ES2460896T3 - Amplificación de ácido nucleico - Google Patents
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Abstract
Un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método: poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con (i) al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y (ii) dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.
Description
Amplificación de ácido nucleico
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la amplificación selectiva de secuencias específicas de ácido nucleico. La selectividad de la amplificación se consigue mediante el uso de al menos un cebador de oligonucleótido modificado junto con un oligonucleótido facilitador correspondiente en una reacción de amplificación enzimática termocíclica. Se proporciona también selectividad mediante secuencias ubicadas dentro del amplicón a las cuales se une el oligonucleótido facilitador. La invención se refiere también a la manipulación del producto de amplificación y a los usos del producto modificado generado de acuerdo con los métodos de la invención, tal como la adición de la secuencia 3' monocatenaria que se puede usar como un sitio de unión a una única secuencia de nucleótidos.
Antecedente de la invención
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica para sintetizar rápidamente un gran número de copias de un segmento definido de una molécula de ácido nucleico (véase, por ejemplo, Mullis y col., patentes de los Estados Unidos Nros 4683195, 4683202 y 4800159). La técnica de la PCR es extremadamente sensible, requiriendo teóricamente una solo única molécula de ácido nucleico para la amplificación. La PCR es una reacción mediada por enzimas que incorpora normalmente una molécula molde, una pareja de cebadores de oligonucleótidos y una polimerasa de ácido nucleico en un medio de reacción que contiene las sales adecuadas, cationes metálicos, nucleótidos libres y un sistema tamponante del pH. El método de la PCR se basa en ciclos repetidos de desnaturalización del ácido nucleico bicatenario, seguido por la hibridación del ácido nucleico con el molde de ácido nucleico, y la extensión del cebador mediante la polimerasa. Los cebadores de oligonucleótidos utilizados en la PCR se diseñan para hibridarse a las hebras opuestas de la molécula molde y se sitúan flanqueando la secuencia diana que se va a amplificar. A medida que los cebadores se amplían desde sus extremos 3' mediante la polimerasa, los productos de ampliación proporcionan copias de la secuencia diana original que pueden a su vez actuar como moléculas molde para los ciclos adicionales de la amplificación. La amplificación mediante la PCR da como resultado el aumento exponencial de moléculas de ácido nucleico discretas para obtener la cantidad deseada de producto de ácido nucleico amplificado, cuya longitud se define por los extremos 5' de los cebadores de oligonucleótidos.
Aunque es simple y específica en principio, la PCR es propensa a diversos tipos de artefactos no deseados que pueden ser problemáticos para los usuarios y pueden afectar negativamente la selectividad y la especificidad de la técnica. Por ejemplo, la amplificación no específica de fragmentos puede ser el resultado de la unión de uno o ambos cebadores a una(s) secuencia(s) diferente(s) de la secuencia diana, que puede producir uno o más fragmentos que no sean el producto deseado. La unión no específica de cebadores se produce frecuentemente y puede deberse, por ejemplo, a alternar secuencias de unión a cebadores que están presentes en el molde de la secuencia de nucleótidos diana, la presencia de secuencias de unión a cebadores similares en moléculas contaminantes extrañas y/o a un diseño de la secuencia del cebador que no sea óptimo. Estos productos de ácido nucleico no específicos pueden ser problemáticos, especialmente cuando el molde de ácido nucleico que contiene la secuencia diana está presente en unas pocas copias.
En algunos casos, los cebadores solamente pueden unirse parcialmente a los sitios de unión complementarios, y ampliarse incluso cuando está presente un emparejamiento incorrecto con el ADN unido en el extremo 3' de un cebador (por ejemplo, véase Kwok y col. 1990, "Effects of primer template mismatches on the polymerase chain reaction human-immunodeficiency-virus type-1 model studies." Nucleic Acids Research 18(4): 999-1005). Debido a esto, se puede producir una amplificación no específica no deseada. Cuando se copia la hebra de ADN resultante del cebado incorrecto, se genera un primer sitio de unión al cebador que se empareja completamente con el cebador. De este modo, pueden aparecer productos no deseados en la PCR convencional que tiene en ambos extremos sitios de unión que son totalmente complementarios de los cebadores. De esta manera, una vez que se produce este producto no deseado, es probable que se amplifique con elevada eficacia. En otras palabras, una vez se ha producido el cebado incorrecto, no es posible especificidad adicional en la PCR convencional. Aunque se pueden usar diversos tipos de sondas para detectar específicamente la diana deseada, si se producen demasiadas amplificaciones no específicas, puede evitarse o reducirse la producción del producto deseado a niveles que son indetectables con la sonda específica. Esta situación es más probable que se produzca en casos donde la diana de interés constituye solo una muy pequeña fracción del ácido nucleico total.
La amplificación no específica se agudiza también cuando se produce en los ciclos iniciales del ciclo de la PCR. Normalmente en las técnicas de la PCR existentes, la especificidad debida a las secuencias de los cebadores se consigue solo en los ciclos iniciales de la PCR. Una vez que se ha generado una cantidad significativa de producto, la amplificación continúa a iguales velocidades tanto si los cebadores se han ampliado desde los sitios previstos que flanquean la secuencia diana o desde los amplicones no específicos que surgen del cebado incorrecto. Esto es, incluso aunque los cebadores puedan haberse unido y se haya producido la extensión desde sitios incorrectos para los cuales los cebadores tengan solo complementariedad parcial, los productos no específicos amplificados tienen la
secuencia exacta de unión al cebador de oligonucleótido incorporada en virtud de la técnica de la PCR, y esta compite con igual eficacia con el molde de ácido nucleico que contiene la secuencia diana para la unión al cebador de oligonucleótido en los ciclos posteriores de la PCR. En aplicaciones tales como la PCR específica de alelo se requieren normalmente un considerable cuidado en el diseño del cebador y un considerable esfuerzo en la optimización de la técnica para minimizar el cebado incorrecto.
En un intento de limitar la incidencia de la amplificación de productos no específicos, las técnicas de la PCR actuales pueden emplear procedimientos modificados destinados a aumentar la especificidad de unión del cebador al ácido nucleico diana. Esto puede implicar, por ejemplo, alterar la presencia y la concentración de diferentes cofactores que median el método de unión al cebador o modifican la termociclación del método de la PCR. Alternativamente, se puede utilizar la PCR anidada que implica dos conjuntos de cebadores utilizados en dos ciclos sucesivos de la PCR. La primera amplificación de la PCR produce la diana y productos potencialmente no específicos que utilizan el primer conjunto de cebadores, mientras que el segundo ciclo de la PCR utiliza nuevos cebadores para amplificar una diana secundaria dentro del primer ciclo del producto diana en un esfuerzo por reducir la generación de un producto no específico.
El documento W003/074724 se refiere a un método de amplificación polinomial del ADN que utiliza, inter alia, cebadores semianidados. De acuerdo con esta divulgación, una molécula de ácido nucleico que se va a amplificar se pone en contacto con al menos dos cebadores; un cebador no replicable que se puede hibridar con la molécula de ácido nucleico que se está amplificando, y un cebador replicable que se puede hibridar con un producto de ampliación del cebador generado a partir de la ampliación del cebador no repicable.
Aunque existen modificaciones a la técnica de la PCR que son útiles para mejorar la especificidad de unión al cebador, muchos requieren amplia prueba y error lo que pueden ser laborioso y llevar tiempo. Además, incluso tras incorporar estas técnicas, sigue habiendo a menudo productos no específicos que son inherentemente difíciles de eliminar. En consecuencia, existe una necesidad continuada de mejorar las metodologías basadas en la PCR que permitan la amplificación selectiva mejorada de las secuencias de ácido nucleico diana.
Como con estos métodos, la nueva invención descrita en la presente memoria incluye la selectividad de la disposición de secuencias entre los sitios de cebado en la secuencia de nucleótidos de partida y puede proporcionar una especificidad de secuencia adicional en una única reacción tal como se obtiene normalmente utilizando cebadores anidados y dos ciclos de la PCR.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente del inventor de que la especificidad de una PCR se puede potenciar mediante el uso de dos oligonucleótidos modificados que se pueden unir al mismo extremo de una secuencia diana. Uno de estos oligonucleótidos modificados (denominado en el presente documento el "oligonucleótido facilitador") no actúa como cebador, ya que incluye una modificación en el extremo o próxima al extremo 3' que impide la extensión. El oligonucleótido facilitador actúa como molde para la regeneración de la secuencia del amplicón y no se incorpora directamente a níngún producto de amplificación. El otro oligonucleótido modificado (denominado en el presente documento el "cebador iniciador") está modificada de tal manera que aunque es posible la extensión en 3' del cebador mediada por la polimerasa, se evita la copia de la polimerasa en la hebra opuesta. En determinadas realizaciones, este cebador puede compartir suficiente identidad de la secuencia en la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la hebra utilizando el oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra. En dichos casos, el cebador iniciador es "dependiente del oligonucleótido facilitador" ya que la unión satisfactoria al molde de la secuencia del nucleótido amplificado depende del oligonucleótido facilitador que actúa como un molde para la regeneración al sitio de unión al cebador iniciador. En los casos donde existe una identidad de secuencia insuficiente entre el cebador iniciador y la región 5' del oligonucleótido facilitador, el método puede emplear un "cebador dependiente del oligonucleótido facilitador" adicional, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria, y dicho cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra que utiliza el oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra. De acuerdo con la presente invención, se puede emplear la combinación del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador y/o del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador en uno o ambos extremos de una secuencia diana que se va a amplificar.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan métodos para la amplificación selectiva de secuencias de nucleótidos diana específicas en muestras biológicas que contienen moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos se denominan también de forma conjunta en el presente documento como una reacción en cadena dependiente de hibridación (HDCR).
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método: poner en
contacto la molécula "molde" de la molécula de ácido nucleico") con
- (i)
- al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y
- (ii)
- dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa,
donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias con la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y llevar a cabo la amplificación enzimática termocíclica de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.
