ES2966013T3 - Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado - Google Patents
Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado Download PDFInfo
- Publication number
- ES2966013T3 ES2966013T3 ES19866029T ES19866029T ES2966013T3 ES 2966013 T3 ES2966013 T3 ES 2966013T3 ES 19866029 T ES19866029 T ES 19866029T ES 19866029 T ES19866029 T ES 19866029T ES 2966013 T3 ES2966013 T3 ES 2966013T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target
- sequence
- primers
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 397
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 298
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 298
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 title description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 144
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 132
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 81
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 78
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 77
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 76
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 51
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 10
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 claims description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 447
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 153
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 56
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 37
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 25
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 22
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 21
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 21
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 20
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 20
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 19
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 18
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 18
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 14
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 13
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 11
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 10
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 10
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 9
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 4
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 3
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical compound C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 2
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000009133 cooperative interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 2
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 2
- IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N hexaethylene glycol Chemical class OCCOCCOCCOCCOCCOCCO IIRDTKBZINWQAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 1,1-dioxo-1$l^{6},2-benzodithiol-3-one Chemical compound C1=CC=C2C(=O)SS(=O)(=O)C2=C1 JUDOLRSMWHVKGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-triazine Chemical class C1=CN=NC=N1 FYADHXFMURLYQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminopropyl)-7h-purin-6-amine Chemical compound CC(N)CC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 QSHACTSJHMKXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 2-(2-azaniumylethylamino)acetate Chemical compound NCCNCC(O)=O PIINGYXNCHTJTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical class NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101900242680 Escherichia coli Ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 101001094518 Escherichia coli Ribonuclease H Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241000582786 Monoplex Species 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910004679 ONO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100054666 Streptomyces halstedii sch3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O)CC[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 OTXOHOIOFJSIFX-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005122 aminoalkylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 229920000547 conjugated polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002079 cooperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000592 heterocycloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002324 mouth wash Substances 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 125000001893 nitrooxy group Chemical group [O-][N+](=O)O* 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N sulfamic acid Chemical group NS(O)(=O)=O IIACRCGMVDHOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005486 sulfidation Methods 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical group 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 125000000876 trifluoromethoxy group Chemical group FC(F)(F)O* 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
En el presente documento se divulga un método para sintetizar un ácido nucleico diana preferentemente en relación con un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana. También se describen sistemas y kits para los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. N.° 62/736,094, presentada el 25 de septiembre de 2018.
Antecedentes
Los "cebadores cooperativos", como se conocen en la técnica, reducen drásticamente la formación y propagación de dímeros de cebadores. Sin embargo, la aplicación de cebadores cooperativos para la diferenciación entre hebras estrechamente relacionadas (especialmente aquellas con solo una diferencia entre uno o unos pocos nucleótidos, tales como SNP) ha tenido poco o ningún éxito. Las limitaciones de detección solo permitían la diferenciación en aplicaciones limitadas, especialmente aquellas en las que la concentración de alelo se conocía antes del ensayo. Lo que se necesita en la técnica es la capacidad de distinguir entre ácidos nucleicos, incluso aquellos con una diferencia de un solo nucleótido, tal como un SNP.
El documento US2017/247752 describe un método para la síntesis de un ácido nucleico diana utilizando un ácido nucleico cooperativo que comprende una porción de cebador unida a una porción de sonda que hibrida con la diana secuencia abajo de la porción de cebador.
Compendio
Se describe en el presente documento un método para sintetizar un ácido nucleico diana de forma preferente con respecto a un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana, comprendiendo el método: a) exponer una molécula de ácido nucleico cooperativo a una solución que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana y también que potencialmente comprende un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana (ácido nucleico que difiere), en donde la molécula de ácido nucleico cooperativo comprende, de 3' a 5': i) una primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria de una primera región de un ácido nucleico diana, y además en donde un penúltimo nucleótido del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico es complementario del ácido nucleico diana, pero no es complementario al ácido nucleico que difiere, y además también en donde el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3'; ii) una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria de una segunda región del ácido nucleico diana, en donde la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana comienza en el espacio de un nucleótido o menos de la primera región del ácido nucleico diana, de manera que se hibrida con el ácido nucleico diana secuencia abajo del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, o solapa en el extremo 5' con el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico; iii) un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico de una manera que permite que tanto dicha primera como segunda secuencia de ácido nucleico se hibriden con el ácido nucleico diana al mismo tiempo; b) proporcionar condiciones apropiadas para la síntesis de ácido nucleico en donde la polimerasa se extiende desde el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico a través de la segunda secuencia de ácido nucleico, sintetizando de esta manera el ácido nucleico diana de forma preferente al ácido nucleico que difiere si está presente en la solución.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen parte de esta memoria descriptiva, ilustran varios aspectos y junto con la descripción sirven para explicar los principios de la invención.
La Figura 1 muestra una estructura general del cocebador.
La Figura 2A-D muestra enfoques que implican situar el desajuste inducido por variante bajo la secuencia de cebado y captura, así como varias posibilidades de desajustes intencionados que no corresponden ni a la diana ni a la cadena de ácido nucleico que difiere. La figura 2B muestra el desajuste bajo el cebado, en la última posición. La Figura 2C muestra desajustes bajo el cebado, en una penúltima posición, con desajustes intencionados extra bajo la porción 5' del cebado.
La Figura 3A-C muestra estudios de tamaño de hueco usando huecos de 0, 1,3 o 6 nucleótidos entre la primera y segunda secuencia del ácido nucleico cooperativo.
La Figura 4A-D muestra estudios de eficiencia de dúplex frente a múltiplex.
La Figura 5A-D muestra los resultados de un estudio de Mezcla y Coincidencia, que permitió obtener resultados de genotipado para 6 SNP, mezclados en todas las combinaciones posibles (permitiendo fluoróforos).
La Figura 6 muestra el método de extensión de un cebador cooperativo. En la etapa 1, se muestra un cebador cooperativo en solución con la secuencia de captura, el enlazador flexible y la secuencia de cebador, orientados en una dirección de 5' a 3'. En la etapa 2, la secuencia de captura hibrida con su diana, llevando el cebador a una proximidad artificialmente cercana a su diana. La secuencia diana del cebador y la secuencia diana de captura se marcan. En la etapa 3, el cebador hibrida con su diana y la polimerasa comienza a extenderse. En la etapa 4, la polimerasa se extiende a través de la secuencia de captura, escindiéndola. Obsérvese que alternativamente la polimerasa puede extenderse a través de la secuencia de captura, desplazándola.
La Figura 7 muestra el efecto de los cocebadores (denominados en el presente documento cebadores cooperativos o ácidos nucleicos cooperativos) sobre el dímero de cebadores: en la etapa 1, dos cocebadores interaccionan de manera que la polimerasa se extiende a través de un cebador y forma un dímero de cebadores. La extensión está bloqueada para continuar más allá del extremo 5' del cebador por un resto no extensible. En la etapa 2, se muestra un cocebador que se une a un dímero de cebadores dando como resultado la extensión de la polimerasa en la otra dirección. En la etapa 3, el procedimiento se repite con la formación de más dímeros de cebadores. Debido a que la Tm del cebador está por debajo de la temperatura de reacción, y la extensión de los dímeros de cebadores pasado el extremo 5' del cebador está bloqueada, los dímeros de cebadores formados por cocebadores no son capaces de unirse consistentemente y extender más cebadores. Las etapas 2 y 3 no son capaces de ocurrir con alta eficiencia, indicado por las X rojas entre ellas. La amplificación y propagación de dímeros de cebadores está significativamente restringida incluso si se forman.
La figura 8 es una figura aproximadamente a escala que muestra un cebador cooperativo unido a su diana. Las unidades están en longitud de nucleótidos. Se muestra un cebador (azul) de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud hibridado con su diana. Se muestra una captura (púrpura) de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud hibridada con su diana. Se muestra un enlazador (verde) de aproximadamente 12 nucleótidos de longitud que conecta el cebador y la captura. El molde (rojo) tiene un hueco de aproximadamente 3 nucleótidos entre la diana del cebador y la diana de la captura.
La Figura 9 muestra un método de detección de amplificación de cebador cooperativo usando colorante intercalante. El cebador cooperativo, tras la hibridación y la extensión, forma ADN bicatenario. El colorante intercalante se inserta el mismo entonces en esa hélice bicatenaria y aumenta la señal fluorescente. Este incremento en la señal fluorescente puede ser entonces detectado.
La Figura 10 muestra un método de detección de amplificación de cebador cooperativo usando un marcador fluorescente. El cebador cooperativo se marca con una marcador fluorescente (verde) y atenuador (violeta). El marcador y el atenuador están en estrecha proximidad y la fluorescencia se silencia. Después de la hibridación y extensión, la polimerasa escinde la captura, liberando el marcador fluorescente y aumentando su distancia del atenuador. Esto aumenta la señal fluorescente que puede detectarse a continuación.
La Figura 11 muestra un cebador cooperativo hecho para dirigirse a un SNP. Todas las partes están marcadas. Los cebadores cooperativos están orientados en la dirección de 5' a 3'.
La Figura 12 muestra un cebador cooperativo hecho para dirigirse a un SNP. El nucleótido hecho para dirigirse al SNP está marcado en naranja. Cuando el cebador cooperativo se une a una diana que contiene el SNP al que se dirige, el extremo 3' del cebador se une y la polimerasa es capaz de extenderse. Si el SNP al que se dirige no está presente, el extremo 3' del cebador no se une - incluso si el resto del cebador cooperativo si lo hace - y no se produce extensión de polimerasa.
La Figura 13 muestra un cebador cooperativo hecho para dirigirse a un SNP. La secuencia de captura también se hace de modo que las dianas del cebador y la captura solapan. La secuencia de captura se hace con un nucleótido que se dirige al SNP opuesto del cebador. Si el SNP al que se dirige está presente, el extremo 5' de la captura no se une, mientras que el extremo 3' del cebador si lo hace, lo que da como resultado la extensión de la polimerasa. Si el SNP al que se dirige no está presente, el extremo 5' de la captura hibrida con la diana, lo que reduce adicionalmente la posibilidad de que el extremo 3' del cebador se una, y no se produce extensión de polimerasa.
La Figura 14 muestra el desajuste en diversas posiciones en ácidos nucleicos de cebadores cooperativos.
La Figura 15 muestra que cuando se puso un desajuste inducido por variante bajo la secuencia de captura, los valores de dCt (que demuestran el poder de diferenciación de los cocebadores específicos de alelo) fueron muy variables, con promedio de 8 ciclos con una desviación estándar de 4,8 ciclos.
Ventajas adicionales de la invención se expondrán en parte en la descripción que sigue y en parte serán evidentes a partir de la descripción o se podrán aprender por la puesta en práctica de la invención. Las ventajas de la invención se realizarán y se lograrán mediante los elementos y las combinaciones señaladas particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Se debe comprender que tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y no limitan la invención, tal como se reivindica.
Descripción detallada
El método descrito hace uso de ciertos materiales y procedimientos que permiten la amplificación de secuencias de ácido nucleico y genomas completos u otras muestras de ácido nucleico muy complejas. Estos materiales y procedimientos se describen en detalle a continuación.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado según lo entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes definiciones complementan a las de la técnica y están dirigidas a la solicitud actual y no deben imputarse a ningún caso relacionado o no relacionado, p. ej., a ninguna patente o solicitud de propiedad común. Aunque en la práctica se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento para ensayar la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en el presente documento. Por consiguiente, la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante.
Como se usa en el presente documento, "secuencia de ácido nucleico" se refiere al orden o secuencia de nucleótidos a lo largo de una cadena de ácidos nucleicos. En algunos casos, el orden de estos nucleótidos puede determinar el orden de los aminoácidos a lo largo de una cadena polipeptídica correspondiente. La secuencia de ácido nucleico codifica así la secuencia de aminoácidos. La secuencia de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, según se especifique, o contener porciones de secuencias tanto bicatenarias como monocatenarias. La secuencia de ácido nucleico puede estar compuesta de ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde la secuencia comprende cualquier combinación de desoxirribo y ribonucleótidos, y cualquier combinación de bases, que incluyen uracilo (U), adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G), inosina, xatanina, hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc. Puede incluir bases modificadas, incluyendo ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos peptídicos y otros conocidos por los expertos en la técnica.
Un "oligonucleótido" es un polímero que comprende dos o más nucleótidos. El polímero puede comprender adicionalmente elementos no nucleotídicos tales como marcadores, atenuadores, grupos de bloqueo, o similares. Los nucleótidos del oligonucleótido pueden ser naturales o no naturales y pueden ser no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados. Los nucleótidos pueden estar unidos por enlaces fosfodiéster, o por enlaces fosforotioato, enlaces metilfosfonato, enlaces boranofosfato, o similares.
Un "ácido nucleico peptídico" (PNA) es un polímero que comprende dos o más monómeros de ácido nucleico peptídico. El polímero puede comprender adicionalmente elementos tales como marcadores, atenuadores, grupos de bloqueo, o similares. Los monómeros del PNA pueden ser no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados.
Por "ácido nucleico cooperativo" se entiende a) una primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria de una primera región de un ácido nucleico diana, y además en donde un penúltimo nucleótido del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico es complementario del ácido nucleico diana, y además también en donde el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3' y la extensión puede proceder desde el último nucleótido, pasado el penúltimo nucleótido; y b) una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria de una segunda región del nucleico diana, en donde la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana comienza en el espacio de dos nucleótidos o menos de la primera región del ácido nucleico diana, de manera que hibrida con el ácido nucleico diana secuencia abajo del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico. La primera y segunda secuencias de ácido nucleico pueden estar separadas por un enlazador, por ejemplo.
Un "cebador" es un ácido nucleico que contiene una secuencia complementaria de una región de una hebra de ácido nucleico molde y que ceba la síntesis de una cadena complementaria del molde (o una porción de la misma). Los cebadores son típicamente, pero no necesitan serlo, oligonucleótidos relativamente cortos, sintetizados químicamente (típicamente, desoxirribonucleótidos). En una amplificación, p. ej., una amplificación por PCR, un par de cebadores definen típicamente los extremos 5' de las dos hebras complementarias de la diana de ácido nucleico que se amplifica. Por "cebador normal" se entiende un cebador que no tiene una secuencia de captura, o segunda secuencia de ácido nucleico, unida al mismo a través de un enlazador.
Por "secuencia de captura", a la que también se hace referencia en el presente documento como una "segunda secuencia de ácido nucleico" se entiende una secuencia que híbrida con el ácido nucleico diana y permite que la primera secuencia de ácido nucleico, o secuencia de cebador, esté muy cerca de la región diana del ácido nucleico diana.
"Secuencia abajo" se refiere a la acción de la polimerasa durante la síntesis o extensión de ácido nucleico. Por ejemplo, cuando la polimerasa Taq extiende un cebador, añade bases al extremo 3' del cebador y se moverá hacia una secuencia que está "secuencia abajo del extremo 3' del cebador".
Una "región diana" es una región de un ácido nucleico diana que se va a amplificar, detectar o ambos.
La "T m" (temperatura de fusión) de un dúplex de ácido nucleico en condiciones especificadas es la temperatura a la que la mitad de las secuencias de ácido nucleico están disociadas y la mitad están asociadas. (Cálculos de Tm usados como sugiere John SantaLucia en "The Thermodynamics of DNA Structural Motifs"). Como se usa en el presente documento, "Tm aislada" se refiere a la temperatura de fusión individual de la primera o segunda secuencia de ácido nucleico en el ácido nucleico cooperativo cuando no está en el par cooperativo. "Tm efectiva" se refiere a la temperatura de fusión resultante del primer o segundo ácido nucleico cuando se unen entre sí.
