CN101889096B

CN101889096B - 核酸扩增

Info

Publication number: CN101889096B
Application number: CN200880119335.8A
Authority: CN
Inventors: 基思·N·兰德
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2007-10-04
Filing date: 2008-10-03
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2028-10-03
Also published as: JP5535921B2; WO2009043112A1; JP2010539956A; AU2008307153B2; EP2207896A1; ES2460896T3; EP2207896A4; US20110033851A1; EP2207896B1; US8455197B2; CN101889096A; AU2008307153A1

Abstract

本文提供了一种选择性扩增位于核酸分子内的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括将所述核酸分子(“模板”分子)与下列物质相接触：(1)至少一种协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在其3′末端或其附近具有至少一个修饰从而使得自所述协助寡核苷酸3′的延伸受阻断，以及(ii)两个或更多寡核苷酸引物，至少其中一个为起始引物，经修饰从而使得所述修饰的存在使互补链合成过早终止，其中所述协助寡核苷酸与所述起始引物结合于实施模板核酸分子上基本上相同或邻近的区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与所述靶序列上3′于所述起始引物结合位置的序列互补的序列；并实施热循环酶扩增从而使得特定靶序列选择性的被扩增。

Description

核酸扩增

发明领域

本发明涉及选择性扩增特定核酸序列的方法。扩增的选择性通过将至少一种经修饰的寡核苷酸引物与其相应的协助寡核苷酸(facilitator nucleotide)一同使用于热循环(thermocyclic)酶扩增反应来达成。选择性亦通过所述协助寡核苷酸所结合的位于扩增子内的序列来提供。本发明亦涉及对扩增产物的操作，以及根据本发明方法产生的修饰产物的用途，例如，添加3’单链序列，其可用作独特的核苷酸序列结合位点。

发明背景

聚合酶链式反应(PCR)为迅速合成核酸分子给定区段大量拷贝的方法(参见，例如，Mullis et al US Patent Nos.4683195，4683202 and 4800159)。PCR技术极端敏感，理论上仅需要一个单独的核酸分子以供扩增。PCR为酶介导的反应，通常将模板分子，一对寡核苷酸引物与核酸聚合酶掺入反应介质中，所述介质包含合适的盐，金属阳离子，游离核苷酸与pH缓冲系统。PCR过程为基于双链核酸变性，继以寡核苷酸引物退火结合于所述核酸模板，并通过聚合酶进行引物延伸的反复循环。所述PCR中所用的寡核苷酸引物设计为退火结合于所述模板分子的相反链，并定位于侧接(flanking)需扩增的靶序列的。当引物从其3’末端通过所述聚合酶延伸时，延伸产物提供原先靶序列的拷贝，其可顺次作为后继扩增轮次的模板分子而起作用。PCR扩增导致个别核酸分子的指数性增加，以获取所需量的扩增核酸产物，其长度由所述寡核苷酸引物的5’末端所限定。

虽然大体而言，PCR简单且具有特异性，但其易受几种类型的不希望的矫作物的影响，其对于用户而言可为成问题的，且可妨碍所述技术的选择性与特异性。举例而言，片段非特异性扩增可来自所述引物的一个或两者结合于靶序列以外的序列，其可产生一个或多个非所期望产物的片段。引物的非特异性结合频繁出现，且可为下述原因导致，例如，在靶核苷酸序列模板上引物结合序列交替存在，在外源污染分子上相似引物结合序列的存在和/或欠佳的引物序列设计。这些非特异性核酸产物可为成问题的，尤其是当含有所述靶序列的模板核酸以少量拷贝存在时。

在一些情况下，引物可能结合于仅为部分互补的结合位点，甚至当与其结合的DNA的错配存在于引物3’末端时亦被延伸(例如，参见Kwok et al.1990，″Efiects of primer template mismatches on the polymerase chain-reaction-human-immunodeficiency-virus type-1 model studies.″Nucleic Acids Research18(4)：999-1005)。由于该原因，可发生不希望的非特异性扩增。当拷贝由引导错误(mispriming)产生的DNA链时，产生了完全匹配所述引物的引物结合位点。从而在标准PCR中可出现不希望的产物，且其两个末端均具有完全互补于引物的结合位点。从而一旦该不希望的产物产生，其很可能将以高效率扩增。换言之，一旦出现引导错误，在标准PCR中不再可能具有后继的特异性。尽管数种类型的探针可用于特异性的检测希望的靶，但若发生了过多非特异性扩增，所期望产物的产生可遭阻遏，或减少到使用所述特异性探针无法检测的水平。该情况最可能在当所述目标仅仅构成总核酸的非常微小部分时发生。

当非特异性扩增发生在PCR循环早期轮次时，亦导致其加剧。通常在现有PCR技术中，由所述引物序列产生的特异性仅仅在所述PCR早期轮次中达成。一旦产生了相当量的产物，无论引物是侧接靶序列的预期位点还是从由引导错误产生的非特异性扩增子延伸，扩增均以相同速率继续。换言之，即使当引物可能结合且延伸自引物仅具有部分互补性的错误位点发生，所扩增的非特异性产物由于所述PCR技术掺入了准确的引物结合序列，且其在后续PCR循环中与含有所述靶序列的核酸模板以相同效率竞争寡核苷酸引物的结合。在例如等位基因特异性PCR之类的应用中，通常需要在引物设计中着重注意以及在技术优化中相当努力以尽可能减少引导错误。

若希望尝试限制非特异性产物扩增的发生，现行PCR技术可使用经修饰的过程针对性的增加引物结合于靶核酸的特异性。这可涉及，例如，改变介导引物结合过程的不同辅助因子(co-factor)的存在与否或浓度，或者修饰所述PCR方法的热循环。或者，可使用嵌套式(nested)PCR，其涉及在PCR中两个连续轮次中使用两套引物。第一次PCR扩增产生靶，以及使用第一套引物导致的潜在非特异性产物，而第二个PCR轮次使用新引物以在第一轮次的靶产物中扩增二次靶(secondary target)，以尽量减少非特异性产物的产生。

尽管增加了引物结合特异性的现行PCR技术修饰为有用的，其多数需要大量的反复尝试(trial and error)，可为消耗时间的与麻烦的。此外，即使在并用这些技术后，固有难以移除的的非特异性产物仍经常留存。其结果，当下存在对改善下述基于PCR方法的需求，即所述方法可以改善靶核酸序列的选择性扩增。

使用下述方法，本文描述的新发明包括对位于起始核苷酸序列的引导位点之间的序列的选择性，并可在一个单独反应中提供额外的序列特异性，其通常需使用嵌套PCR与两轮PCR获取。

发明综述

本发明基于发明人的下述惊人发现，即PCR的特异性可通过使用两个均结合于靶序列相同末端的修饰寡核苷酸来增强。这些修饰寡核苷酸之一(本文定名为“协助寡核苷酸”)并不充当引物，其3’末端或其附近的修饰阻止延伸。所述协助寡核苷酸充当模板以供扩增子序列的再生，且不直接掺入任何扩增产物。另一个修饰寡核苷酸(本文定名为“起始引物”)经如下修饰，即其使得当自引物的聚合酶介导3’延伸为可能时，阻止在相对链上聚合酶的拷贝。在特定实施方案中，该引物可与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得在使用协助寡核苷酸进行链延伸(fllowing standextension)再生了所述起始引物结合位点，从而由此使所述起始引物得以起始后续轮次的链合成。在上述情况下，所述起始引物具有“协助寡核苷酸依赖性”，这是因为与扩增核苷酸序列模板的连续结合依赖于所述协助寡核苷酸充当模板以供再生所述起始引物结合位点。在所述起始引物与所述协助寡核苷酸的5’区域间缺乏足够的序列同一性的情况下，所述方法可利用额外的“协助寡核苷酸依赖性引物”，其经修饰从而使得该修饰的存在过早地(prematurely)终止互补链的合成，且该引物与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得使用所述协助寡核苷酸的链合成产生了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，从而由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物得以起始后续轮次的链合成。依照本发明，协助寡核苷酸与起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物可组合用于需扩增的靶序列的一端或两端。

本发明的实施方案提供了在含有核酸分子的生物样品中选择性扩增特定靶核苷酸序列的方法。上述方法在此亦总称为杂交依赖性链式反应(hybridisation dependent chain reaction，HDCR)。

根据本发明的第一个方面，提供了选择性扩增位于核酸分子内靶核苷酸序列的方法，所述方法包括：将所述核酸分子(“模板”分子)与下述物质相接触：

(i)至少一个协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在3’末端或其附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸遭阻断，以及