El método anterior puede comprender las etapas de:
- (a)
- desnaturalizar la molécula molde ácido nucleico;
- (b)
- poner en contacto la molécula molde ácido nucleico desnaturalizada con al menos un cebador iniciador e iniciar la síntesis de la segunda hebra a partir de la anterior, introduciendo de esta forma la modificación a partir del cebador iniciador en la hebra sintetizada recientemente;
- (c)
- desnaturalizar las moléculas bicatenarias así generadas e iniciar la síntesis de la hebra inversa a partir de un cebador localizado en el extremo opuesto de la secuencia de nucleótidos diana a la cual se une el cebador iniciador, mientras que la síntesis de la hebra inversa termina prematuramente debido a la modificación introducida en la etapa (b);
- (d)
- desnaturalizar las moléculas bicatenarias sintetizadas recientemente, unir el oligonucleótido facilitador a la hebra inversa incompleta generada en la etapa (c) y ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador para completar la hebra inversa; y
- (e)
- repetir opcionalmente las etapas (a) a (d) en uno o más ciclos adicionales.
En una realización, la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
En una realización alternativa, la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador.
De acuerdo con esta realización alternativa, el método puede emplear adicionalmente un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
El método se puede usar para mejorar la especificidad de la amplificación de una secuencia diana deseada, reduciendo o eliminando de forma prácticamente simultánea la amplificación de secuencias no diana no deseadas.
La molécula de ácido nucleico puede estar presente en cualquier muestra biológica adecuada, incluyendo por ejemplo, tejidos, células y/o extractos de las mismas. La molécula de ácido nucleico se puede purificar a partir de la muestra biológica antes de llevar a cabo el método de amplificación de acuerdo con la invención.
La molécula de ácido nucleico puede ser ADN o ARN o puede comprender una combinación de desoxirribonucleótidos. ribonucleótidos y/o análogos de nucleótidos naturales.
Usualmente, la al menos una modificación que bloquea la extensión 3' del oligonucleótido facilitador incluye la incorporación de uno o más restos o nucleótidos análogos extensibles en o próximos al extremo 3', por ejemplo, una base no extensible del extremo 3' única o un análogo de base, una combinación de una base no extensible del extremo 3' y uno o más nucleótidos emparejados incorrectamente próximos al extremo 3' del oligonucleótido, o la incorporación de un sitios abásico cerca del extremo 3' del oligonucleótido. La base no extensible se puede seleccionar a partir de, por ejemplo, un 2', 3' didesoxinucleótido, un 3' C3, C18 u otro separador en longitud, un nucleótido 3' fosforilado, una base de "ácido nucleico peptídico", una base de "ácido nucleico bloqueado" (LNA), un derivado de amina de nucleótido, uracilo tratado con Uracil ADN glicosilasa, ARN o un 2' O-metil nucleótido, o una combinación de estos.
El cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador puede modificarse mediante la inclusión de, por ejemplo, uno o más separadores, un sitios abásicos o nucleótidos modificados tales como 2'-Ometil nucleótidos. Normalmente, la modificación en el cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador se localiza suficientemente próxima al extremo 3' del cebador de tal manera que aunque el cebador retiene la capacidad de iniciar la extensión de 3', cuando se copia el producto ampliado que contiene la modificación en su secuencia de cebador, la hebra complementaria se trunca prematuramente evitando la unión del cebador en los posteriores ciclos de amplificación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la modificación puede localizarse aproximadamente 10 bases, 9 bases, 8 bases, 7 bases, 6 bases, 5 bases o 4 bases desde el extremo 3' del cebador.
El extremo 5' del oligonucleótido facilitador puede coincidir o estar comprendido en el extremo 5' del cebador iniciador y/o del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador. Alternativamente, el oligonucleótido facilitador puede comprender una secuencia 5' adicional. Dicha secuencia adicional se puede utilizar como, o puede facilitar la unión de una etiqueta o marca detectable.
En una realización, ambos cebadores (cebadores directo e inverso) son cebadores iniciadores. En este caso, se emplean dos oligonucleótidos facilitadores, uno de los cuales se une a prácticamente a la misma región o a la región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador directo y el otro se une a prácticamente la misma región o a la región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador inverso.
Además, el método puede emplear dos cebadores dependientes del oligonucleótido facilitador, uno de los cuales se une a prácticamente a la misma región o a la región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador directo y el otro se une a prácticamente la misma o a la región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador inverso.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para mejorar la especificidad de una reacción de amplificación enzimática termocíclica, utilizando la reacción al menos dos cebadores de oligonucleótidos que flanquean una secuencia de nucleótidos diana de interés localizada en una molécula de ácido nucleico, donde al menos uno de dichos cebadores está modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria y la reacción utiliza además al menos un oligonucleótido facilitador sin cebar, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y donde el oligonucleótido facilitador y el cebador modificado se unen a prácticamente la misma o a las regiones adyacentes de la molécula de ácido nucleico molde y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias con la secuencia 3' diana a la localización de unión del cebador modificado, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.
La especificidad de la reacción de amplificación enzimática termocíclica se determina normalmente mediante la eliminación de, o la reducción en la cantidad de, producto de amplificación que no comprende la secuencia del nucleótido diana de interés.
Se pueden usar los métodos llevados a cabo de acuerdo con los anteriores aspectos y realizaciones, por ejemplo, en el análisis de metilación del ADN y/o en el diagnóstico de, o en la predicción de la susceptibilidad de, una enfermedad o dolencia en un sujeto, donde la enfermedad o dolencia se caracteriza o se asocia con una secuencia genética variante. La secuencia variante puede comprender la adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos o una modificación, tal como un estado de metilación alterado, de uno o más nucleótidos.
De acuerdo con ello, un tercer aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia de nucleótidos variante, comprendiendo el método amplificar selectivamente una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico y que comprende la secuencia variante, donde el método comprende:
poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con
- (i)
- al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y
- (ii)
- dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria,
donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a prácticamente la misma region o a las regiones adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias 3' complementarias de la secuencia 3' diana con respecto a la localización de la unión del cebador iniciador y donde dichas secuencias 3' permiten la unión preferente del oligonucleótido facilitador con la secuencia de nucleótidos diana que comprende la secuencia variante en lugar de con la correspondiente secuencia no variante; llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador, y comparar la secuencia de nucleótidos del producto amplificado con una secuencia correspondiente a la secuencia diana no variante, para detectar la
5 secuencia de nucleótidos variante.
En una realización, la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de
10 síntesis de la hebra.
En una realización alternativa la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una identidad de secuencia insuficiente con la región correspondiente del cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador.
15 De acuerdo con esta realización alternativa, el método puede emplear adicionalmente un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador
20 dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
La secuencia variante puede comprender la adición, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos o una modificación, tal como un estado de metilación alterado, de uno o más nucleótidos en la secuencia diana.
25 Breve descripción de los dibujos
La presente invención se describe en el presente documento, a modo solo de ejemplo, con referencia a los dibujos que la acompañan.
30 Figura 1: Representación esquemática de las etapas en una reacción en cadena dependiente de hibridación de acuerdo con la invención.
Figura 2: Secuencias y posiciones de unión del cebador inverso (AIuRev), cebador iniciador directo (InAluPr3) y oligonucleótido facilitador (InAluFol15) al molde de secuencia de ácido nucleico diana derivado de la secuencia
35 de repetición Alu humana. Δ representa un sitio abásico; I representa inosina. Las secuencias se muestran despues del tratamiento con UDG.
Figura 3: Curvas de amplificación HDCR en tiempo real (por duplicado) que muestran la cantidad de producto Alu amplificado (medido mediante fluorescencia) para la reacción en cadena dependiente de hibridación de
40 acuerdo con una realización de la invención que contiene: cebador iniciador (cebador FD) InAluPr3 solo; oligonucleótido facilitador InAluFol15 (foligo) solo; o cebador FD [nAluPr3 en combinación con el foligo InAluFol15.
Figura 4: Identidad de la secuencia y alineación de la secuencia del molde de ácido nucleico mutante (MUTB) y
45 la secuencia del molde de ácido nucleico normal (NORB). La mutación T por A oncogénica (V600E) está subrayada en la secuencia mutante (MUTB). La región central de la secuencia que se muestra (que incluye la mutación T por A) se deriva del homólogo B1 del oncogén del virus del sarcoma murino v-raf (BRAF)
Figura 5: Secuencias y posiciones de unión del cebador inverso (CommR3G), cebador iniciador (BRF2) y
50 oligonucleótido facilitador (BFol3) al molde de secuencia del ácido nucleico diana mutante (MUTB) y normal (NORB). Los huecos en la secuencia subrayada representan los emparejamientos incorrectos de una secuencia de ácido nucleico diana con el oligonucleótido facilitador (BFoI3) o un sitio abásico (Δ) en el cebador iniciador (BRF2). I representa inosina; ddG representa didesoxiguanosina.
55 Figura 6: Curvas de amplificación HDCR en tiempo real (por duplicado) que muestran la cantidad de producto amplificado (medido mediante fluorescencia) tal como se produjo mediante reacción en cadena dependiente de hibridación de acuerdo con una realización de la invención para la secuencia diana del gen BRAF normal (círculos) y mutación puntual que contiene la secuencia diana del gen BRAF (triángulos), como se muestra en la Figura 4, a dos temperaturas de hibridación de 68 ºC y 72 ºC.
60 Figura 7: Identidad de la secuencia y alineación del molde de la secuencia de nucleótidos metilada (M) y no metilada (U) derivada del gen hMLH1. La secuencia subrayada indica la región de tratamiento con bisulfito del gen hMLH1, mientras que las regiones en negrita indican los restos que difieren entre los moldes de las secuencias de los nucleótido M y U.
Figura 8: Secuencias y posiciones de unión del cebador inverso (CommR3G), cebador iniciador (MLH2O) y oligonucleótido facilitador (MLHF1) para el molde de la secuencia de ácido nucleico diana metilado (M) y sin metilar (U) procedente del gen hMLH1 tal como se muestra en la Figura 7. Δ representa un sitio abásico (separador d); u representa 2'-O-metil uridina. La secuencia subrayada indica diferencias de nucleótidos entre los moldes de la secuencia M y U, mostrándose también las posiciones correspondientes en el oligonucleótido facilitador.
Figura 9: A y B. Curvas de amplificación HDCR en tiempo real (cada una por duplicado) que muestran el efecto de una etapa de calentamiento de termociclación intermedia (74 ºC) (B) sobre la cantidad de producto amplificado (medido mediante fluorescencia) a partir de los moldes de la secuencia diana metilada (M) y sin metilar (U) procedentes del gen hMLH1.
