のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４（
１９８８年４月２５日公開）を参照のこと）、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ａ
ｇｅｎｔ）（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６
：９５８−９７６を参照のこと）、またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏｎ
，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を含み得
る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、
ハイブリダーゼーション誘引架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘引切断
剤など）に結合体化され得る。
【０４７４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの改変された塩基部分を
含み得、この塩基部分は、以下を含むがそれらに限定されない群から選択される
：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨー
ドウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カル
ボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシ
ル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデ
ニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、
２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシ
トシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシ
ル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュー
オシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２
−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ
）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュ
ーオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシ
ル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチル
エステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、
３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）
ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０４７５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、以下を含むがそれらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変された糖部分を含み得る：アラビノース
、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソース。
【０４７６】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含
むがそれらに限定されない群から選択される少なくとも１つの改変されたリン酸
骨格を含む：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオ
エート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロジ
アミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルム
アセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）またはそれらのアナログ。
【０４７７】 さらに別の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ａ−アノ
マーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的な
ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のｂ−ユニットとは
対照的に、その鎖は互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。このオリゴヌクレオチド
は、２’−０−メチルリボヌクレオチドであるか（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログである（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２
１５：３２７−３３０）。
【０４７８】 本発明のポリヌクレオチドは当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動Ｄ
ＮＡ合成機（このような装置はＢｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）の使用により）により合成され得る。例
えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（１９８
８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９）により合成され得、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御化細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）ポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）な
どの使用により調製され得る。
【０４７９】 コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写
された非翻訳領域に相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０４８０】 本発明に従う潜在的なアンタゴニストはまた、触媒ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４、１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを
使用して、ｍＲＮＡを破壊し得るが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ま
しい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的な塩基対を形成す
る隣接領域により決定される位置で、ｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、
標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列を有することである：５’−ＵＧ−３’。ハ
ンマーヘッド型リボザイムの構築および生成は当該分野で周知であり、そしてＨ
ａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１
（１９８８）により十分に記載される。配列番号Ｘのヌクレオチド配列内に多く
の潜在的なハンマーヘッド型リボザイム切断部位が存在する。好ましくは、この
リボザイムは、切断認識部位がｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように；すな
わち、効率を増大し、そして非機能的ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化する
ように、操作される。
【０４８１】 アンチセンスアプローチの場合、本発明のリボザイムは、改変されたオリゴヌ
クレオチド（例えば、安定性、標的化などについて改善された）から構成され得
、そしてインビボにおいて本発明のポリペプチドを発現する細胞に送達される。
リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導
入のための上記と同じ様式において細胞中に導入され得る。送達の好ましい方法
は、強力な構成性プロモーター（例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐ
ｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下で、リボザイムを「コードする」ＤＮ
Ａ構築物を使用することを包含し、その結果トランスフェクトされた細胞が内因
性メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するに十分な量のリボザイムを生成す
る。リボザイムはアンチセンス分子とは異なり触媒性であるので、より低い細胞
内濃度が効率のために必要とされる。
【０４８２】 アンタゴニスト／アゴニスト化合物を利用して、腫瘍性の細胞および組織に対
する本発明のポリペプチドの細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉ
ｆｅｒａｔｉｏｎ）効果を阻害し得る。すなわち、腫瘍の新脈管形成を刺激し、
それにより異常な細胞成長および増殖を（例えば、腫瘍の形成または成長におい
て）遅延または防止する。
【０４８３】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、血管過多の疾患を予防し得、そ
して嚢外白内障（ｅｘｔｒａｃａｐｓｕｌａｒ ｃａｔａｒａｃｔ）手術後の上
皮水晶体細胞の増殖を予防する。本発明のポリペプチドのマイトジェン活性の予
防はまた、例えば、バルーン血管形成術後の再狭窄のような場合に要求され得る
。
【０４８４】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、創傷治癒の間の瘢痕組織の増殖
予防し得る。
【０４８５】 アンタゴニスト／アゴニストをまた利用して、本明細書中に記載される疾患を
処置し得る。
【０４８６】 従って、本発明は、障害または疾患（本発明のポリヌクレオチドの過剰発現に
関連する、本願の全体に渡って列挙される障害または疾患が含まれるが、これら
に限定されない）を、（ａ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたアンチセン
ス分子、および／または（ｂ）本発明のポリヌクレオチドに指向されたリボザイ
ムを、患者に投与することによって処置する方法を提供する。
【０４８７】 （他の活性） 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、血管内皮細胞増殖を刺激する能力の結果として、種々の疾患状態（例えば、
血栓症、動脈硬化、および他の心臓血管の状態）に起因する虚血組織の血管再生
を刺激するための処置において利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌク
レオチド、アゴニストまたはアンタゴニストをまた利用して、上記で議論される
ように新脈管形成および肢の再生を刺激し得る。
【０４８８】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
を、傷害、火傷、手術後組織修復、および潰瘍に起因する創傷の処置にもまた利
用し得る。なぜなら、それらは異なる起源の種々の細胞（例えば、線維芽細胞お
よび骨格筋細胞）に対してマイトジェン性であり、それゆえ損傷を受けた組織ま
たは疾患組織の修復または置換を促進するからである。
【０４８９】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、ニューロンの成長を刺激し、そして特定のニューロンの障害または神経
変性状態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびエイズ関連複合
体（ｃｏｍｐｌｅｘ））において生じるニューロンの損傷を処置および予防する
ために利用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストま
たはアンタゴニストは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得、それゆえ、これ
らは骨および歯周の再生を増強し、そして組織移植片または骨の移植片における
補助のために利用され得る。
【０４９０】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた利用して、ケラチノサイト増殖を刺激することにより、日焼けに起因する
皮膚の加齢を予防し得る。
【０４９１】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
をまた、抜け毛を予防するために利用し得る。なぜなら、ＦＧＦファミリーのメ
ンバーは、髪形成細胞を活性化し、そしてメラノサイト増殖を促進するからであ
る。同じ系列にそって、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニスト
またはアンタゴニストを利用して、他のサイトカインと組み合わせて使用した場
合、造血細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激し得る。
【０４９２】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、移植前の器官を維持するか、または初代組織の細胞培養を支持するため
に使用され得る。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたは
アンタゴニストはまた、初期胚における分化のための中胚葉起源の組織を誘導す
るために利用され得る。
【０４９３】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、上記で議論されるように造血系統に加えて、胚幹細胞の分化または増殖
を増加または減少し得る。
【０４９４】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、哺乳動物の特徴（例えば、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組
織の割合、色素沈着、大きさ、および形（例えば、美容外科））を調節するため
に使用され得る。同様に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニス
トまたはアンタゴニストは、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、および
エネルギーの貯蔵に影響を及ぼす哺乳動物の代謝を調節するために使用され得る
。
【０４９５】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
は、バイオリズム、概日（ｃａｒｉｃａｄｉｃ）リズム、うつ病（抑うつ性障害
を含む）、暴力の傾向、痛みへの耐性、生殖能力（好ましくは、アクチビンまた
はインヒビン様活性によって）、ホルモンレベルもしくは内分泌レベル、食欲、
性欲、記憶、ストレス、または他の認知の質に影響を及ぼすことによって、哺乳
動物の精神状態または身体状態を変更するために使用され得る。
【０４９６】 本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、アゴニストまたはアンタゴニスト
はまた、例えば、貯蔵能力、脂肪含有量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミ
ン、ミネラル、補因子、または他の栄養成分を増加または減少させるような食品
添加物または保存剤として使用され得る。
【０４９７】 上記に列挙された適用は、広範な種々の宿主において用途を有する。そのよう
な宿主としては、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マ
ウス、ラット、ハムスター、ブタ、ミクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワ
トリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、およびヒトが挙げられ
るが、これらに限定されない。特定の実施形態において、宿主は、マウス、ウサ
ギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌま
たはネコである。好ましい実施形態において、宿主は、哺乳動物である。最も好
ましい実施形態において、宿主は、ヒトである。
【０４９８】 （他の好ましい実施形態） 本願発明の他の好ましい実施形態は、配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／
またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の、少なくとも約５０の連続
するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含
む、単離された核酸分子を含む。
【０４９９】 連続するヌクレオチドの上記配列が、表１の配列番号Ｘについて同定される位
置の範囲で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列中に含まれる、核酸分子もまた好ま
しい。
【０５００】 配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列中の、少なくとも約１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ま
しい。
【０５０１】 配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列中の、少なくとも約５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なく
とも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子はさらに好
