KR20050025149A

KR20050025149A - 유전자 치료에 의한 골 생성

Info

Publication number: KR20050025149A
Application number: KR1020047015547A
Authority: KR
Inventors: 송선욱; 이영석; 이관희; 노문종; 배현
Original assignee: 티슈진, 인코포레이티드
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2005-03-11
Also published as: EP1490495A4; JP2010069327A; AU2003218463B2; EP1490495A2; WO2003083079A3; CN1656223A; US20030223965A1; WO2003083079A9; CN103182092A; WO2003083079A2; AU2003218463A1; JP2006500081A; WO2003083079A8; CA2480554A1

Abstract

본 발명에는 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터에 골 재생 기능(bone regenerating function)을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계; 및 골 결함 부위에 포유동물 세포를 이식하여 골 결함 부위에서 골을 생성시키는 단계를 포함하는, 저골량(low bone bass)을 앓고 있는 사람을 위해 골 결함 부위에서 골을 형성하는 방법이 개시되어 있다.

Description

유전자 치료에 의한 골 생성{BONE GENERATION BY GENE THERAPY}

본 발명은, 특히 골원성 골의 골절을 치유하거나 포유동물 숙주의 척주를 융합시키기 위해 골을 생성하거나 재생하는데 사용하기 위한 1종 이상의 연결조직 세포에 형질전환 성장 인자 β 상과의 일원을 암호화하는 1종 이상의 유전자를 도입하는 방법에 관한 것이다.

살아 있는 골 조직의 항상성(homeostasis)은 호르몬, 및 성장 및 분화 인자와 같은 조절 신호에 의해 조정되는 동적 과정(dynamic process)이다. 골 세포의 분열증식(proliferation)을 자극하는 것으로 공지된 성장 인자로는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 형질전환 성장 인자-β 단백질(TGF-β), 인슐린형 성장 인자(IGF) 및 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 있다.

골 골절을 야기하는 낮은 골량(bone mass) 및 골 구조의 미세구성의 퇴화에 의해 특징지어 지는 골다공증은 점점 증가하는 노인들 중에서 일반적인 건강 문제이다. 또한, 골다공성 질병은 다양한 요인, 예를 들어 폐경기, 칼슘 결핍 식이, 난소절제(ovrariectomization), 글루코르티코이드-유도 골다공증, 갑상성 항진증(hyperthyroidism), 고정, 헤파린 유도 또는 면역억제성 유도에 의해 야기될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

골절 치유는 복잡한 과정이며, 거의 밝혀져 있지 않다. 환자가 골다공증에 걸리도록 자극하는 난소절제술 및 저칼슘 식이에 의해 제작된 래트 모델에서, 골절된 골원성 골은 적절히 치유되지 않는다(문헌[Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202, 1999] 및 문헌[Namkung-Matthai et al., Bone, 28: 80-86, 2001]). 따라서, 골 재생과 관련된 치료는 골원성 골 골절의 치료를 상당히 개선시킬 수도 있을 것이다.

정형 분야에서, 몇몇 사이토카인은 성형 질환의 치료를 위한 후보 물질로서 고려되어 왔다. 골 형성 단백질은 골 형성의 효과적인 자극제로서 고려되어 왔고(문헌[Ozkaynak et al., EMBO J, 9: 2085-2093, 1990] 및 문헌[Sampath and Rueger, Complications in Ortho, 101-107, 1994]), TGF-β는 골형성 및 연골형성의 자극제로서 보고되어 있다(문헌[Joyce et al., J. Cell Biology, 110: 2195-2207, 1990]). 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)는 다작용성 사이토카인으로서 고려되고(문헌[Sporn and Roberts, Nature (London), 332: 217-219,1988]), 세포 성장, 분화 및 세포외 매트릭스 단백질 합성에서 조절 역할을 한다(문헌[Madri et al., J. Cell Biology, 106: 1375-1384, 1988]). TGF-β는 시험관내 상피세포 및 용골세포형 세포(osteoclast-like cell)의 성장을 억제하지만(문헌[Chenu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 5683-5687, 1988]), 내연골성 골화(enchondral ossification) 및 그 결과 시험관내 골 형성을 자극한다(문헌[Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995], 문헌[Lind et al. , A Orthop Scand, 64(5): 553-556, 1993] 및 문헌[Matsumoto et al., In vivo, 8: 215-220, 1994]). FGF-β-유도 골 형성은 아골막 분화다능(subperiosteal pluripotent) 세포의 자극에 의해 중재되어, 결과적으로 연골 형성 세포로 분화한다(문헌[Joyce et al., J. Cell biology, 110: 2195-2207, 1990] 및 문헌[Miettinen et al., J. Cell Biology, 127-6: 2021-2036, 1994]).

정형술에서 TGF-β의 생물학적 효과가 보고되어 있다(문헌[Andrew et al., Calcif Tissue In. 52: 74-78, 1993], 문헌[Borque et al., Int J Dev Biol., 37: 573-579, 1993], 문헌[Carrington et al., J Cell Biology, 107: 1969-1975, 1988], 문헌[Lind et al., A Orthop Scand. 64(5), 5530556, 1993] 및 문헌[Matsumoto et al., In Vivo, 8: 215-220, 1994]). 생쥐 배아에서, 염색법에 의해 TFG-β는 중배엽(mesenchyme)으로부터 유래된 조직, 예를 들어 연결조직, 연골 및 골과 밀접하게 회합되어 있는 것으로 나타났다. 발생학적 발견 이외에, TGF-β는 골 형성 및 연골 형성 부위에 존재한다. 이는 또한 토끼의 경골(tibiae)에서 골절 치유를 향상시킬 수 있다. 최근, TGF-β의 치료학적 가치가 보고되었지만(문헌[Critchlow et al., Bone, 521-527, 1995] 및 문헌[Lind et al., A Orthop Scand, 64(5):553-556, 1993]), 이의 단기간 효과 및 높은 비용으로 광범위한 임상적인 용도가 제한되었다.

과도한 외상으로 인한 다량의 골 결함은 완전히 회복되지 않으며, 횡경사된 골(banked bone)로부터의 자가 조직이식 및 조직이식과 같은 치료학적 중재를 요구할 것이다. 이들 통상적인 치료법은 실패율이 상당히 높았다. 대부분의 최근 대체 접근법은 상처 부위에 골유도성 단백질(osteoinductive protein)로 주입된 생분해성 담체의 이식을 이용한다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,656,598 호를 참조한다. 기타 접근법으로는 골수를 재생시키는 기계 장치를 사용하는 것을 들 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 6,077,076호 및 미국 특허 제 6,022,349 호에 개시됨). 이들 방법의 하나의 중요한 단점은 생체내 치료학적 단백질의 짧은 활동 기간으로 인해 치료 효과를 달성하기 위해서는 다량의 재조합 단백질이 요구된다는 것이다.

척주의 척추(vertebrae)에서의 골 퇴화는 골을 생성하는 것이 붕괴된 척추에 의해 야기되는 요통을 겪고 있는 환자에게 위안을 제공할 것이다. 따라서, 골원성 단백질의 방출 기간을 증가시키기 위한 치료학적 적용 분야가 요구된다. 본 출원에서 기술된 바와 같이, 본 발명은 골을 효과적으로 재생시킬 수 있는 골 결함 부위에서의 상기 골원성 치료학적 단백질의 지속적인 발현 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 하기에 기술된 필요성을 충족시킨다. 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 포유동물 연결조직의 하나 이상의 세포에 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 도입하는 방법이 본 발명에 제공된다. 이 방법은 재조합 기법을 이용하여 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자를 제조하는 단계, 및 연결조직 세포에 생성물을 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 벡터 분자를 도입하는 단계를 포함한다. DNA 벡터 분자는 흥미있는 생성물을 암호화하는 유전자가 안정하게 발현될 수 있도록 표적 세포 또는 조직내에 전달되어 유지될 수 있는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 본 발명에서 바람직하게 이용되는 DNA 벡터 분자는 바이러스성 DNA 벡터 또는 플라스미드 DNA 벡터 분자이다. 이 방법은 바람직하게는 치료적 용도를 위해 포유동물 연결조직의 세포에 생성물을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계를 포함한다.

본 발명은,

a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터에 골 형성 기능(bone generating function)을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계;

b) 상기 재조합 벡터로 시험관내 연결조직 세포의 군집을 형질감염 또는 형질도입시키는 단계: 및

c) 골 결함 부위에 포유동물 세포를 이식하여 골 결함 부위에서 골을 형성시키는 단계를 포함하는, 저골량(low bone bass)을 앓고 있는 개체를 위해 골 결함 부위에서 골을 생성하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 벡터는 레트로바이러스성 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 유전자는 TGF-β상과의 일원일 수 있으며, 특히 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP)일 수 있다. 또한, 구체적으로는 BMP는 BMP-2일 수 있다. 게다가, 연결조직 세포는 섬유아세포(fibroblast) 또는 골 전구세포(bone progenitor cell)일 수 있다.

상기 방법에서, 골은 초기 또는 말기 동안에 생성된다.

또한, 본 발명은

a) 벡터에 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계;

c) 형질감염 또는 형질도입된 연결조직 세포의 개체의 골원성(osteogenic) 유효량 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 척주(spine)와 접촉시켜, 척주에서 상기 유전자를 암호화하는 DNA 서열의 발현으로 골을 생성하여 척주를 융합시키는 단계를 포함하는, 척주를 융합시키는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서, 벡터는 레트로바이러스성 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 유전자는 TGF-β 상과의 일원일 수 있으며, 특히 골 형성 단백질일 수 있다. 또한, 구체적으로는 BMP는 BMP-2일 수 있다. 게다가, 연결조직은 섬유아세포 또는 골 전구 세포일 수 있다.

상기 방법에서 골은 초기 또는 말기 동안에 생성된다.

또한, 본 발명은,

c) 골절 부위에 연결조직 세포를 도입하여 골절을 치유하는 단계를 포함하는, 골원성 골절을 치유하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에서 골은 초기 또는 말기 동안에 생성된다.

본 발명의 이들 및 기타 목적은 하기 본 발명의 상세한 설명, 본원에 첨부된 관련 도면 및 본원에 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 상세하게 이해될 것이다.

(도면의 상세한 설명)

본 발명은 하기에 기술된 본 발명의 상세한 설명 및 예시를 목적으로 기술된 첨부된 도면으로부터 더욱 상세하게 이해될 것이며, 따라서 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 이하,

도 1A 및 도 1B는 인간 BMP2 유전자를 제공하는 pMT-BMP2의 구조를 나타낸 것이다.

도 2A 내지 도 2F는 NIH3T3-BMP-2 섬유아세포 세포에 의한 골의 재생을 나타낸 것이다. 도 2A 및 도 2B는 대조군인 NIH3T3 섬유아세포 세포(A) 및 NIH3T3-BMP-2 세포(B)를 주사한지 8주 후의 다리뼈의 사진을 나타낸 것이다. 도 2C 내지 도 2F는 동물의 희생시키기 전에 대조군 (C 및 D) 및 실험군(E 및 F)의 다리뼈를 방사선 촬영 검사한 것이다. BMP-2를 발현하는 세포로 처리된 골 결함은 주사한지 8주 후에 치유되었다.

도 3A 내지 도 3D는 재생된 골 조직을 조직 검사한 것을 나타낸 것이다. 재생된 골 조직의 파라핀 절단부분을 마송 삼색(Mason's trichrome)으로 염색하였다. 그 결과, 재생된 골 조직(RB)의 구조는 정상 골 조직(NB)과 거의 동일했다. 도 3A 및 도 3B는 저배율(40x) 사진을 나타내고, 도 3C 및 도 3D는 고배율(100x) 사진을 나타낸다. 점선은 재생 골조직과 정상 골 조직 사이의 경계선을 나타낸다.