Figura 10: Secuencias diana de los genes TMEFF2 y hMLH1 para la amplificación del ADN tratado con bisulfito. Secuencias que surgen de la conversión del bisulfito de las regiones de los sitios de cebado y los oligonucleótidos iniciadores correspondientes, TMEFInL1 yTMEFInR1 y los oligonucleótidos facilitadores TMEFLdS170 y TMEFRdS133 para TMEFF2, cebadores iniciadores MLHInit2 y MLHInit1 y los oligonucleótidos facilitadores RMLH170 y 131hMLHFoldS2 para hMLH1 y los cebadores MCD4 y MCD6 dependientes de oligonucleótidos facilitadores externos comunes están alineados. ddG denota un didesoxi G que se añadió utilizando la transferasa terminal (síntesis posterior de oligonucleótidos). Las bases subrayadas son emparejamiento incorrectos que junto con la ddG añadida reducen o eliminan ampliación. Δ indica un separador d; "5" indicate 5-metil citosina (cuando está presente en lugar de C en un oligonucleótido); y R indica una mezcla de A y G. Se indica la presencia de una secuencia adicional por ---
Figura 11: Curvas de amplificación HDCR (cada una por duplicado) que muestran la amplificación de TMEFF2 metilado (Panel A) o hMLH1 (Panel B) a partir de moldes de ADN tratados con bisulfito metilado (M) o no metilado (U). En los paneles de la izquierda se detectó la amplificación del producto metilado con sondas TaqMan marcadas específicas de HEX y en los paneles de la derecha se detectó ADN amplificado total utilizando el SYBR green.
Figura 12: Curvas de amplificación HDCR en tiempo real (cada una por duplicado) que muestran la amplificación de hMLH1 metilado procedente del molde de ADN tratado con bisulfito metilado. Se omitieron los oligonucleótidos individuales tal como se ha indicado. En la amplificación del panel de la izquierda se detectó el producto metilado con una sonda TaqMan marcada específicas de HEX y en el panel de la derecha se detectó ADN amplificado total utilizando el SYBR green.
Descripción detallada
A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a no ser que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprende", y las variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros indicados pero no la exclusión de cualquier otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.
Los artículos "un" y "uno" se usan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir), a al menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Tal como se usa en el contexto de la presente invención, el término "amplificación" se refiere a realizar una o más copias de una secuencia de nucleótidos diana mediante una reacción enzimática termocíclica, e incluye, pero no se limita a la amplificación de las moléculas de ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Tal como se usa en el presente documento el término "Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se refiere a una técnica para producir un gran número de copias de un segmento específico de una secuencia de un ácido nucleico mediante la amplificación enzimática dirigida al cebador de oligonucleótidos llevada a cabo en un procedimiento de termociclación. Los ejemplos de diferentes técnicas de la PCR incluyen, pero no se limitan a la PCT mediante transcripción inversa, PCR anidada, PCR específica de alelo, PCR cuantitativa, PCR de intervalo amplio, análisis rápido de ADN polimórfico amplificado, amplificación rápida de los extremos del ADNc, PCR de expresión diferencial, PCR mediada por ligadura, PCR de metilación específica, PCR Headloop y PCR con alto contenido en metilo. La PCR puede referirse a la amplificación lineal no exponencial del ADN además de la amplificación exponencial del ADN, donde la persona experta en la técnica reconocería que cualquier forma de amplificación es adecuada para el fin de la invención.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "cebador" designan cualquier molécula basada en ácido nucleico, incluyendo el ADN, ADNc, ARN, ARNm, ARNc, pNA o cualquier combinación de los mismos. De esta manera, una molécula de ácido nucleico, un oligonucleótido o un cebador pueden comprender nucleótidos que se producen naturalmente, nucleótidos que no se producen naturalmente o una combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se refiere a una secuencia monocatenaria de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, análogos conocidos de nucleótidos naturales, o mezclas de los mismos. Los oligonucleótidos son secuencias normalmente cortas (por ejemplo, de menos de 50 nucleótidos de longitud) que se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, síntesis química directa o clonación y restricción de las secuencias adecuadas. Normalmente en el contexto de la presente invención se diseña un oligonucleótido para reconocer y unirse a una secuencia específica de un nucleótido complementario localizada en una molécula de un ácido nucleico más grande. El oligonucleótido puede ser o no capaz de actuar como cebador para la ampliación mediada por la polimerasa. No todas las bases de un oligonucleótido tienen que ser complementarias de la secuencia para la cual se diseña el oligonucleótido para unirse; el oligonucleótido necesita solo contener suficientes bases complementarias para permitir al oligonucleótido reconocer y unirse a la secuencia. Un oligonucleótido puede incluir también bases adicionales. La secuencia del oligonucleótido puede ser una secuencia de nucleótidos sin modificar o se puede modificar o conjugar químicamente mediante una variedad de medios tal como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el contexto de la presente invención, el término "síntesis de la hebra complementaria" se refiere a la generación de la secuencia de nucleótidos complementaria mediante una reacción enzimática que utiliza una secuencia de amplicón desnaturalizada como molde.
Tal como se usa en el presente documento, el término "amplicón" se refiere al producto de una secuencia de nucleótidos amplificada que incorpora al menos un cebador que flanquea la secuencia diana.
Tal como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido que se une a una región específica de una molécula molde de ácido nucleico monocatenario e inicia la síntesis de ácido nucleico mediante una reacción enzimática, que se extiende desde el extremo 3' del cebador y es complementaria de la secuencia de la molécula molde. Por convención, los cebadores se denominan normalmente cebadores 'directo' e 'inverso', uno de los cuales es complementario de una hebra de ácido nucleico y el otro de los cuales es complementario del complemento de esta hebra.
Tal como se usa en el presente documento, el término "secuencia diana" se refiere a una secuencia de nucleótidos específica que se va a amplificar. Los oligonucleótidos utilizados de acuerdo con los métodos de la invención poseen al menos una secuencia sustancial complementaria de las secuencias de ácido nucleico localizadas en los extremos 5' y 3' de la secuencia diana.
Tal como se usa en el presente documento, el término "en o cerca del extremo 3'" se refiere a la región de nucleótidos inmediatamente a 5' del extremo 3' y que se extiende a 5' del extremo 3' de una molécula de ácido nucleico, que incluye normalmente el nucleótido terminal.
Tal como se usa en el contexto de la presente invención, el término "extensión 3' bloqueada" se refiere a la ausencia en términos prácticos de una extensión 3' del oligonucleótido facilitador, de tal manera que no continuará la reacción de amplificación, o continuará a una velocidad no práctica.
Tal como se usa en el presente documento, el término "prácticamente la misma región o las regiones adyacentes" en el contexto de los sitios de unión de los oligonucleótidos facilitadores, y los cebadores iniciadores y/o cebadores dependientes de oligonucleótidos facilitadores significa que los oligonucleótidos/cebadores son capaces de unirse a la misma región general de la molécula molde, pero no necesariamente a las mismas secuencias de nucleótidos del molde. Por ejemplo, un oligonucleótido facilitador puede unirse a las secuencias del molde 3' (en la dirección 3' de) las secuencias unidas mediante un cebador iniciador, pero todavía prácticamente en la misma región del molde. En este caso, se produce la unión del oligonucleótido facilitador con las secuencias adyacentes a las secuencias de unión del cebador iniciador. El término "adyacente" no requiere que las secuencias sean inmediatamente adyacentes o 'que estén en contacto', sino que abarca situaciones en las que existen uno o más nucleótidos intervinientes o solapantes entre las secuencias 'adyacentes'.
Tal como se usa en el presente documento, el término "muestra" se refiere a una muestra biológica que comprende moléculas de ácido nucleico, que comprende normalmente ADN y/o ARN. Las muestras pueden ser tejidos, células
o extractos de los mismos. o pueden ser muestras purificadas de moléculas de ácidos nucleicos. El uso del término "muestra" no implica necesariamente la presencia de la secuencia diana en las moléculas de ácidos nucleicos presentes en la muestra.
Los métodos de amplificación de la presente invención, denominados también en el presente documento colectivamente como reacción en cadena dependiente de hibridación (HDCR), proporciona un grado elevado de especificidad para cuaalquier amplificación de ácido nucleico dirigida, que reduce o elimina a la vez drásticamente los productos de amplificación no específicos.
La metodología descrita en el presente documento permite que se mantenga la selección de una diana deseada durante muchos ciclos en la reacción de amplificación, a diferencia de la técnica anterior de la PCR convencional. Incluso en el caso de que la eficacia de amplificación de la diana deseada sea solo ligeramente mejor que la de los
productos no deseados, el efecto acumulativo del mantenimiento de esta diferencia durante un número grande de ciclos da como resultado una selectividad elevada para la diana deseada. Esta selectividad se consigue utilizando cebadores concretos (denominados en el presente documento 'cebadores iniciadores' y 'cebadores dependientes de oligonucleótidos facilitadores') que contienen una modificación que les evita copiarse completamente. No es posible una amplificación significativa a no ser que los sitios de unión a cebador puedan regenerarse para permitir la unión y ampliación adicionales. Se consigue la regeneración de un sitio de unión a cebador utilizando un oligonucleótido denominado en el presente documento oligonucleótido facilitador que se diseña para reconocer una secuencia en la diana deseada, en la dirección 3' del cebador iniciador y/o el sitio de unión al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador. En el caso de un acontecimiento de cebado incorrecto, es poco probable que esta región se empareje lo suficiente con la región correspondiente en el oligonucleótido facilitador para permitir la regeneración del sitio de unión al cebador. De esta manera se puede reducir o eliminar la amplificación no específica. Adicionalmente, el sistema se puede usar para seleccionar variantes de secuencias concretas tales como mutaciones en la region de la dirección 3' desde el sitio de unión del cebador. En este caso, se pueden regenerar los sitios de unión al cebador incluso cuando existe un emparejamiento incorrecto con el oligonucleótido facilitador, pero esto se produce con una eficacia más baja debido a que se puede mantener la selección durante un número grande de ciclos (dependiendo de la cantidad de diana añadida a la reacción) para que se pueda producir una fuerte selección de la variante de la secuencia deseada.