El término "enlazador" significa la composición que une el primer y segundo ácidos nucleicos entre sí. El enlazador comprende al menos un resto no extensible, pero también puede comprender ácidos nucleicos extensibles, y puede ser de cualquier longitud. El enlazador puede estar conectado al extremo 3', el extremo 5', o puede estar conectado a una o más bases desde el extremo ("el medio") de la primera y segunda secuencias de ácido nucleico. La conexión puede ser covalente, enlace de hidrógeno, interacciones iónicas, interacciones hidrófobas, y similares. El término "no extensible" se refiere a la incapacidad de la polimerasa Taq nativa para reconocer un resto y por lo tanto continuar la síntesis de ácido nucleico. Una variedad de bases de ácido nucleico naturales y modificadas son reconocidas por la polimerasa y son "extensibles". Los ejemplos de restos no extensibles incluyen, entre otros, fluoróforos, atenuadores, polietilenglicol, polipropilenglicol, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliésteres y otros conocidos por los expertos en la técnica. En algunos casos, incluso una base de ácido nucleico con orientación inversa (p. ej., 5' ACGT 3' 3' A 5' 5' AAGT 3') o de otro modo convertida de manera que la polimerasa Taq no pudiera extenderse a través de ella podría considerarse "no extensible".
La expresión "enlazador no ácido nucleico" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo químico reactivo que es capaz de unir covalentemente un primer ácido nucleico a un segundo ácido nucleico, o más específicamente, el cebador a la secuencia de captura. Los enlazadores flexibles adecuados son típicamente moléculas lineales en una cadena de al menos uno o dos átomos, más típicamente una cadena polimérica orgánica de 1 a 12 átomos de carbono (y/u otros átomos de la cadena principal) de longitud. Los enlazadores flexibles de ejemplo incluyen polietilenglicol, polipropilenglicol, polietileno, polipropileno, poliamidas, poliésteres y similares.
Como se usa en el presente documento, "complementario" o "complementariedad" se refiere a la capacidad de un nucleótido en una molécula de polinucleótido para formar un par de bases con otro nucleótido en una segunda molécula de polinucleótido. Por ejemplo, la secuencia 5'-A-C-T-3' es complementaria de la secuencia 3'-T-G-A-5'. La complementariedad puede ser parcial, en la que solo algunos de los nucleótidos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases, o completa, en la que todos los nucleótidos coinciden de acuerdo con el emparejamiento de bases. Para los fines de la presente invención, "sustancialmente complementario" se refiere a una identidad de 90% o superior a lo largo de la longitud de la región del par de bases diana. La complementariedad también puede ser complementaria al 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, o cualquier cantidad inferior o entre estas cantidades.
Como se usa en el presente documento, "amplificar, que amplifica, amplifica, amplificado, amplificación" se refiere a la creación de una o más copias idénticas o complementarias del ADN diana. Las copias pueden ser monocatenarias o bicatenarias. La amplificación puede ser parte de una serie de procesos tales como extensión de un cebador, transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa, secuenciación de ácido nucleico, amplificación de círculo rodante y similares.
Como se usa en el presente documento, "purificado" se refiere a un polinucleótido, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana, que se ha separado de los residuos celulares, por ejemplo, a Dn , ARN y proteína de alto peso molecular. Esto incluiría una muestra de ARN aislada que se separaría de los residuos celulares, incluyendo el ADN. También puede significar ácido nucleico no nativo, o no natural.
Como se usa en el presente documento, "proteína", "péptido" y "polipéptido" se usan indistintamente para indicar un polímero de aminoácidos o un conjunto de dos o más polímeros de aminoácidos que interaccionan o unidos.
Como se usa en el presente documento, "rigurosidad" se refiere a las condiciones, es decir, temperatura, fuerza iónica, disolventes y similares, en las que se produce la hibridación entre polinucleótidos. La hibridación es el proceso que se produce entre el cebador y el ADN de molde durante la etapa de reasociación del proceso de amplificación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico que difiere" significa que el ácido nucleico difiere en uno o más nucleótidos del ácido nucleico diana. Por ejemplo, un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) puede tener dos nucleótidos diferentes (A, G, C o T) en la misma posición en la molécula de ácido nucleico. El ácido nucleico que difiere también puede diferir en más de una posición, de modo que existen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más diferencias entre el ácido nucleico que difiere y el ácido nucleico diana. Estas diferencias pueden incluir adiciones, deleciones, inversiones o SNP.
Como se usa en el presente documento, la expresión "nucleótidos que solapan" o "hueco negativo" significa que la segunda región de complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana se solapa con la primera región de complementariedad del ácido nucleico diana y la primera secuencia de ácido nucleico, de manera que la primera y segunda regiones se solapan en uno o más nucleótidos. Esto se conoce como un "hueco negativo". Por ejemplo, en el caso de un hueco -1 (un hueco negativo de un nucleótido, o dicho de otra manera, un nucleótido solapante), el nucleótido 3' de la primera secuencia de ácido nucleico y la base 5' del segundo ácido nucleico son complementarios del mismo nucleótido en el ácido nucleico diana. Del mismo modo, con un hueco -2 (un hueco de dos nucleótidos, o dicho de otra manera, dos nucleótidos solapantes), la base 5' de la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria de la hebra que difiere mientras que el penúltimo nucleótido 3' de la segunda secuencia de ácido nucleico es complementario del ácido nucleico diana. En el caso de un hueco corto, la falta de flexibilidad perfecta en el molde conduce a la competencia entre la polimerasa y la captura por espacio. Además, la polimerasa no puede comenzar a extenderse sin una resistencia inmediata de la secuencia de captura que se está uniendo.
Una variedad de términos adicionales se definen o caracterizan de otra manera en el presente documento.
Materiales y métodos
En el presente documento se describe un método para discriminar entre un ácido nucleico diana y un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana, comprendiendo el método: a) exponer una molécula de ácido nucleico cooperativo a una solución que comprende un ácido nucleico diana y que también comprende potencialmente un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana (ácido nucleico que difiere), en donde la molécula de ácido nucleico cooperativo comprende, de 3' a 5': i) una primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera la secuencia de ácido nucleico es complementaria de una primera región de un ácido nucleico diana, y además en donde un penúltimo nucleótido del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico es complementario del ácido nucleico diana, pero no es complementario del ácido nucleico que difiere, y además también en donde el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3' y la extensión puede proceder desde el último nucleótido, pasado el penúltimo nucleótido; ii) una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria de una segunda región del ácido nucleico diana, en donde la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana está en el espacio de un nucleótido o menos de la primera región del ácido nucleico diana, de modo que se hibrida con el ácido nucleico diana secuencia abajo del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, o solapa en el extremo 5' de la primera secuencia de ácido nucleico; iii) un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácidos nucleicos de una manera que permite que tanto dicha primera como segunda secuencias de ácidos nucleicos se hibriden con el ácido nucleico diana al mismo tiempo; b) proporcionar condiciones apropiadas para la síntesis de ácidos nucleicos, sintetizando así el ácido nucleico diana y no sintetizando el ácido nucleico que difiere si está presente en la solución
Sin limitarse a la teoría, hay varios factores en la diferenciación de ácidos nucleicos con uno o más desajustes, inserciones, deleciones y/u otras modificaciones usando cocebadores que tienen cada uno impacto en la diferenciación de SNP individualmente y en combinación. Estos incluyen, pero no se limitan a 1) la situación del SNP u otro desajuste en la secuencia primera o de cebado en el cocebador; 2) el tamaño del hueco o número de ácidos nucleicos entre el extremo 3' de la primera secuencia extensible y el extremo 5' de la segunda secuencia; 3) la presencia de cocebadores competidores para el otro alelo; 4) la temperatura de fusión (Tm) de la primera y/o segunda secuencia con respecto a la temperatura de reacción; 5) la adición de otros desajustes situados intencionadamente en la primera y/o segunda secuencia; y 6) el tipo de mezcla maestra usada.
Por ejemplo, si las bases de ácido nucleico en la primera secuencia del cocebador se numeran desde el extremo 3': 1, 2, 3, etc., entonces el SNP u otro desajuste puede localizarse en el extremo 3' de la primera secuencia también llamada base 1 o la primera base. En otra realización, el SNP u otra mutación podría localizarse bajo la tercera base o base 3. En una realización preferida, el SNP u otro desajuste se localiza bajo la base 2, la segunda base desde el extremo 3' también llamada la penúltima base.
La diferenciación de SNP se ha analizado con el desajuste bajo la base 1 y la base 3, pero no bajo la base 2. Puesto que ACt entre el tipo natural y con desajuste para los cocebadores con el desajuste localizado bajo la base 1 y la base 3 era similar y pequeño, fue sorprendente descubrir que el ACt aumentó notablemente con el desajuste bajo la base 2, la penúltima base.
El tamaño de hueco es el número de bases entre el extremo 3' de la primera secuencia y el extremo 5' de la segunda secuencia en el cocebador. Los tamaños de huecos son únicos para los cocebadores ya que los cebadores normales no tienen una segunda secuencia que se pliegue sobre el cebador para unirse secuencia abajo desde el extremo 3' de la primera secuencia. La presencia del hueco proporciona un beneficio único a los cocebadores en la diferenciación de SNP y otros polimorfismos. Sin estar limitados por la teoría, los huecos pequeños de 3, 2, 1, 0, o menos bases crean impedimento estérico para la unión de la polimerasa al extremo 3' de la primera secuencia. La presencia de impedimento estérico incrementa la especificidad del suceso de unión/extensión inicial ya tensionado donde está presente un desajuste. En una realización preferida, el tamaño de hueco es de 2 o menos bases. En una realización todavía más preferida, el tamaño de hueco es de 1 o menos bases.
El uso de un tamaño de hueco de 2 o menos bases estaba contraindicado previamente. Los datos recogidos por los investigadores, tanto publicados como no publicados, indicaban que la eficiencia de amplificación era más probable que se maximizara con un tamaño de hueco de al menos 3 bases. La disminución del número de bases en el hueco estaba cada vez más contraindicada basándose en los datos. Por lo tanto, los resultados que muestran que el tamaño del hueco es significativo en la diferenciación de cocebadores de SNP y otros polimorfismos es sorprendente. Por ejemplo, una investigación publicada previamente (Cooperative Primers: Intersecting Spherical Model for the Optimization of Linker and Gap Lengths) afirma: "En el caso de un hueco corto, la falta de flexibilidad perfecta en el molde conduce a la competencia entre la polimerasa y la captura por el espacio. Además, la polimerasa no puede comenzar a extenderse sin una resistencia inmediata de la secuencia de captura que se está uniendo. En este artículo se teoriza una "penalización" a la eficiencia de amplificación debido a longitudes cortas de huecos.
Una característica adicional única para los cocebadores es la capacidad de crear un "hueco negativo". Un hueco negativo es donde el extremo 3' de la primera secuencia solapa con el extremo 5' de la segunda secuencia en el cocebador. Un solapamiento de una sola base correspondería a un tamaño de hueco de -1. Un solapamiento de dos, tres, cuatro o cinco bases correspondería a tamaños de huecos de -2, -3, -4 y -5 bases respectivamente.
En algunas realizaciones, los tamaños de huecos negativos son -1, -2, -3, -4, -5 o menos bases. Sin estar limitado por la teoría, esto añade competencia a la unión además del impedimento estérico que conduce a una especificidad aún mayor. En una realización preferida, el tamaño del hueco es de -1 o -2 bases. Al igual que con los tamaños de huecos pequeños, los huecos negativos están contraindicados y su uso para mejorar la especificidad es sorprendente.
En realizaciones donde el tamaño del hueco es negativo de manera que el SNP o desajuste diana está contenido en las áreas de unión de la diana tanto de la secuencia de cebado como de la secuencia de captura, un método preferido es diseñar el cebador como se ha descrito anteriormente para dirigirse al SNP, mientras que el nucleótido correspondiente en la secuencia de captura está diseñado opuesto de manera que es complementario a la hebra que difiere o el polimorfismo opuesto a la secuencia de cebado. Por ejemplo, si la secuencia de cebado se hace complementaria a la hebra de tipo natural y el nucleótido diana del SNP es complementario a esa hebra, entonces el nucleótido diana del SNP de la secuencia de captura será complementario de la hebra mutante, y viceversa. En esta realización, la secuencia de cebado y la secuencia de captura compiten por su diana complementaria relativa. Si la cepa de tipo natural está presente, la secuencia de cebado tiene ventaja sobre la secuencia de captura y se produce la extensión. Si solo está presente la hebra mutante, la secuencia de captura gana y no se produce extensión puesto que el extremo 3' del cebador no está unido.
En algunas realizaciones, están presentes cocebadores competidores para el otro alelo o desajuste. Sin estar limitados por la teoría, la presencia de cebadores competidores crea competencia por el cebador inverso conduciendo a un aumento en la especificidad. Por ejemplo, si el cocebador diseñado se dirige al tipo natural, entonces el cocebador competidor se dirigiría al mutante. La amplificación del mutante por el cocebador reduciría la cantidad de cebador inverso presente conduciendo a una menor eficiencia de la amplificación para el cebador de tipo natural cuando comienza a amplificarse. En el trabajo previo, los cebadores competidores no se introdujeron en el proceso de diferenciación de SNP. El aumento de ACt mediante la adición de cocebadores competidores fue sorprendente.
En algunas realizaciones, la Tm de la primera secuencia en el cocebador está más de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25°C por debajo de la temperatura de reacción. En algunas realizaciones, la Tm de la segunda secuencia en el cocebador está más de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25°C por debajo de la temperatura de reacción.
En algunas realizaciones, se crean desajustes adicionales intencionadamente en la primera o segunda secuencia en el cocebador. En una realización preferida, se añaden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 desajustes adicionales al extremo 5' de la primera secuencia de manera que la Tm prevista es menor para la ronda inicial de unión y amplificación pero aumenta en la segunda y todas las rondas posteriores de amplificación. En otras realizaciones, se añaden intencionadamente uno o más desajustes en otras ubicaciones en la primera secuencia de cebado.
En algunas realizaciones, la mezcla maestra usada mejora la diferenciación de SNP o de otro desajuste.
En algunas realizaciones, cada uno de los factores: (es decir, 1) la ubicación del SNP u otro desajuste en la secuencia primera o cebadora en el cocebador; 2) el tamaño del hueco o número de ácidos nucleicos entre el extremo 3' de la primera secuencia extensible y el extremo 5' de la segunda secuencia; 3) la presencia de cocebadores competidores para el otro alelo; 4) la Tm de la primera y/o segunda secuencia con respecto a la temperatura de reacción; 5) la adición de otros desajustes colocados intencionadamente en la primera y/o segunda secuencia; y 6) el tipo de mezcla maestra utilizada) se utilizan solos para mejorar la diferenciación de SNP. En realizaciones preferidas, se usan dos o más factores en combinación para aumentar la especificidad más allá de la suma de las partes.
Por ejemplo, en una realización preferida, la mutación se localiza bajo la penúltima base de la primera secuencia y el tamaño de hueco se restringe a 2, 1, 0, -1, -2, -3 o menos bases. En otras realizaciones, la mutación se localiza bajo la penúltima base de la primera secuencia y están presentes cebadores competidores para el otro alelo. En otras realizaciones más, la mutación se localiza bajo la penúltima base de la primera secuencia y la Tm de la primera secuencia está más de 5°C por debajo de la temperatura de reacción. En otras realizaciones más, el desajuste está debajo de la penúltima base de la primera secuencia y se añaden desajustes adicionales al extremo 5' de la primera secuencia.
