DE69937223T3

DE69937223T3 - Verfahren zur synthese von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69937223T3
Application number: DE69937223T
Authority: DE
Inventors: Tsugunori Nasu Jigyosho Otawara-shi NOTOMI; Tetsu c/o Nasu Kojo Otawara-shi HASE
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2011-05-05
Anticipated expiration: 2019-11-09
Also published as: EP1020534B1; ES2294862T3; EP1873260B1; EP1873260A1; HK1154635A1; JP4139424B2; US20020168676A1; ATE426045T1; ES2294862T5; WO2000028082A1; EP1020534A4; MY157626A; EP2045337A1; US6410278B1; EP2287338A1; DE69940623D1; US6974670B2; ATE521718T1; DE69937223T2; EP1020534A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure, die aus einer spezifischen Nukleotidsequenz aufgebaut ist, welches nützlich ist als ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure.
Stand der Technik
Ein Analyseverfahren, das auf der Komplementarität der Nukleotidsequenz von einer Nukleinsäure basiert, kann genetische Merkmale direkt analysieren. Demgemäß ist diese Analyse ein sehr starkes Mittel zur Identifikation von genetischen Krankheiten, Krebs, Mikroorganismen usw. Ferner ist ein Gen selbst das Objekt der Detektion und somit können zeitraubende und komplizierte Verfahren, wie beispielsweise eine Kultivierung, in einigen Fällen weggelassen werden.
Nichtsdestotrotz ist die Detektion von einem Zielgen, das in einer sehr kleinen Menge in einer Probe vorliegt, prinzipiell nicht einfach, so dass eine Amplifikation von einem Zielgen selbst oder dessen Detektionssignal notwendig ist. Als ein Verfahren zum Amplifizieren eines Zielgens ist die PCR (Polymerase Kettenreaktion) bekannt (Science, 230, 1350–1354, 1985). Derzeitig ist das PCR-Verfahren das am häufigsten verwendete Verfahren einer Technik zum Vervielfältigen von Nukleinsäure in vitro. Dieses Verfahren wurde nachhaltig als ein exzellentes Detektionsverfahren etabliert durch den Vorteil von hoher Sensitivität, die auf dem Effekt einer exponentiellen Amplifikation basiert. Da das Amplifikationsprodukt als DNA gewonnen werden kann, wird dieses Verfahren ferner weit verbreitet eingesetzt als ein wichtiges Werkzeug, das Gentechniken unterstützt, wie beispielsweise das Klonen von Genen und die Strukturaufklärung. In dem PCR-Verfahren sind jedoch die folgenden Probleme bekannt: eine spezielle Temperaturkontrolleinheit ist notwendig zur Durchführung; das exponentielle Wachstum von der Amplifikationsreaktion führt zu einem Problem in der Quantifizierung; und Proben und Reaktionslösungen werden leicht von außen kontaminiert, was es einer Nukleinsäure, die fälschlicherweise beigemischt wird, erlaubt, als Matrize zu dienen.
Während genetische Informationen angesammelt werden, zieht die Analyse von einzelnen Nukleotidpolymorphismen (single nucleotide polymorphism (SNPs) Aufmerksamkeit auf sich. Der Nachweis von SNPs durch PCR wird möglich durch Entwerfen eines Primers derart, dass dessen Nukleotidsequenz die SNPs enthält. Das heißt, ob eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu dem Primer ist, vorhanden ist oder nicht, kann herausgefunden werden durch Ermitteln, ob ein Reaktionsprodukt vorhanden ist oder nicht. Wenn jedoch einmal fälschlicherweise zufällig eine komplementäre Kette in einer PCR synthetisiert wird, dient dieses Produkt als eine Matrize in Folgereaktionen und verursacht dadurch ein fehlerhaftes Ergebnis. In der Praxis wird gesagt, dass die strenge Kontrolle von einer PCR schwierig ist bei einem Unterschied von nur einer Base, die sich an einem Ende von dem Primer befindet. Entsprechend ist es notwendig, die Spezifität zu erhöhen, um die PCR für die Detektion von SNPs einzusetzen.
Auf der einen Seite wird ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure mit einer Ligase ebenfalls praktisch eingesetzt. Das LCR-Verfahren (Ligase Kettenreaktion, Laffler TG; Garrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (Paris), 51:9, 821–6, 1993) basiert auf der Reaktion, in welcher zwei benachbarte Sonden mit einer Zielsequenz hybridisiert werden und durch eine Ligase miteinander verknüpft werden. Die zwei Sonden können nicht miteinander verknüpft werden ohne die Zielnukleotidsequenz, und deshalb ist das Vorhandensein von einem verknüpften Produkt ein Indikator für die Ziel-Nukleotidsequenz. Da das LCR-Verfahren ebenfalls die Regelung der Temperatur zur Trennung von einer komplementären Kette von einer Matrize erfordert, entstehen dieselben Probleme wie im PCR-Verfahren. Für eine LCR gibt es ebenfalls einen Bericht über ein Verfahren zum Verbessern der Spezifität durch Hinzufügen des Schrittes des Bereitstellens eines Strangbruchs zwischen den benachbarten Sonden und Schließen des Strangbruchs durch eine DNA-Polymerase. Jedoch kann man in diesem modifizierten Verfahren lediglich Spezifität erwarten und es verbleibt immer noch das Problem, dass eine Regelung der Temperatur nötig ist. Ferner führt die Verwendung von dem zusätzlichen Enzym zu einem Anstieg der Kosten.
