ES2214319T3 - Metodos y composiciones para la amplificacion isotermica lineal de secuencias de polinucleotidos. - Google Patents
Metodos y composiciones para la amplificacion isotermica lineal de secuencias de polinucleotidos.Info
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Abstract
Un método para amplificar una secuencia de polinucleótidos complementaria a una secuencia de polinucleótidos diana que comprende: (a) proporcionar un complejo que comprende: (i) un molde de ADN que comprende la secuencia diana; y (ii) un producto de extensión del cebador compuesto producido extendiendo con polimerasa de ADN un cebador compuesto que comprende una parte de ARN y una parte de ADN 3¿, en donde el producto de extensión del cebador compuesto se hibrida con el molde de ADN; (b) cortar la parte de ARN del producto de extensión del cebador compuesto con una enzima que corta el ARN de un híbrido de ARN/ADN, de modo que otro cebador compuesto se hibrida con el molde de ADN; (c) repetir la extensión del cebador con polimerasa de ADN mediante desplazamiento de la hebra; (d) repetir las etapas (b) y (c) produciendo de este modo múltiples copias de la secuencia complementaria de la secuencia diana.
Description
Métodos y composiciones para la amplificación
isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos.
La invención se refiere al campo de la
amplificación de polinucleótidos. Más particularmente, la invención
proporciona métodos, composiciones y equipos de reactivos para
amplificar (es decir, realizar múltiples copias) secuencias de
polinucleótidos diana que emplean un único cebador compuesto de
ARN/ADN, implicando opcionalmente la amplificación una
transcripción.
En los últimos años, el desarrollo de métodos
para amplificar ácidos nucleicos y detectar los productos de la
amplificación han fomentado la detección, la identificación, la
cuantificación y los análisis de la secuencia de secuencias de
ácidos nucleicos.
El análisis de ácidos nucleicos es útil para
detectar e identificar patógenos, detectar una alteración génica
que conduce a fenotipos definidos, diagnosticar enfermedades
genéticas o la susceptibilidad de una enfermedad, determinar la
expresión génica en desarrollo, una enfermedad y como respuesta a
estímulos definidos, así como para los diferentes proyectos sobre
el genoma. Otras aplicaciones del método de amplificación de ácidos
nucleicos, son la detección de células poco comunes, la detección
de patógenos y la detección de una expresión génica alterada en el
cáncer, y similares. La amplificación de ácidos nucleicos es
potencialmente útil para el análisis cualitativo, tal como la
detección de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos
definidos y para la cuantificación de secuencias génicas definidas.
Esta última es útil para determinar y cuantificar secuencias
patógenas, así como para determinar la multiplicación o la deleción
génica, que se encuentra frecuentemente en la transformación
celular de un tipo de célula normal a maligna.
La detección de alteraciones de la secuencia en
una secuencia de ácidos nucleicos, es importante para la detección
de genotipos mutantes, que es apropiada para el análisis genético,
para la detección de mutaciones que conducen a la resistencia a los
fármacos, para la farmacogenómica, etc. Diversos métodos para
detectar mutaciones específicas incluyen la extensión de un cebador
específico de alelo, la ligación de una sonda específica de alelo y
la hibridación de la sonda diferencial. Véanse, por ejemplo, los
documentos de patentes de EE.UU. nº 5.888.819; 6.004.744;
5.882.867; 5.710.028; 6.027.889; 6.004.745; y WO US88/02746, WO
99/40219 y WO 99/29901. Los métodos para detectar la presencia de
alteraciones de la secuencia en una secuencia definida de ácidos
nucleicos, sin un conocimiento específico de la alteración, también
están descritos. Algunos de estos métodos se basan en la detección
de emparejamientos incorrectos formados por la hibridación de un
producto de amplificación del ensayo con un producto de
amplificación de referencia. La presencia de emparejamientos
incorrectos en tales heterohíbridos se puede detectar empleando
proteínas de unión específicas del emparejamiento incorrecto o
mediante escisión química o enzimática del emparejamiento
incorrecto. Un método para detectar la alteración de la secuencia
que se basa en la inhibición de la migración ramificada en
estructuras de ADN de cuatro hebras, ha sido descrito
recientemente. Véase, por ejemplo Lishanski, A. y col. Nucleic
Acids Res 28(9); E42 (2000). Otros métodos se basan en
la detección de configuraciones específicas de productos de la
amplificación monocatenarios. La estructura secundaria de un ADN o
ARN aislado plantilla es dependiente de la secuencia específica.
Las alteraciones de la secuencia en una diana de ácidos nucleicos
para ensayo, en relación con una secuencia de referencia, conducen a
una configuración alterada. La configuración alterada de un producto
de la amplificación monocatenario se puede detectar por un cambio
en la movilidad electroforética del producto de la amplificación
del ensayo, comparada con la de un producto de amplificación de
referencia. El polimorfismo en la configuración monocatenaria,
SSCP, se emplea habitualmente para detectar alteraciones de la
secuencia. Véase, por ejemplo, Orita M. y col. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86(8):2766-70 (1989); Suzuki,
Y. y col. Oncogene 5(7):1037-43
(1990); y el documento de patente de EE.UU. nº 5.871.697. Este
método también se emplea en la identificación microbiana que se
basa en los cambios definidos en una secuencia específica de ácidos
nucleicos, en especies o cepas diferentes. La detección de
mutaciones que emplea los métodos SSCP, emplea principalmente
productos de la amplificación de ADN, sin embargo, también se han
descrito métodos de SSCP con ARN. La configuración dependiente de
la secuencia de un ARN monocatenario está bien documentada y se
mostró que conduce a una plantilla definida de movilidad
electroforética. Véase, por ejemplo, Sarkar y col. Nucleic Acid
Research 20(4):871-878 (1992) y
Gasparini y col. Hum. Genet. 97:492-495
(1996).
Aunque la detección de la presencia de una
secuencia definida de ácido nucleico y el análisis de su secuencia,
se pueden realizar mediante hibridación con sonda, el método carece
generalmente de sensibilidad cuando en la muestra del ensayo están
presentes pequeñas cantidades de la secuencia del ácido nucleico,
tal y como unas pocas moléculas. Una solución para este obstáculo
era el desarrollo de métodos para generar copias múltiples de la
secuencia de ácido nucleico definida que eran adecuadas para un
análisis posterior. Los métodos para generar copias múltiples de
una secuencia específica de ácido nucleico se definen generalmente
como métodos de amplificación de la diana. Otros métodos para
incrementar la sensibilidad de la detección del análisis de
hibridación se basan en la generación de productos múltiples a
partir de la sonda hibridada, o las sondas, por ejemplo, escisión
de la sonda hibridada para formar múltiples productos o la ligación
de sondas adyacentes para formar un solo producto dependiente de
hibridación. De forma similar, una sensibilidad incrementada de la
reacción de hibridación se consiguió por métodos de amplificación de
señales generadas por el acontecimiento de hibridación, tal como el
método basado en la hibridación de sondas de ADN ramificado.
Existen muchas variaciones de la amplificación de
ácidos nucleicos, por ejemplo, amplificación exponencial,
amplificación lineal ligada, amplificación basada en la ligación y
amplificación basada en la transcripción. Un ejemplo de
amplificación exponencial de ácidos nucleicos es la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) que se ha descrito en numerosas
publicaciones. Véase, por ejemplo, Mullis y col. Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986);
Mullis K., documento EP 201.184; Mullis y col., documento de patente
de EE.UU. nº 4.582.788; Erlich y col., documentos EP 50.424, EP
84.796, EP 258.017, EP 237.362; y Saiki R. y col., documento de
patente de EE.UU. nº 4.683.194. La amplificación lineal ligada está
descrita por Wallace y col. en el documento de patente de EE.UU. nº
6.027.923. Ejemplos de amplificación basada en la ligación son la
reacción de amplificación y ligación (LAR), descrita por Wu y col.
en Genomics 4:560 (1989) y la reacción en cadena de la
ligasa, descrita en el documento de solicitud EP nº 0320308B1. En
los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.766.849 y 5.654.142, se
describen diversos métodos de amplificación basada en la
transcripción; y también Kwoh y col. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 86:1173 (1989) y Ginergeras y col. en el documento WO
88/10315.
El método de amplificación de una diana, empleado
más generalmente es la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, que
se basa en múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de dos
cebadores de oligonucleótidos, cada uno para una cadena opuesta de
las cadenas dianas, y la extensión del cebador mediante una
polimerasa de nucleótidos para producir copias múltiples
bicatenarias de la secuencia diana. Se han descrito muchas
variaciones de la PCR y el método se está utilizando para
amplificar secuencias de ácido nucleico de ADN o de ARN, para
secuenciación, para análisis de mutación y otros. Los métodos
basados en la termociclación que emplean un cebador aislado, también
se han descrito. Véanse, por ejemplo, los documentos de patentes de
EE.UU. nº 5.508.178; 5.595.891; 5.683.879; 5.130.238 y 5.679.512.
El cebador puede ser un cebador quimérico de ADN/ARN, tal y como se
describe en el documento de patente de EE.UU. nº 5.744.308. Otros
métodos que dependen de la ciclación térmica son la reacción en
cadena de la ligasa (LCR) y la reacción en cadena relacionada con
la reparación (RCR, del inglés "related repair chain
reaction").
La amplificación de ácidos nucleicos dianas se
puede realizar mediante ciclos múltiples de incubaciones a diversas
temperaturas, es decir, ciclación térmica, o a una sola temperatura
(un procedimiento isotérmico). El descubrimiento de enzimas
termoestables que modifican ácidos nucleicos, ha contribuido a los
veloces avances en la tecnología de la amplificación de ácidos
nucleicos. Véase, Saiki y col. Science 239:487 (1988). Las
enzimas termoestables que modifican ácidos nucleicos, tales como
polimerasas de ADN y de ARN, ligasas, nucleasas y similares, se
emplean en ambos métodos dependiendo de los métodos de
amplificación con ciclación térmica e isotérmica. Los métodos
isotérmicos, tales como la amplificación con desplazamiento de hebra
(SDA), está descrito por Fraiser y col. en el documento de patente
de EE.UU. nº 5.648.211; Cleuziat y col. en el documento de patente
de EE.UU. nº 5.824.517; y Walker y col. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:392-396 (1992). Fu y col., Nucleic
Acids Research 1997, vol 25, nº 3, describen la secuenciación
de ADN bicatenario mediante desplazamiento de la hebra. Otros
métodos isotérmicos de amplificación de la diana son los métodos de
amplificación basados en la transcripción, en los que una secuencia
promotora de polimerasa de ARN se incorpora en los productos de
extensión del cebador, en un estado temprano de la amplificación
(documento WO 89/01050) y una secuencia diana adicional o una
secuencia complementaria de la diana, se amplifica mediante etapas
de transcripción y digestión de una hebra de ARN en un producto
intermedio híbrido de ADN/ARN. Véanse, por ejemplo, los documentos
de patentes de EE.UU. nº 5.169.766 y 4.786.600 y US 5.849.547. Estos
métodos incluyen una amplificación mediada por transcripción (TMA),
replicación autosostenida de la secuencia (3SR), amplificación
basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA) y variaciones de
las mismas. Véanse, por ejemplo, Guatelli y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878 (1990); documentos
de patentes de EE.UU. nº 5.766.849 (TMA); y 5.654.142 (NASBA). Otros
métodos de amplificación emplean oligonucleótidos conmutadores del
molde (TSOs) y oligonucleótidos bloqueantes. Por ejemplo, la
amplificación con conmutación del cebador, en la que se emplea un
cebador de ADN quimérico, está descrita en el documento de patente
de EE.UU. nº 5.679.512 y por Patel y col. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93:2969-2974 (1996) y los oligonucleótidos
bloqueantes están descritos por Laney y col. en el documento de
patente nº 5.679.512.
Los métodos de amplificación isotérmica de la
diana no requieren un termociclador y se adaptan de este modo más
fácilmente a la plataforma de instrumentación común. Sin embargo,
los métodos de amplificación isotérmica de la diana, descritos
anteriormente tienen diversos inconvenientes. La amplificación
según los métodos SDA, requiere la presencia de sitios para enzimas
de restricción definidas, lo que limita su aplicabilidad. Los
métodos de amplificación basados en la transcripción, tales como la
NASBA y TMA, por el otro lado, están limitados por la necesidad de
incorporar la secuencia promotora de la polimerasa en el producto
de amplificación mediante un cebador, un procedimiento propenso a
dar como resultado una amplificación no específica. Además, el
mecanismo de amplificación de una diana de ADN mediante estos
métodos de amplificación basados en la transcripción, no está bien
establecido.
Otro inconveniente de los métodos actuales de
amplificación son las muestras del ensayo potencialmente
contaminadas por productos de la amplificación de reacciones de
amplificación anteriores, dando como resultado una amplificación no
específica de la diana en las muestras. Este inconveniente es un
problema bien conocido, que es el resultado del impacto de la
tecnología de amplificación de dianas y la formación de productos
de la amplificación, que son sustratos para la amplificación. Se
han descrito diversos medios para descontaminar muestras de ensayo
al final de la reacción de amplificación o antes del inicio de la
amplificación de la diana. Además, también se han descrito métodos
para contener la solución del ensayo mediante medios físicos. Todas
estas soluciones son enojosas y contribuyen a la complejidad del
ensayo de ácidos nucleicos en el marco del laboratorio común.
Además, los métodos de amplificación que emplean
un procedimiento de termociclación tienen el inconveniente añadido
de largos retrasos en el tiempo requerido para que el bloque de
termociclación alcance la temperatura "diana" para cada ciclo.
Consecuentemente, las reacciones de amplificación realizadas
empleando procedimientos de termociclación, requieren un tiempo
significativamente largo para conseguir completarse.
Por tanto, existe una necesidad de métodos
mejorados de amplificación de ácidos nucleicos que superen estos
inconvenientes. La invención proporcionada en esta memoria,
satisface esta necesidad y proporciona beneficios adicionales.
La invención proporciona métodos y composiciones
para la amplificación de polinucleótidos, así como aplicaciones de
los métodos de amplificación.
Por tanto, en un aspecto, la invención
proporciona métodos para amplificar una secuencia de polinucleótidos
complementaria a una secuencia de polinucleótidos diana que
comprende: (a) hibridar un molde de ADN monocatenario que comprende
la secuencia diana con un cebador compuesto, comprendiendo dicho
cebador compuesto una parte de ARN y una parte de ADN 3'; (b)
opcionalmente hibridar un polinucleótido que comprende una
secuencia de polinucleótidos de terminación con una región del
molde que está 5' en relación con la hibridación del cebador
compuesto con el molde; (c) extender el cebador compuesto con la
polimerasa de ADN; (d) cortar la parte de ARN del cebador compuesto
reasociado con una enzima que corta el ARN de un híbrido de
ARN/ADN, de modo que otro cebador compuesto se puede hibridar con
el molde y repetir la extensión del cebador, mediante
desplazamiento de la hebra, produciendo de este modo copias
múltiples de la secuencia complementaria de la secuencia diana.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos
para amplificar una secuencia de polinucleótidos diana que
comprende: (a) hibridar un molde de ADN monocatenario que comprende
la secuencia diana con un cebador compuesto, comprendiendo dicho
cebador compuesto una parte de ARN y una parte de ADN 3'; (b)
hibridar un polinucleótido que comprende una secuencia de
polinucleótidos de terminación con una región del molde que está 5'
en relación con la hibridación del cebador compuesto con el molde;
(c) extender el cebador compuesto con la polimerasa de ADN; (d)
cortar la parte de ARN del cebador compuesto reasociado con una
enzima que corta el ARN de un híbrido de ARN/ADN, de modo que otro
cebador compuesto se puede hibridar con el molde y repetir la
extensión del cebador mediante desplazamiento de la hebra, para
producir un producto de extensión del cebador desplazado; (e)
hibridar un polinucleótido que comprende un propromotor y una
región que se hibrida con el producto de extensión del cebador
desplazado bajo condiciones que permiten que tenga lugar la
transcripción mediante la polimerasa de ARN, de modo que se producen
transcritos de ARN que comprenden secuencias complementarias a los
productos de extensión del cebador desplazado, produciéndose de
este modo copias múltiples de la secuencia
diana.
diana.
Diversas realizaciones del cebador compuesto
utilizado en los métodos de la invención, están descritas en esta
memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la parte de ARN del
cebador compuesto está 5' en relación con la parte de ADN 3'. En
todavía otras realizaciones, la parte de ARN 5' es adyacente a la
parte de ADN 3'. Para los métodos descritos en esta memoria, se
puede utilizar uno o varios cebadores compuestos.
Diversas realizaciones ejemplares de
polinucleótidos que comprenden una secuencia de terminación, también
se describen en esta memoria. En algunas realizaciones, el
polinucleótido que comprende una secuencia de terminación es un
oligonucleótido conmutador del molde (TSO) que podría contener (pero
no necesariamente) una o varias modificaciones para mejorar la unión
al molde. Por tanto, en algunas realizaciones el TSO comprende una
modificación en la región que se hibrida con el molde, en donde,
bajo una serie de condiciones dadas, el TSO se une más estrechamente
con la región, en comparación con un TSO sin la modificación.
Ejemplos de modificaciones adecuadas se proporcionan en esta
memoria. En algunas realizaciones, el polinucleótido que comprende
una secuencia de terminación es una secuencia bloqueante que puede
contener, como el TSO, una o varias modificaciones para mejorar la
unión al molde. Por tanto, en algunas realizaciones, la secuencia de
bloqueo comprende una modificación en la región que se hibrida con
el molde, en donde, bajo una serie de condiciones dadas, el
bloqueador se une más estrechamente a la región, comparado con un
bloqueador sin la modificación. Ejemplos de modificaciones adecuadas
se proporcionan en esta memoria.
Las enzimas que se pueden utilizar en los métodos
y en las composiciones, se describen en esta memoria. Por ejemplo,
la enzima que corta el ARN puede ser una ARNasaH.
En algunos aspectos, un TSO proporciona una
función de propromotor y también comprende una región (que puede ser
adyacente o no al promotor) que se hibrida con el producto de
extensión del cebador desplazado. En otras realizaciones, el
polinucleótido que comprende el propromotor, comprende una región en
el extremo 3', que se hibrida con el producto de extensión del
cebador desplazado, de este modo, la extensión con la polimerasa de
ADN del producto de extensión desplazado, produce un promotor
bicatenario, a partir del cual tiene lugar la transcripción. En
algunas realizaciones, el polinucleótido que comprende el
propromotor es un PTO.
Los métodos son aplicables para amplificar
cualquier diana de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADN genómico y
ADNc. Se pueden combinar una o varias etapas y/o realizar de forma
secuencial (frecuentemente con cualquier orden, mientras que
el(los) producto(s) requerido(s) se
pueda(n) formar).
La invención también proporciona métodos que
emplean (generalmente, analizan) los productos de los métodos de
amplificación de la invención, tales como secuenciación y detección
de alteración(es) de la secuencia.
Por tanto, en un aspecto, la invención
proporciona métodos de secuenciación de una secuencia de
nucleótidos diana que comprende: (a) hibridar un molde de ADN
monocatenario que comprende la secuencia diana con un cebador
compuesto, comprendiendo dicho cebador compuesto una parte de ARN y
una parte de ADN 3'; (b) opcionalmente hibridar un polinucleótido
que comprende una secuencia de polinucleótidos de terminación con
una región del molde que está 5' en relación con la hibridación del
cebador compuesto con el molde; (c) extender el cebador compuesto
con la polimerasa de ADN y una mezcla de dNTPs y análogos de dNTP
(que pueden estar marcados o no), de modo que la extensión del
cebador se termina después de incorporar un análogo de dNTP que
puede estar marcado o no; (d) cortar la parte de ARN del cebador
compuesto reasociado con una enzima que corta el ARN de un híbrido
de ARN/ADN, de modo que otro cebador compuesto se puede hibridar
con el molde y repetir la extensión del cebador mediante
desplazamiento de la hebra, produciendo de este modo copias
múltiples de la secuencia complementaria de la secuencia diana, con
diversas longitudes: (e) analizar el producto de las etapas (a)
hasta (d) para determinar la secuencia.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos
para secuenciar una secuencia de nucleótidos diana que comprende:
(a) hibridar un molde de ADN monocatenario que comprende la
secuencia diana con un cebador compuesto, comprendiendo dicho
cebador compuesto una parte de ARN y una parte de ADN 3'; (b)
hibridar el molde con un polinucleótido que comprende una secuencia
de polinucleótidos de terminación con una región del molde que está
5' en relación con la hibridación del cebador compuesto con el
molde; (c) extender el cebador compuesto con una polimerasa de ADN;
(d) cortar la parte de ARN del cebador compuesto reasociado con una
enzima que corta el ARN de un híbrido de ARN/ADN, de modo que otro
cebador compuesto se puede hibridar con el molde y repetir la
extensión del cebador mediante desplazamiento de la hebra, para
producir un producto de extensión del cebador desplazado; (e)
hibridar un polinucleótido que comprende un propromotor en el
extremo 5' y una región que se hibrida con el producto de extensión
del cebador desplazado bajo condiciones tales que permiten que
tenga lugar la transcripción del producto de extensión mediante una
polimerasa de ARN, empleando una mezcla de rNTPs y análogos de rNTP
(que pueden estar marcados o no), de modo que se producen
transcritos de ARN que comprenden secuencias complementarias a los
productos de extensión del cebador desplazado, y de modo que esta
transcripción se termina después de la incorporación de un análogo
de rNTP que puede estar marcado o no, produciéndose de este modo
copias múltiples de la secuencia diana de diversas longitudes; (f)
analizar el producto de las etapas (a) hasta (e) para determinar la
secuencia.
En algunos aspectos, la invención proporciona
métodos para caracterizar o analizar, la secuencia de una diana.
Algunos aspectos se basan en la parte de ARN del cebador compuesto
y, por tanto, los resultados reflejan una información en relación
con la región correspondiente de la diana que, si es complementaria
o tiene una complementariedad suficiente, se hibrida con la parte de
ARN del cebador compuesto. La cantidad de producto comparada con la
cantidad de producto procedente de la realización de la misma
reacción de amplificación sobre una secuencia diana de referencia,
indica la presencia o ausencia de una secuencia que puede indicar a
su vez, la presencia o ausencia del tipo silvestre, mutante o
variantes alélicas. Diversas realizaciones de la detección de
secuencias, se describen en esta memoria. Por tanto, por ejemplo, la
invención proporciona métodos para detectar una mutación en una
región de una secuencia de polinucleótidos diana, que comprende
realizar un método de amplificación descrito en esta memoria, en
donde la región de la secuencia de polinucleótidos diana se
corresponde con la parte de ARN del cebador compuesto y en donde
una mutación en el polinucleótido diana da como resultado menos
productos de amplificación detectables, comparados con la cantidad
de productos de amplificación producidos a partir de una región que
comprende un molde de referencia que se corresponde con la parte de
ARN del cebador compuesto, que no comprende una mutación. En estas
realizaciones, la amplificación por desplazamiento de hebra es
menor comparada con la producción a partir de un molde de
referencia, que comprende una región que se corresponde con la
parte de ARN del cebador compuesto que no contiene la mutación
(comparada con la parte de ARN del cebador compuesto).
Por tanto, la invención proporciona métodos para
caracterizar una secuencia de interés en un polinucleótido diana,
comprendiendo dichos métodos realizar los métodos de amplificación
de la invención, en donde la secuencia de una parte de ARN del
cebador compuesto es conocida y en donde (a) la producción de menos
productos de la amplificación detectables a partir del molde,
comparada con la cantidad de productos de la amplificación de un
molde de referencia que comprende una región complementaria a la
parte de ARN del cebador compuesto, indica que el polinucleótido
diana no comprende una secuencia complementaria a la parte de ARN
del cebador compuesto y es una variante de la secuencia en relación
con la secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador
compuesto o (b) la producción de más productos de la amplificación
detectables a partir del molde, comparada con la cantidad de
productos de la amplificación procedentes de un molde de referencia
que no comprende una región que es complementaria a la parte de ARN
del cebador compuesto, indica que el polinucleótido diana comprende
una secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador
compuesto y no es una variante de la secuencia en relación con la
secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador compuesto. En
una realización, la secuencia de una parte de ARN del cebador
compuesto, comprende una secuencia de tipo silvestre y la secuencia
de interés se caracteriza determinando la presencia o ausencia de
la secuencia de tipo silvestre. En otra realización, la secuencia
de una parte de ARN del cebador compuesto comprende una secuencia
mutante y la secuencia de interés se caracteriza determinando la
presencia o ausencia de la secuencia mutante. En aún otra
realización, la secuencia de una parte de ARN del cebador compuesto,
comprende una secuencia alélica y la secuencia de interés se
caracteriza determinando la presencia o ausencia de la secuencia
alélica.
En otros aspectos, la invención proporciona
métodos para detectar una mutación (o, en algunos aspectos,
caracterizar una secuencia) en un polinucleótido diana, que
comprenden (a) efectuar un método de amplificación descrito en esta
memoria; y (b) analizar los productos amplificados del método en
busca de una configuración monocatenaria, en donde una diferencia en
la configuración, comparada con un polinucleótido monocatenario de
referencia, indica una mutación en el polinucleótido diana. En otras
realizaciones, la invención proporciona métodos para detectar una
mutación (o, en algunos aspectos, caracterizar una secuencia) en un
polinucleótido diana que comprende analizar los productos
amplificados según cualquiera de los métodos descritos en esta
memoria para buscar una configuración monocatenaria, en donde una
diferencia en la configuración comparada con un polinucleótido
monocatenario de referencia, indica una mutación en el
polinucleótido diana (o, en algunos casos, caracteriza la
secuencia
diana).
diana).
En otros aspectos, la invención proporciona
métodos para producir una micromatriz que comprende (a) efectuar un
método de amplificación descrito en esta memoria y (b) fijar los
productos amplificados sobre un sustrato sólido para formar una
micromatriz de los productos amplificados. En otras realizaciones,
las micromatrices se producen fijando los productos amplificados
según cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, sobre un
sustrato sólido para formar una micromatriz de productos
amplificados.
Cualquiera de estas aplicaciones puede utilizar
cualquiera de los métodos de amplificación (incluyendo diversos
componentes y diversas realizaciones de cualquiera de los
componentes) tal y como se describe en esta memoria. Por ejemplo,
el cebador compuesto empleado puede tener una parte de ARN 5' que
puede ser adyacente a la parte de
\hbox{ADN 3'.}
La invención también proporciona composiciones,
equipos de reactivos, complejos, mezclas de reacción y sistemas que
comprenden diversos componentes (y diversas combinaciones de los
componentes) empleados en los métodos de amplificación descritos en
esta memoria. En un aspecto, por ejemplo, la invención proporciona
composiciones que comprenden un cebador compuesto, comprendiendo
dicho cebador compuesto una parte de ADN 3' y una parte de ARN 5'.
En algunas realizaciones, la parte de ARN 5' es adyacente a la
parte de ADN 3'. En todavía otras realizaciones, la parte de ARN 5'
tiene aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 nucleótidos y la
parte de ADN 3' tiene aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos. Las composiciones comprenden adicionalmente una
secuencia de polinucleótidos de terminación, en particular un TSO,
por ejemplo en donde el TSO comprende una modificación en la región
que se hibrida con el molde, en donde, bajo una serie de
condiciones dadas, el TSO se une más estrechamente a la región,
comparado con un TSO sin la modificación. En algunas realizaciones,
las composiciones de la invención comprenden cualquier cebador
compuesto descrito en esta memoria y un TSO. También describimos
composiciones que comprenden cualquiera de los cebadores compuestos
descritos en esta memoria y cualquiera de las secuencias
bloqueantes descritas en esta memoria, incluyendo las que contienen
modificaciones que mejoran la unión al molde. En otras
realizaciones, la invención proporciona composiciones que comprenden
cualquiera de los cebadores compuestos descritos en esta memoria y
un PTO.