En otras realizaciones más, el tamaño de hueco es de 2, 1, 0, -1, -2, -3 o menos bases y están presentes cocebadores competidores. En aún otras realizaciones, el tamaño de hueco es de 2, 1, 0, -1, -2, -3 o menos bases y la Tm de la primera secuencia está más de 5°C por debajo de la temperatura de reacción. En otras realizaciones más, el tamaño de hueco es de 2, 1, 0, -1, -2, -3 o menos bases y se añaden desajustes adicionales intencionadamente en el extremo 5' de la primera secuencia.
En realizaciones aún más preferidas, tres o más factores pueden combinarse entre sí. Por ejemplo, en una de tales realizaciones preferidas, la mutación se localiza bajo la penúltima base, el tamaño del hueco es de 2, 1, 0, -1, -2, -3 o menos bases, y están presentes cocebadores competidores. En otras realizaciones más, 4, 5, o incluso los 6 factores están presentes juntos.
El ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere pueden diferir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más nucleótidos. Por ejemplo, el ácido nucleico que difiere puede comprender un morfismo de un solo nucleótido (SNP) cuando se compara con el ácido nucleico diana. También se describe un ensayo múltiplex, que se comenta en detalle a continuación, con múltiples ácidos nucleicos que difieren que pueden diferir del ácido nucleico diana en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos. Cuando más de un nucleótido difiere entre la diana y el ácido nucleico que difiere, los diferentes nucleótidos pueden ser contiguos, o pueden ser no contiguos. Cuando no son contiguos, pueden estar separados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más nucleótidos, o cualquier cantidad por encima o entre estas cantidades.
El ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere pueden diferir no solo por una sustitución, sino que también pueden ser el resultado de una inserción o deleción. Un experto en la técnica apreciará que cualquier diferencia entre el ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere se puede aprovechar para amplificar la diana frente al ácido nucleico que difiere.
En la presente invención, el ácido nucleico diana se sintetiza de forma preferente al ácido nucleico que difiere permitiendo que se amplifique mucho más que el ácido nucleico que difiere. En la presente invención, "sintetizar el ácido nucleico diana y no sintetizar el ácido nucleico que difiere" significa que, para todos los propósitos prácticos conocidos en la técnica, el ácido nucleico diana se amplifica en un grado mucho mayor. Por ejemplo, el ácido nucleico diana puede sintetizarse 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 o 2000 veces o más cuando se compara con el ácido nucleico que difiere (o cualquier cantidad por encima o entremedias).
La síntesis preferente puede ocurrir con una única ronda de síntesis de ácido nucleico o puede usarse en múltiples rondas. En una realización, se puede usar una única ronda de síntesis como parte de un método para secuenciar de manera preferente un ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, se desea la diferenciación del ácido nucleico diana durante o después de la amplificación. Por ejemplo, en algunas realizaciones que emplean detección en tiempo real, ACt entre el ácido nucleico diana y el que difiere es 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más ciclos. En una realización preferida, ACt es de 10 o más ciclos. En una realización más preferida, ACt es de 15 o más ciclos. En algunas realizaciones, sólo el ácido nucleico diana tiene un Ct medible.
En otras realizaciones, se usan métodos de detección de punto final para determinar la cantidad del ácido nucleico diana con respecto al ácido nucleico que difiere. En algunas realizaciones, se utiliza electroforesis en gel o capilar. En otras realizaciones, se mide la fluorescencia. En otros más, se miden señales conocidas por los expertos en la técnica.
En una realización, la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico puede estar en el espacio de un nucleótido de la primera región del ácido nucleico diana. La complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y la primera región del ácido nucleico diana también puede ser contigua, de manera que no hay nucleótidos, o "huecos" entre estas dos regiones. Alternativamente, puede existir solapamiento entre la segunda secuencia de ácido nucleico y la primera región del ácido nucleico diana, de manera que solapan 1, 2, 3, 4, 5, o más nucleótidos. Un ejemplo de esto puede verse en la Figura 13.
Pueden usarse múltiples ácidos nucleicos cooperativos en el ensayo. Por ejemplo, puede haber 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o más ácidos nucleicos cooperativos distintos en el mismo ensayo. Estos ácidos nucleicos cooperativos distintos se pueden dirigir a cualquier cantidad de ácidos nucleicos diana en la muestra. Por ejemplo, se pueden usar ácidos nucleicos cooperativos distintos que son complementarios de varias hebras de la misma bacteria. Alternativamente, se pueden usar ácidos nucleicos cooperativos distintos que son complementarios de varios SNP. En este caso, un segundo, tercer, e incluso un cuarto ácido nucleico cooperativo podrían usarse simultáneamente para detectar diferentes combinaciones de nucleótidos presentes en un SNP. Por ejemplo, el primer ácido nucleico cooperativo puede ser específico para una base "A" en un SNP, el segundo ácido nucleico cooperativo podría ser específico para una base "T" en un SNP, un tercer ácido nucleico cooperativo podría ser específico para una base "C" en un SNP, y un cuarto ácido nucleico cooperativo podría ser específico para una base "G" en un SNP. Estos ácidos nucleicos cooperativos distintos pueden exponerse simultáneamente a los ácidos nucleicos diana, o pueden exponerse en diferentes momentos en diferentes ensayos. En una realización, los ácidos nucleicos cooperativos primero y segundo pueden amplificar sus dianas previstas en condiciones sustancialmente similares. En otra realización, las condiciones pueden variar, permitiendo de este modo que un ácido nucleico diana se amplifique de manera diferente que el otro ácido nucleico diana basándose en las condiciones del ensayo.
También se describe un ensayo múltiplex en donde la primera secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico cooperativo no hibridará con el ácido nucleico diana sin que la segunda secuencia de ácido nucleico hibride con el ácido nucleico diana. Esto se denomina en el presente documento "hibridación condicional".
Además, el aumento de la longitud de un cebador o secuencia de nucleótidos aumenta su temperatura de fusión, o Tm, definida como la temperatura a la que hibridan el 50% de las secuencias disponibles. En general, el aumento de la Tm aumenta la sensibilidad pero reduce la especificidad. Dadas las condiciones favorables, los cebadores pueden unirse y extenderse sobre cualquier nucleótido presente en una muestra. El aumento de la especificidad reducirá la eficiencia a la que se unen y se extienden a cualquier cosa aparte del objetivo deseado. Esto se denomina unión no específica, extensión no específica o amplificación no específica. El propósito de aumentar la especificidad es disminuir la unión, extensión y amplificación no específicas.
Un tipo de unión no específica puede ocurrir cuando un cebador se une a otro cebador. Si se produce la extensión, el producto se denomina un dímero de cebadores. Los dímeros de cebadores son un producto no específico especialmente peligroso porque constituyen un complemento exacto a un cebador ya que la extensión se produjo a través de un cebador presente en la reacción. Debido a esto, ese cebador se unirá y se extenderá con eficacia total a ese dímero de cebadores durante todo el resto de la reacción. En una aplicación de PCR, cualquier dímero de cebadores formado se amplificará exponencialmente a lo largo de la reacción y puede generar una señal falsa, eclipsar la señal verdadera o disminuir la señal verdadera usando reactivos que de otra manera se habrían utilizado en los propósitos de amplificación deseados.
El "cebador cooperativo", al que se hace referencia alternativamente en el presente documento como un "ácido nucleico cooperativo", se refiere a un cebador que es mucho más corto que los cebadores tradicionales. Generalmente, la Tm de este cebador es demasiado baja para que el cebador se una, extienda o amplifique por sí mismo en una reacción. Esto da al cebador cooperativo una especificidad extremadamente alta. El cebador es incapaz de unirse eficientemente a dianas no específicas, lo que reduce drásticamente la formación de productos no específicos. Con respecto a los dímeros de cebadores la ventaja se amplifica por el hecho de que no solo los dímeros de cebadores son menos propensos a formarse, sino que incluso después de que se forman su Tm es demasiado baja para facilitar la unión, extensión y amplificación futuras de los dímeros de cebadores. El cebador extremadamente corto y altamente específico del cebador cooperativo tendría una sensibilidad muy baja si no fuera por el enlazador y la captura. La captura es una secuencia de nucleótidos con Tm a o cerca o por encima de la temperatura de reacción. La captura se une al cebador por un enlazador flexible, no extensible unido al extremo 5' del cebador y ya sea el extremo 3' o 5' de la captura. Generalmente, la captura no es extensible debido al enlazador o a un marcador fluorescente unido a su extremo 3'. La captura, con su Tm cerca de la temperatura de reacción, es capaz de unirse a su diana. La diana de la captura está generalmente cerca de la diana del cebador de manera que cuando la captura hibrida con su diana, el cebador en virtud del enlazador se lleva artificialmente muy próximo a su diana. Esto incrementa la concentración local del cebador, lo que incrementa su Tm efectiva a la diana en la vecindad, facilitando la unión y extensión. Puesto que el enlazador bloquea la extensión, cualquier producto no específico o dímero de cebadores no contendrá tanto la diana del cebador como la de captura, lo que eliminará la posible amplificación futura de ese producto. De esta manera, los cebadores cooperativos pueden mantener un nivel extremadamente alto de especificidad mientras que siguen siendo lo suficientemente sensibles para amplificar la diana deseada.
Los ácidos nucleicos cooperativos de la presente invención están en fuerte contraste con conceptos tales como el cebador de especificidad dual (Publicación de patente de EE. UU. 20120135473 por su enseñanza relativa a cebadores de especificidad dual). Véase el Ejemplo 6, el cebador de especificidad dual tiene una secuencia de captura unida a un cebador corto a través de restos de inosina donde la secuencia de captura hibrida con la diana en el lado 5' del cebador. El resultado es que el cebador de especificidad dual es altamente específico en la primera ronda de amplificación. Sin embargo, si los cebadores de especificidad dual se amplifican entre sí, la polimerasa se extiende hasta el extremo 5', creando un dímero de cebadores de Tm alta que se propagará en cada ronda en lo sucesivo. Esto está en contraste con el ácido nucleico cooperativo donde la secuencia de captura hibrida con la diana en el lado 3' del cebador, evitando que se incorpore en el dímero de cebadores en el orden necesario para permitir la propagación del dímero de cebadores.
Los ácidos nucleicos cooperativos y los métodos para usarlos también son diferentes de las "sondas de candado" (Nilsson et al., 1994: "Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection".Science265 (5181): 2085-2088), sondas de inversión molecular (MIP) (Hardenbol et al. 2003: "Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversion probes".Nat Biotechnol21 (6): 673-678) y las sondas de inversión de conector (CIP) (Akhras et al. 2007: Hall, Neil. ed. "Connector inversion probe technology: a powerful one-primer multiplex DNA amplification system for numerous scientific applications". PLoS ONE 2 (9): e195). Por ejemplo, las sondas descritas en el presente documento pueden tener un enlazador con al menos un resto no extensible. Además, la molécula descrita en el presente documento es un cebador, mientras que las "sondas de candado" están ligadas, y las sondas de candado no ligadas se digieren o son retiradas de otro modo antes de la amplificación y no se pueden usar como cebadores.
Las sondas de candado son moléculas de ADN monocatenario con dos segmentos de 20 nucleótidos de longitud complementarios de la diana conectados por una secuencia de enlazador de 40 nucleótidos de largo. Cuando las regiones complementarias de la diana se hibridan con la diana de ADN, las sondas de candado también se circularizan. Sin embargo, a diferencia de las MIP, las sondas de candado están diseñadas de manera que las regiones complementarias de la diana abarcan toda la región diana tras la hibridación, sin dejar huecos. Por lo tanto, las sondas de candado solo son útiles para detectar moléculas de ADN con secuencias conocidas.
Se desarrollaron sondas de inversión molecular para realizar el genotipado de SNP, que son sondas de candado modificadas de manera que cuando la sonda se hibrida con la diana genómica, hay un hueco en la posición del SNP. El llenado de huecos usando un nucleótido que es complementario del nucleótido en la ubicación del SNP determina la identidad del polimorfismo. Este diseño aporta numerosos beneficios frente a la técnica de sonda de candado más tradicional. El uso de múltiples sondas de candado específicas para un SNP plausible requiere un equilibrio cuidadoso de la concentración de estas sondas específicas de alelo para garantizar que los recuentos de SNP en un lugar dado se normalicen adecuadamente.
Las sondas de inversión de conector hacen uso de un diseño modificado de MIP al extender el espacio delimitado por los extremos de sonda hibridados y se denomina diseño de la sonda de inversión de conector (CIP). El hueco corresponde a la región genómica de interés que se va a capturar (p. ej., exones). La reacción de llenado de huecos se logra con ADN polimerasa, usando los cuatro nucleótidos. La identificación de las regiones capturadas se puede hacer entonces secuenciándolas usando cebadores específicos de locus que mapean a uno de los extremos complementarios de la diana de las sondas.
La presente invención puede usar ácidos nucleicos unidos cooperativamente que también comprenden una sonda. Este cebador/sonda modificado es similar al ácido nucleico cooperativo, pero con la adición de uno o más marcadores detectables a la secuencia de captura o al cebador, convirtiéndolo en una sonda. Debido a que la extensión del cebador/sonda cooperativo es detectable, puede ser útil en una variedad de aplicaciones que incluyen aplicaciones de multiplexado que requieren diferenciación de SNP usando un enfoque basado en ARMS. En algunas realizaciones, tanto el cebador como la sonda están diseñados con Tm por debajo de la temperatura de fusión que se usa en la reacción de amplificación, de modo que el cebador no se amplificará sin la unión de la sonda y la sonda no tendrá una señal sin la unión del cebador. Esto crea dos puntos de especificidad en la misma combinación de cebador/sonda.
Los ácidos nucleicos cooperativos, tales como cebadores y sondas, son útiles en una variedad de reacciones de extensión/amplificación de cebadores conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a la reacción en cadena de la polimerasa, amplificación de círculo rodante, secuenciación de ácido nucleico y otros. Los cebadores y sondas cooperativos también se pueden usar en aplicaciones que tienen etapas de extensión/amplificación posteriores, tales como hibridación con una matriz. Debido a que los cebadores/sondas cooperativos en esta invención reducen sustancialmente los dímeros de cebadores, son de particular uso en reacciones multiplexadas y altamente multiplexadas.
El uso de un ácido nucleico cooperativo puede disminuir la cantidad de dímeros de cebadores presentes en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 por ciento en comparación con la cantidad de dímeros de cebadores presentes cuando se usa un cebador normal (un ácido nucleico no cooperativo).
El ácido nucleico cooperativo puede ser lineal o circularizado.
Por "extensible en el extremo 3'" se entiende que el primer ácido nucleico está libre en este extremo para amplificarse, o extenderse. Esto pretende incluir cebadores activables por calor tales como los descritos por Lebedev et al., entre otras tecnologías.
En un ejemplo, el ácido nucleico cooperativo comprende 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, o menos nucleótidos continuos en la misma orientación. En otras palabras, este es el número de nucleótidos que son parte de una secuencia de ácido nucleico única, no rota y orientada en la misma dirección 5' a 3', o la dirección 3' a 5'. A modo de ejemplo, si el enlazador es una secuencia de ácido nucleico, puede incluir el enlazador, si los nucleótidos en el enlazador están en la misma orientación que la primera o la segunda secuencia de ácido nucleico a la que está conectado directamente.
El enlazador puede estar hecho de ácidos nucleicos, no ácidos nucleicos, o alguna combinación de ambos. Si el enlazador está hecho de ácidos nucleicos, puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más nucleótidos de longitud, o cualquier número intermedio. Los tipos de enlazadores se describen en otra parte del presente documento. El enlazador puede ser de cualquier longitud, y puede ser más largo o más corto que la longitud combinada de la primera y segunda secuencias de ácido nucleico, más largo o más corto que solo la primera secuencia de ácido nucleico, o más largo o más corto que la segunda secuencia de ácido nucleico. El enlazador puede estar hecho de modo que sea no extensible.