Ein Verfahren, das SDA-Verfahren (Strangverdrängungsamplifikation) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392–396, 1992] [Nucleic Acid. Res., 20, 1691–1696, 1992] genannt wird, ist ebenfalls bekannt als ein Verfahren zum Amplifizieren von DNA, die eine Sequenz als Matrize aufweist, welche Sequenz komplementär zu einer Zielsequenz ist. In dem SDA-Verfahren wird eine spezielle DNA-Polymerase verwendet, um eine komplementäre Kette ausgehend von einem Primer, der komplementär zu der 3'-Seite von einer bestimmten Nukleotidsequenz ist, zu synthetisieren, während eine doppelstrangige Kette verdrängt wird, wenn eine an der 5'-Seite von der Sequenz vorhanden ist. In der vorliegenden Beschreibung beziehen sich die einfachen Ausdrücke ”5'-Seite” oder ”3'-Seite” auf die Seite von einer Kette, die als Matrize dient. Weil eine doppelstrangige Kette an der 5'-Seite verdrängt wird durch eine neu synthetisierte komplementäre Kette, wird diese Technik SDA-Verfahren genannt. Der Schritt des Temperaturänderns, welcher essentiell in dem PCR-Verfahren ist, kann in dem SDA-Verfahren ausgelassen werden durch vorheriges Einfügen einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz in eine angelagerte Sequenz als einen Primer. Das heißt, ein Strangbruch, der durch ein Restriktionsenzym geschaffen wird, stellt eine 3'-OH-Gruppe bereit, die als Ausgangspunkt für die Synthese von einer komplementären Kette dient, und die vorher synthetisierte komplementäre Kette wird als eine einzelstrangige Kette freigesetzt durch die Strangverdrängunsgsynthese und dann wieder verwendet als eine Matrize für folgende Synthesen von komplementären Ketten. Auf diese Weise ist die komplizierte Regelung der Temperatur, die in dem PCR-Verfahren essentiell ist, in dem SDA-Verfahren nicht erforderlich.
In dem SDA-Verfahren sollte das Restriktionsenzym, welches einen Strangbruch erzeugt, jedoch zusätzlich zu der DNA-Polymerase von der Art der Strangverdrängung verwendet werden. Dieses Erfordernis für ein zusätzliches Enzym ist einer der Hauptgründe für höhere Kosten. Weil das Restriktionsenzym nicht für die Spaltung von beiden Doppelstrangketten verwendet wird, sondern zum Einfügen von einem Strangbruch (das heißt, Spalten von nur einer der Ketten), sollte ferner ein dNTP-Derivat, wie beispielsweise α-thio-dNTP, als ein Substrat für die Synthese eingesetzt werden, um die andere Kette resistent gegenüber dem Verdau mit dem Enzym zu machen. Demgemäß hat das Amplifikationsprodukt einer SDA eine Struktur, die sich von der Struktur von natürlichen Nukleinsäuren unterscheidet, und es besteht eine Beschränkung gegenüber der Spaltung mit Restriktionsenzymen oder gegenüber der Anwendung von dem Amplifikationsprodukt für das Klonen von Genen. In dieser Hinsicht besteht auch ein Hauptgrund für die höheren Kosten. Wenn das SDA-Verfahren auf eine unbekannte Sequenz angewendet wird, besteht ferner die Möglichkeit, dass die gleiche Nukleotidsequenz wie die Restriktionsenzym-Erkennungssequenz, die zum Einfügen eines Strangbruchs verwendet wird, in einer Region, die synthetisiert werden soll, vorhanden ist. In diesem Fall kann es vorkommen, dass eine vollständig komplementäre Kette daran gehindert wird, synthetisiert zu werden.