También describimos composiciones que comprenden
cualquiera de los complejos (que se consideran generalmente
compuestos intermedios en relación con los productos finales de la
amplificación) descritos en esta memoria (véanse también las
figuras para descripciones esquemáticas de los diversos complejos).
Por ejemplo, describimos composiciones que comprenden un complejo
de (a) una hebra molde; y (b) un cebador compuesto, comprendiendo
dicho cebador compuesto una parte de ADN 3' y una parte de ARN. La
parte de ARN puede ser 5' así como ser adyacente a la parte de ADN.
En algunas realizaciones, el complejo comprende adicionalmente un
polinucleótido que comprende una secuencia de terminación (que
puede ser, por ejemplo, un TSO o una secuencia bloqueante). En
algunas realizaciones, el complejo comprende adicionalmente un
PTO.
En otro aspecto, la invención proporciona mezclas
de reacción (o composiciones que comprenden mezclas de reacción) que
contienen diversas combinaciones de componentes descritos en esta
memoria. Por ejemplo, la invención proporciona mezclas de reacción
que comprenden (a) un molde de polinucleótido; (b) un cebador
compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de ARN; y
(c) una polimerasa de ADN y (d) una secuencia de polinucleótidos de
terminación que comprende un TSO. Tal y como se describe en esta
memoria, cualquiera de los cebadores compuestos puede estar en la
mezcla de reacción (o una pluralidad de cebadores compuestos),
incluyendo un cebador compuesto que comprende una parte de ARN 5'
que es adyacente a la parte de ADN 3'. La mezcla de reacción podría
comprender adicionalmente una enzima que corta el ARN de un híbrido
de ARN/ADN, tal como ARNasaH. Una mezcla de reacción de la invención
puede comprender también cualquiera de los polinucleótidos que
comprenden secuencias de terminación descritas en esta memoria, así
como un polinucleótido que comprende un propromotor y una región
que se hibrida con el producto de extensión del cebador desplazado,
y una polimerasa de ARN. Una mezcla de reacción de la invención
puede comprender también un PTO.
En otro aspecto, la invención proporciona equipos
de reactivos para efectuar los métodos descritos en esta memoria.
Estos equipos de reactivos, en envases adecuados y que contienen
generalmente (pero no necesariamente) instrucciones adecuadas,
contienen uno o varios componentes empleados en los métodos de
amplificación. Por ejemplo, la invención proporciona equipos de
reactivos que comprenden un cebador compuesto que comprende una
parte de ADN 3' y una parte de ARN (que puede ser 5' y puede estar
adicionalmente adyacente a la parte de ADN 3') y un polinucleótido
que comprende una secuencia de polinucleótidos de terminación que
comprende un TSO. El cebador compuesto en los equipos de reactivos
puede ser cualquiera descrito en esta memoria. Los equipos de
reactivos pueden contener componentes adicionales, tales como
cualquiera entre (a) un polinucleótido que comprende un propromotor;
(b) cualquiera de las enzimas descritas en esta memoria, tales como
una enzima que corta ARN a partir de un híbrido de ARN/ADN (por
ejemplo, ARNasaH); y (c) un polinucleótido que comprende un
propromotor y una región que se hibrida con el producto de
extensión del cebador desplazado.
También describimos sistemas para efectuar los
métodos de amplificación descritos en esta memoria. Por ejemplo, la
invención puede emplear un sistema para amplificar una secuencia de
polinucleótidos diana o su complemento, que comprende (a) un
cebador compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de
ARN; (b) una polimerasa de ADN; y (c) una enzima que corta el ARN de
un híbrido de ARN/ADN (tal como ARNasaH). El cebador compuesto
puede ser cualquiera (uno o varios) descrito en esta memoria, que
incluye un cebador compuesto que comprende una parte de ARN 5' que
es adyacente a la parte de ADN 3'.
La Figura 1A-C es una
representación esquemática de un procedimiento de amplificación
isotérmica lineal con un solo cebador compuesto.
La Figura 2A-C es una
representación esquemática de un procedimiento de amplificación
lineal e isotérmica mejorada de ácidos nucleicos, con un solo
cebador que implica transcripción, empleando una secuencia de
oligonucleótidos conmutadores del molde.
La Figura 3A-3D es una
representación esquemática de un procedimiento de amplificación
lineal e isotérmica mejorada de ácidos nucleicos, con un solo
cebador compuesto que implica transcripción, empleando un componente
bloqueador de secuencia.
La Figura 4 es una representación esquemática de
la detección de una mutación en una secuencia molde que emplea el
procedimiento de amplificación lineal e isotérmica con un solo
cebador. "X" significa una mutación en el ADN diana en un sitio
complementario a la parte de ARN del cebador compuesto. Tal y como
se muestra, la amplificación del ácido nucleico diana está bloqueada
cuando está presente una mutación.
La Figura 5 describe un gel PAGE teñido con
bromuro de etidio de los productos de la amplificación lineal e
isotérmica de una diana de ADN sintético.
La Figura 6 describe un autorradiograma de
análisis por PAGE de la hibridación de los productos de
amplificación de ADN con una sonda específica.
La Figura 7 describe un gel PAGE teñido con
bromuro de etidio en el que se compara la eficacia de los productos
de la transcripción de ARNmc, generados a partir de la extensión
solapada.
La Figura 8 describe un gel PAGE teñido con
bromuro de etidio en el que se compara la amplificación lineal e
isotérmica con y sin PTO bloqueado en 3'.
La Figura 9 describe un autorradiograma de una
sonda hibridada con productos de la amplificación, generados
mediante amplificación lineal e isotérmica de una secuencia del gen
J, procedente del ADN genómico de E. coli.
La Figura 10 describe un gel PAGE teñido con
bromuro de etidio de productos de ARN amplificados lineal e
isotérmicamente, generados empleando tres diseños diferentes del
cebador compuesto.
La invención proporciona métodos, composiciones y
equipos de reactivos para amplificar secuencias de polinucleótidos.
Los métodos comprenden generalmente el uso de un cebador compuesto
de ARN/ADN, opcionalmente una secuencia de terminación y, en
realizaciones en las que se emplea la transcripción, una secuencia
de oligonucleótidos de propromotor.
Como sumario general, los métodos de
amplificación funcionan del modo siguiente: un cebador compuesto de
ARN/ADN forma la base para la replicación de la secuencia diana. En
algunas realizaciones, una secuencia de terminación proporciona la
base para un punto final para la replicación, desviando o
bloqueando una replicación adicional a lo largo de la hebra diana.
Tal y como se describe a continuación, en algunas realizaciones, el
polinucleótido que comprende una secuencia de terminación es un
oligonucleótido de conmutación del molde (TSO) que contiene
secuencias que no son suficientemente complementarias para
hibridarse con la hebra molde (además de las secuencias que son
suficientemente complementarias para hibridarse); en otras
realizaciones, la secuencia de terminación comprende en primer
lugar secuencias que son suficientemente complementarias para
hibridarse con la hebra molde. La polimerasa de ADN efectúa copias
de la secuencia diana a partir del cebador. Una enzima que corta el
ARN de un híbrido de ARN/ADN (tal como una ARNasaH) corta (separa)
una secuencia de ARN del híbrido, dejando la secuencia en la hebra
molde disponible para la unión con otro cebador compuesto. Otra
hebra se produce mediante la polimerasa de ADN que desplaza la
hebra previamente replicada, dando como resultado un producto de
extensión desplazado. Opcionalmente, un polinucleótido que
comprende un propromotor y una región que se hibrida con el
producto de extensión del cebador desplazado (que puede ser, por
ejemplo, un oligonucleótido conmutador del molde o un
oligonucleótido molde propromotor) que contiene secuencias
suficientemente complementarias para hibridarse con el extremo 3'
del producto de extensión del desplazamiento, se une con el producto
de extensión del cebador desplazado. El promotor dirige la
transcripción (mediante una polimerasa de ARN dependiente de ADN)
para producir productos de ARN transcritos.
Por tanto, la invención proporciona métodos para
producir al menos una copia de una secuencia de polinucleótidos
diana (generalmente, métodos para amplificar la secuencia de
polinucleótidos diana) que comprenden combinar y hacer reaccionar
lo siguiente: (a) un polinucleótido diana monocatenario que
comprende una secuencia diana; (b) un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN y una parte de ADN 3'; (c) una
polimerasa de ADN; (d) trifosfatos de desoxirribonucleósidos o
análogos adecuados; (e) una enzima, tal como ARNasaH, que corta el
ARN de un híbrido de ARN/ADN; y (f) generalmente, pero
opcionalmente, un polinucleótido que comprende una secuencia de
terminación, tal como cualquiera de las descritas en esta memoria
que comprende una parte (o región) que se hibrida con el
polinucleótido molde. Una secuencia de terminación se emplea si la
amplificación basada en la transcripción (véase abajo) también se
emplea. La combinación se somete a condiciones adecuadas tales como
(a) el cebador compuesto (y, opcionalmente, un polinucleótido que
comprende una secuencia de terminación) se hibrida con el molde;
(b) la extensión del cebador tiene lugar a partir del cebador
compuesto, para formar un híbrido; (c) la ARNasaH corta el ARN del
cebador compuesto por el híbrido de ARN/ADN; (d) otro cebador
compuesto se hibrida con el molde y tiene lugar otra ronda de
extensión del cebador (mediada con polimerasa de ADN), desplazando
la hebra ya copiada del molde.
Opcionalmente, lo siguiente también está incluido
en la reacción de amplificación (al mismo tiempo que los
componentes enumerados anteriormente o añadido separadamente): (e)
un polinucleótido que comprende una secuencia de propromotor (que
puede estar en cualquiera de una variedad de formas, tal y como se
describe en esta memoria) y una región que se hibrida con el
producto de extensión del cebador desplazado; (f) trifosfatos de
ribonucleósidos o análogos adecuados; y (g) polimerasa de ARN, bajo
unas condiciones tales que tiene lugar la transcripción de la hebra
desplazada. Detalles en relación con los diversos componentes de
los métodos de la presente invención, se proporcionan a
continuación.
En algunas realizaciones, la invención
proporciona métodos de secuenciación de ácidos nucleicos (ADN o
ARN). Para los métodos de secuenciación, se emplean los dNTPs
adecuados (o, cuando se emplean realizaciones que dependen de las
amplificaciones basadas en la transcripción, rNTPs adecuados) que
pueden estar marcados o sin marcar. Por tanto, la invención
proporciona métodos de secuenciación de una secuencia de
nucleótidos diana que comprenden los métodos descritos
anteriormente, en donde se emplean dNTPs y análogos de dNTPs que son
terminadores de la elongación del cebador, que pueden estar
marcados o sin marcar, y/o rNTPs y análogos de rNTPs que son
terminadores de la elongación del cebador que pueden estar marcados
o no, y el producto de la amplificación se analiza para obtener
información sobre la secuencia, tal y como se describe a
continuación.
En otras realizaciones, la invención proporciona
métodos para detectar mutaciones de secuencias de ácidos nucleicos
y/o para caracterizar secuencia(s) diana. En una
realización, la presencia o ausencia de una mutación en un
polinucleótido diana, se detecta basándose en la capacidad de
amplificar el polinucleótido diana que emplea un cebador compuesto
cuya parte de ARN contiene de la secuencia mutada o carece de ella,
empleando los métodos de la invención. En otra realización, los
productos amplificados se emplean para detectar mutaciones mediante
hibridación con sondas específicas. En aún otras realizaciones, los
productos amplificados se emplean para detectar y/o identificar
polimorfismos en la configuración monocatenaria de un polinucleótido
diana.
En aún otras realizaciones, la invención
proporciona métodos para generar micromatrices de ácidos nucleicos
(ADN o ARN) que emplea los productos amplificados de los métodos de
amplificación de ácidos nucleicos lineales o lineales mejorados de
la presente invención.
Otros métodos que usan los productos amplificados
descritos en esta memoria se proporcionan a continuación.
Los métodos de amplificación de la invención
proporcionan diversas ventajas significativas sobre otros métodos de
amplificación de ácidos nucleicos. La formación del molde cebado,
la extensión del cebador y el desplazamiento del producto de
extensión generado previamente, depende del corte de la parte de ARN
del cebador hibridado, mediante una actividad ribonucleasa. Por
tanto, el producto de la extensión del cebador carece de la parte
más 5' del cebador. Consecuentemente, el producto de la
transcripción del ARN generado a partir del complejo del producto
de extensión y el oligonucleótido conmutador del molde, o el
oligonucleótido molde promotor, no contiene en su extremo 3' la
secuencia complementaria a esta parte del cebador. Por tanto, los
productos de la amplificación no son capaces de hibridarse con el
cebador para tener una amplificación productiva, volviéndose los
métodos de amplificación de la invención resistentes a una
amplificación no específica, debida a la contaminación con
productos generados por reacciones de amplificación anteriores.
Esta característica lo distingue claramente de otros métodos
conocidos de amplificación de la diana, tales como PCR, NASBA y
similares, y torna adecuados los métodos de la invención para
plataformas en tubo abierto, empleadas normalmente en laboratorios
clínicos, sitios de ensayo de alto rendimiento y similares.
El único requerimiento de corte de la parte de
ARN del cebador compuesto en la forma hibridada y extendida,
mediante una ribonucleasa tal como ARNasaH, para una progresión
adicional de la amplificación de la secuencia de ácido nucleico
diana, da como resultado la amplificación exclusiva de la diana de
ADN. Por tanto, es posible emplear los métodos de la invención para
amplificar las dianas de ADN genómico en presencia de ARNm en
exceso. Esta característica es útil para la cuantificación precisa
de la dosificación génica. Cuando la secuencia de ácido nucleico
diana del ensayo es ARN, la diana se transcribe en primer lugar
para producir ADNc que se puede amplificar empleando los métodos de
la invención.
Los métodos de la invención también proporcionan
la amplificación de ácidos nucleicos diana con alta precisión en
relación con el molde. Cada producto de la amplificación es una
copia directa de la secuencia diana en el ADN molde de aportado (en
los métodos de amplificación lineal) o el ADN molde aportado y los
productos de extensión del cebador del ADN molde aportado (en los
métodos de amplificación lineal mejorada).
Los métodos de la invención no requieren la
termociclación ya que la amplificación se puede realizar de forma
isotérmica. Esta característica proporciona numerosas ventajas que
incluyen facilitar la automoción y la adaptación para una
amplificación de alto rendimiento y/o el análisis de ácidos
nucleicos. Por ejemplo, los métodos de secuenciación basados en los
métodos de amplificación de la invención, se simplifican por la
capacidad de realizar reacciones de forma isotérmica. Otros métodos
que se han descrito requieren la ciclación térmica para separar los
productos de extensión del cebador de la secuencia diana. La
reacción isotérmica es más rápida que la proporcionada por la
ciclación térmica y es adecuada para realizar la secuenciación de un
ácido nucleico diana en dispositivos en miniatura.
Otra ventaja de los métodos de la invención es
que sólo es necesario un cebador aislado. Un cebador aislado se
utiliza para proporcionar una extensión del cebador unidireccional
que da como resultado la amplificación del ácido nucleico molde.
Esto evita los diversos inconvenientes asociados con el uso de
parejas de cebadores, por ejemplo, el coste del diseño y la
preparación de dos grupos de cebadores, la necesidad de tener un
conocimiento previo de una región adicional de la secuencia dentro
del ácido nucleico del molde y el incremento de la posibilidad de
que los productos amplificados sean el resultado de un cebado no
específico.
Los métodos de amplificación isotérmica y lineal
de la invención son también adecuados para emplear en la detección
de dianas de ácido nucleico, la cuantificación de secuencias
definidas de ácido nucleico y la producción de sondas para
secuencias de ácido nucleico definidas. Los métodos de la invención
son útiles para la detección cualitativa de una secuencia de ácido
nucleico, la determinación cuantitativa de la cantidad de secuencia
de ácido nucleico diana, la detección de la presencia de
alteraciones definidas de la secuencia, tal y como son necesarias
para el genotipado y la secuenciación. Los productos de la
amplificación de acuerdo con los métodos de la invención son
monocatenarios y se detectan fácilmente por métodos diversos
conocidos de detección de ácidos nucleicos.
Los métodos de la invención son útiles
adicionalmente para múltiples análisis de secuencias de ácidos
nucleicos. Es decir, diversas secuencias diana se pueden amplificar
simultáneamente en una sola mezcla de reacción. Las diversas
secuencias diana pueden formar parte de un ADN genómico aislado o
pueden representar secuencias específicas de diversas dianas de
ácidos nucleicos, que pueden estar presentes en una sola muestra
del ensayo. Por ejemplo, los métodos de la invención son útiles
para detectar la presencia de diversos patógenos en una sola
muestra biológica. De forma similar, la determinación de diversos
sitios polimórficos en una sola muestra de ADN genómico, se puede
determinar simultáneamente en una sola reacción.
Se entiende que, en relación con todas las
realizaciones descritas en esta memoria, como componentes o
aspectos "comprendidos" generalmente, la invención también
incluye realizaciones que "constan esencialmente de" estos
componentes o aspectos. La invención también incluye realizaciones
que "constan de" estos componentes o aspectos. Esto se aplica
a todas las realizaciones descritas en esta memoria.
La puesta en práctica de la presente invención
empleará, a no ser que se indique lo contrario, técnicas
convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas
recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e
inmunología, que están dentro de los conocimientos de un experto en
la técnica. Tales técnicas se explican con más detalle en la
bibliografía, tal como, "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", segunda edición (Sambrook y col., 1989);
"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, compilador, 1984);
"Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, compilador, 1987);
"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current
Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel y col.,
compiladores, 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The
Polymerase Chain Reaction", (Mullis y col., compiladores,
1994).
Los cebadores, los oligonucleótidos y los
polinucleótidos empleados en la presente invención se pueden generar
empleando técnicas convencionales conocidas en la técnica.
Una "secuencia diana", tal y como se emplea
en esta memoria, es una secuencia de polinucleótidos de interés, que
se desea amplificar. La secuencia diana puede ser conocida o
desconocida, desde el punto de vista de su secuencia real.
Generalmente, un "molde", tal y como se emplea en esta memoria,
es un polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos
diana. En algunos ejemplos, las expresiones "secuencia diana",
"ADN molde", "polinucleótido molde", "ácido nucleico
diana", "polinucleótido diana" y sus variaciones, se emplean
indistintamente.
"Amplificación", tal y como se emplea en
esta memoria, se refiere en general al procedimiento de producir
copias múltiples de una secuencia deseada. "Copias múltiples"
significa al menos 2 copias. Una "copia" no significa
necesariamente una complementariedad o identidad perfecta de la
secuencia con la secuencia molde. Por ejemplo, las copias pueden
incluir análogos de nucleótidos tales como desoxiinosina,
alteraciones intencionadas de la secuencia (tal como alteraciones
de la secuencia introducidas mediante un cebador que comprende una
secuencia que se puede hibridar, pero no es complementaria, con el
molde), y/o errores de la secuencia que tienen lugar durante la
amplificación.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico",
tal y como se emplea indistintamente en esta memoria, se refiere a
polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y
ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos,
ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos,
o cualquier sustrato que se puede incorporar en un polímero
mediante una polimerasa de ADN o de ARN. Un polinucleótido puede
comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos
metilados y sus análogos. Si están presentes, la modificación de la
estructura del nucleótido puede ser impartida antes o después del
ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar
interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido se
puede modificar adicionalmente después de la polimerización,
mediante la conjugación con un componente marcador. Otros tipos de
modificación incluyen, por ejemplo, "caperuzas", sustitución de
uno o de varios de los nucleótidos presentes en la naturaleza por un
análogo, modificaciones entre nucleótidos, tales como por ejemplo,
con enlaces no cargados (p. ej., fosfonatos de metilo,
fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces
cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que
contienen restos colgantes, tales como por ejemplo, proteínas (p.
ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal,
ply-L-lisina, etc.), con
intercaladores (p. ej., acridina, psolaren, etc.) las que contienen
quelatos (p. ej., metales, metales radiactivos, boro, metales
oxidativos, etc.), las que contienen alquiladores, las que tienen
enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos
alfa-anoméricos, etc.), así como formas no
modificadas de polinucleótido(s). Además, cualquiera de los
grupos hidroxilo presentes generalmente en los azúcares puede ser
reemplazado, por ejemplo, por grupos fosfonatos, grupos fosfatos,
pueden estar protegidos mediante grupos protectores convencionales
o activados para preparar enlaces adicionales con nucleótidos
adicionales o pueden estar conjugados con soportes sólidos. El OH
5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos
de grupos formadores de caperuzas orgánicas de 1 a 20 átomos de
carbono. Otros hidroxilos también se pueden derivatizar para formar
grupos protectores convencionales. Los polinucleótidos también
pueden contener formas análogas de azúcares de ribosa o
desoxirribosa que se conocen generalmente en la técnica que
incluyen, por ejemplo,
2'-O-metil-ribosa,
2'-O-alil-ribosa,
2'-fluoro-ribosa o
2'-azido-ribosa, análogos de azúcar
carbocíclico, azúcares \alpha-anoméricos,
azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas,
azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos
acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos, tales como
metil-ribósido. Uno o varios enlaces fosfodiéster
pueden estar reemplazados por grupos de enlaces alternativos. Estos
grupos de enlaces alternativos incluyen, pero no están limitados a
realizaciones en donde un fosfato está reemplazado por
P(O)S ("tioato"), P(S)S
("ditioato"), (O)NR_{2} ("amidato"),
P(O)R, P(O)OR', CO o CH_{2}
("formacetal"), en donde cada R o R' es independientemente H o
alquilo (1-20 C) sustituido o no sustituido, que
contiene opcionalmente un enlace éter (-O-), arilo, alquenilo,
cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un
polinucleótidos tienen que ser idénticos. La descripción anterior se
aplica a todos los polinucleótidos mencionados en esta memoria,
incluyendo ARN y ADN.
"Oligonucleótido", tal y como se emplea en
esta memoria, se refiere generalmente a polinucleótidos cortos,
generalmente monocatenarios y sintéticos que tienen generalmente,
pero no necesariamente, una longitud menor de aproximadamente 200
nucleótidos. Los oligonucleótidos en la presente invención incluyen
un cebador compuesto, TSO, PTO y una secuencia de bloqueo. Los
términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no se
excluyen entre sí. La descripción anterior de los polinucleótidos
es igual y totalmente aplicable a los oligonucleótidos.
Un "cebador" es generalmente un
polinucleótido monocatenario corto aislado, en general con un grupo
3'-OH libre, que se une a una diana presente
potencialmente en una muestra de interés, mediante hibridación con
una secuencia diana y que a continuación favorece la polimerización
de un polinucleótido complementario a la diana.
Una "secuencia de polinucleótidos de
terminación" o "secuencia de terminación", tal y como se usa
en esta memoria de forma intercambiable, es una secuencia de
polinucleótidos que produce el cese de la replicación del ADN con la
polimerasa de ADN, en relación con el molde que comprende la
secuencia diana. Una secuencia de terminación comprende una parte
(o región) que se hibrida generalmente con el molde en la posición
5' del punto (sitio) de terminación. La parte hibridable puede
comprender o no la secuencia de terminación completa. Ejemplos de
secuencias adecuadas de polinucleótidos de terminación (tales como
secuencias de bloqueo y TSOs) se proporcionan en esta memoria.
"Secuencia de bloqueo" o "secuencia
bloqueante", tal y como se emplean indistintamente en esta
memoria, es un ejemplo de una secuencia de terminación y se refiere
a un oligonucleótido que se une, generalmente con alta afinidad, al
ácido nucleico molde, en una posición 5' en relación con el sitio de
terminación y que produce el cese de la replicación del ADN con la
polimerasa de ADN, en relación con el molde, que comprende la
secuencia diana. Su extremo 3' puede estar bloqueado o no para la
extensión con una polimerasa de ADN.
"Sitio de terminación" o "punto de
terminación", tal y como se emplea en esta memoria de forma
indistinta, se refiere al sitio, punto o región del molde que se
replica en último lugar por la polimerasa de ADN, antes de terminar
la polimerización (generalmente, extensión del cebador) o la
conmutación del molde. Por ejemplo, en relación con un TSO, es la
posición o región en la secuencia diana que es complementaria al
extremo 3' del producto de extensión del cebador, antes de conmutar
el molde desde el polinucleótido molde con la parte no hibridada
del TSO.
"Secuencia protopromotora" y "secuencia
propromotora", tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a
una región de la secuencia de ADN monocatenario que, en forma
bicatenaria, es capaz de mediar en la transcripción del ARN. En
algunos contextos, "secuencia protopromotora",
"protopromotor", "secuencia propromotora",
"propromotor", "secuencia promotora" y "promotor" se
usan indistintamente.
"Oligonucleótido conmutador del molde
(TSO)", tal y como se usa en esta memoria, se refiere a un
oligonucleótido que comprende una parte (o región) que es
hibridable con un molde en una posición 5' en relación con el sitio
de terminación de la extensión del cebador y que es capaz de
efectuar una conmutación del molde en el proceso de extensión del
cebador, mediante una polimerasa de ADN. Los TSOs se conocen en
general en la técnica. "Conmutación del molde" se refiere a un
cambio en el ácido nucleico del molde, generalmente del ácido
nucleico diana de la parte no hibridada de un TSO, durante el
transcurso de una ronda aislada de extensión del cebador.
"Oligonucleótido molde propromotor (PTO)",
tal y como se usa en esta memoria, se refiere a un oligonucleótido
que comprende una secuencia propromotora y una parte, generalmente
una parte 3', que es hibridable con la región 3' de un producto de
extensión del cebador. La secuencia propromotora y la parte
hibridable pueden ser nucleótidos iguales, distintos o solapantes de
un oligonucleótido.
Una primera secuencia que se "corresponde"
con una segunda secuencia, tal como una parte de ARN de un cebador
compuesto, significa que la primera secuencia tiene una identidad
de secuencia significativa en relación con la segunda secuencia.
Este término se emplea generalmente en el contexto de detectar
mutaciones o caracterizar secuencias de una diana.
"Inhibir" es disminuir o reducir una
actividad, función y/o cantidad, comparada con una referencia.
Un "complejo" es un conjunto de componentes.
Un complejo puede ser o no estable y se puede detectar directa o
indirectamente. Por ejemplo, tal y como se describe en esta
memoria, dados ciertos componentes de una reacción y el tipo de
producto(s) de la reacción, se puede deducir la existencia de
un complejo. Para fines de la invención, un complejo es
generalmente un producto intermedio en relación con el(los)
producto(s) de amplificación final.
Una "parte" o una "región", empleadas
de forma indistinta en esta memoria, de un polinucleótido u
oligonucleótido, es una secuencia contigua de 2 o más bases. En
otras realizaciones, una región o parte tiene al menos
aproximadamente cualquiera entre 3, 5, 10, 15, 20, 25 nucleótidos
contiguos.
Una región, parte o secuencia que es
"adyacente" a otra secuencia, termina directamente en esta
región, parte o secuencia. Por ejemplo, una parte de ARN que es
adyacente a una parte de ADN 5' de un cebador compuesto, termina
directamente en esta región. Para una ilustración de este ejemplo,
véase la Figura 1A-C.
Una "mezcla de reacción" es un conjunto de
componentes que, bajo condiciones adecuadas, reacciona para formar
un complejo (que puede ser un intermedio) y/o un(os)
producto(s).
"Un", "uno" y "el" y similares, a
no ser que se indique de otro modo, incluyen las formas
plurales.
"Que comprende" significa que incluye.
Las condiciones que "permiten" que tenga
lugar un acontecimiento o las condiciones que son "adecuadas"
para que tenga lugar un acontecimiento, tal como hibridación,
extensión de la hebra y similares, o las condiciones
"adecuadas", son condiciones que no impiden que tengan lugar
tales acontecimientos. Por tanto, estas condiciones permiten,
mejoran, facilitan y/o conducen al acontecimiento. Tales
condiciones, conocidas en la técnica y descritas en esta memoria,
dependen de, por ejemplo, la naturaleza de la secuencia de
nucleótidos, la temperatura y las condiciones del tampón. Estas
condiciones también dependen de qué acontecimiento se desea, tal
como hibridación, corte, extensión de la hebra o transcripción.