También se describe en el presente documento un kit que comprende las moléculas de ácido nucleico cooperativas descritas en el presente documento junto con instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, se proporcionan moléculas de ácido nucleico cooperativas adicionales en el kit. En otros más, se incluyen reactivos para realizar la extensión, tales como polimerasa, dNTP, tampones y similares. En algunas realizaciones, se pueden incluir controles positivos y negativos. En tales realizaciones, los reactivos pueden estar todos envasados por separado o combinados en un solo tubo o recipiente.
Diseño de cebador
En algunas realizaciones, la temperatura de fusión aislada "Tm" del cebador, también denominada en el presente documento como la primera secuencia de ácido nucleico, está 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 grados o más por debajo de la temperatura de reacción utilizada durante la fase de reasociación, de la PCR, o la fase de extensión de reacciones sin fase de reasociación. Por lo tanto, la temperatura de fusión de la secuencia de cebador puede estar entre aproximadamente 1°C y 40°C, entre aproximadamente 3°C y 20°C, entre aproximadamente 5°C y 15°C por debajo de la temperatura de reacción utilizada en la reacción de PCR. En una realización preferida, la Tm aislada está entre aproximadamente 7°C y 12°C por debajo de la temperatura de reacción. Esto proporciona que menos de 20%, y más preferiblemente menos de 5% del molde se hibride con un cebador aislado.
Un experto en la técnica puede diseñar cebadores con una temperatura de fusión dada basándose en muchos factores, tales como la longitud, y con un contenido de GC creciente. Una fórmula simple para el cálculo de la (Tm) es:
Tm = 4(G C) 2(A T) °C
Además, un experto en la técnica apreciará que en la Tm real influye la concentración de Mg2+, K+, y codisolventes. Existen numerosos programas informáticos para ayudar al diseño de cebadores.
Para lograr las temperaturas de fusión deseadas, la primera secuencia de ácido nucleico, o el cebador, puede
ser de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,
34, 35, 36, 37, 38, 39 y 40 bases de longitud. Por ejemplo, los cebadores pueden ser de entre aproximadamente
5 y 26, entre aproximadamente 7 y 22, entre aproximadamente 9 y 17 bases de longitud dependiendo del contenido de GC.
Puede usarse cualquier número deseado de cebadores de secuencia de nucleótidos distinta, pero se prefiere
el uso de uno o unos pocos cebadores. La reacción de amplificación puede realizarse, por ejemplo, con uno,
dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o diecisiete cebadores. Se pueden usar más cebadores. No existe un límite superior fundamental para el número de cebadores que se pueden utilizar. Sin embargo, se prefiere el uso de menos cebadores. Cuando se usan
múltiples cebadores, los cebadores deben tener cada uno una secuencia de nucleótidos específica distinta.
La reacción de amplificación puede realizarse con un único cebador y, por ejemplo, sin cebadores adicionales,
o con 1 cebador adicional, con 2 cebadores adicionales, con 3 cebadores adicionales, con 4 cebadores adicionales, con 5 cebadores adicionales, con 6 cebadores adicionales, con 7 cebadores adicionales, con 8 cebadores adicionales, con 9 cebadores adicionales, con 10 cebadores adicionales, con 11 cebadores adicionales, con 12 cebadores adicionales, con 13 cebadores adicionales, con 14 cebadores adicionales, con
15 cebadores adicionales, con 16 cebadores adicionales, con 17 cebadores adicionales, con 18 cebadores adicionales, con 19 cebadores adicionales, con 20 cebadores adicionales, con 21 cebadores adicionales, con
22 cebadores adicionales, con 23 cebadores adicionales, con 24 cebadores adicionales, con 25 cebadores adicionales, con 26 cebadores adicionales, con 27 cebadores adicionales, con 28 cebadores adicionales, con
29 cebadores adicionales, con 30 cebadores adicionales, con 31 cebadores adicionales, con 32 cebadores adicionales, con 33 cebadores adicionales, con 34 cebadores adicionales, con 35 cebadores adicionales, con
36 cebadores adicionales, con 37 cebadores adicionales, con 38 cebadores adicionales, con 39 cebadores adicionales, con 40 cebadores adicionales, con 41 cebadores adicionales, con 42 cebadores adicionales, con
43 cebadores adicionales, con 44 cebadores adicionales, con 45 cebadores adicionales, con 46 cebadores adicionales, con 47 cebadores adicionales, con 48 cebadores adicionales, con 49 cebadores adicionales, con
50 cebadores adicionales, con 51 cebadores adicionales, con 52 cebadores adicionales, con 53 cebadores adicionales, con 54 cebadores adicionales, con 55 cebadores adicionales, con 56 cebadores adicionales, con
57 cebadores adicionales, con 58 cebadores adicionales, con 59 cebadores adicionales, con 60 cebadores adicionales, con 61 cebadores adicionales, con 62 cebadores adicionales, con 63 cebadores adicionales, con
64 cebadores adicionales, con 65 cebadores adicionales, con 66 cebadores adicionales, con 67 cebadores adicionales, con 68 cebadores adicionales, con 69 cebadores adicionales, con 70 cebadores adicionales, con
71 cebadores adicionales, con 72 cebadores adicionales, con 73 cebadores adicionales, con 74 cebadores adicionales, con 75 cebadores adicionales, con 76 cebadores adicionales, con 77 cebadores adicionales, con
78 cebadores adicionales, con 79 cebadores adicionales, con 80 cebadores adicionales, con 81 cebadores adicionales, con 82 cebadores adicionales, con 83 cebadores adicionales, con 84 cebadores adicionales, con
85 cebadores adicionales, con 86 cebadores adicionales, con 87 cebadores adicionales, con 88 cebadores adicionales, con 89 cebadores adicionales, con 90 cebadores adicionales, con 91 cebadores adicionales, con
92 cebadores adicionales, con 93 cebadores adicionales, con 94 cebadores adicionales, con 95 cebadores adicionales, con 96 cebadores adicionales, con 97 cebadores adicionales, con 98 cebadores adicionales, con
99 cebadores adicionales, con 100 cebadores adicionales, con 110 cebadores adicionales, con 120 cebadores adicionales, con 130 cebadores adicionales, con 140 cebadores adicionales, con 150 cebadores adicionales,
con 160 cebadores adicionales, con 170 cebadores adicionales, con 180 cebadores adicionales, con 190 cebadores adicionales, con 200 cebadores adicionales, con 210 cebadores adicionales, con 220 cebadores adicionales, con 230 cebadores adicionales, con 240 cebadores adicionales, con 250 cebadores adicionales,
con 260 cebadores adicionales, con 270 cebadores adicionales, con 280 cebadores adicionales, con 290 cebadores adicionales, con 300 cebadores adicionales, con 310 cebadores adicionales, con 320 cebadores adicionales, con 330 cebadores adicionales, con 340 cebadores adicionales, con 350 cebadores adicionales,
con 360 cebadores adicionales, con 370 cebadores adicionales, con 380 cebadores adicionales, con 390 cebadores adicionales, con 400 cebadores adicionales, con 410 cebadores adicionales, con 420 cebadores adicionales, con 430 cebadores adicionales, con 440 cebadores adicionales, con 450 cebadores adicionales,
con 460 cebadores adicionales, con 470 cebadores adicionales, con 480 cebadores adicionales, con 490 cebadores adicionales, con 500 cebadores adicionales, con 550 cebadores adicionales, con 600 cebadores adicionales, con 650 cebadores adicionales, con 700 cebadores adicionales, con 750 cebadores adicionales,
con 800 cebadores adicionales, con 850 cebadores adicionales, con 900 cebadores adicionales, con 950 cebadores adicionales, con 1,000 cebadores adicionales, con 1,100 cebadores adicionales, con 1.200 cebadores adicionales, con 1.300 cebadores adicionales, con 1.400 cebadores adicionales, con 1.500 cebadores adicionales, con 1.600 cebadores adicionales, con 1.700 cebadores adicionales, con 1.800 cebadores adicionales, con 1.900 cebadores adicionales, con 2.000 cebadores adicionales, con 2.100 cebadores adicionales, con 2.200 cebadores adicionales, con 2.300 cebadores adicionales, con 2.400 cebadores adicionales, con 2.500 cebadores adicionales, con 2.600 cebadores adicionales, con 2.700 cebadores adicionales, con 2.800 cebadores adicionales, con 2.900 cebadores adicionales, con 3.000 cebadores adicionales, con 3.500 cebadores adicionales, o con 4.000 cebadores adicionales. Los cebadores adicionales pueden ser cebadores cooperativos adicionales, o pueden ser cebadores tradicionales (lineales).
Los cebadores descritos pueden tener uno o más nucleótidos modificados. Tales cebadores se denominan en el presente documento cebadores modificados. También se pueden usar cebadores quiméricos. Los cebadores quiméricos son cebadores que tienen al menos dos tipos de nucleótidos, tal como tanto desoxirribonucleótidos como ribonucleótidos, ribonucleótidos y nucleótidos modificados, dos o más tipos de nucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados, ribonucleótidos y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados, o desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y dos o más tipos diferentes de nucleótidos modificados. Una forma de cebador quimérico son los cebadores de ácido nucleico peptídico/ácido nucleico. Por ejemplo, los cebadores 5'-PNA-ADN-3' o 5'-PNA-ARN-3' se pueden usar para una invasión de hebra y una invasión de polimerización más eficientes. Otras formas de cebadores quiméricos son, por ejemplo, 5'-(2'-O-Metil) ARN-ARN-3' o 5'-(2'-O-Metil) ARN-ADN-3'.
Se conocen muchos nucleótidos modificados (análogos de nucleótidos) y se pueden usar en oligonucleótidos. Un análogo de nucleótido es un nucleótido que contiene algún tipo de modificación en cualquiera de las restos de base, azúcar o fosfato. Las modificaciones en el resto de base incluirían modificaciones naturales y sintéticas de A, C, G y T/U así como diferentes bases de purina o pirimidina, tales como uracil-5-ilo, hipoxantina-9-ilo (I) y 2-aminoadenin-9-ilo. Una base modificada incluye, pero no se limita a, 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados 6-metilo y otros alquílicos de adenina y guanina, derivados 2-propilo y otros alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquil, 8-hidroxil-adeninas y guaninas y otras 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil-uracilos y citosinas y otros 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Pueden encontrarse modificaciones de base adicionales, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 3,687,808, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991,30, 613, y Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, Antisense Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S. T. y Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993. Determinados análogos de nucleótidos, tales como pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. 5-metilcitosina pueden aumentar la estabilidad de formación de dúplex. Otras bases modificadas son aquellas que funcionan como bases universales. Las bases universales incluyen 3-nitropirrol y 5-nitroindol. Las bases universales sustituyen a las bases normales pero no tienen sesgo en el emparejamiento de bases. Es decir, las bases universales pueden emparejarse con cualquier otra base. Un cebador que tiene una o más bases universales no se considera que sea un cebador que tiene una secuencia específica.
Las modificaciones de base a menudo se pueden combinar, por ejemplo, con una modificación de azúcar, tal como 2'-O-metoxietilo, para lograr propiedades únicas, tales como una mayor estabilidad de dúplex. Existen numerosas patentes de los Estados Unidos tales como 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121, 5,596,091; 5,614,617; y 5,681,941, que detallan y describen una variedad de modificaciones de bases.
Los análogos de nucleótidos también pueden incluir modificaciones del resto de azúcar. Las modificaciones al resto de azúcar incluirían modificaciones naturales de la ribosa y la desoxirribosa así como modificaciones sintéticas. Las modificaciones de azúcar incluyen, pero no se limitan a, las siguientes modificaciones en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10, o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituidos o no sustituidos. Las modificaciones 2' del azúcar también incluyen, pero no se limitan a, -O[(CH2)n O]m CH3, -O(CH2)n OCH3, -O(CH2)n NH2, -O(CH2)n CH3, -O(CH2)n -ONH2, y -O(CH2)nON[(CH2)n CHa)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10.
Otras modificaciones en la posición 2' incluyen, pero no se limitan a: alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH<3>, ONO2, NO2, N<3>, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el azúcar, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en oligonucleótidos unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido 5' terminal. Los azúcares modificados también incluirían aquellos que contienen modificaciones en el oxígeno del anillo puente, tales como CH2 y S. Los análogos de azúcar de nucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Hay numerosas patentes de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas tales como 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920.
Los análogos de nucleótidos también se pueden modificar en el resto fosfato. Los restos de fosfato modificados incluyen, pero no se limitan a, aquellos que pueden modificarse de modo que el enlace entre dos nucleótidos contenga un fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, metil- y otros alquilfosfonatos, incluidos 3'-alquilenfosfonato y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos. Se entiende que estos enlaces fosfato o fosfato modificado entre dos nucleótidos pueden ser a través de un enlace 3'-5' o un enlace 2'-5', y el enlace puede contener polaridad invertida tal como 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre. Numerosas patentes de Estados Unidos enseñan cómo preparar y usar nucleótidos que contienen fosfatos modificados e incluyen, pero no se limitan a, 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; y 5,625,050.
Se entiende que los análogos de nucleótidos solo necesitan contener una única modificación, pero también pueden contener múltiples modificaciones dentro de uno de los restos o entre diferentes restos.
Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que tienen propiedades funcionales similares a los nucleótidos, pero que no contienen un resto fosfato, tal como ácido nucleico peptídico (PNA). Los sustitutos de nucleótidos son moléculas que reconocerán e hibridarán con ácidos nucleicos complementarios de una manera Watson-Crick o Hoogsteen, pero que están unidos entre sí a través de un resto distinto de un resto fosfato. Los sustitutos de nucleótidos son capaces de conformarse en una estructura de tipo de doble hélice cuando interaccionan con las moléculas de ácido nucleico apropiadas.
Los sustitutos de nucleótidos son nucleótidos o análogos nucleotídicos en los que se ha sustituido el resto fosfato y/o restos azúcar. Los sustitutos de nucleótidos no contienen un átomo de fósforo estándar. Los sustitutos para el fosfato pueden ser, por ejemplo, enlaces internucleósidos de cicloalquilo o alquilo de cadena corta, enlaces internucleósidos de cicloalquilo o de heteroátomo y alquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleósidos heterocíclicos o heteroatómicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos. Numerosas patentes de los Estados Unidos describen cómo preparar y usar estos tipos de sustitutos de fosfato e incluyen, pero no se limitan a 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439.
También se entiende en un sustituto de nucleótido que se pueden reemplazar tanto los restos azúcar como fosfato del nucleótido, por ejemplo, por un enlace de tipo amida (aminoetilglicina) (PNA). Las patentes de los Estados Unidos 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262 enseñan como preparar y usar moléculas de PNA , (Véase también Nielsen et al.,Science254:1497-1500 (1991)).
Los cebadores pueden comprender nucleótidos y pueden estar compuestos por diferentes tipos de nucleótidos o el mismo tipo de nucleótidos. Por ejemplo, uno o más de los nucleótidos en un cebador pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metil-ribonucleótidos, o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil-ribonucleótidos; de aproximadamente 10% a aproximadamente 50% de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metilribonucleótidos, o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil-ribonucleótidos; aproximadamente 50% o más de los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, 2'-O-metil-ribonucleótidos, o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil-ribonucleótidos; o todos los nucleótidos son ribonucleótidos, 2'-O-metil-ribonucleótidos, o una mezcla de ribonucleótidos y 2'-O-metil-ribonucleótidos. Los nucleótidos pueden estar compuestos por bases (es decir, la parte de base del nucleótido) y pueden comprender (y normalmente comprenderán) diferentes tipos de bases.