도 4A 내지 도 4I는 HIH3T3-hBMP2 섬유아세포 세포에 의해 골이 재생된 것을 나타낸다. 봉합후에 NIH3T3-hBMP2 세포(2㎖의 2 x 10⁶세포/㎖)를 경골(tibia bone)에서의 결함 부위에 주사하였다. (A 내지 G): 세포를 주사한지 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7주 후에 방사선 촬영 분석을 수행하였다. (H): 주사한지 7주 후에 표본을 수확하고, 사진을 촬영하였다. (I): 수확후에 조직 검사를 수행하였다. 마송 삼색 염색의 결과가 나타나 있다.

도 5A 내지 도 5I는 대조군 DMEM 배지에 의해 DMLO 골의 재생을 나타낸 것이다. 봉합후에 대조군 DMEM 배양 배지(2㎖)를 경골(tibia bone)에서의 결함 부위에 주사하였다. (A 내지 G): 세포를 주사한지 1일, 1, 2, 3, 4, 5 및 6주 후에 방사선 촬영 분석을 수행하였다. (H): 주사한지 6주 후에 표본을 수확하고, 사진을 촬영하였다. (I): 수확후에 조직 검사를 수행하였다. 마송 삼색 염색의 결과가 나타나 있다.

도 6A 및 도 6B는 흡수성 콜라겐 스폰지(absorbable collagen sponge, ACS) 담체를 이용하여 세포를 이식하는 후측면 사이근 공정(posterolateral intertransverse process) 융합 방법의 4 및 6주 이후의 래트TG001의 방사선 사진을 나타낸 것이다. 후측면 사이근 공정 융합 연구에 있어서, 좌측의 방사선 촬영 연결골(bridging bone)은 BMP-2 5 x 10⁶ 섬유아세포(생쥐)를 cDNA로 형질감염한 후에 둘러 쌓인다. 만약 존재하는 경우, 우측상의 보다 적은 세포 및 보다 적은 골 형성을 주목한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 1종 이상의 추가적인 치료제와 “함께”투여함은 임의의 순서로 동시(공동) 및 연속 투여하는 것을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 핵산, 단백질, 단백질 단편 또는 이의 유도체와 관련하여 “생물학적 활성”이란 용어는 핵산 또는 아미노산이 야생형 핵산 또는 단백질에 의해 유도되는 공지된 생물학적 기능을 모방하는 능력으로서 정의된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "골 성장"이란 용어는 골량에 관한 것이다. TGF-β 단백질은 골량을 계통적으로 증가시키는 것을 생각된다. 이는 조골세포(osteoblast)의 수 및 크기의 증가, 및 전신 투여 후에 골성 라이닝 골 표면(osteoid lining bone surface)의 증가된 침착에 의해 제안된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “담체”란 용어는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 사용된 투여량 및 농도에서 여기에 노출된 세포 또는 포유동물에 비독성인 안정제를 포함한다. 종종, 약학적으로 허용가능한 담체는 pH 완충된 수용액이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 비롯한 항산화제;저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 혈정 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소비톨과 같은 당 알콜(sugar alcohol); 나트륨과 같은 염 형성 짝이온(counterion); 및/또는 트윈^ⓐ(TWEEN^ⓐ), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 플루로닉스^ⓐ(PLURONICS^ⓐ)와 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, “연결조직”이란 용어는 기타 조직 또는 기관을 연결하고 지지하는 임의의 조직이고, 포유동물 숙주의 인대, 연골, 힘줄, 골 또는 활액막을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 바와 같이, “결합 조직 세포” 또는 “결합 조직의 세포”란 용어는 지방 세포(adipocyte) 및 평활근 세포 뿐만 아니라, 섬유아세포, 연골세포(chondrocyte) 및 골세포(조골세포/골세포)와 같은 연결 세포에서 발견되는 세포를 포함한다. 바람직하게는, 연결조직 세포는 섬유아세포, 연골 세포 및 골 세포이다. 더욱 바람직하게는, 연결조직 세포는 섬유아세포이다. 다르게는, 연결조직 세포는 조골세포 또는 골세포이다. 본 발명은 단일형의 세포 뿐만 아니라, 연결조직 세포의 혼합 배양액으로 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 조직 세포는 화학약품 또는 방사선에 의해 처리되어, 세포는 흥미있는 유전자를 안정하게 발현시킬 수 있음을 인식한다. 바람직하게는, 연결조직 세포는 숙주 생명체에 주사하였을 때 음성 면역 반응을 일으키지 않는다. 세포 중재 유전자 치료 또는 체세포 치료를 위해 자가조직 세포(autologous cell) 뿐만 아니라, 동종이계성(allogeneic) 세포가 이와 관련하여 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “연결조직 세포주”란 용어는 일반적인 모세포로부터 유래한 복수의 연결조직 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “숙주 세포”란 용어는 본 발명의 벡터의 수용체였거나 수용체일 수 있는 개개의 세포 또는 세포 배양액을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 필수적으로 자연적인 돌연변이 및/또는 변화, 우발적인 돌연변이 및/또는 변화 및 의도적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 (형태학 또는 DNA 총량에 있어서) 초기 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 TGF-β 상과의 일원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 시험관내에서 형질감염되거나 감염된 세포를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “저골량”이란 용어는 골량의 수준이 세계 보건 기구의 "Assessment of Fracture Risk and its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis (1994). Report of a World Health Organization Study Group. World Health Organization Technical Series 843”(이는 본원에서 정상 및 골다공성 수준의 골량을 참고하여 참고로 인용됨)에 의한 표준서에서 정의된 바와 같은 나이 특별 규정 미만인 상태를 지칭한다. 또한, “골량”이란 용어는 단위 면적 당 골량을 지칭하며, 종종 골 무기물 농도로서 지칭된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “유지”란 용어는 리포좀(liposome) 전달과 관련하여 사용되는 경우에 도입된 DNA가 세포에서 존재하는 능력을 나타낸다. 기타 경우에 사용되는 경우, 이는 표적 DNA가 표적 세포 또는 조직에 존재하여 치료학적 효과를 부여하는 능력을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “포유동물 숙주”란 용어는 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않은 동물계의 일원을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “성숙한 골”이란 용어는 골성(osteoid)과 같이 비무기화(non-mineralizing)된 골과는 대조적으로 무기화(mineralizing)된 골을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “골형성적 유효량”이란 용어는 성숙한 골의 형성 및 발생에 영향을 미치는 양을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “골전구 세포” 또는 “골 전구 세포”란 용어는 골 세포가 될 잠재성을 갖고, 골막 및 골수에 존재하는 세포이다.

골전구 세포는 주변 조직(근육)에서 또한 존재하는 연결조직 전구 세포로부터 유래한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “환자”란 용어는 인간을 포함하지만 이에 한정되지 않은 동물계의 일원을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 수용체 동물이 조성물의 투여에 내성을 갖는 경우 조성물은 “약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능하고”, 다르게는 상기 동물에 투여하기에 적합하다. 이 같은 약제는 투여량이 생리학적으로 유효한 경우에 치료학적 유효량으로 투여되는 것으로 얘기된다. 약제의 존재로 인해 수용체 환자의 생리 현상에서의 검출가능한 변화를 야기하는 경우 약제는 생리학적으로 유의한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제”란 용어는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항-박테리아제 및 항-진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 상기 매질 및 약제의 사용은 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 약제가 활성 성분과 상용성이라는 것을 제외하면, 치료학적 조성물에서의 이의 용도가 고려되고 있다. 보조 활성 성분은 또한 조성물에 혼입될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “프로모터”란 용어는 활성은 나타내며, 진핵 세포에서 전사를 조절하는 DNA의 임의의 서열일 수 있다. 프로모터는 진핵 세포 또는 원핵 세포 각각 또는 둘다에서 활성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 포유동물 세포에서 활성을 나타낸다. 프로모터는 구조적으로 발현되거나 유도성일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 유도성이다. 바람직하게는, 프로모터는 외부 자극에 의해 유도성이다. 더욱 바람직하게는, 프로모터는 호르몬 또는 금속에 의해 유도성이다. 게다가, 전사를 또한 조절하는 “엔핸서 원소(enhancer element)”란 용어는 DNA 벡터 컨스트럭트에 삽입되어, 흥미있는 유전자의 발현을 향상시키는 본 발명의 컨스트럭트와 함께 사용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, “선택가능한 표지”란 용어는 도입된 DNA를 안정하게 유지하고, 세포가 형태학적 변형과 같은 변경된 표현형 또는 효소 활성을 나타내도록 하는 세포에 의해 발현된 유전자 생성물을 포함한다. 형질감염된 유전자를 발현하는 세포의 단리는 항생제 또는 약제에 내성을 부여하는 효소 활성을 갖는 표지와 같은 선택가능한 표지를 암호화하는 제 2 유전자를 동일한 세포에 도입함으로써 달성된다. 선택가능한 표지의 예로는 티미딘 키나제(thymidine kinase), 디하이드로폴레이트 환원 효소(dihydrofolate reductase); 카나마이신(kanamycin), 네오마니신(neomycin) 및 게네티신(geneticin)과 같은 아미노글리코사이드 항생제에 내성을 부여하는 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제(aminoglycoside phosphotransferase), 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제(hygromycin B phosphotransferase), 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase), CAD(우리딘 신생 합성의 중요한 3개의 효소(즉, 카바모일 포스페이트 합성 효소(carbamyl phosphate synthetase), 아스파테이트 트랜스카바밀라제(aspartate transcarbamylase) 및 디하이드로오로타제(dihydroorotase)) 활성을 나타내는 단일 단백질), 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase) 및 아스파라긴 합성 효소(asparagine synthetase)(문헌[Mambrook et al., Molecular Cloning, Chapter 16. 1989])를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않으며, 이는 전체가 본원에서 참고로 인용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, “개체”란 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간이다.

본원에서 사용된 바와 같이, “치료”란 용어는 유리하거나 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 있어서, 유리하거나 목적하는 임상 결과는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진전의 연기 또는 지연, 질환 상태의 경감 및 일시적 완화, 및 검출가능하거나 검출불가능한 소실(remission, 부분적이든 전체적이든)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. “치료”란 용어는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예상 생존 기간에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다. “치료”란 용어는 치료학적 치료 및 예방책 둘다를 지칭한다. 치료가 필요한 이들은 질병이 예방되어야 할 사람 뿐만 아니라, 이미 질병을 앓고 있는 사람을 포함한다. 질환을 “일시적 완화하기”란 용어는 치료하지 않은 상황과의 비교시 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상적인 징후가 약해지고/지거나 진행 시간의 경과가 지연되거나 길어짐을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “TGF-β 단백질”이란 용어는 단백질의 TGF-β 상과의 일원을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, “벡터”, “폴리뉴클레오타이드 벡터”, “컨스트럭트” 및 “폴리뉴클레오타이드 컨스트럭트”란 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스성 피복물에 캡슐화(encapsulating)된 RNA, 아데노바이러스 피복물에 캡슐화된 DNA, 기타 바이러스성 또는 바이러스형 형태(예를 들어, 허피스 심플렉스(herpes simplex) 및 아데노 회합 바이러스(AAV))로 패킹(packing)된 DNA, 리포좀(liposome)에 캡슐화된 DNA, 폴리리신과 복합체를 형성한 DNA, 합성 다가 양이온성 분자와 복합체를 형성한 DNA, 분자를 면역학적으로 마스킹(masking)하고/하거나 반감기를 증가시키기 위해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 화합물과 복합체를 형성한 DNA 또는 비-바이러스성 단백질에 접합된 DNA를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 것일 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 본원에서 사용된 바와 같이, “DNA”란 용어는 염기인 A, T, C 및 G를 포함할 뿐만 아니라, 이들 염기의 유사체 및 변형된 형태, 예를 들어 메틸화 뉴클레오타이드, 전하를 띠지 않은 결합 및 티오에이트(thioate)와 같은 뉴클레오타이드간 변형(internucleotide modification), 당 유사체의 용도, 및 폴리아미드와 같은 변형 및/또는 대체 골격 구조를 포함한다.