NASBA (Nukleinsäure-basierte Amplifikation, auch genannt das TMA/ Transkriptions-vermittelte Amplifikationsverfahren), ist bekannt als Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure, wobei die komplizierte Regelung der Temperatur nicht erforderlich ist. NASBA ist ein Reaktionssystem, in welchem DNA durch eine DNA-Polymerase in Gegenwart von einer Ziel-RNA als Matrize synthetisiert wird mit einer Sonde, der ein T7-Promotor hinzugefügt ist, und in welchem das Produkt mit einer zweiten Sonde in eine doppelstrangige Kette ausgebildet wird, gefolgt von einer Transkription durch T7-RNA-Polymerase mit der gebildeten doppelstrangigen Kette als eine Matrize, um eine große Menge von RNA zu amplifizieren (Nature, 350, 91–92, 1991). NASBA erfordert einige Hitze-Denaturierungsschritte, bis die doppelstrangige DNA komplettiert ist, jedoch die nachfolgende transkriptionale Reaktion durch T7-RNA-Polymerase läuft unter isothermen Bedingungen ab. Jedoch ist eine Kombination von verschiedenen Enzymen, wie beispielsweise Reverse Transkriptase, RNase H, DNA-Polymerase und T7-RNA-Polymerase erforderlich, und dies ist unvorteilhaft für die Kosten, wie dies auch bei der SDA der Fall ist. Ferner, weil es kompliziert ist, die Bedingungen für eine Vielzahl von Enzymreaktionen aufzustellen, wird dieses Verfahren nur unwahrscheinlich Verbreitung als ein generelles Analyseverfahren finden. In den bekannten Reaktionen zur Amplifikation von Nukleinsäure verbleiben also Probleme, wie beispielsweise die komplizierte Kontrolle der Temperatur und die Notwendigkeit von mehreren Enzymen, wie sie oben beschrieben sind.
Für diese bekannten Reaktionen zum Synthetisieren von Nukleinsäure gibt es nur wenige Berichte über einen Versuch zur weiteren Verbesserung der Effizienz der Synthese von Nukleinsäure ohne Einbußen der Spezifität oder einen Kostennachteil. Zum Beispiel, in einem Verfahren, das RCA (Rolling-Circle Amplifikation) genannt wird, wurde es gezeigt, dass einzelstrangige DNA, die eine Reihe von Nukleotidsequenzen aufweist, die komplementär zu einer Padlock-Sonde sind, kontinuierlich synthetisiert werden kann in der Gegenwart von einer Zielnukleotidsequenz (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225–232, Juli 1998). In der RCA, wird eine Padlock-Sonde verwendet, die eine spezielle Struktur aufweist, worin jedes von dem 5'- und dem 3'-Ende von einem einzelnen Oligonukleotid eine benachbarte Sonde in einer LCR ausmacht. Dann wird die kontinuierliche Reaktion zum Synthetisieren einer komplementären Kette mit der Padlock-Sonde als eine Matrize, welche verbunden und zyklisiert wurde in der Gegenwart von einer Zielnukleotidsequenz gestartet durch Kombination mit einer Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung zur Synthese einer komplementären Kette synthetisiert. Einzelstrangige Nukleinsäure, die eine Struktur mit einer Serie von Regionen aufweist, die jeweils aus der gleichen Nukleotidsequenz bestehen, wird somit ausgebildet. Ein Primer wird ferner angelagert an diese einzelstrangige Nukleinsäure, um deren komplementäre Kette zu synthetisieren und ein hoher Grad an Amplifikation wird somit erreicht. Jedoch bleibt weiterhin das Problem der Notwendigkeit von einer Vielzahl von Enzymen. Ferner hängt die Auslösung von der Synthese der komplementären Kette von der Reaktion des Verbindens zweier benachbarter Regionen ab, und die Spezifität ist grundsätzlich die gleiche wie bei der LCR.
Mit dem Ziel des Bereitstellens von 3'-OH ist ein Verfahren bekannt, in welchem eine Nukleotidsequenz an dem 3'-Ende mit einer Sequenz versehen ist, die komplementär dazu ist, und in welchem eine Haarnadel-Schleife an dem Ende ausgebildet wird (Gene, 71, 29–40, 1988). Die Synthese von der komplementären Kette mit einer Zielsequenz selbst als eine Matrize startet an der Haarnadel-Schleife, um eine einzelstrangige Nukleinsäure auszubilden, die aus der komplementären Nukleotidsequenz besteht. Zum Beispiel ist in der PCT/FR95/00891 eine Struktur realisiert, in welcher ein sich Anlagern in der gleichen Kette an dem Ende auftritt, an welches Ende eine komplementäre Nukleotidsequenz angebunden worden ist. In diesem Verfahren ist jedoch der Schritt essentiell, in dem das Ende die Basenpaarung mit der komplementären Kette aufgibt und eine Basenpaarung erneut in der selben Kette ausgebildet wird. Es wird geschätzt, dass dieser Schritt abläuft in Abhängigkeit von einem subtilen Gleichgewichtszustand von gegenseitig komplementären Nukleotidsequenzen an dem Ende, die an Basenpaarungen beteiligt sind. Das heißt, ein Gleichgewichtszustand, der zwischen Basenpaarung mit einer komplementären Kette und Basenpaarung in der gleichen Kette aufrecht erhalten wird, wird ausgenutzt, und nur ein sich Anlagern an die Nukleotidsequenz in der gleichen Kette dient als Ausgangspunkt für die Synthese der komplementären Kette. Demgemäß ist es zu beachten, dass strenge Reaktionsbedingungen aufgestellt werden sollten, um eine hohe Reaktionseffizienz zu erzielen. Ferner bildet in diesem Stand der Technik der Primer selbst eine Schleifenstruktur aus. Wenn einmal ein Primer-Dimer gebildet wurde, wird demgemäß die Amplifikationsreaktion automatisch initiiert, ohne Rücksicht darauf, ob eine Zielnukleotidsequenz vorhanden ist oder nicht, und ein unspezifisches Syntheseprodukt wird somit ausgebildet. Dies kann ein schwerwiegendes Problem sein. Weiterhin führt die Bildung von dem Primer-Dimer und dem nachfolgenden Verbrauch von dem Primer durch eine unspezifische Synthesereaktion zu einer Reduzierung in der Amplifikationseffizienz von der erwünschten Reaktion.