(ii)两个或更多寡核苷酸引物，至少其中之一为起始引物，经修饰从而使得该修饰的存在过早地终止互补链合成，

其中所述协助寡核苷酸与所述起始引物基本上结合于所述模板核酸分子的相同或邻近区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与位于靶序列上所述起始引物结合位置3’的序列互补的序列(wherein the facilitatoroligonucleotide and the initiator primer bind to substantially the same or adjacentregions of the template nucleic acid molecule and the facilitator oligonucleotidefurther comprises sequences complementary to the target sequence 3’to thebinding location of the initiator primer)；并实施热循环酶扩增反应，从而使得所述特定靶序列选择性的扩增。

该方法可包含下列步骤：

(a)使所述模板核酸分子变性；

(b)将所得变性模板核酸分子与至少一种起始引物接触，并自此起始第二链合成，从而由此将所述修饰从所述起始引物导入新合成的链中；

(c)将上述产生的双链分子变性，并由位于所述起始引物结合的靶核苷酸序列相反末端的引物起始反向链合成，由此反向链合成由于步骤(b)导入的修饰而过早终止；

(d)将所得新合成的双链分子变性，将所述协助寡核苷酸结合于步骤(c)产生的不完整反向链，并自此起始链延伸，以由此完成所述反向链；以及

(e)任选地(optionally)重复步骤(a)到(d)一个或多个额外循环。

在实施方案中，所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物具有足够的序列同一性，从而使得在所述协助寡核苷酸起始链延伸再生了所述起始引物结合位点，从而由此使所述起始引物得以起始后续轮次的链合成。

在另一个可选实施方案中，所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物不具有足够的序列同一性，从而使得所述起始引物结合位点在所述协助寡核苷酸起始的链合成后未再生。

依照该另一种可选实施方案，所述方法可进一步使用协助寡核苷酸依赖性引物，经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且该引物与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得使用所述协助寡核苷酸的链合成产生了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，从而由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物得以起始后续轮次的链合成。

该方法可用于改善对所期望靶序列扩增的特异性，随之基本上减少或消除了非期望的非靶序列扩增。

所述核酸分子可存在于任何合适的生物样品中，包括，例如，组织，细胞和/或提取物。在实施依照本发明的扩增方法前，可从所述生物样品中提纯所述核酸分子。

所述核酸分子可为DNA或RNA或可包括脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和/或天然核苷酸类似物的组合。

通常，阻断所述协助寡核苷酸3’延伸的所述至少一种修饰包括在3’末端或其附近掺入一个或多个不可延伸部分(moiety)或核苷酸类似物，例如单独的3’末端不可延伸的碱基或碱基类似物，3’末端不可延伸的碱基与靠近所述寡核苷酸3’末端一个或多个核苷酸错配的组合，或在所述寡核苷酸3’末端附近掺入脱碱基位点(abasive site)。所述不可延伸的碱基可选自，例如，2’，3’二脱氧核苷酸，3’C3，C18或其它长度间隔区(length spacer)，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸(peptide nucleic acid)”碱基，“锁定核酸(locked nucleic acid，LNA)”碱基，核苷酸胺衍生物，经尿嘧啶DNA转葡萄糖基酶处理的尿嘧啶，RNA或2’O-甲基核苷酸，或上述的组合。

所述起始引物和/或所述协助寡核苷酸依赖性引物可经修饰包含，例如，一个或多个间隔区，脱碱基位点或修饰核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。通常在起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物中的修饰位于足够靠近所述引物的3’端，从而使得虽然所述引物保留起始3’延伸的能力，但当在其引物序列中包含所述修饰的延伸产物被拷贝时，其互补链过早地遭截短(truncated)从而阻止了后续扩增循环中引物的结合。举例而言，在特定实施例中，所述修饰可位于距所述引物的3’末端约10个碱基，9个碱基，8个碱基，7个碱基，6个碱基，5个碱基或4个碱基处。

所述协助寡核苷酸的5’末端可与所述起始引物和/或所述协助寡核苷酸依赖性引物的5’末端相符或位于其中(The 5’terminus of the facilitatoroligonucleotide may coincide with or fall within the 5’terminus of the initiatorprimer and/or the facilitator oligonucleotide-dependent primer)。或者，所述协助寡核苷酸可包含额外的5’序列。上述额外序列可用作可检测的标记或标签，或可协助附加所述标记或标签。

在实施方案中，两个引物(正向与反向引物)均为起始引物。在此情况下，使用两个协助寡核苷酸，其中之一结合于与正向起始引物的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子的区域，而另一个结合于与反向起始引物的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子的区域(one of which binds to substantially thesame or adjacent region of the template nucleic acid molecule as the forwardinitiator primer and the other binds to substantially the same or adjacent region ofthe template nucleic acid molecule as the reverse initiator primer)。

另外，所述方法可以采用两种协助寡核苷酸依赖性引物，其中之一结合于与一种协助寡核苷酸的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子上的区域，而另一个结合于与另一种协助寡核苷酸的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子上的区域(one of which binds to substantially the same or adjacent regionof the template nucleic acid molecule as one facilitator oligonucleotide and theother binds to substantially the same or adjacent region of the template nucleicacid molecule as the other facilitator oligonucleotide)。

根据本发明的第二个方面，提供了改善热循环酶扩增反应特异性的方法，所述反应使用至少两个侧接位于核酸分子中目标的靶核苷酸序列的核苷酸引物，其中所述引物中的至少一个经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且所述反应进一步使用至少一个非引发(non-priming)的协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在其3’末端或其附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸遭阻断，且其中所述协助寡核苷酸与所述修饰引物基本上结合于所述模板核酸分子上相同或邻近的区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与靶序列上3’于所述修饰引物结合位置的序列互补的序列。

所述热循环酶扩增反应的特异性通常由消除不包括所述目标的靶核苷酸序列的扩增产物或减少其量来确定。

依照上述方面与实施方案所述的方法可用于，例如，DNA甲基化分析和/或诊断受试者的疾病或病状，或者预报其针对该疾病或病状的易感性，其中该疾病或病状以变体基因序列为特征，或与其相关。所述变体序列可包含添加，缺失或取代一个或多个核苷酸，或对一个或多个核苷酸的修饰，例如改变的甲基化状态。

相应的，本发明的第三个方面提供检测变体核苷酸序列的方法，所述方法包括选择性的扩增位于核酸分子内并包含所述变体序列的靶核苷酸序列，其中所述方法包括：

将所述核酸分子(“模板”分子)与下述物质相接触：

(ii)两个或多个寡核苷酸引物，至少其中之一为起始引物，经修饰从而使得该修饰的存在过早地终止互补链合成，

其中所述协助寡核苷酸与所述起始引物基本上结合于所述模板核酸分子的相同或邻近区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与位于靶序列上所述起始引物结合位置3’的序列互补的3’序列，且其中所述3’序列使所述协助寡核苷酸得以优选结合于所述包含所述变体序列的靶核苷酸序列，而非其相应的非变体序列(comprises 3′sequences complementary to the target sequence3’to the binding location of the initiator primer and wherein said 3′sequencesenable preferential binding of the facilitator oligonucleotide to the targetnucleotide sequence comprising the variant sequence rather than to correspondingnonvariant sequence)；

实施热循环酶扩增反应，从而使得所述特定靶序列选择性的扩增；以及

将所得扩增产物的核苷酸序列与所述非变体序列相应的序列相比较，以检测所述变体核苷酸序列。

在实施方案中，所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物具有足够的序列同一性，从而使得在自所述协助寡核苷酸起始的链延伸再生了所述起始引物结合位点，从而由此使所述起始引物得以起始后续轮次的链合成。

在另一个实施方案中，所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物的相应区域不具有足够的序列同一性，从而使得所述起始引物结合位点在自所述协助寡核苷酸起始的链合成后未再生。

依照该另一种实施方案，所述方法可进一步使用协助寡核苷酸依赖性引物，该引物与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得自所述协助寡核苷酸起始的链合成产生了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，从而由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物得以起始后续轮次的链合成。

所述变体序列包括添加，缺失或取代一个或多个核苷酸，或针对在所述靶序列内一个或多个核苷酸的修饰，例如改变的甲基化状态。

附图的简短描述

在此就附图仅以非限定示例的方式描述本发明。

图1：依照本发明实施方案杂交依赖性链式反应中步骤的概略表示。

图2：反向引物(AluRev)，正向起始引物(InAluPr3)与协助寡核苷酸(InAluFol15)的序列与其针对源自人类Alu重复序列的靶核酸序列模板的结合位置。Δ代表脱碱基位点；I代表次黄苷(inosine)。序列在UDG处理后显示。

图3：实时HDCR扩增曲线(在两次重复实验中)显示依照本发明实施方案的杂交依赖性链式反应的扩增Alu产物的量(通过荧光测定)，包含：起始引物(FD引物)InAluPr3自身；InAluFol15协助寡核苷酸(foligo)自身；或者FD引物InAluPr3与foligo InAluFol15的组合。