형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상과(superfamily)

형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상과는 배 발생 단계 동안에 광범위한 분화 과정에 영향을 미치는 구조적으로 관련된 단백질의 일군을 포함한다. 이는 온전하게 보전된 7개의 시스테인 잔기를 포함하는 1차 아미노산 잔기 상동성에 기초한다. 상기 부류는 정상적인 웅성 발생에 요구되는 뮐러리안(Mullerian) 억제 물질(MIS)(문헌[Behringer, et al., Nature, 345: 167, 1990]); 성충원기(imaginal disk)의 등-복부 축 형성 및 형태 형성(morphogenesis)에 요구되는 드로소필라 데카펜타프레직(Drosophila decapentaplegic, DPP) 유전자 생성물(문헌[Padgett, et al., Nature, 325: 81- 84, 1987]); 난자의 식물극(vegetal pole)에 위치하는 제노푸스(Xenopus) Vg-1 유전자 생성물(문헌[Weeks, et al., Cell, 51: 861-867, 1987]); 제노푸스 배아의 중배엽 및 전방 구조의 형성(Thomasen, et al., Cell, 63: 485, 1990)을 유도할 수 있는 액티빈(activin)(문헌[Mason, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 135: 957-964, 1986]); 및 연골 및 골의 신생 형성을 유도할 수 있는 골 형태 형성 단백질(MBP-2 내지 MBP-15와 같은 BMP 단백질)(Sampath, et al., J. Biol. Chem., 265: 13198, 1990)을 포함한다. TGF-β 유전자 생성물은 지방형성(adipogenesis), 근육발생(myogenesis), 연골형성(chondrogenesis), 조혈(hematopoiesis) 및 상피세포 분화를 비롯한 다양한 분화 과정에 영향을 미칠 수 있으며(재검토용, 문헌[Massague, Cell 49: 437, 1987] 참조), 이는 본원에서 전체가 참고로 인용된다.

TGF-β 부류의 단백질은 커다란 전구체 단백질로서 초기에 합성되어, 후속적으로 카복실 말단으로부터 약 110 내지 140번째 아미노산의 염기성 잔기의 무리에서 단백질 가수분해성 개열을 겪는다. 단백질의 카복실 말단 지역은 모두 구조적으로 관련되어 있고, 상이한 부류는 이들의 상동성의 정도에 기초하여 개개의 하위군(subgroup)으로 분류될 수 있다. 특정한 하위군 내의 상동성은 70 내지 90% 아미노산 서열 동일성의 범위에 있을 지라도, 하위군 사이의 상동성은 상당히 낮으며, 일반적으로 20 내지 50% 정도의 범위이다. 각각의 경우에, 활성 종은 C-말단 단편의 이황화 결합된 이량체인 것으로 나타난다. 연구되었던 대부분의 부류(family member)에 있어서, 단일이량체성 종은 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀져 있지만, 인히빈(inhibin)(문헌[Ung, et al., Nature, 321:779, 1986]) 및 TGF-β(문헌[Cheifetz, et al., Cell, 48:409, 1987])과 같은 기타 부류에 있어서, 이질이량체도 또한 검출되었고, 이들은 개개의 단일이량체와는 상이한 생물 특성을 갖는 것으로 나타난다.

TGF-β 유전자의 상과의 일원으로는 TGF-β3, TGF-β2, TGF-β4(닭), TGF-β1, TGF-β5(제노푸스(Xenopus)), BMP-2, BMP-4, 드로소필라(Drosophila) DPP, BMP-5, BMP-6, Vgr1, OP-1/BMP-7, 드로소필라 60A, GDF-1, 제노푸스 Vgf, BMP-3, 인히빈-βA, 인히빈-βB, 인히빈-α 및 MIS를 들 수 있다. 이들 유전자는 문헌[Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791, 1998]에 개시되어 있으며, 이는 전체가 본원에서 참고로 인용된다.

바람직하게는, TGF-β 유전자의 상과의 일원은 BMP이다. 더욱 바람직하게는, 일원은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 또는 BMP-7이다. 더욱더 바람직하게는, 일원은 인간 BMP이다. 가장 바람직하게는, 일원은 인간 BMP-2이다.

BMP

BMP는 골 형성을 개시하기 전에 연골 세포 및 조골세포로의 중배엽형 세포의 분화를 유도하도록 작용하는 단백질이다. 이들은 골절 부위의 주변 또는 이소성 위치(ectopic location)에서 연골- 및 골-형성 세포의 분화를 증진한다. 몇몇 단백질은 조골세포에서 알칼라인 포스포타제 및 콜라겐의 합성을 유도한다. 몇몇 BMP는 조골세포에 직접 작용하여 이들의 성숙을 증진시키는 반면, 동시에 근원성(myogenous) 분화를 억제한다. 기타 BMP는 연골세포로의 전형적인 섬유아세포의 전환을 증진시키고, 비골원성 세포 유형에서 조골세포 표현형의 발현을 유도할 수도 있다. TGF-β상과에 포함하는 BMP 부류는 하기의 단백질을 포함한다:

BMP-2A 또는 BMP-2-α(114개의 아미노산)는 BMP-2로 재명명되었다. 인간, 생쥐 및 래트 단백질은 이들 아미노산 서열이 동일하다. 단백질은 드로소필라와 68% 상동성을 나타낸다.

BMP-2B 또는 BMP-2-β(116개의 아미노산)는 BMP-4로 재명명되었다. 생쥐 및 래트 단백질은 이들 아미노산 서열이 동일하다.

BMP-3(110개의 아미노산)은 당단백질이고 오스테오게닌(Osteogenin)과 동일하다. 인간 및 래트 성숙 단백질은 98% 동일하다.

BMP-3b(110개의 아미노산)는 BMP-3(82% 동일성)과 관련이 있다. 인간 및 쥐 단백질은 97% 동일성(3개의 상이한 아미노산)을 나타낸다. 인간 및 래트 단백질 서열은 2개의 아미노산이 상이하다. 상기 유전인자는 GDF-10과 동일하다.

BMP-4는 BMP-2B 및 DVR-4와 동일하다. 단백질은 드로로필라와 72% 상동성을 나타낸다.

BMP-5(138개의 아미노산). 아미노산 수준에서 인간 및 생쥐 단백질은 96% 동일하다.

BMP-6(139개의 아미노산)은 DVR-6 및 식물-특이성 연관-1(vegetal-specific-related-1)과 동일하다.

BMP-7(139개의 아미노산)은 OP-1(골원성 단백질-1)과 동일하다. 생쥐 및 인간 단백질은 98% 동일하다. BMP-5 , BMP-6 및 BMP-7의 성숙한 형태는 75% 동일성을 나타낸다.

BMP-8(139개의 아미노산)은 OP-2와 동일하다. 상기 유전인자는 또한 BMP-8a로서 지칭된다.

BMP-8b(139개의 아미노산) OP-3과 동일하고, 생쥐에서만 발견되었다. 상기 유전인자는 OP-3로서 공지되어 있다.

BMP-9(110개의 아미노산)는 또한 GDF-5로서 지칭된다.

BMP-10(108개의 아미노산)은 소 공급원으로부터 단리되었다. 소 및 인간 단백질은 동일하다.

BMP-11(109개의 아미노산)은 소 공급원으로부터 단리되었다. 인간 및 소 서열은 동일하다. 상기 단백질은 GDF-11로도 지칭된다.

BMP-12(104개의 아미노산)는 GDF-7 또는 CDMP-3으로도 공지되어 있다.

BMP-13(120개의 아미노산)은 GDF-6 및 CDMP-2와 동일하다.

BMP-14(120개의 아미노산)는 GDF-5 및 CDMP-1과 동일하다.

BMP-15(125개의 아미노산)는 접합자(oocyte)에서 특이적으로 발현된다. 쥐 단백질은 쥐 GDF-9와 매우 밀접하게 연관되어 있다.

이들 단백질 중 일부는 이질이량체로서 존재한다. OP-1는, 예를 들어 BMP-2A와 회합되어 있다.

높은 정도의 아미노산 서열 상동성(약 95%)으로 인해, BMP-5 , BMP-6 및 BMP-7은 BMP의 특유의 상과로서 인식된다. BMP-5 및 BMP-6을 암호화하는 유전자는 인간 6번 염색체상에 위치한다. BMP-7을 암호화하는 유전자는 인간 20번 염색체상에 위치한다. BMP는 탈무기화된 골 및 골육종 세포로부터 단리될 수 있다. 이들은 또한 배아에서 다양한 상피 조직 및 중배엽 조직에서 발현되는 것으로 나타난다. 몇몇 BMP(예를 들어, BMP-2 및 BMP-4)는 정성적으로 동일한 효과(연골 및 골 형성)를 유도하여, 서로를 위해 치환할 수 있는 능력을 갖는 것으로 나타난다.

오스테오게닌 및 관련 BMP는 또한 단핵구를 순환시키기 위한 강력한 주화성 인자로서 작용하고 이들 사건들 중에서 단핵구에 의한 TGF-β1의 합성 및 분비를 유도함으로써 연골내화골(endochondral bone) 형성 다단계에서 부가적인 연속 단계를 증진시킨다. TGF-β에 의해 자극받은 단핵구는 상피 세포 및 중배엽 세포를 모우고 콜라겐 및 회합된 매트릭스 구성성분의 합성을 증진시키는 조정된 배지에 수많은 미토겐성(mitogenic) 사이토카인을 분비한다.

골 재생을 위한 치료

본 발명은 흥미있는 DNA 서열을 포유동물 숙주의 연결조직 세포로 전달하기위한 생체외(ex vivo) 및 생체내 기법을 개시한다. 생체외 기법은 표적 연결조직 세포, DNA 서열의 시험관내 형질감염, DNA 벡터, 연결조직 세포 내로의 흥미있는 기타 전달 비히클(delivery vehicle), 이어 흥미있는 유전자 생성물의 생체내 발현에 영향을 미치기 위해 포유동물 숙주의 표적 골 결함 구역에 변형된 연결조직 세포의 이식을 포함한다.

다양한 외생 조직 및 생체 적합성 담체 및 기타 보조 물질 뿐만 아니라, 스캐폴딩 골격(scaffolding framework), 매트릭스, 또는 연막(buffy coat) 또는 기타 화학 접착제와 같은 생체 접착성 물질이 본 발명의 유전적으로 변형된 세포와 함께 이식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 한 양태에서, 본 발명은 유전적으로 변형된 연결조직 세포와 골 결함 구역 또는 결함 부근 구역 사이의 접촉을 촉진하는 치료학적 조성물에 생체 접착성 물질을 포함할 수 있다. 다르게는, 상기 물질이 본 발명의 투여 시스템에서 조성물로부터 배제될 수 있을 것이다.

인간 환자를 치료하기 위해 세포의 바람직한 공급원이 환자 자신의 연결조직 세포, 예를 들어 자가조직 섬유아세포, 골전구 세포(골 전구 세포), 골세포, 조골세포 또는 용골세포(osteoclast)이지만, 동종이계 세포도 또한 사용될 수 있음이 당해 기술분야의 숙련자에 의해 이해될 것이다.