ましい。
【０５０２】 さらに好ましい実施形態は、表１の配列番号Ｘについて同定された位置の範囲
で、配列番号Ｘのヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチ
ド配列を含む、核酸分子である。
【０５０３】 さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃ
ＤＮＡプラスミドＺの完全ヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸配列である。
【０５０４】 配列番号Ｘまたはその相補鎖、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレ
オチド配列を含む核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下でハイブリダイズする、単離された核酸分子もまた好ましい。ここで、ハイブ
リダイズする核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
、Ａ残基のみまたはＴ残基のみから構成されるヌクレオチド配列を有する核酸分
子にハイブリダイズしない。
【０５０５】 ｃＤＮＡプラスミドＺを含むＤＮＡ分子を含む物質の組成物もまた好ましい。
【０５０６】 ｃＤＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列中の、少なくとも５０の連続するヌ
クレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単
離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０７】 少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列が、ｃＤＮＡプラスミドＺによ
りコードされるオープンリーディングフレーム配列のヌクレオチド配列中に含ま
れる、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０８】 ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列中の、少なくとも
１５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。
【０５０９】 さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレ
オチド配列中の、少なくとも５００の連続するヌクレオチドの配列に、少なくと
も９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子である。
【０５１０】 さらに好ましい実施形態は、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされる完全ク
レオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む、単離さ
れた核酸分子である。
【０５１１】 さらに好ましい実施形態は、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列
、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列からなる群
から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少
なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を、生物学的サンプ
ルにおいて検出するための方法である。ここで、この方法は、上記サンプル中の
、少なくとも１つの核酸分子のヌクレオチド配列と、上記群から選択される配列
とを比較する工程、およびサンプル中の核酸分子の配列が、選択された配列に、
少なくとも９５％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０５１２】 配列を比較する上記工程が、上記サンプル中の核酸分子と、上記群から選択さ
れる配列を含む核酸分子との間の核酸ハイブリダイゼーションの程度を決定する
工程を包含する、上記方法もまた好ましい。同様に、配列を比較する上記工程が
、上記サンプル中の核酸分子から決定されたヌクレオチド配列と、上記群から選
択された配列とを比較することにより行われる、上記方法もまた好ましい。核酸
分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。
【０５１３】 さらに好ましい実施形態は、生物学的サンプルの種、組織型または細胞型を同
定するための方法であり、この方法は、このサンプル中の核酸分子（もしあれば
、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤＮＡプラスミド
Ｚによりコードされるヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少
なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、
ヌクレオチド配列を含む）を検出する工程を包含する。
【０５１４】 生物学的サンプルの種、組織型または細胞型を同定する方法は、少なくとも２
つのヌクレオチド配列のパネルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検
出する工程を包含し得る。ここで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上
記群から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に
、少なくとも９５％同一である。
【０５１５】 配列番号Ｘもしくはその相補鎖、またはタンパク質をコードするｃＤＮＡプラ
スミドＺのヌクレオチド配列の異常な構造または発現と関連する病理状態を、被
験体において診断するための方法もまた好ましい。ここで、この方法は、核酸分
子（もしあれば、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチド配列、およびｃＤ
ＮＡプラスミドＺのヌクレオチド配列からなる群から選択される配列中の、少な
くとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一である、ヌ
クレオチド配列を含む）を、この被験体から得られた生物学的サンプルにおいて
検出する工程を包含する。
【０５１６】 病理状態を診断するための方法は、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネ
ルにおいて、ヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する工程を包含し得る。こ
こで、このパネル中の少なくとも１つの配列は、上記群から選択される配列中の
、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列に、少なくとも９５％同一であ
る。
【０５１７】 核酸分子のヌクレオチド配列が、少なくとも２つのヌクレオチド配列のパネル
を含む、単離された核酸分子を含む物質の組成物もまた好ましい。ここで、この
パネル中の少なくとも１つの配列が、配列番号Ｘまたはその相補鎖のヌクレオチ
ド配列、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるヌクレオチド配列から
なる群から選択される配列中の、少なくとも５０の連続するヌクレオチドの配列
に、少なくとも９５％同一である。この核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分
子を含み得る。
【０５１８】 配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポ
リペプチド中の、少なくとも約１０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９
０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５１９】 配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードされる
ポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペ
プチド中の、少なくとも約３０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９５％
同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５２０】 配列番号Ｙのアミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードされる
ポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペ
プチド中の、少なくとも約１００の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９５
％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０５２１】 配列番号Ｙの完全アミノ酸配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードさ
れるポリペプチド、および／またはｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポ
リペプチドに、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポ
リペプチドはさらに好ましい。
【０５２２】 ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチドの完全アミノ酸配列中
の、少なくとも約１０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９０％同一であ
るアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドはさらに好ましい。
【０５２３】 連続するアミノ酸の上記配列が、ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポ
リペプチド；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードされるポリペプチド、お
よび／または配列番号Ｙのポリペプチド配列の一部のアミノ酸の配列に含まれる
、ポリペプチドもまた好ましい。
【０５２４】 ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の、
少なくとも約３０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９５％同一であるア
ミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５２５】 ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列中の、
少なくとも約１００の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９５％同一である
アミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５２６】 ｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に、少
なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドもまた
好ましい。
【０５２７】 配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードさ
れるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチ
ドからなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続するアミノ酸の配
列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドに、特異的
に結合する、単離された抗体もまた好ましい。
【０５２８】 配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードさ
れるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチ
ドからなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続するアミノ酸の配
列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、生物学
的サンプルにおいて検出するための方法はさらに好ましい。ここで、この方法は
、上記サンプル中の、少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列と、上
記群から選択される配列とを比較する工程、および上記サンプル中のポリペプチ
ド分子の配列が、少なくとも１０の連続するアミノ酸の上記配列に、少なくとも
９０％同一であるか否かを決定する工程を包含する。
【０５２９】 上記サンプル中の、少なくとも１つのポリペプチド分子のアミノ酸配列と、上
記群から選択される配列とを比較する工程が、配列番号Ｙのポリペプチド配列；
配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードされるポリペプチド、およびｃＤＮＡ
プラスミドＺによりコードされるポリペプチドからなる群から選択される配列中
の、少なくとも１０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９０％同一である
アミノ酸配列を含むポリペプチドに、特異的に結合する抗体に対する、このサン
プルにおけるポリペプチドの特異的な結合の程度を決定する工程を包含する、上
記方法もまた好ましい。
【０５３０】 配列を比較する上記工程が、上記サンプル中のポリペプチド分子から決定され
るアミノ酸配列と、上記群から選択される配列とを比較することにより行われる
、上記方法もまた好ましい。
【０５３１】 上記サンプル中のポリペプチド分子（もしあれば、配列番号Ｙのポリペプチド
配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコードされるポリペプチド、およびｃ
ＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプチドからなる群から選択される
配列中の、少なくとも１０の連続するアミノ酸の配列に、少なくとも９０％同一
である、アミノ酸配列を含む）を検出する工程を包含する、生物学的サンプルの
種、組織型または細胞型を同定するための方法もまた好ましい。
【０５３２】 少なくとも２つのアミノ酸配列のパネル中に、アミノ酸配列を含むポリペプチ
ド分子を検出する工程を包含する、生物学的サンプルの種、組織型または細胞型
を同定するための上記方法もまた好ましい。ここで、このパネル中の少なくとも
１つの配列は、上記群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続するアミ
ノ酸の配列に、少なくとも９０％同一である。
【０５３３】 ポリペプチドをコードする、表１において同定された核酸配列の異常な構造ま
たは発現と関連する病理状態を、被験体において診断するための方法もまた好ま
しい。ここで、この方法は、少なくとも２つのアミノ酸配列のパネル中のアミノ
酸配列を含むポリペプチド分子を、この被験体から得られた生物学的サンプルに
おいて検出する工程を包含する。ここで、このパネル中の少なくとも１つの配列
は、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖によりコード
されるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされるポリペプ
チドからなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続するアミノ酸の
配列に、少なくとも９０％同一である。
【０５３４】 これらの方法のいずれかにおいて、上記ポリペプチド分子を検出する工程は、
抗体を用いる工程を包含する。
【０５３５】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一である
ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子もまた好ましい。ここで、このポ
リペプチドは、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその相補鎖に
よりコードされるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコードされ
るポリペプチドからなる群から選択される配列中の、少なくとも１０の連続する
アミノ酸の配列に、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０５３６】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、原核生物宿主におけるこのポ
リペプチドの発現のために最適化されている、単離された核酸分子もまた好まし
い。
【０５３７】 上記ポリペプチドが、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたはその
相補鎖によりコードされるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによりコ
ードされるポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離さ
れた核酸分子もまた好ましい。
【０５３８】 上記単離された核酸分子のいずれかを、ベクターに挿入する工程を包含する、
組換えベクターを作製する方法はさらに好ましい。本方法により産生される組換
えベクターもまた好ましい。宿主細胞に、ベクターを導入する工程を包含する、
組換え宿主細胞を作製する方法、および本方法により産生された組換え宿主細胞
もまた好ましい。
【０５３９】 上記ポリペプチドが発現され、そしてこのポリペプチドを回収するような条件
下で、この組換え宿主細胞を培養する工程を包含する、単離されたポリペプチド