Im Übrigen gibt es einen Bericht, dass eine Region, die nicht als Matrize für eine DNA-Polymerase dient, verwendet wurde, um eine 3'-terminale Struktur zu realisieren, die sich an die gleiche Kette anlagert ( EP713922 ). Dieser Bericht nennt die gleichen Probleme, die in der obigen PCT/FR95/00891 genannt werden, in Bezug auf die Verwendung eines dynamischen Gleichgewichts an dem Ende oder der in Bezug auf die Möglichkeit einer unspezifischer Synthesereaktion durch die Ausbildung von einem Primer-Dimer. Ferner sollte eine spezielle Region, die nicht als eine Matrize für eine DNA-Polymerase dient, als ein Primer hergestellt werden.
In verschiedenen Signal-Amplifikationsreaktionen, auf welche das Prinzip von der NASBA, das oben beschrieben ist, angewendet wird, wird weiterhin oftmals ein Oligonukleotid verwendet, das eine Haarnadel-Struktur an dessen Ende aufweist, um eine doppelstrangige Promoter-Region zur Verfügung zu stellen ( JP-A 5-211873 ). Diese Techniken sind jedoch nicht solche, die eine ausreichende Bereitstellung von 3'-OH für die Synthese von einer komplementären Kette erlauben. In der JP-A 10-510161 ( WO 96/17079 ) wird ferner eine Haarnadel-Schleifenstruktur, die ein 3'-Ende aufweist, das sich an der gleichen Kette anlagert, eingesetzt zum Zwecke des Erhaltens einer DNA-Matrize, die durch eine RNA-Polymerase transkribiert wird. In diesem Verfahren wird die Matrize amplifiziert durch eine Transkription in RNA und einer reversen Transkription von RNA in DNA. In diesem Verfahren kann jedoch das Reaktionssystem nicht ohne die Kombination von einer Vielzahl von Enzymen aufgestellt werden.
Die WO 97/04131 beschreibt ein Verfahren zur exponentiellen Amplifikation einer Polynukleotid-Haarnadel, welches einen einzigen Primer verwendet, der dazu in der Lage ist, an einer Stelle von dem 3'-Teil von dem Haarnadel-Polynukleotid zu hybridisieren, welche Stelle für eine Primer-Verlängerung in den Stammbereich oder den Duplex-Teil von der Schleife geeignet ist. Die Basenpaarung von dem Schleifen-Polynukleotid wird unterbrochen und einer Hybridisierung mit dem Primer ausgesetzt und dann wird der Primer verlängert, wodurch ein verlängertes Produkt erzeugt wird.
Offenbarung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure bereitzustellen, das auf einem neuen Prinzip basiert. Eine mehr spezifische Aufgabe ist es ein Verfahren bereitzustellen, das dazu in der Lage ist, die Synthese von einer Nukleinsäure, die von einer Sequenz abhängt, effizient bei geringen Kosten zu realisieren. Das heißt, eine Aufgabe von der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren bereitzustellen, das dazu in der Lage ist, die Synthese und Amplifikation von Nukleinsäure durch ein einziges Enzym selbst unter isothermen Reaktionsbedingungen bereitzustellen. Ein weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure bereitzustellen, welches eine hohe Spezifität realisieren kann, die nur schwer mit den bekannten Reaktionsprinzipien zur Synthese von Nukleinsäure zu erreichen ist, sowie ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure durch Anwenden besagten Syntheseverfahrens.
Die vorliegenden Erfinder fokussierten ihre Aufmerksamkeit auf die Tatsache, dass der Einsatz von einer Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung zur Synthese einer komplementären Kette katalysiert, geeignet ist für die Nukleinsäuresynthese, die nicht abhängig ist von einer komplizierten Regelung der Temperatur. Solch eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, welches in der SDA und der RCA eingesetzt wird. Jedoch, selbst wenn so ein Enzym verwendet wird, ist in den bekannten Verfahren immer eine weitere Enzymreaktion erforderlich, um, basierend auf Primern, 3'-OH als den Ausgangspunkt für die Synthese bereitzustellen, wie beispielsweise der SDA.