더욱 구체적으로는, 이 방법은 형질전환 성장 인자 β상과의 일원, 생물활성 유도체 또는 이의 단편인 유전자 생성물을 이용함을 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, TGF-β 상과 단백질 및 적합한 약학적 담체를 포함하는, 환자에게 약학적 유효량의 비경구 투여를 위한 화합물이 제공된다.

본 발명의 다른 실시태양은 TGF-β상과 단백질 및 적합한 약학적 담체를 포함하는, 환자에게 예방적 치료량의 비경구 투여를 위한 화합물을 제공한다.

본 발명에서, BMP-2, 및 TGF-β1, 2 및 3을 포함하지만 이에 한정되지 않은 형질전환 성장 인자-β(TGF-β) 상과의 일원을 암호화하는 유전자로 형질감염되거나 형질도입된 적절한 포유동물 세포를 주사함으로써 골을 생성하거나 재생하는 방법이 제공된다. BMP-2가 예시되어 있다.

본 발명의 실시태양에서, 세포는 골이 외생 세포 또는 기타 생체 적합성 담체와 같은 스캐폴딩 또는 기타 보조 물질의 유무에 따라 생성되거나 재생될 수 있는 구역에 주사될 수 있는 것으로 이해된다. 즉, 변형된 세포는 골이 임의의 부가적인 구조 또는 골격의 도움없이 재생될 수 있는 구역에 주사될 수 있다. 본 발명의 실시태양에서, 상기 부가적인 물질은, 예를 들어 미국 특허 제 5,842,477 호에 개시되어 있고, 본 발명의 조성물에는 포함되지 않을 수 있다.

본 발명의 방법은 비교합(non-union) 골절(치유되지 않은 골절), 두개안면(craniofacial) 복원, 종양 제거로 인한 환절 결함, 엉덩이 이식체 교정 주위의 골 증가(즉, 엉덩이 이식체의 수명이 겨우 약 10년이므로, 엉덩이 이식체의 25%는 존재하는 이식체로 치환됨), 치과용 턱뼈의 복원을 포함하지만, 이에 한정되지 않은 신체중의 모든 유형의 골에 적용될 수 있다. 또한, 기타 표적 골은 척주 융합을 위한 척주상의 척추, 대골(large bone) 등을 포함한다.

변형될 세포는 섬유아세포, 골전구 세포, 조골세포, 골세포 및 용골세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않은 골의 형성에 도움이 되는 임의의 적합한 포유동물 연결조직 세포를 포함하고, 연골세포를 추가로 포함한다. 그러나, 기타 비-유전적으로 변형된 세포는 또한 골 결함 부위, 예를 들어 조골세포, 골세포, 용골세포,연골세포 등을 접촉시키도록 사용되는 조성물에 포함될 수 있다.

숙주 세포의 시험관내 조작에 대한 대안으로서, 흥미있는 생성물을 암호화하는 유전자를 리포좀에 도입하고, 골 골절 또는 골 결함에 또는 이의 주변의 구역에 직접 주사하며, 이때 리포좀은 연결조직 세포와 융합되어 TGF-β 상과에 속하는 유전자 생성물의 유전자를 시험관내 발현시킨다.

“골 결함” 또는 “결함된 골”이란 용어에 관한 언급하는 경우, 상기 결함은 상처 또는 질환에 의해 야기되는 이 같은 질병을 비롯한 골절, 단절, 및/또는 골의 퇴화를 포함할 수 있고, 척주의 척추의 결함 및 척추 사이의 디스크 구역의 추가적인 퇴화를 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 한 양태에서, 척추 사이의 디스크 공간의 퇴화에 의해 야기되는 통증은 퇴화된 디스크 공간을 둘러싸고 있는 척추를 융합시킴으로써 치료될 수 있다.

연결조직 세포의 시험관내 조작에 대한 부가적인 대안으로서, 흥미있는 생성물을 암호화하는 유전자를 네이키드(naked) DNA로서 결함된 골 구역에 도입된다. 네이키드 DNA는 연결조직 세포로 들어가서, TGF-β 상과에 속하는 유전사 생성물의 유전자를 생체내 발현시킨다.

본 명세서 전체에서 개시된 골절되거나 결함된 골을 치료하는 하나의 생체외 방법은 단백질 또는 이의 생물학적 활성 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 바이러스성 벡터 또는 플라스미드 벡터를 초기에 생성하는 단계를 포함한다. 이어, 이 재조합 벡터는 시험관내에서 배양된 연결조직 세포의 개체를 감염시키거나 형질감염시켜, 벡터를 포함하는 연결조직 세포의 개체를 얻기 위해 사용된다. 이어, 이들 연결조직 세포는 포유동물 숙주의 표적 골 결함 구역에 이식되어, 결함된 구역내의 단백질 또는 단백질 단편의 후속적인 발현에 영향을 준다. 흥미있는 이 DNA 서열의 발현은 골절 또는 결함을 실질적으로 치료하는데 유용하다.

더욱 구체적으로는, 이 방법은 상기 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 상과의 일원, 생물활성 유도체 또는 이의 단편, 및 선별가능한 표지, 또는 생물활성 유도체 또는 이의 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 사용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가적인 실시태양은 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 상과의 1종 이상의 일원 또는 생물활성 유도체 또는 이의 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계, 및 사용된 전달 방법과는 무관하게 전달시의 표적 세포 또는 조직 내에서 안정하게 유지할 수 있는 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 DNA 플라스미드 벡터를 DNA 플라스미드 벡터로서 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 연결조직의 하나 이상의 세포에 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생성물을 암호화하는 유전자를 연결조직 세포에 도입하기 위해 비-바이러스성 수단을 이용하는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로는, 이 방법은 리포좀 캡슐화, 칼슘 포스페이트 동시 침전(coprecipitation), 전기 천공(electroporation) 또는 DEAE-덱스트란 매개를 포함하고, 유전자로서 형질전환 성장 인자 β 상과의 일원 또는 생물 활성 유도체 또는 이의 단편, 및 선별가능한 표지, 또는 생물활성 유도체 또는 이의 단편을 암호화할 수 있는 유전자를 사용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양은 포유동물 숙주를 치료하는데 사용하기 위해 연결조직의 하나 이상의 세포에 생성물을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 도입하는 추가적인 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 세포 또는 조직에 DNA 벡터 분자를 전달하는 바이러스를 이용하는 생물학적 수단을 이용하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 바이러스는 표적 세포 내로 전달되어 안정하게 유지될 수는 있지만, 표적 세포 또는 조직 내에서 복제하는 능력을 갖지 않는 슈도바이러스와 같은 게놈(genome)이 변경된 슈도바이러스이다. 변경된 바이러스성 게놈은 바이러스성 게놈이 표적 세포 또는 조직 내에서 발현되는 흥미있는 이종 조직 유전자(heterologous gene)를 포함하는 DNA 벡터 분자로서 작용하도록 재조합 DNA 기법에 의해 추가로 조작된다.

본 발명의 바람직한 실시태양은 본 명세서 내에 개시된 생체외 기법으로 레트로바이러스성 벡터를 사용하여 포유동물 숙주의 연결조직에 TGF-β 유전자를 전달함으로써 표적 결함 구역에 TGF-β 단백질을 전달하는 방법이다. 즉, 작용성 TGF-β 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 흥미있는 DNA 서열을 선택된 레트로바이러스성 벡터에 서브클로닝(subcloning)하고, 이어 재조합 바이러스성 벡터를 적절한 농도까지 성장시키고, 시험관내 배양된 연결조직 세포를 감염시키기 위해 사용하고, 형질도입된 연결조직 세포, 바람직하게는 자기 이식 세포를 골 결함 영역 또는 치료학적 유효 부근 구역에 이식한다.

본 발명의 다른 바람직한 방법은 아데노바이러스 벡터, 아데노-회합 바이러스(AAV) 벡터 또는 허피즈-심플렉스 바이러스(HSV) 벡터를 사용하여 포유동물 숙주의 연결조직에 TGF-β 상과 유전자를 직접 생체내로 전달함을 포함한다. 즉, 작용성 THF-β 단백질 또는 단백질 단편을 암호화하는 흥미있는 DNA 서열은 개개의 바이러스성 벡터에 서브클로닝한다. 이어, 바이러스성 벡터를 포함하는 TGF-β를 적절한 농도로 성장시키고, 골 결함 영역 또는 골형성 유효 부근 구역에 전달한다.

DNA 분자를 관절의 표적 연결조직에 제공하는 방법은 양이온 피로좀내로의 DNA 분자의 캡슐화, 레트로바이러스성 벡터 또는 플라스미드 벡터에 흥미있는 DNA 서열의 서브클로닝, 또는 DNA 분자 자체를 골 결함 영역 또는 골형성 유효 부근 구역으로의 직접적인 주사를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. DNA 분자는 바람직하게는 재조합 바이러스성 DNA 벡터 분자 또는 재조합 DNA 플라스미드 벡터 분자와 같은 DNA 벡터 분자로서 제공된다. 흥미있는 이종 조직 유전자의 발현은 진핵 세포에서 활성인 프로모터 단편을 이종 조직 유전자의 코팅 영역의 바로 상류에 삽입함으로써 확보된다. 당해 기술분야의 숙련자는 연결조직내로의 DNA 분자의 도입에 이어 적절한 발현 정도를 확보하기 위해 벡터 구축의 공지된 전략 및 기법을 이용할 수 있다.

리포좀을 이용하는 바이러스성 벡터는 레트로바이러스가 연결조직 세포의 감염 및 통합에 영향을 미치도록 요구되는 바와 같이 세포분화에 의해 제한되지 않는다는 것이 당해 기술분야의 숙련자에 의해 인식될 것이다. 본원에 기술된 바와 같은 비-바이러스성 수단을 이용하는 이 방법은 유전자로서 TGF-β 상과에 속하는 일원 및 항생제 내성 유전자와 같은 선별가능한 표지 유전자를 암호화할 수 있는 유전자를 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 세포를 전달하기 전에 연결조직 세포를 저장하는 단계를 포함한다. 연결조직 세포는 액체 질소 중의 10% DMSO에 냉동 저장될 수 있다는 것이 당해 기술분야의 숙련자에 의해 인식될 것이다.

본 발명자들은 BMP-2 발현 컨스트럭트를 형질감염시킴으로써 안정한 섬유아세포 세포주를 제조하였다. 이들 BMP-2 생산 세포는 고농도의 활성 BMP-2 농도를 장기간 동안 시험관내에서 유지하였다.

골다공성 골 골절을 치유하는 방법

골다공증은 재흡수가 골 형성 단계를 좌우하여, 영향을 받은 골의 중량 지지력을 감소시키도록 골 형성, 골 재흡수 또는 둘다에서의 불균형을 일으키는 골량의 손실에 의해 야기되는 골격의 구조적인 퇴화이다. 건강한 성인에서, 골이 형성되고 재흡수되는 속도는 골격 골의 재생을 유지하도록 엄격하게 조정된다. 그러나, 골다공성 개체에서, 이들 골 리모델링(remodeling) 주기의 불균형이 진행되어, 골량이 손실되고, 골격의 연속성에서의 미세 구조의 결함을 형성한다. 리모델링 순서에서의 혼란에 의해 생성된 이들 골격 결함이 축적되고, 최종적으로 골격의 구조적 보존이 심각하게 손상되어, 골절 가능한 시점에서 이른다. 이 같은 불균형이 나이가 들어가면서 대부분의 개인에게서 점진적으로 나타날지라도(“노인성 골다공증”), 이는 훨씬 더 심각하며, 폐경 이후의 여성에서 빠르게 발생한다. 또한, 골다공증은 영양 및 내분비선의 불균형, 유전병 및 수많은 악성 혈질전환으로부터 기인할 수 있다.