Se han descrito también metodologías de la técnica anterior que también permiten la selección durante un número grande de ciclos. Estas incluyen el uso de oligonucleótidos bloqueantes (tal como se describe por ejemplo en Cottrell y col. 2004, "A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers." Nucleic Acids Research 32(1)) y la amplificación del ADN de tipo headloop (descrita en el documento US2005221312). En estos métodos, la especificidad mejorada se debe a la supresión de productos con secuencias concretas. En los casos donde pueden existir diferentes productos potenciales no deseados, podría necesitarse el uso de múltiples oligonucleótidos bloqueantes para evitar la amplificación no deseada. Adicionalmente, en el caso de la amplificación del ADN del tipo headloop, solo puede seleccionarse una de las secuencias no deseadas. En contraste, la presente metodología descrita en el presente documento proporciona una selección positiva de las secuencias deseadas y da como resultado la supresión de todos los productos no deseados, incluso cuando las secuencias de estos productos son desconocidas.
En la PCR, la especificidad de la amplificación depende de la especificidad de la unión de los cebadores y, en los métodos de la PCR de la técnica anterior, la especificidad es el resultado del diseño de cebadores directos e inversos adecuados con la secuencia complementaria para la secuencia diana. Sin embargo, la especificidad debida a las secuencias de los cebadores se consigue solo en los ciclos iniciales de la PCR. Una vez que se ha generado una cantidad significativa de producto, la amplificación continúa a iguales velocidades tanto si los cebadores se han ampliado desde los sitios correctos que flanquean la secuencia diana o desde los amplicones no específicos que surgen del cebado incorrecto.
Por el contrario, en los métodos de amplificación de la invención se mantiene la selectividad en cada ciclo de la amplificación. Esta elevada especificidad se consigue haciendo que la amplificación sea dependiente de la presencia de la secuencia diana correcta en la dirección 3' de la región de cebado de uno o ambos cebadores directo e inverso. Los métodos de la invención utilizan al menos un cebador de oligonucleótido modificado en uno (o ambos) extremos de la secuencia diana con un oligonucleótido facilitador correspondiente para aumentar la especificidad de la amplificación. En la forma más amplia de la metodología descrita en el presente documento, el cebador modificado se denomina en el presente documento un cebador iniciador, que está modificado de tal manera que la síntesis de la hebra inversa está impedida por la modificación. El cebado incorrecto de los métodos de la PCR de la técnica anterior que da como resultado productos de amplificación no deseados se evita en los métodos de la presente invención porque el oligonucleótido facilitador no reconocerá la secuencia de nucleótidos localizada en la dirección 3' (3') con respecto al sitio del cebado incorrecto.
De acuerdo con ello, un aspecto de la presente invención proporciona un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método: poner en contacto la molécula "molde" de la molécula de ácido nucleico") con
- (i)
- al menos un oligonucleótido facilitador. donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y
- (ii)
- al menos dos cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria,
donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a prácticamente la misma región o a regiones adyacentes de la molécula de ácido nucleico molde y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias de la secuencia 3' diana con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la
unión de dicho oligonucleótido facilitador.
De acuerdo con las realizaciones de la invención, se mantiene la selectividad en cada ciclo de la aamplificación. Los resultados de la selectividad no solo proceden de la unión al cebador sino también de la necesidad de tener la secuencia 'correcta' en la dirección 3' del sitio de unión al cebador. De este modo, se mantiene un grado sorprendentemente elevado de selectividad especialmente si la amplificación incorpora más de un cebador y un oligonucleótido facilitador modificados, en el que la generación de productos no deseados procedentes del cebado incorrecto se reduce o elimina.
La región 5' del oligonucleótido facilitador puede compartir una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra. Alternativamente, puede ser insuficiente la similitud de la secuencia entre la región 5' del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la síntesis de la hebra utilizando el oligonucleótido facilitador como molde. En este último caso, el método empleará normalmente además un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria, y que comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra que utiliza el oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para mejorar la especificidad de una reacción de amplificación enzimática termocíclica, utilizando la reacción al menos dos cebadores de oligonucleótidos que flanquean una secuencia de nucleótidos diana de interés localizada en una molécula de ácido nucleico, donde al menos uno de dichos cebadores está modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria y la reacción utiliza además al menos un oligonucleótido facilitador sin cebar, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y donde el oligonucleótido facilitador y el cebador modificado se unen a prácticamente la misma o a las regiones adyacentes de la molécula de ácido nucleico molde y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias con la secuencia 3' diana a la localización de unión del cebador modificado.
Los métodos de la invención se pueden usar para mejorar la especificidad de la amplificación de cualquier secuencia diana deseada, reduciendo o eliminando de forma prácticamente simultánea la amplificación de secuencias no diana no deseadas. Los expertyos en la técnica apreciarán que el método puede utilizarse en cualquier reacción de amplificación enzimática termocíclica en la que se desea la especificidad y la selectividad de la amplificación de un amplicón concreto.
Por medio solo de ejemplo, los métodos de la presente invención encuentran aplicación en el análisis de metilación del ADN tal como en las técnicas de la PCR específicas de metilación que mejoran la especificidad de la detección de los nucleótidos metilados. Los métodos de la invención encuentran también aplicación en la detección de mutaciones puntuales, por ejemplo, en el diagnóstico de enfermedades. En algunos casos, se pueden asociarse numerosas mutaciones puntuales diferentes con una enfermedad concreta (tal como mutaciones oncogénicas en el gen K-ras) que requieren el multiplexado de la PCR. Los métodos de la invención son adecuados para la multiplexión. Los expertos en la materia apreciarán que los métodos de la invención no se limitan de esta manera en su aplicación y los métodos se pueden utilizar en cualquier amplificación enzimática termocíclica que requiera un grado elevado de selectividad y especificidad. Dichas aplicaciones incluyen, pero no se limitan a la detección de organismos patógenos que incluyen virus y bacterias, la dirección de polimorfismos y/o mutaciones en genomas, la huella genética, antropología forense, sistemáticas moleculares, investigaciones genealógicas, detección de enfermedades heredadas, secuenciación del genoma, identificación de genes que controlan rasgos de interés y que detectan diferentes estados de metilación del ADN.
Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que se puede emplear cualquier medio de bloqueo de la extensión 3' desde el extremo 3' del oligonucleótido facilitador. Las modificaciones de bloqueo adecuadas incluyen, pero no se limitan a la incorporación de uno o más restos análogos de nucleótidos no extensibles en o próximos al extremo 3', por ejemplo, una base no extensible del extremo 3' única o un análogo de base, una combinación de una base no extensible del extremo 3' y uno o más nucleótidos emparejados incorrectamente próximos al extremo 3' del oligonucleótido, o la incorporación de un sitios abásico cerca del extremo 3' del oligonucleótido. La base no extensible se puede seleccionar a partir de, por ejemplo, un 2', 3' didesoxinucleótido, un 3' C3, C18 u otro separador en longitud, un nucleótido 3' fosforilado, una base de "ácido nucleico peptídico", una base de "ácido nucleico bloqueado" (LNA), un derivado de amina de nucleótido, uracilo tratado con Uracil ADN glicosilasa, ARN o un 2' Ometil nucleótido, o una combinación de estos.
De igual forma, se puede emplear una variedad de modificaciones adecuadas en el cebador del oligonucleótido facilitador para terminar la síntesis de la hebra inversa. Por ejemplo, estas modificaciones pueden incluir, pero no se
limitan a, la inclusión de uno o más emparejamientos incorrectos, sitios abásicos o nucleótidos modificados tales como 2'-O-metil nucleótidos. Normalmente, la modificación en el cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador se localiza suficientemente próxima al extremo 3' del cebador de tal manera que aunque el cebador retiene la capacidad de iniciar la extensión de 3', cuando el cebador actúa como un molde para la hebra de la síntesis complementaria, el producto de la secuencia amplificada se trunca lo que da como resultado la ausencia de unión al cebador en los posteriores ciclos de amplificación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la modificación puede localizarse aproximadamente 10 bases, 9 bases, 8 bases, 7 bases, 6 bases, 5 bases o 4 bases desde el extremo 3' del cebador.
El oligonucleótido facilitador comprende secuencias complementarias de la secuencia de ácido nucleico diana en la dirección 3' desde el cebador iniciador y/o el sitio de unión al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador. El oligonucleótido facilitador puede comprender también secuencias complementarias de la secuencia diana que también son reconocidas y unidas mediante el cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador. El extremo 5' del oligonucleótido facilitador puede coincidir con o o estar comprendido en el extremo 5' del cebador iniciador y/o del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, o puede contener una extensión 5' de una única secuencia que se puede usar para generar un sitio de unión a una única secuencia para una etiqueta en el producto amplificado si se desea de esta manera. Se puede usar dicho sitio de unión, por ejemplo, para la captura
o la detección de amplicones específicos (por ejemplo, detección de mutaciones) o para la clonación de productyos de amplificación.
A modo de ejemplo, en la Figura 1A se muestran las etapas típicas de una reacción de amplificación llevada a cabo de acuerdo con una realización de la presente invención. Señalar que por simplicidad, solo un extremo de la secuencia de nucleótidos diana que participa en la reacción de amplificación se representa gráficamente en la Figura 1A. Esta figura muestra esquemáticamente los papeles del cebador iniciador (20) en el presente documento, un cebador de la PCR 'directo') y un oligonucleótido facilitador (60) en una realización de la invención. En el extremo de la secuencia de nucleótidos diana que no se muestra en la Figura 1A se puede utilizar cualquier cebador inverso adecuado o se puede emplear alternativamente un segundo cebador iniciador y un segundo oligonucleótido facilitador correspondiente.
Volviendo al esquema de la Figura 1A, tras una etapa inicial de desnaturalización de la secuencia del molde bicatenario, la reacción se enfría para permitir al cebador iniciador (10) unirse a la secuencia complementaria del molde monocatenario (20) (Etapa 1). El cebador iniciador (10) incluye una modificación (15) en o próxima al extremo 3' del cebador. La síntesis de la hebra directa se inicia desde el extremo 3' del cebador iniciadore (Etapa 2) generando por tanto una nueva hebra de ácido nucleico (30) Tras una segunda etapa de desnaturalización, la síntesis de la hebra inversa (40) se inicia por el cebador inverso (no se muestra) incorporando la hebra sintetizada recientemente (30) el cebador iniciador como molde (Etapa 3). Sin embargo, la síntesis de la hebra inversa (40) se termina prematuramente (50) a medida que se bloquea el copiado por la presencia de la modificación (15) presente en el nuevo molde, que se proporciona por el cebador iniciador (10). Tras una etapa de desnaturalización posterior, el oligonucleótido facilitador (60) se hibrida preferentemente sobre el cebador iniciador (10) en la hebra inversa incompleta (40) generada en la etapa 3 en virtud de la mayor capacidad de unión de la secuencia del extremo 3' del oligonucleótido facilitador (60) en comparación con el extremo 3' del cebador iniciador (10) (Etapa 4). El oligonucleótido facilitador (60) incluye una modificación (65) en o próxima al extremo 3' del oligonucleótido. El oligonucleótido facilitador (60) actúa a continuación como molde para la ampliación de la hebra inversa (40) de tal manera que se consigue la finalización de la hebra inversa (70) y la regeneración del sitio de unión completo para el cebador iniciador (Etapa 4). En este punto, existe una etapa opcional de calentamiento de la reacción a una temperatura que desplazará el oligonucleótido facilitador (60) desde el molde (40) sin desnaturalizar la mayoría o todo el material bicatenario de longitud completa. La reacción se enfría a continuación para permitir al cebador iniciador (10) unirse y un ciclo de síntesis de la hebra directa (80) (Etapa 5).