Diseño de la secuencia de captura
La secuencia de captura, también denominada en el presente documento como la "segunda secuencia de ácido nucleico", es complementaria del molde de modo que hibrida con la molécula de ácido nucleico diana secuencia abajo del extremo 3' del cebador. En algunas realizaciones, se desea resistencia a mutaciones en el ácido nucleico diana y la secuencia de captura se diseña con una temperatura de fusión mayor que la temperatura de reacción. En estas realizaciones, la secuencia de captura está diseñada con una Tm aislada de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más grados por encima de la temperatura de reacción. Por ejemplo, la secuencia de captura, o segunda secuencia, está entre aproximadamente 0°C y 40°C, entre aproximadamente 5°C y 30°C, entre aproximadamente 7°C y 25°C por encima de la temperatura de reacción. En algunas realizaciones, la temperatura de fusión prevista de la secuencia de captura también se hace para mutantes esperados. En estas realizaciones, la Tm aislada de la secuencia de captura para los mutantes esperados está entre aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, o más grados C por debajo de la temperatura de reacción, o 10, 11, 12, 13, 14,1 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50 o más grados C por encima de la temperatura de reacción. Por ejemplo, puede estar 10°C por debajo de la temperatura de reacción y 30°C por encima de la temperatura de reacción, entre aproximadamente 3°C por debajo de la temperatura de reacción y aproximadamente 10°C por encima de la temperatura de reacción.
Para lograr estas temperaturas de fusión, la longitud de la secuencia de captura puede ser de 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 o 75 o más bases de longitud. Por ejemplo, puede estar entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50, entre aproximadamente 22 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 23 y aproximadamente 37 bases.
En algunas realizaciones, se desea una resistencia aún mayor a las mutaciones en la secuencia diana. En estas realizaciones, además de una secuencia de captura con una Tm aislada de entre aproximadamente 0°C y 40°C por encima de la temperatura de reacción, el cebador cooperativo está diseñado con una Tm aislada de entre aproximadamente 7°C por debajo y aproximadamente 20°C por encima, entre aproximadamente 5°C por debajo y aproximadamente 10°C por encima, entre aproximadamente 3°C por debajo y aproximadamente 3°C por encima de la temperatura de reacción. La interacción cooperativa entre el cebador y la secuencia de captura dará como resultado una Tm incluso más eficaz para el cebador cooperativo, haciéndolo casi insensible a las mutaciones en la secuencia. En comparación, un cebador normal podría tener que tener de 5 a 30 bases adicionales de longitud para tener una resistencia equivalente a las mutaciones en la secuencia diana, y en consecuencia, sería mucho más susceptible a la formación de dímeros de cebadores.
En otras realizaciones, se prefiere una mayor resistencia a los dímeros de cebadores y la temperatura de fusión de la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, aislada se diseña para ser menor que la temperatura de reacción. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más grados por debajo de la temperatura de reacción, o fase de reasociación, de la PCR. En realizaciones preferidas, la Tm de la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, aislada está entre aproximadamente 0°C y 12°C, entre aproximadamente 1°C y 8°C, entre aproximadamente 2°C y 5°C por debajo de la temperatura de reacción. Para conseguir estas bajas temperaturas de fusión, la longitud de la secuencia de captura puede ser de 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más bases de longitud. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de captura, o segunda secuencia, puede estar entre aproximadamente 5 y 30, entre aproximadamente 8 y 25, y entre aproximadamente 10 y 22 bases.
En algunas realizaciones, la secuencia de captura se une y libera la secuencia diana rápidamente de manera que la polimerasa puede extenderse por debajo de la secuencia de captura, dejando la secuencia de captura intacta. En algunas realizaciones, esto se mejora usando un cebador cooperativo con el enlazador unido al extremo 5' de la secuencia de captura. En una realización preferida, la polimerasa es capaz de escindir la secuencia de captura durante la extensión. En una realización preferida, esto se mejora usando un cebador cooperativo con el enlazador unido al extremo 3' de la secuencia de captura.
Enlazador
El número de bases entre el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, o cebador, y el extremo 5' del segundo ácido nucleico, o ubicaciones de hibridación de la secuencia de captura en el molde es importante. En algunas realizaciones, el número de bases entre el cebador y la secuencia de captura es 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50. Por ejemplo, pueden ser entre aproximadamente 0 y 30, entre aproximadamente 0 y 20, entre aproximadamente 0 y 10 bases.
Cuantas más bases haya entre los dos sitios, más largo deberá ser el enlazador si se desea la escisión de la secuencia de captura. Cuanto más largo es el enlazador, más entropía entra en el sistema, lo que reduce el efecto de la unión cooperativa. Esto se expresa en la siguiente ecuación:
Ke f —Kcebador<+>Kcaptura<+>LcKcebadorKcaptura
Donde Kef es la constante de equilibrio efectiva o cooperativa, Kcebador es la constante de equilibrio del cebador en aislamiento, Kcaptura es la constante de equilibrio de la secuencia de captura en equilibrio y Lc es la concentración local definida como:
Donde r es la longitud del enlazador en decímetros. Esto proporciona la concentración local efectiva en molaridad debida a la interacción cooperativa entre el cebador y la sonda. Por consiguiente, la longitud del enlazador determina directamente la contribución cooperativa (LcKcebadorKcaptura) a la constante de equilibrio efectiva.
La Kcebador y Kcaptura se pueden calcular obteniendo los valores de entalpía y entropía para las secuencias de cebador y captura usando cálculos del vecino más cercano u otros conocidos por los expertos en la técnica.
La cantidad total de molde unida por el cebador se puede calcular como sigue:
Donde Tcebador es el molde unido por el cebador, To es la cantidad total de molde y Po es la concentración de cebador cooperativo de partida. Se puede ver que el mayor efecto cooperativo es cuando LcKcebadorKcaptura es mucho mayor que Kcebador. Para que esto ocurra, la longitud del enlazador debe ser lo más corta posible.
Aunque las matemáticas muestran que la longitud del enlazador debe ser tan corta como sea posible, hay varias limitaciones a cómo de corto que puede ser realmente el enlazador. Cuando la secuencia de captura y la sonda se unen al molde, forman dobles hélices rígidas. La longitud del enlazador debe ser suficiente para acomodar esta estructura.
En algunas realizaciones, el enlazador une el extremo 5' del cebador al extremo 3' de la secuencia de captura (Figuras 1-3, 6, 7, 9, 10, 12 y 13). En esta realización, el enlazador es mayor que la longitud combinada de las secuencias del cebador y de captura. En una realización preferida donde el enlazador se une al extremo 3' de la secuencia de captura, el enlazador comprende 6 hexaetilenglicoles. En otra realización, el cebador se invierte de manera que el extremo 5' del cebador se une al extremo 5' de la secuencia de captura. En esta realización, el enlazador es más largo que el cebador. En una realización preferida donde el enlazador se une al extremo 5' de la secuencia de captura, el enlazador comprende 3 hexaetilenglicoles. En otra realización más, el extremo 3' de la secuencia de captura se une a la parte media del cebador. En este caso, el enlazador puede ser más corto que la longitud del cebador. En otras realizaciones, el enlazador puede ser más corto que el descrito anteriormente debido a la flexibilidad del molde monocatenario (Figura 8). En una realización de este tipo, se entiende que las Figuras 1-3, 6, 7, 9, 10, 12 y 13 no están dibujadas "a escala". Específicamente, el enlazador en las figuras se muestra que es más largo con respecto a las longitudes de las secuencias de cebado y captura de lo que sería en la aplicación.
Los expertos en la técnica conocen una variedad de tipos y composiciones de enlazadores. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de polietilenglicol y carbono. Los enlazadores se pueden unir a través de una variedad de métodos, que incluyen, pero no se limitan a, enlaces covalentes, enlaces iónicos, enlace de hidrógeno, asociación polar, asociación magnética y asociación de Van der Wals. Un método preferido es la unión covalente a través de métodos de síntesis de ADN convencionales.
La longitud de los enlazadores de polietilenglicol es de aproximadamente 0,34 nm por monómero. En algunas realizaciones, la longitud del enlazador de polietilenglicol está entre aproximadamente 1 y 90, entre aproximadamente 2 y 50, entre aproximadamente 3 y 30 monómeros (entre aproximadamente 1 y 10 nm completamente extendido).
Uso de un cebador con un mecanismo de detección incorporado
En algunas realizaciones, el cebador tiene un mecanismo de detección incorporado. En algunas realizaciones, el mecanismo de detección incluye uno o más marcadores detectables. En una realización preferida, el mecanismo de detección incluye un par FRET. Ejemplos de cebadores con mecanismos de detección incorporados incluyen, pero no se limitan a, cebadores Amplifluor, cebadores Rapid Detex, y otros conocidos por los expertos en la técnica.
Los ácidos nucleicos cooperativos con mecanismos de detección incorporados pueden ser más útiles para los diseñadores de ensayos que los ácidos nucleicos no cooperativos (cebadores normales) con mecanismos de detección incorporados. Sin estar limitados por la teoría, esto se debe a que los ácidos nucleicos cooperativos son menos propensos a generar señales de productos no específicos, tales como dímeros de cebadores.
En algunas realizaciones, se usa un colorante de unión a ácido nucleico, tal como SYBR Green o EvaGreen, para vigilar el progreso de la reacción de amplificación.
Las sondas de cambio fluorescente y los cebadores de cambio fluorescente se refieren a todas las sondas y cebadores que implican un cambio en la intensidad de fluorescencia o longitud de onda basado en un cambio en la forma o conformación de la sonda o cebador y el ácido nucleico que se va a detectar, ensayar o replicar. Los ejemplos de sondas y cebadores de cambio fluorescente incluyen balizas moleculares, Amplifluors, sondas FRET, sondas FRET escindibles, sondas TaqMan, cebadores Scorpion, oligos tríplex fluorescentes, polímeros conjugados solubles en agua fluorescentes, sondas de PNA y sondas de QPNA.
Las sondas y cebadores de cambio fluorescente pueden clasificarse de acuerdo con su estructura y/o función. Las sondas de cambio fluorescente incluyen sondas atenuadas por horquilla, sondas atenuadas por escisión, sondas activadas por escisión y sondas fluorescentes activadas. Los cebadores de cambio fluorescente incluyen cebadores atenuados por tallo y cebadores atenuados por horquilla. El uso de varios tipos de sondas y cebadores de cambio fluorescentes se revisan en Schweitzer y Kingsmore,Curr. Opin. Biotech.12:21-27 (2001). Hall et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA97:8272-8277 (2000), describen el uso de sondas de cambio fluorescentes con ensayos Invader.
Las sondas atenuadas por horquilla son sondas que cuando no se unen a una secuencia diana forman una estructura de horquilla (y, típicamente, un bucle) que acerca un marcador fluorescente y un resto de atenuación de manera que se atenúa la fluorescencia del marcador. Cuando la sonda se une a una secuencia diana, el tallo se altera, el resto de atenuación ya no está cerca del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia. Ejemplos de sondas atenuadas por horquilla son las balizas moleculares, los oligos tríplex fluorescentes y las sondas de QPNA.
Las sondas activadas por escisión son sondas en las que la fluorescencia aumenta por escisión de la sonda. Las sondas activadas por escisión pueden incluir un marcador fluorescente y un resto de atenuación cercano de manera que se atenúa la fluorescencia del marcador. Cuando la sonda se corta o se digiere (típicamente por la actividad de exonucleasa 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto de atenuación ya no está cerca del marcador fluorescente y la fluorescencia aumenta. Las sondas TaqMan (Holland et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:7276-7280 (1991)) son un ejemplo de sondas activadas por escisión.
Las sondas atenuadas por escisión son sondas donde la fluorescencia disminuye o se altera por escisión de la sonda. Las sondas atenuadas por escisión pueden incluir un marcador fluorescente aceptor y un resto donador de manera que, cuando el aceptor y el donador están cerca, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia del donador al aceptor provoca que el aceptor produzca fluorescencia. Por lo tanto, las sondas son fluorescentes, por ejemplo, cuando se hibridan con una secuencia diana. Cuando la sonda se corta o digiere (típicamente por la actividad de exonucleasa 5'-3' de una polimerasa durante la amplificación), el resto donador ya no está cerca del marcador fluorescente aceptor y la fluorescencia del aceptor disminuye. Si el resto donador es en sí mismo un marcador fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (típicamente a una longitud de onda diferente que la fluorescencia del aceptor) cuando no está cerca de un aceptor. El efecto global sería entonces una reducción de la fluorescencia del aceptor y un aumento de la fluorescencia del donador. La fluorescencia del donador en el caso de sondas atenuadas por escisión es equivalente a la fluorescencia generada por las sondas activadas por escisión, siendo el aceptor el resto de atenuación y siendo el donador el marcador fluorescente. Las sondas FRET escindibles (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) son un ejemplo de sondas atenuadas por escisión.
Las sondas activadas fluorescentes son sondas o pares de sondas donde la fluorescencia incrementa o se altera por hibridación de la sonda con una secuencia diana. Las sondas activadas fluorescentes pueden incluir un marcador fluorescente aceptor y un resto donador de manera que, cuando el aceptor y el donador están cerca (cuando las sondas se hibridan con una secuencia diana), la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del donador al aceptor provoca que el aceptor produzca fluorescencia. Las sondas activadas fluorescentes son típicamente pares de sondas diseñadas para hibridar con secuencias adyacentes de manera que el aceptor y el donador se acercan. Las sondas activadas fluorescentes también pueden ser sondas individuales que contienen tanto un donador como un aceptor donde, cuando la sonda no está hibridada con una secuencia diana, el donador y el aceptor no están cerca, pero donde el donador y el aceptor se acercan cuando la sonda se hibrida con una secuencia diana. Esto se puede lograr, por ejemplo, poniendo el donador y el aceptor en extremos opuestos de la sonda y poniendo secuencias de complemento diana en cada extremo de la sonda donde las secuencias de complemento diana son complementarias de las secuencias adyacentes en una secuencia diana. Si el resto donador de una sonda fluorescente activada es en sí mismo un marcador fluorescente, puede liberar energía como fluorescencia (típicamente a una longitud de onda diferente que la fluorescencia del aceptor) cuando no está cerca de un aceptor (es decir, cuando las sondas no están hibridadas con la secuencia diana). Cuando las sondas hibridan con una secuencia diana, el efecto global sería entonces una reducción de la fluorescencia del donador y un aumento de la fluorescencia del aceptor. Las sondas FRET son un ejemplo de sondas activadas fluorescentes.
Los cebadores atenuados por tallo son cebadores que cuando no están hibridados con una secuencia complementaria forman una estructura de tallo (ya sea una estructura de tallo intramolecular o una estructura de tallo intermolecular) que acerca un marcador fluorescente y un resto de atenuación de manera que se atenúa la fluorescencia del marcador. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, el tallo se altera, el resto de atenuación ya no está cerca del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia. En el método descrito, los cebadores atenuados por tallo se usan como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y por lo tanto quedan incorporados en el ácido nucleico sintetizado o amplificado. Ejemplos de cebadores atenuados por tallo son cebadores atenuados por ácido nucleico peptídico y cebadores atenuados por horquilla.
Los cebadores atenuados por ácido nucleico peptídico son cebadores asociados con un atenuador de ácido nucleico peptídico o un flúor de ácido nucleico peptídico para formar una estructura de tallo. El cebador contiene un marcador fluorescente o un resto de atenuación y está asociado con un atenuador de ácido nucleico peptídico o un flúor de ácido nucleico peptídico, respectivamente. Esto pone el marcador fluorescente cerca del resto de atenuación. Cuando se replica el cebador, el ácido nucleico peptídico se desplaza, permitiendo así que el marcador fluorescente produzca una señal fluorescente.