본 발명의 목적은, 예를 들어 골격 골량을 감소시키는 질환, 특히 골 리모델링에서의 불균형을 야기하는 질환에 감염된 개개에서의 골 골절을 겪고 있는 환자의 골을 생성하는 방법 및 조성물을 개발하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 대사성 골 질환을 비롯한 골 질병을 겪고 있는 아이들의 골절을 치료하기 위해 골 성장을 증진시키는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 폐경 이후의 여성, 노인 및 투석을 받고 있는 환자를 비롯한, 골량이 감소할 위험이 있는 개인에서 골절된 골을 치료하는 것이다. 볼 발명의 또 다른 목적은 골 골절을 치료하는 단계를 포함하는, 구조적으로 손상된 골의 미세 구조에서 결함을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 따라서, 본 발명은 골 형성을 자극하여 선택적으로는 장기간에 걸쳐 골량을 증가시키는 것을 목적으로 하며, 특히 골격의 구조적인 퇴화로부터 기인된 새로운 골절의 발생을 감소시키는 것을 목적으로 한다.

문헌[Namkung-Matthai et al., Bone, 28: 80-86 (2001)]에서는 골절 이후 초기 기간 동안에 골 치료에 관하여 연구된 래트 골다공성 모델이 개시되어 있다. 초기는 골절 이후의 3 내지 6주 이내로서 언급된다. 문헌[Kubo et al. , Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202 (1999)]에는 또는 골절 이후의 말기 동안의 골 치료에 관하여 연구된 래트 골다공성 모델이 개시되어 있다. 말기는 골절 이후 약 12주로서 언급된다. 이들 참고문헌은 본원에서 골다공성 골 골절에 관한 골다공성 래트 모델 및 데이터의 개시에 있어 전체가 참고로 인용된다.

다른 양태에서, 본 발명은 골절 또는 파골 부위에 또는 이들 주변에 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 세포를 투여함으로서 척추동물, 예를 들어 포유동물에서 골 이식편을 강화하는 방법에 관한 것이다.

예를 들어, 미국 특허 제 6,521,750 호에 개시되어 있는 골절 기법, 조직 분석 및 생화학적 분석을 비롯한 골절 치유분석은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 이는, 특히 골다공성 개체에서의 골절의 정도 및 치료 과정을 야기할 뿐만 아니라, 측정하는 실험서의 개시내용에 있어서 본원에서 전체가 참고로 인용된다.

치료 용도에서, 치료학적 유효 조성물이 연결조직 세포와 함께 투여되어야 하는 경우, TGF-β 단백질은 국부 투여용으로 제제화될 수 있다. 기법 및 제제는 일반적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., latest edition]에서 찾아볼 수 있다. TGF-β 단백질인 활성 성분은 일반적으로 투여 방식 및 투여 형태의 특징에 따라 충진제, 증점제, 결합제, 습윤제, 분산제, 표면 활성제, 부식성 중합체, 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석제와 같이 담체와 조합된다. 전형적인 투여 형태는 분말, 현탁제, 유제 및 용제를 비롯한 액체 제제, 과립 및 캡슐제를 포함한다.

기타 적합한 약학적 담체의 예로는 N-(1-2,3-다이올레일옥시)프로필)-n,n,n-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA) 및 다이올레일포스파티틸 에탄올아민(DOPE)을 포함하지만, 이에 한정되지 않은 다양한 양이온성 액체가 있다. 리포좀은 또한 본 발명의 TGF-β 단백질 분자에 적합한 담체이다. 다른 적합한 담체는 서방형 겔 또는 TGF-β 단백질 분자를 포함하는 중합체이다.

TGF-β 단백질은 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 예를 들어 염 용액 또는 기타 적합한 액체의 임의의 양으로 혼합될 수 있다. 또한, TGF-β 단백질 분자가 조직 벽을 가로질러 이의 표적에 도달하고/하거나 TGF-β 단백질 및 생물학적 활성 형태의 이동을 촉진할 때까지 TGF-β 단백질 및 이의 생물학적 활성 형태가 분해되지 않도록 보호하는 기타 담체 수단과 조합될 수 있다.

척주 융합용 유전자 치료

본 발명은 척추가 융합되도록 요구되는 척주 구역에 본 발명의 조성물을 투여함으로써 척주상에 표적 척추를 융합시키는 방법에 관한 것이다. 형질전환되거나 형질감염된 연결조직 세포, 예를 들어 섬유아세포 또는 골전구 세포의 골원성 유효량은 주치의에 의해 최적화된 바와 같이, 1회 주사 또는 수회 주사로 결함 영역 또는 이의 골원성 유효 구역과 접촉하여, 표적 척추를 융합시킨다.

척주는 각각이 서로의 상부에 쌓여있는 골의 지주(척추)이며, 이들 사이에 큐션형 디스크(척추내 디스크)가 존재한다. 이 척추의 중심에는 척수가 존재한다. 척수 신경은 척수로부터 유래하고, 척추체(vertebral body) 사이의 공간을 통해 척주가 존재한다. 벌징 디스크(bulging disk) 또는 탈장된 디스크는 현존하는 척수 신경상에 압력을 가할 수 있다. 불안정한 척추는 골을 서로에 대해 미끄러져 나가게 하여, 요통 및 가능한 신경 손상을 야기한다. 상처 또는 퇴행성 질병에 의한 척추에서의 골 및 디스크의 변경은 요통 또는 종종 신경 손상을 야기할 수 있다.

척추 융합 외과 수술은 일반적으로 척추의 총체적인 불안정(비정상적인 움직임), 운동기능항진(hypermobility), 척추탈위증(spondylolisthesis)(다른 척추 위에 하나의 척추가 미끄러져 나옴), 기타 치료에 반응하지 않은 척추관절돌기(관절) 질환, 및 골절 또는 종양에 의해 심각한 퇴행성 질환을 앓는 사람에서 수행된다. 척추 융합 치료를 위한 최고의 후보자는 너무 비정상이어서 척추 사이의 공간이 50% 이상 붕괴되거나, 주변 골이 자극을 받을 정도로 붕괴된 개체이다.

골 이식편 및 종종 임플란트(implant)는 척주 융합 외과 수술 동안에 안정성을 증가시키기 위해 사용된다. 척추간 디스크의 일부가 제거된 후, 척추 골이 강화되고 성형되어 이식편 및 임플란트를 허용한다. 시간이 지남에 따라, 이식편은 인접한 척추 골과 서로에게 융합한다. 골이 융합된 경우에 척추는 더 이상 개별적으로 움직이지 않는다. 이는 척추를 더욱 안정하게 만든다. 전형적으로, 척추 융합 외과 수술에서 스크류(screw), 플레이트, 케이지, 금속 막대 및 기타 임플란트가 또한 안정성을 증가시키기 위해 사용된다.

치료학적 조성물

본 발명의 다른 실시태양에서, 연결조직 세포를 포함하는 TGF-β 상과 유전자 및 적합한 약학 담체를 포함하는, 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 환자에게 비경구 투여하기 위한 화합물이 제공된다.

치료 용도에서, TGF-β 상과의 일원을 암호화하는 유전자를 포함하는 연결조직 세포는 국부 투여용으로 제형화될 수 있다. 본 발명에서, 연결조직 세포는 일반적으로 투여 방식 및 투여 형태의 특징에 따라 충진제, 증점제, 결합제, 습윤제, 분산제, 표면 활성제, 부식성 중합체 및 윤활제를 포함할 수 있는 부형제의 희석제와 같은 담체와 조합된다.

주사용으로 적합한 약학 형태는 면균 증류수(즉, 가용성 수용액) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 약학 형태는 멸균되어야 하고, 용이하게 주사할 수 있는 정도로 유체이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하고, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리프로필렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물 또는 식물성 오일을 비롯한 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적합한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅물의 사용, 분산액의 경우에 목적하는 입자 크기의 유지 및 슈퍼펙턴트(superfactant)의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오머살(theomersal) 등에 의해 미생물 작용을 예방할 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 장기간 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 야기될 수 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 유리하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료될 포유동물 개체를 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적인 개개의 단위를 지칭하며, 이때 각각의 단위는 목적하는 약학적 담체와 함께 목적하는 치료학적 효과를 얻기 위해 계산된 소정량의 활성 물질을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태를 위한 사양은 (a) 활성 물질의 고유의 특징 및 달성될 특정한 치료 효과, (b) 신체적 건강이 손상을 입은 질병 상태를 갖는 생물 개체에서의 질환의 치료를 위해 상기 활성 물질을 조합하는 당해 기술분야에서의 본질적인 한계에 의해 기술되며, 이들에 직접적으로 의존한다.

주요 활성 성분은 단일 투여 형태로 적합한 약학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 유효량의 편리하고 효과적인 투여를 위해 제조된다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 통상적인 투여량 및 투여 방법을 참고하여 측정한다.

전달 시스템

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 조성물, 예를 들어 리포좀, 미세입자 및 미세캡슐의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis), 레트로바이러스성 벡터 또는 기타 벡터의 일부로서 핵산의 구축 등을 투여하는 데 사용될 수 있고, 기타 생물 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국부 투여될 수 있다.

특정한 실시태양에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 구역에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 이는, 예를 들어 한정에 의해서가 아니라, 외과 수술 동안의 국부 주입, 좌제의 수단, 또는 임플란트의 수단에 의해 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 시알라스틱 막과 같은 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질이다.

본 발명은 본원에서 기술된 특정한 실시태양에 의해 범위가 한정되어서는 않된다. 실제로, 본원에서 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 기술분야의 숙련자에게 자명하게 될 것이다. 이같은 변형은 첨부된 특허청구의 범위내에 있는 것으로 의도된다. 하기 실시예는 본 발명을 한정하기 위함이 아니라, 예시할 목적으로 제공된다.

<실시예 1> 골 재생을 위한 실험 방법

인간 BMP2 유전자를 인간 태아 뇌 cDNA 및 2개의 프라이머를 사용하는 PCR(폴리머자제 연쇄 반응)에 의해 클로닝하였다. 5‘ 프라이머는 5'-TCCCAGCGTGAAAAGAGAGACTGC-3'(서열번호: 1)이고, 3’ 프라이머는 5'-TTTTGCTGTACTAGCGACACCCACAACC-3'(서열번호: 2)이다. GC 풍부 PCR 시스템(Roche)을 이용한 PCR 이후, CRII-TOPO 벡터에의 클로닝은 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 수행되었다(도 1). 레트로바이러스성 벡터에 클로닝하기 위해, pCRIIbmp2 DNA를 Sal I 및 Not I로 절단하였다. 인간 BMP2 cDNA 삽입체(약 1.2kb)를 Sal I 및 Not I 돌출 서열(overhang)을 갖는 pMTMLV에 연결하였다(도 1B).

패키징 세포주(packaging cell line) GP-293 세포(5 x 10⁵ 세포/p60 배양 접시)를 형질감염시키기 하루 전에 배양하였다. pMTMLV 또는 pMT-BMP2를 푸겐(Fugene, Roche)을 이용하여 GP-293 세포에 형질 감형시켰다. 형질감염 48시간 후, 네오마이신을 배양 배지에 첨가하여 네오마이신 내성 세포를 선별하였다. 선별은 10일 동안 계속하였다. 플라스미드 pVSVG를 암호화하는 외피(envelop)의 후일 형질감염을 위해 선별된 293MT 및 293MTBMP2 세포를 배양하였다(1 x 10⁵ 세포/p60 배양 접시). 형질감염 24시간 후, 표적 세포 NIH3T3을 감염을 위해 도말하였다(5 x 10⁵ 세포/p60 배양 접시). 형질감염된 세포의 상층액을 저-단백질 결합 필터(0.45㎛)를 통해 여과하고, 형질 감염 48시간 후에 동일한 부피의 DMEM으로 희석하였다. HIH3T3의 배양 배지를 제거하고, 여과된 상층액으로 교체하였다. 폴리브렌을 8㎛/㎖의 최종 농도에 첨가하였다. 감염 이틀 후에 네오마이신 선별을 시작하여 NIH3T3-네오 및 NIH3T3-BMP-2의 안정한 세포주를 수득하였다. 선별을 10일 동안 계속하였다. 생산된 BMP2의 양은 24시간 말기에 약 15ng/10⁵인 것으로 측정되었다.