"Mutación" de la secuencia, tal y como se
emplea en esta memoria, se refiere a cualquier alteración de la
secuencia en una secuencia de interés, en comparación con una
secuencia de referencia. Una secuencia de referencia puede ser una
secuencia de tipo silvestre o una secuencia con la que se desea
comparar una secuencia de interés. Una mutación de la secuencia
incluye cambios aislados de nucleótidos o alteraciones de más de un
nucleótido en una secuencia, debido a mecanismos tales como
sustitución, deleción o inserción. Un polimorfismo de un nucleótido
aislado (SNP), tal y como se emplea en esta memoria, también es una
mutación de la secuencia.
"Polimorfismo en la configuración
monocatenaria" y "SSCP", tal y como se emplea en esta
memoria, se refiere generalmente a la configuración específica de un
ácido nucleico monocatenario que está afectado por su secuencia
específica de ácidos nucleicos. Una alteración de la secuencia del
polinucleótido monocatenario, tal como una sustitución de un
nucleótido aislado, deleciones o inserciones, dan como resultado un
cambio o polimorfismo en la configuración del polinucleótido
monocatenario. La configuración del polinucleótido es generalmente
detectable, identificable y/o visible empleando métodos conocidos en
la técnica, tales como movilidad electroforética, medida mediante
electroforesis en gel, electroforesis capilar y/o susceptibilidad a
la digestión con endonucleasas.
"Micromatriz" y "matriz", tal y como se
emplean en esta memoria, se refieren a una disposición de una
colección de secuencias de nucleótidos en una localización
centralizada. Las formaciones pueden estar sobre un sustrato
sólido, tal como un portaobjetos de vidrio o sobre un sustrato
semisólido, tal como una membrana de nitrocelulosa. Las secuencias
de nucleótidos pueden ser de ADN, ARN o cualquier permutación de
las mismas.
El término "3'" se refiere en general a una
región o una posición en un polinucleótido u oligonucleótido 3'
(aguas abajo) de otra región o posición en el mismo polinucleótido
u oligonucleótido.
El término "5'" se refiere generalmente a
una región o una posición en un polinucleótido u oligonucleótido 5'
(aguas arriba) de otra región o posición en el mismo polinucleótido
u oligonucleótido.
Las expresiones "parte de ADN 3'", "región
de ADN 3'", "parte de ARN 3'" y "región de ARN 3'", se
refieren a la parte o a la región de un polinucleótido o un
oligonucleótido localizado hacia el extremo 3' del polinucleótido u
oligonucleótido y puede incluir o no el(los)
nucleótido(s) o restos más 3', fijados al nucleótido más 3'
del mismo polinucleótido u oligonucleótido. El(los)
nucleótido(s) más 3' puede tener preferentemente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, más preferentemente
desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos.
Las expresiones "parte de ADN 5'", "región
de ADN 5'", "parte de ARN 5'" y "región de ARN 5'", se
refieren a la parte o a la región de un polinucleótido o un
oligonucleótido localizado hacia el extremo 5' del polinucleótido u
oligonucleótido y puede incluir o no el(los)
nucleótido(s) o restos más 5', fijados al nucleótido más 5'
del mismo polinucleótido u oligonucleótido. El(los)
nucleótido(s) más 5' puede tener preferentemente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20, más preferentemente
desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos.
"Detección" incluye cualquier medio de
detección, incluyendo la detección directa e indirecta. Por
ejemplo, productos "menos detectables" se pueden observar
directa o indirectamente y la expresión indica cualquier reducción
(que incluye ausencia de productos). De forma similar, producto
"más detectable", significa cualquier incremento, observado
directa o indirectamente.
La diana de ácido nucleico (AN) que se va a
amplificar incluye ácidos nucleicos procedentes de cualquier fuente
en forma purificada o no purificada, que pueden ser de ADN (ADNbc y
ADNmc) o ARN, incluyendo ARNt, ARNm, ARNr, ADN y ARN mitocondrial,
ADN y ARN de cloroplastos, híbridos de ADN-ARN o
mezclas de los mismos, genes, cromosomas, plásmido, los genomas de
material biológico, tales como microorganismos, p. ej., bacterias,
levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, vegetales, animales,
seres humanos y fragmentos de los mismos. Para la obtención y
purificación de los ácidos nucleicos se emplean métodos
convencionales en la técnica. La amplificación de una diana de ARN
requerirá una síntesis inicial de ADNc, tal y como se conoce en la
técnica. La amplificación de un híbrido de ADN-ARN
requerirá la desnaturalización del híbrido para obtener un ADNmc o
la desnaturalización seguida de transcripción inversa para obtener
un ADNc. El ácido nucleico diana puede ser sólo una fracción menor
de una mezcla compleja, tal como una muestra biológica y se puede
obtener a partir de diverso material biológico mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica.
La etapa inicial de la amplificación de una
secuencia de ácido nucleico diana es convertir la diana en
monocatenaria. Si el ácido nucleico diana es un ADN(bc)
bicatenario, la etapa inicial es la desnaturalización de la diana.
La etapa de desnaturalización puede ser desnaturalización térmica o
cualquier otro método conocido en la técnica, tal como tratamiento
alcalino. Si la diana es de ARN, la etapa inicial puede ser la
síntesis de un ADNc monocatenario. Las técnicas para la síntesis de
ADNc a partir de ARN son conocidas en la técnica.
Los métodos de amplificación de la invención
emplean un cebador compuesto aislado que está compuesto de partes de
ARN y de ADN. El diseño compuesto del cebador es decisivo para un
desplazamiento posterior del producto de extensión del cebador
mediante la unión de un nuevo (adicional) cebador compuesto y la
extensión del nuevo cebador con la polimerasa. Además, la escisión
de la parte de ARN del producto de extensión del cebador produce la
generación de un producto de la amplificación que no es un sustrato
para la amplificación con un cebador compuesto, tal y como se
describe a continuación.
Los cebadores compuestos para uso en los métodos
y en las composiciones de la presente invención comprenden al menos
una parte de ARN que es capaz de (a) unirse (hibridarse) a una
secuencia en el ácido nucleico diana (molde) independientemente de
la hibridación de la(s) parte(s) de ADN con una
secuencia en el ácido nucleico diana; y (b) de ser cortada con una
ribonucleasa cuando se hibrida con el ADN de la diana. Los
cebadores compuestos se unen al ácido nucleico de la diana para
formar un heterohíbrido parcial en el que sólo la parte del ARN del
cebador es cortada después de entrar en contacto con una
ribonucleasa, tal como ARNasaH, mientras que la hebra diana
permanece intacta, permitiendo de este modo la reasociación de otro
cebador compuesto.
Los cebadores compuestos también comprenden una
parte de ADN 3' que es capaz de hibridarse con una secuencia del
ácido nucleico diana (molde) de modo que favorece su hibridación
con la secuencia diana (molde) sobre la de la hebra de ácido
nucleico que es desplazado del ácido nucleico diana mediante la
polimerasa de ADN. Tales cebadores se pueden diseñar racionalmente
basándose en factores bien conocidos que influyen en la afinidad de
la unión del ácido nucleico, tal como la longitud de la secuencia
y/o la identidad, así como las condiciones de hibridación. En una
realización preferida, la hibridación de la parte de ADN 3' del
cebador compuesto con su secuencia complementaria en el ácido
nucleico diana, es favorecida sobre la hibridación de la secuencia
homóloga en el extremo 5' de la hebra desplazada con el ácido
nucleico diana.
La generación de cebadores adecuados para la
extensión mediante polimerización, es bien conocida en la técnica,
tal y como se describe en el documento PCT nº de pub. WO99/42618 (y
las referencias citadas en la memoria). El cebador compuesto
comprende una combinación de ARN y ADN (véase la definición
anterior), siendo el nucleótido del extremo 3' un nucleótido
adecuado para la extensión de ácido nucleico. El nucleótido del
extremo 3' puede ser cualquier nucleótido o análogo que cuando está
presente en un cebador, se puede extender gracias a una polimerasa
de ADN. Generalmente, el nucleótido del extremo 3' tiene un OH 3'.
Los cebadores adecuados incluyen los que comprenden al menos una
parte de ARN y al menos una parte de ADN. Tal y como se muestra en
el Ejemplo 5 (que muestra el comportamiento relativo de diversos
cebadores empleados para la amplificación del gen J de E.
coli), para un gen, los cebadores compuestos pueden comprender
una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3' (en donde la parte de ARN
es adyacente a la parte de ADN 3'); o partes de ADN 5' y 3' con una
parte de ARN intercalado. Por tanto, en una realización, el cebador
compuesto comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3',
preferentemente en donde la parte de ARN es adyacente a la parte de
ADN 3'. En otra realización, el cebador compuesto comprende partes
de ADN 5' y 3' con al menos una parte de ARN intercalado (es decir,
una parte de ARN entre las dos partes de ADN). En todavía otra
realización, el cebador compuesto de la presente invención comprende
una parte de ADN 3' y al menos una parte de ARN intercalado (es
decir, una parte de ARN entre las partes de ADN).
La longitud de una parte de ARN en un cebador
compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de ARN,
puede tener preferentemente desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 25, más preferentemente desde aproximadamente 3
hasta aproximadamente 20, incluso más preferentemente desde
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 15 y lo más preferido desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 nucleótidos. En algunas
realizaciones de un cebador compuesto que comprende una parte de
ADN 3' y una parte de ARN, una parte de ARN puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 4 y 5 nucleótidos con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 15, 20, 25,
30 nucleótidos.
La longitud de la parte de ARN 5' en un cebador
compuesto que comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3',
puede tener preferentemente desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 18
nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 17 nucleótidos y lo más preferido desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 nucleótidos. En otras
realizaciones de un cebador compuesto que comprende una parte de ARN
5' y una parte de ADN 3', la parte de ARN 5' puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 3, 5, 7, 8 y 10 nucleótidos con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 15, 17, 18, 20
nucleótidos.
En realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3', que comprende
adicionalmente una(s) parte(s) de ARN no 5', una
parte de ARN no 5' puede tener preferentemente desde aproximadamente
1 hasta aproximadamente 7 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6 nucleótidos y lo más
preferible desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5
nucleótidos. En ciertas realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3', que comprende
adicionalmente una(s) parte(s) de ARN no 5', una parte
de ARN no 5' puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre
1, 2, 3, 5 con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 5, 6, 7, 10 nucleótidos.
En las realizaciones en las que un cebador
compuesto que comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3',
en donde la parte de ARN 5' es adyacente a la parte de ADN 3', la
longitud de la parte de ARN 5' puede ser preferentemente desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 25 nucleótidos, más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20
nucleótidos, incluso más preferentemente desde aproximadamente 7
hasta aproximadamente 18 nucleótidos, preferentemente desde
aproximadamente 8 hasta aproximadamente 17 nucleótidos y lo más
preferido desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15
nucleótidos. En ciertas realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3', en donde la
parte de ARN 5' es adyacente a la parte de ADN 3', la parte de ARN
5' puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre 3, 5, 7,
8, 10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente
cualquiera entre 15, 17, 18, 20 nucleótidos.
La longitud de una parte de ARN intercalado en un
cebador compuesto que comprende partes de ADN 5' y 3', con al menos
una parte de ARN intercalado, puede ser preferentemente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 7 nucleótidos, más
preferentemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6
nucleótidos y lo más preferido desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 5 nucleótidos. En algunas realizaciones de un
cebador compuesto que comprende partes de ADN 5' y 3' con al menos
una parte de ARN intercalado, una parte de ARN intercalado puede
tener al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 2, 3, 5
nucleótidos con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 5, 6, 7, 10 nucleótidos. La longitud de una parte de ARN
intercalado en un cebador compuesto que comprende una parte de ADN
3' y al menos una parte de ARN intercalado, puede ser
preferentemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 7
nucleótidos, más preferentemente desde aproximadamente 2 hasta
aproximadamente 6 nucleótidos y lo más preferido desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 5 nucleótidos. En algunas
realizaciones de un cebador compuesto que comprende una parte de ADN
3' y al menos una parte de ARN intercalado, una parte de ARN
intercalado puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre 1,
2, 3, 5 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente
cualquiera entre 5, 6, 7, 10 nucleótidos. En un cebador compuesto
que comprende una parte de ADN 3' y al menos una parte de ARN
intercalado, que comprende adicionalmente una parte de ARN 5', la
parte de ARN 5' puede tener desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 25 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 18
nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 8 hasta
aproximadamente 17 nucleótidos y lo más preferido desde
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15 nucleótidos. En algunas
realizaciones de un cebador compuesto que comprende una parte de ADN
3' y al menos una parte de ARN intercalado, que comprende
adicionalmente una parte de ARN 5', la parte de ARN 5' puede tener
al menos aproximadamente cualquiera entre 3, 5, 7, 8, 10
nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 15, 17, 18, 20 nucleótidos.
La longitud de la parte de ADN 3' en un cebador
compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de ARN,
puede ser preferentemente desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 20, más preferentemente desde aproximadamente 3
hasta aproximadamente 18, incluso más preferentemente desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15 y lo más preferido entre
aproximadamente 7 hasta aproximadamente 12 nucleótidos. En algunas
realizaciones de un cebador compuesto que comprende una parte de
ADN 3' y una parte de ARN, la parte de ADN 3' puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7, 10 nucleótidos con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 12, 15, 18,
20, 22 nucleótidos.
La longitud de la parte de ADN 3' en un cebador
compuesto que comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3',
puede ser preferentemente desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 20 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18 nucleótidos, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos y lo más preferido desde aproximadamente 7 hasta
aproximadamente 12 nucleótidos. En algunas realizaciones de un
cebador compuesto que comprende una parte de ARN 5' y una parte de
ADN 3', la parte de ADN 3' puede tener al menos aproximadamente
cualquiera entre 1, 3, 5, 7, 10 nucleótidos, con un límite superior
de aproximadamente cualquiera entre 10, 12, 15, 18, 20, 22
nucleótidos.
En realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3' que comprende
adicionalmente parte(s) de ADN no 3', una parte de ADN no 3'
puede ser preferentemente desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 10 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 nucleótidos y lo más
preferido desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6
nucleótidos. En algunas realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3' que comprende
adicionalmente parte(s) de ADN no 3', una parte de ADN no 3'
puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 2, 3, 5,
nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 6, 8, 10, 12 nucleótidos.
En realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3', en la que la
parte de ARN 5' es adyacente a la parte de ADN 3', la longitud de la
parte de ADN 3' puede ser preferentemente desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 20 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18 nucleótidos, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos y lo más preferido desde aproximadamente 7 hasta
aproximadamente 12 nucleótidos. En ciertas realizaciones del cebador
que comprende una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3', en donde la
parte de ARN 5' es adyacente a la parte de ADN 3', la parte de ADN
3' puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7,
10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 10, 12, 15, 18, 20, 22 nucleótidos.
La longitud de una parte de ADN no 3' en un
cebador compuesto que comprende partes de ADN 5' y 3' con al menos
una parte de ARN intercalado, puede ser preferentemente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 nucleótidos, más
preferentemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8
nucleótidos y lo más preferido desde aproximadamente 3 hasta
aproximadamente 6 nucleótidos. En algunas realizaciones de un
cebador que comprende partes de ADN 5' y 3' con al menos una parte
de ARN intercalado, una parte de ADN no 3' puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 1, 2, 3, 5 nucleótidos, con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 6, 8, 10, 12
nucleótidos.
La longitud de la parte de ADN 3' en un cebador
compuesto que comprende partes de ADN 5' y 3', con al menos una
parte de ARN intercalado, puede ser preferentemente desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, más
preferentemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18
nucleótidos, incluso más preferentemente desde aproximadamente 5
hasta aproximadamente 15 nucleótidos y lo más preferido desde
aproximadamente 7 hasta aproximadamente 12 nucleótidos. En algunas
realizaciones de un cebador compuesto que comprende partes de ADN 5'
y 3' con al menos una parte de ARN intercalado, la parte de ADN 3'
puede tener al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7, 10
nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 10, 12, 15, 18, 20, 22 nucleótidos.
La longitud de una parte de ADN no 3' (es decir,
cualquier parte de ADN distinta de la parte de ADN 3') en un cebador
compuesto que comprende una parte de ADN 3' y al menos una parte de
ARN intercalado, puede ser preferentemente desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 10 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 nucleótidos y lo más
preferido desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 6
nucleótidos. En algunas realizaciones de un cebador compuesto que
comprende una parte de ADN 3' y al menos una parte de ARN
intercalado, una parte de ADN no 3' puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7, 10 nucleótidos, con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 6, 8, 10, 12
nucleótidos. La longitud de la parte de ADN 3' en un cebador
compuesto que comprende una parte de ADN 3' y al menos una parte de
ARN intercalado, puede ser preferentemente desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 20 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 3 hasta aproximadamente 18 nucleótidos, incluso más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos y lo más preferido desde aproximadamente 7 hasta
aproximadamente 12 nucleótidos. En algunas realizaciones de un
cebador compuesto que comprende una parte de ADN 3' y al menos una
parte de ARN intercalado, la parte de ADN 3' puede tener al menos
aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7, 10 nucleótidos, con un
límite superior de aproximadamente cualquiera entre 10, 12, 15, 18,
20, 22 nucleótidos. Se entiende que las longitudes de las partes
diversas pueden ser mayores o menores, según sea adecuado con las
condiciones de reacción de los métodos de esta invención.
En algunas realizaciones, la parte de ADN 5' de
un cebador compuesto incluye el nucleótido más 5' del cebador. En
algunas realizaciones, la parte de ARN 5' de un cebador compuesto
incluye el nucleótido más 5' del cebador. En otras realizaciones, la
parte de ADN 3' de un cebador compuesto incluye el nucleótido más 3'
del cebador. En otras realizaciones, la parte de ADN 3' es adyacente
a la parte de ARN 5' e incluye el nucleótido más 3' del cebador (y
la parte de ARN 5' incluye el nucleótido más 5' del cebador).
La longitud total del cebador compuesto puede ser
preferentemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 40
nucleótidos, más preferentemente desde aproximadamente 15 hasta
aproximadamente 30 nucleótidos y lo más preferible desde
aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 nucleótidos. En algunas
realizaciones, la longitud puede ser al menos aproximadamente
cualquiera entre 10, 15, 20, 25 nucleótidos, con un límite superior
de aproximadamente cualquiera entre 25, 30, 40, 50 nucleótidos. Se
entiende que la longitud puede ser mayor o menor, según sea
apropiado con las condiciones de reacción de los métodos de esta
invención.
Para conseguir la hibridación (que, como se
conoce bien en la técnica, depende de otros factores tales como, por
ejemplo, fuerza iónica y temperatura), los cebadores compuestos para
usar en los métodos y las composiciones de la presente invención,
tienen preferentemente al menos aproximadamente 60%, más
preferentemente al menos aproximadamente 75%, incluso más
preferentemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferible al
menos aproximadamente 95% de complementariedad con el ácido nucleico
diana. Las partes de ADN y ARN individuales de los cebadores
compuestos tienen preferentemente al menos aproximadamente 60%, más
preferentemente al menos aproximadamente 75%, incluso más
preferentemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferible al
menos aproximadamente 95% de complementariedad con el ácido nucleico
diana.
Tal y como se ha descrito en esta memoria, se
pueden utilizar uno o varios cebadores compuestos en una reacción de
amplificación.
En algunas realizaciones de los métodos de la
presente invención, especialmente si se emplea una amplificación
basada en la transcripción, se incluye un polinucleótido que
comprende una secuencia de terminación, cuyos ejemplos se
proporcionan a continuación.
Un segundo oligonucleótido que se puede utilizar
en los métodos de amplificación de la invención, es un
oligonucleótido conmutador de la terminación (TSO). En una
realización, el TSO actúa como una secuencia de terminación. En otra
realización, el TSO actúa como una secuencia de terminación y
proporciona una secuencia propromotora.
En métodos de amplificación descritos
previamente, basados en un oligonucleótido conmutador del molde, se
redujo la concentración de este oligonucleótido debido a la
inhibición de la hibridación del segundo cebador o de la segunda
etapa de hibridación del mismo cebador, cuando el método se diseña
para utilizar una especie única de cebador. Los métodos de la
invención están exentos de esta limitación. En contraposición con
métodos descritos previamente que emplean TSOs, el oligonucleótido
conmutador del molde se puede utilizar con una concentración elevada
para amplificar, según los métodos de la presente invención. Esta
característica asegura una hibridación eficaz del oligonucleótido
con la hebra diana y maximiza el rendimiento del complejo
trimolecular, el sustrato para la extensión del cebador y la
conmutación del molde. Un atributo adicional a esta característica
es la eficacia de la hibridación del producto de extensión del
cebador desplazado con el oligonucleótido conmutador del molde, para
formar un sustrato para la polimerasa de ARN, tal y como se ha
descrito.
Un TSO comprende una parte 3' que se puede
hibridar con la diana y una parte 5' que está diseñada para conmutar
la hebra durante la polimerización (véase la Figura
2A-C). El diseño de un TSO que produzca una
conmutación de la hebra es conocido en la técnica, tal como ha sido
descrito previamente por Patel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
1996, 93:2969-2974.
La parte 3' se hibrida con el molde en el lugar
5' con la posición o región en el polinucleótido molde que es
complementaria al extremo 3' del producto de extensión del cebador,
antes de conmutar el molde del polinucleótido molde con la parte no
hibridada del TSO ("sitio de terminación").
En una realización, la conmutación de la hebra se
favorece con la presencia de secuencias cortas complementarias entre
sí en los segmentos del TSO inmediatamente 5' y 3' a la unión entre
las partes hibridadas y no hibridadas del TSO. Sin tener la
intención de estar atado a la teoría, una explicación es que en el
acontecimiento en el que el producto de extensión del cebador es
extendido en la parte del ácido nucleico diana que se hibrida con el
TSO (mediante desplazamiento de la parte hibridada del TSO), el
extremo 3' del producto de extensión del cebador podría comprender
una secuencia corta que se puede unir con su secuencia corta
complementaria en el segmento del TSO que está inmediatamente
adyacente a la unión entre las partes hibridadas y no hibridadas del
TSO. Esto incrementa la eficacia de la conmutación del molde,
incrementando la probabilidad de que el producto de extensión del
cebador pueda conmutar la parte de la cola del TSO como molde. La
longitud de las secuencias cortas complementarias es preferentemente
desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 20 nucleótidos, más
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15
nucleótidos y lo más preferible, desde aproximadamente 7 hasta
aproximadamente 10 nucleótidos. En algunas realizaciones, la
longitud es de al menos aproximadamente cualquiera entre 1, 3, 5, 7,
10 nucleótidos, con un límite superior de aproximadamente cualquiera
entre 10, 15, 20, 25 nucleótidos. Se entiende que la longitud puede
ser mayor o menor, según sea apropiado para las condiciones de
reacción de los métodos de esta invención.
En algunas realizaciones, la parte 5' del TSO
comprende una secuencia (de aquí en adelante "secuencia
propromotora") que se diseña para la formación de un promotor
bicatenario de una polimerasa de ARN. Esta realización del TSO
funcionaría tanto como secuencia de terminación como para
proporcionar un molde promotor. En esta realización, la secuencia
propromotora del TSO sirve como molde para incorporar una secuencia
propromotora (generalmente complementaria a la secuencia
propromotora del TSO molde) en el producto de extensión del cebador.
Una hibridación posterior de un TSO que comprende una secuencia
propromotora que es hibridable con la secuencia propromotora del
producto de extensión del cebador, da como resultado la formación de
un promotor bicatenario, capaz de efectuar la transcripción mediante
una polimerasa de ARN adecuada. Las secuencias promotoras que
permiten la transcripción de un ADN molde, son conocidas en la
técnica, como lo son los métodos para obtenerlas y/o prepararlas.
Preferentemente, la secuencia promotora se selecciona para
proporcionar una actividad transcripcional óptima de la polimerasa
de ARN utilizada en particular. Los criterios para tal selección, es
decir, una secuencia promotora particular, favorecida
particularmente por una polimerasa de ARN particular, también son
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de los
promotores para la transcripción mediante una polimerasa de ARN
dependiente del ADN de T7 y SP6, son conocidas en la técnica. La
secuencia promotora puede ser de origen eucariota o procariota.
En una realización, la secuencia promotora es
adyacente a una secuencia que está diseñada para proporcionar una
transcripción mejorada u óptima, con la polimerasa de ARN utilizada.
En algunas realizaciones, la secuencia no está relacionada (es
decir, no se hibrida sustancialmente) con el ácido nucleico diana.
Una transcripción mejor tiene lugar cuando la actividad
transcripcional de la polimerasa de un promotor que está ligado
funcionalmente con dicha secuencia, es mayor que la de un promotor
que no está ligado. Los requerimientos de la secuencia para una
transcripción óptima son conocidos generalmente en la técnica, tal y
como se ha descrito previamente para diversas polimerasas de ARN
dependientes de ADN, como en los documentos de patentes de EE.UU. nº
5.766.849 y 5.654.142.
En una realización preferida, un segmento de la
parte 3' del TSO (que incluye la parte 3' completa que se hibrida
con la diana) que se hibrida con el ADN molde, se fija al ADN molde
de modo que se inhibe sustancialmente, o al menos suficientemente,
el desplazamiento del TSO por la polimerasa que efectúa la extensión
del cebador. Métodos adecuados para conseguir tal fijación, incluyen
técnicas conocidas en la técnica, tal como el uso de un análogo de
citosina que contiene una modificación del heterociclo del gancho G
(descrita por Flanagan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999,
96(7):3513-8); y que encierra ácidos
nucleicos (descrito, p. ej., por Kumar y col., Bioorg. Med. Chem.
Lett. 1998, 8(16):2219-22; y Wahlestedt y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000,
97(10):5633-8). Otros métodos adecuados
incluyen el uso, cuando es apropiado, de secuencias con un alto
contenido en GC y/o reticulación. Cualquiera de estos métodos para
obtener una fijación mejorada se puede utilizar de forma aislada o
en combinación. El desplazamiento del TSO se inhibe sustancial o
suficientemente si la polimerasa conmuta el molde de la hebra de
ácido nucleico diana de la parte no hibridada del TSO, en al menos
aproximadamente 25%, preferentemente al menos aproximadamente 50%,
más preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo más preferido
al menos aproximadamente 90% de los acontecimientos de extensión del
cebador. Un desplazamiento del TSO inhibido sustancial o
suficientemente también puede estar indicado empíricamente, si los
métodos de amplificación conducen a un resultado satisfactorio, en
cuanto a cantidad de producto deseado. Generalmente, bajo una serie
de condiciones dadas de reacción, el TSO "modificado" se une
más estrechamente al molde, que comparado con un TSO no modificado
de este modo.
La longitud de la parte del TSO que se hibrida
con la hebra de ácido nucleico diana, es preferentemente desde
aproximadamente 5 hasta 50 nucleótidos, más preferentemente desde
aproximadamente 20 hasta 45 nucleótidos y lo más preferido desde
aproximadamente 25 a 40 nucleótidos. En otras realizaciones, la
longitud es al menos de aproximadamente cualquiera entre las
siguientes: 10, 15, 20, 25, 30; y menos de aproximadamente
cualquiera entre las siguientes: 35, 40, 45, 50, 55. Se entiende que
la longitud puede ser mayor o menor, según sea apropiado para las
condiciones de reacción de los métodos de esta invención. La
complementariedad de la parte del TSO que se hibrida con la hebra de
ácido nucleico diana es preferentemente de al menos aproximadamente
25%, más preferentemente al menos aproximadamente 50%, incluso más
preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo más preferido al
menos aproximadamente 90%, con la secuencia a la que se pretende
unir en el ácido nucleico diana.