En la Figura 1B se ejemplifica una realización alternativa. Tras una etapa inicial de desnaturalización de la secuencia del molde bicatenario, la reacción se enfría para permitir al cebador iniciador (10) unirse a la secuencia complementaria del molde monocatenario (20) (Etapa 1). El cebador iniciador (10) incluye una modificación (15) en o próxima al extremo 3' del cebador. La síntesis de la hebra directa se inicia desde el extremo 3' del cebador iniciadore (Etapa 2) generando por tanto una nueva hebra de ácido nucleico (30) Tras una segunda etapa de desnaturalización, la síntesis de la hebra inversa (40) se inicia por el cebador inverso (no se muestra) incorporando la hebra sintetizada recientemente (30) el cebador iniciador como molde (Etapa 3). Sin embargo, la síntesis de la hebra inversa (40) se termina prematuramente (50) a medida que se bloquea el copiado por la presencia de la modificación (15) presente en el nuevo molde, que se proporciona por el cebador iniciador (10). Tras una etapa de desnaturalización posterior, un oligonucleótido facilitador (61) que tiene una región 5' que es prácticamente similar a un cebador dependiente de un oligonucleótido facilitador (11) se hibrida preferentemente sobre el cebador del oligonucleótido iniciador y facilitador a la hebra inversa incompleta (40) generada en la etapa 3 en virtud de una mayor capacidad de unión a la secuencia del extremo 3' del oligonucleótido facilitador (61) en comparación tanto con el cebador iniciador (10) como con el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador (11) (Etapa 4). El oligonucleótido facilitador (61) incluye una modificación (65) en o próxima al extremo 3' del oligonucleótido. El oligonucleótido facilitador (61) actúa a continuación como molde para la ampliación de la hebra inversa (40) de tal manera que se consigue la finalización de la hebra inversa (71) y la regeneración del sitio de unión del cebador
dependiente del oligonucleótido facilitador (Etapa 4). En este punto existe una etapa preferida de calentamiento de la reacción a una temperatura que desplazará el oligonucleótido facilitador (61) desde el molde (40) sin desnaturalizar cualquier material bicatenario de longitud completa. La reacción se enfría a continuación para permitir unirse al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador (11) y un ciclo de síntesis adicional de la hebra directa (80) (Etapa 5). Los expertos en la materia apreciarán que la modificación (15) en el cebador iniciador y la modificación
(15) en el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador puede ser igual o diferente.
La síntesis de la hebra directa mediante el uso de secuencias molde de amplicón requiere que el cebador iniciador o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador se hibride con la hebra inversa completamente sintetizada después de la regeneración del extremo 3' de la hebra inversa mediante el oligonucleótido facilitador.
Durante esta etapa del ciclo de amplificación, se minimiza preferentemente la competición en la unión de la secuencia entre el cebador iniciador o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador y el oligonucleótido facilitador. En una realización, la unión del cebador iniciador o del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador se puede favorecer con respecto a la unión del oligonucleótido facilitador mediante el uso de una concentración baja del oligonucleótido facilitador y/o mediante la incorporación de modificaciones en la secuencia de oligonucleótidos. Por ejemplo, la unión del cebador iniciador o del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador se puede potenciar mediante el uso de modificaciones en la secuencia del cebador conocidas de los expertos en la materia tal como 5-metil citosina en lugar de citosina, el uso de INA o pNA o de la unión en el extremo 5' de un aglutinante de la ranura menor. Además, la estabilidad de la unión a la secuencia del oligonucleótido facilitador se puede reducir mediante el uso de bases alternativas tales como inosina o deazaguanina en lugar de guanina.
En otra realización, si la secuencia diana tiene una alteración en su secuencia (por ejemplo, mutación), esta se va a amplificar especialmente, esto se puede conseguir haciendo que la amplificación sea dependiente de la hibridación específica de la secuencia de un oligonucleótido facilitador para esta región. Este principio se puede aplicar a la detección de mutaciones y para la amplificación selectiva de ADN metilado de manera diferencial después del tratamiento con bisulfito, por ejemplo. Incluso aunque se consiga solamente una pequeña selectividad en una sola etapa de la amplificación, como esta selectividad tiene lugar durante la totalidad del periodo de amplificación, la selectividad se ve potenciada significativamente durante la reacción.
En una realización adicional, el uso de los procedimientos de la invención permite manipulaciones tales como adiciones y/o ampliaciones a incorporar en los productos de la amplificación. Por ejemplo, cuando la cola 5' del oligonucleótido facilitador se diseña para que sea más larga que el extremo 3' de la secuencia del molde del amplicón por incorporación del cebador iniciador o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, el producto final de la amplificación tendrá una extensión monocatenaria en 3'. Esta ampliación de la secuencia se puede utilizar, por ejemplo, como sitio de unión a secuencia único para la unión del cebador/la sonda y/o para unir el producto de amplificación a diferentes sustratos.
De forma típica, las moléculas de ácido nucleico a analizar de acuerdo con la invención comprenden ADN. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los procedimientos de la presente invención también se pueden aplicar a otras moléculas de ácido nucleico, tales como ARN, con el aporte de los reactivos adecuados, por ejemplo, ARN polimerasas o transcriptasas inversas, adecuadas para la amplificación o la copia del ARN.
Al igual que con otros métodos de amplificación, las condiciones tales como tiempos de hibridación, tiempos de ampliación, número de ciclos de amplificación y temperaturas utilizadas en los procedimientos de la presente invención son dependientes de las secuencias específicas y necesitan optimización individual. Dicha optimización está comprendida entre las capacidades y habilidades de los expertos en la materia, y no necesita más esfuerzo que el de la experimentación rutinaria (véase por ejemplo, Sambrool, J. y Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª Edición, 2001, y Dieffenbach, C.W. y Dveksler, G.S. (eds.) PCR primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª Edición, 2003). Adicionalmente, los métodos de la invención pueden utilizar cualquier enzima adecuada capaz de catalizar la síntesis de la secuencia de nucleótidos como un producto de ampliación del cebador. Están disponibles una variedad de polimerasas y son adecuadas para su uso de acuerdo con la invención, y dichas polímeros son conocidas por los expertos en la materia. En realizaciones particulares, la polimerasa es una ADN polimerasa. La ADN polimerasa se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que incluye la ADN polimerasa I de E. coli , el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli , la ADN polimerasa T4, la ADN polimerasa T7, la ADN polimerasa de T. litoralis , y polimerasas termoestables tales como las polimerasas Taq, Tth, Pfu, Vent, deep vent, y UITma, y variaciones derivadas de las mismas.
Y con otros métodos en los que una secuencia común se añade a los extremos de las moléculas de ácido nucleico para amplificar, los métodos de la presente invención se pueden adaptar con facilidad al PCR multiplex.
Los productos de las reacciones de amplificación realizadas de acuerdo con la presente invención se pueden detectar mediante procedimientos normalizados bien conocidos para los expertos en la materia, incluyendo, pero sin limitación, electroforesis en gel, seguimiento en tiempo real que utiliza colorantes de unión a ácido nucleico no específicos tales como SYBR Green, sondas fluorescentes específicas de secuencia o hibridación con matrices.
Los expertos en la materia apreciarán las limitaciones asociadas con el diseño de cebadores de oligonucleótidos en metodología PCR convencional. Se aplican limitaciones similares al diseño de sondas de oligonucleótidos que se pueden utilizar en la detección de amplicones de PCR. Las sondas están diseñadas de forma típica para hibridarse mejor que los cebadores, de manera que la sonda puede unirse con una hebra monocatenaria. De esta forma, las sondas habitualmente deben ser largas o tener modificaciones que les permitan unirse a una temperatura relativamente elevada, en comparación con los cebadores. Para utilizar sondas más cortas, deben llevarse a cabo modificaciones en la PCR para permitir la producción de moléculas de ácido nucleico monocatenarias en la PCR -la amplificación exponencial solamente tiene lugar durante un número limitado de ciclos, seguido por ampliación lineal. Esto se consigue de forma típica limitando la concentración de uno de los cebadores, o mediante el uso de cebadores con temperaturas de unión diferentes y el uso de un incremento en la temperatura de hibridación durante la PCR. Estas limitaciones se pueden superar usando el método de amplificación de acuerdo con una realización de la invención que permite la amplificación exponencial mediante el uso de sondas con etiquetas fluorescentes monocatenarias 3' para unir dichas regiones después de la fase de ampliación. Además, después de la fase de expansión (por ejemplo, 72 °C), se puede medir la unión de la sonda de oligonucleótido a temperaturas seleccionadas (por ejemplo, 40 °C, 50 °C y 60 °C). Mediante la combinación de diferentes colorantes fluorescentes y diferentes combinaciones de sondas/etiquetas de hibridación, se puede conseguir la multiplexación de un mayor número de reacciones. Alternativamente, se puede desarrollar una tecnología de detección novedosa usando los sitios de unión a etiquetas. De acuerdo con una realización de la invención, la presencia de una extensión en 3' permite el desarrollo, por ejemplo, de sondas moleculares de tipo beacon que solamente presentarán fluorescencia si se copian mediante ampliación de la etiqueta monocatenaria en 3'. Los expertos en la materia apreciarán que se deben optimizar las secuencias específicas de los oligonucleótidos facilitadores, cebadores iniciadores y cebadores dependientes del oligonucleótido facilitador adecuadas dependiendo de la secuencia de las secuencias del ácido nucleico diana, y la aplicación concreta en la que se va a utilizar el procedimiento. El diseño de secuencias adecuadas de oligonucleótido y cebador está bien comprendido entre las habilidades de los expertos en la materia, y no necesita más esfuerzo que el de la experimentación rutinaria.