<실시예 2> 토끼에 NIH3T3-BMP2 세포의 주사

중량이 2.0 내지 2.5㎏인 뉴질랜드 백색 토기를 동물 연구용으로 선별하였다. 경골을 노출시키고, 정형술 외과 기기를 사용하여 결함(길이: 2㎝ 및 깊이: 0.5㎝)을 만들었다. 봉입한 후에 대조군 NIH3T3-네오 또는 NIH3T3-BMP-2 세포(2㎖의 2 x 10⁶세포/㎖)를 결함 구역에 주사하였다. 세포에 주사한지 8주 후, 방사선 촬영 분석 및 조직 검사를 수행하였다.

<실시예 3> 매주 방사선 촬영 검사

중량이 2.0 내지 2.5㎏인 뉴질랜드 백색 토기를 동물 연구용으로 선별하였다. 경골을 노출시키고, 정형술 외과 기기를 사용하여 결함(길이: 2㎝ 및 깊이: 0.5㎝)을 만들었다. 봉입한 후에 NIH3T3-BMP-2 세포(2㎖의 2 x 10⁶세포/㎖)를 결함 구역에 주사하였다. 세포를 주사한지 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7주 후에 방사선 촬영 분석을 수행하였다. 주사한지 7주 후에 표본을 수확하고, 사진 촬영을 수행하였다. 조직 검사는 수확 수에 수행하였다.

도 2A 내지 도 2F는 NIH3T3-BMP-2 섬유아세포에 의한 골의 재생을 나타낸 것이다. 도 2A 및 도 2B는 대조군 NIH3T3 섬유아세포(A) 및 NIH3T3-BMP-2 세포(B)의 방사선 촬영 감사를 나타낸 것이다. 도 2C 내지 도 2F는 동물의 희생시키기 전에 대조군 (C 및 D) 및 실험군(E 및 F)의 다리뼈를 방사선 촬영 검사를 나타낸 것이다. BMP-2 단백질을 발현하는 세포로 처리된 골의 결함은 주사한지 8주 후에 치유되었지만, 대조군 섬유아세포로 처리된 골 결함은 골 재생이 일어나지 않았다.

도 3A 내지 도 3D는 재생된 골 조직을 조직 검사한 것을 나타낸 것이다. 재생된 골 조직의 파라핀 절단부분을 제조하고, 마송 삼색(Mason's trichrome)으로 염색하였다. 그 결과, 재생된 골 조직(RB)의 구조는 정상 골 조직(NB)과 거의 동일한 것으로 나타났다. 도 3A 및 도 3B는 저배율(40x) 사진을 나타내고, 도 3C 및 도 3D는 고배율(100x) 사진을 나타낸다. 점선은 재생 골조직과 정상 골 조직 사이의 경계선을 나타낸다. 이들 결과는 재생된 골의 품질이 정상 골과 유사하다는 것을 보여준다.

도 4A 내지 도 4I는 HIH3T3-hBMP2 섬유아세포에 의해 골이 재생된 것을 나타낸다. 봉합후에 NIH3T3-hBMP2 세포(2㎖의 2 x 10⁶ 세포/㎖)를 경골(tibia bone)에서의 결함 구역에 주사하였다. (A 내지 G): 세포를 주사한지 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7주 후에 방사선 촬영 분석을 수행하였다. 그 결과, 세포를 주사한지 3주 후에 결함이 새롭게 생성된 고 조직으로 채워지기 시작했고, 주사한지 7주 후에 완성되었다. (H): 주사한지 7주 후에 표본을 수확하고, 사진 촬영을 하였다. 또한, 이 사진은 재생된 골 조직에 의해 겸함이 완전히 충전됨을 보여준다. (I): 수확후에 조직 검사를 수행하였다. 마송 삼색 염색의 결과가 나타나 있다. 염색 결과는 치료된 골 조직이 정상 골 조직과 유사한 특징을 갖는다는 것을 보여준다.

도 5A 내지 도 5I는 대조군 DMEM 배지에 의한 골의 재생을 보여주는 것이다. 봉합후에 대조군 DMEM 배양 배지(2㎖)를 경골(tibia bone)에서의 결함 부위에 주사하였다. (A 내지 G): 세포를 주사한지 1일, 1, 2, 3, 4, 5 및 6주 후에 방사선 촬영 분석을 수행하였다. NIH3T3-hBMP2 섬유아세포에 의한 데이터와는 대조적으로, 그 결과는 세포를 주사한지 6주 후에도 결함이 완전히 채워지지 않았음을 보여준다. (H): 주사한지 6주 후에 표본을 수확하고, 사진을 촬영하였다. 이 사진은 또한 겸함의 불완전한 충전을 보여준다. (I): 수확후에 조직 검사를 수행하였다. 마송 삼색 염색의 결과가 나타나 있다.

<실시예 4> HIH3T3에 의한 골다공성 래트의 주사

문헌[Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68: 197-202, 1999] 및 문헌[Namkung-Matthai et al., Bone, 28: 80-86, 2001]에 개시된 바와 같은 골다공성 모델 래트를 사용하였다. 경골을 노출시키고, 정형술 외과 기기를 이용하여 결함(길이: 2㎝ 및 깊이: 0.5㎝)을 만들었다. 봉입한 후에 대조군 HIH3T3-네오 또는 HIH3T3-BMP-2 세포(2㎖의 2 x 10⁶ 세포/㎖)를 결함 구역에 주사하였다. 수주 간격, 특히 세포를 주사한지 8주 후에, 방사선 촬영 분석 및 조직 검사를 수행하였다.

<실시예 5> 척주 융합을 위한 실험 방법

인간 BMP2를 클로닝하고, 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 NIH3T3에 형질감염시켰다. 인간(표피 섬유아세포 유래 세포주, 단계 I), 쥐(HIH3T3, 단계 I), 래트(루이스(Lewis) 래트 위관절(pseudoarthrosis) 섬유 조직 유래 섬유아세포, 단계 II) 및 인간(위관절 섬유성 조직/상흔 조직 유래 섬유아세포, 단계 II)으로 부터의 부착성 섬유아세포를 개별적으로 배양하고, 레트로바이러스를 통해 BMP-2 cDNA로 감염시켰다. 60㎜ 접시 중의 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 미국 버지니아주 헤른돈(Herndon) 소재의 Cellgro), 10% 열 불활성 우 태아 혈청(미국 뉴욕주 아일랜드 소재의 Gibco BRL) 및 페니실린 및 스트렙토마이신(미국 버지니아주 헤른돈 소재의 Cellgro)을 사용하여 세포를 성장시켰다. 섬유아세포를 레트로바이러스-BMP-2 또는 -lacZ(음성 대조군)로 2일 동안 4시간/일 동안 감염시켰다. ELISA를 완성하여 발현된 단백질의 농도(ng/㎖)를 측정하였다. 각각의 종에 있어서, 5 x 10⁶, 10 x 10⁶, 20 x 10⁶의 양의 BMP-2 생산 세포를 1 x 0.5㎝ 콜라겐 지혈용 스폰지( 미국 뉴저지주 플레인스보로(Plainsboro) 소재의 ACS, Helistat, Integra LifeSciences). 0.16 내지 0.18㎎/㎖ rhBMP-2 (미국마세추세츠주 캠브리지 소재의 Genetics Institute)를 1 x 0.5㎝ ACS(양성 대조군)에 흡수시켰다. 세분된 장골 융기골을 융합 부위에 놓았다.

실시예 6. 래트의 척주내로의 세포의 주사

총 48 마리의 자성 성인(3 내지 4월령) 무흉선 rnu/rnu 래트를 사용하였다(단계 1에서 24시간 동안; 및 단계 II에서 24시간 동안). 래트를 마취시켰다. 후배부 중선법(posterior midline approach)을 사용하여 L4 및 L5의 횡근 융기를 노출시켰다. 고속 블러(blurr)를 사용하여 횡근 융기만을 박피하였다. 부위를 자극하였다(항생제-링거액). 세포/ACS를 L4 및 L5 횡근 융기 베드 사이에 이식시켰다. 절개부분을 접하였다. 희생시킬 때까지 2주마다 방사선 촬영을 수행하였다. L4 및 L5 단편을 수동으로 촉진하였다. 횡근 융기 사이에서 검출된 움직임은 융합 실패로 간주된다. 비-탈회석화 조직 검사를 수행하였다.

도 6A 및 도 6B는 흡수성 콜라겐 스폰지(absorbable collagen sponge, ACS) 담체를 이용하여 세포를 이식하는 후측면 사이근 공정(posterolateral intertransverse process) 융합 방법의 4 및 6주 이후의 래트TG001의 방사선 사진을 나타낸 것이다. 후측면 사이근 공정 융합 연구에 있어서, 좌측의 방사선 촬영 연결골(bridging bone)은 BMP-2 5 x 10⁶ 섬유아세포(생쥐)를 cDNA로 형질감염한 후에 둘러 쌓인다. 만약 존재하는 경우, 우측상의 보다 적은 세포 및 보다 적은 골 형성을 주목한다. 도시된 바와 같이, 골이 생성되었고, 척추의 융합이 일어났다.

본 원에서 인용된 모든 참고문헌은 전체가 참고로 인용된다.

본 발명의 특정한 실시태양은 본 발명을 예시할 목적으로 상술되었지만, 첨부된 특허청구범위에서 정의된 바와 같이 본 발명에서 벗어나지 않는 한, 본 발명의 세부사항을 다수 변경할 수 있음이 당해 기술분야의 숙련자에게 자명할 것이다.