图4：突变核酸模板序列(MUTB)与正常核酸模板序列(NORB)的序列同一性与比对。癌基因型的T到A突变(V600E)在所述突变序列中(MUTB)以下划线表示。所示序列的中间区域(包括所述T到A突变)源自v-raf鼠类肉瘤病毒癌基因同源物(homolog)B1(BRAF)。

图5：反向引物(CommR3G)，起始引物(BRF2)与协助寡核苷酸(BFol3)的序列与其针对突变(MUTB)与正常(NORB)靶核酸序列模板的结合位置。在下划线序列中的缺口(gap)代表与协助寡核苷酸(BFol3)或在起始引物(BRF2)中脱碱基位点(Δ)错配的靶核酸序列。I代表次黄苷；ddG代表二脱氧鸟嘌呤核苷。

图6：实时HDCR扩增曲线(在两次重复实验中)显示在两个退火温度，68℃与72℃下，依照本发明实施方案的杂交依赖性链式反应所产生的正常BRAF基因靶序列(圆形)与含有点突变的BRAF基因靶序列(三角形)扩增产物的量(通过荧光测定)，如图4所示。

图7：源自hMLH1基因甲基化(M)与未甲基化(U)核苷酸序列模板的序列同一性与比对。下划线序列指明所述hMLH1基因的亚硫酸氢盐处理区域，而粗体的区域指明在M与U序列模板间的核苷酸差异，并且显示了其在所述协助寡核苷酸上的相应位置。

图8：反向引物(CommR3G)，起始引物(MLH20)与协助寡核苷酸(MLHF1)的序列与其针对如图7所示来自hMLH1基因的甲基化(M)与未甲基化(U)靶核酸序列模板的结合位置。Δ代表脱碱基位点(d-间隔区)。u代表2’-O-甲基-尿嘧啶。下划线序列指明在M与U序列模板间的核苷酸差异，并且显示了其在所述协助寡核苷酸上的相应位置。

图9：A与B。实时HDCR扩增曲线(在两次重复实验中)显示中间热循环加热步骤(74℃)(B)对来自hMLH1基因的甲基化(M)与未甲基化(U)靶序列模板所扩增产物(由荧光测定)的作用。

图10：TMEFF2与hMLH1基因供自亚硫酸氢盐处理DNA扩增的靶序列。对来自用亚硫酸氢盐转换引发位点区域的序列与的相应的TMEFF2的起始寡核苷酸，TMEFInL1与TMEFInR1，及协助寡核苷酸TMEFLdS170与TMEFRdS133，hMLH1的起始引物MLHInit2与MLHInit1，及协助寡核苷酸RMLH170与131hMLHFoldS2，以及共同的外部协助寡核苷酸依赖性引物MCD4与MCD6进行序列比对。ddG表示使用末端转移酶(在寡核苷酸合成之后)添加的二脱氧G。下划线的碱基为可与添加的ddG一同减少或消除延伸的错配。Δ表示d-间隔区；“5”表示5-甲基胞嘧啶(当其在寡核苷酸中存在于C的位置上时)；而R表示A与G的混合物。后续序列的存在由---表示。

图11：实时HDCR扩增曲线(每个均为在两次重复实验中)显示来自甲基化(M)或未甲基化(U)的亚硫酸氢盐处理模板DNA的甲基化TMEFF2(小图A)或hMLH1(小图B)的扩增。在左边小图所述甲基化产物的扩增通过特定HEX标记的TaqMan探针检测，而在右边小图中总扩增DNA使用SYBR绿(SYBR green)检测。

图12：实时HDCR扩增曲线(每个均为在两次重复实验中)显示自甲基化，亚硫酸氢盐处理模板DNA扩增甲基化hMLH1。个别寡核苷酸指明忽略。在左边小图所述甲基化产物的扩增用特定HEX标记TaqMan探针检测，而右边小图中总扩增DNA使用SYBR绿检测。

详细描述

贯穿本说明书及其所附的权利要求，除非上下文另行宣称，词语“包括(comprise)”，以及其变体“包括(comprises)”或“包括(comprising)”，应理解为意指包含确定的整体(integer)或步骤或者整体或步骤的集合，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的集合。

冠词“一个(a)”与“一个(an)”在本文中用于指一个或多于一个该冠词限定的语法对象。举例说明，“一个要素(an element)”意指一个要素或多于一个要素。

如本发明背景下所用的术语“扩增”指通过热循环酶反应制成一个或多个拷贝的靶核苷酸序列，并且包括但不仅限于，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸分子。如本文所用术语“聚合酶链式反应”(PCR)指下述技术，即其通过在热循环过程中所述的寡核苷酸引物引导的酶扩增反应以产生大量拷贝的核酸序列特定区段。不同PCR技术的示例括但不仅限于逆转录PCR，嵌套PCR，同源基因特异性(Allele-Specific)PCR，定量PCR，大范围(LongRange)PCR，快速扩增多态性DNA分析(Rapid Amplified Polymorphic DNAAnalysis)，快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNA ends)，差异显示(Differential Display)PCR，连接反应介导(Ligation-Mediated)PCR，甲基化特异性(Methylation specific)PCR，头环(Headloop)PCR与重甲基(HeavyMethyl)PCR。除DNA的指数扩增外，PCR亦可指线性，非指数DNA扩增，而本领域技术人员将了解任一形式的扩增对本发明的目的均为合适的。

如本文所使用的术语“核酸”，“寡核苷酸”与“引物”指任何基于核酸的分子，包括DNA，cDNA，RNA，mRNA，cRNA，PNA或其任意组合。因此，核酸分子，寡核苷酸与引物可包含天然出现的核苷酸，非天然出现的核苷酸或其组合。

如本文所使用的术语“寡核苷酸”指单链序列的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基，天然核苷酸的已知类似物，或其混合物。寡核苷酸通常为短(例如，长度小于50个核苷酸)序列，可通过任何合适方法制备，包括，例如，直接化学合成或克隆并限制性酶切合适的序列。通常在本发明的背景下，寡核苷酸被设计为识别并结合特异的互补的核苷酸序列。核苷酸序列位于更大的核酸分子中。所述寡核苷酸可以能够或不能够充当聚合酶介导延伸反应的引物。寡核苷酸中并非所有碱基需与该寡核苷酸设计用来结合的序列互补；所述寡核苷酸只需包含足够的互补碱基以使所述寡核苷酸得以识别并结合于该序列即可。寡核苷酸亦可包含额外的碱基。所述寡核苷酸序列可为未修饰的核苷酸序列或可为如本文所述通过多种方法经化学修饰或偶联的。

如本发明背景下所用的术语“互补链合成”指通过酶反应使用变性扩增子序列作为模板产生互补核苷酸序列。

如本文所使用的术语“扩增子”指掺入至少一个侧接靶序列的引物的扩增核苷酸序列产物。

如本文所使用的术语“引物”指下述寡核苷酸，其结合于单链模板核酸分子的特定区域，并通过酶反应起始核酸合成，从所述引物的3’末端延伸并与所述模板分子的序列互补。习惯上，引物通常称为“正向”与“反向”引物，其中一个与核酸链互补，而另一个与该链的互补链互补。

如本文所使用的术语“靶序列”指需扩增的特定核苷酸序列。依照本发明方法的寡核苷酸序列拥有至少与位于所述靶序列5’与3’末端的核酸序列具有的实质序列互补性。

如本文所使用的术语“在3’末端或其附近”指所述3’末端紧接着的5’区域，以及从3’末端的5’区域延伸的核酸分子，通常包括末端核苷酸。

如本发明背景下所用的术语“阻断3’延伸”指所述协助寡核苷酸实际上缺乏3’延伸，从而使得所述扩增反应无法继续，或以无实用价值的速率继续。

如本文所使用的术语“基本上相同或邻近区域”在供协助寡核苷酸，与起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物的结合位点的背景下意指所述寡核苷酸/引物能够结合于所述模板分子的相同大致区域，但无需为所述模板的相同核苷酸序列。举例而言，协助寡核苷酸可结合于所述模板的区域，其3’(下游)于由起始引物结合的区域，但仍旧基本上位于所述模板的相同区域内。在此情况下，所述协助寡核苷酸的结合发生于邻近所述起始引物结合序列邻近的序列。术语“邻近”无需所述序列为直接邻接或“毗连(abutting)”，但涵盖“邻近”序列间有一个或多个插入或重叠(overlapping)核苷酸的情况。

如本文所使用的的术语“样品”指任何包含核酸分子的生物样品，通常包含DNA和/或RNA。样品可为组织，细胞或其提取物，或可为核酸分子的纯化样品。使用术语“样品”并不必然意指在所述样品中存在的核酸分子内存在靶序列。