Unter diesen Voraussetzungen untersuchten die vorliegenden Erfinder die Bereitstellung von 3'-OH aus einem komplett anderen Gesichtswinkel als dem der bekannten Ansätze. Als ein Ergebnis fanden die vorliegenden Erfinder heraus, dass das Verwenden eines Oligonukleotids, das eine spezielle Struktur aufweist, 3'-OH ohne eine weitere Enzymreaktion bereit gestellt werden kann, wodurch die vorliegende Erfindung vollendet wurde. Das heißt, die vorliegende Erfindung ist begrenzt auf:

1. Ein Kit für die Synthese von einer Nukleinsäure, die komplementäre Ketten besitzt, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, enthaltend die folgenden Elemente: i) ein erstes Oligonukleotid umfassend wenigstens zwei Regionen F2 und F1c, wobei F1c mit der 5'-Seite von F2 verbunden ist, und wobei F2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär ist zu einer willkürlichen Region F2c in einer Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, und F1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie eine Region F1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region F2c in Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, angeordnet ist; ii) ein zweites Oligonukleotid umfassend wenigstens zwei Regionen R2 und R1c, wobei R1c mit der 5'-Seite von R2 verbunden ist, und wobei R2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär ist mit einer willkürlichen Region R2c in einer komplementären Kette, synthetisiert mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangpunkt der Synthese, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, und R1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie eine Region R1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region R2c in der komplementären Kette, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, lokalisiert ist; iii) ein erster äußerer Primer mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Region F3c, die lokalisiert ist an der 3'-Seite von der Region F2c in der Nukleinsäure, die als Matrize dient; iv) eine DNA-Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese einer komplementären Kette katalysiert; v) ein Nukleotid, das als Substrat für das Element iv) dient, und vi) ein zweiter äußerer Primer mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Region R3c, die lokalisiert ist an der 3'-Seite von der willkürlichen Region R2c in der komplementären Kette, die mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese synthetisiert wird.
2. Das Kit gemäß Punkt 1 umfassend ein Nachweismittel zum Nachweisen des Produktes von der Nukleinsäuresynthesereaktion.
3. Ein Verfahren zum Synthetisieren eines Nukleinsäuremoleküls umfassend: a. Zugeben der Elemente i) bis vi) von dem Kit gemäß Punkt 1 zu einer einzelstrangigen oder doppelstrangigen Nukleinsäure, die als Matrize dient; und b. Inkubieren des Gemisches von Schritt a) bei solch einer Temperatur, dass die Nukleotidsequenz, welche das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid ausbildet, stabile Basenpaarung mit dessen komplementären Nukleotidsequenzen bilden kann, während die Enzymaktivität erhalten bleiben kann.
4. Das Verfahren gemäß Punkt 3, wobei das Gemisch ferner einen Regulator für die Schmelztemperatur umfasst.
5. Das Verfahren gemäß Punkt 4, wobei der Regulator für die Schmelztemperatur Betain ist.
6. Das Verfahren gemäß Punkt 5, wobei 0,2 bis 3,0 M Betain vorhanden ist.
7. Das Verfahren gemäß Punkt 3, wobei das Gemisch ferner umfasst ein Nachweismittel zum Nachweisen des Produktes von der Nukleinsäuresynthese, welche gemäß dem Verfahren nach Punkt 10 erstellt wird.
8. Das Verfahren gemäß Punkt 3, wobei die Matrizen-Nukleinsäure RNA ist und die DNA-Polymerase Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist.

Das Folgende dient nur zu Illustrationszwecken.
Die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, welche die Aufgabe von der Synthese in der vorliegenden Erfindung ist, bedeutet eine Nukleinsäure, die gegenseitig komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die Seite an Seite in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind. In der vorliegenden Erfindung sollte die Nukleinsäure ferner eine Nukleotidsequenz zum Ausbilden einer Schleife zwischen den komplementären Ketten enthalten. In der vorliegenden Erfindung wird diese Sequenz die schleifen-bildende Sequenz genannt. Die Nukleinsäure, die durch die vorliegende Erfindung synthetisiert wird, ist im Wesentlichen aufgebaut aus abwechselnd komplementären Ketten, die über die schleifen-bildende Sequenz miteinander verknüpft sind. Im Wesentlichen wird ein Strang, der nicht in zwei oder mehr Moleküle durch Dissoziation von Basenpaarung getrennt wird, eine einzelstrangige Kette genannt, unabhängig davon, ob ein Strang teilweise an Basenpaarungen beteiligt ist oder nicht. Die komplementäre Nukleotidsequenz kann Basenpaarungen in der gleichen Kette ausbilden. Ein intramolekulares Basenpaarungsprodukt, welches dadurch erhalten werden kann, dass es der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, erlaubt wird, eine Basenpaarung in der gleichen Kette einzugehen, erzielt eine Region, die augenscheinlich eine doppelstrangige Kette darstellt, und eine Schleife, die nicht an Basenpaarung beteiligt ist.