<110> Eisai Co., Ltd. <120> PRESYNAPTIC PROTEIN P120 <150> JP 2002-063186 <151> 2002-03-08 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2932 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (59)..(2929) <400> 1 aagccatcac gctgcctagc atttcttccc ttcagtagcg ccacgtcaca gaagaaaa 58 atg tac ggg agt gca aga aca atc agc aat ccg gaa ggc agc cct tcc 106 Met Tyr Gly Ser Ala Arg Thr Ile Ser Asn Pro Glu Gly Ser Pro Ser 1 5 10 15 aga tcg ccg cgt ttg cca agg tct cct cgt ttg ggc cac cga aga aca 154 Arg Ser Pro Arg Leu Pro Arg Ser Pro Arg Leu Gly His Arg Arg Thr 20 25 30 agc agt ggg gga ggg gga ggg aca ggc aag act ctg tct atg gag aac 202 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Lys Thr Leu Ser Met Glu Asn 35 40 45 atc cag tcc ctt aat gcg gcc tat gcc acg tct gga ccc atg tac ttg 250 Ile Gln Ser Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Thr Ser Gly Pro Met Tyr Leu 50 55 60 agt gac cat gaa ggg gtg gca tca aca act tac cca aag ggc acc atg 298 Ser Asp His Glu Gly Val Ala Ser Thr Thr Tyr Pro Lys Gly Thr Met 65 70 75 80 act cta ggc agg gcc aca aat cga gct gtt tat gga ggc cgg gtc aca 346 Thr Leu Gly Arg Ala Thr Asn Arg Ala Val Tyr Gly Gly Arg Val Thr 85 90 95 gcc atg ggg agt agt ccc aat att gct tcc gct gga ctt tcc cac aca 394 Ala Met Gly Ser Ser Pro Asn Ile Ala Ser Ala Gly Leu Ser His Thr 100 105 110 gat gtc ctt tca tat acg gat caa cat gga ggg ctg ggt ggc tca tcc 442 Asp Val Leu Ser Tyr Thr Asp Gln His Gly Gly Leu Gly Gly Ser Ser 115 120 125 cac cac cac cac cac cag gtg ccc tcc atg ttg agg cag gta aga gac 490 His His His His His Gln Val Pro Ser Met Leu Arg Gln Val Arg Asp 130 135 140 agc acg atg ttg gat ctt caa gcc cag ctc aaa gaa ctg cag aga gag 538 Ser Thr Met Leu Asp Leu Gln Ala Gln Leu Lys Glu Leu Gln Arg Glu 145 150 155 160 aat gac ctc ctt cgc aag gag ctt gac att aag gac agc aaa ctg ggg 586 Asn Asp Leu Leu Arg Lys Glu Leu Asp Ile Lys Asp Ser Lys Leu Gly 165 170 175 tct tcc atg aat agc atc aag act ttc tgg agt cct gag ctt aag aag 634 Ser Ser Met Asn Ser Ile Lys Thr Phe Trp Ser Pro Glu Leu Lys Lys 180 185 190 gag aga gtc ttg agg aaa gag gag gct gct cgc atg tct gtc ctc aag 682 Glu Arg Val Leu Arg Lys Glu Glu Ala Ala Arg Met Ser Val Leu Lys 195 200 205 gag cag atg agg gtt tct cac gaa gaa aac cag cac ctg cag ttg acc 730 Glu Gln Met Arg Val Ser His Glu Glu Asn Gln His Leu Gln Leu Thr 210 215 220 atc cag gcc ctt cag gat gaa ctg cgg acc cag aga gac ctc aac cac 778 Ile Gln Ala Leu Gln Asp Glu Leu Arg Thr Gln Arg Asp Leu Asn His 225 230 235 240 ctc ctg cag caa gag agt ggc aac cga gga gca gag cat ttc acc atc 826 Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Asn Arg Gly Ala Glu His Phe Thr Ile 245 250 255 gag ctg acg gag gag aac ttc cgc agg ctc caa gcc gaa cac gac agg 874 Glu Leu Thr Glu Glu Asn Phe Arg Arg Leu Gln Ala Glu His Asp Arg 260 265 270 cag gcc aag gag ctg ttc ctt ctg cgg aag aca ttg gaa gaa atg gag 922 Gln Ala Lys Glu Leu Phe Leu Leu Arg Lys Thr Leu Glu Glu Met Glu 275 280 285 cta agg att gaa aca cag aaa cag act ctc aat gcc cgc gac gag tcc 970 Leu Arg Ile Glu Thr Gln Lys Gln Thr Leu Asn Ala Arg Asp Glu Ser 290 295 300 att aaa aag ctc ctg gag atg ctg cag agt aag ggc ttg cca tcg aaa 1018 Ile Lys Lys Leu Leu Glu Met Leu Gln Ser Lys Gly Leu Pro Ser Lys 305 310 315 320 agc cta gag gac gac aac gag cgc aca cgg cgg atg gcc gag gct gag 1066 Ser Leu Glu Asp Asp Asn Glu Arg Thr Arg Arg Met Ala Glu Ala Glu 325 330 335 tct cag gtc agc cac ttg gaa gtg att tta gac cag aag gag aag gaa 1114 Ser Gln Val Ser His Leu Glu Val Ile Leu Asp Gln Lys Glu Lys Glu 340 345 350 aac atc cac ctg aga gag gaa ttg cac cga aga agc caa ctt cag ccg 1162 Asn Ile His Leu Arg Glu Glu Leu His Arg Arg Ser Gln Leu Gln Pro 355 360 365 gag cca gcc aag acg aag gcg ctc cag act gtc atc gaa atg aag gac 1210 Glu Pro Ala Lys Thr Lys Ala Leu Gln Thr Val Ile Glu Met Lys Asp 370 375 380 aca aaa att gct tca ctg gag cgg aac atc cgg gac ctc gag gat gag 1258 Thr Lys Ile Ala Ser Leu Glu Arg Asn Ile Arg Asp Leu Glu Asp Glu 385 390 395 400 atc cag atg ttg aaa gcc aat ggt gtg ctc aac aca gag gac cga gag 1306 Ile Gln Met Leu Lys Ala Asn Gly Val Leu Asn Thr Glu Asp Arg Glu 405 410 415 gag gag atc aaa cag atc gag gtg tac aaa agc cac tcc aag ttt atg 1354 Glu Glu Ile Lys Gln Ile Glu Val Tyr Lys Ser His Ser Lys Phe Met 420 425 430 aag acc aag aat gac cag ctg aaa cag gaa ctt tcc aag aag gag tca 1402 Lys Thr Lys Asn Asp Gln Leu Lys Gln Glu Leu Ser Lys Lys Glu Ser 435 440 445 gaa ctt ctt gcc tta caa aca aag ctt gaa acc ctt agc aat cag aat 1450 Glu Leu Leu Ala Leu Gln Thr Lys Leu Glu Thr Leu Ser Asn Gln Asn 450 455 460 tca gat tgc aag caa cac att gaa gtg ctt aaa gag tca ctt act gcc 1498 Ser Asp Cys Lys Gln His Ile Glu Val Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ala 465 470 475 480 aaa gaa cag agg gct gcc atc ctt cag act gag gta gat gca ctg aga 1546 Lys Glu Gln Arg Ala Ala Ile Leu Gln Thr Glu Val Asp Ala Leu Arg 485 490 495 tta cgg ctg gaa gag aaa gaa tct ttt ctc aat aag aaa aca aaa cag 1594 Leu Arg Leu Glu Glu Lys Glu Ser Phe Leu Asn Lys Lys Thr Lys Gln 500 505 510 ctc caa gac ctc act gaa gag aag ggg acc cta gct gga gag atc cgt 1642 Leu Gln Asp Leu Thr Glu Glu Lys Gly Thr Leu Ala Gly Glu Ile Arg 515 520 525 gat atg aaa gat atg tta gaa gta aag gaa aga aaa atc aat gtt ctt 1690 Asp Met Lys Asp Met Leu Glu Val Lys Glu Arg Lys Ile Asn Val Leu 530 535 540 cag aaa aaa att gaa aac ttg caa gaa caa ctt agg gat aag gac aaa 1738 Gln Lys Lys Ile Glu Asn Leu Gln Glu Gln Leu Arg Asp Lys Asp Lys 545 550 555 560 caa ctg acc aac ctg aaa gac aga gtg aag tcc ctg cag acg gac tcc 1786 Gln Leu Thr Asn Leu Lys Asp Arg Val Lys Ser Leu Gln Thr Asp Ser 565 570 575 agc aac act gac act gct ctg gcc act ctg gag gag gcc ttg tcg gaa 1834 Ser Asn Thr Asp Thr Ala Leu Ala Thr Leu Glu Glu Ala Leu Ser Glu 580 585 590 aag gag aga ata ata gag cgc ttg aaa gag cag agg gag aga gat gat 1882 Lys Glu Arg Ile Ile Glu Arg Leu Lys Glu Gln Arg Glu Arg Asp Asp 595 600 605 cgg gaa aga cta gaa gag ata gaa tcc ttt cga aag gag aac aaa gac 1930 Arg Glu Arg Leu Glu Glu Ile Glu Ser Phe Arg Lys Glu Asn Lys Asp 610 615 620 ctc aaa gag aag gtc aat gct tta cag gct gag ctg aca gag aaa gag 1978 Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Leu Gln Ala Glu Leu Thr Glu Lys Glu 625 630 635 640 tct agt tta atc gac ctc aaa gaa cat gca tct tca tta gct tct gca 2026 Ser Ser Leu Ile Asp Leu Lys Glu His Ala Ser Ser Leu Ala Ser Ala 645 650 655 gga ctg aag agg gac tcg aaa cta aag tct cta gaa ata gcc att gaa 2074 Gly Leu Lys Arg Asp Ser Lys Leu Lys Ser Leu Glu Ile Ala Ile Glu 660 665 670 caa aag aag gag gaa tgc aac aaa cta gaa gca caa ttg aaa aag gca 2122 Gln Lys Lys Glu Glu Cys Asn Lys Leu Glu Ala Gln Leu Lys Lys Ala 675 680 685 cat aat att gaa gat gac tcc agg atg aac ccc gag ttt gca gac cga 2170 His Asn Ile Glu Asp Asp Ser Arg Met Asn Pro Glu Phe Ala Asp Arg 690 695 700 ctg aaa cag ctg gac aag gaa gca tct tac tac cgt gat gag tgt ggc 2218 Leu Lys Gln Leu Asp Lys Glu Ala Ser Tyr Tyr Arg Asp Glu Cys Gly 705 710 715 720 aag gct caa gca gaa gtc gac agg ttg ctg gag atc ctc aag gag gtg 2266 Lys Ala Gln Ala Glu Val Asp Arg Leu Leu Glu Ile Leu Lys Glu Val 725 730 735 gag aat gag aaa aac gac aaa gac aag aag att gcg gaa ctt gag agc 2314 Glu Asn Glu Lys Asn Asp Lys Asp Lys Lys Ile Ala Glu Leu Glu Ser 740 745 750 ttg act ctc agg cat atg aaa gat cag aat aag aag gtg gcc aac ctc 2362 Leu Thr Leu Arg His Met Lys Asp Gln Asn Lys Lys Val Ala Asn Leu 755 760 765 aag cac aac caa cag ctg gag aag aag aag aac gcc cag tta tta gaa 2410 Lys His Asn Gln Gln Leu Glu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu Leu Glu 770 775 780 gaa gtg cgc cgg cga gaa ttt agc atg gtt gac aac tca cag cat ttg 2458 Glu Val Arg Arg Arg Glu Phe Ser Met Val Asp Asn Ser Gln His Leu 785 790 795 800 cag atc gag gag ctg atg aat gcc ttg gag aag acc aga cag gaa ctg 2506 Gln Ile Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Glu Lys Thr Arg Gln Glu Leu 805 810 815 gac gcc acc aaa gca cgc ctc gcc tct acc cag caa tca ttg gct gag 2554 Asp Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Ser Thr Gln Gln Ser Leu Ala Glu 820 825 830 aag gaa gca cac cta gcc aat ctc cgg atg gag agg agg aaa cag cta 2602 Lys Glu Ala His Leu Ala Asn Leu Arg Met Glu Arg Arg Lys Gln Leu 835 840 845 gag gag atc ttg gag atg aaa cag gaa gcg tta ctt gcg gcc atc agt 2650 Glu Glu Ile Leu Glu Met Lys Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ala Ile Ser 850 855 860 gaa aag gat gca aac att gcc ttg ctg gag tta tct gcc tcc aag aag 2698 Glu Lys Asp Ala Asn Ile Ala Leu Leu Glu Leu Ser Ala Ser Lys Lys 865 870 875 880 aaa aag acg cag gag gaa gtc atg gca ctg aag cgg gag aaa gac cga 2746 Lys Lys Thr Gln Glu Glu Val Met Ala Leu Lys Arg Glu Lys Asp Arg 885 890 895 ctg gtg cat cag tta aag cag cag acc cag aat aga atg aag ctg atg 2794 Leu Val His Gln Leu Lys Gln Gln Thr Gln Asn Arg Met Lys Leu Met 900 905 910 gca gac aac tat gac gac gac cac cac cat tac cac cac cac cac cat 2842 Ala Asp Asn Tyr Asp Asp Asp His His His Tyr His His His His His 915 920 925 cac cac cac cac cgg tct cct ggg agg tca cag cat tcc aac cac agg 2890 His His His His Arg Ser Pro Gly Arg Ser Gln His Ser Asn His Arg 930 935 940 ccc tct ccg gac cag gat gac gag gag ggc ata tgg gca t ag 2932 Pro Ser Pro Asp Gln Asp Asp Glu Glu Gly Ile Trp Ala 945 950 955 <210> 2 <211> 957 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Met Tyr Gly Ser Ala Arg Thr Ile Ser Asn Pro Glu Gly Ser Pro Ser 1 5 10 15 Arg Ser Pro Arg Leu Pro Arg Ser Pro Arg Leu Gly His Arg Arg Thr 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Lys Thr Leu Ser Met Glu Asn 35 40 45 Ile Gln Ser Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Thr Ser Gly Pro Met Tyr Leu 50 55 60 Ser Asp His Glu Gly Val Ala Ser Thr Thr Tyr Pro Lys Gly Thr Met 65 70 75 80 Thr Leu Gly Arg Ala Thr Asn Arg Ala Val Tyr Gly Gly Arg Val Thr 85 90 95 Ala Met Gly Ser Ser Pro Asn Ile Ala Ser Ala Gly Leu Ser His Thr 100 105 110 Asp Val Leu Ser Tyr Thr Asp Gln His Gly Gly Leu Gly Gly Ser Ser 115 120 125 His His His His His Gln Val Pro Ser Met Leu Arg Gln Val Arg Asp 130 135 140 Ser Thr Met Leu Asp Leu Gln Ala Gln Leu Lys Glu Leu Gln Arg Glu 145 150 155 160 Asn Asp Leu Leu Arg Lys Glu Leu Asp Ile Lys Asp Ser Lys Leu Gly 165 170 175 Ser Ser Met Asn Ser Ile Lys Thr Phe Trp Ser Pro Glu Leu Lys Lys 180 185 190 Glu Arg Val Leu Arg Lys Glu Glu Ala Ala Arg Met Ser Val Leu Lys 195 200 205 Glu Gln Met Arg Val Ser His Glu Glu Asn Gln His Leu Gln Leu Thr 210 215 220 Ile Gln Ala Leu Gln Asp Glu Leu Arg Thr Gln Arg Asp Leu Asn His 225 230 235 240 Leu Leu Gln Gln Glu Ser Gly Asn Arg Gly Ala Glu His Phe Thr Ile 245 250 255 Glu Leu Thr Glu Glu Asn Phe Arg Arg Leu Gln Ala Glu His Asp Arg 260 265 270 Gln Ala Lys Glu Leu Phe Leu Leu Arg Lys Thr Leu Glu Glu Met Glu 275 280 285 Leu Arg Ile Glu Thr Gln Lys Gln Thr Leu Asn Ala Arg Asp Glu Ser 290 295 300 Ile Lys Lys Leu Leu Glu Met Leu Gln Ser Lys Gly Leu Pro Ser Lys 305 310 315 320 Ser Leu Glu Asp Asp Asn Glu Arg Thr Arg Arg Met Ala Glu Ala Glu 325 330 335 Ser Gln Val Ser His Leu Glu Val Ile Leu Asp Gln Lys Glu Lys Glu 340 345 350 Asn Ile His Leu Arg Glu Glu Leu His Arg Arg Ser Gln Leu Gln Pro 355 360 365 Glu Pro Ala Lys Thr Lys Ala Leu Gln Thr Val Ile Glu Met Lys Asp 370 375 380 Thr Lys Ile Ala Ser Leu Glu Arg Asn Ile Arg Asp Leu Glu Asp Glu 385 390 395 400 Ile Gln Met Leu Lys Ala Asn Gly Val Leu Asn Thr Glu Asp Arg Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Lys Gln Ile Glu Val Tyr Lys Ser His Ser Lys Phe Met 420 425 430 Lys Thr Lys Asn Asp Gln Leu Lys Gln Glu Leu Ser Lys Lys Glu Ser 435 440 445 Glu Leu Leu Ala Leu Gln Thr Lys Leu Glu Thr Leu Ser Asn Gln Asn 450 455 460 Ser Asp Cys Lys Gln His Ile Glu Val Leu Lys Glu Ser Leu Thr Ala 465 470 475 480 Lys Glu Gln Arg Ala Ala Ile Leu Gln Thr Glu Val Asp Ala Leu Arg 485 490 495 Leu Arg Leu Glu Glu Lys Glu Ser Phe Leu Asn Lys Lys Thr Lys Gln 500 505 510 Leu Gln Asp Leu Thr Glu Glu Lys Gly Thr Leu Ala Gly Glu Ile Arg 515 520 525 Asp Met Lys Asp Met Leu Glu Val Lys Glu Arg Lys Ile Asn Val Leu 530 535 540 Gln Lys Lys Ile Glu Asn Leu Gln Glu Gln Leu Arg Asp Lys Asp Lys 545 550 555 560 Gln Leu Thr Asn Leu Lys Asp Arg Val Lys Ser Leu Gln Thr Asp Ser 565 570 575 Ser Asn Thr Asp Thr Ala Leu Ala Thr Leu Glu Glu Ala Leu Ser Glu 580 585 590 Lys Glu Arg Ile Ile Glu Arg Leu Lys Glu Gln Arg Glu Arg Asp Asp 595 600 605 Arg Glu Arg Leu Glu Glu Ile Glu Ser Phe Arg Lys Glu Asn Lys Asp 610 615 620 Leu Lys Glu Lys Val Asn Ala Leu Gln Ala Glu Leu Thr Glu Lys Glu 625 630 635 640 Ser Ser Leu Ile Asp Leu Lys Glu His Ala Ser Ser Leu Ala Ser Ala 645 650 655 Gly Leu Lys Arg Asp Ser Lys Leu Lys Ser Leu Glu Ile Ala Ile Glu 660 665 670 Gln Lys Lys Glu Glu Cys Asn Lys Leu Glu Ala Gln Leu Lys Lys Ala 675 680 685 His Asn Ile Glu Asp Asp Ser Arg Met Asn Pro Glu Phe Ala Asp Arg 690 695 700 Leu Lys Gln Leu Asp Lys Glu Ala Ser Tyr Tyr Arg Asp Glu Cys Gly 705 710 715 720 Lys Ala Gln Ala Glu Val Asp Arg Leu Leu Glu Ile Leu Lys Glu Val 725 730 735 Glu Asn Glu Lys Asn Asp Lys Asp Lys Lys Ile Ala Glu Leu Glu Ser 740 745 750 Leu Thr Leu Arg His Met Lys Asp Gln Asn Lys Lys Val Ala Asn Leu 755 760 765 Lys His Asn Gln Gln Leu Glu Lys Lys Lys Asn Ala Gln Leu Leu Glu 770 775 780 Glu Val Arg Arg Arg Glu Phe Ser Met Val Asp Asn Ser Gln His Leu 785 790 795 800 Gln Ile Glu Glu Leu Met Asn Ala Leu Glu Lys Thr Arg Gln Glu Leu 805 810 815 Asp Ala Thr Lys Ala Arg Leu Ala Ser Thr Gln Gln Ser Leu Ala Glu 820 825 830 Lys Glu Ala His Leu Ala Asn Leu Arg Met Glu Arg Arg Lys Gln Leu 835 840 845 Glu Glu Ile Leu Glu Met Lys Gln Glu Ala Leu Leu Ala Ala Ile Ser 850 855 860 Glu Lys Asp Ala Asn Ile Ala Leu Leu Glu Leu Ser Ala Ser Lys Lys 865 870 875 880 Lys Lys Thr Gln Glu Glu Val Met Ala Leu Lys Arg Glu Lys Asp Arg 885 890 895 Leu Val His Gln Leu Lys Gln Gln Thr Gln Asn Arg Met Lys Leu Met 900 905 910 Ala Asp Asn Tyr Asp Asp Asp His His His Tyr His His His His His 915 920 925 His His His His Arg Ser Pro Gly Arg Ser Gln His Ser Asn His Arg 930 935 940 Pro Ser Pro Asp Gln Asp Asp Glu Glu Gly Ile Trp Ala 945 950 955 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 3 taatggcaga ggctgagtct ca 22 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 4 tcagtcacga atttcaccgg cca 23 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized peptide sequence <400> 5 Ser Asn His Arg Pro Ser Pro Asp Gln Asp Asp Glu Glu Gly Ile Trp 1 5 10 15 Ala <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized peptide sequence <400> 6 Ser Pro Asp Gln Asp Asp Glu Glu Gly Ile Trp Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized peptide sequence <400> 7 Ser Pro Asp Gln Asp Asp Glu Glu Gly 1 5 <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized peptide sequence <400> 8 Ala Asp Asp Gln Ser Pro Glu Trp Glu Ile Gly Asp 1 5 10