En algunas realizaciones, la secuencia de
terminación de la extensión del cebador es proporcionada por una
secuencia de bloqueo. La secuencia de bloqueo es un polinucleótido,
generalmente un polinucleótido sintético que es monocatenario y que
comprende una secuencia que es hibridable, preferentemente
complementaria a un segmento de la secuencia de ácido nucleico diana
de la posición en la secuencia diana que es complementaria al
extremo 3' del producto de extensión del cebador ("sitio de
terminación"). El bloqueador comprende nucleótidos que se unen al
ácido nucleico diana con una afinidad, preferentemente una alta
afinidad, de modo que la secuencia de bloqueo resiste el
desplazamiento con la polimerasa de ADN en el transcurso de la
extensión del cebador, en preferentemente, más de aproximadamente
30%, más preferentemente más de aproximadamente 50%, incluso más
preferentemente más de aproximadamente 75% y lo más preferido, más
de aproximadamente 90% de los acontecimientos de extensión del
cebador. La longitud y la composición del polinucleótido de bloqueo
deben ser tales que se evite una hibridación no específica al azar
excesiva, bajo las condiciones de los métodos de la presente
invención. La longitud del polinucleótido de bloqueo es
preferentemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 30
nucleótidos, más preferentemente desde aproximadamente 5 hasta
aproximadamente 25 nucleótidos, incluso más preferentemente desde
aproximadamente 8 hasta aproximadamente 20 nucleótidos y lo más
preferido desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 15
nucleótidos. En otras realizaciones, el polinucleótido de bloqueo
tiene al menos aproximadamente cualquiera entre los siguientes: 3,
5, 8, 10, 15; y menos de aproximadamente cualquiera entre los
siguientes: 20, 25, 30, 35. Se entiende que la longitud puede ser
mayor o menor, según sea apropiado con las condiciones de reacción
de los métodos de esta invención. La complementariedad del
polinucleótido de bloqueo es preferentemente de al menos
aproximadamente 25%, más preferentemente al menos aproximadamente
50%, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo
más preferido al menos aproximadamente 90% con la secuencia a la que
se pretende unir en el ácido nucleico diana.
En una realización, la secuencia de bloqueo que
comprende un segmento que se hibrida con el ADN diana está fijada al
ADN diana de modo que dicho desplazamiento de la secuencia de
bloqueo con la polimerasa que efectúa la extensión del cebador, está
inhibido sustancial o al menos suficientemente. Medios adecuados
para conseguir dicha fijación y para determinar sustancial o
suficientemente la inhibición del desplazamiento, son como los
descritos anteriormente para el TSO empleado en los métodos de la
presente invención.
En una realización, el polinucleótido de bloqueo
no puede actuar de forma eficaz como cebador para la extensión del
ácido nucleico (es decir, la extensión de la secuencia de bloqueo
está reducida o inhibida). Las técnicas para bloquear la función del
cebador del polinucleótido de bloqueo incluyen cualquiera que evite
la adición de nucleótidos al extremo 3' del cebador con una
polimerasa de ADN. Tales técnicas son conocidas en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, la sustitución o la modificación del grupo
3' hidroxilo o la incorporación de un nucleótido modificado, tal
como un didesoxinucleótido, en la posición más 3' del polinucleótido
de bloqueo que no es capaz de anclar la adición de nucleótidos con
una polimerasa de ADN.
Algunas realizaciones emplean un polinucleótido
que comprende un propromotor y una región que se hibrida con un
producto de extensión del cebador desplazado. En algunas
realizaciones, el polinucleótido es un TSO que contiene una
secuencia propromotora, tal y como se ha descrito anteriormente. En
otras realizaciones, la secuencia propromotora está contenida en un
PTO, tal y como se describe a continuación.
En algunas realizaciones, los métodos emplean una
secuencia promotora para la transcripción que es proporcionada por
un oligonucleótido molde propromotor (PTO).
Un PTO para uso en los métodos y en las
composiciones de la presente invención es un polinucleótido
monocatenario, generalmente ADN, que comprende una secuencia
propromotora que está diseñada para la formación de un promotor bc
de una polimerasa de ARN y una parte capaz de hibridarse con el
extremo 3' del producto de extensión del cebador. En una realización
preferida, la secuencia propromotora está localizada en la parte 5'
del oligonucleótido y la secuencia que se hibrida está localizada en
la parte 3' del oligonucleótido. En una realización, y más
típicamente, las secuencias del promotor y las que se hibridan se
solapan en identidad de secuencia. En aún otra realización, las
secuencias del promotor y las que se hibridan son secuencias
diferentes. En otra realización, las secuencias del promotor y las
que se hibridan son la misma secuencia y están, por tanto, en la
misma posición en el PTO. En las realizaciones en las que la
hibridación del PTO con el producto de extensión del cebador, dan
como resultado un híbrido que comprende una parte sobresaliente (el
extremo 5' del PTO que no se hibrida con el producto de extensión
del cebador desplazado, que comprende típicamente toda o parte de la
secuencia propromotora), la polimerasa de ADN rellena la parte
sobresaliente para crear un promotor bicatenario capaz de efectuar
la transcripción mediante una polimerasa de ARN adecuada.
Las secuencias promotoras que permiten la
transcripción de un ADN molde, son conocidas en la técnica y se han
descrito anteriormente. Preferentemente, la secuencia promotora se
selecciona para proporcionar una actividad transcripcional óptima de
la polimerasa de ARN particular empleada. Los criterios para dicha
selección, es decir, una secuencia promotora particular, favorecida
especialmente por una polimerasa de ARN particular, son también
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de los
promotores para la transcripción con una polimerasa de ARN
dependiente de ADN de T7 y SP6, son conocidas en la técnica. La
secuencia promotora puede ser de origen procarionte o
eucarionte.
En algunas realizaciones, el PTO comprende una
secuencia intercalada entre una secuencia propromotora y una parte
capaz de hibridarse con el extremo 3' del producto de extensión del
cebador. La longitud adecuada de la secuencia intercalada se puede
determinar empíricamente y puede tener al menos aproximadamente 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12, 15 nucleótidos. La identidad de secuencia
adecuada de la secuencia intercalada, también se puede determinar
empíricamente y la secuencia se diseña para mejorar preferentemente,
pero no necesariamente, el grado de amplificación, comparado con la
omisión de secuencia. En una realización, la secuencia intercalada
es una secuencia que está diseñada para proporcionar una
transcripción mejorada u óptima, con la polimerasa de ARN empleada.
Generalmente, la secuencia no está relacionada (es decir, no se
hibrida sustancialmente) con el ácido nucleico diana. Una
transcripción óptima tiene lugar cuando la actividad transcripcional
de la polimerasa de un promotor que está enlazado funcionalmente con
dicha secuencia, es mayor que la de un promotor que no está
enlazado. Los requerimientos de la secuencia para una transcripción
óptima, se conocen generalmente en la técnica, como se ha descrito
previamente para diversas polimerasas de ARN dependientes de ADN,
tal como en los documentos de patentes de EE.UU. nº 5.766.849 y
5.654.142, y también se pueden determinar empíricamente.
En otra realización, el PTO comprende una
secuencia que está 5' en relación con la secuencia propromotora, es
decir, el PTO comprende nucleótidos adicionales (que pueden ser o no
secuencias reguladoras de la transcripción) situados 5' de la
secuencia propromotora. Generalmente, pero no necesariamente, la
secuencia no es hibridable con el producto de extensión del
cebador.
En una realización, el PTO no puede actuar
eficazmente como cebador para la extensión de ácidos nucleicos. Las
técnicas para bloquear la función cebadora del PTO incluyen
cualquiera que evite la adición de nucleótidos en el extremo 3' del
PTO con una polimerasa de ADN. Tales técnicas son conocidas en la
técnica, incluyendo, por ejemplo, la sustitución o la modificación
del grupo 3' hidroxilo o la incorporación de un nucleótido
modificado, tal como un didesoxinucleótido, en la posición más 3' el
PTO que no es capaz de anclar la adición de nucleótidos con una
polimerasa de ADN. También es posible bloquear el extremo 3'
empleando un marcador o una molécula pequeña que es un miembro de
una pareja de unión específica, tal como biotina.
La longitud de la parte del PTO que se hibrida
con el producto de extensión del cebador desplazado es
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50
nucleótidos, más preferentemente desde aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 40 nucleótidos, incluso más preferentemente desde
aproximadamente 15 hasta aproximadamente 35 nucleótidos y lo más
preferido desde aproximadamente 20 a 30 nucleótidos. En algunas
realizaciones, la parte que se hibrida tiene al menos
aproximadamente cualquiera entre las siguientes: 3, 5, 10, 15, 20; y
menos de aproximadamente cualquiera entre las siguientes: 30, 40,
50, 60. La complementariedad de la parte que se hibrida es
preferentemente de al menos aproximadamente 25%, más preferentemente
al menos aproximadamente 50%, incluso más preferentemente al menos
aproximadamente 75% y lo más preferido al menos aproximadamente 90%
con la secuencia a la que se pretende unir en el ácido nucleico
diana.
Los métodos de amplificación de la invención
emplean las siguientes enzimas: una polimerasa de ADN, una
ribonucleasa tal como ARNasaH y, opcionalmente, una polimerasa de
ARN dependiente de ADN.
Las polimerasas de ADN para uso en los métodos y
en las composiciones de la presente invención son capaces de
efectuar la extensión del cebador compuesto de acuerdo con los
métodos de la presente invención. Por tanto, una polimerasa
preferida es una que es capaz de extender un cebador de ácido
nucleico a lo largo de un molde de ácido nucleico que está
compuesto, al menos predominantemente, por desoxinucleótidos. La
polimerasa tiene que ser capaz de desplazar una hebra de ácido
nucleico desde el polinucleótido al que está unida la hebra
desplazada y, generalmente, es preferible cuando la polimerasa
muestra la mayor capacidad de desplazamiento de la hebra (es decir,
comparado con otras polimerasas que no tienen mucha capacidad de
desplazar la hebra). Preferentemente, la polimerasa de ADN tiene una
alta afinidad por la unión con el extremo 3' de un oligonucleótido
hibridado con una hebra de ácido nucleico. Preferentemente, la
polimerasa de ADN no posee sustancialmente una actividad de corte.
Preferentemente, la polimerasa tiene una actividad exonucleasa
5'\rightarrow3' reducida o inexistente, de modo que se minimiza la
degradación del cebador, la terminación o los polinucleótidos de
extensión del cebador. Generalmente, esta actividad exonucleasa
depende de factores tales como el pH, la concentración salina, de si
el molde es mono o bicatenario, etc., todos ellos son conocidos por
un experto en la técnica. Las polimerasas de ADN mutantes en las que
la actividad exonucleasa 5'\rightarrow3' ha sido delecionada, son
conocidas en la técnica y son adecuadas para los métodos de
amplificación descritos en esta memoria. Las polimerasas de ADN
adecuadas para el uso en los métodos y las composiciones de la
presente invención, incluyen las descritas en los documentos de
patente de EE.UU. nº 5.648.211 y 5.744.312, que incluyen exo Vent
(New England Biolabs), exo Deep Vent (New England Biolabs), Bst
(BioRad), exo Pfu (Stratagene), Bca (Panvera), sequencing grade Taq
(Promega) y polimerasas de ADN termoestables procedentes de
termoanaerobacter termohidrosulfuricus. Se prefiere que la
polimerasa de ADN desplace los productos de extensión del cebador
del ácido nucleico molde en al menos aproximadamente 25%, más
preferentemente al menos aproximadamente 50%, incluso más
preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo más preferible al
menos aproximadamente 90% de la incidencia de contacto entre la
polimerasa y el extremo 5' del producto de extensión del cebador. En
algunas realizaciones, se prefiere el uso de polimerasas de ADN
termoestables con actividad de desplazamiento de la hebra. Tales
polimerasas se conocen en la técnica, tal y como se describe en el
documento de patente de EE.UU. nº 5.744.312 (y referencias citadas
en la memoria). Preferentemente, la polimerasa de ADN tiene una
actividad reducida o no tiene actividad de corrección de
pruebas.
La ribonucleasa para uso en los métodos y las
composiciones de la presente invención es capaz de cortar
ribonucleótidos en un híbrido de ARN/ADN. Preferentemente, la
ribonucleasa corta ribonucleótidos sin tener en cuenta la identidad
y el tipo de nucleótidos adyacentes al ribonucleótido que se va a
cortar. Se prefiere que la ribonucleasa corte independientemente de
la identidad de secuencia. Ejemplos de ribonucleasas adecuadas para
los métodos y las composiciones de la presente invención, son bien
conocidos en la técnica, incluyendo la ribonucleasa
H (ARNasaH).
H (ARNasaH).
Las polimerasas de ARN dependientes de ADN para
usar en los métodos y las composiciones de la presente invención,
son conocidas en la técnica. Se pueden utilizar polimerasas
eucariotas o procariotas. Los ejemplos incluyen polimerasas de ARN
de T7, T3 y SP6. Generalmente, la polimerasa de ARN seleccionada es
capaz de transcribir desde la secuencia promotora proporcionada por
el TSO o el PTO, tal y como se ha descrito en esta memoria.
Generalmente, la polimerasa de ARN es una polimerasa dependiente de
ADN que es preferentemente capaz de transcribir a partir de un molde
de ADN monocatenario mientras que la región del promotor sea
bicatenaria.
En general, las enzimas empleadas incluidas en
los métodos y las composiciones de la presente invención, no deben
producir una degradación sustancial de los componentes de ácido
nucleico de dichos métodos y composiciones.
Los medios de reacción y las condiciones
adecuadas para llevar a cabo los métodos de la presente invención,
son los que permiten la amplificación de ácidos nucleicos según los
métodos de la presente invención. Tales medios y condiciones son
conocidos por personas expertas en la técnica y se describen en
diversas publicaciones, tales como los documentos de patentes de
EE.UU. nº 5.679.512 y PCT nº de pub. WO99/42618. Por ejemplo, un
tampón puede ser tampón Tris, aunque también se pueden utilizar
otros tampones, mientras que los componentes del tampón no inhiban
los componentes enzimáticos de los métodos de la invención. El pH es
preferentemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 11,
más preferentemente desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente
10, incluso más preferible desde aproximadamente 7 hasta
aproximadamente 9 y lo más preferible desde aproximadamente 7,5
hasta aproximadamente 8,5. El medio de reacción también puede
incluir iones metálicos bivalentes, tales como Mg^{2+} o
Mn^{2+}, con una concentración final de iones libres que está
dentro del intervalo desde aproximadamente 0,01 hasta
aproximadamente 10 mM y lo más preferible desde aproximadamente 1
hasta 5 mM. El medio de reacción también puede incluir otras sales,
tales como KCl que contribuye a la fuerza iónica total del medio.
Por ejemplo, el intervalo de una sal tal como KCl, es
preferentemente desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 100
mM, más preferentemente desde aproximadamente 0 hasta
aproximadamente 75 mM y lo más preferible desde aproximadamente 0
hasta aproximadamente 50 mM. El medio de reacción puede incluir
adicionalmente aditivos que podrían afectar a la realización de las
reacciones de amplificación, pero que no son constituyentes de la
actividad de los componentes enzimáticos de los métodos. Tales
aditivos incluyen proteínas tales como BSA y detergentes no iónicos
tales como NP40 o Triton. Los reactivos, tales como DTT, que son
capaces de mantener actividades enzimáticas, también se pueden
incluir. Tales reactivos son conocidos en la técnica. Si es
adecuado, se puede incluir un inhibidor de ARNasa (tal como
ARNasina) que no inhibe la actividad de la ARNasa empleada en el
método. Cualquier aspecto de los métodos de la presente invención
puede tener lugar a la misma temperatura o a temperaturas diversas.
Preferentemente, las reacciones se realizan isotérmicamente, lo que
evita el complicado proceso de termociclado. La reacción de
amplificación se realiza a una temperatura que permite la
hibridación de los oligonucleótidos (cebador, TSO, secuencia de
bloqueo y/o PTO) de la presente invención con el polinucleótido
molde y que no inhibe sustancialmente la actividad de las enzimas
empleadas. La temperatura puede estar en el intervalo de
preferentemente aproximadamente 25ºC hasta aproximadamente 85ºC, más
preferentemente aproximadamente 30ºC hasta aproximadamente 75ºC y lo
más preferible aproximadamente 37ºC hasta aproximadamente 70ºC. En
algunas realizaciones que incluyen la transcripción de ARN, la
temperatura para las etapas de la transcripción es menor que
la(s) temperatura(s) de las etapas precedentes. En
estas realizaciones, la temperatura de las etapas de transcripción
pueden estar en el intervalo de preferentemente aproximadamente 25ºC
hasta aproximadamente 80ºC, más preferentemente aproximadamente 30ºC
hasta aproximadamente 75ºC y lo más preferible aproximadamente 37ºC
hasta aproximadamente 70ºC.
El nucleótido y/o análogos de nucleótidos, tales
como trifosfatos de desoxirribonucleósidos que se pueden emplear
para la síntesis de los productos de extensión del cebador en los
métodos de la invención, se proporcionan en una cantidad desde
preferentemente aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2500
\muM, más preferentemente aproximadamente 100 hasta
aproximadamente 2000 \muM, incluso más preferentemente
aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1700 \muM, y lo más
preferido aproximadamente 800 hasta aproximadamente 1500 \muM. En
algunas realizaciones, se incluye un nucleótido o un análogo de
nucleótido cuya presencia en la hebra de extensión del cebador
mejora el desplazamiento de la hebra (por ejemplo, provocando un
emparejamiento de bases que es más débil que el emparejamiento
convencional de bases AT, CG). Tal nucleótido o análogos de
nucleótidos incluye desoxiinosina y otras bases modificadas, todas
ellas conocidas en la técnica. Los nucleótidos y/o análogos, tales
como trifosfatos de ribonucleósidos, que se pueden emplear para la
síntesis de los transcritos de ARN en los métodos de la invención,
se proporcionan en una cantidad desde preferentemente
aproximadamente 0,25 hasta aproximadamente 6 mM, más preferentemente
aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5 mM, incluso más
preferentemente aproximadamente 0,75 hasta aproximadamente 4 mM y lo
más preferible aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3 mM.
Los componentes oligonucleótidos de las
reacciones de amplificación de la invención están generalmente en
exceso para la cantidad de secuencia de ácidos nucleicos diana que
se va a amplificar. Se pueden proporcionar en una forma que se
multiplique aproximadamente o al menos por cualquiera de las
siguientes: 10, 10^{2}, 10^{4}, 10^{6}, 10^{8}, 10^{10},
10^{12} veces la cantidad de ácido nucleico diana. Los cebadores
compuestos, TSO, PTO y la secuencia de bloqueo se pueden
proporcionar cada uno con aproximadamente o al menos cualquiera de
las siguientes concentraciones: 50 nM, 100 nM, 500 nM, 1000 nM, 2500
nM, 5000 nM.
En una realización, los componentes anteriores se
añaden simultáneamente al comienzo del proceso de amplificación. En
otra realización, los componentes se añaden con cualquier orden,
antes o después de los momentos adecuados durante el proceso de
amplificación, según sea necesario y/o esté permitido por la
reacción de amplificación. Tales momentos, algunos de los cuales se
indican a continuación, pueden ser identificados fácilmente por un
experto en la técnica. Las enzimas empleadas para la amplificación
de ácidos nucleicos según los métodos de la presente invención, se
pueden añadir a la mezcla de reacción antes de la etapa de
desnaturalización del ácido nucleico, después de la etapa de
desnaturalización o después de la hibridación del cebador y/o la
secuencia de bloqueo con el ADN diana, tal y como se determina por
su estabilidad térmica y/o otras consideraciones conocidas por el
experto en la técnica.
Las reacciones de amplificación se pueden detener
en diversos momentos y reanudar un tiempo después. Dichos momentos
pueden ser identificados fácilmente por un experto en la técnica.
Los métodos para detener las reacciones son conocidos en la técnica,
incluyendo, por ejemplo, enfriar la mezcla de reacción a una
temperatura que inhibe la actividad enzimática. Métodos para
reanudar las reacciones son también conocidos en la técnica, por
ejemplo, aumentar la temperatura de la mezcla de reacción hasta una
temperatura que permita la actividad enzimática. En algunas
realizaciones, uno o varios de los componentes de las reacciones se
reponen antes, durante o después de la reanudación de las
reacciones. Alternativamente, la reacción se puede dejar transcurrir
la reacción (es decir, desde el comienzo hasta el final) sin
interrupciones.
La detección del producto de amplificación es
indicativa de la presencia de la secuencia diana. También es viable
un análisis cuantitativo. Los métodos de detección directa o
indirecta (incluyendo cuantificación) son bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, comparando la cantidad de producto amplificado
de una muestra del ensayo que contiene una cantidad desconocida de
un polinucleótido que contiene una secuencia diana con el producto
de la amplificación de una muestra de referencia, que tiene una
cantidad conocida de un polinucleótido que contiene la secuencia
diana, se puede determinar la cantidad de secuencia diana en la
muestra del ensayo. Los métodos de amplificación de la presente
invención también se pueden extender al análisis de alteraciones de
la secuencia y secuenciación del ácido nucleico diana. Además, la
detección podría realizarse, por ejemplo, mediante el examen de los
productos de la traducción de los productos de la amplificación del
ARN.
Lo siguiente son ejemplos de los métodos de
amplificación de la invención. Se entiende que se pueden poner en
práctica otras realizaciones, dada la descripción general
proporcionada anteriormente. Por ejemplo, la referencia al uso de un
cebador compuesto, significa que se puede utilizar cualquiera de los
cebadores compuestos descritos en esta memoria.
En un aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para amplificar una secuencia de nucleótidos
complementaria a una secuencia de nucleótidos diana. En este método,
se consigue una amplificación isotérmica y lineal de la secuencia de
ácidos nucleicos. En otro aspecto, se proporciona un método para
amplificar una secuencia de polinucleótidos diana, en donde el
producto amplificado es un ARN transcrito, al que se hace referencia
a veces en esta memoria como método de amplificación lineal
"mejorado". En una realización, se proporciona un método para
amplificar de forma mejorada, lineal e isotérmicamente una secuencia
de ácidos nucleicos que se basa en TSO (de aquí en adelante
"Método 1"). En otra realización, se proporciona un método de
amplificación mejorada, isotérmica y lineal de la secuencia de
ácidos nucleicos que se basa en la secuencia de bloqueo y en un PTO
(de aquí en adelante, "Método 2").
Cuando no está ligado a la transcripción, el
método de amplificación de la invención proporciona una
amplificación isotérmica lineal de una secuencia de ácidos nucleicos
diana. El método utiliza un solo cebador compuesto. En una
realización, el método también emplea una secuencia de terminación,
tal como una secuencia de bloqueo como la descrita en el Método 2 o
un TSO, como se describe en el Método 1. Los Métodos 1 y 2 se
describen a continuación. Mientras que la amplificación lineal no
esté ligada a la transcripción, los componentes y las etapas que
conducen a la formación de un complejo que comprende una secuencia
promotora para una polimerasa de ARN dependiente de ADN, no están
incluidos.
La secuencia de terminación (TSO o el componente
de secuencia de bloqueo, si se emplea) se añade para producir un
producto con extremo 3' definido. En algunas realizaciones,
una(s) secuencia(s) natural dentro del molde 5' del
sitio de unión del cebador, inhibe la polimerización del ácido
nucleico de modo que se consigue la terminación de la extensión del
cebador. Tales secuencias naturales son conocidas en la técnica, por
ejemplo, secuencias ricas en GC o se pueden determinar
empíricamente. El uso de una secuencia de terminación es
particularmente beneficioso cuando se amplifica ADN genómico, de
modo que se proporciona un extremo definido de la extensión del
cebador. Cuando no se desea esta característica, la amplificación
lineal e isotérmica de acuerdo con los métodos de la invención, se
puede realizar sin una secuencia de terminación. La amplificación
isotérmica y lineal utiliza adicionalmente dos enzimas, una
polimerasa de ADN y una ribonucleasa tal como una ARNasaH. La
descripción esquemática de la amplificación lineal e isotérmica de
ácidos nucleicos de la invención, se muestra en la Figura
1A-C.
De forma similar a los Métodos 1 y 2, tal y como
se describe a continuación, el método de amplificación lineal se
diseña para amplificar una diana de ADN monocatenario. Cuando la
diana que se va a amplificar es ADNbc, la diana se desnaturaliza en
primer lugar para producir una diana monocatenaria. La
desnaturalización de la diana se puede realizar empleando métodos
conocidos en la técnica, tal como tratamiento térmico o alcalino.
Cuando la diana es un ARN monocatenario, tal como ARNm o ARN vírico,
la diana se transcribe en primer lugar para producir diana de ADNc,
según métodos conocidos en la técnica.
Tal y como se muestra en la Figura
1A-C, el método de amplificación lineal e isotérmico
de la invención comprende etapas similares a las etapas iniciales de
los métodos de amplificación lineal mejorada (Métodos 1 y 2)
descritos a continuación y en las Figuras 2A-C y
3A-D. El ácido nucleico diana se combina con un
cebador compuesto, una polimerasa de ADN, una ribonucleasa tal como
ARNasaH y, opcionalmente, con un componente de secuencia de bloqueo
o TSO, tal y como se ha descrito anteriormente. En una realización,
cada reacción de amplificación incluye cebadores compuestos de una
secuencia idéntica. En otra realización, cada reacción de
amplificación incluye una mezcla de variantes de cebador compuesto,
en donde las variantes representan dos o más secuencias homólogas
pero no idénticas y en donde todas son capaces de hibridarse con la
misma secuencia de ácido nucleico diana. La complementariedad es
preferentemente de al menos aproximadamente 50%, más preferentemente
al menos aproximadamente 75% y lo más preferible al menos
aproximadamente 90%. Las ventajas de esta realización incluyen la
capacidad de introducir diferentes secuencias de interés en los
productos de extensión del cebador. En aún otra realización, cada
reacción de amplificación incluye una mezcla de cebadores
compuestos, en donde los cebadores representan dos o más secuencias
no idénticas que tienen poca o ninguna homología, y en donde los
cebadores se hibridan preferentemente con diferentes secuencias de
ácido nucleico diana o sitios diferentes a lo largo de la misma
hebra de ácido nucleico diana. Las ventajas de esta realización
incluyen la detección múltiple y/o el análisis de ácidos nucleicos
diana a través de la amplificación de una variedad de especies de
ácido nucleico diana en una sola reacción de
amplificación.
amplificación.
La Figura 1A-C ilustra una
realización que incluye una secuencia de terminación. El cebador
compuesto y la secuencia de terminación (TSO o componente de
secuencia de bloqueo) se hibridan con la misma hebra de la diana,
para formar un complejo trimolecular, XX (Figura
1A-C). El extremo 3' del cebador compuesto se
extiende a lo largo de la hebra diana mediante la polimerasa, hasta
el sitio de hibridación del TSO o del componente de la secuencia de
bloqueo, para obtener un complejo XXI (Figura 1A-C).
Una ribonucleasa, tal como ARNasaH, corta el ARN, generalmente la
parte de ARN 5' del cebador extendido del complejo XXI (Figura
1A-C) para producir el complejo XXII (Figura
1A-C). Un segundo cebador compuesto se une con el
complejo XXII (Figura 1A-C) mediante hibridación de
la parte de ARN, generalmente la parte de ARN 5', para producir el
complejo XXIII (Figura 1A-C). La parte 3' libre del
cebador compuesto unido desplaza entonces el extremo 5' del producto
de extensión del cebador y se hibrida con la diana para formar el
complejo XXIV (Figura 1A-C). La hibridación del
extremo 3' del cebador compuesto con la diana está favorecida
generalmente sobre la hibridación del extremo 5' del producto de
extensión del cebador, puesto que el extremo 3' hibridado del
cebador es un sitio de unión de la polimerasa de ADN que extenderá
entonces el extremo 3' del cebador a lo largo de la diana. La
extensión del cebador da como resultado el desplazamiento del primer
producto de extensión del cebador para producir el complejo XXV
(Figura 1A-C). El procedimiento se repite para
conseguir múltiples productos de desplazamiento del ADN
monocatenario que son generalmente complementarios a la secuencia
diana.