Das heißt, die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, enthält komplementäre Nukleotidsequenzen, die zur Anlagerung in der gleichen Kette in der Lage sind, und deren angelagerte Produkte können definiert werden als einzelstrangige Nukleinsäuren, die eine Schleife ausbilden, die keine Basenpaarung an ihrer gekrümmten Schleifenregion aufweist. Ein Nukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär dazu ist, kann sich an die Schleife, welche nicht in Basenpaarung verwickelt ist, anlagern. Die schleifen-bildende Sequenz kann eine beliebige Nukleotidsequenz sein. Die schleifen-bildende Sequenz ist zu einer Basenpaarung in der Lage, um so die Synthese von einer komplementären Kette zur Verdrängung zu initiieren, und die schleifen-bildende Sequenz ist vorzugsweise versehen mit einer Sequenz, die unterscheidbar ist von einer Nukleotidsequenz, die in der anderen Region angeordnet ist, um eine spezifische Anlagerung zu erzielen. In der vorliegenden Erfindung enthält die schleifenbildende Sequenz zum Beispiel im Wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz wie eine Region F2c (oder R2c), die an der 3'-Seite von einer Region (das heißt F1c oder R1c), lokalisiert ist, die von einer Nukleinsäure einer Matrize abgeleitet ist, und die sich in der gleichen Kette anlagert.
In der vorliegenden Erfindung sind die im Wesentlichen gleichen Nukleotidsequenzen wie folgt definiert. Das heißt, wenn sich eine komplementäre Kette, die mit einer bestimmten Sequenz als Matrize synthetisiert wurde, an eine Zielnukleotidsequenz anlagert, um den Ausgangspunkt für die Synthese einer komplementären Kette bereitzustellen, ist diese bestimmte Sequenz im Wesentlichen die gleiche wie die Zielnukleotidsequenz. Zum Beispiel schließt im Wesentlichen die gleiche Sequenz wie F2 nicht nur absolut die gleiche Nukleotidsequenz wie F2 mit ein, sondern schließt auch eine Nukleotidsequenz mit ein, die dazu in der Lage ist, als eine Matrize zu dienen, welche eine Nukleotidsequenz ausmacht, die dazu in der Lage ist, sich an F2 anzulagern und als ein Ausgangspunkt für die Synthese einer komplementären Kette zu dienen. Der Ausdruck ”Anlagern” in der vorliegenden Erfindung bedeutet die Ausbildung von einer doppelstrangigen Struktur von Nukleinsäuren durch Basenpaarung auf der Grundlage von dem Gesetz nach Watson-Crick. Dementsprechend, selbst wenn eine Nukleinsäurekette, die Basenpaarung ausbildet, eine einzelstrangige Kette ist, erfolgt ein Anlagern, wenn intramolekulare komplementäre Nukleotidsequenzen basengepaart werden. In der vorliegenden Erfindung haben Anlagern und Hybridisieren die gleiche Bedeutung, in dem Sinne, dass die Nukleinsäure eine doppelstrangige Struktur durch Basenpaarung ausbildet.
Die Anzahl der Paare von der komplementären Nukleotidsequenz, welche die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ausmachen, ist wenigstens 1. Gemäß einer gewünschten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung kann die Anzahl 2 oder mehr sein. In diesem Fall besteht theoretisch keine obere Grenze für die Anzahl der Paare von komplementären Nukleotidsequenzen, welche die Nukleinsäure ausmachen. Wenn die Nukleinsäure als das Syntheseprodukt der vorliegenden Erfindung durch mehrere Sätze von komplementären Nukleotidsequenzen festgelegt wird, besteht diese Nukleinsäure aus sich wiederholenden identischen Nukleotidsequenzen.
Die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, die durch die vorliegende Erfindung synthetisiert wird, braucht nicht die gleiche Struktur wie natürlich vorkommende Nukleinsäuren zu haben. Es ist bekannt, dass, wenn ein Nukleotidderivat durch die Aktion von einer DNA-Polymerase als Substrat beim Synthetisieren von Nukleinsäure verwendet wird, ein Nukleinsäurederivat synthetisiert werden kann. Das Nukleotidderivat schließt Nukleotide ein, die mit einem Radioisotop markiert sind, oder Nukleotidderivate, die mit einem Bindungsligand wie Biotin oder Digoxin markiert sind. Diese Nukleotidderivate können verwendet werden, um Nukleinsäurederivate als die Produkte zu markieren. Alternativ kann die Nukleinsäure des Produktes, wenn fluoreszierende Nukleotide als Substrat verwendet werden, ein fluoreszierendes Derivat sein. Dieses Produkt kann ferner entweder DNA oder RNA sein. Welches davon ausgebildet wird, bestimmt sich durch eine Kombination aus der Struktur von einem Primer, der Art von einem Substrat für die Polymerisation und den Reagenzien der Polymerisation zum Durchführen der Polymerisation von Nukleinsäure.