Los cebadores atenuados por horquilla son cebadores que cuando no están hibridados a una secuencia complementaria forman una estructura de horquilla (y, típicamente, un bucle) que acerca un marcador fluorescente y un resto de atenuación de manera que se atenúa la fluorescencia del marcador. Cuando el cebador se une a una secuencia complementaria, el tallo se altera, el resto de atenuación ya no está cerca del marcador fluorescente y aumenta la fluorescencia. Los cebadores atenuados por horquilla se usan típicamente como cebadores para la síntesis de ácido nucleico y por lo tanto quedan incorporados en el ácido nucleico sintetizado o amplificado. Ejemplos de cebadores atenuados por horquilla son cebadores Amplifluor (Nazerenko et al.,Nucleic Acids Res.25:2516-2521 (1997)) y los cebadores Scorpion (Thelwell et al.,Nucleic Acids Res.28(19):3752-3761 (2000)).
Los cebadores activados por escisión son similares a las sondas activadas por escisión excepto que son cebadores que se incorporan en cadenas replicadas y luego se escinden posteriormente. Little et al.,Clin. Chem.45:777-784 (1999), describen el uso de cebadores activados por escisión.
Multiplexado con ARMS
En algunas realizaciones, se desea la detección de polimorfismos múltiples, inserciones, deleciones u otras mutaciones. En algunas realizaciones, el cebador está diseñado de manera que la base en el extremo 3' está sobre la mutación. En algunas realizaciones, se diseñan polimorfismos intencionados adicionales en el cebador. En una realización, la presencia de una sonda unida al cebador permite la detección específica de alelo en tiempo real de polimorfismos múltiples en la misma ubicación.
Diferenciación de mutaciones con la sonda
En algunas realizaciones, la diferenciación de polimorfismos se realiza usando la secuencia de captura unida al cebador. En algunas realizaciones, la secuencia de captura tiene mutaciones adicionales añadidas intencionadamente para mejorar la diferenciación. En algunas realizaciones, la secuencia de captura no se unirá cuando esté presente un polimorfismo, evitando la amplificación eficiente ronda tras ronda. En algunas realizaciones donde la secuencia de captura tiene un marcador detectable, incluso si se produce alguna amplificación, la secuencia de captura no se une lo suficiente para generar una señal detectable.
ARN y otras reacciones
En algunas realizaciones, se usa una polimerasa distinta de una ADN polimerasa. Los expertos en la técnica conocen una variedad de polimerasas y enzimas capaces de añadir una o más bases a un molde de ácido nucleico. En algunas realizaciones, se desea la transcripción inversa. En algunas realizaciones, la sonda tiene una temperatura de fusión suficientemente baja de modo que la polimerasa puede extenderse por debajo de ella. En otras realizaciones, un aumento en la temperatura después de un tiempo para la polimerización inicial elimina la secuencia de captura del molde, permitiendo que la polimerasa se extienda. En otras realizaciones, se usan secuencias de cebador adicionales que no tienen una secuencia de captura, permitiendo que la polimerasa haga copias de una manera sin restricciones a temperaturas de reacción más bajas.
Moléculas de ácido nucleico diana
Las moléculas de ácido nucleico, que son el objeto de amplificación, pueden ser cualquier ácido nucleico de cualquier fuente. En general, el método descrito se realiza usando una muestra de ácido nucleico que contiene (o se sospecha que contiene) moléculas de ácido nucleico a amplificar.
Una muestra de ácido nucleico puede ser cualquier muestra de ácido nucleico de interés. Se conocen la fuente, identidad y preparación de muchas de tales muestras de ácido nucleico. Se prefiere que las muestras de ácido nucleico conocidas o identificadas para usar en métodos de amplificación o detección se utilicen para el método descrito en el presente documento. La muestra de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una muestra de ácido nucleico de una o más células, tejido o fluidos corporales tales como sangre, orina, semen, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo o líquido amniótico, u otras muestras biológicas, tales como células de cultivo de tejido, hisopos bucales, enjuagues bucales, heces, cortes de tejidos, biopsia por aspiración y muestras arqueológicas tales como hueso o tejido momificado. Los tipos de muestras de ácidos nucleicos útiles incluyen muestras de sangre, muestras de orina, muestras de semen, muestras de líquido linfático, muestras de líquido cefalorraquídeo, muestras de líquido amniótico, muestras de biopsia, muestras de biopsia por aspiración con aguja, muestras de cáncer, muestras de tumor, muestras de tejido, muestras de células, muestras de lisado celular, muestras de lisado celular bruto, muestras forenses, muestras arqueológicas, muestras de infección, muestras de infección nosocomial, muestras de producción, muestras de preparación de fármacos, muestras de producción de moléculas biológicas, muestras de preparación de proteínas, muestras de preparación de lípidos y/o muestras de preparación de carbohidratos.
Para la amplificación del genoma completo, las muestras de ácido nucleico preferidas son muestras de ácido nucleico de una sola célula. Las muestras de ácido nucleico para usar en el método descrito son preferiblemente moléculas de ácido nucleico y muestras que son complejas y no repetitivas. Cuando la muestra de ácido nucleico es una muestra de ácido nucleico genómico, el genoma puede ser el genoma de cualquier organismo de interés. Por ejemplo, el genoma puede ser un genoma viral, un genoma bacteriano, un genoma eubacteriano, un genoma bacteriano de arqueas, un genoma fúngico, un genoma microbiano, un genoma eucariota, un genoma de planta, un genoma animal, un genoma de vertebrado, un genoma de invertebrado, un genoma de insecto, un genoma de mamífero o un genoma humano. El genoma diana es preferiblemente puro o sustancialmente puro, pero esto no es necesario. Por ejemplo, una muestra genómica de una fuente animal puede incluir ácido nucleico de organismos contaminantes o infecciosos.
La muestra de ácido nucleico puede ser, o puede derivar de, por ejemplo, uno o más genomas completos del mismo o de diferentes organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más genomas parciales del mismo o de diferentes organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas completos del mismo o de diferentes organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas parciales del mismo o de diferentes organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más fragmentos de cromosoma del mismo o de diferentes organismos, tejidos, células o una combinación; uno o más cromosomas artificiales; uno o más cromosomas artificiales de levadura; uno o más cromosomas artificiales bacterianos; uno o más cósmidos; o cualquier combinación de estos.
Síntesis de oligonucleótidos
Se pueden sintetizar cebadores, sondas de detección, sondas de dirección y cualquier otro oligonucleótido usando métodos de síntesis de oligonucleótidos establecidos. Los métodos para producir o sintetizar oligonucleótidos son bien conocidos en la técnica. Tales métodos pueden variar desde la digestión enzimática convencional seguida por el aislamiento de fragmentos de nucleótidos (véase, por ejemplo, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2a edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989) Capítulos 5, 6) hasta los métodos puramente sintéticos, por ejemplo, mediante el método de cianoetil-fosforamidita. La síntesis química en fase sólida de fragmentos de ADN se realiza rutinariamente usando cianoetil-fosforamiditas de nucleósidos protegidos (S. L. Beaucage et al. (1981)Tetrahedron Lett.
22:1859). En este enfoque, el grupo 3'-hidroxilo de un nucleósido 5'-protegido inicial se une primero covalentemente al soporte polimérico (R. C. Pless et al. (1975)Nucleic Acids Res.2:773 (1975)). La síntesis del oligonucleótido procede entonces por desprotección del grupo 5'-hidroxilo del nucleósido unido, seguido por el acoplamiento de un nucleósido-3'-fosforamidita entrante con el grupo hidroxilo desprotegido (M. D. Matteucci et al. (1981)J. Am. Chem. Soc.103:3185). El triéster de fosfito resultante finalmente se oxida a un fosforotriéster para completar el enlace internucleótidos (R. L. Letsinger et al. (1976)J. Am. Chem. Soc.
9:3655). Alternativamente, la síntesis de enlaces fosforotioato se puede llevar a cabo por sulfuración del triéster de fosfito. Se pueden usar varios productos químicos para realizar esta reacción, entre ellos el 1,1 -dióxido de 3H-1,2-benzoditiol-3-ona, (R.P. lyer, W. Egan, J.B. Regan, y S.L. Beaucage,J. Am. Chem. Soc.,1990, 112, 1253-1254). Las etapas de desprotección, acoplamiento y oxidación se repiten hasta que se obtiene un oligonucleótido de la longitud y secuencia deseadas. Existen otros métodos para generar oligonucleótidos tales como el método de H-fosfonato (Hall et al., (1957)J. Chem. Soc.,3291-3296) o el método de fosfotriéster como se describe por Ikuta et al.,Ann. Rev. Biochem.53:323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster y fosfito-triéster), y Narang et al.,Methods Enzymol.,65:610-620 (1980), (método de fosfotriéster). Las moléculas de ácido nucleico de proteína se pueden preparar usando métodos conocidos tales como los descritos por Nielsen et al.,Bioconjug. Chem.5:3-7 (1994). Otras formas de síntesis de oligonucleótidos se describen en las patentes de EE. UU. N.° 6,294,664 y EE. UU. N.° 6,291,669.
La secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido generalmente se determina por el orden secuencial en el que se añaden subunidades de bloques de subunidades a la cadena de oligonucleótidos durante la síntesis. Cada ronda de adición puede implicar un precursor de nucleótido específico diferente, o una mezcla de uno o más precursores de nucleótido diferentes. Para los cebadores descritos de secuencia específica, se añadirían secuencialmente precursores nucleotídicos específicos.
Muchos de los oligonucleótidos descritos en el presente documento están diseñados para ser complementarios de ciertas porciones de otros oligonucleótidos o ácidos nucleicos de manera que se pueden formar híbridos estables entre ellos. La estabilidad de estos híbridos se puede calcular usando métodos conocidos tales como los descritos en Lesnick y Freier,Biochemistry34:10807-10815 (1995), McGraw et al.,Biotechniques8:674-678 (1990), y Rychlik et al.,Nucleic Acids Res.18:6409-6412 (1990).
Siempre que se mantenga su función relevante, los cebadores, sondas de detección, sondas de dirección y cualquier otro oligonucleótido pueden estar compuestos por o incluir nucleótidos modificados (análogos de nucleótidos). Muchos nucleótidos modificados son conocidos y se pueden usar en oligonucleótidos, y se describen en otra parte del presente documento.
Kits
Los materiales descritos anteriormente, así como otros materiales, pueden envasarse juntos en cualquier combinación adecuada como un kit útil para llevar a cabo, o ayudar a llevar a cabo el método descrito. Es útil si los componentes del kit en un kit dado están diseñados y adaptados para usarse juntos en el método descrito. Por ejemplo, se describen kits para la amplificación de muestras de ácido nucleico, comprendiendo el kit ácidos nucleicos cooperativos y una ADN polimerasa. Los kits también pueden contener nucleótidos, tampones, sondas de detección, sondas de cambio fluorescente, soluciones de lisis, soluciones de estabilización, soluciones de desnaturalización, o una combinación.
Usos
El método y las composiciones descritas son aplicables a numerosas áreas que incluyen, pero no se limitan a, análisis de ácidos nucleicos presentes en células (por ejemplo, análisis de ADN genómico en células), detección de enfermedades, detección de mutaciones, descubrimiento de genes, mapeo de genes (haplotipado molecular), e investigación agrícola. Particularmente útil es la amplificación del genoma completo. Otros usos incluyen, por ejemplo, la detección de ácidos nucleicos en células y en matrices de ADN genómico; haplotipado molecular; detección de mutaciones; detección de enfermedades hereditarias tales como fibrosis quística, distrofia muscular, diabetes, hemofilia, anemia de células falciformes; evaluación de la predisposición para cánceres tales como cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer pancreático.
Amplificación
Los métodos de amplificación adecuados para su uso con los presentes métodos incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR de transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), sistema de amplificación basado en transcripción (TAS), reacción de amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), replicación de secuencia autosostenida (3SR), reacción de amplificación por desplazamiento de hebra (SDA), amplificación de ADN boomerang (BDA), replicación Q-beta: o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico isotérmica. Estos métodos de amplificación se describen cada uno brevemente a continuación y son bien conocidos en la técnica.
La PCR es una técnica para hacer muchas copias de una secuencia de ADN molde específica. La reacción consiste en múltiples ciclos de amplificación y se inicia utilizando un par de oligonucleótidos cebadores que hibridan con los extremos 5' y 3' de la secuencia a copiar. El ciclo de amplificación incluye una desnaturalización inicial, y hasta 50 ciclos de reasociación, alargamiento (o extensión) de hebra y separación (desnaturalización) de hebra. En cada ciclo de la reacción, se copia la secuencia de ADN entre los cebadores. Los cebadores pueden unirse al ADN copiado así como a la secuencia molde original, de modo que el número total de copias aumenta exponencialmente con el tiempo. La PCR puede realizarse según Whelan, et al.,Journal of Clinical Microbiology,33(3):556-561 (1995). En resumen, una mezcla de reacción de PCR incluye dos cebadores específicos, dNTP, Taq polimerasa, y tampón de PCR 1X, que se amplifican usando un termociclador. Los parámetros de ciclo pueden variarse, dependiendo, por ejemplo, de la temperatura de fusión del cebador o de la longitud de los ácidos nucleicos que se van a extender. El experto en la técnica es capaz de diseñar y preparar cebadores que son apropiados para amplificar una secuencia objetivo. La longitud de los cebadores de amplificación para su uso en la presente invención depende de varios factores que incluyen la identidad de la secuencia de nucleótidos y la temperatura a la que estos ácidos nucleicos se hibridan o se usan durante la amplificaciónin vitrode los ácidos nucleicos. Las consideraciones necesarias para determinar una longitud preferida para un cebador de amplificación de una identidad de secuencia particular son bien conocidas por un experto en la técnica e incluyen consideraciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, la longitud de un ácido nucleico u oligonucleótido corto puede estar relacionada con su especificidad o selectividad de hibridación.
La PCR en tiempo real es un método de amplificación basado en PCR en el que los productos de la PCR se detectan en tiempo real, es decir, la acumulación de productos de PCR se puede determinar en cada ciclo. Un ejemplo de<p>C<r>en tiempo real se realiza usando sondas TaqMan en combinación con un amplificador/analizador adecuado tal como el sistema de detección de secuencias Applied Biosystems (ABI) Prism 7900HT, que es un sistema de PCR en tiempo real de alto rendimiento. En resumen, las sondas TaqMan específicas para la secuencia diana amplificada se incluyen en la reacción de amplificación por PCR. Estas sondas contienen un colorante indicador en el extremo 5' y un colorante atenuador en el extremo 3'. Las sondas que hibridan con diferentes secuencias diana se conjugan con un colorante indicador fluorescente diferente. De esta manera, se puede ensayar más de una secuencia diana en el mismo recipiente de reacción. Durante la PCR, las sondas marcadas fluorescentemente se unen específicamente a sus secuencias diana respectivas; la actividad de nucleasa 5' de la polimerasa Taq escinde el colorante indicador de la sonda y se genera una señal fluorescente. El incremento en la señal de fluorescencia se detecta solo si la secuencia diana es complementaria de la sonda y se amplifica durante la PCR. Un desajuste entre la sonda y la diana reduce en gran medida la eficiencia de la hibridación de la sonda y escisión. El sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700HT o 7900HT mide el aumento de fluorescencia durante el ciclo térmico de PCR, proporcionando detección en "tiempo real" de la acumulación de producto de la PCR. La detección en tiempo real en el detector de secuencias ABI Prism 7900HT o 7900HT vigila la fluorescencia y calcula Rn durante cada ciclo de PCR. El ciclo umbral, o valor Ct, es el ciclo en el que la fluorescencia se cruza con el valor umbral. El valor umbral se determina mediante el software del sistema de detección de secuencias o manualmente.