La referencia en esta memoria descriptiva a cualquier otra publicación anterior (o a información derivada de la misma), o a cualquier otra materia conocida, no es, ni se deberá tomar como un reconocimiento o admisión o cualquier forma de sugerencia de que dicha publicación anterior (o información derivada de la misma) o materia conocida forma parte del conocimiento general común en el campo de desarrollo al que se refiere esta memoria descriptiva.
La presente invención se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos específicos.
Ejemplos
Métodos y Materiales
Cebadores de oligonucleótidos modificados
Los ejemplos de modificaciones del cebador que finalizan la ampliación del cebador son los siguientes: 2'-O metil nucleótidos -minúscula (por ejemplo, u para 2' O-metil uridina), Inosina -I, Sitios abásicos -Δ, y/o +ddG didesoxiguanosina se añadieron al extremo del oligonucleótido usando transferasa terminal. Se incluyeron sitios abásicos bien por incorporación de un separador d durante la síntesis de oligonucleótidos o desoxiuridina. En el último caso, los uracilos se convirtieron en sitios abásicos tratando el oligonucleótido a 5 μM (es decir, 1 nmol) con 4 unidades de Uracil-DNA Glycosylase (New England Biolabs) en 200 μl de tampón TEX (Tris HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, Triton-X100 al 0,01%) durante 2 horas a 37 °C.
Molde de secuencia de nucleótido
El molde de secuencia del nucleótido diana se preparó a partir de moléculas de ácido nucleico monocatenarias correspondientes a las regiones diana. Se utilizó amplificación mediante la PCR convencional para amplificar y generar moldes de secuencia diana bicatenarios. A continuación, los productos de amplificación se diluyeron 1 en
10.000 y se usaron como moldes de la región diana para amplificación mediante HDCR.
Condiciones de amplificación
Se llevaron a cabo condiciones normalizadas para la HDCR (en 25 ml) que son las siguientes: 1x tampón Platinum Taq [Tris-HCl 20 mM (pH 8.4) y KCl 50 mM], MgCl2 4 mM, 0,2 mM de cada dNTP, dilución 1/25.000 de SYBR Green y 0,5 U de ADN polimerasa Platinum Taq (inicio caliente) de Invitrogen, con concentraciones de oligonucleótidos y condiciones de ciclación especificadas en cada ejemplo.
Ejemplo 1 -Dependencia del cebador iniciador y del oligonucleótido facilitador para conseguir una amplificación correcta.
Este ejemplo demuestra que la técnica de amplificación mediante HDCR de acuerdo con la realización de la presente invención depende de la presencia tanto del cebador iniciador como del oligonucleótido facilitador.
HDCR se utilizó para amplificar una región de la secuencia de repetición Alu humana, tal como se muestra en la Figura 2. Se muestra el efecto de omitir bien el cebador iniciador o el oligonucleótido facilitador. Todas las reacciones se llevaron a cabo por duplicado. La Figura 2 muestra la secuencia de la región diana, el cebador iniciador primer InAluPr3, el oligonucleótido facilitador InAluFol5 y el cebador inverso AluRev. El cebador iniciador contiene un sitio abásico y el extremo 3' del oligonucleótido facilitador contiene dos sitios abásicos y dos emparejamientos incorrectos comprendidos en la secuencia del ácido nucleico diana (emparejamiento incorrecto TIT y emparejamiento incorrecto GIT) para evitar el cebado. El oligonucleótido facilitador también contiene un sitio abásico adicional para reducir el fondo ocasionado por el cebado incorrecto sobre el oligonucleótido facilitador.
Las amplificaciones replicadas que contienen 1 ml de una dilución 1:10.000 de un molde de ácido nucleico se llevaron a cabo en un equipo PCR en tiempo real Corbett Rotor-Gene 3000. El cebador iniciador InAluPr3 y el oligonucleótido facilitador InAluFol5 se utilizaron a una concentración de 200 nM y el cebador inverso AluRev a 40 nM. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 95 °C durante 2 minutos seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 1 segundo, 60 °C durante 20 segundos, 80 °C durante 1 segundo y 60 °C durante 20 segundos. La fluorescencia de SYBR Green se determinó al finalizar la etapa a 60 °C. Tal como se indica en la Figura 3, el producto de amplificación del cebador iniciador y el oligonucleótido facilitador se observó después de aproximadamente 17 ciclos, mientras que las reacciones del cebador indicador o del oligonucleótido facilitador independientes no habían pasado aún el umbral de detección a los 40 ciclos.
Ejemplo 2 -Amplificación selectiva mediante el uso de la metodología HDCR.
Este ejemplo demuestra que es posible conseguir una amplificación selectiva a partir de moldes de ácido nucleico que se diferencian en un único par de bases. La región central de la secuencia mostrada en la Figura 4 corresponde a parte de la secuencia del gen homólogo B1 del oncogén del virus del sarcoma murino v-raf (BRAF). Las bases subrayadas muestran la posición de la mutación oncogénica común T a A V6000E (secuencia MUTB) comparada con la secuencia normal (NORB). Las secuencias exteriores se corresponden con los cebadores oligonucleótidos utilizados. Tal como se muestra en la Figura 5, el cebador iniciador directo BRF2 contiene un sitio abásico situado a 7 bases a partir de su extremo 3'. El extremo 3' del oligonucleótido facilitador BFol3 contiene 6 emparejamientos incorrectos con respecto al ADN diana, y está finalizado por una didesoxiGTP para evitar su ampliación. El oligonucleótido facilitador contiene una región de 19 bases adyacente al cebador BRF2 que se corresponde exactamente con la secuencia mutante, pero contiene un único emparejamiento incorrecto de base con respecto a la secuencia BRAF normal (hueco en el subrayado). El oligonucleótido facilitador también contiene inosinas en lugar de algunas guaninas (véase la Figura 5) en la región equivalente al cebador iniciador para reducir la estabilidad del duplete oligonucleótido facilitador / hebra inversa ampliada.
Se llevaron a cabo amplificaciones HDCR replicadas utilizando una máquina de PCR en tiempo real Bio-Rad I Cycler. El cebador iniciador directo BRF2 se incluyó a 200 nM, el oligonucleótido facilitador BFol3 a 20 nM, y el cebador inverso CommR3G a 40 nM; Se utilizó MgCl2 a una concentración de 2 mM. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 95 °C durante 2 minutos seguido de 60 ciclos de 95 °C durante 5 segundos, 68 °C o 72 °C durante 15 segundos, 83 °C durante 10 segundo y 68 °C o 72 °C durante 15 segundos. La fluorescencia de SYBR Green se determinó en la etapa final de cada ciclo.
Tal como se observa en la Figura 6, cuando las etapas de termociclado de hibridación / ampliación se llevaron a cabo a 68 °C, la cantidad de producto de amplificación de la secuencia mutante fue solo una fracción más grande con respecto al producto de amplificación de la secuencia normal. Es decir, cuando las etapas de termociclado de hibridación / ampliación se llevaron a cabo a 72 °C, la cantidad de producto de amplificación del molde normal emparejado quedó reducido de manera importante cuando se compara con el producto de amplificación del molde mutante. La significativa dependencia de la temperatura de la hibridación selectiva del oligonucleótido facilitador con respecto a la secuencia mutante, en comparación con la secuencia normal (emparejada de forma incorrecta) se puede demostrar por la mayor diferencia observada a la temperatura selectiva (Figura 6).
Ejemplo 3 -Amplificación selectiva y eficacia de amplificación mejorada mediante el uso de la metodología HDCR.
Este ejemplo demuestra tanto el potencial de uso de la amplificación mediante HDCR para la amplificación selectiva de ADN metilado de manera diferencial después del tratamiento con bisulfito, así como la ventaja de una etapa de calentamiento intermedia en el ciclado de temperatura para mejorar la eficacia de las síntesis en dos etapas de la hebra inversa. La Figura 7 muestra diferentes moldes de secuencia de ácido nucleico que se prepararon con regiones centrales (subrayadas) que imitan secuencias producidas a partir del tratamiento con bisulfito de una región del gen hMLH1 después del tratamiento con bisulfito. Ambas secuencias están flanqueadas por la misma secuencia
para unión al cebador oligonucleótido. El molde M imita el ADN metilado en el que las citosinas de los dinucleótidos CpG siguen siendo C después del tratamiento con bisulfito. El molde U imita el ADN sin metilar en el que todas las citosinas se han convertido en uracilo (y posteriormente en T después de la amplificación). El molde de ácido nucleico se preparó mediante PCR y se diluyó 1:100 además de las amplificaciones mediante la reacción HDCR. Las secuencias del cebador iniciador, del oligonucleótido facilitador y el cebador inverso CommR2G se muestran en la Figura 8.
El cebador iniciador MLH2O tiene cuatro 2O-metil nucleótidos (u minúscula) para evitar que pueda experimentar amplificación exponencial en ausencia del oligonucleótido facilitador. El oligonucleótido facilitador MLHF1 tiene un separador d interno (sitio abásico) que ayuda a evitar la amplificación del fondo que surge del emparejamiento incorrecto del oligonucleótido facilitador. Hay también 2 separadores d cerca del extremo 3' combinados con un emparejamiento incorrecto 3' que se espera que interfiera con la ampliación del oligonucleótido facilitador. El resto del oligonucleótido facilitador corresponde exactamente a la secuencia de ácido nucleico metilado, pero también tiene 3 emparejamientos incorrectos respecto a la secuencia de ácido nucleico equivalente no metilada (Figura 8).
Se llevaron a cabo amplificaciones HDCR replicadas en una máquina de PCR en tiempo real Corbett Rotor-Gene 3000. Las mezclas de reacción contenidas en 200 nM FD del cebador oligonucleótido MLH20, 20 nM del oligonucleótido facilitador MLHF1 y 40 nM del cebador oligonucleótido inverso CommR2G. Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: 95 °C durante 2 minutos seguido por 60 ciclos de 95 °C durante 5 segundos y 65 °C durante 40 segundos (Figura 9A) o 95 °C durante 5 segundos, 65 °C durante 20 segundos, 74 °C durante 10 segundos y 65 °C durante 20 segundos (Figura 9B). Se compararon reacciones con y sin inclusión de una etapa de calentamiento intermedio. En ambas condiciones, la amplificación desde el molde M resultó ser fuertemente preferida en comparación con el molde U, pero la cinética de reacción resultó muy mejorada con la inclusión de la etapa de calentamiento intermedio, donde la amplificación desde el molde M tuvo un avance de 5 a 10 ciclos (Figura 9B). Incluso una etapa extra a 74 °C durante 10 segundos aumenta la eficacia de HDCR tal como se predeciría a partir del mecanismo esperado. Esta etapa elimina el oligonucleótido facilitador del ADN diana hibridado y ampliado, permitiendo de esta forma la hibridación del cebador iniciador una vez la temperatura se ha reducida lo suficiente.