本发明的扩增方法，在本文中亦总称为杂交依赖性链式反应(HDCR)，提供了高度的特异性以供扩增任何靶核酸，其随之戏剧性的减少或消除了非特异性扩增产物。

本文所描述的方法使所期望的靶在扩增反应中可以保持多个循环，迥异于标准的现有技术PCR。甚至在所期望靶的扩增效率仅仅略微佳于不希望的产物时，在大量循环下保持该差异的积累效应导致对所期望靶的高选择性。该选择性通过使用特定引物(在本文中称为“起始引物”与“协助寡核苷酸依赖性引物”)来达成，所述引物包含阻止其受完全拷贝的修饰。除非引物结合位点可经再生以允许后继结合与延伸，无法获得显著的扩增。再生引物结合位点通过使用在本文中称为协助寡核苷酸的寡核苷酸来达成，所述寡核苷酸设计为识别所期望靶中，在所述起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物结合位点下游的序列。当发生引导错误时，该区域不太可能与所述协助寡核苷酸上相应的区域充分匹配以允许所述引物结合位点的再生。从而可减少或消除非特异性的扩增。进一步，所述系统可用于选择特定的序列变体，例如在所述引物结合位点下游区域中的突变。在此情况下，即使与所述协助寡核苷酸存在错配，仍可再生引物结合位点，但该情况以较低效率发生，且由于选择可在大量循环下保持(取决于添加入反应物中靶的量)，可针对所期望序列变体进行强选择。

亦描述了现有技术中亦允许在大量循环中进行选择的方法。这些包括使用阻断寡核苷酸(blocking oligonucleotide)(如描述于，例如，Cottrell et al.2004，″A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specificblockers.″Nucleic Acids Research 32(1))和headloop DNA扩增(描述于US2005221312)。在这些方法中，特异性的改善是由于阻抑具有特定序列的产物。当可能出现多种不同不希望的潜在产物时，将需要多个阻断寡核苷酸以阻止不希望的扩增。此外，在头环DNA扩增时，仅仅一个不希望的序列可受选择排除(against)。与之相对，本文所描述的现行方法提供对所期望序列的正向选择，并导致阻抑所有不希望的产物，甚至包括其序列未知的产物。

在PCR中，扩增的特异性取决于引物结合的特异性，而在现行技术中，PCR方法的特异性来自设计合适的，与靶序列有互补序列的正向与反向引物。然而，引物序列导致的特异性仅仅在PCR的早期轮次中有效。一旦产生了足够量的产物，无论引物是自正确的侧接所述靶序列的位点还是自由引导错误产生的非特异性扩增子延伸，扩增都以相同速率继续。

与之相反，在本发明所述的扩增方法中，选择性在扩增的每个循环中都得到保持。该高特异性是通过使扩增依存于在正向与反向引物中一个或两者的引发区域(priming region)下游存在正确的靶序列来达成的。本方面所述方法在所述靶序列的一个(或两个)末端使用至少一种修饰寡核苷酸引物，以及相应的协助寡核苷酸以增加扩增的特异性。在本文所述方法最广泛的形式下，所述修饰引物在本文中称为起始引物，其经修饰使得所述修饰妨碍(impede)反向链合成。在本发明所述的方面中，避免了现有技术PCR方法中导致不希望的扩增产物的引导错误，由于所述协助寡核苷酸将不会识别位于引导错误位点下游(3’)的核苷酸序列。

相应的，本发明的一个方面提供了选择性扩增位于核酸分子内靶核苷酸序列的方法，所述方法包括：

将所述核酸分子(“模板”分子)与下述物质相接触：

其中所述协助寡核苷酸与所述起始引物基本上结合于所述模板核酸分子的相同或邻近区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与位于靶序列上所述起始引物结合位置3’的序列互补的序列；并实施热循环酶扩增反应，从而使得所述特定靶序列选择性的扩增。

依照本发明的实施方案，选择性在扩增的每个循环中均得到保持。特异性不仅来自引物结合，亦来自需要在所述引物结合位点下游具有“正确的”序列。照此，得以保持令人惊讶的高度选择性，尤其是当扩增包含多于一种修饰引物与协助寡核苷酸时，由此大幅度的减少或消除了由引导错误导致的不希望的产物的产生。

所述协助寡核苷酸的5’区域可能与所述起始引物具有足够的同一性，从而使得所述起始引物结合位点在由所述协助寡核苷酸起始的(followingstrand extension)链延伸再生，从而使所述起始引物得以起始后续轮次的链合成。或者，所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物不具有足够的序列同一性，从而使得所述起始引物结合位点在使用所述协助寡核苷酸作为模板的链合成后未再生。在后一情况下，所述方法通常将进一步使用协助寡核苷酸依赖性引物，经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且其与所述协助寡核苷酸5’区域具有足够的同一性，从而使得使用所述协助寡核苷酸的链合成产生协助寡核苷酸依赖性引物结合位点从而使所述协助寡核苷酸依赖性引物得以起始后续轮次的链合成。

本发明的进一步方面提供了改善热循环酶扩增反应特异性的方法，所述反应使用侧接位于核酸分子内目标的靶核苷酸序列的至少两个寡核苷酸引物，其中所述引物中至少一个经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且所述反应进一步使用至少一种非起始协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在其3’末端或其附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸受阻断，且其中所述协助寡核苷酸与所述修饰引物基本上结合于所述模板核酸分子上相同或邻近区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括所述靶序列上3’于所述修饰引物结合位置序列的互补序列。

本发明所述方法可用于改善扩增任何所期望靶序列的特异性，随之基本上减少或消除了不期望的非靶序列的扩增。本领域技术人员应理解本方法可用于任何热循环酶扩增反应，只要期望其具有对特定扩增子的特异性与选择性。

仅举例而言，本发明所述方法在DNA甲基化分析中有应用前景，例如，在甲基化特异性PCR技术中改善检测甲基化核苷酸的特异性。本发明所述方法亦在检测点突变中有应用前景，例如在疾病诊断中。在一些情况下，多个不同点突变可与特定疾病相联系(例如K-ras基因中的致癌性突变)，需要多重化(multiplexing)PCR来检测。本发明的方法适于多重化。本领域技术人员应理解本发明所述方法的应用并非限定，且该方法可用于任何需要高度选择性与特异性的热循环酶扩增反应。上述应用包括但不仅限于检测包括病毒与细菌的病原生物，检测基因组中的多态性和/或突变，基因指纹分析(geneticfingerprinting)，法医人类学(forensic anthropology)，分子系统学(molecularsystematics)，家系调查(genealogical investigation)，遗传疾病检测，基因组测序，识别控制目标性征的基因以及检测DNA甲基化的不同状态。

本领域技术人员应容易的理解可使用阻断自所述协助寡核苷酸3’末端延伸的任何合适方法。合适的阻断修饰包括但不仅限于在所述3’末端或其附近掺入一个或多个不可延伸的部分或核苷酸类似物，例如，单独的3’末端不可延伸的碱基或碱基类似物，3’末端不可延伸的碱基与一个或多个靠近所述寡核苷酸3’末端的核苷酸错配的组合，或在靠近所述核苷酸3’末端掺入脱碱基位点。所述不可延伸的碱基可选自，例如，2’，3’二脱氧核苷酸，3’C3，C18或其它长度间隔区，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸”碱基，“锁定核酸(LNA)”碱基，核苷酸胺(amine)衍生物，经尿嘧啶DNA转葡萄糖基酶处理的尿嘧啶，RNA或2’O-甲基核苷酸，或上述的组合。

类似的，可在所述协助寡核苷酸引物中使用多种合适的修饰以终止反向链合成。举例而言，所述修饰可包括但不仅限于，包含一个或多个错配，脱碱基位点和/或修饰核苷酸，例如2’-O-甲基核苷酸。通常在起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物中的修饰的位置足够靠近所述引物的3’端，从而使得虽然所述引物保留起始3’延伸的能力，但当在所述引物充当互补链合成的模板时，其扩增序列产物遭截短从而导致后续扩增循环中缺乏引物结合。举例而言，在特定实施例中，所述修饰可位于距所述引物的3’末端约10个碱基，9个碱基，8个碱基，7个碱基，6个碱基，5个碱基或4个碱基处。

所述协助寡核苷酸包括互补于所述靶核酸序列中下游于所述起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物结合位点的序列。所述协助寡核苷酸亦可包括互补于靶序列的序列，所述序列亦为所述起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物所识别与结合。所述协助寡核苷酸的5’末端可与所述起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物的5’末端相符或在其内，或者其可包含独特序列的5’延伸，如期望，所述序列可用于在扩增产物上产生标签的独特序列结合位点。上述标签结合位点可能用于，例如，捕获或检测特定扩增子(举例而言，检测突变)，或克隆扩增产物。