El ADN monocatenario (es decir, los productos de
extensión del cebador desplazados) del método de amplificación
lineal e isotérmica, se detectan fácilmente mediante cualquiera de
los numerosos métodos de detección conocidos en la técnica. Se han
descrito previamente diversos métodos de detección homogéneos y
heterogéneos, adecuados para la detección de moléculas de ácido
nucleico monocatenario, incluyendo la identificación por el tamaño
y/o propiedades de migración en electroforesis en gel, o por
hibridación de sondas específicas de la secuencia.
La detección del producto de amplificación es
indicativa de la presencia de la secuencia diana. El análisis
cuantitativo también es posible. Por ejemplo, comparando la cantidad
de producto amplificado de una muestra del ensayo que contiene una
cantidad desconocida de un polinucleótido que contiene una secuencia
diana, con el producto de amplificación de una muestra de referencia
que tiene una cantidad conocida de un polinucleótido que contiene la
secuencia diana, se puede determinar la cantidad de secuencia diana
en la muestra del ensayo. Los métodos de amplificación de la
presente invención también se puede extender al análisis de
alteraciones de la secuencia y a la secuenciación del ácido nucleico
diana.
Se puede esperar la producción de al menos 1, al
menos 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente
1000, al menos aproximadamente 10^{5}, al menos aproximadamente
10^{7}, al menos aproximadamente 10^{9}, al menos
aproximadamente 10^{12} copias complementarias de cada copia del
polinucleótido molde, conduciendo, por tanto, hasta al menos 1, al
menos 10, al menos 100, al menos 1000, al menos aproximadamente
10^{5}, al menos aproximadamente 10^{7}, al menos
aproximadamente 10^{9}, al menos aproximadamente 10^{12} veces
una mejora en relación con cada copia del polinucleótido molde.
La presente invención también proporciona métodos
para amplificar una secuencia de polinucleótidos diana, en donde el
producto amplificado es ARN que contiene la secuencia transcrita (es
decir, la misma secuencia que la diana). La amplificación de un
ácido nucleico diana de acuerdo con el Método 1, que da como
resultado la generación de un único producto de amplificación
intermedio que comprende la diana y partes relacionadas con el
oligonucleótido conmutador del molde (TSO), proporciona el
acoplamiento de la amplificación lineal con la transcripción. El
complejo formado por la hibridación del oligonucleótido conmutador
del molde y el producto de extensión del cebador desplazado es un
sustrato para la transcripción con la polimerasa de ARN, que genera
un producto de ARN transcrito igual que la secuencia diana inicial.
De forma similar, la amplificación de la diana de ácido nucleico
según el Método 2, da como resultado la formación de un producto de
extensión del cebador desplazado que, cuando se hibrida con el
oligonucleótido molde del promotor, forma un complejo que es un
sustrato para la polimerasa de ARN. Como en el Método 1, este
procedimiento da como resultado el acoplamiento de la amplificación
lineal con la transcripción. Se espera que la producción sea
preferentemente al menos aproximadamente 1, más preferentemente al
menos aproximadamente 50, incluso más preferentemente al menos
aproximadamente 75, aún más preferentemente al menos aproximadamente
100 y lo más preferible al menos aproximadamente 1000 productos
transcritos de ARN a partir de cada producto de extensión del
cebador, conduciendo, por tanto, a preferentemente al menos
aproximadamente 1, más preferentemente al menos aproximadamente 50,
incluso más preferentemente al menos aproximadamente 75, todavía más
preferentemente al menos aproximadamente 100 y lo más preferido al
menos aproximadamente 1000 veces una mejora en relación con los
métodos de amplificación no relacionados con la transcripción.
A continuación hay dos métodos a modo de
ejemplo.
Método
1
En una realización, el método de amplificación
lineal basada en TSO de la presente invención está ligado a la
transcripción de los productos de extensión del cebador para
proporcionar una amplificación mejorada de los ácidos nucleicos. Una
descripción esquemática de este nuevo método de amplificación,
Método 1, se muestra en la Figura 2A-C.
El método de amplificación de ácidos nucleicos
basado en TSO de la invención, emplea un cebador compuesto aislado,
tal y como se ha descrito anteriormente. Un segundo oligonucleótido
empleado en el método de amplificación de la invención, es un
oligonucleótido conmutador del molde (TSO), también tal y como se ha
descrito anteriormente. El método de amplificación de la invención
emplea las siguientes enzimas: una polimerasa de ADN, una
ribonucleasa tal como ARNasaH y una polimerasa de ARN dependiente de
ADN. La diana de ácido nucleico que se va a amplificar puede ser de
ADN o ARN. La amplificación de una diana de ARN requerirá una
síntesis inicial de ADNc, tal y como se conoce en la técnica.
El nuevo método de amplificación lineal mejorada
basada en TSO de la presente invención, puede producir múltiples
copias de un producto de ARN homólogo (es decir, la hebra
transcrita) con la secuencia de ADN diana.
El ácido nucleico diana monocatenario se combina
con el cebador compuesto, un oligonucleótido TSO, polimerasa de ADN,
ribonucleasa tal como ARNasaH, una polimerasa de ARN dependiente de
ADN y nucleótidos, tales como trifosfatos de desoxirribonucleósidos
(dNTPs) y trifosfatos de ribonucleósidos (rNTPs) en un medio de
reacción adecuado para la hibridación y la amplificación de ácidos
nucleicos, tal y como se conoce en la técnica. El medio de reacción
adecuado y las condiciones, se han descrito anteriormente. En una
realización, la transcripción se realiza a una temperatura
diferente, generalmente menor que la de las etapas precedentes. En
otra realización, todas las etapas de los métodos se realizan de
forma isotérmica.
En una realización, cada reacción de
amplificación incluye cebadores compuestos de una secuencia
idéntica. En otra realización, cada reacción de amplificación
incluye una mezcla de variantes de cebador compuesto, en donde las
variantes representan dos o más homólogos, pero no secuencias
idénticas y en donde todas son capaces de hibridarse con la misma
secuencia de ácido nucleico diana. La homología (identidad de
secuencia) es preferentemente de al menos aproximadamente 50%, más
preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo más preferible al
menos aproximadamente 90%. Las ventajas de esta realización incluyen
la capacidad de introducir diferentes secuencias de interés en los
productos de extensión del cebador. En aún otra realización, cada
reacción de amplificación incluye una mezcla de cebadores
compuestos, en donde los cebadores representan dos o más secuencias
no idénticas que tienen baja homología o ninguna, y en donde los
cebadores se hibridan preferentemente con diferentes secuencias de
ácidos nucleicos diana o diferentes sitios a lo largo de la misma
hebra de ácido nucleico diana. Las ventajas de esta realización
incluyen la detección múltiple y/o el análisis de ácidos nucleicos
diana mediante la amplificación de una pluralidad de especies de
ácido nucleico diana en una sola reacción de amplificación.
En una realización, el TSO actúa como una
secuencia de terminación y proporciona una secuencia propromotora.
En otra realización, el TSO no comprende una secuencia propromotora.
En esta realización, una secuencia propromotora es proporcionada
separadamente por otro oligonucleótido, tal como un PTO, que
comprende una secuencia propromotora y que es hibridable con la
parte 3' del producto de extensión del cebador, de modo que puede
tener lugar la transcripción del producto de extensión del
cebador.
El cebador compuesto aislado y el TSO se hibridan
entonces con la misma hebra del ácido nucleico que se va a
amplificar. Los dos oligonucleótidos se pueden añadir a la muestra
que se sospecha que contiene la diana de ácido nucleico antes de la
etapa de desnaturalización del ácido nucleico diana. La hibridación
de los dos oligonucleótidos con la hebra diana da como resultado la
formación del complejo trimolecular I (Figura
2A-C).
Una polimerasa de ADN realiza la extensión del
cebador. El cebador se extiende a lo largo de la hebra de ácido
nucleico diana del complejo I (Figura 2A-C), hasta
el sitio de hibridación de TSO. La conmutación del molde desde la
hebra diana hasta la parte 5' no hibridada del TSO y la extensión
adicional del cebador a lo largo del molde TSO, da como resultado la
formación del complejo trimolecular II. El último comprende un ácido
nucleico diana, el TSO y el primer producto de la extensión del
cebador. El primer producto de extensión del cebador es un ADN único
que comprende una parte dependiente de la diana (es decir, una
secuencia complementaria al ácido nucleico diana) y una parte
dependiente de TSO (es decir, una secuencia complementaria a la
parte no hibridada del TSO).
El complejo II (Figura 2A-C) es
un sustrato para una polimerasa de ARN y una ribonucleasa tal como
una ARNasaH. La polimerasa de ARN dependiente de ADN se une al
promotor bc funcional del complejo II y transcribe el primer
producto de extensión del cebador para producir un producto III de
ARN transcrito (Figura 2A-C). Una ribonucleasa, tal
como ARNasaH, que es específica de la degradación de la hebra de ARN
de un heterohíbrido de ARN/ADN, degrada la parte 5' del producto de
extensión del cebador en el complejo II, para formar el complejo
trimolecular IV.
El cebador compuesto libre se hibrida con el
sitio complementario del cebador del complejo IV del ácido nucleico
diana (Figura 2A-C). Esta hibridación da como
resultado la formación del complejo V (Figura 2A-C)
en el que la parte de ARN, generalmente la parte de ARN5' del
cebador se hibrida con la hebra diana. El desplazamiento de la parte
más 5' del producto de extensión del cebador por la parte de ADN 3'
del cebador parcialmente hibridado, dará como resultado la formación
del complejo VI (Figura 2A-C) que es un sustrato de
una polimerasa de ADN. La extensión del cebador a lo largo de la
hebra diana (VII; Figura 2A-C), da como resultado el
desplazamiento del primer producto de extensión del cebador del
complejo. Las extensiones repetidas del cebador y los
desplazamientos de la hebra, dan como resultado la generación de
copias múltiples de polinucleótidos que son al menos sustancialmente
complementarias al ácido nucleico diana.
El producto de extensión del cebador generado tal
y como se ha descrito anteriormente, se emplea como molde para la
transcripción en la realización, en donde se proporciona el TSO que
comprende una secuencia propromotora. El producto de extensión del
cebador desplazado (VIII; Figura 2A-C) se hibrida
con el oligonucleótido TSO libre para formar el híbrido IX parcial
(Figura 2A-C). El complejo (híbrido) IX comprende
una parte bicatenaria en un extremo y dos hebras aisladas no
complementarias, obtenidas respectivamente a partir del producto de
extensión del cebador y del TSO. La parte bicatenaria de este
híbrido parcial contiene un promotor bicatenario totalmente
funcional para la polimerasa de ARN dependiente de ADN. El último se
une al promotor del híbrido parcial IX y se transcribe el producto
de extensión del cebador para formar copias múltiples de un producto
X de ARN transcrito (Figura 2A-C).
Los productos de la amplificación descrita
anteriormente, se pueden detectar por métodos de detección
homogéneos o heterogéneos, incluyendo la identificación por tamaño
y/o las propiedades de migración en electroforesis en gel o por
hibridación de sondas específicas de la secuencia. La detección del
producto de amplificación es indicativa de la presencia dl ácido
nucleico diana. El análisis cuantitativo también es viable. Por
ejemplo, comparando la cantidad de producto amplificado procedente
de una muestra del ensayo que contiene una cantidad desconocida de
un polinucleótido que contiene una secuencia diana para el producto
de amplificación de una muestra de referencia, que tiene una
cantidad conocida de un polinucleótido que contiene la secuencia
diana, se puede determinar la cantidad de secuencia diana en la
muestra del ensayo. Una extensión adicional del nuevo método de
amplificación para analizar una alteración de la secuencia y la
secuenciación del ácido nucleico diana, también son factibles, tal y
como se describe a continuación.
Método
2
En otra realización, el método de amplificación
lineal basado en la secuencia de bloqueo de la presente invención,
está ligado a la transcripción de los productos de extensión del
cebador, para proporcionar una amplificación mejorada de los ácidos
nucleicos. Esta amplificación alternativa, lineal y mejorada, Método
2, que no implica una etapa de conmutación del molde, se muestra en
la Figura 3A-D.
El Método 2 utiliza el cebador compuesto aislado,
como en el Método 1, tal y como se ha descrito anteriormente, un
componente de la secuencia de bloqueo que es un oligonucleótido o un
análogo de oligonucleótido que, como se ha descrito anteriormente,
es capaz adicionalmente de hibridarse con una secuencia en la misma
hebra de ácido nucleico diana que el cebador aislado, y un tercer
oligonucleótido, el molde promotor (PTO) que, como se ha descrito
anteriormente, comprende una parte 3' que es capaz de hibridarse (y
que es preferentemente complementaria) al extremo 3' del producto de
extensión desplazado y una parte 5' que incluye en su extremo 5' una
secuencia de un promotor para una polimerasa de ARN dependiente de
ADN. Tal y como se ha descrito anteriormente en el TSO, la secuencia
inmediatamente adyacente a la secuencia promotora está diseñada para
proporcionar preferentemente una actividad transcripcional óptima,
mediante la polimerasa de ADN empleada en la amplificación, según el
método de la invención. El componente de la secuencia de bloqueo se
diseña para hibridar la secuencia diana en un sitio que está
localizado aguas arriba, hacia el extremo 5' de la diana, en
relación con el sitio de hibridación del cebador aislado. Expuesto
de forma alternativa y tal y como se ha descrito anteriormente, la
secuencia de bloqueo se hibrida con un segmento de la secuencia de
ácido nucleico diana 5' de la posición en la secuencia diana que es
complementaria al extremo 3' del producto de extensión del cebador.
La secuencia de bloqueo se une con afinidad suficientemente alta
para bloquear la extensión del cebador en el sitio de hibridación
del bloqueador de la diana. Esta característica proporciona una
parada enérgica de la extensión del cebador con la polimerasa y
define el extremo 3' del producto de extensión del cebador.
Como en el Método 1, el ácido nucleico diana para
la amplificación de acuerdo con el Método 2, es un ADN
monocatenario. Cuando el ácido nucleico diana es un ADNbc, la diana
se vuelve primero monocatenaria por desnaturalización. La
desnaturalización de la diana de ADNbc se puede realizar calentando
o por cualquier otro método conocido en la técnica, tal como
tratamiento con álcali. Cuando el ácido nucleico diana es ARN, tal
como ARNm, la diana se transcribe inversamente en primer lugar por
métodos conocidos en la técnica, para producir un ADNc que se
amplifica a continuación según el método de la invención.
La diana de ácido nucleico monocatenario se
combina con el cebador compuesto aislado, el componente de bloqueo,
el molde propromotor (PTO), la polimerasa de ADN, la ribonucleasa,
tal como ARNasaH, una polimerasa de ARN dependiente de ADN y
nucleótidos tales con NTPs (p. ej., dNTPs y rNTPs) tal y como se ha
descrito para el Método 1. El medio y las condiciones de reacción
adecuadas son como se han descrito anteriormente. En una
realización, la transcripción se realiza a diferente temperatura,
generalmente menor que la de las etapas precedentes. En otra
realización, todas las etapas de los métodos se realizan
isotérmicamente.
En una realización, cada reacción de
amplificación incluye cebadores compuestos de una secuencia
idéntica. En otra realización, cada reacción de amplificación
incluye una mezcla de variantes de cebador compuesto, en donde las
variantes representan dos o más secuencias homólogas pero no
idénticas y en donde todas son capaces de hibridarse con la misma
secuencia de ácido nucleico diana. La homología (identidad de
secuencia) es preferentemente de al menos aproximadamente 50%, más
preferentemente al menos aproximadamente 75% y lo más preferible al
menos aproximadamente 90%. Las ventajas de esta realización incluyen
la capacidad de introducir diferentes secuencias de interés en los
productos de extensión del cebador. En aún otra realización, cada
reacción de amplificación incluye una mezcla de cebadores compuestos
en donde los cebadores representan dos o más secuencias no idénticas
que tienen poca o ninguna homología, y en donde los cebadores se
hibridan preferentemente con diferentes secuencias de ácido nucleico
diana o con diferentes sitios a lo largo de la misma hebra de ácido
nucleico diana. Las ventajas de esta realización incluyen la
detección múltiple y/o el análisis de los ácidos nucleicos diana a
través de la amplificación de una variedad de especies de ácido
nucleico diana en una sola reacción de amplificación.
El cebador compuesto aislado y el componente de
la secuencia de bloqueo se hibridan con la misma hebra diana para
formar un complejo trimolecular. El cebador se extiende a lo largo
de la diana hasta el sitio de hibridación de la secuencia de
bloqueo, para formar el complejo XII (Figura
3A-D).
Como en el Método 1, una ribonucleasa tal como
una ARNasaH, corta la parte de ARN, generalmente la parte de ARN 5',
del cebador compuesto aislado del complejo XII para formar el
complejo XIII (Figura 3A-D). Tal y como se ha
descrito anteriormente, la enzima es específica para cortar la hebra
de ARN de un híbrido de ARN/ADN y no digiere el ARN monocatenario.
Por tanto, la ribonucleasa no degrada el cebador compuesto libre.
Las siguientes etapas, tal y como se ilustran en la Figura
3A-D, de la hibridación del cebador (XIV),
desplazamiento del extremo 5' del producto de extensión del cebador
por la parte de ADN 3' del cebador compuesto (XV), extensión del
cebador y desplazamiento del primer producto de extensión del
cebador (XVI), se realizan como en el Método 1, para obtener
múltiples copias del producto de extensión desplazado (XVII). Al
contrario que con el producto de desplazamiento del Método 1, XVII
es totalmente complementario a la secuencia diana y no comprende una
parte del extremo 3' que no es complementaria a la diana. Las
extensiones repetidas del cebador y los desplazamientos de las
hebras, dan como resultado la generación de múltiples copias de
polinucleótidos que son complementarios al ácido nucleico diana.
El oligonucleótido molde promotor (PTO) se une al
producto de extensión desplazado, para formar el complejo XVIII
(Figura 3A-D) por hibridación de la parte del
extremo 3' (A) del molde propromotor, con el extremo 3' del producto
de extensión del cebador desplazado. Tal y como se ha descrito
anteriormente, el extremo 3' del PTO puede estar bloqueado o no.
Cuando el extremo 3' del molde propromotor no está bloqueado, el
molde se extenderá a lo largo del producto de extensión del cebador
desplazado. El extremo 3' del producto desplazado se extenderá con
la polimerasa de nucleótidos (ADN) a lo largo de la parte B (véase
la Figura 3A-D) del molde propromotor hibridado,
para formar el complejo XIX que comprende en su extremo una
secuencia bc promotora que puede utilizar la polimerasa de ARN
dependiente de ADN. El complejo XIX se describe en la Figura
3A-D como el producto de hibridación de un molde
promotor en el que el extremo 3' está bloqueado para la extensión de
la polimerasa. Alternativamente, cuando el extremo 3' del molde
promotor no está bloqueado, la extensión del extremo 3' a lo largo
del producto de extensión del cebador desplazado, da como resultado
la formación de un complejo completamente bicatenario. La polimerasa
de ARN dependiente de ADN transcribirá el producto de extensión del
cebador desplazado y extendido del complejo XIX en ambas formas
(para la elección de la polimerasa de ARN se tiene que tener en
cuenta su capacidad de transcribir desde un molde de ADN bc y/o mc),
es decir, o la forma de híbrido parcial o de híbrido totalmente
bicatenario del complejo. Las copias múltiples de un único producto
de ARN monocatenario se producen mediante esta etapa de
transcripción.
Los productos de la amplificación descrita
anteriormente, se pueden detectar por métodos de detección
homogéneos o heterogéneos, incluyendo la identificación por tamaño
y/o las propiedades de migración en electroforesis en gel o por
hibridación de sondas específicas de la secuencia. La detección del
producto de amplificación es indicativa de la presencia del ácido
nucleico diana. El análisis cuantitativo también es factible. Por
ejemplo, comparando la cantidad de producto amplificado procedente
de una muestra del ensayo que contiene una cantidad desconocida de
un polinucleótido que contiene una secuencia diana, con el producto
de amplificación de una muestra de referencia que tiene una cantidad
conocida de un polinucleótido que contiene la secuencia diana, se
puede determinar la cantidad de secuencia diana en la muestra del
ensayo. Los métodos de amplificación de la presente invención
también se pueden extender al análisis de alteraciones de la
secuencia y a la secuenciación del ácido nucleico diana, tal y como
se describe a continuación.
Los métodos y las composiciones de la presente
invención se pueden utilizar para una variedad de fines. Para fines
de ilustración, se describen métodos de secuenciación, genotipado
(detección de mutaciones en el ácido nucleico), preparación de
micromatrices empleando los productos de ácido nucleico amplificados
generados por los métodos de la presente invención y la
caracterización de secuencias de ácidos nucleicos.
Los métodos de amplificación lineal e isotérmica
de la invención son útiles, por ejemplo, para secuenciar una
secuencia definida de ácido nucleico diana. El procedimiento de
secuenciación se realiza tal y como se ha descrito para los métodos
de amplificación descritos en esta memoria. Además de los
nucleótidos, tal como trifosfatos desoxirribonucleótidos naturales
(dNTPs), que se emplean para el método de amplificación de acuerdo
con la presente invención, la mezcla de la reacción de secuenciación
también incluye los análogos de trifosfatos de nucleótidos adecuados
que pueden estar marcados o no, que después de la incorporación en
un producto de extensión del cebador, efectúan la terminación de la
polimerización de nucleótidos. Tales análogos se emplean
generalmente en otros métodos de secuenciación y son bien conocidos
en la técnica, tales como didesoxirribonucleótidos. Pueden estar
marcados, p. ej., con fluorocromos o radioisótopos. Los marcadores
también pueden ser marcadores que son adecuados para la
espectroscopía de masas. El marcador también puede ser una pequeña
molécula que es un miembro de una pareja de unión específica y se
puede detectar después de la unión del otro miembro de la pareja de
unión específica, tal como biotina y estreptavidina,
respectivamente, con el último miembro de la pareja de unión
conjugada con una enzima que cataliza la generación de una señal
detectable que podría ser detectada por métodos tales como
colorimetría, fluorometría o quimioluminiscencia. Todos los ejemplos
anteriores son bien conocidos en la técnica. Estos se incorporan en
el producto de extensión del cebador mediante la polimerasa y sirven
para detener una extensión adicional a lo largo de la secuencia
diana. Los productos de extensión truncados resultantes están
marcados. Los productos de extensión del cebador desplazado,
múltiples acumulados, varían en su longitud, según el sitio de
incorporación de cada análogo, lo que representa las distintas
posiciones de la secuencia de un nucleótido complementario en la
secuencia diana.
El análisis de los productos de la reacción para
esclarecer la información de la secuencia, se puede realizar
empleando cualquiera de los diversos métodos conocidos en la
técnica. Tales métodos incluyen electroforesis en gel y detección de
las bandas marcadas empleando un escáner adecuado, secuenciación de
la electroforesis en gel y detección de la banda radiomarcada
directamente por fosforescencia, tal como con un lector de Molecular
Dynamics, electroforesis capilar adaptada con un detector específico
para los marcadores empleados en la reacción, y similares. El
marcador también puede ser un ligando para una proteína de ligación
que se emplea para la detección del marcador, en combinación con una
enzima conjugada con la proteína de ligación, tal como un terminador
de cadena marcado con biotina y estreptavidina conjugada con una
enzima. El marcador se detecta por la actividad enzimática de la
enzima que genera una señal detectable. Como con otros métodos de
secuenciación conocidos en la técnica, las reacciones de
secuenciación para los 4 tipos de nucleótidos (A, C, G, T) se
realizan en un único recipiente de reacción o en recipientes de
reacción separados (representando cada uno 1 de los 4 tipos de
nucleótidos). La elección del método a emplear es dependiente de
consideraciones prácticas, evidentes para un experto en la técnica,
tales como los análogos de trifosfatos de nucleótidos y/o el
marcador utilizado. Por tanto, por ejemplo, cuando cada uno de los
análogos se marca diferencialmente, la reacción de secuenciación se
puede realizar en un único recipiente. Las consideraciones para
elegir el reactivo y las condiciones de reacción para una
realización óptima de los análisis de secuenciación, de acuerdo con
los métodos de la invención, son similares a las mencionadas para
otros métodos de secuenciación descritos previamente. El reactivo y
las condiciones de reacción deben ser como se han descrito
anteriormente para los métodos de amplificación lineal de ácidos
nucleicos de la presente invención.
La secuenciación basada en la transcripción ha
sido descrita previamente por, por ejemplo, Sasaki y col., PNAS,
95:3455-3460, 1998. La inclusión de análogos de
rNTPs que pueden estar marcados o sin marcar, que después de la
incorporarse en un transcrito de ARN efectúan la terminación de la
polimerización de rNTP en la mezcla de reacción, para los métodos de
amplificación lineal mejorada, dará como resultado la producción de
productos de ARN truncados que dan como resultado el bloqueo de la
polimerasa de ARN en los sitios de incorporación de los análogos.
Análogos de rNTP adecuados son conocidos en la técnica. Los últimos
se incorporan de forma opuesta al nucleótido complementario en el
producto de extensión desplazado en los complejos relevantes, de
acuerdo con el método empleado (Método 1 o Método 2).
El análisis de los productos de reacción para
clarificar la información de la secuencia, se realiza empleando uno
cualquiera entre una variedad de métodos conocidos en la técnica.
Tales métodos incluyen los descritos arriba para la secuenciación de
dianas definidas de ácido nucleico, empleando los métodos de
amplificación lineal (no mejorada) de la invención.
Las propiedades únicas del cebador compuesto para
el uso en los métodos de amplificación isotérmica de la invención,
proporcionan la base para un método isotérmico de detección de
mutaciones definidas o de sitios polimórficos (tales como SNPs), en
una secuencia de ácidos nucleicos diana. El método es útil para el
genotipado, la detección de mutaciones que conducen a la resistencia
a fármacos y similares. Estos métodos son aplicables para
caracterizar secuencias en una región en la hebra molde que se
hibrida generalmente con la parte de ARN del cebador compuesto
-
por lo tanto, referencia a mutaciones "definidas", que se definen en función de su posición.
por lo tanto, referencia a mutaciones "definidas", que se definen en función de su posición.
La secuencia de ácido nucleico diana adecuada
para el método de la invención es ADNmc. Sin embargo, la preparación
de una diana de ADNmc a partir de una diana de ADNbc o una diana de
ARN, se puede realizar tal y como se ha descrito anteriormente y es
conocido en la técnica.
Una realización del método de la invención se
ilustra esquemáticamente en la Figura 4. En esta realización,
la(s) parte(s) de ARN del cebador compuesto se diseña
para que sea complementaria a la secuencia del ácido nucleico diana
del ensayo, en el que se sospecha la presencia de una alteración de
la secuencia. Expuesto de otra forma, el cebador comprende
una(s) parte(s) de ARN que comprende una secuencia que
es complementaria a la secuencia de referencia (por ejemplo, una
secuencia de tipo silvestre) con la que se va a comparar la
secuencia en el ácido nucleico diana del ensayo. En algunas
realizaciones, la secuencia alterada (es decir, la secuencia que
comprende una alteración de la secuencia) y la secuencia de
referencia son alelos. La alteración de la secuencia puede ser una
sustitución aislada de nucleótidos, una deleción o una inserción. El
sitio de la alteración de la secuencia se marca esquemáticamente con
una X en la Figura 4.