を作製する方法もまた好ましい。上記組換え宿主細胞が、真核生物細胞であり、
そして上記ポリペプチドが、配列番号Ｙのポリペプチド配列；配列番号Ｘまたは
その相補鎖によりコードされるポリペプチド、およびｃＤＮＡプラスミドＺによ
りコードされるポリペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒ
トタンパク質である、単離されたポリペプチドを作製する本方法もまた好ましい
。本方法により産生される単離されたポリペプチドもまた好ましい。
【０５４０】 増加したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置の方法もまた好まし
い。この方法は、上記個体において上記タンパク質活性のレベルを上昇させるの
に有効な量の、本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、免疫原
性フラグメントまたはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗原結合フラグメン
トを含む治療薬を、このような個体に投与する工程を包含する。
【０５４１】 低下したレベルのタンパク質活性を必要とする個体の処置の方法もまた好まし
い。この方法は、上記個体において上記タンパク質活性のレベルを低下させるの
に有効な量の、本願発明の単離されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、免疫原
性フラグメントまたはそのアナログ、結合剤、抗体、または抗原結合フラグメン
トを含む治療薬を、このような個体に投与する工程を包含する。
【０５４２】 概して、本発明を記載してきたが、本発明は、例示の目的のために提供され、
そして限定を意図しない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解
される。
【０５４３】 （実施例） （実施例１：寄託されたサンプルからの選択されたｃＤＮＡクローンの単離） 引用されたＡＴＣＣ寄託における各ｃＤＮＡクローンは、プラスミドベクター
に含まれる。表１は、各クローンを単離したｃＤＮＡライブラリーを構築するた
めに使用されるベクターを同定する。多くの場合において、ライブラリーを構築
するために使用されるベクターは、プラスミドが削除されたファージベクターで
ある。すぐ下の表は、ｃＤＮＡライブラリーを構築する際に使用される各ファー
ジベクターについて関連するプラスミドと相関する。例えば、特定のクローンが
、ベクター「Ｌａｍｂｄａ Ｚａｐ」において単離されるように、表１において
同定される場合、対応する寄託クローンは「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ」内に存在
する。
【０５４４】
【表２】 ベクターＬａｍｂｄａ Ｚａｐ（米国特許第５，１２８，２５６号および同第
５，２８６，６３６号）、Ｕｎｉ−Ｚａｐ ＸＲ（米国特許第５，１２８，２５
６号および同第５，２８６，６３６号）、Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ（米国特許第
５，１２８，２５６号および同第５，２８６，６３６号）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ（ｐＢＳ）（Ｓｈｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：
７５８３−７６００（１９８８）；Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：９４９４（１９８９））およびｐＢＫ（Ａｌｔ
ｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、５：５８−６１（１９９２））は
、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、１１０
１１ Ｎ．Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，９
２０３７から市販されている。ｐＢＳはアンピシリン耐性遺伝子を含み、そして
ｐＢＫはネオマイシン耐性遺伝子を含む。両方の遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ
−１Ｂｌｕｅに形質転換され得、またＳｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能である
。ｐＢＳは、４形態（ＳＫ＋、ＳＫ−、ＫＳ＋およびＫＳ）で手に入る。Ｓおよ
びＫは、ポリリンカー領域に隣接するＴ７およびＴ３プライマー配列に対するポ
リリンカーの方向をいう（「Ｓ」はＳａｃＩについてであり、そして「Ｋ」はＫ
ｐｎＩについてであり、これらはリンカーのそれぞれの末端上の第１の部位に存
在する。「＋」または「−」とは、ｆ１複製起点（「ｏｒｉ」）の方向をいい、
その結果、一つの方向においてｆ１ ｏｒｉから開始される一本鎖のレスキュー
（ｒｅｓｃｕｅ）は、センス鎖ＤＮＡを生成し、そしてもう一方においては、ア
ンチセンス鎖を生成する。
【０５４５】 ベクターｐＳｐｏｒｔ１、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０およびｐＣＭＶＳＳｐｏ
ｒｔ３．０を、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐ．Ｏ．Ｂｏ
ｘ ６００９、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ ２０８９７より入手した。す
べてのＳｐｏｒｔベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏ
ｌｉ株ＤＨ１０Ｂに形質転換され得、またＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
より入手可能である。（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｃ．Ｅ．ら、Ｆｏｃｕｓ １５
：５９（１９９３）を参照のこと）。ベクターｌａｆｍｉｄ ＢＡ（Ｂｅｎｔｏ
Ｓｏａｒｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ）は、アンピ
シリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１Ｂｌｕｅに形質転換さ
れ得る。ベクターｐＣＲ（登録商標）２．１（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、
１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ ９２００
８より入手可能である）は、アンピシリン耐性遺伝子を含み、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉ株ＤＨ１０Ｂに形質転換され得、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入
手可能である。（例えば、Ｃｌａｒｋ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：
９６７７−９６８６（１９８８）およびＭｅａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ、９（１９９１）を参照のこと）。好ましくは、本発明のポリヌクレオチド
は、表１における特定のクローンについて同定されたファージベクター配列なら
びに上記の対応するプラスミドベクター配列を含まない。
【０５４６】 任意の所定のｃＤＮＡクローンに対して表１に列挙されるＡＴＣＣ寄託番号を
設定されたサンプルにおける寄託された材料はまた、一つ以上の付加的プラスミ
ドを含み得、各々は、所定のクローンと異なるｃＤＮＡクローンを含む。従って
、同じＡＴＣＣ寄託番号を共有する寄託物は、少なくとも表１において同定され
た各ｃＤＮＡクローンに対するプラスミドを含む。代表的に、表１に列挙される
各ＡＴＣＣ寄託サンプルは、およそ等量（重量で）の約５０プラスミドＤＮＡの
混合物を含み、各々は、異なるｃＤＮＡクローンを含むが、そのような寄託サン
プルは、およそ５０ｃＤＮＡクローンから約５００までのｃＤＮＡクローンに対
するプラスミドを含み得る。
【０５４７】 ２つのアプローチを使用して、表１のそのクローンに対して引用されるプラス
ミドＤＮＡの寄託サンプルから特定のクローンを単離し得る。第１に、プラスミ
ドは、配列番号Ｘに対応するポリヌクレオチドプローブを使用して、クローンを
スクリーニングすることにより直接単離され得る。
【０５４８】 詳細には、３０〜４０のヌクレオチドを有する特定のポリヌクレオチドは、報
告された配列に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＤＮＡ合成器
を使用して合成される。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｔ４ポリヌクレオチド
キナーゼを使用して、32Ｐ−γ−ＡＴＰを用いて標識され、そして慣用の方法に
従って精製される。（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、ＮＹ（１９８２））
。プラスミド混合物は、上記に示されるように（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、当業者において公知の技術（例えば、ベクターの供
給者によってか、または上記に引用される、関連する刊行物もしくは特許におい
て提供される技術）を使用して適切な宿主に形質転換される。この形質転換体を
、１プレートあたり約１５０の形質転換体（コロニー）密度まで、１．５％アガ
ープレート（適切な選択薬剤（例えば、アンピシリン）を含む）上にプレートす
る。これらのプレートは、Ｎｙｌｏｎ膜を使用し、細菌コロニースクリーニング
（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１．９３〜１．１
０４頁）についての慣用な方法または当業者に公知の他の技術に従ってスクリー
ニングされる。
【０５４９】 あるいは、配列番号Ｘの両端（すなわち、表１に定義されるクローンの５’Ｎ
Ｔおよび３’ＮＴによって囲まれる配列番号Ｘの領域内）に由来する、１７〜２
０ヌクレオチドの２つのプライマーを合成し、そしてこれらを使用して、寄託さ
れたｃＤＮＡプラスミドをテンプレートとして使用して、所望のｃＤＮＡを増幅
する。ポリメラーゼ連鎖反応を、慣用の条件下で、例えば、０．５μｇの上記ｃ
ＤＮＡテンプレートを有する反応混合物の２５μｌ中で実施する。便利な反応混
合物は、１．５〜５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、それぞ
れ２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、２５ｐｍｏｌの各プラ
イマーおよび０．２５ユニットのＴａｑポリメラーゼである。３５サイクルのＰ
ＣＲ（９４℃での変性を１分間；５５℃でのアニーリングを１分間；７２℃での
伸長を１分間）を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ自動化サーマルサイ
クラーを用いて実施する。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、そ
して予想される分子量のＤＮＡバンドを切り出し、そして精製する。ＰＣＲ産物
を、ＤＮＡ産物をサブクローニングおよび配列決定することによって選択された
配列であることを確認する。
【０５５０】 寄託されたクローンに存在しないかもしれない遺伝子の５’非コード部分また
は３’非コード部分の同定のために、いくつかの方法が利用可能である。これら
の方法は、以下を含むがこれらに限定されない：フィルタープローブ探索、特異
的プローブを使用するクローン濃縮、ならびに当該分野で周知である５’および
３’「ＲＡＣＥ」プロトコルと類似するかまたは同一のプロトコル。例えば、５
’ＲＡＣＥに類似する方法は、所望の全長転写物の失われた５’末端を生成する
ために利用可能である（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１（７）：１６８３−１６８４（１９９３））。
【０５５１】 簡潔には、特定のＲＮＡオリゴヌクレオチドを、全長遺伝子ＲＮＡ転写物をお
そらく含むＲＮＡの集団の５’末端に連結する。連結されたＲＮＡオリゴヌクレ
オチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子の公知の配列に特異的なプライ
マーを含む、プライマーセットを使用して、所望の全長遺伝子の５’部分をＰＣ
Ｒ増幅する。次いで、この増幅した産物を配列決定し得、そしてこれを使用して
全長遺伝子を生成し得る。
【０５５２】 この上記の方法は、所望の供給源から単離された総ＲＮＡを用いて開始するが
、ポリＡ＋ＲＮＡをも使用し得る。次いで、ＲＮＡ調製物を、必要ならばホスフ
ァターゼで処理して、後のＲＮＡリガーゼ工程を妨害し得る分解ＲＮＡまたは損
傷ＲＮＡ上の５’リン酸基を除去し得る。次いで、このホスファターゼを不活化
するべきであり、そしてこのＲＮＡを、メッセンジャーＲＮＡの５’末端に存在
するキャップ構造を除去するために、タバコ酸性ピロホスファターゼを用いて処
理するべきである。この反応は、キャップ切断ＲＮＡの５’末端に５’リン酸基
を残し、これは次いでＴ４ ＲＮＡリガーゼを用いてＲＮＡオリゴヌクレオチド
に連結され得る。
【０５５３】 この改変型ＲＮＡ調製物を、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドを用いる、第
一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして使用する。第一鎖合成反応物を、
連結されたＲＮＡオリゴヌクレオチドに特異的なプライマーおよび目的の遺伝子
の公知の配列に特異的なプライマーを用いる、所望の５’末端のＰＣＲ増幅のた
めのテンプレートとして使用する。次いで、得られた産物を配列決定し、そして
分析してその５’末端配列が所望の遺伝子に属することを確認する。
【０５５４】 （実施例２：ポリヌクレオチドに対応するゲノムクローンの単離） ヒトゲノムＰ１ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）
を、実施例１に記載される方法に従って、配列番号Ｘに対応するｃＤＮＡ配列に
ついて選択されたプライマーを用いるＰＣＲによってスクリーニングする（Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋらもまた参照のこと）。
【０５５５】 （実施例３：ポリペプチドの組織分布） 本発明のポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現の組織分布を、とりわけ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋらによって記載されたノーザンブロット分析についてのプロトコルを用
いて決定する。例えば、実施例１に記載される方法によって生成されるｃＤＮＡ
プローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、製造業者の指示に従って、32Ｐで標識す
る。標識後、このプローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）を使用して、製造業者の
プロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って精製する。次いで、精製した標識プロ
ーブを使用して、種々のヒト組織をｍＲＮＡ発現について試験する。
【０５５６】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリ
ダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、製造業者のプロトコル番号
ＰＴ１１９０−１に従って、標識プローブで試験する。ハイブリダイゼーション
および洗浄後、このブロットをマウントして、そして−７０℃で一晩フィルムに
曝露し、そしてこのフィルムを標準的な手順に従って現像する。
【０５５７】 （実施例４：ポリヌクレオチドの染色体マッピング） オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、配列番号Ｘの５’末端の配列に従
って設計する。このプライマーは、好ましくは約１００ヌクレオチドにわたる。
次いで、このプライマーセットを、以下のセットの条件下でポリメラーゼ連鎖反
応に使用する：９５℃で３０秒；５６℃で１分；７０℃で１分。このサイクルを
３２回反復し、次いで１回、７０℃で５分間のサイクルを行う。個々の染色体ま
たは染色体フラグメントを含む体細胞ハイブリッドパネル（Ｂｉｏｓ，Ｉｎｃ）
に加えて、ヒト、マウス、およびハムスターのＤＮＡを鋳型として使用する。反
応物を、８％ポリアクリルアミドゲルまたは３．５％アガロースゲルのいずれか
で分析する。染色体マッピングを、特定の体細胞ハイブリッドにおける約１００
ｂｐのＰＣＲフラグメントの存在によって決定する。
【０５５８】 （実施例５：ポリペプチドの細菌性発現） 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、実施例１に概説する
ように、ＤＮＡ配列の５’末端および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して増幅して、挿入フラグメントを合成する。ｃＤＮＡ挿
入物を増幅するために使用されるプライマーは好ましくは、発現ベクターに増幅
産物をクローニングするために、必要に応じて、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよび開
始／停止コドンのような制限部位を含むべきである。例えば、ＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−９上の制限酵素部位に対応する。（Ｑｉ
ａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）。このプラスミドベクター
は、抗生物質耐性（Ａｍｐr）、細菌の複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧで調節可
能なプロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、
６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコード
する。