仅为举例，而非限定本发明的范围，依照本发明的实施方案进行的扩增反应的通常步骤示于图1A。注意为简洁起见，在图1A中仅描述了参与所述扩增反应的靶核苷酸序列的一个末端。该图概略性的显示了起始引物(10)(在此为“正向”PCR引物)与协助寡核苷酸(60)在本发明的实施方案中的作用。在图1A中未显示的所述靶核苷酸序列的末端处，可使用任何合适的反向引物，或者可使用第二个起始引物与相应的第二个协助寡核苷酸。

回到图1A的概略，在起始的双链模板序列变性步骤后，冷却反应物以允许起始引物结合于单链模板(20)上(步骤1)。所述起始引物(10)在该引物的3’末端或其附近包含修饰(15)。正向链合成自所述起始引物的3’末端起始(步骤2)，由此产生新核酸链(30)。在第二次变性步骤后，反向链合成(40)由反向引物(未显示)起始，并以掺入了起始引物的新合成链(30)作为模板(步骤3)。然而，当在存在于所述新模板上的，由所述起始引物(10)提供的所述修饰(15)的存在阻断拷贝时，反向链(40)的合成过早终止(50)。在后续的变性步骤后，协助寡核苷酸(60)较之所述起始引物(10)优选的杂交于步骤3产生的不完整的反向链(40)，这是由于所述协助寡核苷酸(60)的3’末端较之所述起始引物(10)的3’末端具有更强的序列结合能力(步骤4)。所述协助寡核苷酸(60)在该寡核苷酸3’末端或其附近包含修饰(65)。所述协助寡核苷酸(60)随即充当模板以供反义链(40)的延伸，从而使反义链的完成与所述起始引物的完整结合位点的再生得以实现(步骤4)。此时，任选地可添加下述步骤，即将反应物加热到将所述协助寡核苷酸(60)从所述模板(40)上移除，但不至于使全长双链材料全部或大部变性的温度。随即冷却该反应物以允许起始引物(10)结合并进行后续轮次的正向链(80)合成(步骤5)。

另一种可选实施方案的示例见于图1B。在起始的双链模板序列变性步骤后，冷却反应物以允许起始引物结合于单链模板(20)上(步骤1)。所述起始引物(10)在该引物的3’末端或其附近包含修饰(15)。正向链合成自所述起始引物的3’末端起始(步骤2)，由此产生新核酸链(30)。在第二次变性步骤后，反向链合成(40)由反向引物(未显示)起始，并以掺入了起始引物的新合成链(30)作为模板(步骤3)。然而，当在存在于所述新模板上的，由所述起始引物(10)提供的所述修饰(15)的存在阻断拷贝时，反向链(40)的合成过早终止(50)。在后续的变性步骤后，具有基本上相似于协助寡核苷酸依赖性引物(11)的5’区协助寡核苷酸(61)较之所述起始引物以及协助寡核苷酸依赖性引物优选的杂交于步骤3产生的不完整的反向链(40)，这是由于所述协助寡核苷酸(61)的3’末端较之所述起始引物(10)或所述协助寡核苷酸依赖性引物(11)的3’末端具有更强的序列结合能力(步骤4)。所述协助寡核苷酸(61)在该寡核苷酸3’末端或其附近包含修饰(65)。所述协助寡核苷酸(61)随即充当模板以供反义链(40)的延伸，从而使反义链的完成(71)与所述起始引物的完整结合位点的再生得以实现(步骤4)。此时，任选地可添加下述步骤，即将反应物加热到将所述协助寡核苷酸(61)从所述模板(40)上移除，但不至于使全长双链材料全部或大部变性的温度。随即冷却该反应物以允许起始引物(11)结合并进行后续轮次的正向链(80)合成(步骤5)。本领域技术人员应理解所述起始引物上的修饰(15)与所述协助寡核苷酸依赖性引物上的修饰(15)可相同或不同。

使用扩增子模板序列的正向链合成需要所述起始引物或协助寡核苷酸依赖性引物在由所述协助寡核苷酸再生反向链的3’末端后退火结合于完整合成的反向链。在扩增循环的这一阶段，优选最小化所述起始引物或协助寡核苷酸依赖性引物与所述协助寡核苷酸间的序列结合竞争。在一个实施方案中，可通过使用低浓度的协助寡核苷酸和/或在所述寡核苷酸序列中掺入修饰来使所述起始引物或协助寡核苷酸依赖性引物的结合较之所述协助寡核苷酸的结合更加有利。举例而言，所述起始引物或协助寡核苷酸依赖性引物的结合可通过在所述引物序列使用本领域技术人员已知的修饰来增强，所述修饰可举出用5甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，使用INA或PNA，或者在5’末端附加小沟结合物(minor groove binder)。此外，协助寡核苷酸序列结合的稳定性可通过使用替代性碱基，例如用次黄苷或脱氮鸟嘌呤替代鸟嘌呤来减少。

在另一个实施方案中，若所述靶序列具有需特异性扩增的序列改变(例如，突变)，可通过使扩增反应依存于协助寡核苷酸针对该区域的序列特异性杂交来达成。例如，该原理可应用于检测突变以及在亚硫酸氢盐处理后选择性扩增不同程度甲基化的DNA。即使在扩增反应的一个单独步骤中仅达成相对较小的选择性，由于该选择性存在于所述扩增的整个期间，在所述反应的全过程中选择性显著增强。

在进一步的实施方案中，使用本发明所述方法使例如添加和/或延伸之类的操作结果得以掺入扩增产物中。举例而言，当将所述协助寡核苷酸的5’尾做成较之掺入了所述起始引物或协助寡核苷酸依赖性引物的扩增子模板序列的3’末端更长时，所得最终扩增产物将具有3’单链延伸。该序列延伸可随即用作，例如，独特序列结合位点以供引物/探针结合和/或将所述扩增产物附加到不同底物上。

通常依照本发明需进行分析的核酸分子包括DNA。然而本领域技术人员将容易理解本发明所述方法，若提供合适的试剂，亦可应用于其它核酸分子，例如RNA，所述试剂可举出RNA聚合酶或逆转录酶为例，只需其适用于扩增或拷贝RNA。

如同其它扩增方法，本发明方法中所用条件，例如退火时间，延伸时间，扩增循环数以及使用的温度取决于特定的序列，并需要个别优化。上述优化属于本领域技术人员拥有的技巧与能力，且无需超过仅为常规的实验探索(参见，例如，Sambrook，J.and Russell，D.W.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，3rd Edition，2001，andDieffenbach，C.W.and Dveksler，G.S.(eds.)PCR Primer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd Edition，2003；其公开以全文引用的方式包含于本文中)。此外，本发明的方法可使用任何合适的酶，只要其催化合成作为引物延伸产物的核苷酸序列。可获取多种聚合酶且其适于依照本发明的应用，且上述聚合酶对本领域技术人员为已知的。在特定实施方案中所述聚合酶为DNA聚合酶。所述DNA聚合酶可，例如，选自下组：大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，T.litoralis DNA聚合酶，以及热稳定性聚合酶，例如Taq，Tth，Pfu，Vent，深海火山口(deep vent)与U1Tma聚合酶，以及其变体与衍生物。

如同其它其中共通序列添加到需扩增核酸分子末端的方法，本发明的扩增方法可方便的改用于多重PCR(multiplex PCR)。

依照本发明进行的扩增反应产物可通过本领域技术人员众所周知的标准方法来检测，包括但不仅限于，凝胶电泳，使用非特异性核酸结合染料例如SYBR绿的实时监控，序列特异性荧光探针或与点阵(array)杂交。

本领域技术人员应理解在标准PCR方法中与寡核苷酸引物设计相关的限制。类似的限制亦适用于设计可用于检测PCR扩增子的寡核苷酸探针。探针通常必须设计为较之引物具有较佳杂交能力，从而使得所述探针能够结合于单链靶。从而探针通常须较长，或者具有修饰从而使其较之引物能够在相对较高温度结合。为了使用较短探针，必须修饰PCR以允许以允许在所述PCR中生成单链核酸分子-指数性扩增仅仅发生于限定数量的循环中，继以线性扩增。这通常通过限制一种引物的浓度，或通过使用不同结合温度的引物并在PCR过程中使用增加的退火温度来达成。这些限制可使用依照本发明实施方案的扩增方法来克服，其允许使用3’单链标签进行的指数性扩增-所述标签可在延伸期后使用荧光探针来结合。此外，在延伸期后(例如，72℃)，可测定在选定温度(例如，40℃，50℃与60℃)结合的寡核苷酸探针。通过将不同的荧光染料与不同的熔解探针/标签组合相组合，可达成大量反应的多重化。或者，可使用所述标签结合位点开发新型检测技术。依照本发明的实施方案，3’延伸的存在允许开发，例如，类分子信标(molecularbeacon-like)探针，其仅于经3’单链标签延伸所拷贝后发出荧光。本领域技术人员应理解特定序列的合适协助寡核苷酸，起始引物与协助寡核苷酸依赖性引物需根据靶核酸序列的序列与使用本方法的特定应用而进行优化。涉及合适的寡核苷酸与引物序列属于本领域技术人员的能力范围，并无需超过仅为常规的实验探索。