En otra realización, la(s) parte(s)
de ARN del cebador compuesto se diseña para que sea complementaria a
la secuencia alterada, que se sospecha que está presente en el ácido
nucleico diana del ensayo. Dicho de otra forma, el cebador comprende
una(s) parte(s) de ARN que comprende una secuencia que
es complementaria al ácido nucleico diana del ensayo y que, por
tanto, no es complementaria a la secuencia de referencia (por
ejemplo, una secuencia de tipo silvestre) con la que se compara la
secuencia en el ácido nucleico diana del ensayo. En algunas
realizaciones, la secuencia alterada (es decir, la secuencia que
comprende una alteración de la secuencia) y la secuencia de
referencia son alelos.
La parte de ARN, generalmente una parte de ARN
5', del cebador compuesto comprende una secuencia que es
complementaria a una secuencia de tipo silvestre normal o un mutante
conocido o un genotipo polimórfico. Generalmente, un cebador
compuesto adecuado comprende una parte de ARN que permite que el
cebador se hibride preferentemente con una ácido nucleico diana, si
la secuencia de ácido nucleico diana comprende una secuencia
complementaria a la parte de ARN del cebador, comparado con si fuera
un mal emparejamiento (es decir, el cebador tiene la secuencia
mutada y la diana no, o viceversa), en donde el ácido nucleico diana
tiene un producto de extensión del cebador unido y su parte de ARN
5' está cortada. Tal y como se muestra en la Figura 4, la presencia
de una alteración de la secuencia no evita generalmente la etapa
inicial de amplificación. El cebador compuesto se hibrida con la
secuencia diana para formar el complejo trimolecular primero, y se
extiende. Una ribonucleasa, tal como ARNasaH, corta a continuación
la parte de ARN del cebador extendido del complejo. Aunque es
probable que la presencia de un par de bases mal emparejadas afecte
al patrón de escisión del híbrido ARN/ADN, aún así, la escisión no
es probable que tenga lugar. La siguiente etapa de unión de un
cebador compuesto con el complejo, mediante la hibridación de la
parte de ARN 5' se inhibirá, preferentemente se evitará, con un mal
emparejamiento. Este efecto depende de factores tales como el tamaño
del oligonucleótido a hibridar y las restricciones de las
condiciones de la reacción. Estos factores se consideran en el
diseño del cebador compuesto, según las técnicas bien conocidas y
rutinarias en al técnica. También es posible que el mal
emparejamiento inhiba la escisión de la(s) parte(s) de
ARN del cebador compuesto, evitando de este modo la amplificación de
la secuencia diana. Otra posibilidad es que el mal emparejamiento dé
como resultado una menor eficacia de la escisión de la parte de ARN
del cebador, dando como resultado una menor eficacia de la
amplificación o la producción de menos producto de la amplificación.
La incapacidad del cebador compuesto para hibridarse con la diana en
esta etapa de la amplificación, evita etapas adicionales de
desplazamiento de la hebra en la extensión del cebador y de
producción de múltiples copias de los productos de la amplificación.
Se entiende que la detección de la mutación con los métodos de la
presente invención, se puede basar en la ausencia o presencia de un
producto de extensión del cebador o en comparaciones cuantitativas
de la cantidad acumulada de producto de extensión del cebador. Por
ejemplo, cuando el cebador compuesto comprende la secuencia de
referencia (por ejemplo, de tipo silvestre), la presencia de una
mutación en una hebra diana puede conducir a productos de la
amplificación no detectables; alternativamente, puede conducir a
productos detectables, pero menos que los producidos a partir de una
hebra molde sin la mutación.
Cuando el cebador compuesto comprende una parte
de ARN, generalmente una parte de ARN 5' que es totalmente
complementaria a un genotipo mutante, se evitará la amplificación de
una secuencia que tiene el genotipo normal, mientras que una diana
con genotipo mutante se amplificará. Por tanto, en este caso, la
detección y/o la determinación cuantitativa de copias múltiples del
producto de amplificación será indicativa de la presencia de una
secuencia diana del genotipo mutante. Por ejemplo, reacciones
paralelas que incluyen la muestra de ácido nucleico de interés o la
muestra de referencia de ácido nucleico diana, con una secuencia de
tipo silvestre, podrían funcionar. La acumulación de más productos
de extensión del cebador en la primera reacción comparada con la
última reacción, sería indicativo de la presencia de un genotipo
mutante en la muestra de interés. Alternativamente, cuando el
cebador compuesto comprende una secuencia de ARN 5' que es
totalmente complementaria a la secuencia del genotipo normal de la
diana del ensayo, se evita la amplificación de una secuencia diana
del genotipo mutante y la detección y/o la determinación
cuantitativa de los productos de la amplificación es indicativa de
un genotipo normal.
Cualquiera de los métodos de amplificación de la
presente invención son adecuados para la detección de una mutación,
tal y como se ha descrito anteriormente.
En este método, la complementariedad del
nucleótido más 3' de un cebador compuesto se emplea para
caracterizar la presencia o ausencia de una secuencia mutada. La
hibridación del nucleótido más 3' del cebador compuesto con un ácido
nucleico diana, es necesaria para la extensión del cebador. Por
ello, la amplificación del producto indica que el ácido nucleico
diana contiene la secuencia definida por el nucleótido más 3' del
cebador compuesto. La reducción o la ausencia de una amplificación
del producto, por otro lado, indica que el ácido nucleico diana
contiene una alteración de la secuencia que incluye al menos la base
complementaria al nucleótido más 3' del cebador compuesto. La falta
de la secuencia se puede deber a una mutación puntual, a
polimorfismo de un nucleótido aislado, inserción o deleción de un
segmento de secuencia que contiene la secuencia definida por el
nucleótido más 3'.
En una realización, los cebadores específicos del
genotipo, diseñados para tener el nucleótido más 3', correspondiente
a las distintas secuencias en la posición del nucleótido variante
(tal como la debida a alelismo) se emplean para la amplificación
según los métodos de la invención. La presencia de productos de la
amplificación, indicaría que el ácido nucleico diana comprende la
secuencia definida por el nucleótido más 3' del cebador particular
utilizado. La ausencia o la carencia (en comparación con un ácido
nucleico de referencia que tiene la secuencia definida por el
nucleótido más 3' del cebador particular empleado) de productos de
amplificación indicaría que el ácido nucleico diana no comprende la
secuencia definida por el nucleótido más 3' del cebador particular
utilizado.
Los productos de la amplificación del ARN o ADN
generados según los métodos de la presente invención, también son
adecuados para el análisis de la detección de cualquier alteración
en la secuencia de ácido nucleico diana, comparada con una secuencia
de ácido nucleico de referencia que es idéntica a la secuencia de
ácido nucleico diana aparte de la alteración de la secuencia, tal y
como se describe a continuación.
Los productos de los métodos de amplificación de
ácidos nucleicos lineales (ADN) y de los métodos de amplificación
lineal mejorada (ARN), descritos previamente son adecuados para la
detección de mutaciones basadas en el polimorfismo en la
configuración monocatenaria (SSCP o rSSCP). Teniendo en cuenta que
el producto de ARN de los nuevos métodos de amplificación no es un
sustrato para una amplificación adicional, la amplificación de la
secuencia de acuerdo con los nuevos métodos, no requiere la
presencia de agentes que reducen estructuras secundarias en el
producto monocatenario. Los métodos de amplificación basados en la
transcripción descritos por otros, se realizan en presencia de
agentes que reducen estructuras secundarias, tales como DMSO. Por
tanto, se anticipa que los métodos de amplificación lineal mejorada
de la presente invención pueden estar ligados directamente con
medios adecuados para detectar un polimorfismo en la configuración
monocatenaria, tal como un método de separación electroforética,
para la identificación de un patrón de movilidad específico de los
productos de ARN monocatenarios, para aclarar la presencia de
características específicas de la secuencia o la presencia de
cualquier diferencia en un ácido nucleico del ensayo, comparado con
un ácido nucleico de referencia.
Los métodos basados en la electroforesis en gel o
la electroforesis capilar, se pueden utilizar para la detección y el
análisis de distintos isómeros configuracionales monocatenarios.
Alternativamente, también es probable que la escisión del producto
de ADN o ARN monocatenario, empleando nucleasas que reconocen
estructuras secundarias dependientes de la secuencia, sea útil para
la determinación del polimorfismo de la configuración específico de
la secuencia. Tales nucleasas son conocidas en la técnica, tal como
el ensayo de Cleavase (Third Wave). Los métodos electroforéticos son
potencialmente más adecuados como métodos de detección de mutaciones
de alto rendimiento o de genotipado.
La determinación de un patrón electroforético
específico de secuencia para una secuencia de ácidos nucleicos dada,
es útil para detectar los alelos específicos de una secuencia del
ensayo. Además, se espera que un patrón de movilidad electroforética
para diversos alelos, podría estar bien diferenciado, de modo que
permita la detección de dos alelos en una sola muestra de ADN
genómico, tal y como se requiere para un genotipo heterocigoto o
alelos múltiples. Cualquier alteración en la secuencia de ácidos
nucleicos del ensayo, tal como una sustitución de bases, inserciones
o deleción, podría ser detectada empleando este método. El método se
espera que sea útil para detectar un polimorfismo específico de una
base aislada, SNP, y el descubrimiento de nuevos SNPs.
La naturaleza monocatenaria de los productos de
los métodos de amplificación lineal de ácidos nucleicos (ADN), y los
métodos de amplificación lineal mejorada (ARN), descritos
previamente, son particularmente adecuados para preparar
micromatrices que comprenden los productos de la amplificación.
Se conocen bien diversas técnicas para fijar
ácidos nucleicos a un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de
vidrio. Un método es incorporar bases modificadas o análogos que
contienen un resto que es capaz de fijarse a un sustrato sólido, tal
como un grupo amino, un derivado de un grupo amino u otro grupo con
una carga positiva, en los ácidos nucleicos amplificados. El
producto amplificado se pone en contacto a continuación con un
sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio que es revestido
con un grupo reactivo aldehído u otro grupo reactivo que formará un
enlace covalente con el grupo reactivo que está en el producto
amplificado y se fija covalentemente al portaobjetos de vidrio.
Otros métodos, tales como los que emplean una química de superficie
de amino propil silicio, también son conocidos en la técnica, tal y
como se describe en http://www.cmt.corning.com y
http://cmgm.standord.ecu/pbrown1.
La fijación de grupos al cebador que se podrían
convertir posteriormente en grupos reactivos, también es posible
empleando métodos conocidos en la técnica. Cualquier fijación a
nucleótidos del cebador compuesto, formará parte del producto de
ADN monocatenario de los métodos de amplificación lineal, que se
podría fijar a continuación a la superficie sólida de la
micromatriz.
Los productos de la amplificación de los métodos
de la presente invención se pueden modificar adicionalmente,
mediante la escisión en fragmentos o la fijación de marcadores
detectables, antes o después de la fijación al sustrato sólido, tal
y como es requerido y/o permitido por las técnicas empleadas.
Los productos de la amplificación obtenidos por
los métodos de la invención son particularmente susceptibles de una
caracterización posterior, en parte debido a que los productos son
monocatenarios. Los productos amplificados, tanto ADN como ARN, se
pueden analizar utilizando técnicas de hibridación con sonda
conocidas en la técnica, tales como la transferencia de tipo
Southern o Northern. Los productos amplificados también se pueden
analizar poniéndolos en contacto con micromatrices que comprenden
sondas de oligonucleótidos. La identidad de las sondas proporciona
la caracterización de la identidad de secuencia de los productos
amplificados y de este modo por extrapolación, la identidad del
ácido nucleico molde presente en una muestra sospechosa de contener
dicho ácido nucleico molde.
La invención también proporciona composiciones y
equipos de reactivos empleados en los métodos descritos en esta
memoria. Las composiciones pueden ser cualquier
componente(s), mezcla de reacción y/o compuesto intermedio
descrito en esta memoria, así como cualquier combinación. Por
ejemplo, la invención proporciona una composición que contiene un
cebador compuesto, en donde el cebador compuesto comprende una
parte de ARN y una parte de ADN 3'. En otro ejemplo, la invención
proporciona una composición que comprende un cebador compuesto, en
donde el cebador compuesto comprende una parte de ARN 5' y una
parte de ADN 3'. En una realización, la parte de ARN es adyacente a
la parte de ADN. En otro ejemplo, la invención proporciona una
composición que comprende un cebador compuesto, en donde el cebador
compuesto comprende partes de ADN 5' y 3', con al menos una parte
de ARN intercalado. En otros ejemplos, la invención proporciona una
composición que comprende un cebador compuesto que se derivatiza
adicionalmente por fijación de un resto capaz de efectuar la
fijación de un polinucleótido que comprende el cebador compuesto a
un sustrato sólido empleado para preparar micromatrices de ácido
nucleico. En algunas realizaciones, el cebador compuesto se
derivatiza adicionalmente por fijación de un resto cargado
positivamente, tal como una amina. En otras realizaciones, la
invención proporciona una composición que comprende un TSO (es
decir, cualquiera de las realizaciones de TSO descritas en esta
memoria, que incluyen TSOs que contienen una o varias modificaciones
que mejoran la unión al molde). En algunas realizaciones, las
composiciones comprenden un cebador compuesto y una secuencia de
terminación. En otras realizaciones, la invención proporciona una
composición que comprende un polinucleótido que comprende una
secuencia propromotora, tal como TSO o PTO (es decir, cualquiera de
las realizaciones descritas en esta memoria) y puede comprender
adicionalmente un cebador compuesto y/o una secuencia de bloqueo. En
algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que
comprende una secuencia de bloqueo (es decir, cualquiera de las
realizaciones descritas en esta memoria, incluyendo secuencias de
bloqueo con modificaciones).
En otras realizaciones, la invención proporciona
composiciones que comprenden (a) un cebador compuesto, en donde el
cebador compuesto comprende una parte de ARN y una parte de ADN 3'
(en algunas realizaciones, la parte de ARN es adyacente a la parte
de ADN); y (b) una secuencia de terminación. En algunas
realizaciones, la secuencia de terminación es un TSO. En otras
realizaciones, la secuencia de terminación es una secuencia de
bloqueo. En algunas realizaciones, el cebador compuesto comprende
una parte de ARN 5' y una parte de ADN 3' (en ciertas
realizaciones, la parte de ARN es adyacente a la parte de ADN). En
otras realizaciones, el cebador compuesto comprende partes de ADN
5' y 3' con al menos una parte de ARN intercalado. En algunas
realizaciones, la composición comprende (a) un cebador compuesto;
(b) un polinucleótido que comprende una secuencia de terminación;
(c) un polinucleótido que comprende una secuencia propromotora. En
algunas realizaciones, la secuencia propromotora es proporcionada
por un PTO. En otras realizaciones, la secuencia propromotora es
proporcionada por un TSO. Cualquiera de las composiciones
anteriores puede comprender adicionalmente un molde (que comprende
una secuencia diana) y/o cualquiera de las enzimas descritas en
esta memoria (tales como polimerasa de ADN, ARNasaH y/o polimerasa
de ARN). Las composiciones están generalmente en forma acuosa,
preferentemente en un tampón adecuado.
La invención también proporciona composiciones
que comprenden los productos de amplificación descritos en esta
memoria. Por tanto, la invención proporciona una población de
moléculas de ADN (de hebra complementaria) o de ARN (de hebra
transcrita) que son copias de una secuencia diana que son producidas
por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria.
Las composiciones están generalmente en un medio
adecuado, aunque pueden estar en forma liofilizada. Los medios
adecuados incluyen, pero no están limitados a medios acuosos (tales
como agua pura o tampones).
La invención proporciona equipos de reactivos
para llevar a cabo los métodos de la invención. Por tanto, se
proporciona una variedad de equipos de reactivos, envasados
adecuadamente. Los equipos de reactivos se pueden utilizar para uno
cualquiera o para más de los usos descritos en esta memoria y, por
tanto, pueden contener instrucciones para uno o para varios de los
siguientes usos: amplificar una secuencia de nucleótidos;
secuenciar polinucleótidos amplificados y detectar una mutación de
la secuencia en polinucleótidos amplificados.
Los equipos de reactivos de la invención
comprenden uno o varios recipientes que comprenden cualquier
combinación de los componentes descritos en esta memoria; y a
continuación hay ejemplos de tales equipos de reactivos. Un equipo
de reactivos comprende cualquiera de los cebadores compuestos
descritos en esta memoria. En algunas realizaciones, un equipo de
reactivos comprende dos o más cebadores compuestos que pueden estar
envasados o no separadamente. En otras realizaciones, un equipo de
reactivos comprende un cebador compuesto y una secuencia de
terminación (cualquiera de las descritas en esta memoria). Un
equipo de reactivos puede comprender un cebador compuesto, un
polinucleótido que comprende una secuencia de terminación y un
polinucleótido que comprende una secuencia propromotora (que puede
ser un PTO o TSO). El cebador compuesto puede estar marcado o no.
Los equipos de reactivos pueden incluir también opcionalmente
cualquiera entre una o varias de las enzimas descritas en esta
memoria, así como trifosfatos de desoxinucleósidos y/o trifosfatos
de ribonucleósidos. Los equipos de reactivos también pueden incluir
uno o varios tampones adecuados (tal y como se ha descrito en esta
memoria). Los equipos de reactivos útiles para la secuenciación de
ácidos nucleicos pueden incluir opcionalmente análogos de
nucleótidos marcados o sin marcar que, después de incorporarles en
un producto de extensión del cebador, efectúan la terminación de la
polimerización de nucleótidos. Uno o varios reactivos en el equipo
de reactivos se puede proporcionar como un polvo seco, generalmente
liofilizado, que incluye excipientes que en disolución
proporcionarán una solución de reactivo que tenga las
concentraciones adecuadas para realizar cualquiera de los métodos
descritos en esta memoria. Cada componente puede ser envasado en
recipientes separados o algunos componentes se pueden combinar en un
recipiente que permita reactividad cruzada y una duración de
almacenamiento.
Los equipos de reactivos de la invención pueden
incluir opcionalmente un conjunto de instrucciones, generalmente
instrucciones escritas, aunque también son aceptables los medios de
grabación electrónicos (p. ej., disquete magnético o disco óptico),
en relación con el uso de los componentes de los métodos de la
presente invención para la amplificación deseada de ácidos nucleicos
y/o son adecuados para el uso de los productos de amplificación
para fines tales como la secuenciación de ácidos nucleicos y la
detección de una mutación de la secuencia. Las instrucciones
incluidas en el equipo de reactivos, incluyen generalmente
información sobre los reactivos (si están incluidos o no en el
equipo de reactivos) necesarios para poner en práctica los métodos
de la invención que se presenta, instrucciones sobre cómo utilizar
el equipo de reactivos y/o condiciones de reacción adecuadas.
El(los) componente(s) del equipo de
reactivos pueden estar envasados en cualquier envase conveniente y
adecuado. Los componentes pueden estar envasados separadamente o en
una o varias combinaciones. Cuando se proporcionan equipos de
reactivos para poner en práctica los métodos de amplificación lineal
mejorada de la presente invención, la polimerasa de ARN (si está
incluida) se proporciona preferentemente de forma separada de los
componentes empleados en las etapas anteriores a las etapas de la
transcripción.
Las cantidades relativas de los distintos
componentes en los equipos de reactivos pueden variar ampliamente
para proporcionar las concentraciones de los reactivos que mejoran
sustancialmente las reacciones que tienen que ocurrir para poner en
práctica los métodos descritos en esta memoria y/o para mejorar
adicionalmente la sensibilidad de cualquier ensayo.
La invención también proporciona sistemas para
perpetrar los métodos descritos en esta memoria. Los sistemas
comprenden distintas combinaciones de los componentes descritos
anteriormente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la invención
proporciona un sistema adecuado para producir una secuencia de
polinucleótidos diana (o una secuencia de polinucleótidos diana para
amplificar) que comprende (a) un cebador compuesto (cualquiera de
los descritos en esta memoria), (b) una polimerasa de ADN y (c) una
ribonucleasa. En algunas realizaciones, el sistema comprende
adicionalmente un polinucleótido que comprende una secuencia de
terminación (cualquiera de las descritas en esta memoria). En
algunas realizaciones, el sistema comprende adicionalmente un
polinucleótido que comprende una secuencia propromotora (que puede
ser un PTO o un TSO) y una polimerasa de ARN dependiente de ADN.
Cualquiera de las realizaciones de los sistemas también puede
comprender una secuencia molde (diana), tal y como se ha descrito
en esta memoria.
La invención también proporciona mezclas de
reacción (o composiciones que comprenden mezclas de reacción) que
contienen diversas combinaciones de componentes descritos en esta
memoria. En algunas realizaciones, la invención proporciona mezclas
de reacción que comprenden (a) un molde de polinucleótido; (b) un
cebador compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de
ARN y (c) una polimerasa de ADN. Tal y como se ha descrito en esta
memoria, cualquiera de los cebadores compuestos puede estar en la
mezcla de reacción (o una pluralidad de cebadores compuestos), que
incluyen un cebador compuesto que comprende una parte de ARN 5' que
es adyacente a la parte de ADN 3'. La mezcla de reacción puede
comprender también adicionalmente una enzima que corta el ARN de un
híbrido ARN/ADN, tal como ARNasaH. Una mezcla de reacción de la
invención también puede comprender cualquiera de los
polinucleótidos que comprenden secuencias de terminación descritas
en esta memoria. Otro ejemplo de una mezcla de reacción es (a) un
producto de extensión del cebador desplazado (y que, como tal,
contiene en su extremo 5' una complementariedadde secuencia con la
parte de ADN 3' del cebador compuesto, pero no las secuencias
complementarias a la parte de ARN del cebador compuesto); (b) un
polinucleótido que contiene una secuencia propromotora (por
ejemplo, un PTO); y (c) una polimerasa de ARN. Otras mezclas de
reacción se describen en esta memoria y están incluidas en la
invención.
La invención también incluye composiciones que
comprenden cualquiera de los complejos (que son productos
intermedios en los métodos descritos en esta memoria) descritos en
esta memoria. Los complejos se describen esquemáticamente en las
Figuras 1-4. A modo de ejemplo, un complejo de la
invención es un complejo que comprende: (a) una hebra molde y (b)
un cebador compuesto, que comprende una parte de ADN 3' y una parte
de ARN. El cebador compuesto puede tener una parte de ARN que es
5', adyacente a la parte de ADN 3'. El complejo puede comprender
adicionalmente un polinucleótido que comprende una secuencia de
terminación (tal como un TSO o una secuencia de bloqueo). El
complejo también puede comprender un polinucleótido que comprende
un propromotor, tal como un PTO.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan a modo de
ilustración, pero no para limitar la invención.
Los métodos generales que se describen en este
ejemplo también se emplean en otros ejemplos proporcionados en esta
memoria.
Los tampones que se emplearon durante todos los
ejemplos se prepararon con los siguientes materiales.
Tampón TE: | Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM |
Tampón TBE: | Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3 |
Tampón FX: | Tris-SO_{4} 20 mM, pH 9,0, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, NP-40 0,1% |
La amplificación de la secuencia se realizó en
reacciones de 15 \mul que contenían Tris-HCl 20
mM, pH 8,5, MgCl_{2} 6,0 mM, dATP 1,0 mM, dCTP 1,0 mM, dTTP 1,0
mM, dGTP 0,8 mM, dITP 0,2 mM (dNTPs de Amersham),
0-6% de DMSO, 0-8% de glicerol,
0-100 \mug/ml de BSA acetilada (Ambion, Austin,
TX), 0,6 unidades/\mul de inhibidor de ribonucleasa recombinante
(rRNasin, Promega, Madison, WI), 0,5-5 \muM de
cebador compuesto IA005 y 100-200 nM de
oligonucleótido molde-promotor (PTO) IA015C. El
cebador compuesto IA005 es un cebador 20-mero con la
secuencia: ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:1). El oligonucleótido
promotor-molde (PTO) IA015C es un oligonucleótido
55-mero con la secuencia:
ggAATTCTAATACgACTCACTATAgggAgAgCggTACgCTgATCAAAgATCCgTg-biotina
(SEQ ID NO:12).
Las reacciones se reunieron con todos los
componentes excepto las dos enzimas. Después de calentar a 70ºC o
99ºC durante 10 s, en un ciclador térmico programable (GeneAmp
9600, Perkin Elmer), las mezclas de las reacciones se enfriaron a
55ºC, 60ºC o 65ºC, tal y como se describe en los ejemplos
individuales. Después de alcanzar la temperatura inferior, se
añadieron 0,05- 0,24 unidades de ARNasaH (diluida a partir de la
solución madre de 5 U/\mul) empleando una solución de
diluyente/almacenamiento: Tris-HCl 10 mM, pH 8,5,
30% de glicerol; Hybridase thermostable RNase H, Epicentre
Technologies, Madison, WI) y 1,0-5,0 unidades de
polimerasa de ADN Bca (2 U/\mul; Panvera, Madison, WI). Las
reacciones se incubaron a 55ºC-65ºC durante 30
minutos. Al final de la incubación, las reacciones se enfriaron a
4ºC. Las reacciones pueden permanecer a 4ºC hasta que se desee
iniciar la etapa de transcripción del ARN.
La transcripción del ARN se realizó a 37ºC
durante 3 h en reacciones de 10 \mul que contenían 2,5 \mul de
las mezclas de reacción de amplificación lineal anteriores y
Tris-HCl 40 mM, pH 8,5, KCl 70 mM, DTT 5,0 mM,
MgCl_{2} 12 mM, 110 \mug/ml de BSA, 3 mM de cada rNTP (ATP,
CTP, UTP, GTP, Amersham), 7,5% de DMSO, 1 unidad/\mul de rRNasin
(Promega, Madison, WI) y 20 unidades de polimerasa de ARN de T7
(Ambion, Austin, TX).
Una secuencia de la región del gen J de E.
coli K12 se escogió como molde de ADN para varios de los
siguientes Ejemplos. Se emplearon tres moldes de ADN para estos
experimentos: una diana de ADN sintético (IA013), un molde de ADN
principalmente monocatenario (351 bases) producido por amplificación
con PCR y ADN genómico procedente de la cepa K12 de E. coli
(preparación descrita en el Ejemplo 4). La diana de ADN sintético
IA013 comprende:
Espaciador 18-espaciador
18CGGTACGCTGATCAAAGATCCGTGCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTG
TTGAGCTGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT (SEQ ID NO:18). El espaciador 18 se refiere a espaciadores de polioxietileno. Estos se añadieron al oligo para retardar su movilidad en relación con el producto de ADNmc de 100 pb. La secuencia del molde de ADN principalmente monocatenario (351 bases), mencionado anteriormente, producido por amplificación con PCR es:
TTGAGCTGCAGCAAAACGCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT (SEQ ID NO:18). El espaciador 18 se refiere a espaciadores de polioxietileno. Estos se añadieron al oligo para retardar su movilidad en relación con el producto de ADNmc de 100 pb. La secuencia del molde de ADN principalmente monocatenario (351 bases), mencionado anteriormente, producido por amplificación con PCR es:
CGGTACGCTGATCAAAGATCCGT GCAACAAATGTCATGGTCATGGTCGTGTTGAGCGCAGCAAAAC
GCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT CTTGCGGGCGAAGGTGAAGC
GGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTCAGGTTAAACAGCACCCGATTTTCGA
GCGTGAAGGCAACAACCTGTATTGCGAAGTCCCGATCAACTTCGCTATGGCGGCGCTGGGTGGCGAAATC
GAAGTACCGACCCTTGATGGTCGCGTCAAACTGAAAGTGCCTGGCGAAACCC AGACCGGTAAGCTATTC
CGTATGCG (SEQ ID NO:17) en donde los cebadores de la PCR están en negrita y subrayados y los cebadores compuestos están en negrita, con la parte de ARN en cursiva.