【０５５９】 ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして増幅された
フラグメントを、細菌性ＲＢＳにおいて開始されるリーディングフレームを維持
しながら、ｐＱＥ−９ベクターに連結する。次いで連結混合物を、ｌａｃＩリプ
レッサーを発現し、またカナマイシン耐性（Ｋａｎr）を与えるプラスミドｐＲ
ＥＰ４の多重コピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４（Ｑｉａｇｅｎ，
Ｉｎｃ．）を形質転換するために使用する。形質転換体を、それらがＬＢプレー
ト上で増殖する能力によって同定し、そしてアンピシリン／カナマイシン耐性コ
ロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、そして制限分析によって確認す
る。
【０５６０】 所望の構築物を含むクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（
２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一晩（Ｏ／Ｎ）
増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を、１：１００〜１：２５０の比で大量培養に接種す
るために使用する。この細胞を、０．４と０．６との間の光学密度６００（Ｏ．
Ｄ．600）まで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド）を最終濃度１ｍＭになるように加える。ＩＰＴＧは、ｌａｃ
Ｉリプレッサーの不活化によりＰ／Ｏの障害物除去（ｃｌｅａｒｉｎｇ）を誘導
し、遺伝子発現の増加を導く。
【０５６１】 細胞を、さらに３〜４時間増殖させる。次いで、細胞を遠心分離（６０００×
ｇで２０分間）によって収集する。細胞ペレットを、カオトロピック剤である６
Ｍ塩酸グアニジン中に、４℃で３〜４時間攪拌することによって可溶化させる。
細胞細片を遠心分離によって取り除き、そしてタンパク質を含む上清を、ニッケ
ル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡ
ＧＥＮ，Ｉｎｃ．前出から入手可能）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有するタ
ンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして単純な１工程手順
で精製され得る（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ
（１９９５）ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出を参照のこと）。
【０５６２】 手短に言えば、上清を、６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ８）のカラムにロードし、
このカラムを、最初に１０容量の６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ８）で洗浄し、次い
で１０容量の６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ６）で洗浄し、最後にポリペプチドを、
６Ｍ塩酸グアニジン（ｐＨ５）で溶出する。
【０５６３】 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５
０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透
析することにより再生させる。あるいは、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラムに固
定化されている間に、首尾よく再折畳みされ得る。推奨条件は以下の通りである
：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロー
ル、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中の６Ｍ〜１Ｍの尿素の直線勾
配を使用する再生。再生は１．５時間以上の時間をかけて行うべきである。再生
後、タンパク質を２５０ｍＭ イミダゾールの添加によって溶出させる。イミダ
ゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）の緩衝液＋２００
ｍＭ ＮａＣｌに対する最終の透析工程によって除去する。精製したタンパク質
を、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍する。
【０５６４】 上記の発現ベクターに加えて、本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドに
作動可能に連結された、ファージのオペレーターエレメントおよびプロモーター
エレメントを含む、ｐＨＥ４ａと呼ばれる発現ベクターを含む。ｐＨＥ４ａベク
ターはＡＴＣＣ受託番号２０９６４５を有し、そして１９９８年２月２５日に寄
託された。このベクターは以下を含む：１）選択マーカーとしてのネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２）Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、３）Ｔ５ファー
ジプロモーター配列、４）２つのｌａｃオペレーター配列、５）シャイン−ダル
ガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）
。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）に由来する。プロモーター配列およびオペレーター配列は合成的に作製さ
れる。
【０５６５】 ＤＮＡを、ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１
８でベクターを制限処理し、制限処理された産物をゲル上で泳動し、そしてより
大きなフラグメント（そのスタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）フラグメントは、約
３１０塩基対であるべきである）を単離することによってｐＨＥａベクターの中
へ挿入し得る。このＤＮＡインサートを、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸ
ｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩまたはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する
制限部位を有するＰＣＲプライマーを使用して、実施例１に記載されるＰＣＲプ
ロトコルに従って生成する。このＰＣＲインサートを、ゲル精製し、そして適合
性酵素を用いて制限処理される。そのインサートおよびベクターを標準的なプロ
トコルに従って連結する。
【０５６６】 上記のプロトコールにおいて、操作されたベクターを、細菌系でタンパク質を
発現させるために容易に置換し得る。
【０５６７】 （実施例６：封入体からのポリペプチドの精製） 以下の代替法は、ポリペプチドが封入体の形態で存在する場合に、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ中で発現されたポリペプチドを精製するために使用され得る。他に指定されな
い場合には、以下のすべての工程は４〜１０℃で行われる。
【０５６８】 Ｅ．ｃｏｌｉ発酵の生産期の完了後、細胞培養物を４〜１０℃に冷却し、そし
て１５，０００ｒｐｍでの連続遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）
によって細胞を採集する。細胞ペーストの単位重量あたりのタンパク質の予想さ
れる収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて、細胞ペーストの適
切な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７
．４）を含む緩衝溶液に懸濁させる。細胞を、高剪断ミキサーを使用して均質な
懸濁液へと分散させる。
【０５６９】 次いで、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃ
ｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｃｏｒｐ．またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．）に
２回、４０００〜６０００ｐｓｉでこの溶液を通すことによって細胞を溶解させ
る。次いでホモジネートを、最終濃度０．５Ｍ ＮａＣｌになるようにＮａＣｌ
溶液と混合し、続いて７０００×ｇで１５分間遠心分離を行う。得られたペレッ
トを、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
７．４）を使用して再度洗浄する。
【０５７０】 得られた洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化させる。７０００×ｇで１５分間の遠心分離の後、ペレットを廃棄
し、そしてポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベートしてさらなるＧ
ｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０５７１】 不溶性粒子を除去するための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）に続き、この
ＧｕＨＣｌ抽出物と、５０ｍＭ ナトリウム（ｐＨ４．５）、１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０容量の緩衝液とを、激しく攪拌して迅速に混
合することによって、ＧｕＨＣｌ可溶化タンパク質を再折り畳みさせる。この再
折り畳みした希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合し
ないで４℃で保つ。
【０５７２】 再折り畳みされたポリペプチド溶液を清澄化にするために、４０ｍＭ 酢酸ナ
トリウム（ｐＨ６．０）で平衡化した、適切な表面積を有する０．１６μｍメン
ブレンフィルターを備える、あらかじめ準備した接線濾過ユニット（例えば、Ｆ
ｉｌｔｒｏｎ）を使用する。濾過したサンプルを、カチオン交換樹脂（例えば、
Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に
ロードする。カラムを４０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で洗浄し、そし
て同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、および１５００ｍＭ
のＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を
、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさら
に分析する。
【０５７３】 次いで、このポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量の水と混合す
る。次いで希釈されたサンプルを、あらかじめ準備した強アニオン交換樹脂（Ｐ
ｏｒｏｓ ＨＱ−５０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および
弱アニオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０，Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）の直列カラムのセット上にロードする。これらのカラムを４０
ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で平衡化する。両方のカラムを、４０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。次いでＣ
Ｍ−２０カラムを、１０カラム容量の直線勾配（０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ 酢酸ナト
リウム（ｐＨ６．５）の範囲）を用いて溶出させる。画分を、溶出液の定常Ａ28 0 モニタリング下で収集する。次いで、（例えば、１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって判明した）ポリペプチドを含む画分をプールする。
【０５７４】 この得られたポリペプチドは、上記の再折り畳み工程および精製工程の後で、
９５％より高い純度を示すはずである。５μｇの精製タンパク質がロードされる
場合、クマシーブルー染色した１６％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、いかなる主
な夾雑バンドも観察されないはずである。この精製タンパク質はまた、内毒素／
ＬＰＳ混入について試験され得、そして代表的には、ＬＡＬアッセイによって、
ＬＰＳ含量は０．１ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０５７５】 （実施例７：バキュロウイルス発現系におけるポリペプチドのクローニング
および発現） この実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を使用して、ポリヌ
クレオチドをバキュロウイルスに挿入し、ポリペプチドを発現する。この発現ベ
クターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多核体ウイルス（
ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてＢａｍＨＩ、Ｘｂａ
Ｉ、およびＡｓｐ７１８のような簡便な制限部位を含む。シミアンウイルス４０
（「ＳＶ４０」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために使
用する。組換えウイルスの容易な選択のために、このプラスミドは、同方向の弱
いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子、続いてポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含
む。挿入された遺伝子は、クローン化したポリヌクレオチドを発現する生存可能
なウイルスを生成する、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性の相同組換えのた
めのウイルス配列と両方の側で隣接する。
【０５７６】 他の多くのバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１
、およびｐＡｃＩＭ１）は、当業者が容易に理解するように、構築物が転写、翻
訳、分泌などのために適切に配置されたシグナル（必要とされる場合、シグナル
ペプチドおよびインフレームなＡＵＧを含む）を提供する限りにおいて、上記の
ベクターの代わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏ
ｗら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）に記載される。
【０５７７】 具体的には、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡ配列を、適切な制限部位
および開始コドン／終止コドンを含むプライマーを用いて、実施例１に記載され
るＰＣＲプロトコルを使用して増幅させる。天然に存在するシグナル配列を使用
して分泌タンパク質を産生する場合、ｐＡ２ベクターは第２のシグナルペプチド
を必要としない。あるいは、Ｓｕｍｍｅｒｓら、「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉ
ｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」、Ｔｅｘａｓ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂ
ｕｌｌｅｔｉｎ ＮＯ．：１５５５（１９８７）に記載される標準的な方法を用
いて、このベクターを、バキュロウイルスリーダー配列を含むように改変し得る
（ｐＡ２ＧＰ）。
【０５７８】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロース
ゲルから単離する。次いで、このフラグメントを適切な制限酵素で消化し、そし
て再び１％アガロースゲル上で精製する。
【０５７９】 このプラスミドを対応する制限酵素で消化し、そして必要に応じて、当該分野
で公知の慣用の手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸し得る
。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０５８０】 このフラグメントおよび脱リン酸したプラスミドを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを
用いて互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合液で形質転換
し、そして培養プレート上に拡げる。このプラスミドを含む細菌を、個々のコロ
ニー由来のＤＮＡを消化し、そしてゲル電気泳動によって消化産物を分析するこ
とにより同定する。クローニングしたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定に
よって確認する。
【０５８１】 このポリヌクレオチドを含む５μｇのプラスミドを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９
８７）によって記載されたリポフェクション法を使用して、１．０μｇの市販の
線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｕｓ ＤＮＡ」，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時
トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ウイルスＤＮＡおよ
び５μｇのプラスミドを、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含む、マイ