"RT-PCR" como se usa en el presente documento se refiere a la combinación de transcripción inversa y PCR en un solo ensayo. La "transcripción inversa" es un procedimiento mediante el cual un molde de ARN se transcribe en una molécula de ADN mediante una enzima transcriptasa inversa. Por lo tanto, la "transcriptasa inversa" describe una clase de polimerasas caracterizadas como ADN polimerasas dependientes de ARN, es decir, tales polimerasas usan un molde de ARN para sintetizar una molécula de ADN. Históricamente, se han usado transcriptasas inversas para la transcripción inversa de ARNm en ADNc. Sin embargo, las transcriptasas inversas se pueden usar para la transcripción inversa de otros tipos de ARN tales como ARN genómico viral o ARN subgenómico viral. Las transcriptasas inversas convencionales incluyen la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Maloney (MoMuLV RT) y el virus de la mioblastosis aviar (AMV). Estas enzimas tienen actividad de ADN polimerasa dependiente de ARN 5'->3', actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN 5'->3', y actividad de RNasa H. Sin embargo, a diferencia de muchas ADN polimerasas dependientes de ADN, estas enzimas carecen de actividad de exonucleasa 3'->5' necesaria para la "corrección de lectura" (es decir, corregir errores cometidos durante la transcripción). Después de que se ha preparado una copia de ADN de un ARN, la copia de ADN se puede someter a varios métodos de amplificación de ADN tales como la PCR.
La LCR es un método de amplificación de ADN similar a la PCR, excepto que utiliza cuatro cebadores en lugar de dos y utiliza la enzima ligasa para ligar o unir dos segmentos de ADN. La LCR puede realizarse según Moore et al.,Journal of Clinical Microbiology36(4)1028-1031 (1998). En resumen, una mezcla de reacción de LCR contiene dos pares de cebadores, dNTP, ADN ligasa y ADN polimerasa que representan aproximadamente 90 pl, a los que se añaden 100 pl de ácido nucleico aislado del organismo diana. La amplificación se realiza en un termociclador (p. ej., LCx de Abbott Labs, North Chicago, Ill.).
TAS es un sistema de amplificación de ácido nucleico en el que cada ciclo está compuesto por una etapa de síntesis de ADNc y una etapa de transcripción de ARN. En la etapa de síntesis de ADNc, una secuencia reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN (es decir, una secuencia de unión a polimerasa o PBS) se inserta en la copia de ADNc secuencia abajo de la secuencia diana o marcador que se va a amplificar usando un cebador de oligonucleótidos de dos dominios. En la segunda etapa, se usa una ARN polimerasa para sintetizar múltiples copias de ARN a partir del molde de ADNc. La amplificación usando TAS requiere solo unos pocos ciclos porque la transcripción de ARN dependiente de ADN puede dar como resultado 10-1000 copias por cada copia de molde de ADNc. El TAS se puede realizar de acuerdo con Kwoh et al.,PNAS86:1173-7 (1989). En resumen, el ARN extraído se combina con tampón de amplificación de TAS y albúmina de suero bovino, dNTP, NTP y dos cebadores oligonucleótidos, uno de los cuales contiene una PBS. La muestra se calienta para desnaturalizar el molde de ARN y se enfría a la temperatura de reasociación del cebador. Se añade transcriptasa inversa (RT) a la muestra incubada a la temperatura apropiada para permitir la elongación del ADNc. Posteriormente se añade la ARN polimerasa<t>7 y la muestra se incuba a 37°C durante aproximadamente 25 minutos para la síntesis de ARN. Los pasos anteriores se repiten a continuación. Alternativamente, después de la síntesis inicial de ADNc, se añaden tanto RT como ARN polimerasa después de una desnaturalización de 1 minuto a 100°C seguida de una elongación de ARN de aproximadamente 30 minutos a 37°C. El TAS también se puede realizar en fase sólida según Wylie et al.,Journal of Clinical Microbiology,36(12):3488-3491 (1998). En este método, las dianas de ácido nucleico se capturan con perlas magnéticas que contienen cebadores de captura específicos. Las perlas con dianas capturadas se lavan y sedimentan antes de añadir reactivos de amplificación que contienen cebadores de amplificación, dNTP, NTP, 2500 U de transcriptasa inversa y 2500 U de ARN polimerasa T7. Se ponen 100 j l de una mezcla de reacción de TMA en un tubo, se añaden 200 pl de reactivo de aceite y se logra la amplificación mediante incubación a 42°C en un baño de agua durante una hora.
La NASBA es un método de amplificación basado en transcripción que amplifica ARN a partir de una diana de ARN o ADN. La NASBA es un método utilizado para la amplificación continua de ácidos nucleicos en una sola mezcla a una temperatura. Por ejemplo, para la amplificación del ARN, se usan transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV), RNasa H y ARN polimerasa T7. Este método puede realizarse según Heim, et al.,Nucleic Acids Res.,26(9):2250-2251 (1998). En resumen, una mezcla de reacción de NASBA contiene dos cebadores específicos, dNTP, NTP, 6,4 U de transcriptasa inversa de AMV, 0,08 U de Rnasa H de Escherichia coli y 32 U de ARN polimerasa T7. La amplificación se lleva a cabo durante 120 min a 41°C en un volumen total de 20 l.
En un método relacionado, la reacción de replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación isotérmica de secuencias de ADN o ARN dianain vitrousa tres actividades enzimáticas: transcriptasa inversa, ARN polimerasa dependiente de ADN y ribonucleasa H de Escherichia coli. Este método puede modificarse de un sistema de 3 enzimas a un sistema de 2 enzimas usando transcriptasa inversa del virus de inmunodeficiencia humana (VIH)-1 en lugar de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) para permitir la amplificación con ARN polimerasa T7 pero sin ribonucleasa H de E. coli. En la 3SR de 2-enzimas, el ARN amplificado se obtiene en una forma más pura en comparación con la 3SR de 3-enzimas (Gebinoga y OehlenschlagerEuropean Journal of Biochemistry,235:256-261, 1996).
La SDA es un método de amplificación de ácido nucleico isotérmico. Un cebador que contiene un sitio de restricción se reasocia con el molde. Los cebadores de amplificación se reasocian a continuación con secuencias adyacentes 5' (formando una muesca) y la amplificación se inicia a una temperatura fija. Las hebras de ADN recién sintetizadas son cortadas por una enzima de restricción y la amplificación de polimerasa comienza de nuevo, desplazando las hebras recién sintetizadas. La SDA se puede realizar según Walker, et al.,PNAS,89:392-6 (1992). En resumen, una mezcla de reacción de SDA contiene cuatro cebadores de SDA, dGTP, dCTP, TTP, dATP, 150 U de Hinc II y 5 U del fragmento grande de ADN polimerasa I de E. coli deficiente en exonucleasa (exo.sup.-Klenow polimerasa). La mezcla de muestra se calienta a 95°C durante 4 minutos para desnaturalizar el ADN diana antes de la adición de las enzimas. Después de la adición de las dos enzimas, se lleva a cabo la amplificación durante 120 min a 37°C en un volumen total de 50 pl. A continuación, la reacción se termina calentando durante 2 minutos a 95°C.
La amplificación de ADN de boomerang (BDA) es un método en el que la polimerasa comienza la extensión desde un único sitio de unión de cebador y luego hace un bucle alrededor de la otra hebra, regresando finalmente al sitio de cebado original en el ADN. La BDA difiere de la PCR por el uso de un único cebador. Este método implica una digestión de endonucleasa de una muestra de ADN, que produce fragmentos de ADN discretos con extremos pegajosos, ligar los fragmentos a polinucleótidos "adaptadores" (compuestos de un extremo ligable y primera y segunda secuencias autocomplementarias separadas por una secuencia espaciadora) formando así dúplex ligados. Los dúplex ligados se desnaturalizan para formar moldes con los cuales se reasocia un cebador de oligonucleótido en una secuencia específica dentro de la secuencia diana o de marcador de interés. El cebador se extiende con una ADN polimerasa para formar productos dúplex seguido por la desnaturalización de los productos dúplex. Los ciclos múltiples posteriores de reasociación, extensión y desnaturalización se realizan para lograr el grado de amplificación deseado (patente de EE. UU. N° 5,470,724).
El sistema de replicación Q-beta usa ARN como molde. La replicasa Q-beta sintetiza el genoma de ARN monocatenario del colifago QI3. La escisión del ARN y ligado en un ácido nucleico de interés permite la replicación de esa secuencia cuando el ARN se replica mediante replicasa Q-beta (Kramer y LizardiTrends Biotechnol.1991 9(2):53-8, 1991).
Una variedad de enzimas de amplificación son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa, ARN polimerasa, transcriptasa inversa, replicasa Q-beta, ADN y ARN polimerasas termoestables. Debido a que estas y otras reacciones de amplificación son catalizadas por enzimas, en un ensayo de una sola etapa los reactivos de liberación de ácido nucleico y los reactivos de detección no deben ser inhibidores potenciales de las enzimas de amplificación si la detección final ha de basarse en la amplificación.
La amplificación de las moléculas de ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico puede dar como resultado la replicación de al menos 0,01% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 0,1% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 1% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 5% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 10% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 20% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico muestra, al menos 30% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 40% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 50% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 60% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 70% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 80% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 90% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 95% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 96% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 97% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, al menos 98% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico, o al menos 99% de las secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico.
Las diversas representaciones de secuencias descritas anteriormente y en otras partes del presente documento pueden ser, por ejemplo, para 1 secuencia diana, 2 secuencias diana, 3 secuencias diana, 4 secuencias diana, 5 secuencias diana, 6 secuencias diana, 7 secuencias diana, 8 secuencias diana, 9 secuencias diana secuencias, 10 secuencias diana, 11 secuencias diana, 12 secuencias diana, 13 secuencias diana, 14 secuencias diana, 15 secuencias diana, 16 secuencias diana, 17 secuencias diana, 18 secuencias diana, 19 secuencias diana, 20 secuencias diana, 25 secuencias diana, 30 secuencias diana, 40 secuencias diana, 50 secuencias diana, 75 secuencias diana o 100 secuencias diana. La representación de secuencias puede ser, por ejemplo, para al menos 1 secuencia diana, al menos 2 secuencias diana, al menos 3 secuencias diana, al menos 4 secuencias diana, al menos 5 secuencias diana, al menos 6 secuencias diana, al menos 7 secuencias diana secuencias, al menos 8 secuencias diana, al menos 9 secuencias diana, al menos 10 secuencias diana, al menos 11 secuencias diana, al menos 12 secuencias diana, al menos 13 secuencias diana, al menos 14 secuencias diana, al menos 15 secuencias diana, al menos 16 secuencias diana, al menos 17 secuencias diana, al menos 18 secuencias diana, al menos 19 secuencias diana, al menos 20 secuencias diana, al menos 25 secuencias diana, al menos 30 secuencias diana, al menos 40 secuencias diana, al menos 50 secuencias diana, al menos 75 secuencias diana o al menos 100 secuencias diana.
La representación de secuencias puede ser, por ejemplo, para 1 secuencia diana, 2 secuencias diana diferentes, 3 secuencias diana diferentes, 4 secuencias diana diferentes, 5 secuencias diana diferentes, 6 secuencias diana diferentes, 7 secuencias diana diferentes, 8 secuencias diana diferentes, 9 secuencias diana diferentes, 10 secuencias diana diferentes, 11 secuencias diana diferentes, 12 secuencias diana diferentes, 13 secuencias diana diferentes, 14 secuencias diana diferentes, 15 secuencias diana diferentes, 16 secuencias diana diferentes, 17 secuencias diana diferentes, 18 secuencias diana diferentes, 19 secuencias diana diferentes, 20 secuencias diana diferentes, 25 secuencias diana diferentes, 30 secuencias diana diferentes, 40 secuencias diana diferentes, 50 secuencias diana diferentes, 75 secuencias diana diferentes o 100 secuencias diana diferentes. La representación de secuencia puede ser, por ejemplo, para al menos 1 secuencia diana, al menos 2 secuencias diana diferentes, al menos 3 secuencias diana diferentes, al menos 4 secuencias diana diferentes, al menos 5 secuencias diana diferentes, al menos 6 secuencias diana diferentes, al menos 7 secuencias diana diferentes, al menos 8 secuencias diana diferentes, al menos 9 secuencias diana diferentes, al menos 10 secuencias diana diferentes, al menos 11 secuencias diana diferentes, al menos 12 secuencias diana diferentes, al menos 13 secuencias diana diferentes, al menos 14 secuencias diana diferentes, al menos 15 secuencias diana diferentes, al menos 16 secuencias diana diferentes, al menos 17 secuencias diana diferentes, al menos 18 secuencias diana diferentes, al menos 19 secuencias diana diferentes, al menos 20 secuencias diana diferentes, al menos 25 secuencias diana diferentes, al menos 30 secuencias diana diferentes, al menos 40 secuencias diana diferentes, al menos 50 secuencias diana diferentes, al menos 75 secuencias diana diferentes o al menos 100 secuencias diana diferentes.
Detección
Los productos de amplificación pueden detectarse usando cualquier técnica de detección de ácidos nucleicos. Para la detección en tiempo real, los productos de amplificación y el progreso de la amplificación se detectan durante la amplificación. La detección en tiempo real se logra de manera útil usando una o más, o una o una combinación de sondas de cambio fluorescente y cebadores de cambio fluorescente. Se pueden usar otras técnicas de detección, ya sea solas o en combinación con detección en tiempo real y/o detección que implica sondas y cebadores de cambio fluorescente. Se conocen muchas técnicas para detectar ácidos nucleicos. La secuencia de nucleótidos de las secuencias amplificadas también se puede determinar usando cualquier técnica adecuada.
Por ejemplo, el producto de ácido nucleico se puede detectar mediante cualquiera de una variedad de métodos bien conocidos, por ejemplo, electroforesis (p. ej., electroforesis en gel o electroforesis capilar). Los fragmentos amplificados pueden someterse a métodos adicionales para detectar, por ejemplo, secuencias variantes (p. ej., polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)). Un método de ejemplo es la extensión de cebador de un solo nucleótido (Lindblad-Toh et al., Large-Scale discovery and genotiping of single-nucleotide polymorphisms in the mouse.Nature Genet.Abril de 2000; 24(4):381-6). En esta reacción, un cebador oligonucleótido está diseñado para tener un extremo 3' que es un nucleótido 5' en un sitio de mutación específico. En algunas realizaciones, los cebadores de extensión se marcan con un marcador o un miembro de un par de unión para permitir la captura del cebador en fase sólida. En realizaciones particulares, los cebadores se pueden marcar con longitudes variables de polinucleótidos no específicos (p. ej., poli-GACT) para permitir la detección multiplexada de preferiblemente 2 o más, más preferiblemente 3 o más, 4 o más, 5 o más, incluso 10 o más mutaciones diferentes (polimorfismos) en una única reacción. El cebador hibrida con el amplicón de PCR en presencia de uno o más ddNTP marcados y una ADN polimerasa. La polimerasa extiende el cebador por un nucleótido, añadiendo un único ddNTP marcado al extremo 3' del cebador de extensión. La adición de un didesoxinucleótido termina la elongación de la cadena. Si se utiliza más de un didesoxinucleótido (p. ej., ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP, ddUTP, etc.) en una reacción, se pueden marcar uno o más. Si se usan múltiples marcadores, los marcadores pueden ser distinguibles, p. ej., cada uno está marcado con un colorante de color fluorescente diferente. Los productos son oligonucleótidos marcados, cada uno de los cuales puede detectarse basado en su marcador. Otros métodos para detectar secuencias variantes incluyen el sistema de genotipado SNP READIT (Promega Corporation, Madison Wis.) y ensayos de ligado de oligonucleótidos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cocebadores (Ácidos nucleicos cooperativos)
Se describe en el presente documento el uso de cocebadores para genotipado de mutaciones y SNP, principalmente para variantes de un solo nucleótido. Como los ensayos de genotipado se realizan a menudo como un múltiplex, el POC incluyó la evaluación de ensayos de genotipado basados en cocebador tanto en configuraciones monoplexada como multiplexada. También se evaluó el rendimiento de los ensayos de genotipado de cocebadores mientras se mezclaban y emparejaban en cualquier combinación.