Die Synthese der Nukleinsäure, die die oben beschriebene Struktur aufweist, kann initiiert werden durch die Verwendung von einer DNA-Polymerase, die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, und einer Nukleinsäure, welche an ihrem 3'-Ende mit einer Region F1 versehen ist, die dazu in der Lage ist, sich an einen Teil F1c in der gleichen Kette anzulagern, und welche Nukleinsäure beim Anlagern von der Region F1 an F1c, dazu in der Lage ist, eine Schleife auszubilden, welche Schleife eine Region F2c enthält, die zur Basenpaarung in der Lage ist. Es gibt viele Berichte über die Reaktion zum Synthetisieren einer komplementären Kette, wobei eine Haarnadel-Schleife ausgebildet wird, und eine Probensequenz selbst als Matrize verwendet wird, wohingegen in der vorliegenden Erfindung der Teil von der Haarnadel-Schleife bereitgestellt wird mit einer Region, die zur Basenpaarung in der Lage ist, und das ist ein neues Merkmal des Verwendens von dieser Reaktion beim Synthetisieren einer komplementären Kette. Durch Verwendung von dieser Region als dem Ausgangspunkt der Synthese, wird eine komplementäre Kette, die zuvor mit einer Probensequenz selbst als eine Matrize synthetisiert wurde, verdrängt. Danach ist eine Region R1c (willkürliche Region), die an dem 3'-Ende von der verdrängten Kette lokalisiert ist, in einem Zustand, der zur Basenpaarung in der Lage ist. Eine Region, die eine komplementäre Kette zu dieser R1c aufweist, wird an diese angelagert, was in der Ausbildung von einer Nukleinsäure (2 Moleküle) resultiert, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die sich von F1 bis R1c erstreckt und deren komplementäre Kette abwechselnd über die schleifenbildende Sequenz verknüpft ist. In der vorliegenden Erfindung kann die willkürliche Region, wie beispielsweise R1c, willkürlich ausgewählt werden, unter der Voraussetzung, dass diese an ein Polynukleotid angelagert werden kann, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu dieser Region ist, und dass eine komplementäre Kette, die mit dem Polynukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese synthetisiert wurde, die erforderlichen Funktionen der vorliegenden Erfindung aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird der Begriff ”Nukleinsäure” verwendet. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung schließt im Allgemeinen DNA und RNA ein. Aber auch Nukleinsäure, deren Nukleotide durch ein artifizielles Derivat ersetzt wurde, oder modifizierte Nukleinsäure von natürlicher DNA oder RNA sind ebenfalls in der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eingeschlossen, insoweit sie als eine Matrize zur Synthese von einer komplementären Kette dienen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung ist grundsätzlich in einer biologischen Probe enthalten. Die biologische Probe schließt Tiere, Pflanzen oder mikrobielle Gewebe, Zellen, Kulturen oder Ausschnitte oder Extrakte dieser ein. Die biologische Probe der vorliegenden Erfindung schließt intrazelluläre parasitische genomische DNA oder RNA ein, wie beispielsweise Viren oder Mycoplasmen. Die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung kann von Nukleinsäure, die in besagter mikrobieller Probe enthalten ist, abgeleitet werden. Zum Beispiel sind cDNA, die aus mRNA synthetisiert wurde, oder Nukleinsäure, die auf der Basis von Nukleinsäure amplifiziert wurde, welche Nukleinsäure von der biologischen Probe abgeleitet wurde, typische Beispiele für die Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung.
Die charakteristische Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung, welche an ihrem 3'-Ende mit einer Region F1 versehen ist, die dazu in der Lage ist, sich an einen Teil F1c in der gleichen Kette anzulagern, und die, beim Anlagern von der Region F1 an F1c, dazu in der Lage ist, eine Schleife auszubilden, die eine Region F2c enthält, die zur Basenpaarung in der Lage ist, kann durch verschiedene Verfahren erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung kann die Reaktion des Synthetisierens einer komplementären Kette, unter Verwendung eines Oligonukleotids mit der nachfolgenden Struktur, eingesetzt werden, um die Struktur zu erhalten.
Das heißt, das verwendbare Oligonukleotid in der vorliegenden Erfindung besteht aus wenigstens zwei Regionen X2 und X1c, wie unten beschrieben, wobei X1c mit der 5'-Seite von X2 verbunden ist.
X2: eine Region, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu einer Region X2c in einer Nukleinsäure ist, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt.
X1c: eine Region, die im Wesentlichen die gleiche Nukleotidsequenz wie eine Region X1c aufweist, die an der 5'-Seite von der Region X2c in der Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz angeordnet ist.