在本说明书中任何在先公开出版物(或由其来源的信息)，或任何已知事物的引用，均不认为，并不应认为是对该在先公开出版物(或由其来源的信息)或已知事物构成本说明书相关技术领域中通常一般知识一部分的承认或认同，或者任何形式的暗示。

本发明将参照下列特定实施例进行描述，其不应认定为以任何方式对本发明的范围进行限定。

实施例

方法与材料

修饰寡核苷酸引物

终止引物延伸的引物修饰示例如下所示：2’-O甲基核苷酸-小写字母(例如，u表示2’O尿嘧啶核苷)，次黄苷-I，脱碱基位点-Δ，和/或+ddG-二脱氧鸟嘌呤核苷，其使用末端转移酶添加到寡核苷酸末端。脱碱基位点通过在寡核苷酸合成期间掺入d-间隔区或脱氧尿嘧啶核苷引入。在后一情形下，将尿嘧啶通过在5μM(亦即1nmole)下用4单位尿嘧啶-DNA糖基化酶(NewEngland Biolabs)在200μL TEX缓冲液(10mM Tris HCl，0.1mM EDTA，0.01％Triton-X100)中在37℃下处理2小时从而转换为脱碱基位点。

核苷酸序列模板

核苷酸靶序列模板自对应于所述靶区域的合成单链核酸分子制备。标准PCR扩增用于扩增并产生双链靶序列模板。扩增产物随即以1∶10000稀释，并用作靶区域模板以供HDCR扩增。

扩增条件

HDCR(25μl中)的标准条件如下述进行：1x Platinum Taq缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.4)及50mM KCl]，4mM MgCl₂，0.2mM每种dNTP，25000倍稀释的SYBR绿与来自Invitrogen的0.5U Platinum Taq DNA聚合酶(热启动)，其中寡核苷酸浓度与循环条件具体描述于每个实施例中。

实施例1-用于成功扩增的起始引物与协助寡核苷酸的依赖性

该实施例说明依照本发明所述实施方案的HDCR扩增技术依存于起始引物与协助寡核苷酸两者的存在。

HDCR用于扩增如图2所示的人类Alu重复序列的区域。显示了略去所述起始引物与所述协助寡核苷酸之一的作用。所有反应均重复两次。图2显示所述靶区域的序列，起始引物InAluPr3，协助寡核苷酸InAluFol5与反向引物AluRev。所述起始引物包含脱碱基位点，且所述协助寡核苷酸3’末端含有两个脱碱基位点以及两个与所述靶核酸序列的错配(T/T错配与G/T错配)，从而阻止其起始。所述协助寡核苷酸亦含有额外的脱碱基位点以减少在该协助寡核苷酸上引导错误造成的背景。

包含1μL 1∶10000倍稀释的核酸模板的复制扩增在Corbett Rotor-Gene3000 Real-time PCR机器上进行。起始引物InAluPr3与协助寡核苷酸InAluFol5以浓度为200nM使用，且所述反向引物AluRev为40nM。热循环条件如下所述：95℃下2分钟，继以40循环的95℃下1秒，60℃下20秒，80℃下1秒与60℃下20秒。在最后的60℃步骤测定SYBR绿的荧光。如图3所指明，所述起始引物与协助寡核苷酸扩增产物在大约17个循环后观测到，而单独使用起始引物或协助寡核苷酸的反应在40个循环处仍未超过检测阈值。

实施例2-使用HDCR方法的选择性扩增

该实施例说明可能对彼此间以单独碱基对相异的核酸模板达成选择性扩增。示于图4的所述序列中央区域对应于v-raf鼠类肉瘤癌基因同源物B1(BRAF)基因的部分序列。下划线的碱基显示常见的致癌性T到A突变V600E(MUTB序列)与正常序列(NORB)相比较的位置。靠外的序列与所用寡核苷酸引物相匹配。如图5所示，正向起始引物BRF2距其3’末端7个碱基包含脱碱基位点。协助寡核苷酸BFol3的3’末端包含6个与靶DNA的错配，且终止于脱氧GTP以阻止其延伸。所述协助寡核苷酸包含邻近于所述BRF2引物的19碱基区域，其与所述突变序列完全匹配，但包含与正常BRAF序列的单一碱基错配(下划线所示的间隔)。所述协助寡核苷酸亦在等价于所述起始引物的区域中一些鸟嘌呤的位置包含次黄苷(参见图5)以减少协助寡核苷酸/延伸的反向链双链体的稳定性。

复制HDCR扩增使用Bio-Rad I Cycler Real-time PCR机器进行。正向起始引物BRF2以200nM加入，协助寡核苷酸BFol3以20nM加入，而反向引物CommR3G以40nM加入；MgCl₂以2mM的浓度使用。热循环条件如下所述：95℃下2分钟，继以60循环的95℃下5秒，68℃或72℃下15秒，83℃下10秒与68℃或72℃下15秒。在每个循环的最后一步测定SYBR绿荧光。

如图6所见，当在68℃下进行退火/延伸热循环步骤时，突变序列扩增产物的量相对于正常序列扩增产物仅仅略多。然而，当在72℃下进行所述退火/延伸热循环时，匹配的正常模板扩增产物的数量较之突变模板扩增产物剧烈减少。所述协助寡核苷酸针对所述突变序列较之所述正常(错配)序列选择性杂交的显著温度依赖性可由选择性温度下所见的较大差异所显示(图6)。

实施例3-使用HDCR方法选择性扩增以及改善扩增效率

该实施例说明使用HDCR扩增以供在亚硫酸氢盐处理后选择性扩增不同甲基化程度的DNA的潜能，以及在温度循环中中间加热步骤对改善反向链两步合成效率的益处。图7显示制备了具有模仿由用亚硫酸氢盐处理经亚硫酸氢盐处理的hMLH1基因区域的所产生序列的中央区域(下划线所示)的不同核酸序列模板。两个序列均由相同的供寡核苷酸引物结合的区域所侧接。模板M模仿甲基化的DNA，其中CpG二核苷酸中的胞嘧啶在亚硫酸氢钠处理后仍为C。模板U模仿未甲基化的DNA，其中所有的胞嘧啶转换为尿嘧啶(且随后在扩增后变为T)。核酸模板通过PCR制备，且稀释100倍以供添加至HDCR反应扩增中。所述起始引物，协助寡核苷酸与反向引物CommR2G的序列示于图8.

起始引物MLH2O具有四个2’O-甲基核苷酸(小写u)以阻止其在缺乏协助寡核苷酸时起始指数性扩增。协助寡核苷酸MLHF1具有内部d-间隔区(脱碱基位点)，其协助阻止协助寡核苷酸的引导错误导致的背景扩增。亦在3’末端由两个d-间隔区，期望其与3’错配一同干扰所述协助寡核苷酸的延伸。所述协助寡核苷酸的剩余部分完全对应于所述甲基化核酸序列，但亦与所述等价的未甲基化的核酸序列有三个错配(图8)。

复制HDCR扩增在Corbett Rotor-Gene 3000 Real-time PCR机器中进行。HDCR反应混合物包含200nM FD寡核苷酸引物MLH20，20nM协助寡核苷酸MLHF1与40nM反向寡核苷酸引物CommR2G。热循环条件如下所述：95℃下2分钟，继以60循环的95℃下5秒与65℃下40秒(图9A)或95℃下5秒，65℃下20秒，74℃下10秒与65℃下20秒(图9B)。比较了包含与不包含中间加热步骤的反应。在两个条件下较之来自U模板的，来自M模板的扩增均强烈有利，但添加所述中间加热步骤后反应动力学得到很大改善，由此使得自M模板的扩增提前了5到10个循环(图9B)。甚至额外的74℃下10秒的步骤较之自预期机理所预测的增加了HDCR效率。该步骤将所述协助寡核苷酸从杂交与延伸的靶DNA上移除，从而一旦在温度足够降低后允许所述起始引物的杂交。

实施例4-供掺入常见外起始位点(outer priming site)的HDCR

该实施例说明如何使用HDCR建立有效的多重化系统。尽管选择性扩增在不同试管中进行，同样的“外(outer)”引物用于两个反应。所选两个用于该研究的CpG岛在癌症研究中受瞩目，这是因为其在许多癌症，例如结肠直肠癌中变得超甲基化，而在正常组织，包括血液中仍为未甲基化的。图10显示TMEFF2与hMLH1CpG岛内的靶序列(分别为hg18 chr2：192,767,556-192,767,775(-strand)与hg18 chr3：37,010,130-37,010,262)，以及引物与协助寡核苷酸相对于源自亚硫酸氢盐处理甲基化DNA的排列。