Ejemplo 4 -HDCR para incorporar sitios de cebado comunes externos
Este ejemplo demuestra cómo se puede utilizar la HDCR para configurar una etapa de multiplexado eficaz. Aunque se llevaron a cabo amplificaciones selectivas en tubos independientes, los mismos cebadores 'externos' se utilizaron para ambas reacciones. Las dos islas CpG se escogieron para este estudio son de interés en la investigación del cáncer porque resultan hipermetiladas en numerosos cánceres tales como el cáncer colorrectal, pero permanecen no metiladas en ADN procedente de los tejidos normales incluyendo sangre. La Figura 10 muestra las regiones de secuencia diana comprendidas en las islas TMEFF2 y hMLHI CpG (hg18 chr2:192,767,556-192,767,775 (hebra) y hg18 chr3:37,010,130-37,010,262 respectivamente) y la disposición de cebadores y de oligonucleótidos facilitadores con respecto a la secuencia derivada a partir de ADN metilado tratado con bisulfito.
Los moldes de ADN U y M respectivamente eran bien ADN de sangre normal o ADN de sangre que se había tratado con Sssl metilasa, que es conocida por convertir citosinas en el contexto de CpG a 5-metil citosina (5mC). 5mC es resistente a la conversión por el bisulfito, mientras que se espera que C sin metilar se convierta en U (y posteriormente en T amplificaciones que contienen dTTP). Después del tratamiento con bisulfito, se espera que todas las C comprendidas en la región ensayada que no están metiladas se conviertan en U mediante bisulfito y posteriormente en T mediante la PCR. Aunque este ADN convertido mediante bisulfito se denomina como 'U', se debe destacar que antes de realizar el experimento, el estado de metilación exacto de las regiones escogidas de esta muestra de ADN sanguíneo concreto era desconocido.
Se muestra la amplificación selectiva de la versión metilada de una región de la isla CpG de MLH1 (dentro de hg18 chr3:37,010,130-37,010,262) y la versión metilada de una región de la isla CpG de TMEFF2 (dentro de hg18 chr2:192,767,556-192,767,775) después de la conversión con bisulfito, usando HDCR y cebadores dependientes 'exteriores'.
La clave de esta variante de la HDCR es el uso de cebadores iniciadores (Figura 10). Estos cebadores están diseñados para poder poderse hibridar con una secuencia diana y ampliarse a través de la región de interés. Sin embargo, contienen una modificación, aquí un separador d, lo que les evitará copiarse totalmente. Esto conduce a la finalización prematura de dianas opuestas o en la proximidad de la modificación en el cebador iniciador y por tanto no es posible una reacción en cadena de la polimerasa típica. Los oligonucleótidos facilitadores, en este caso, tienen colas 5' que no se corresponden con las de los cebadores iniciadores, pero en su lugar se corresponden con las regiones 5' de otros cebadores dependientes que están presentes en la reacción. Los oligonucleótidos facilitadores tienen una parte hibridante en 3' que reconoce regiones en 3' con respecto a la región de cebado de los cebadores iniciadores. Una molécula diana terminada prematuramente con una secuencia que permite la hibridación con el oligonucleótido facilitar puede copiar las colas 5' de los oligonucleótidos facilitadores. Esto genera sitios de unión al cebador para un cebador dependiente de un oligonucleótido facilitador 'exterior'. Puesto que estos cebadores dependientes también contienen modificaciones (separadores d) que evitan el copiado completo, la amplificación depende de la regeneración continua de los sitios de unión de los cebadores dependiente mediante la copia de los
oligonucleótidos facilitadores en cada uno de los ciclos. En el ejemplo que se proporciona en la presente memoria, los cebadores iniciadores se diseñaron para cebar ambas variantes M y U de sus dianas. En otras palabras, el cebado está diseñado para ser específico de la secuencia convertida mediante bisulfito, pero no proporciona especificidad alguna para cualquiera de las variantes M o U. Para ello, las secuencias CpG en las que están presentes variaciones en la metilación se evitan en la medida de lo posible. Cuando las posiciones CpG se encuentran dentro de los sitios de unión de los iniciadores, se utiliza una mezcla de C y T (o G y A, dependiendo de la hebra diana) dentro del iniciador de forma que se pueda unir tanto a M como a U. La única especificidad de la variante de la secuencia M está dentro de las regiones de hibridación de los oligonucleótidos facilitadores, que emparejan la secuencia M pero no la secuencia U.
Las secuencias de oligonucleótidos (5' a 3') y sus concentraciones utilizadas en la HDCR para la diana TMEFF2 fueron:
250 nM TMEFInL1 TTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTΔGTTTTT
250 nM TMEFInR1CCRAACAACRAACTACTAAACATCCC
40 nM TMEFLdS170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTG-
TATTTCGCGTTTTCGGCAAddG
40 nM TMEFRdS133
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTGTCAACCCGCGAACGACGGAddG
500 nM MCD6
TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500 nM MCD4
CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100 nM TPEFMC HEX-AAATTTTCGAGATTATGCGCGGGT TAMRA
Y para la diana hMLH1:
250 nM MLHInit2 AATGTTATTAAAGAGATGATTGAGAΔTTGGTA
250 nM MLHInit1 CTATACATACCTCTACCCRAACAΔAAAAAC
40 nM 131hMLHFoldS2
CACACGTCGCTCGGGCCTGTGTTCTTG-TAAAA!CGTATCCGCGCAGG-ddG
40 nM RMLH170
TGGCCCGTCGCCGTCCCTCTGTTTTGCTTTGΔ
TACGGAGGGAGTCGCC-ddG
500 nM MCD6
TGG555GT5G55GT555T5TGΔTTTGCT
500 nM MCD4
CA5A5GT5G5T5GGG55TGTGΔTCTTGT
100 nM hMLH HEX-ACGCGACCCGTTAAATCG-TAACCCT BHQ1
Donde D = separador d, 5 = metil citosina, ddG = didesoxiguanosina introducida mediante el uso de transferasa terminal, R = mezcla de A y G, HEX = hexacloro-6carboxifluoresceína, TAMRA = 6-carboxitetrametilrodamina, BHQ1 = Black Hole Quencher 1. Bases subrayadas = emparejamientos incorrectos que junto con la ddG añadida reducen
o eliminan ampliación.
Se llevaron a cabo HDCR por duplicado en volúmenes de 10 microlitros que contenían 1x tampón Platinum Taq [Tris-HCl 20 mM (pH 8,4) y KCl 50 mM], MgCl2 4 mM, dATP 0,2 mM, dCTP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dUTP 0,4 mM, dilución 1/25.000 de SYBR Green, fluoresceína 10 nM y 0,4 unidades de ADN polimerasa Platinum Taq (inicio caliente) de Invitrogen. 1 nanogramo de ADN de sangre humana que se había metilado in vitro con metilasa Sssl y posteriormente tratada con bisulfito (M) se comparó con el mismo ADN de sangre qut también se había tratado con bisulfito pero no se había sometido al tratamiento con metilasa Sssl (U). El ciclado se llevó a cabo en un RotorGene 3000 (rotor de 72 tubos) con el programa: 90C 5 s, 95C 2 m, a continuación 10 ciclos de 90C 5 s, 95C 15 s, 50C 2 m, 80C 10 s, 60C 2 m a continuación, una incubación simple a 60C durante 15 con una lectura del canal FAM/SYBR (de esta manera, la autocalibración se realizaría a esta temperatura), a continuación 60 ciclos de 90C 15 s, 50C 1m, 80C 10 s, 60C 1 m con lectura a 90C en el canal JOE (para detectar la hidrólisis de las sondas HEX TaqMan) y a 60C en el canal FAM/SYBR (para detectar la producción de ADN bicatenario). Las etapas de 90C 5 s se incluyeron para evitar cualquier exceso de temperatura al subir a la siguiente etapa, 95C. En experimentos anteriores se ha descubierto que subir directamente hasta 95C desde una temperatura mucho menor puede ser perjudicial cuando se utilizan volúmenes tales como 10 microlitros en el RotorGene 3000.
La amplificación satisfactoria de secuencias metiladas para dos dianas diferentes, TMEFF2 (panel A) y hMLH1 (panel B) se muestra en la Figura 11. La producción de fluorescencia HEX debida a la hidrólisis de una sonda de hidrólisis indica la amplificación satisfactoria de la versión metilada. Esto se produce para ambas dianas TMEFF2 y hMLH1. La presencia de SYBR Green permite la detección de cualquier otro ADN amplificado. Puede observarse que las secuencias no diana se amplifican muy poco en el caso de TMEFF2, y no se amplifican en absoluto en el
caso de hMLH1. En este ejemplo se ha incluido un separador d en el interior de la región de hibridación de cada oligonucleótido facilitador. Una ventaja de esto es que esto reduce la temperatura de fusión del oligonucleótido facilitador, reduciendo de esta forma su capacidad para competir con el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador por la unión a la diana reparada. Una posible segunda ventaja es evitar copiar la región 5' del 5 oligonucleótido facilitador por ampliación desde moléculas no diana que tienen por casualidad emparejamientos parciales o completos con las regiodes de la región de hibridación del oligonucleótido facilitador en 3' con respecto al separador d. En ambos casos se utilizaron los mismos cebadores dependientes, indicando de esta forma que se ha logrado la posibilidad de conseguir un sistema HDCR multiplexado con especificidad por diana(s) concreta(s) mediante el uso de oligonucleótidos iniciadores y facilitadores, con un único par de cebadores dependientes capaz
10 de amplificar cualquier o todas las dianas presentes.