GCTGTCCGTTAAAATCCCGGCAGGGGTGGACACTGGAGACCGCATCCGT CTTGCGGGCGAAGGTGAAGC
GGGGCGAGCATGGCGCACCGGCAGGCGATCTGTACGTTCAGGTTCAGGTTAAACAGCACCCGATTTTCGA
GCGTGAAGGCAACAACCTGTATTGCGAAGTCCCGATCAACTTCGCTATGGCGGCGCTGGGTGGCGAAATC
GAAGTACCGACCCTTGATGGTCGCGTCAAACTGAAAGTGCCTGGCGAAACCC AGACCGGTAAGCTATTC
CGTATGCG (SEQ ID NO:17) en donde los cebadores de la PCR están en negrita y subrayados y los cebadores compuestos están en negrita, con la parte de ARN en cursiva.
El molde de ADN monocatenario para la
amplificación isotérmica lineal se preparó mediante amplificación
con PCR de un segmento de 351 pb del gen J de E. coli,
empleando los cebadores IA006 e IA004. El cebador IA006 es un
23-mero con la secuencia: CGGTACGCTGATCAAAgATCCGT
(SEQ ID NO:16). El cebador IA004 es un 26-mero con
la secuencia: CGCATACGGAATAGCTTACCGGTCT (SEQ ID NO:15).
La PCR se realizó en reacciones de 100 \mul que
contenían Tris-SO_{4} 20 mM, pH 9,0,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, 0,1% de
NP-40, MgCl_{2} 2,0 mM, 300 \muM de cada dNTP
(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 5 unidades de polimerasa de ADN Taq,
cebador IA006 400 nM, cebador 5'-fosfato IA004 400
nM y 0,2 \mul de un lisado en bruto de la cepa K12 de E.
coli. Se empleó un protocolo de "PCR de aterrizaje" con
los siguientes parámetros: 95ºC durante 5 segundos, 68ºC durante 1
minuto para 5 ciclos; 94ºC durante 5 segundos, 60ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 1 minuto para 5 ciclos; 94ºC durante 5
segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto para 40
ciclos; 72ºC durante 15 minutos y a continuación se mantuvo
indefinidamente a 4ºC. El cebador IA004 se sintetizó con un
5'-fosfato para proteger la hebra transcrita de la
digestión con la exonucleasa lambda (equipo de reactivos Strandase,
Novagen, Madison, WI). La digestión con Strandase se realizó de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En forma resumida,
el producto de la PCR, preparado tal y como se ha descrito
anteriormente, se precipitó desde la mezcla de reacción por adición
de 1/10 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2 y 0,6 volúmenes de
isopropanol, se enfrió a -20ºC durante 1 hora y se centrifugó a
velocidad máxima en una microcentrífuga durante 30 minutos. El
sedimento de ADN se lavó una vez con etanol al 75%, a continuación
se secó brevemente al aire antes de resuspender en 80 \mul de
agua. La concentración se estimó con D.O. a 260 nm y se añadieron
60 unidades de exonucleasa lambda (Strandase, Novagen). La
digestión se realizó a 37ºC durante 20 minutos, las reacciones se
calentaron luego a 75ºC durante 10 minutos y se enfriaron a 4ºC.
Las incubaciones se realizaron en un ciclador térmico programable
(GeneAmp 9600, Perkin Elmer). El ADN restante se purificó empleando
columnas de eliminación de nucleótidos de QiaQuick (Qiagen,
Valencia, CA) siguiendo el procedimiento recomendado por el
fabricante y empleando los tampones proporcionados con el equipo de
reactivos (Qiagen, Valencia, CA). De forma resumida, se añadieron
10 volúmenes de Tampón PN (Qiagen) a la muestra. El volumen total
se aplicó a continuación a una columna con rotación de Qiagen y se
centrifugó (6000 rpm 1 minuto en una microcentrífuga). El material
filtrado se eliminó y la columna se lavó dos veces con 500 \mul
de Tampón PE (Qiagen). La columna se secó a continuación a fondo
por centrifugación a velocidad máxima durante 3 minutos. El ADN se
eluyó en 50 \mul de Tampón EB (Tris-HCl 10 mM, pH
8,5) (Qiagen). La concentración se estimó que era de
aproximadamente 2,5 X 10^{12} copias/5 \mul a partir de la DO a
260 nm. El análisis del gel reveló que ADNbc significativo (menos de
la mitad del total) permanecía, pero el error en la concentración
era menor de 2 veces. El ADN se diluyó hasta tener 10^{10}
copias/5 \mul en Tampón TE. Se prepararon diluciones en serie a
partir de la solución madre con 10^{10} copias, según fuera la
necesidad. La concentración basada en mediciones de la D.O. se
confirmó limitando el análisis con PCR de la dilución.
Los productos de la amplificación se separaron
electroforéticamente en geles en gradiente de poliacrilamida de
4-20% premoldeada de Novex (Invitrogen, Carlsbad,
CA; part. nº EC62255) en Tampón TBE IX (Tris base 89 mM, ácido
bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3) en un aparato de electroforesis de
Novex (EI9001-XCell II Mini Cell, Novex). Las
mezclas de reacción (5 \mul) de la amplificación lineal o la
transcripción (amplificación lineal mejorada) se mezclaron con 1
\mul de 6X solución de carga del gel (40% de sacarosa, 0,25% de
azul de bromofenol, 0,25% de xileno cianol), y la muestra completa
se cargó inmediatamente en cada pocillo. Los geles se sometieron a
250 V durante aproximadamente 5 minutos, hasta que todas las
muestras entraron en el gel y el voltaje se disminuyó a 175 V
durante 45 minutos. Los geles se retiraron de entre las placas de
plástico y se tiñeron en 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio en
Tampón TBE 1X (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM, pH
8,3). Un marcador del tamaño molecular de ADNbc
(Hi-Lo DNA Marker, Bionexus, San Leandro, CA) se
incluyó en una pista de cada recorrido del gel. Este marcador
contiene 16 fragmentos con los siguientes tamaños: 50, 100, 200,
300, 400, 500, 750, 1000, 1400, 1550, 2000, 3000, 4000, 6000, 8000
y 10000 pb. Típicamente, 50-2000 pb se podían
resolver en los geles empleados.
Las sondas de oligonucleótidos para los ejemplos
de hibridación (IA010 para los productos de ADNmc; IA014 para los
productos de ARNmc) se marcaron en el extremo 5', empleando la
quinasa de polinucleótidos de T4 (New England Biolabs, Beverly, MA)
y \gamma-^{32}P-ATP
(5'-[\gamma-^{32}P]trifosfato de
adenosina, sal de trietilamonio, Amersham, Piscataway, NJ;
PB10218,>5000 Ci/mmol, 10 mCi/ml). El cebador IA010 es un
21-mero con la secuencia: ATGTCATGGTCATGGTCGTGT (SEQ
ID NO:13). El cebador IA014 es un 31-mero con la
secuencia: CTCAACACGACCATGACCATGACATGACATTTGTTG (SEQ ID NO:14). Las
reacciones de marcación (50 \mul del volumen total) contenían
Tris-HCl 70 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM,
1 \mug de oligo (147 pmol para el cebador IA010; 101 pmol para el
cebador IA014), 250 \muCi
\gamma-^{32}P-ATP y 30 unidades
de quinasa de polinucleótido de T4. La incubación era a 37ºC durante
30 minutos, seguido de eliminación de los nucleótidos no
incorporados empleando el equipo de reactivos de eliminación de
nucleótidos de QIAquick (Qiagen, Valencia, CA). La tasa de
desintegración (cpm) se determinó en un contador de centelleo
líquido de 4000 series de Packard Minaxi Tri-Carb
de Cherenkov que hacía el recuento de 1 \mul de oligo
marcado.
La hibridación se realizó en reacciones de 30
\mul. El ADN producto (o ARN) (10 \mul) se añadió a 20 \mul
de mezcla de sonda. Las reacciones contenían NaCl 100 mM y 10^{6}
cpm de sonda (corregir para la desintegración empleando una
semi-vida de 14,3 días). Después de calentar a 65ºC,
15 segundos, se dejó transcurrir la hibridación a 42ºC durante 30
minutos, seguido de enfriamiento a 4ºC. Estas etapas se realizaron
en un ciclador térmico programable con una cubierta calentada
(GeneAmp 9600, Perkin Elmer). El volumen total de la reacción de
hibridación fue sometido a electroforesis en geles de poliacrilamida
al 10% en Tampón TBE 1X (Tris base 89 mM, ácido bórico 89 mM, EDTA
2 mM, pH 8,3) a 150 V durante 3 horas. Los geles se retiraron de
las placas de vidrio, se envolvieron en una envoltura de plástico y
se expusieron a una película de autorradiografía (BioMax, MR,
Kodak) a -20ºC durante una noche (\sim16 horas) con dos
detecciones intensificantes.
La amplificación isotérmica lineal se realizó
empleando un cebador compuesto aislado, una polimerasa de ADN, una
ARNasaH y un TSO o bloqueador. Las mezclas de la reacción que
contenían todos los componentes de la reacción, tal y como se ha
descrito anteriormente, así como las mezclas de reacción sin uno de
los reactivos clave, tal como el cebador compuesto, la ARNasaH o la
polimerasa de ADN Bca (Panvera, Madison, WI) se repicaron con
10^{10} copias de la diana de ADNmc sintética (IA010 - secuencia
mencionada en el Ejemplo 1). Una reacción de testigo negativo que
contenía todos los reactivos y no tenía ADNmc diana, también estaba
incluida. La amplificación lineal isotérmica de la secuencia de ADN
diana se realizó tal y como se ha descrito anteriormente. La
desnaturalización de la diana se realizó a 70ºC y la amplificación
isotérmica se realizó a 65ºC.
Los productos de la amplificación se resolvieron
por electroforesis en gel (Figura 5) (Primera pista: escala de
pesos moleculares, pistas nº 1-4: sin ADN, sin
cebador, sin ARNasaH, sin polimerasa de ADN Bca, respectivamente;
pista 5: contiene todos los componentes). No se detectaron
productos de la amplificación en las mezclas de reacción sin
cebador, ARNasaH, polimerasa de ADN Bca.
La hibridación y la autorradiografía de la sonda
IA010 con el producto de ADNmc del método de amplificación lineal,
tal y como se muestra en la Figura 6 (Pistas 1-4:
sin ADN, sin cebador, sin ARNasaH, sin polimerasa de ADN,
respectivamente; pista 5: contiene todos los componentes), verificó
la identidad del producto de la amplificación. La amplificación
lineal de la diana de oligonucleótidos sintéticos en este
experimento se realizó empleando un oligonucleótido
promotor-molde no bloqueado (IA015b). El
oligonucleótido promotor-molde IA015b es un
55-mero con una secuencia:
GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG
(SEQ ID NO:11). Los componentes de la reacción convencional de la
reacción de amplificación, empleados para esta reacción de
amplificación son como los mencionados anteriormente. La etapa
inicial de desnaturalización se realizó a 70ºC durante 10 segundos.
Las reacciones se enfriaron hasta 65ºC y se incubaron
adicionalmente a esta temperatura durante 30 minutos después de la
adición de polimerasa Bca y ARNasaH. No se detectó hibridación en
las reacciones testigos (sin ADN, sin cebador, sin ARNasaH, sin
Bca).
El oligonucleótido promotor molde (PTO) contiene
dos motivos de secuencia esenciales: una secuencia de promotor de T7
(5'-TAATACGACTCACTATAGGGAgGAG (SEQ ID NO:20)) y una
secuencia complementaria al molde de ADNmc. Se diseñaron cuatro
versiones de un PTO (IA012, IA012b, IA015, IA015b). El PTO IA012 es
un 67-mero y tiene la secuencia:
GGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG
(SEQ ID NO:8). El PTO IA012 contiene dos secuencias además del
núcleo del promotor T7: una extensión 5' (5'GGAATTC (SEQ ID NO:21))
y un espaciador (5'-ATCGAGTAGCTC (SEQ ID NO:22))
entre el promotor y la secuencia complementaria de ADN diana. IA015
es el PTO más corto (48-mero) que carece de la
extensión 5' y del espaciador. El PTO IA015 tiene la secuencia:
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG (SEQ ID NO:10). El
PTO IA012b es un 60-mero que contiene el espaciador
pero no la extensión. El PTO IA012b tiene la secuencia:
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGATCGAGTAGCTCCGGTACGCTGATCAAAGATCCGTG
(SEQ ID NO: 9). IAO15b contiene la extensión, pero no el
espaciador. La secuencia de IA015b se describe en el Ejemplo 2.
Todos los cebadores distintos de los oligonucleótidos quiméricos
IA005, IA019 y IA020 fueron sintetizados por Keystone (División de
BioSource International, Camarillo, CA) y se purificaron con
PAGE.
Un esquema general para este método de
amplificación se ilustra en la Figura 2A-C. La
capacidad de IA012, IA012b, IA015 y IA015b para convertir el molde
de ADNmc en un sustrato para la polimerasa de ARN de T7, se
determinó comparando la cantidad de ARN producido después de la
transcripción de productos de extensión solapantes, formados entre
un oligoproducto sintético (IA009) y cada uno de los PTOs. El
oligoproducto sintético IA009 es un 100-mero con la
secuencia:
AGTGTCCACCCCTGCCGGGATTTTAACGGACAGCGTTTTGCTGCGCTCAACACGACCATGACCATGAC
ATTTGTTGCACGGATCTTTGATCAGCGTACCG (SEQ ID NO:19). La extensión solapante se preparó en reacciones de 15 \mul que contenían Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 6 mM, 1 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), IA009 100 nM, PTO 100 nM y 1 unidad de polimerasa de ADN Bca. Las reacciones se constituyeron sin polimerasa de ADN Bca, se calentaron a 95ºC y a continuación se enfriaron durante 10 minutos a 60ºC. Después de añadir la polimerasa de ADN, las reacciones se incubaron a 60ºC durante 30 minutos. Una parte (2,5 \mul) de la mezcla de reacción se añadió a la mezcla de reacción de transcripción de ARN convencional y las reacciones de transcripción se determinaron mediante electroforesis en gel.
ATTTGTTGCACGGATCTTTGATCAGCGTACCG (SEQ ID NO:19). La extensión solapante se preparó en reacciones de 15 \mul que contenían Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 6 mM, 1 mM de cada dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), IA009 100 nM, PTO 100 nM y 1 unidad de polimerasa de ADN Bca. Las reacciones se constituyeron sin polimerasa de ADN Bca, se calentaron a 95ºC y a continuación se enfriaron durante 10 minutos a 60ºC. Después de añadir la polimerasa de ADN, las reacciones se incubaron a 60ºC durante 30 minutos. Una parte (2,5 \mul) de la mezcla de reacción se añadió a la mezcla de reacción de transcripción de ARN convencional y las reacciones de transcripción se determinaron mediante electroforesis en gel.
Tal y como se muestra en la Figura 7 (pista 1:
escala del peso molecular; pistas 2-5: producto de
extensión solapante de IA012, IA012b, IA015, IA015b,
respectivamente, las pistas 6-13: ARN desde IA012,
IA012b, IA015, IA015b, IA012, IA012b, IA015, IA015b,
respectivamente) se produjo significativamente más ARN con el
sustrato de la transcripción producido con los PTOs más cortos
(IA015, IA015b) que con IA012 o IA012b. El PTO que contenía la
extensión 5' pero no el espaciador (IA015b) producía unos
rendimientos demostrablemente mayores de ARN. En todos los casos,
sin embargo, aparecen múltiples productos además de la banda
principal de ARN. Se diseñó un quinto PTO que tenía la misma
secuencia que IA015b pero con un grupo 3' bloqueante (biotina) para
eliminar el 3'-OH libre, para demostrar el
comportamiento mejorado de un PTO bloqueado en 3'. El bloqueo del
3'-OH libre del PTO, elimina su capacidad de iniciar
una incorporación no específica de una secuencia promotora
funcional en los productos de amplificación, que conduce a una
generación no específica de productos de transcripción. El
comportamiento del PTO bloqueado en 3' y el PTO no bloqueado en la
amplificación lineal isotérmica mejorada, se determinó a partir de
la amplificación de una diana de oligonucleótidos sintéticos,
empleando condiciones convencionales. El PTO bloqueado en 3'
(IA015c) producía rendimientos comparables con IA015b de ARN
específico, pero con significativamente menos ruido de fondo, tal y
como se muestra en la Figura 8 (pista 1: escala de pesos
moleculares; pistas 2, 9: sin ADN, 30 minutos; pistas 3, 10: sin
ADN, 1 h; pistas 4, 11: sin ADN, 2 h; pistas 5, 12: 10^{10} copias
de IA013, 30 min; pistas 6, 13: 10^{10} copias de IA013; 1 h;
pistas 7, 14: 10^{10} copias de IA013, 2 h; pistas 8, 15:
10^{11} copias de IA013, 30 min; las reacciones
1-7 no se bloquearon (IA015b), las reacciones
8-15 se bloquearon (IA015c)). Las reacciones de los
testigos negativos (sin molde de ADN) y las reacciones que
contenían 10^{10} copias de oligodiana (IA013) se amplificaron
por desplazamiento de la hebra durante 30 minutos, 1 hora o 2 horas
a 55ºC, con IA015b o IA015c, incluido en la reacción de
desplazamiento de la hebra. Cuando el 3'-OH no
estaba bloqueado, se producía ARN no específico en todas las
reacciones y complicaba la identificación de la banda de ARN
específica. Por el contrario, el PTO bloqueado producía
principalmente un producto de ARN aislado.
El ADN se aisló a partir de 25 ml de E.
coli K12 (ATCC 10798) que creció durante una noche en medio de
triptona-NaCl. El ADN genómico se aisló por
digestión con lisozima y solubilización en una solución de lisis
caotrópica (equipo de reactivos Bactozol, Molecular Research
Center, Cincinnati, OH) siguiendo el procedimiento recomendado por
el fabricante. De forma resumida, se recogieron las bacterias por
centrifugación a 6000 x g durante 5 minutos. Los sedimentos
celulares se resuspendieron en tampón de digestión Bactozyme y se
incubaron a 50ºC durante 30 minutos. El material lisado resultante
se aclaró al final de la digestión, sin ningún racimo visible de
células sin digerir. El material lisado se mezcló con 4 volúmenes
de reactivo DNazol (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) y se
incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. El ADN fue
precipitado de la solución añadiendo 0,6 volúmenes de etanol
helado. Después de incubar durante 5 minutos a temperatura
ambiente, el ADN precipitado se recogió por centrifugación durante 5
minutos a velocidad máxima en una microcentrífuga. El sedimento de
ADN se lavó con etanol al 75%, se centrífugo de nuevo y se
resuspendió en 1,5 ml de Tampón TE (Tris-HCl 10 mM,
pH 8,0, EDTA 1 mM) calentado a 50ºC-55ºC durante 30
minutos, con agitación frecuente. La solución resultante se hizo
pasar repetidamente a través de una aguja de jeringa de calibre 22
para cizallar el ADN y reducir la viscosidad de la solución. El ADN
se precipitó de nuevo (EPI005-35) añadiendo 1/10
volúmenes de acetato de amonio 5 M y 3 volúmenes de etanol helado.
Después de incubar a -20ºC durante 1 h, el ADN se recogió por
centrifugación a velocidad máxima en una microcentrífuga. El
sedimento se lavó con etanol al 75%, se centrífugo de nuevo y se
resuspendió en 150 \mul de Tampón TE. Se prepararon dos
diluciones en Tampón TE para medir la D.O. (espectrofotómetro
Beckman DU640, a partir de las cuales se calculó la concentración
de ADN, asumiendo que 50 \mug/ml de ADNbc produce una D.O. a 260
nm de 1. Las concentraciones de ADN de dos diluciones eran 24,2
\mug/10 \mul y 24,6 \mug/10 \mul. La media de estas dos
mediciones (24,4 \mug/10 \mul) se corresponde aproximadamente
con 2,5 X 10^{9} copias del genoma/5 \mul (5 fg de ADN genómico
de E. coli = 1 copia).
El ADN se diluyó en Tampón TE en series de
10^{9}, 10^{8} o 10^{7} copias/5 \mul y se desnaturalizó
por calentamiento a 95ºC durante 5 minutos, seguido de un rápido
enfriamiento en hielo. El ADN molde monocatenario se diluyó hasta
10^{9} copias/5 \mul. Las reacciones se determinaron para
contener ausencia de ADN, 10^{7}, 10^{8}, 10^{9} o 2,5 x
10^{9} copias de ADN genómico.
La amplificación se realizó en reacciones de 15
\mul que contenían Tris-HCl 20 mM, pH 8,5,
MgCl_{2} 6,0 mM, dATP 1,0 mM, dCTP 1,0 mM, dTTP 1,0 mM, dGTP 0,8
mM, dITP 0,2 mM (dNTPs de Amersham), 6% de DMSO, 8% de glicerol, 100
\mug/ml de BSA acetilada (Ambion, Austin, TX), 0,6
unidades/\mul de inhibidor de la ribonucleasa recombinante
(rRNasin, Promega, Madison, WI), cebador compuesto IA005 5 \muM
(secuencia descrita en el Ejemplo 1), oligonucleótido
promotor-molde (PTO) IA015C 200 nM (secuencia
descrita en el Ejemplo 1). Las reacciones se reunieron con todos
los componentes excepto las dos enzimas. Después de calentar a 99ºC
durante 10 segundos en un ciclador térmico programable (GeneAmp
9600, Perkin Elmer), las reacciones se incubaron a 60ºC durante 30
minutos. Después de alcanzar 60ºC, se añadieron 0,6 \mul de
ARNasaH (0,05 unidades diluidas de la solución madre de 5 U/\mul
en Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, 30% de glicerol,
Hybridase, Epicentre Technologies, Madison, WI) y 1,0 \mul de
polimerasa de ADN Bca (2,0 unidades, Panvera, Madison, WI). Al final
de la incubación a 60ºC, las reacciones se enfriaron a 4ºC. Un
volumen de 5,0 \mul de producto de desplazamiento de hebra se
añadió a cada reacción de transcripción de ARN (volumen total 20
\mul). La transcripción del ARN se realizó empleando condiciones
convencionales y aumentando el volumen de la reacción hasta 20
\mul para proporcionar suficiente material para el análisis
directo del gel (5 \mul) y la hibridación de la sonda (10
\mul).
Al contrario que la amplificación de la diana
sintética definida monocatenaria, la amplificación del ADN genómico
de acuerdo con el método de la invención, requiere la formación de
una parada definida para la formación de un producto de ADNmc con
un extremo 3' definido. La formación de una parada definida para la
extensión del cebador, se puede conseguir con un bloqueador, que se
hibrida con el sitio definido en la hebra diana y no se puede ser
desplazado por la polimerasa. Alternativamente, como en el presente
ejemplo, una secuencia rica en GC aguas arriba del sitio del
cebador, proporciona un punto de detención para la extensión del
cebador, conduciendo de este modo a la formación de un producto de
ADNmc con extremo 3' definido.
La amplificación con éxito de una secuencia
definida de ADN genómico mediante el método de amplificación lineal,
isotérmica mejorada de la invención, se muestra en la Figura 9
(Pista 1: sin ADN; pista 2: 10^{7} copias de ADN genómico de
E. coli; pista 3: vacía; pista 4: 10^{8} copias de ADN
genómico de E. coli). El producto de ARNmc se muestra que se
hibrida con una sonda de oligonucleótidos específica.
Se determinó el comportamiento de cada uno de los
tres cebadores compuestos en los métodos de amplificación de la
invención. La amplificación lineal isotérmica se realizó en
reacciones de 15 \mul que contenían Tris-HCl 20
mM, pH 8,5, MgCl_{2} 6,0 mM, dATP 1,0 mM, dCTP 1,0 mM, dTTP 1,0
mM, dGTP 0,8 mM, dITP 0,2 mM (dNTPs de Amersham), DMSO al 6%,
glicerol al 8%, 100 \mug/ml de BSA acetilada (Ambion, Austin,
TX), 0,6 unidades/\mul de inhibidor de la ribonucleasa
recombinante (rRNasin, Promega, Madison, WI), cebador compuesto 5
\muM, oligonucleótido promotor-molde (PTO) IA015C
200 nM. La secuencia del PTO IA015C está descrita en el Ejemplo 1.
La secuencia de los cebadores compuestos IA005
(20-mero) está descrita en el Ejemplo 1. Otras
secuencias de cebadores compuestos con nombres alfanuméricos son las
siguientes:
IA019 (20-mero) | ACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:2) |
IA020 (21-mero) | GACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:3) |
Se utilizaron otras cuatro secuencias de
cebadores compuestos que no tenían nombres alfanuméricos. Sus
secuencias son, respectivamente:
(1) GCAAGACGGAUGCGGUCUCCAGTGT (SEQ ID NO:4)
(2) GACGATGCGUCTCCAGTGT (SEQ ID NO:5)
(3) GACGGATGCGGUCTCCAGUGT (SEQ ID NO:6)
(4) GACGGATGCGGUCTCCAGUGUCCA (SEQ ID NO:7)
Estos cebadores compuestos fueron sintetizados
por Dharmacon Research, Inc. (Boulder, CO). La parte de ARN del
oligonucleótido fue sintetizada empleando un grupo protector
5'-sililo junto con un grupo protector
2'-ortoéster lábil frente a ácidos (éter
2'-bis(acetoxietoxi)-metílico
o "2'-ACE" (Scaringe, S.A., y col. J. Am.
Chem. Soc. 120:11820-11821 (1998) y Scaringe,
S.A. Advanced
5'-silyl-2'-orthoester
approach to RNA oligonucleotide synthesis. Methods in Enzymology
(en prensa)). Los cebadores se purificaron con PAGE.
Las reacciones se reunieron con todos los
componentes excepto las dos enzimas. Después de calentar a 70ºC
durante 10 segundos en un ciclador térmico programable (GeneAmp
9600, Perkin Elmer), las reacciones se enfriaron a
55ºC-65ºC. Después de alcanzar la temperatura
inferior, se añadieron 0,05 unidades de ARNasaH (diluida a partir
de la solución madre de 5 U/\mul, empleando una solución de
diluyente/almacenamiento: Tris-HCl 10 mM, pH 8,5,
30% de glicerol; Hybridase Thermostable RNAase H, Epicentre
Technologies, Madison, WI) y 2,0 unidades de polimerasa de ADN Bca
(2 U/\mul; Panvera, Madison, WI). Las reacciones se incubaron a
55ºC-65ºC durante 30 minutos. Al final de la
incubación, las reacciones se enfriaron a 4ºC hasta la
transcripción. La transcripción del ARN se realizó a 37ºC durante 3
horas en reacciones de 10 \mul que contenían 2,5 \mul de la
reacción de amplificación lineal anterior y Tris-HCl
40 mM, pH 8,5, KCl 70 mM, DTT 5,0 mM, MgCl_{2} 12 mM, 110
\mug/ml de BSA, 3 mM de cada rNTP (ATP, UTP, CTP, GTP, Amersham),
7,5% de DMSO, 1 unidad/\mul de rRNasin (Promega, Madison, WI) y
20 unidades de polimerasa de ARN de T7 (Novagen, Madison, WI).
Los productos de la amplificación lineal mejorada
generada con cada uno de los cebadores compuestos se resolvió por
electroforesis en gel, tal y como se muestra en la Figura 10 (Pista
1: escala de peso molecular; pistas 1, 2: IA015, 60ºC; pistas 3, 4:
IA019, 55ºC; pistas 5, 6: IA019, 60ºC; pistas 7, 8: IA019, 65ºC;
pistas 9, 10: IA020, 55ºC; pistas 11, 12: IA020, 60ºC; pistas 13,
14: IA020, 65ºC). Los cebadores compuestos se diseñaron para
hibridarse en el mismo sitio sobre la hebra diana y diferían en el
número de desoxinucleótidos en el extremo 3'. Los mayores
rendimientos de producto de ARN se produjeron con el cebador IA020,
seguido de IA005 y IA019 igualmente. Los otros cuatro cebadores
compuestos producían menos producto de ARN. La temperatura óptima
para la etapa de amplificación lineal isotérmica era diferente para
los distintos cebadores, tal y como se esperaba.