クロタイタープレートの滅菌したウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポ
フェクチンおよび９０μｌグレース培地を加え、混合し、そして室温で１５分間
インキュベートする。次いで、トランスフェクション混合液を、無血清のグレー
ス培地１ｍｌを加えた３５ｍｍ組織培養プレートに播種したＳｆ９昆虫細胞（Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下する。次いで、このプレートを２７℃で５時
間インキュベートする。次いで、トランスフェクション溶液をこのプレートから
除去し、そして１０％ウシ胎仔血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加
する。次いで、培養を２７℃で４日間継続する。
【０５８２】 ４日後上清を収集し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によっ
て記載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を含むア
ガロースゲルを使用して、ｇａｌが発現しているクローン（青色に染色したプラ
ークを生ずる）の容易な同定および単離を可能にする。（この型の「プラークア
ッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．
，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，９−１０頁によって頒布される、昆虫細胞培養お
よびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの中に見出され得る）。適切なイ
ンキュベーションの後、青色に染色したプラークを、マイクロピペッターのチッ
プ（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天
を、２００μｌのグレース培地を含む微小遠心分離チューブ中で再懸濁させ、そ
して組換えバキュロウイルスを含む懸濁液を使用して、３５ｍｍディッシュに播
種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を採集
し、次いで４℃に貯蔵する。
【０５８３】 ポリペプチドの発現を確認するために、１０％熱非働化ＦＢＳを補充したグレ
ース培地中で、Ｓｆ９細胞を増殖させる。この細胞を、約２の感染多重度（「Ｍ
ＯＩ」）で、このポリヌクレオチドを含む組換えバキュロウイルスで感染させる
。放射性標識したタンパク質を所望する場合には、６時間後に培地を除去し、そ
してメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手
可能）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉ
の35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさら
に１６時間インキュベートし、次いで遠心分離によって採集する。上清中のタン
パク質ならびに細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、次いでオート
ラジオグラフィーによって（放射性標識した場合）分析する。
【０５８４】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定法を使用して、産
生されたタンパク質のアミノ末端配列を決定し得る。
【０５８５】 （実施例８：哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現） 本発明のポリペプチドを、哺乳動物細胞において発現させ得る。代表的な哺乳
動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント
、タンパク質コード配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に必
要なシグナルを含む。さらなるエレメントは、エンハンサー、コザック（Ｋｏｚ
ａｋ）配列、ならびに、ＲＮＡスプライシングのためのドナー部位およびアクセ
プター部位に隣接する介在配列を含む。非常に効率的な転写は、ＳＶ４０由来の
初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えばＲＳＶ、ＨＴＬＶ Ｉ、
ＨＩＶ Ｉ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）の初期プロモーターを用いて達成される。しかし、細胞内エレメント（例え
ば、ヒトアクチンプロモーター）もまた、使用され得る。
【０５８６】 本発明を実施する際の使用に適切な発現ベクターは、例えば、ｐＳＶＬおよび
ｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃ
ａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、
ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ２．０、ならび
にｐＣＭＶＳｐｏｒｔ３．０のようなベクターを含む。使用され得る哺乳動物宿
主細胞としては、ヒトのＨｅｌａ細胞、２９３細胞、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａ
ｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ １細胞、Ｃｏ
ｓ ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、およ
びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。
【０５８７】 あるいは、ポリペプチドは、染色体に組み込まれたポリヌクレオチドを含む、
安定な細胞株中で発現され得る。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイグロマ
イシンのような選択可能なマーカーを用いる同時トランスフェクションは、トラ
ンスフェクトされた細胞の同定および単離を可能にする。
【０５８８】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、大量のコードされたタンパク質を発現
するために増幅され得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、
目的の遺伝子の数百または数千さえものコピーを有する細胞株の開発に有用であ
る（例えば、Ａｌｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０
（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ、１０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、９：６４−６８（１９９１）を参照のこと）。別の有用な選択マー
カーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６９−１７５（１９９２））。これら
のマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、そしてもっとも
高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体に組み込まれた、
増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細
胞は、タンパク質の産生のためにしばしば使用される。
【０５８９】 プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）の誘導体であ
る、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴ
ＣＣ受託番号２０９６４７）は、ラウス肉腫ウイルス（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（
１９８５年３月））の強力なプロモーター（ＬＴＲ）、およびＣＭＶ−エンハン
サー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））の
フラグメントを含む。例えば、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８の制
限酵素切断部位を有するマルチプルクローニングサイトは、目的の遺伝子のクロ
ーニングを容易にする。このベクターはまた、３’イントロン、ラットプレプロ
インスリン遺伝子のポリアデニル化シグナルおよび終結シグナル、ならびに、Ｓ
Ｖ４０初期プロモーターの制御下にあるマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。
【０５９０】 具体的には、例えば、プラスミドｐＣ６は、適切な制限酵素を用いて消化され
、次いで当該分野で公知の手順によって、仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ）を使用して脱リン酸する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルか
ら単離する。
【０５９１】 本発明のポリヌクレオチドは、必要であれば、適切な制限部位および開始コド
ン／終止コドンを有するプライマーを使用して、実施例１に概説するプロトコル
に従って増幅される。分泌のために必要であれば、このベクターは異種シグナル
配列を含むように改変され得る（例えば、ＷＯ９６／３４８９１を参照のこと）
。
【０５９２】 増幅フラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ １０
１ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲルか
ら単離する。次いで、このフラグメントを、適切な制限酵素で消化し、そして再
び１％アガロースゲルで精製する。
【０５９３】 次いで、増幅フラグメントを同じ制限酵素で消化し、そして１％アガロースゲ
ルで精製する。次いで、単離されたフラグメントおよび脱リン酸したベクターを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞ま
たはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そしてプラスミドｐＣ６に挿入され
たフラグメントを含む細菌を、例えば、制限酵素分析を用いて同定する。
【０５９４】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ６を、リポフェクチン
を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと同時トランスフェクトする（
Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優性で選択可能な
マーカーであるところの、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対する耐性を付与する
酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌ
のＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、この細胞をトリプ
シン処理し、そして１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよ
び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクロ
ーニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に播種する。約１０〜
１４日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキ
サート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用
して、６ウェルのペトリ皿または１０ｍｌのフラスコに播種する。次いで、最高
濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、さらに高い濃度のメトトレキサ
ート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含む新たな６ウェルプ
レートに移す。同じ手順を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得
られるまで繰り返す。所望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥお
よびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０５９５】 （実施例９：タンパク質融合物） 本発明のポリぺプチドは、好ましくは、他のタンパク質に融合される。これら
の融合タンパク質は、種々の適用に使用され得る。例えば、本発明のポリぺプチ
ドの、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトー
ス結合タンパク質への融合は、精製を容易にする（実施例５を参照のこと；ＥＰ
Ａ ３９４，８２７もまた参照のこと；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒ
ｅ、３３１：８４−８６（１９８８））。このポリペプチドはまた、分泌および
細胞内輸送を容易にするために、異種ポリペプチド配列（例えば、ＫＤＥＬ）に
融合され得る。さらに、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−３、およびアルブミンへの融合は
、インビボでの半減期を増大させる。本発明のポリぺプチドに融合した核局在化
シグナルは、タンパク質を特定の細胞内局在に標的化し得る。一方、共有結合ヘ
テロ二量体またはホモ二量体は、融合タンパク質の活性を増大または減少させ得
る。融合タンパク質はまた、１つより多い機能を有するキメラ分子を作製し得る
。最後に、融合タンパク質は、非融合タンパク質と比較して、融合タンパク質の
可溶性および／または安定性を増大させ得る。上記の融合タンパク質の全ての型
は、ＩｇＧ分子へのポリぺプチドの融合を概説する以下のプロトコル、または実
施例５に記載されるプロトコルを改変することによって作製され得る。
【０５９６】 簡単には、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載の配列の５’末端および
３’末端にわたるプライマーを使用してＰＣＲ増幅され得る。これらのプライマ
ーはまた、発現ベクター（好ましくは、哺乳動物発現ベクター）へのクローニン
グを容易にする都合の良い制限酵素部位、および、必要であれば、開始コドン／
終止コドンを有するべきである。
【０５９７】 例えば、ｐＣ４（受託番号２０９６４６）が使用される場合、ヒトＦｃ部分は
、ＢａｍＨＩクローニング部位に連結され得る。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊され
るべきであることに注意のこと。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターが、Ｂ
ａｍＨＩを用いて再び制限され、ベクターを線状化し、そして実施例１に記載さ
れるＰＣＲプロトコルによって単離された本発明のポリヌクレオチドが、このＢ
ａｍＨＩ部位に連結される。ポリヌクレオチドは、終止コドンなしにクローニン
グされ、そうでなければ、融合タンパク質は産生されないことに注意すること。
【０５９８】 天然に存在するシグナル配列が分泌タンパク質を産生するために使用される場
合、ｐＣ４は、第２のシグナルペプチドを必要としない。あるいは、天然に存在
するシグナル配列が使用されない場合、ベクターは、異種シグナル配列を含むよ
うに改変され得る（例えば、ＷＯ ９６／３４８９１を参照のこと）。
【０５９９】
【化４】 （実施例１０：ポリペプチドの処方） ポリペプチド組成物を、個々の患者の臨床状態（特に、分泌ポリペプチドを単
独で用いる処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知
の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ｇｏｏｄ ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒａｃ
ｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目
的とする「有効量」は、このような考慮によって決定される。
【０６００】 一般的提案として、用量当り、非経口的に投与されるポリペプチドの合計薬学
的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあ
るが、上記のように、これは治療的裁量に委ねられる。より好ましくは、このホ
ルモンについて、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そして最も
好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／日との間で
ある。連続投与する場合、代表的には、ポリペプチドを、約１μｇ／ｋｇ／時間
〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下
注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ
溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置の長さおよび応答が生
じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０６０１】 本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、槽
内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、
ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔ス
プレーとして投与する。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、
半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤をい
う。本明細書で用いる場合、用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、
胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６０２】 このポリペプチドはまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性組
成物の適切な例としては、成形品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプ
セル）の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスとしては
、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−
グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ
ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２
−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍ
ａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃ
ｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテ
ート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（Ｅ
Ｐ１３３，９８８）が挙げられる。徐放性組成物はまた、リポソームに封入され
たポリペプチドを包含する。分泌ポリペプチドを含有するリポソームは、それ自
体が公知である方法により調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６
９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ、７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，
６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国
特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第
４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、
小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、
約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された比率が、最適な分泌ポリペ
プチド治療のために調整される。
【０６０３】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、ポリペプチドは、そ
れを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち用いる投薬量
および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合す
るキャリア）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で
混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、
およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まな
い。
【０６０４】 一般に、ポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはそ
の両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、
生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア
、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャ
リアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロー
ス溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒク
ルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０６０５】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖
類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトール
またはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；およ
び／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界
面活性剤が挙げられる。
【０６０６】 ポリペプチドは、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好まし
くは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に
処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することによ
り、ポリペプチド塩が形成されることが理解される。
【０６０７】 治療的投与に用いられる任意のポリペプチドは無菌状態であり得る。滅菌濾過
膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）を通す濾過により無菌状態は容易に達成
される。一般に、治療ポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容器
、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたは
バイアルに配置される。
【０６０８】 ポリペプチドは、通常、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプ
ルまたはバイアルに、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として貯蔵さ
れる。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（
ｗ／ｖ）ポリペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥
する。凍結乾燥したポリペプチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液
を調製する。
【０６０９】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関
する政府機関による承認を表す。さらに、本発明のポリペプチドを他の治療用化
合物と組み合わせて使用し得る。
【０６１０】 （実施例１１：ポリペプチドのレベル低下を処置する方法） 個体におけるポリペプチドの標準または正常発現レベルの低下により引き起こ
される状態は、本発明のポリペプチドを、好ましくは分泌形態および／または可
溶性形態で投与することにより処置し得ることが理解される。従って、本発明は
また、ポリペプチドのレベルの増加が必要な個体の処置方法を提供する。この方
法は、このような個体に、このような個体でポリペプチドの活性レベルを増加さ
せる量のポリペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。
【０６１１】 例えば、ポリペプチドのレベルが低下した患者は、ポリペプチドを、１日用量
０．１〜１００μｇ／ｋｇで６日続けて服用する。好ましくは、ポリペプチドは
分泌形態である。投与および処方物に基づく投薬計画の正確な詳細は、実施例１
０に提供されている。
【０６１２】 （実施例１２：ポリペプチドのレベル上昇を処置する方法） アンチセンス技術を使用して本発明のポリペプチドの産生を阻害する。この技
術は、ガンのような様々な病因に起因するポリペプチド、好ましくは分泌形態の
ポリペプチドのレベルを低下させる方法の１つの例である。
【０６１３】 例えば、ポリペプチドのレベルが異常に上昇したと診断された患者に、アンチ
センスポリヌクレオチドを、０．５、１．０、１．５、２．０および３．０ｍｇ
／ｋｇ／日で静脈内に２１日間投与する。この処置に対して十分な耐性があれば
、７日間の休薬期間後に、この処置を繰り返す。アンチセンスポリヌクレオチド
の処方は、実施例１０に提供されている。
【０６１４】 （実施例１３：遺伝子治療を使用する処置方法−エキソビボ） 遺伝子治療の１つの方法は、ポリペプチドを発現し得る線維芽細胞を患者に移
植する。一般に、線維芽細胞は、皮膚生検により被験者から得られる。得られた
組織を組織培養培地中に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラス
コの湿潤表面に置き、約１０片を各フラスコ中に置く。このフラスコを倒置し、
しっかりと閉め、そして室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコを反
転させ、組織塊をフラスコの底に固定させたままにし、そして新鮮培地（例えば
、１０％ＦＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１
２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０６１５】 この時点で、新鮮培地を添加し、次いで数日ごとに取り換える。さらに二週間
培養した後に単層の線維芽細胞が出現する。単層をトリプシン処理し、さらに大
きなフラスコにスケールアップする。
【０６１６】 Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルスの長末端反復が隣接するｐＭＶ−７（Ｋｉ
ｒｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｐ．Ｔ．ら、ＤＮＡ，７：２１９−２５（１９８８））を
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、仔ウシ腸ホスファターゼで処理
する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを使用して
精製する。
【０６１７】 本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、必要な場合、プライマーを用
いそして適切な制限部位および開始／終止コドンを有する、実施例１に記載の５
’および３’末端配列にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーを使用して増幅し得
る。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、そして３’プライマ
ーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量の、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス線
状骨格および増幅したＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に加える。得られた混合物を二つのフラグメント
を連結するのに適した条件下で維持する。次に、連結混合物を使用し、細菌ＨＢ
１０１を形質転換する。次に、それを、カナマイシンを含む寒天上にプレーティ
ングし、ベクターが正確に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する。
【０６１８】 アンフォトロピックｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を、
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むＤｕｌ
ｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中、組織培養でコンフルエントな
密度まで増殖させる。次に、遺伝子を含むＭＳＶベクターを培地に加え、そして
パッケージング細胞にベクターを形質導入する。このとき、パッケージング細胞
は遺伝子を含む感染性ウイルス粒子を産生する（ここで、パッケージング細胞を
プロデューサー細胞という）。
【０６１９】 形質導入されたプロデューサー細胞に新鮮培地を添加し、次いで培地をコンフ
ルエントなプロデューサー細胞の１０ｃｍプレートから採取する。感染性ウイル
ス粒子を含む使用済み培地を、ミリポアーフィルターを通して濾過し、はがれた
プロデューサー細胞を除去した後、この培地を使用して、線維芽細胞を感染させ
る。線維芽細胞のサブコンフルエントなプレートから培地を除去し、そしてプロ
デューサー細胞からの培地で速やかに置き換える。この培地を除去し、そして新
鮮培地と置き換える。ウイルスの力価が高ければ、実質的にすべての線維芽細胞
が感染され、選択は必要ではない。力価が非常に低ければ、ｎｅｏまたはｈｉｓ
のような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用することが必要で
ある。一旦、線維芽細胞が効率的に感染したなら、線維芽細胞を分析し、タンパ
ク質が産生されているか否かを決定する。
【０６２０】 次に、操作された線維芽細胞を、単独で、またはサイトデックス３マイクロキ
ャリアビーズ上でコンフルエントに増殖させた後のいずれかで宿主に移植する。
【０６２１】 （実施例１４：内因性Ｓｅｒｐｉｎ遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、内因性Ｓｅｒｐｉｎ配列を、例えば、
米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日公布）；国際公開第Ｗ
Ｏ ９６／２９４１１号（１９９６年９月２６日公開）；国際公開第ＷＯ ９４
／１２６５０号（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５（１９８９）；お
よびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４３８（１９８９）
に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動可能に結合する工
程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、その細胞中で発現さ
れないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、遺伝子の活性化を包
含する。
【０６２２】 プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオチド構築物を作製する。こ
の標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性Ｓｅｒｐｉｎの５’非コード配
列に相同である。この標的化配列は、Ｓｅｒｐｉｎの５’末端に十分に近く、そ
の結果、このプロモーターは、相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連
結される。このプロモーターおよび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る
。好ましくは、この増幅したプロモーターは、５’末端および３’末端上に異な
る制限酵素部位を含む。好ましくは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅した
プロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の
５’末端は、増幅したプロモーターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０６２３】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０６２４】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０６２５】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが、このプロモーターで生
じて、この内因性Ｓｅｒｐｉｎ配列に作動可能に連結される。これは、この細胞
中におけるＳｅｒｐｉｎの発現を生じる。発現は、免疫学的染色または当該分野
で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０６２６】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％胎仔ウシ血清中に配置する。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を
、トリプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細
胞懸濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離
に供する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩
衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この
細胞を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミ
ン１ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細
胞懸濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸
濁直後に実施すべきである。
【０６２７】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、Ｓｅｒｐｉｎ遺
伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミドｐＵＣ１８
（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄＩＩＩで消
化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａ
ｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのＳｅｒｐｉｎ非コード配列を
ＰＣＲを介して増幅する：一方のＳｅｒｐｉｎ非コード配列（Ｓｅｒｐｉｎフラ
グメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位および３’末端にＸｂａ部位を
備えて増幅する；他方のＳｅｒｐｉｎ非コード配列（Ｓｅｒｐｉｎフラグメント
２）を、５’末端にＢａｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備え
て増幅する。このＣＭＶプロモーターおよびＳｅｒｐｉｎフラグメントを、適切
な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；Ｓｅｒｐｉｎフラグ
メント１−ＸｂａＩ；Ｓｅｒｐｉｎフラグメント２−ＢａｍＨＩ）で消化し、そ
してともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてＨｉ
ｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結する。
【０６２８】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。容量および電圧を、それぞれ、９６０μ
Ｆおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生存が減少す
るが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割合が劇的に
増加する。これらのパラメーターを与えると、パルス時間約１４〜２０ｍＳｅｃ
が観察されるはずである。
【０６２９】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０６３０】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
３マイクロキャリアビーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいず
れかで、注入する。ここで、この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次
いで、この線維芽細胞を、上記のような患者に導入し得る。
【０６３１】 （実施例１５：遺伝子治療を使用する処置方法−インビボ） 本発明の別の局面は、障害、疾患、および状態を処置するためにインビボ遺伝
子治療方法を使用することである。この遺伝子治療法は、Ｓｅｒｐｉｎポリペプ
チドの発現を増大または減少させるための、動物への裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ
、およびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）Ｓｅｒｐｉｎ配列の導入に関する。
Ｓｅｒｐｉｎポリヌクレオチドは、プロモーター、または標的組織によるＳｅｒ
ｐｉｎポリペプチドの発現に必要な任意の他の遺伝子エレメントに、作動可能に
連結され得る。このような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当該分野
で公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９８／１１７７９；米国特
許第５６９３６２２号、同第５７０５１５１号、同第５５８０８５９号；Ｔａｂ
ａｔａら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５（３）：４７０−４７９（１９
９７）；Ｃｈａｏ Ｊら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．３５（６）：５１７−
５２２（１９９７）；Ｗｏｌｆｆ、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７
（５）：３１４−３１８（１９９７）、Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６）；Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙら、Ｃｉｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６）（本明細書
中に参考として援用される）を参照のこと。
【０６３２】 Ｓｅｒｐｉｎポリヌクレオチド構築物は、注入可能な物質を動物の細胞に送達
する任意の方法（例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間隙
空間への注入）によって送達され得る。Ｓｅｒｐｉｎポリヌクレオチド構築物は
、薬学的に受容可能な液体または水性キャリア中で送達され得る。
【０６３３】 用語「裸の」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡは、細胞への侵入を補助
、促進、または容易にするように作用するいかなる送達ビヒクル（ウイルス配列
、ウイルス粒子、リポソーム処方物、リポフェクチン、または沈澱剤などを含む
）も含まない配列をいう。しかし、Ｓｅｒｐｉｎポリヌクレオチドはまた、当業
者に周知の方法によって調製され得るリポソーム処方物（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒら、Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：１２６−１３９（１９９５）
およびＡｂｄａｌｌａｈら、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７（１９９
５）で教示されたもの）中で送達され得る。
【０６３４】 この遺伝子治療方法において使用されるＳｅｒｐｉｎポリヌクレオチドベクタ
ー構築物は、好ましくは、宿主ゲノムに組み込まれず、複製を可能にする配列も
含まない構築物である。当業者に公知の任意の強力なプロモーターが、ＤＮＡの
発現を駆動するために用いられ得る。他の遺伝子治療技術とは異なり、裸の核酸
配列を標的細胞に導入する１つの主要な利点は、その細胞におけるポリヌクレオ
チド合成の一過性の性質である。研究によって、非複製ＤＮＡ配列が細胞に導入
されて、６ヶ月までの間の期間、所望のポリペプチドの産生を提供し得ることが
示された。
【０６３５】 このポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織（筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、
脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸
、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織を包含する）の間
隙空間に送達され得る。この組織の間隙空間は、細胞間液、ムコ多糖基質（器官
組織の細網線維、血管または腔（ｃｈａｍｂｅｒ）の壁における弾性線維、線維
性組織のコラーゲン線維間にある）、あるいは結合組織鞘性筋肉細胞内または骨
の裂孔中の同じ基質を包含する。これは、同様に、循環の血漿およびリンパチャ
ンネルのリンパ液により占められた空間である。筋肉組織の間隙空間への送達は
、以下に考察する理由のために好ましい。それらは、これらの細胞を含む組織へ
の注入によって、好都合に送達され得る。それらは、好ましくは、分化した持続
性の非分裂細胞に送達され、そしてその細胞において発現されるが、送達および
発現は、非分化細胞または完全には分化していない細胞（例えば、血液の幹細胞
または皮膚線維芽細胞）において達成され得る。インビボで、筋肉細胞は、ポリ
ヌクレオチドを取り込み、そして発現するそれらの能力において、特に適格であ
る。
【０６３６】 裸のセルピンポリヌクレオチド注入のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投薬
量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にある。好まし
くは、この投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇであり、そ
してより好ましくは、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇである。もちろ
ん、当業者が認識するように、この投薬量は、注入の組織部位に従って変化する
。核酸配列の適切かつ有効な投薬量は、当業者によって容易に決定され得、そし
て処置される状態および投与経路に依存し得る。好ましい投与経路は、組織の間
隙空間への非経口注入経路によってである。しかし、他の非経口経路もまた用い
られ得、これには、例えば、特に肺または気管支組織、咽喉、または鼻の粘膜へ
の送達のためのエアロゾル処方物の吸入が挙げられる。さらに、裸のセルピンポ
リヌクレオチド構築物が、血管形成術の間に、この手順において用いられるカテ
ーテルによって動脈に送達され得る。
【０６３７】 インビボでの筋肉における注入セルピンポリヌクレオチドの用量応答効果を、
以下のようにして決定する。セルピンポリペプチドをコードするｍＲＮＡの生成
のための適切なセルピン鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ方法論に従って調
製する。鋳型ＤＮＡ（これは環状または線状のいずれかであり得る）を裸のＤＮ
Ａとして使用するか、またはリポソームと複合体化するかのいずれかである。次
いで、マウスの四頭筋に、種々の量の鋳型ＤＮＡを注入する。
【０６３８】 ５〜６週齢の雌性および雄性のＢａｌｂ／Ｃマウスに、０．３ｍｌの２．５％
Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより麻酔する。１．５ｃｍの切開を大腿
前部で行い、そして四頭筋を直接可視化する。セルピン鋳型ＤＮＡを、０．１ｍ
ｌのキャリアに入れて、１ｃｃ注射器で２７ゲージ針を通して１分間にわたって
、筋肉の遠位挿入部位から約０．５ｃｍのところで膝に、約０．２ｃｍの深さで
注入する。縫合を、将来の位置決定のために注入部位の上に配置し、そしてその
皮膚をステンレス鋼クリップで閉じる。
【０６３９】 適切なインキュベーション時間（例えば、７日）後、筋肉抽出物を、四頭全体
を切り出すことによって調製する。個々の四頭筋の５枚毎の１５μｍ切片を、セ
ルピンタンパク質発現について組織化学的に染色する。セルピンタンパク質発現
についてのタイムコースを、異なるマウスからの四頭を異なる時間で採取するこ
と以外は、同様な様式で行い得る。注入後の筋肉中のセルピンＤＮＡの持続性を
、注入したマウスおよびコントロールマウスからの全細胞性ＤＮＡおよびＨＩＲ
Ｔ上清を調製した後、サザンブロット分析によって決定し得る。マウスにおける
上記実験の結果を、セルピンの裸のＤＮＡを用いて、ヒトおよび他の動物におい
て適切な投薬量および他の処置パラメーターを外挿するために使用し得る。
【０６４０】 （実施例１６：抗体の産生） （ａ．ハイブリドーマ技術） 本発明の抗体は、種々の方法によって調製され得る。（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ，第２章を参照のこと）。このような方法の１つの例として、セ
ルピンポリペプチドを発現する細胞は、ポリクローナル抗体を含む血清の産生を
誘導するために動物に投与される。好ましい方法において、セルピンポリペプチ
ドの調製物が調製され、そして精製されて、天然の夾雑物を実質的に含まないよ
うにされる。次いで、より大きな比活性のポリクローナル抗血清を生成するため
に、このような調製物は、動物に導入される。
【０６４１】 セルピンポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体は、ハイブリドー
マ技術を使用して調製される（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５
（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１
９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２（１９７
６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．
、５６３−６８１頁（１９８１））。一般に、動物（好ましくはマウス）は、セ
ルピンポリペプチドで、またはより好ましくは分泌セルピンポリペプチド発現細
胞で免疫される。このようなポリペプチド発現細胞は、任意の適切な組織培養培
地において、好ましくは１０％ウシ胎仔血清（約５６℃で非働化した）を補充し
、そして約１０ｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、
および約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅ改変イー
グル培地において培養される。
【０６４２】 このようなマウスの脾細胞は抽出され、そして適切な骨髄腫細胞株と融合され
る。任意の適切な骨髄腫細胞株は、本発明に従って用いられ得る；しかし、ＡＴ
ＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞株（ＳＰ２Ｏ）を用いることが好ましい。融合
後、得られるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地において選択的に維持し、次い
でＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（
１９８１））により記載されるように限界希釈によってクローニングする。次い
で、このような選択を通して得られるハイブリドーマ細胞は、セルピンポリぺプ
チドを結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
【０６４３】 あるいは、セルピンポリぺプチドに結合し得るさらなる抗体を、抗イディオタ
イプ抗体を使用して２段階工程の手順において生成し得る。このような方法は、
抗体それ自体が抗原であり、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることが可
能であるという事実を利用する。この方法に従って、タンパク質特異的抗体を使
用して、動物（好ましくは、マウス）を免疫する。次いで、このような動物の脾
細胞を使用して、ハイブリドーマ細胞を産生する。そして、このハイブリドーマ
細胞は、抗体のセルピンタンパク質特異的抗体に結合する能力がセルピンポリペ
プチドによってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスク
リーニングされる。このような抗体は、セルピンタンパク質特異的抗体に対する
抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさらなるセルピンタンパク
質特異的抗体の形成を誘導するために使用される。
【０６４４】 ヒトにおける抗体のインビボ使用のために、抗体は、「ヒト化」される。この
ような抗体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来
する遺伝的構築物を使用することによって産生され得る。キメラ抗体およびヒト
化抗体を産生するための方法は当該分野で公知であり、そして本明細書中で議論
される（総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０
２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６
）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ
ら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６
７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎ
ｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと
）。
【０６４５】 （ｂ）ｓｃＦｖｓのライブラリーからのセルピンポリペプチドに対して指向さ
れる抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離した天然に存在するＶ遺伝子を、ドナーが曝され得たかま
たは曝され得なかったセルピンポリペプチドに対する反応性を含む抗体フラグメ
ントのライブラリーに構築する（例えば、米国特許第５，８８５，７９３号（そ
の全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと）。
【０６４６】 ライブラリーのレスキュー。
【０６４７】 ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０１０４７に記載のように、ヒトＰＢＬのＲＮＡから
ｓｃＦｖｓのライブラリーを構築する。抗体フラグメントを提示するファージを
レスキューするため、ファージミドを保有する約１０9個のＥ．ｃｏｌｉを用い
て、５０ｍｌの２×ＴＹ（１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含有する）（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を接種し、そして振盪しながら０
．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。この培養物の５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×Ｔ
Ｙ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのΔ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３Δ
遺伝子ＩＩＩ、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を添加し、そし
て培養物を振盪なしで３７℃で４５分間インキュベートし、次いで振盪しながら
３７℃で４５分間インキュベートする。この培養物を１０分間４０００ｒ．ｐ．
ｍ．で遠心分離し、そしてペレットを２リットルの２×ＴＹ（１００μｇ／ｍｌ
アンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する）中に再懸濁し、そ
して一晩増殖させる。ファージをＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７に記載のよう
に調製する。
【０６４８】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしない。それゆえ、抗体フラグ