模板DNAU与M分别为或者正常血液DNA或经SssI甲基酶处理的血液DNA，已知所述甲基酶在CpG的环境下将胞嘧啶转换为5-甲基胞嘧啶(5mC)。5mC对亚硫酸氢盐转换有抗性，而期待未甲基化的C转换为U(并之后在含有dTTP的扩增中转换为T)。在亚硫酸氢盐处理后，期待测试区域内的所有未甲基化的C由亚硫酸氢盐转换为U，且之后由PCR转换为T。尽管该亚硫酸氢盐转换的DNA称为“U”，应指出在实验进行之前在该特定血液DNA中所选区域的准确甲基化状态不得而知。

显示了在亚硫酸氢盐转换后，hMLH1 CpG岛(在hg18chr3：37,010,130-37,010,262内)区域的甲基化版本以及TMEFF2 CpG岛(在hg18 chr2：192,767,556-192,767,775内)区域的甲基化版本的选择性扩增，使用HDCR与“外”依赖性引物。

HDCR的该变体的关键是起始引物的使用(图10)。这些引物设计为能够杂交于靶序列，并能够穿过目标区域延伸。然而其含有修饰，在此为d-间隔区，其将阻止其受完全拷贝。这导致靶过早终止于所述起始引物上修饰反侧或附近，从而使得通常的链式反应无法进行。在此情况下，所述协助寡核苷酸具有与所述起始引物的5’尾不匹配的5’尾，但却与其它存在于反应物中的依赖性引物的5’区域相匹配。所述协助寡核苷酸具有3’杂交部分，其识别所述起始引物启动(priming)区域3’的区域。过早终止的靶分子，若其具有允许杂交于所述协助寡核苷酸的序列，可拷贝所述协助寡核苷酸的5’尾。这生成了“外”协助寡核苷酸依赖性引物的引物结合位点。因为这些依赖性引物亦包含阻止完全拷贝的修饰(d-间隔区)，扩增依赖于在每一循环中，由拷贝所述协助寡核苷酸引起的所述依赖性引物结合位点的连续再生。在此所给出的实施例中，所述起始引物设计为能够启动其靶的M与U变体两者。换言之，启动设计为特定于亚硫酸氢盐转换序列，但并不给予M或U变体之一任何特异性。为此，尽一切可能避免了其中存在甲基化变体的CpG序列。当CpG位置确实位于所述起始物的结合位点内时，在所述起始物中使用C与T的混合(或G与A，取决于所靶向的链)，从而使得其可结合于M与U两者。仅有的对M序列变体的特异性存在于所述协助寡核苷酸的杂交区域内，其匹配所述M序列但非所述U序列。

用于针对TMEFF2靶的HDCR的寡核苷酸序列(5’到3’)及其浓度为：

250nM TMEFInL1 TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTΔGTTTTT

250nM TMEFInR1 CCRAACAACRAACTACTAAΔCATCCC

40nM TMEFLdS170

TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTGTΔTTTCGCGTTTTCGGCAA ddG

40nM TMEFRdS133

CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAΔCCCGCGAACGACGG A ddG

500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT

500nM MCD4CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT

100nM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGTTAMRA

而对hMLH1靶：

250nM MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔTTGGTA

250nM MLHInit1 CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC

40nM 131hMLHFoldS2

CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTAAAAΔCGTATCCGCGCCAGG-ddG

40nM RMLH170

TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔTACGGAGGGAGTCGCC-ddG

500nM MCD6 TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT

500nM MCD4 CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT

100nM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCGTAACCCT BHQ1

其中Δ＝d-间隔区，5＝甲基胞嘧啶，ddG＝用末端转移酶导入的二脱氧鸟嘌呤，R＝A与G的混合物，HEX＝六氯-6-羰基荧光素(hexachloro-6-carboxyfluorescein)，TAMRA＝6-羧基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine)，BHQ1＝Black Hole Quencher 1。下划线碱基＝与添加的ddG一同减少或消除延伸的错配。

重复实验的HDCR在10微升反应体积中进行，其包含1x Platinum Taq缓冲液[20mM Tris-HCl(pH8.4)与50mM KCl]，4mM MgCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dCTP，0.2mM dGTP，0.4mM dUTP，1/25000倍稀释的SYBR绿，10nM荧光素与来自Invitrogen的0.4单位的Platinum Taq DNA聚合酶(热启动)。将1纳克人类血液DNA，其在体外经使用SssI甲基酶甲基化并随即经亚硫酸氢盐处理(M)，与同样的血液DNA，其亦经亚硫酸氢盐处理但未经SssI甲基酶处理(U)，相比较。循环使用RotorGene 3000(72管转子(tube rotor))与下述程序进行：90℃下5秒，95℃下2分钟，随即10循环的90℃下5秒，95℃下15秒，50℃下2分钟，80℃下10秒，60℃下2分，随即单独培育于60℃下15秒并在FAM/SYBR频道(channel)下读数(从而可在该温度下进行自动校正)，随即60循环的90℃下15秒，50℃下1分钟，80℃下10秒，60℃下1分，并在90℃下在JOE频道下阅读(以检测HEX TaqMan探针的水解)，并在60℃下在FAM/SYBR频道下阅读(以检测双链DNA的产生)。加入了90℃下5秒的步骤以阻止在变温(ramp)到下一步骤95℃时任何的温度过冲(overshooting)。在早期的实验中发现当在所述RotorGene 3000中使用例如10微升的体积时从更低温度直接变温到95℃可为有害的。

针对两个不同靶，TMEFF2(小图A)与hMLH1(小图B)甲基化序列的成功扩增示于图11。由于水解探针水解而产生的HEX荧光指明所述甲基化版本的成功扩增。这发生于TMEFF2与hMLH1靶两者。SYBR绿的存在允许检测任何其它扩增DNA。可见非靶序列在TMEFF2的情况下扩增非常不良，而在hMLH1的情况下完全不扩增。d-间隔区包括在该实施例中每个协助寡核苷酸的杂交区域内。其一个益处为其降低了所述协助寡核苷酸的熔解温度从而降低了其结合于经修复的靶的能力。第二个可能的益处为通过自非靶分子延伸来阻止所述协助寡核苷酸5’区域的拷贝，所述非靶分子有可能部分或全部匹配于所述协助寡核苷酸杂交区域3’于所述d-间隔区的区域。在两个情况下均使用同样的依赖性引物，从而指明了达成下述多重HDCR系统的可能性，即在所述系统中针对特定靶的特异性通过使用起始物与协助寡核苷酸，以及能够扩增存在的靶全部或部分的单独一对依赖性引物来达成。

实施例5-HDCR的寡核苷酸依赖性

该实施例使用hMLH1靶，显示所有三种寡核苷酸(仅考虑所述靶的一个末端)均需用于HDCR。缓冲液与循环条件与之前针对hMLH1的实施例中所用的相同，但在此情况下所有反应物包含1纳克的经亚硫酸氢盐转换的SssI甲基化DNA(M)。为确立成功的HDCR对寡核苷酸的需求，在一些重复实验中缺乏特定的寡核苷酸。HEX(水解探针)与SYBR绿均于包含50个循环的阶段中60℃步骤时读数。所得结果示于图12。在使用水解探针与SYBR绿所得的曲线之间几乎无甚区别，表明所述hMLH1靶受特异性扩增。当所有三种测试的寡核苷酸存在时，紧接着循环20后首次检测到了扩增。当MLHInit2，其为起始物之一，从反应物中略去时，对其中一个反应仅在循环35后方可检测到扩增。在其它重复实验中，未检测到扩增。略去协助寡核苷酸RMLH170，或外依赖性引物MCD6导致非常迟的扩增。这显示成功的HDCR依赖于包含所有三种寡核苷酸。在所有这些反应中在所述靶另一末端引导的相应寡核苷酸均存在。

Claims

1.一种选择性扩增位于核酸分子内的靶核苷酸序列的方法，所述方法包括：

将所述核酸分子与下述物质相接触：

(i)两个或更多寡核苷酸引物，其中至少一个为起始引物，该起始引物经修饰，从而使得因为该起始引物中的修饰，互补链合成过早地终止，和

(ii)至少一个协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸结合与起始引物相同的，重叠的或邻近的序列并且包括下述的序列，所述序列互补于自(i)的过早地终止链，和侧接序列，所述侧接序列是所述起始引物结合位置的3’，从而使得所述协助寡核苷酸充当自(i)的过早地终止的链的延伸的模板，所述协助寡核苷酸还在其3’末端或其3’末端附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸遭阻断；和