Ejemplo 5. Dependencia del oligonucleótido en HDCR
Este ejemplo que utiliza la diana hMLH1 muestra que los tres oligonucleótidos (considerando solamente un extremo
15 de la diana) son necesarios para la HDCR. Las condiciones de tamponado y ciclación fueron las mismas que las utilizadas en el ejemplo anterior para hMLH1, pero en este caso, todas las reacciones contenían 1 nanogramo de ADN metilado con Sssl convertido en bisulfito (M). Algunas de las reacciones duplicadas carecen de un oligonucleótido particular para establecer el requisito de dicho oligonucleótidos para una HDCR satisfactoria. Tanto HEX (sonda de hidrólisis) como SYBR Green se leyeron en la etapa de 60 °C durante la etapa que contiene
20 cincuenta ciclos. Los resultados se muestran en la Figura 12. Hubo pocas diferencias entre las curvas obtenidas usando la sonda de hidrólisis y SYBR Green, sugiriendo que la diana hMLH1 se había amplificado de forma específica. Cuando los tres oligonucleótidos ensayados estuvieron presentes, la amplificación se detectó por primera vez poco después del ciclo 20. Cuando MLHlnit2, que es uno de los iniciadores, se omitió de la reacción, la amplificación solo se pudo detectar después del ciclo 35 para una de las reacciones. En la otra reacción duplicada,
25 la amplificación no se detectó. La omisión de cualquiera del oligonucleótido facilitador RMLH170, o el cebador dependiente exterior MCD6 dio como resultado una amplificación muy tardía. Esto demuestra que el éxito de una HDCR depende de la inclusión de los tres oligonucleótidos. Los correspondientes oligonucleótidos dirigidos al otro extremo de la diana estuvieron presentes en todas las reacciones.
Claims (18)
- REIVINDICACIONES1. Un método para la amplificación selectiva de una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico, comprendiendo el método:poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con
- (i)
- al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea, y
- (ii)
- dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa,
donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador iniciador; y llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador. -
- 2.
- El método de la reivindicación 1 donde el método comprende las etapas de:
(a). desnaturalizar la molécula molde de ácido nucleico; (b). poner en contacto la molécula molde de ácido nucleico desnaturalizada con al menos un cebador iniciador e iniciar la síntesis de la segunda hebra a partir de la anterior, introduciendo de esta forma la modificación a partir del cebador iniciador en la hebra sintetizada recientemente; (c). desnaturalizar las moléculas bicatenarias así generadas e iniciar la síntesis de la hebra inversa a partir de un cebador localizado en el extremo opuesto de la secuencia de nucleótidos diana a la cual se une el cebador iniciador, mientras que la síntesis de la hebra inversa termina prematuramente debido a la modificación introducida en la etapa (b); (d). desnaturalizar las moléculas bicatenarias sintetizadas recientemente, unir el oligonucleótido facilitador a la hebra inversa incompleta generada en la etapa (c) y ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador para completar la hebra inversa; y (e). repetir opcionalmente las etapas (a) a (d) durante uno o más ciclos adicionales. -
- 3.
- El método de las reivindicaciones 1 o 2 donde la región 5' del oligonucleótido facilitador comparte una de:
- (i)
- una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de dicho oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra, o
- (ii)
- una identidad de secuencia insuficiente con el cebador iniciador de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de dicho oligonucleótido facilitador.
-
- 4.
- El método de reivindicación 3 donde existe (ii) identidad de secuencia insuficiente entre la región 5' del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador, el método emplea adicionalmente un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador de tal manera que la síntesis de la hebra iniciada a partir del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
-
- 5.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el método se puede usar para mejorar la especificidad de la amplificación de una secuencia diana deseada, reduciendo o eliminando de forma simultánea la amplificación de secuencias no diana no deseadas.
-
- 6.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la al menos una modificación que bloquea la extensión 3' del oligonucleótido facilitador incluye la incorporación de uno o más restos o análogos de nucleótidos no extensibles en o próximos al extremo 3',
-
- 7.
- El método de la reivindicación 6 donde la al menos una modificación comprende una base o un análogo de base no extensibles del extremo 3' únicos, una combinación de una base no extensible del extremo 3' y uno o más nucleótidos emparejados incorrectamente próximos al extremo 3' del oligonucleótido, y/o la incorporación de un sitio
abásico cerca del extremo 3' del oligonucleótido, opcionalmente donde la base no extensible se selecciona entre un 2' 3' didesoxinucleótido, un 3' C3, C18 u otro separador en longitud, un nucleótido 3' fosforilado, una base de "ácido nucleico peptídico", una base de "ácido nucleico bloqueado" (LNA), un derivado de amina de nucleótido, uracilo tratado con Uracil ADN glicosilasa, ARN o un 2' O-metil nucleótido, o una combinación de estos. -
- 8.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el cebador iniciador y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador están modificados mediante la inclusión de uno o más separadores, sitios abásicos o nucleótidos modificados tales como 2'-O-metil nucleótidos, de manera opcional donde la modificación se localiza suficientemente próxima al extremo 3' del cebador de tal manera que aunque el cebador retiene la capacidad de iniciar la extensión 3', cuando se copia el producto ampliado que contiene la modificación en su secuencia de cebador, la hebra complementaria se trunca prematuramente evitando la unión del cebador en los posteriores ciclos de amplificación.
-
- 9.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el extremo 5' del oligonucleótido facilitador coincide con el extremo 5' o está comprendido dentro del cebador iniciador, y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador.
-
- 10.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde el oligonucleótido facilitador comprende una cola 5' ampliada que comprende una secuencia adicional a la que está presente en el extremo 5' del cebador iniciador, y/o el cebador dependiente del oligonucleótido facilitador.
-
- 11.
- El método de reivindicación 1 donde ambos cebadores de oligonucleótidos que flanquean la secuencia diana son cebadores iniciadores y el método emplea dos oligonucleótidos facilitadores, uno de los cuales se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador directo, y el otro se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el cebador iniciador inverso.
-
- 12.
- El método de reivindicación 11 donde la región 5' de al menos un oligonucleótido facilitador comparte una de:
- (i)
- una identidad de secuencia suficiente con el cebador iniciador correspondiente de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de al menos un oligonucleótido facilitador permitiendo por tanto al cebador iniciador correspondiente iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra, o
- (ii)
- una identidad de secuencia insuficiente con el cebador iniciador correspondiente de tal manera que el sitio de unión al cebador iniciador no se regenera tras la ampliación de la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir de la unión de al menos un oligonucleótido facilitador.
-
- 13.
- El método de reivindicación 12 donde existe (ii) identidad de secuencia insuficiente entre la región 5' del oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador, el método emplea adicionalmente al menos un cebador dependiente del oligonucleótido facilitador, modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, cuyo cebador comparte una identidad de secuencia suficiente con la región 5' del oligonucleótido facilitador correspondiente de tal manera que la síntesis de la hebra inversa iniciada a partir del de la unión del oligonucleótido facilitador genera un sitio de unión del cebador dependiente del oligonucleótido facilitador que permite por tanto al cebador dependiente del oligonucleótido facilitador iniciar ciclos adicionales de síntesis de la hebra.
-
- 14.
- El método de la reivindicación 13 donde el método emplea dos cebadores dependientes de oligonucleótidos facilitadores, uno de los cuales se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el oligonucleótido facilitador, y el otro se une a la misma región, a una región solapante o a una región adyacente de la molécula de ácido nucleico molde como el otro oligonucleótido facilitador.
-
- 15.
- Un método para mejorar la especificidad de una reacción de amplificación enzimática termocíclica, utilizando la reacción al menos dos cebadores de oligonucleótidos que flanquean una secuencia de nucleótidos diana de interés localizada en una molécula de ácido nucleico, donde al menos uno de dichos cebadores está modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra inversa, y la reacción utiliza además al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos una modificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del oligonucleótido facilitador se bloquea; y donde el oligonucleótido facilitador y el cebador modificado se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias complementarias a la secuencia diana 3' con respecto a la localización de unión del cebador modificado; donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador.
-
- 16.
- El método de reivindicación 15 donde la especificidad de la reacción de amplificación enzimática termocíclica se determina mediante la eliminación de, o la reducción en la cantidad de, producto de amplificación que no comprende
la secuencia del nucleótido diana de interés. -
- 17.
- Un método para detectar una secuencia de nucleótidos variante, comprendiendo el método amplificar selectivamente una secuencia de nucleótidos diana localizada en una molécula de ácido nucleico y que comprende
5 la secuencia variante, donde el método comprende: poner en contacto la molécula de ácido nucleico (molécula "molde") con(i) al menos un oligonucleótido facilitador no cebador, donde el oligonucleótido facilitador incluye al menos unamodificación en su extremo 3' o próxima a su extremo 3' de tal manera que la extensión 3' procedente del 10 oligonucleótido facilitador se bloquea, y(ii) dos o más cebadores de oligonucleótidos, al menos uno de los cuales es un cebador iniciador modificado de tal manera que la presencia de la modificación termina prematuramente la síntesis de la hebra complementaria,donde el oligonucleótido facilitador y el cebador iniciador se unen a las mismas regiones solapantes o adyacentes de15 la molécula molde de ácido nucleico y el oligonucleótido facilitador comprende además secuencias 3' complementarias a la secuencia 3' diana con respecto a la localización de la unión del cebador iniciador y donde dichas secuencias 3' permiten la unión preferente del oligonucleótido facilitador con la secuencia de nucleótidos diana que comprende la secuencia variante en lugar de con la correspondiente secuencia no variante; llevando a cabo la amplificación enzimática termocíclica, de tal manera que la secuencia diana específica se amplifica20 selectivamente, donde dicha amplificación incluye la etapa de ampliar la síntesis de la hebra inversa iniciada por la unión de dicho oligonucleótido facilitador; y comparar la secuencia de nucleótidos del producto amplificado con una secuencia correspondiente a la secuencia diana no variante, para detectar la secuencia de nucleótidos variante.25 18. El método de la reivindicación 17 donde la secuencia variante comprende la adición, la deleción o la sustitución de uno o más nucleótidos o una modificación, tal como un estado de metilación alterado, de uno o más nucleótidos en la secuencia diana. - 19. El método de las reivindicaciones 17 o 18 donde el método se utiliza en el análisis de metilación del ADN y/o en30 el diagnóstico de, o en la predicción de la susceptibilidad de, una enfermedad o dolencia en un sujeto, donde la enfermedad o dolencia está caracterizada o asociada con una alteración en una secuencia genética.Hibridación / ampliación
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