メントを提示するファージ（ファージミド）は、抗原に対するより大きい結合ア
ビディティーを有する。ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質
を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞においてヘルパーファージを増殖さ
せることにより、感染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を作製する。培養物を振盪な
しで３７℃で１時間インキュベートし、次いで振盪しながら３７℃でさらにイン
キュベートする。細胞を遠心沈殿（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ．
ｍ．で１０分間）し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含有する２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）３００ｍ
ｌ中で再懸濁し、そして３７℃で振盪しながら一晩増殖させる。ファージ粒子を
、２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）により培養培地から精製
および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、そして０．４５μｍのフィルター（
Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過させ、約１０13形質導
入単位／ｍｌ（アンピシリン耐性クローン）の最終濃度を得る。
【０６４９】 ライブラリーのパニング。
【０６５０】 Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％ Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし
、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し
、そして、回転盤上で上下にタンブリングしながら室温で３０分間インキュベー
トし、次いでさらに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ ０．１％ Ｔ
ｗｅｅｎ−２０で１０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭ
トリエチルアミンを添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることに
よりファージを溶出し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ，ｐＨ７．４で直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに
３７℃で３０分間インキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌ
の対数増殖中期のＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを
１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート
上にプレートする。次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝
子３ヘルパーファージでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製す
る。次いで、このプロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３
回目および４回目にはチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で２
０回、そしてＰＢＳで２０回に増加する。
【０６５１】 結合剤の特徴付け。
【０６５２】 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ｐｇ／ｍｌのいずれかで被膜したマイクロタ
イタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クローンを
ＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７を
参照のこと）、次いで配列決定することによりさらに特徴付ける。これらのＥＬ
ＩＳＡ陽性クローンはまた、当該分野において公知の技術（例えば、エピトープ
マッピング、結合親和性、レセプターシグナル形質導入、抗体／抗原結合をブロ
ックするかまたは競合的に阻害する能力、および競合的アゴニスト活性または競
合的アンタゴニスト活性など）によりさらに特徴付けられ得る。
【０６５３】 （実施例１７：セリンプロテアーゼ阻害活性についてのアッセイ） プロテアーゼ阻害における精製されたかまたは発現されたセルピンの活性は、
既知の量のこの酵素を、強力な基質セリンプロテアーゼ（エラスターゼ、カテプ
シンＧ、キマーゼ、プラスミン、トロンビン、ＮＩ、Ｃｌｒ、Ｃｌｓ、カリクレ
イン、活性化プロテインＣ、ＰＳＡ、ＰＡ、ｔＰＡ、トリプシン、キモトリプシ
ン、カテプシンＬ、およびプロテアーゼが通常切断する精製されたタンパク質を
含むがこれらに限定されない）とともに混合することによって試験される。所定
の量のセルピンがプロテアーゼを阻害する能力は、特定の期間において、所定の
一連の条件下で産生されるタンパク質フラグメントのＦＰＬＣによってアッセイ
される。
【０６５４】 プロテアーゼインヒビターとしてセルピン活性を試験するための別の方法にお
いて、反応物質のサンプルは、非変性ゲル上で泳動され、これは、異なるサイズ
のペプチドとして、プロテアーゼインヒビター複合体、プロテアーゼ、インヒビ
ター、タンパク質基質、およびタンパク質フラグメントを分離する。
【０６５５】 低分子結合における精製されたかまたは発現されたセルピンの活性は、セルピ
ンを、放射標識した形態である種々の低分子とともにインキュベートすることに
よって試験される。結合のための適切な時間の後、セルピン結合低分子は、ＦＰ
ＬＣによって遊離の低分子から分離され得、そして異なる低分子についてのセル
ピンの結合親和性が決定される。
【０６５６】 本発明を、前述の説明および実施例に詳細に記載された以外の方法で実施し得
ることは、明らかである。本発明の多数の改変およびバリエーションが、上記の
教示を考慮して可能であり、従って、それは、添付の特許請求の範囲の範囲内に
ある。
【０６５７】 発明の背景、詳細な説明および実施例において引用された各文書の全開示（特
許、特許出願、学術文献、要約、実験マニュアル、書籍または他の開示を含む）
は、本明細書中に参考として援用される。さらに、本明細書とともに提出された
配列表のハードコピーおよび対応するコンピュ−ター読み出し形態は、両方とも
本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０６５８】 配列表は、３６ＣＦＲ １２２８．１８８（ｃ）において示される基準に従っ
て、情報交換のための米国標準コード（ＡＳＣＩＩ（アスキー））のテキストフ
ァイルとして、ＣＤ−ＲＯＭで提出される。そのＣＤ−ＲＯＭはラベルされ、そ
して電子配列表の同定、維持、および判読を容易にするために書面の説明書が添
付される。
【０６５９】
【表３】 ＡＴＣＣ受託番号２０３８４２ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０６６０】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６６１】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０６６２】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０６６３】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルは専門家に対してのみ利用可能にさ
れる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の準備が
完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない。 ＡＴＣＣ受託番号２０３８４２ （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６６４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０６６５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 5/00 3/10 7/02 5/00 7/04 7/02 7/06 7/04 7/08 7/06 9/00 7/08 9/02 9/00 9/04 9/02 9/06 9/04 9/10 9/06 9/12 9/10 9/14 9/12 11/00 9/14 11/06 11/00 13/08 11/06 13/12 13/08 15/00 13/12 17/00 15/00 17/02 17/00 17/06 17/02 19/02 17/06 21/00 19/02 21/04 21/00 25/00 21/04 25/02 25/00 25/06 25/02 25/08 25/06 25/16 25/08 25/28 25/16 27/02 25/28 27/06 27/02 29/00 27/06 １０１ 29/00 31/04 １０１ 31/10 31/04 31/12 31/10 31/18 31/12 33/00 31/18 35/00 33/00 35/02 35/00 35/04 35/02 37/02 35/04 37/08 37/02 39/02 37/08 43/00 １０５ 39/02 １１１ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/81 １１１ 16/38 Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/38 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/99 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/37 9/99 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/37 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/573 Ｚ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/64 (31)優先権主張番号 ６０／１４９，４５２ (32)優先日 平成11年８月18日(1999．8．18) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルーベン， スティーブン エム． アメリカ合衆国 メリーランド 20832， オルネイ， ヘリテージ ヒルズ ドラ イブ 18528 (72)発明者 ニイ ジャン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号Ｘに示されるポリヌクレオチド、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに
    含まれるｃＤＮＡによりコードされるポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号Ｙの生物学的に活性なポリペプチドフラグメント、またはＡＴ
    ＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によりコードされる生物学的に活性なポ
    リペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含
    まれるｃＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドエピトープをコードするポ
    リヌクレオチド； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）に特定されるポリヌクレオチドのいずれか１つに、スト
    リンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、該ポ
    リヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみのヌクレオチド配列を有する核
    酸分子に、ストリンジェント条件下でハイブリダイズしない、ポリヌクレオチド
    、 からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、可溶性ポリペプチドをコードする
    ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｙとして同定される配列
    、またはＡＴＣＣ受託番号Ｚに含まれるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリ
    ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離された核
    酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号Ｘ、またはＡＴＣＣ受託
    番号Ｚに含まれるｃＤＮＡの全体のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の
    単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２に記載の単
    離された核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項３に記載の単
    離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  9. 【請求項９】 遺伝子発現を制御する異種調節エレメントに作動可能に制限
    された、請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の宿主細胞からコードされたポリペプチド
    を発現させる工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、ポリペプ
    チドを産生する方法。
  11. 【請求項１１】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号Ｙとして示されるポリペプチド、またはｃＤＮＡによりコード
    されるポリペプチド； （ｂ）配列番号Ｙとして示されるポリペプチドフラグメント、またはｃＤＮＡ
    によりコードされるポリペプチド； （ｃ）配列番号Ｙのポリペプチドエピトープ、またはｃＤＮＡによりコードさ
    れるポリペプチド； （ｄ）配列番号Ｙの改変体； からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む、
    単離されたポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 配列番号Ｙを有するポリペプチドを含む、請求項１１に記
    載の単離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドに特異的に結
    合する、単離された抗体。
  14. 【請求項１４】 請求項１１に記載の単離されたポリペプチドを発現する、
    組換え宿主細胞。
  15. 【請求項１５】 単離されたポリペプチドを作製する方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドが発現されるような条件下で、請求項１４に記載の組換
    え宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法によって産生される、ポリペプチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 医学的状態を予防、処置、または緩和するための方法であ
    って、請求項１１に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載のポリヌクレオチ
    ドの治療有効量を、哺乳動物被験体に投与する工程を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
    る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を
    決定する工程；および （ｂ）該変異の存在または非存在に基づいて病理学的状態、または病理学的状
    態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  19. 【請求項１９】 被験体における病理学的状態、または病理学的状態に対す
    る感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプルにおいて請求項１１に記載のポリペプチドの発現の存
    在または量を決定する工程；および （ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づいて病理学的状態、または
    病理学的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１１に記載のポリペプチドに対する結合パートナー
    を同定するための方法であって、以下： （ａ）請求項１１に記載のポリペプチドと結合パートナーとを接触させる工程
    ；および （ｂ）該結合パートナーが該ポリペプチドの活性をもたらすか否かを決定する
    工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１１に記載のポリペプチドの活性を改変する分子に
    ついてスクリーニングする方法であって、以下： （ａ）該ポリペプチドと、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有する
    と疑われる化合物とを接触させる工程；および （ｂ）該ポリペプチドの活性についてアッセイする工程、 を包含する、方法。
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