实施热循环酶扩增，从而使得所述特定靶序列选择性地扩增；

其中所述方法的直接目的不是获得疾病或健康状况的诊断结果。

2.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(a)使所述模板核酸分子变性；

(b)将所述变性模板核酸分子与至少一种起始引物接触，并自此起始第二链合成，从而由此将所述修饰从所述起始引物导入新合成的链中；

(c)将上述所产生的双链分子变性，并由位于所述起始引物结合的靶核苷酸序列相反末端的引物起始反向链合成，由此反向链合成由于步骤(b)中将修饰导入新合成的链而过早终止；

(d)将所述新合成的双链分子变性，将所述协助寡核苷酸结合于步骤(c)产生的不完整反向链，并自此起始链延伸，以由此完成所述反向链。

3.权利要求2所述的方法，其中所述方法包括下述步骤：

(e)重复步骤(a)到(d)一个或多个额外循环。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物具有足够的序列同一性，从而使得自所述协助寡核苷酸起始链延伸之后再生所述起始引物结合位点，从而由此使所述起始引物能起始后续轮次的链合成。

5.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物不具有足够的序列同一性，从而使得所述起始引物结合位点自所述协助寡核苷酸起始的链合成之后未再生。

6.权利要求5所述的方法，其中所述方法进一步使用协助寡核苷酸依赖性引物，所述引物经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且该引物与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得自所述协助寡核苷酸起始的链合成生成了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，从而由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物能够起始后续轮次的链合成。

7.权利要求1的方法，其中所述方法用于改善所期望靶序列扩增的特异性，随之减少或消除了非期望的非靶序列的扩增。

8.权利要求1的方法，其中所述模板核酸分子存在于选自下组的生物样品中：组织，细胞和/或其提取物。

9.权利要求1的方法，其中至少一个阻断所述协助寡核苷酸3’延伸的修饰包含在3’末端或其附近掺入一个或多个不可延伸的部分或核苷酸类似物。

10.权利要求9所述的方法，其中至少一种修饰包括单独的3’末端不可延伸的碱基或碱基类似物，3’末端不可延伸的碱基和所述寡核苷酸3’末端附近的一个或多个核苷酸错配的组合，和/或在所述寡核苷酸3’末端附近掺入脱碱基位点。

11.权利要求10所述的方法，其中所述不可延伸的碱基选自下组：2’，3’二脱氧核苷酸，3’C3，C18或其它长度间隔区，3’磷酸化核苷酸，“肽核酸”碱基，“锁定核酸(LNA)”碱基，核苷酸胺衍生物，经尿嘧啶DNA转葡萄糖基酶处理的尿嘧啶，RNA或2’O-甲基核苷酸，或上述的组合。

12.权利要求1的方法，其中所述起始引物经下述修饰：包含一个或多个3’C3，C18或其它长度间隔区，脱碱基位点或修饰核苷酸。

13.权利要求6的方法，其中所述起始引物和/或所述协助寡核苷酸依赖性引物经下述修饰：包含一个或多个3’C3，C18或其它长度间隔区，脱碱基位点或修饰核苷酸。

14.权利要求12或13的方法，其中所述修饰核苷酸为2’-O-甲基核苷酸。

15.权利要求12的方法，其中在起始引物中的修饰位于足够靠近所述引物的3’端，从而使得虽然所述引物保留起始3’延伸的能力，但当在其引物序列中包含所述修饰的延伸产物被拷贝时，其互补链过早地截短从而阻止了后续扩增循环中引物的结合。

16.权利要求13的方法，其中在起始引物和/或协助寡核苷酸依赖性引物中的修饰位于足够靠近所述引物的3’端，从而使得虽然所述引物保留起始3’延伸的能力，但当在其引物序列中包含所述修饰的延伸产物被拷贝时，其互补链过早地截短从而阻止了后续扩增循环中引物的结合。

17.权利要求1的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’末端与所述起始引物的5’末端相符，或位于(fall within)所述起始引物内。

18.权利要求6的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’末端与所述协助寡核苷酸依赖性引物的5’末端相符，或位于所述协助寡核苷酸依赖性引物内。

19.权利要求1的方法，其中所述协助寡核苷酸包括延伸的5’尾，其包括除存在于所述起始引物5’末端之外的序列。

20.权利要求6的方法，其中所述协助寡核苷酸包括延伸的5’尾，其包括除存在于所述协助寡核苷酸依赖性引物5’末端之外的序列。

21.权利要求19的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’尾便于附接可检测的标记或标签。

22.权利要求1所述的方法，其中侧接所述靶序列的两个寡核苷酸引物均为起始引物和所述方法使用两个协助寡核苷酸，其中两个协助寡核苷酸之一结合于与正向起始引物的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子的区域，而两个协助寡核苷酸的另一个结合于与反向起始引物的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子的区域。

23.权利要求22所述的方法，其中至少一个协助寡核苷酸的5’区域与其相应的起始引物具有足够的序列同一性，从而使得在自所述至少一种协助寡核苷酸起始链延伸之后再生所述起始引物结合位点，从而由此使所述相应的起始引物能起始后续轮次的链合成。

24.权利要求22所述的方法，其中至少一个协助寡核苷酸的5’区域与其相应起始引物不具有足够的序列同一性，从而使得所述相应的起始引物结合位点在自所述至少一种协助寡核苷酸起始的链合成之后未再生。

25.权利要求24所述的方法，其中所述方法进一步使用至少一个协助寡核苷酸依赖性引物，所述引物经修饰从而使得所述修饰的存在过早终止互补链合成，且该引物与所述相应的协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得自所述协助寡核苷酸起始的链合成生成了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物能起始后续轮次的链合成。

26.权利要求25所述的方法，其中所述方法使用两个协助寡核苷酸依赖性引物，其中之一结合于与一个协助寡核苷酸的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子上的区域，而另一个结合于与另一个协助寡核苷酸的基本上相同或邻近的所述模板核酸分子上的区域。

27.一种改善热循环酶扩增反应特异性的方法，所述反应使用至少两个侧接位于核酸分子内的目的靶核苷酸序列的寡核苷酸引物，其中所述寡核苷酸引物中的至少一个经修饰从而使得所述修饰的寡核苷酸引物中的修饰的存在过早终止互补链合成，且所述反应进一步使用至少一个非起始的协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在其3’末端或其3’末端附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸遭阻断，且其中所述协助寡核苷酸结合模板核酸分子的与修饰的寡核苷酸引物基本上相同的或邻近的区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与位于修饰的寡核苷酸引物结合位置的3’的靶序列互补的序列，其中所述方法的直接目的不是获得疾病或健康状况的诊断结果。

28.权利要求27所述的方法，其中所述热循环酶扩增反应的特异性通过消除不包括所述目标靶核苷酸序列的扩增产物或减少其量来确定。

29.一种检测变体核苷酸序列的方法，所述方法包括选择性的扩增位于核酸分子内和包含所述变体序列的靶核苷酸序列，其中所述方法包括：

将所述核酸分子与下述物质相接触：

(i)至少一个协助寡核苷酸，其中所述协助寡核苷酸在协助寡核苷酸的3’末端或其附近包含至少一个修饰，从而使得自所述协助寡核苷酸的3’延伸遭阻断，以及

(ii)两个或更多寡核苷酸引物，其中至少一个为起始引物，所述起始引物经修饰从而使得在修饰的起始引物中的修饰的存在过早地终止互补链合成，

其中所述协助寡核苷酸结合模板核酸分子的与修饰的起始引物基本上相同的或邻近的区域，且所述协助寡核苷酸进一步包括与位于起始引物结合位置的3’的靶序列互补的3’序列，且其中所述协助寡核苷酸的3’序列使所述协助寡核苷酸能优先结合于所述包含所述变体序列而非相应的非变体序列的靶核苷酸序列；

将所述扩增产物的核苷酸序列与所述非变体靶序列相应的序列相比较，以检测所述变体核苷酸序列；

30.权利要求29所述的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物具有足够的序列同一性，从而使得在自所述协助寡核苷酸起始的链延伸之后再生所述起始引物结合位点，从而由此使所述起始引物能起始续轮次的链合成。

31.权利要求29所述的方法，其中所述协助寡核苷酸的5’区域与所述起始引物的相应区域不具有足够的序列同一性，从而使得所述起始引物结合位点在自所述协助寡核苷酸起始的链合成之后未再生。

32.权利要求31所述的方法，其中所述方法可进一步使用协助寡核苷酸依赖性引物，该引物与所述协助寡核苷酸的5’区域具有足够的序列同一性，从而使得自所述协助寡核苷酸起始的链合成产生了协助寡核苷酸依赖性引物结合位点，从而由此使所述协助寡核苷酸依赖性引物能起始后续轮次的链合成。

33.权利要求29到32任一所述的方法，其中所述变体序列包括添加，缺失或取代一个或多个核苷酸，或针对在所述靶序列内一个或多个核苷酸的修饰。

34.权利要求33的方法，其中核苷酸的修饰为改变的甲基化状态。