Claims

a) 프로모터에 작동가능하게 연결된 벡터에 골 형성 기능(bone generating function)을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계;

b) 상기 재조합 벡터로 시험관내(in vitro) 연결조직 세포의 군집을 형질감염 또는 형질도입시키는 단계: 및

c) 골 결함 부위(bone deficit site)에 포유동물 세포를 이식하여 골 결함 부위에서 골을 형성시키는 단계

를 포함하는, 저골량(low bone bass)을 앓고 있는 개체(subject)를 위해 골 결함 부위에서의 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스성 벡터인 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 유전자가 TGF-β상과(superfamily)에 속하는 골 생성 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP를 암호화하는 골 생성 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP-2인 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 연결조직 세포가 섬유아세포(fibroblast)인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 연결조직 세포가 골 전구세포(bone progenitor cell)인 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 골이 초기(early period) 동안에 생성되는 골 생성 방법.
제 1 항에 있어서, 골이 말기(late period) 동안에 생성되는 골 생성 방법.
a) 벡터에 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계;

b) 상기 재조합 벡터로 시험관내 연결조직 세포의 군집을 형질감염 또는 형질도입시키는 단계: 및

c) 형질감염 또는 형질도입된 연결조직 세포의 개체의 골원성(osteogenic) 유효량 및 이의 약학적으로 허용가능한 담체를 척주(spine)와 접촉시켜, 척주에서 상기 유전자를 암호화하는 DNA 서열의 발현으로 골을 생성하여 척주를 융합시키는 단계

를 포함하는 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스성인 벡터인 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 연결조직 세포가 섬유아세포인 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 연결조직 세포가 골 전구세포인 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 유전자가 TGF-β상과인 척주 융합 방법.
제 16 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP를 암호화하는 척주 융합 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP-2를 암호화하는 척주 융합 방법.
a) 벡터에 골 형성 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하는 단계;

b) 상기 재조합 벡터로 시험관내 연결조직 세포의 군집을 형질감염 또는 형질도입시키는 단계: 및

c) 골절 부위에 상기 연결조직 세포를 도입하여 골절을 치유하는 단계

를 포함하는 골다공성(osteoporotic) 골절의 치료 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 벡터가 레트로바이러스성인 벡터인 치료 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 벡터인 치료 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 유전자가 TGF-β상과인 치료 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP를 암호화하는 치료 방법.
제 23 항에 있어서, 상기 유전자가 BMP-2를 암호화하는 치료 방법.
제 19 항에 있어서, 골이 초기 동안에 생성되는 치료 방법.
제 19 항에 있어서, 골이 말기 동안에 생성되는 치료 방법.