Las secuencias de ácidos nucleicos que se van a
analizar, se aislaban primero de sus fuentes. Ejemplos no
limitativos de fuentes empleadas en este ejemplo son animales,
vegetales, bacterias, virus, levaduras u hongos. Si la fuente de
ácidos nucleicos (ADN o ARN) procede de tejidos animales, entonces
el tejido se homogeniza o se somete a ultrasonidos o a alguna
fuerza para permitir que las células individuales se separen del
tejido conectivo. Se debe tener cuidado para evitar la degradación
del ADN y ARN, especialmente, especialmente ARNm y para evitar el
cizallamiento de ADN genómico durante el tratamiento del tejido. Las
células animales también se pueden obtener a partir de fuentes
comerciales, es decir Gibco BRL o a partir de fuentes sin
beneficios, es decir, American Tissue Type Culture (ATCC).
Dependiendo de la forma deseada de ácidos nucleicos, ADN genómico,
ARN total o ARNm, se pueden aislar siguiendo protocolos
convencionales encontrados en Sambrook y col., más arriba.
Los protocolos para aislar ácido nucleico de células vegetales
también se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular
Biology, más arriba. Si la fuente de ácido nucleico son
fuentes de no mamíferos, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos o
virus, se emplean protocolos ligeramente diferentes para aislar el
ácido nucleico. Estos protocolos se pueden encontrar en Sambrook y
col., o "Current Protocols in Molecular Biology for bacteria,
yeast, fungi, and viruses".
La amplificación de la secuencia de ácido
nucleico diana definida se realiza como se ha descrito para la
amplificación lineal isotérmica, tal y como se ha descrito en esta
memoria. Aproximadamente 10^{2} hasta 10^{12} copias se emplean
para el molde. Además de los trifosfatos de desoxinucleótidos
naturales (dNTPs) que se emplean en el método de amplificación, la
mezcla de reacción de secuenciación incluye análogos de trifosfato
marcados. Si cada análogo se marca exclusivamente, se pueden añadir
los cuatro en el mismo tubo de reacción. Por otro lado, si cada
análogo de nucleótido se marca con el mismo marcador, las
reacciones de secuenciación se realizan en cuatro tubos de reacción
diferentes en donde cada mezcla de reacción contiene uno de los
análogos de nucleótido. Estos análogos se incorporan en el producto
de extensión del cebador mediante la polimerasa y sirven para
detener una extensión adicional a lo largo de la secuencia diana.
Los productos de extensión truncados resultantes están marcados.
Los múltiples productos de extensión del cebador desplazado
acumulado, varían en la longitud, según el sitio en donde se
incorpora cada uno de los análogos, lo que representa las distintas
posiciones en la secuencia de un nucleótido complementario en la
secuencia diana. El análisis de los productos de la reacción para
elucidar la información de la secuencia, se puede realizar
sometiendo los productos a una electroforesis en gel.
Alternativamente, otros métodos de análisis también se pueden
utilizar. Como con otros métodos de secuenciación, las reacciones
de secuenciación se realizan en un recipiente de reacción sencillo
o en recipientes de reacción separados. La elección del método que
se va a utilizar depende de los análogos de trifosfato de
nucleótidos utilizados. Por tanto, cuando cada uno de los análogos
se marca diferencialmente, la reacción de secuenciación se puede
realizar en un recipiente aislado. Las consideraciones para la
elección del reactivo y las condiciones de reacción para una
realización óptima del análisis de secuenciación de acuerdo con el
método de la invención, son similares a las de otros métodos
descritos previamente.
La pluralidad de los productos de extensión del
cebador que difieren en tamaño de acuerdo con la incorporación
específica del terminador de la elongación, se separan por el
tamaño empleando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en
la técnica. El perfil de la pluralidad de productos de extensión del
cebador producidos con cada uno de los análogos de terminadores, es
indicativo de la secuencia de nucleótidos de la secuencia de ácidos
nucleicos del ensayo.
La amplificación de la secuencia de ácido
nucleico diana definida se realiza tal y como se ha descrito para
la amplificación isotérmica lineal que implica transcripción, tal y
como se ha descrito en esta memoria. El uso de TSO o PTO se puede
emplear para anexionar la secuencia protopromotora al producto de la
amplificación lineal isotérmica. Además de los trifosfatos de
ribonucleótidos naturales (rRTPs) que se emplean para el método de
amplificación lineal mejorada de acuerdo con la presente invención,
la mezcla de reacción de secuenciación también incluye análogos de
trifosfato marcados adecuados, que se emplean normalmente en otros
métodos de secuenciación conocidos en la técnica. Estos se
incorporan en el producto de extensión mediante la polimerasa de ARN
y sirven para detener una extensión adicional de la secuencia
diana. Los productos de extensión truncados resultantes están
truncados. Los productos de extensión desplazados múltiples
acumulados varían en la longitud, según el sitio de incorporación
de cada uno de los análogos que representan las distintas
localizaciones de la secuencia de un nucleótido complementario,
sobre la secuencia diana. El análisis de los productos de la
reacción para elucidar la información de la secuencia, se puede
realizar tal y como se ha descrito en el anterior ejemplo de
secuenciación.
El ADN genómico se aísla a partir de células del
ensayo, empleando métodos descritos en ejemplos anteriores o por
otros medios conocidos por los expertos en la técnica. Organismos
distintos que incluyen, pero no están limitados a bacterias, virus,
hongos, levaduras, vegetales y animales se genotipan. Los cebadores
específicos del genotipo se diseñan para comprender un nucleótido en
el extremo 3' que se hibrida con un genotipo de una secuencia de
ácidos nucleicos específica o que se hibrida con el genotipo
duplicado. Los genotipos específicos que determinan una variación
de la secuencia pueden ser mutaciones puntuales, polimorfismo de
nucleótidos aislados (SNP), inserciones, deleciones y
similares.
La amplificación de la secuencia de ácido
nucleico diana definida se realiza como se ha descrito para la
amplificación de la secuencia genómica de E. coli, en el
ejemplo anterior. Empleando el cebador específico del genotipo y la
polimerasa de ADN que está desprovista de actividad de corrección de
pruebas, la generación del producto de la amplificación indica la
presencia de la secuencia diana del genotipo definido. La variación
de la secuencia que evita la hibridación del extremo 3' del cebador
con la secuencia de ácido nucleico diana, evitará la amplificación.
El producto de la amplificación se detecta mediante uno cualquiera
de los distintos métodos para detectar una secuencia de ácido
nucleico monocatenario, que se conocen en la técnica. Por ejemplo,
la hibridación de sondas de oligonucleótidos marcadas específicas,
con el producto de la amplificación, se detecta por electroforesis
en gel.
En casos en los que se requiere el genotipado de
células diploides, tales como en la determinación de un genotipo
homocigoto o heterocigoto, es posible realizar la amplificación de
la secuencia diana de ácido nucleico específica, empleando
cebadores específicos, diseñados para el genotipo silvestre y el
mutante, o para un genotipo y para otro genotipo. Las reacciones de
amplificación que emplean los cebadores específicos, se realizan en
recipientes de reacción separados. La detección del producto de la
amplificación en un solo tubo de reacción o menos producto de
amplificación es indicativa de un genotipo homocigoto, es decir,
tanto de tipo silvestre como homocigoto mutante. La detección del
producto de la amplificación en ambas reacciones de amplificación,
indica un genotipo heterocigoto.
Los métodos de amplificación isotérmica descritos
en esta memoria, se emplean para la detección de mutaciones
definidas o de sitios polimórficos (tales como SNPs) en una
secuencia de ácido nucleico diana. Los métodos se emplean para
genotipar o detectar la mutación que conduce a una resistencia a los
fármacos. La secuencia de ácido nucleico diana es ADN(mc)
monocatenario. La diana de ADN monocatenario se prepara a partir de
una diana de ADN bicatenario o una diana de ARN empleando los
métodos de amplificación isotérmica, descritos en esta memoria.
Tal y como se muestra en la Figura 4, un cebador
compuesto que es complementario a una secuencia de ADN de tipo
silvestre, se emplea junto con una diana de ADNmc que tiene o que
se sospecha que tiene una mutación en el alelo bajo escrutinio. Se
emplean aproximadamente 10^{2} hasta aproximadamente 10^{12}
copias de la diana de ADNmc y aproximadamente
0,05-5 \muM de cebador compuesto. La presencia de
la alteración de la secuencia no evita la etapa inicial de la
amplificación, en donde el cebador compuesto se hibrida con la
secuencia diana para formar el primer complejo trimolecular y se
produce un producto de extensión. Una ribonucleasa, ARNasaH, corta
a continuación la parte de ARN del cebador extendido del complejo.
El corte de la parte de ARN del cebador compuesto o el producto de
extensión del cebador, mediante la ARNasaH, está afectado por la
presencia de un mal emparejamiento. Esto puede evitar el corte,
alterar el patrón de corte o reducir la eficacia del corte. La
siguiente etapa de unir un cebador compuesto al complejo mediante
hibridación de la parte de ARN 5', se inhibe por un mal
emparejamiento, por la razón descrita anteriormente. La incapacidad
de del cebador compuesto de hibridarse con la diana, evita etapas
adicionales de desplazamiento de la hebra de extensión del cebador y
la producción de múltiples copias de los productos de la
amplificación. Los productos de la amplificación, o la falta de los
mismos, se visualiza mediante electroforesis en gel u otros medios
equivalentes.
Los factores que contribuyen a inhibir la
hibridación del cebador incluyen el tamaño del oligonucleótido que
se va a hibridar y las restricciones de las condiciones de la
reacción. Estos factores se consideran en el diseño del cebador
compuesto, según las técnicas bien conocidas y rutinarias de la
técnica.
Un cebador compuesto que es complementario a una
secuencia de ADN mutada, también se emplea junto con una diana de
ADNmc de tipo silvestre en el método de amplificación isotérmica
descrito anteriormente. En este caso, el cebador se une al ADN
diana y se produce una extensión. Sin embargo, después del
tratamiento ARNasaH, no se puede unir más cebador al ADN de tipo
silvestre por el mal emparejamiento de nucleótidos y, por tanto, se
produce una menor o ninguna amplificación del producto. Los
productos de la amplificación o la falta de los mismos, se
visualiza por electroforesis en gel u otros medios equivalentes.
También se realizan reacciones paralelas que
incluyen la muestra de ácido nucleico de interés o la muestra de
referencia del ácido nucleico diana, con una secuencia de tipo
silvestre. La acumulación de más productos de extensión del cebador
en la primera reacción, comparada con la última, es indicativo de la
presencia de un genotipo mutante en la muestra de interés.
Alternativamente, cuando el cebador compuesto comprende una
secuencia de ARN 5' que es totalmente complementaria a una
secuencia de genotipo normal de la diana del ensayo, se evita la
amplificación de una secuencia diana del genotipo mutante y la
detección y/o la determinación cuantitativa de los productos de la
amplificación son indicativas de un genotipo normal.
Los métodos para secuenciar mediante hibridación
se describen en los ejemplos previos. La determinación de la
identidad de secuencia mediante hibridación de una sonda específica
es particularmente ventajoso, empleando el método isotérmico de la
invención, mientras que el producto de la amplificación generado
por el método de la invención sea monocatenario y de buena
disponibilidad para emplear en la hibridación de sondas específicas.
Las sondas específicas para un genotipo definido se diseñan
empleando métodos conocidos en la técnica. Es posible determinar
criterios de hibridación que apoyen la hibridación de una sonda
selectiva con los productos de la amplificación generados por
amplificación de un genotipo y no del otro. Una variación de la
secuencia, tan reducida como un único nucleótido, puede evitar la
hibridación de la sonda. Los siguientes factores se toman en
consideración para los criterios de hibridación: longitud de la
sonda, temperatura de la reacción de hibridación y la composición
del tampón, en particular, la concentración de iones divalentes.
Las sondas empleadas para el análisis pueden estar en solución o
pueden estar fijadas a una superficie sólida. Además, las sondas se
pueden marcar o fijar directamente a un miembro de una pareja
específica de unión y, de este modo, ser capaz de unirse
específicamente a otro miembro de la pareja de unión específica que
puede estar marcado directa o indirectamente.
El ADN genómico se aísla a partir de las muestras
del ensayo por métodos conocidos en la técnica o como se ha descrito
en el ejemplo anterior. El ADN del ensayo se combina con los
componentes de la amplificación descritos, el cebador quimera
específico de la diana y la secuencia propromotora (tal como PTO).
La combinación se somete a condiciones de incubación, tales como
las descritas en esta memoria, para generar un producto de
amplificación de ARN monocatenario. La hibridación del producto de
la amplificación con las sondas específicas del genotipo se realiza
en solución o en fase sólida con sondas específicas del genotipo
fijadas. Puesto que los productos de los métodos de amplificación
lineal, isotérmica mejorada son monocatenarios, los productos son
perfectamente adecuados para ser fijados a la fase sólida, tal como
un portaobjetos de vidrio, para generar una formación de sondas
específicas con resolución espacial (es decir, chip génico).
Alternativamente, la fase sólida comprende partículas a las que se
fijan sondas específicas. La detección de la hibridación de la
sonda con los productos de amplificación se realiza mediante
diversos métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos
por Sambrook y col., más arriba. Las sondas específicas se
marcan y el cambio de las propiedades espectrales marcadas debido a
la hibridación se detecta y se almacena en algoritmos de
ordenador.
La asociación de partículas debida a la
hibridación de sondas específicas con los productos de la
amplificación, también se emplea para la detección de la
hibridación de la sonda. Los productos de la amplificación marcados
se generan y la hibridación de los productos con sondas
inmovilizadas sobre superficies sólidas se detecta y se almacena
mediante algoritmos de ordenador. La generación del producto de
amplificación marcado se realiza mediante la incorporación de rNTPs
marcados durante la etapa de transcripción, sustituyendo uno de los
cuatro rNTPs por un análogo de rNTP, que está marcado. La marcación
es un colorante o una pequeña molécula tal como biotina, que se
detecta a continuación por la unión a una entidad de unión
específica, tal como estreptavidina marcada. Los métodos para
detectar la hibridación de la sonda sobre superficies sólidas son
conocidos en la técnica.
El genotipado se realiza por amplificación de la
secuencia de ácido nucleico diana específica, empleando los métodos
descritos en esta memoria y por determinación del patrón de las
bandas electroforéticas del producto de ARN monocatenario que
refleja la configuración monocatenaria. El uso de SSCP para la
detección de la alteración de la secuencia está ampliamente
empleado. La configuración monocatenaria específica del genotipo se
determina sometiendo las muestras a electroforesis en gel o
capilar. La generación de producto monocatenario por amplificación
de la secuencia de ácido nucleico diana, según el método de la
invención, vuelve este método particularmente adecuado para la
determinación del genotipo combinando el método de amplificación con
el análisis rSSCP.
El ADN genómico del ensayo purificado se combina
con componentes del método de amplificación de la invención, tal y
como se ha descrito anteriormente, y el cebador compuesto
específico de la diana y la secuencia propromotora, tal como PTO.
La combinación se somete a condiciones para la amplificación
isotérmica de la secuencia diana. La mezcla de reacción que
contiene el producto de la amplificación se somete a electroforesis
en gel o capilar, empleando instrumentos y condiciones conocidas en
la técnica. El patrón de bandas electroforéticas del producto de la
amplificación se determina. La visualización del producto
oligonucleótido se consigue por inclusión de un intercalador de
colorante. El patrón electroforético del producto de la
amplificación se compara con el de los productos de la amplificación
generados por amplificación de la secuencia de ácido nucleico
diana, obtenida a partir de células de genotipo conocido. Cualquier
cambio en el patrón de movilidad electroforético es indicativo de
variabilidad de la secuencia. La combinación del método de
amplificación de la invención y rSSCP proporciona un solo método
para descubrir el polimorfismo en la secuencia de secuencias dianas
definidas y para detectar los genotipos definidos previamente. El
patrón electroforético de secuencias de ácido nucleico conocidas o
de genotipos definidos, se puede predeterminar y el patrón generado
por los productos de la amplificación del ADN del ensayo se
comparará con patrones conocidos para la determinación del
genotipo.
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Kurn, N.
\vskip0.333000\baselineskip
<120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA
AMPLIFICACIÓN LINEAL E ISOTÉRMICA DE SECUENCIAS DE
POLINUCLEÓTIDOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> 492692000100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140> Adjunta
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
\hskip 1cmIA005
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipacggaugcgg ucuccagtgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
\hskip1cmIA019
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<400> 2
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\hfill20
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
\hskip1cmIA020
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipgacggaugcg gucuccagtg t
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<220>
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<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<223> Cebador quimérico de ADN/ARN
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<223> IA012
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<223> IA012b
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<223> IA015
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<220>
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<223> IA015b
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<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg
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<210> 12
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<211> 55
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> La guanina tiene fijada una molécula
de biotina
\hskip1cmIA015c
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskipggaattctaa tacgactcac tatagggaga gcggtacgct gatcaaagat ccgtg
\hfill55
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<210> 13
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Cebador sintético
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<220>
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<223> IA010
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\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipatgtcatggt catggtcgtg t
\hfill21
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<210> 14
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<211> 31
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<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> IA014
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcaacacga ccatgaccat gacatttgtt g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> IA004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcatacgga atagcttacc ggtct
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> IA006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 16
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtacgctg atcaaagatc cgt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 351
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> IA013
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggtacgctg atcaaagatc cgtgcaacaa atgtcatggt catggtcgtg ttgagcgcag
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaaaacgctg tccgttaaaa tcccggcagg ggtggacact ggagaccgca tccgt
\hfill115
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> IA009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagtgtccacc cctgccggga ttttaacgga cagcgttttg ctgcgctcaa cacgaccatg
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccatgacat ttgttgcacg gatctttgat cagcgtaccg
\hfill100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Bacteriófago
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaatacgact cactataggg agag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaattc
\hfill7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgagtagc tc
\hfill12
Claims (30)
1. Un método para amplificar una secuencia de
polinucleótidos complementaria a una secuencia de polinucleótidos
diana que comprende:
(a) proporcionar un complejo que comprende:
- (i)
- un molde de ADN que comprende la secuencia diana; y
- (ii)
- un producto de extensión del cebador compuesto producido extendiendo con polimerasa de ADN un cebador compuesto que comprende una parte de ARN y una parte de ADN 3', en donde el producto de extensión del cebador compuesto se hibrida con el molde de ADN;
(b) cortar la parte de ARN del producto de
extensión del cebador compuesto con una enzima que corta el ARN de
un híbrido de ARN/ADN, de modo que otro cebador compuesto se hibrida
con el molde de ADN;
(c) repetir la extensión del cebador con
polimerasa de ADN mediante desplazamiento de la hebra;
(d) repetir las etapas (b) y (c) produciendo de
este modo múltiples copias de la secuencia complementaria de la
secuencia diana.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde el complejo comprende adicionalmente un polinucleótido que
comprende una secuencia de polinucleótidos de terminación, hibridada
con una región del molde que está 5' en relación con la hibridación
del cebador compuesto con el molde.
3. Un método para amplificar una secuencia de
polinucleótidos diana que comprende realizar el método de la
reivindicación 2, y que comprende adicionalmente:
(e) hibridar con el producto de extensión del
cebador desplazado un polinucleótido que comprende un propromotor y
una región que se hibrida con el producto de extensión del cebador
desplazado bajo condiciones que permiten que tenga lugar la
transcripción con polimerasa de ARN, de modo que se producen
transcritos de ARN que comprenden secuencias complementarias a los
productos de extensión del cebador desplazados, produciéndose de
este modo múltiples copias de la secuencia diana.
4. Un método para secuenciar una secuencia de
polinucleótidos diana que comprende realizar el método de la
reivindicación 1 ó 2, en donde la extensión del cebador comprende
extender el cebador compuesto hasta un sitio de terminación con
polimerasa de ADN y una mezcla de dNTPs y análogos de dNTPs, de modo
que esta extensión del cebador se termina después de incorporar un
análogo de dNTP; produciéndose de este modo múltiples copias de la
secuencia complementaria a la secuencia diana de diferentes
longitudes;
analizar el producto del método para determinar
la secuencia.
5. Un método de secuenciación de una secuencia de
nucleótidos diana que comprende realizar el método de la
reivindicación 2, y que comprende adicionalmente:
(e) hibridar el producto de extensión del cebador
desplazado con un polinucleótido que comprende un propromotor y una
región que se hibrida con el producto de extensión del cebador
desplazado bajo condiciones tales que tiene lugar la transcripción
del producto de extensión mediante una polimerasa de ARN, empleando
una mezcla de rNTPs y análogos de rNTPs, de modo que se producen
transcritos de ARN que comprenden secuencias complementarias a los
productos de extensión del cebador desplazados, de modo que la
transcripción termina después de la incorporación de un análogo de
rNTP, produciéndose de este modo múltiples copias de la secuencia
diana de diferentes longitudes;
(f) analizar el producto de las etapas (a) a (e)
para determinar la secuencia.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el cebador compuesto
comprende una parte de ARN 5' adyacente a la parte de ADN 3'.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde se emplea una pluralidad de
cebadores compuestos.
8. El método de la reivindicación 2 o cualquier
reivindicación dependiente de la misma, en donde el polinucleótido
que comprende una secuencia de polinucleótidos de terminación, es un
oligonucleótido conmutador del molde (TSO) o una secuencia de
bloqueo.
9. El método de la reivindicación 8, en donde el
TSO o la secuencia de bloqueo comprende una modificación en la
región que se hibrida con el molde, en donde, bajo una serie de
condiciones dadas, el TSO o la secuencia de bloqueo se une más
estrechamente a la región que en comparación con un TSO o una
secuencia de bloqueo, respectivamente, sin la modificación.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde la enzima que corta el ARN es
ARNasaH.
11. El método de la reivindicación 3 o la
reivindicación 5 o cualquier reivindicación dependiente de las
mismas, en donde el polinucleótido que comprende un propromotor y
una región que se hibrida con el producto de extensión del cebador
desplazado, es un oligonucleótido conmutador del molde (TSO).
12. El método de la reivindicación 3 o la
reivindicación 5 o cualquier reivindicación dependiente de las
mismas, en donde el polinucleótido que comprende el propromotor,
comprende una región en el extremo 3' que se hibrida con el producto
de extensión del cebador desplazado, de modo que la extensión con
la polimerasa de ADN del producto de extensión del cebador
desplazado, produce un promotor bicatenario a partir del cual tiene
lugar la transcripción.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el cebador compuesto
comprende una parte de ARN 5' de aproximadamente 5 a 20 nucleótidos
y una parte de ADN 3' de aproximadamente 5 a 15 nucleótidos.
14. El método de la reivindicación 13, en donde
la parte de ARN 5' tiene 10 a 15 nucleótidos y la parte de ADN 3'
tiene 7 a 12 nucleótidos.
15. Un método para caracterizar una
secuencia de interés en un polinucleótido diana, comprendiendo dicho
método
(i) amplificar una secuencia molde de
polinucleótidos que contiene la secuencia de interés según el método
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 10, 13 ó 14, en
donde la secuencia de la parte de ARN del cebador compuesto es
conocida, y
(ii) comparar los productos de la amplificación,
si hay alguno, de la etapa (i) con la cantidad de producto de la
amplificación de un molde de referencia en donde
(a) la producción de menos productos de la
amplificación detectables procedentes del molde, comparados con la
cantidad de producto de la amplificación procedente del molde de
referencia que comprende una región complementaria a la parte de ARN
del cebador compuesto, indica que el polinucleótido diana no
comprende una secuencia complementaria a la parte de ARN del
cebador compuesto y que es una variante de la secuencia en relación
con la secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador
compuesto; o
(b) la producción de más productos de la
amplificación detectables procedentes del molde, comparada con la
cantidad de producto de la amplificación procedente del molde de
referencia que no comprende una región complementaria a la parte de
ARN del cebador compuesto, indica que el polinucleótido diana
comprende una secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador
compuesto y que no es una variante de la secuencia en relación con
la secuencia complementaria a la parte de ARN del cebador
compuesto.
16. El método de la reivindicación 15, en donde
la secuencia de la parte de ARN del cebador compuesto comprende una
secuencia complementaria a una secuencia de tipo silvestre y la
secuencia de interés se caracteriza por determinar la
presencia o ausencia de la secuencia de tipo silvestre; o la
secuencia de la parte de ARN del cebador compuesto comprende una
secuencia complementaria a una secuencia mutante, y la secuencia de
interés se caracteriza por determinar la presencia o ausencia
de la secuencia mutante; o la secuencia de la parte de ARN del
cebador compuesto comprende una secuencia complementaria a una
secuencia alélica, y la secuencia de interés se caracteriza
por determinar la presencia o ausencia de la secuencia alélica.
17. Un método para detectar una mutación en un
polinucleótido diana por polimorfismo en la configuración
monocatenaria, que comprende (a) realizar el método de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 10 ó 13 ó 14; y (b)
analizar los productos amplificados del método para estudiar la
configuración monocatenaria, en donde una diferencia en la
configuración comparando con un polinucleótido monocatenario de
referencia, indica una mutación en el polinucleótido diana.
18. Un método para producir una micromatriz, que
comprende (a) realizar el método de amplificación de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, 6 a 10, 13 ó 14; y (b) fijar los
productos amplificados sobre un sustrato sólido para formar una
micromatriz de los productos amplificados.
19. Una composición que comprende (a) un cebador
compuesto, comprendiendo dicho cebador compuesto una parte de ADN 3'
y una parte de ARN 5' y (b) un polinucleótido que comprende una
secuencia de polinucleótidos de terminación que comprende un
oligonucleótido conmutador del molde, en donde la secuencia de
polinucleótidos de terminación efectúa la finalización de la
replicación del ADN de un molde con la polimerasa de ADN.
\newpage
20. La composición de la reivindicación 19, en
donde el cebador compuesto comprende una parte de ARN 5' adyacente a
la parte de ADN 3'.
21. La composición de la reivindicación 19 ó 20,
en donde la parte de ARN 5' tiene aproximadamente 5 a 20 nucleótidos
y la parte de ADN 3' tiene aproximadamente 5 a 15 nucleótidos.
22. Una composición de la reivindicación 19, 20 ó
21, en donde el TSO comprende una modificación en la región que se
hibrida con el molde, en donde, bajo una serie de condiciones dadas,
el TSO se une más estrechamente a la región que comparando con un
TSO sin la modificación.
23. Una composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 22, que comprende adicionalmente un
oligonucleótido molde propromotor (PTO).
24. Una mezcla de reacción que comprende (a) un
molde de polinucleótido; (b) una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 y; (c) una polimerasa de
ADN.
25. Un equipo de reactivos para la amplificación
de una secuencia de polinucleótidos diana, que comprende (a) un
cebador compuesto que comprende una parte de ADN 3' y una parte de
ARN y (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de
polinucleótidos de terminación que comprende un oligonucleótido
conmutador del molde, en donde la secuencia de polinucleótidos de
terminación efectúa el cese de la replicación del ADN de un molde
mediante una polimerasa de ADN.
26. El equipo de reactivos de la reivindicación
25, en donde el cebador compuesto comprende una parte de ARN 5' que
es adyacente a la parte de ADN 3'.
27. La mezcla de reacción o el equipo de
reactivos de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, que
comprende adicionalmente una enzima que corta el ARN procedente de
un híbrido de ARN/ADN.
28. La mezcla de reacción o el equipo de
reactivos de la reivindicación 27, en donde la enzima es
ARNasaH.
29. La mezcla de reacción o el equipo de
reactivos de una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, que
comprende adicionalmente un polinucleótido que comprende un
propromotor.
30. La mezcla de reacción o el equipo de
reactivos de la reivindicación 29, en donde el polinucleótido que
comprende un propromotor es un oligonucleótido molde propromotor
(PTO).
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