Se consideraron varias posiciones candidatas, tanto en la secuencia de cebado como en la de captura. La colocación de desajuste bajo la secuencia de captura no produjo una diferenciación alélica muy consistente y este enfoque se abandonó pronto durante los experimentos de POC de los autores de la invención. Tres enfoques más prometedores implicaban situar el desajuste inducido por la variante bajo la secuencia de cebado. Estos tres escenarios se representan en la Figura 2.
Captura: Segunda secuencia de ácido nucleico de cocebador
Cuando se puso un desajuste inducido por variante bajo la secuencia de captura, los valores de dCt (que demuestran el poder de diferenciación de los cocebadores específicos de alelo) fueron muy variables, promediando a 8 ciclos con una desviación estándar de 4,8 ciclos (Figura 15; todos los desajustes están en minúsculas). En varios casos, los valores de Ct "coincidentes" (cocebador coincidente con WT que amplifica molde WT) fueron muy altos, lo que significa que la PCR fue muy ineficaz.
Cebado: Primera secuencia de ácido nucleico de cocebador
Se ensayó un gran número de diseños con desajuste inducido por variante bajo la secuencia de cebado. El desajuste se puso bajo la última base de la secuencia de cebado (en la Figura 14, marcada como "-1"), penúltima (-2) y antepenúltima (-3). También, el desajuste inducido por variante se combinó con uno o más desajustes adicionales (intencionados): último y penúltimo (-1 y -2), penúltimo y antepenúltimo (-2 y -3), y cualquiera de los anteriores (-1, -2, -3 etc.) con 3 o 4 desajustes adicionales puestos bajo el extremo 5' de la secuencia de cebado. La Figura 14 resume los resultados para todos los escenarios.
Con el desajuste inducido por variante bajo la última base de la secuencia de cebado (-1), se observó una muy buena diferenciación, con un valor de dCt promedio de 12 ciclos ± 2,8 (desviación estándar). Los valores de Ct coincidentes también fueron muy bajos, lo que indica que la PCR era de alta eficiencia.
En el desajuste inducido por variante situado bajo la penúltima base de la secuencia de cebado (-2), se observó muy buena diferenciación, con un valor de dCt promedio de 12 ciclos ± 2,4. Los valores de Ct coincidentes también fueron muy bajos, lo que indica que la PCR era de alta eficiencia.
Con el desajuste inducido por variante bajo la antepenúltima base de la secuencia de cebado (-3), se observó diferenciación intermedia, con un valor de dCt promedio de 9 ciclos ± 3,9 (SD). Los valores de Ct coincidentes también fueron muy bajos, lo que indica que la PCR presentaba alta eficiencia.
Cuando el desajuste inducido por variante se puso bajo la última base de la secuencia de cebado, y se puso desajuste adicional intencionadamente en la penúltima base (-1 y -2), se observaron valores de dCt modestos, mientras que los valores de Ct coincidentes fueron muy altos (<p>C<r>ineficiente).
El desajuste inducido por variantes en la penúltima base con desajuste adicional, intencionado en la antepenúltima base (-2 y -3) dio como resultado valores de Ct coincidentes altos (PCR ineficiente) y valores de dCt variables.
La adición de múltiples desajustes intencionados a los escenarios -1, -2, -2 y -3, -3, -3 y -4 dio como resultado una buena diferenciación alélica (valores de dCt), pero valores de Ct coincidentes altos/muy altos (PCR ineficiente).
Múltiples diseños de cocebadores para varias variantes mostraron que el escenario n.° 1 (desajuste inducido por variante en la penúltima base 3' de la secuencia de cebado, Figura 2D produce el poder discriminatorio más consistente (dCt; Figura 15).
Ejemplo 2: optimización de la longitud del hueco
Se investigó la influencia de la longitud del hueco en el poder discriminatorio de los cocebadores. Aunque no disminuye la eficacia de la PCR, una ausencia de hueco (ausencia de un hueco, 0 nucleótidos) mejora significativamente la especificidad alélica de los cocebadores (véase la Figura 3A-C).
Ejemplo 3: Evaluación de la eficacia de la PCR del ensayo de genotipado en monoplexado y multiplexado Los ensayos fueron comparativamente robustos se realizarán bien como un monoplexado, duplexado o cuadruplexado (con respecto al SNP; el doble que para el número de pares de cebadores en la reacción, ya que cada SNP requiere 2 cocebadores FWD y un REV). Para la evaluación de la robustez, Tabla 1.
Tabla 1: Eficiencia de monoplexado vs. multiplexado - moldes de ADN sintético para eficiencia de amplificación vs. evaluación de multiplexación
SNP 1 (T) cocebador marcado con FAM; concentración final 0,1 pM
SNP 1 (C) cocebador marcado con CAL Fluor Orange560; 0,1 pM
SNP 1 cocebador inv. común, sin marcar, 0,2 pM
SNP 2 (G) cocebador marcado con CAL Fluor Red610; 0,1 pM
SNP 2 (A) cocebador marcado con Quasar 670; 0,1 pM
SNP 2 cocebador inv. común, sin marcar, 0,2 pM
SNP 3 (G) cocebador no marcado 0,2 pM (doble de la concentración)*
SNP 3 cocebador inv.; 0,2 pM
SNP 4 (A) cocebador no marcado 0,2 pM (doble de la concentración)*
SNP 4 cocebador inv.; 0,2 pM
Condiciones de PCR:
Mezcla maestra 1XBHQ
95°C durante 15 min (activación de la polimerasa) 1 ciclo
95°C durante 15 segundos; 57°C durante 60 segundos 45 ciclos
Moldes de PCR:
SNP 1 molde de ADN de gBlock sintético heterocigoto en una concentració dne 3+03 copias/pl (final) SNP 2 molde de ADN de gBlock sintético heterocigoto en una concentració dne 3+03 copias/pl (final) SNP 3 molde de ADN de gBlock sintético homocigoto en una concentración de 3+03 copias/pl (final) SNP 4 molde de ADN de gBlock sintético homocigoto en una concentración de 3+03 copias/pl (final) *Solo cocebadores específicos del alelo G y el molde del alelo G estaban disponibles en ese momento **Solo cocebadores específicos del alelo A y el molde del alelo A estaban disponibles en ese momento Ejemplo 4: Evaluación del rendimiento del ensayo mientras se mezclan varios ensayos de SNP de forma multiplexada
La capacidad de "Mezcla y Coincidencia" es una característica muy importante de cualquier tecnología de genotipado de PCR. A continuación están los resultados de un Estudio de Mezcla y Coincidencia, que permitió obtener resultados de genotipado para 6 SNP, mezclados en todas las combinaciones posibles (que permiten fluoróforos). Los cocebadores (denominados en el presente documento ácidos nucleicos cooperativos o cebadores cooperativos) funcionan bien independientemente de cuál sea la combinación en cada PCR dúplex (y Figuras 5A-D).
Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar varias modificaciones y variaciones en la presente descripción sin apartarse del alcance de la invención. Otras modalidades de la descripción serán evidentes para los expertos en la técnica al considerar la memoria descriptiva y puesta en práctica de los métodos descritos en el presente documento. Se pretende que la memoria descriptiva y los ejemplos se consideren solamente como ilustrativos, indicándose el verdadero alcance de la invención en las siguientes reivindicaciones.
Claims (15)
1. Un método de síntesis de un ácido nucleico diana de forma preferente respecto a un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana, comprendiendo el método:
a. exponer una molécula de ácido nucleico cooperativa a una solución que se sospecha que comprende un ácido nucleico diana y que también comprende potencialmente un ácido nucleico con uno o más nucleótidos que difieren del ácido nucleico diana (ácido nucleico que difiere), en donde la molécula de ácido nucleico cooperativa comprende, de 3' a 5':
1. una primera secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico es complementaria de una primera región de un ácido nucleico diana, y además en donde un penúltimo nucleótido del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico es complementario del ácido nucleico diana, pero no es complementario del ácido nucleico que difiere, y además también en donde el primer ácido nucleico es extensible en el extremo 3';
ii. una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la segunda secuencia de ácido nucleico es complementaria de una segunda región del ácido nucleico diana, en donde la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana comienza en el espacio de un nucleótido o menos de la primera región del ácido nucleico diana, de manera que hibrida con el ácido nucleico diana secuencia abajo del extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico, o solapa en el extremo 5' con el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico;
iii. un enlazador que conecta dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico de una manera que permite que tanto la primera como la segunda secuencias de ácido nucleico se hibriden con el ácido nucleico diana al mismo tiempo;
b. proporcionar condiciones apropiadas para la síntesis de ácido nucleico en donde la polimerasa se extiende desde el extremo 3' de la primera secuencia de ácido nucleico a través de la segunda secuencia de ácido nucleico, sintetizando de este modo el ácido nucleico diana de forma preferente al ácido nucleico que difiere si está presente en la solución.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere difieren en un nucleótido y en donde el un nucleótido que difiere comprende un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).
3. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere difieren en dos o más nucleótidos.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la complementariedad entre la segunda secuencia de ácido nucleico y el ácido nucleico diana está en el espacio de un nucleótido de la primera región del ácido nucleico diana, o contigua de modo que no hay huecos entremedias, o solapan de modo que hay un hueco negativo en donde el solapamiento es uno o más de un nucleótido.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde una segunda molécula de ácido nucleico cooperativa se expone simultáneamente con el ácido nucleico cooperativo de la reivindicación 1 a una solución que comprende el ácido nucleico que difiere y el ácido nucleico diana, en donde dicho segundo ácido nucleico cooperativo se dirige al ácido nucleico diferente para amplificación, de manera que el penúltimo nucleótido del extremo 3' de la primera secuencia del segundo ácido nucleico cooperativo es complementario del ácido nucleico diferente, pero no es complementario del ácido nucleico diana.
6. El método de la reivindicación 5, en donde los ácidos nucleicos cooperativos primero y segundo pueden amplificar sus dianas pretendidas en condiciones sustancialmente similares.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde están presentes uno o más ácidos nucleicos que difieren adicionales en la solución.
8. El método de la reivindicación 7, en donde el uno o más ácidos nucleicos que difieren adicionales difieren en una misma posición de nucleótido que el objetivo y el primer ácido nucleico que difiere o los ácidos nucleicos que difieren adicionales difieren en diferentes posiciones de nucleótidos que el ácido nucleico diana y el segundo ácido nucleico que difiere.
9. El método de la reivindicación 8, en donde uno o más ácidos nucleicos que difieren adicionales difieren en una misma posición de nucleótido que la diana y el primer ácido nucleico que difiere, el uno o más ácidos nucleicos que difieren adicionales tienen nucleótidos diferentes en la misma posición de nucleótido que el ácido nucleico diana y el primer ácido nucleico que difiere.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde tres o más moléculas de ácido nucleico cooperativas se exponen simultáneamente a los ácidos nucleicos que difieren y diana.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en donde la primera secuencia de ácido nucleico de la molécula de ácido nucleico cooperativa no hibridará con el ácido nucleico diana sin que la segunda secuencia de ácido nucleico hibride con el ácido nucleico diana.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la molécula de ácido nucleico cooperativa comprende un marcador.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el marcador es un marcador fluorescente.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la molécula comprende además un atenuador.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico que difiere difieren debido a una deleción, adición o sustitución de un nucleótido.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862736094P | 2018-09-25 | 2018-09-25 | |
| PCT/US2019/052957 WO2020068983A1 (en) | 2018-09-25 | 2019-09-25 | Allele-specific design of cooperative primers for improved nucleic acid variant genotyping |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2966013T3 true ES2966013T3 (es) | 2024-04-17 |
Family
ID=69953330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES19866029T Active ES2966013T3 (es) | 2018-09-25 | 2019-09-25 | Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210395800A1 (es) |
| EP (1) | EP3856931B1 (es) |
| CA (1) | CA3114004A1 (es) |
| ES (1) | ES2966013T3 (es) |
| WO (1) | WO2020068983A1 (es) |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6451588B1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-09-17 | Pe Corporation (Ny) | Multipartite high-affinity nucleic acid probes |
| WO2002068684A2 (en) * | 2001-02-23 | 2002-09-06 | Pyrosequencing Ab | Allele-specific primer extension assay |
| WO2006119326A2 (en) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Stratagene California | Oligonucleotide probe/primer compositions and methods for polynucleotide detection |
| EP2004861A2 (en) * | 2006-04-04 | 2008-12-24 | Arcxis Biotechnologies, Inc. | Cooperative probes and methods of using them |
| US20140038182A1 (en) * | 2012-07-17 | 2014-02-06 | Dna Logix, Inc. | Cooperative primers, probes, and applications thereof |
| JP6933858B2 (ja) * | 2016-04-07 | 2021-09-08 | ラトガース ザ ステイト ユニバーシティー オブ ニュージャージー | 類縁アレルを検出可能な多重核酸アッセイ法およびその試薬 |
-
2019
- 2019-09-25 ES ES19866029T patent/ES2966013T3/es active Active
- 2019-09-25 WO PCT/US2019/052957 patent/WO2020068983A1/en unknown
- 2019-09-25 CA CA3114004A patent/CA3114004A1/en active Pending
- 2019-09-25 EP EP19866029.2A patent/EP3856931B1/en active Active
- 2019-09-25 US US17/279,825 patent/US20210395800A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3856931A1 (en) | 2021-08-04 |
| CA3114004A1 (en) | 2020-04-02 |
| EP3856931A4 (en) | 2022-06-29 |
| US20210395800A1 (en) | 2021-12-23 |
| WO2020068983A1 (en) | 2020-04-02 |
| EP3856931B1 (en) | 2023-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2961374T3 (es) | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada | |
| US20180171400A1 (en) | Small RNA Capture, Detection and Quantification | |
| US10704087B2 (en) | Cooperative primers, probes, and applications thereof | |
| ES2214319T3 (es) | Metodos y composiciones para la amplificacion isotermica lineal de secuencias de polinucleotidos. | |
| AU2013292706B2 (en) | Cooperative primers, probes, and applications thereof | |
| JP6652693B2 (ja) | ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いたｄｎａ増幅の方法 | |
| CN107429296A (zh) | 捕获、检测和定量小rna的方法、组合物与试剂盒 | |
| JP2008543288A (ja) | プライマーに基づく改善された増幅法 | |
| JP2012511927A (ja) | 対立遺伝子変種を検出するための方法、組成物、およびキット | |
| US8980558B2 (en) | Methods, compositions and kits for the improved detection of small RNA molecules | |
| ES2575378T3 (es) | Métodos y reactivos para reducir la amplificación no específica | |
| CN110446787A (zh) | 通用发夹引物 | |
| CN110012671A (zh) | Ngs文库浓度的标准化 | |
| CN114174535A (zh) | Crispr多靶标检测方法及其试剂盒 | |
| ES2966013T3 (es) | Diseño específico de alelo de cebadores cooperativos para genotipado de variantes de ácido nucleico mejorado | |
| JP2017538429A (ja) | 野生型の抑制のためのブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する、核酸の対立遺伝子特異的増幅 | |
| CN101671672A (zh) | 用于改进的核酸扩增的聚阴离子 | |
| US20240052407A1 (en) | Tertiary cooperative primers and methods of use | |
| EP3837383A1 (en) | Reagents, mixtures, kits and methods for amplification of nucleic acids | |
| Kostina et al. | TaqMan probes based on oligonucleotide-hairpin minor groove binder conjugates | |
| Ranasinghe | Novel techniques for genetic analysis |