Hier bezieht sich die Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, durch welche die Struktur von dem Oligonukleotid gemäß der Erfindung bestimmt wird, auf eine Nukleinsäure, die als eine Matrize dient, wenn das Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung als ein Primer verwendet wird. In dem Fall der Detektion von Nukleinsäure basierend auf dem synthetischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ein Ziel der Detektion oder eine Nukleinsäure, die von dem Detektionsziel abgeleitet ist. Die Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz bezieht sich auf eine Nukleinsäure, von welcher wenigstens ein Teil von der Nukleotidsequenz offenbart oder vorhersagbar ist. Der Teil von der Nukleotidsequenz, der bekannt ist, ist die Region X2c und die Region X1c, die an deren 5'-Seite lokalisiert ist. Es kann angenommen werden, dass diese zwei Regionen benachbart oder beabstandet voneinander angeordnet sind. Durch die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von diesen beiden relativ zueinander wird der Zustand von einer Schleife, die beim Selbst-Anlagern von Nukleinsäure als Produkt ausgebildet wird, bedingt. Der Abstand zwischen den beiden ist vorzugsweise nicht sehr weit auseinander, damit die Nukleinsäure vorzugsweise als das Produkt einer Selbst-Anlagerung gegenüber einem intermolekulares Anlagern ausgebildet wird. Demzufolge ist das die Lage betreffende Anordnungsverhältnis von den beiden vorzugsweise so, dass diese einander benachbart sind in einen Abstand von normalerweise 0 bis 100 Basen. Jedoch kann bei der Ausbildung von einer Schleife durch Selbst-Anlagern, die nachfolgend beschrieben wird, der Fall auftreten, dass es nachteilhaft für die Ausbildung von einer Schleife in einem gewünschten Zustand wäre, dass die beiden zu nahe beieinander liegen. In der Schleife besteht eine Notwendigkeit für eine Struktur für die Anlagerung von einem neuen Oligonukleotid und für die Bereitschaft zum Initiieren der Strangverdrängungsreaktion zum Synthetisieren einer komplementären Kette mit besagtem Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese. Insbesondere ist der Abstand zwischen der Region X2c und der Region X1c, die an der 5'-Seite von X2c lokalisiert ist, ausgestaltet auf 0 bis 100 Basen, besonders wünschenswert auf 10 bis 70 Basen. Diese numerischen Werte zeigen eine Länge exklusive der X1c und der X2. Die Anzahl der Basen, welche den Teil von einer Schleife ausmachen, ist die Anzahl von dieser Länge plus einer Region, die X2 entspricht.
Die beiden Ausdrücke ”die gleiche bzw. dieselbe” und ”komplementär”, die zur Charakterisierung von der Nukleotidsequenz verwendet werden, die das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung ausmacht, bedeuten nicht, dass diese absolut die gleichen oder absolut komplementär sind. Das heißt, die gleiche Sequenz wie eine bestimmte Sequenz schließt Sequenzen mit ein, die komplementär zu Nukleotidsequenzen sind, die dazu in der Lage sind, sich an eine bestimmte Sequenz anzulagern. Auf der anderen Seite bedeutet die komplementäre Sequenz eine Sequenz, die dazu in der Lage ist, sich unter stringenten Bedingungen anzulagern, um ein 3'-Ende bereitzustellen, das als ein Ausgangspunkt für die Synthese von einer komplementären Kette dient.
Herkömmlicherweise sind die Regionen X2 und X1c, welche das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung für die Nukleinsäure mit einer spezifischen Nukleotidsequenz ausmachen, benachbart angeordnet ohne zu überlappen. Wenn ein gemeinsamer Teil in beiden Nukleotidsequenzen auftritt, können die beiden abschnittsweise überlappen. Weil X2 als ein Primer fungieren soll, sollte X2 immer ein 3'-Ende sein. Andererseits sollte X1c die Funktion von einem Primer, wie nachfolgend beschrieben, an dem 3'-Ende von einer komplementären Kette ermöglichen, die mit der Nukleinsäure als Matrize synthetisiert wird, und daher sollte X1c an dem 5'-Ende angeordnet sein. In dem nächsten Schritt dient die komplementäre Kette, die mit diesem Oligonukleotid als Ausgangspunkt der Synthese erhalten worden ist, als eine Matrize zur Synthese von einer komplementären Kette in der umgekehrten Richtung, und schließlich wird der Teil von dem Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung als eine Matrize in eine komplementäre Kette kopiert. Das 3'-Ende, das beim Kopieren erzeugt wird, hat die Nukleotidsequenz X1, welche sich an X1c in der gleichen Kette anlagert, um eine Schleife zu bilden.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das Oligonukleotid ein solches, das zwei Erfordernisse erfüllt, nämlich, es muss dazu in der Lage sein, komplementäre Basenpaarungen auszubilden, und dazu in der Lage sein, eine -OH-Gruppe bereitzustellen, die als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette an dem 3'-Ende dient. Demgemäß ist das Rückgrat des Oligonukleotids nicht notwendigerweise auf eines beschränkt, das über Phosphodiesterbindungen verfügt. Zum Beispiel kann das Rückgrat aufgebaut sein aus einem Phosphothioatderivat mit S anstelle von 0 als ein Rückgrat oder einer Peptid-Nukleinsäure, die auf Peptidbindungen basiert. Die Basen können solche sein, die zur Basenpaarung mit komplementären Basen in der Lage sind. In der Natur gibt es fünf Basen, nämlich A, C, T, G und U, aber die Base kann auch ein Analogon sein, wie beispielsweise Bromdeoxyuridin. Das Oligonukleotid, das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, fungiert vorzugsweise nicht nur als der Ausgangspunkt der Synthese, sondern ebenfalls als Matrize für die Synthese einer komplementären Kette. Der Ausdruck Polynukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung schließt Oligonukleotide mit ein. Der Begriff ”Polynukleotid” wird in dem Fall verwendet, dass die Kettenlänge nicht begrenzt ist, während der Begriff ”Oligonukleotid” so verwendet wird, dass er sich auf ein Nukleotidpolymer bezieht, das eine relativ kurze Kettenlänge aufweist.
Das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung hat solch eine Kettenlänge, dass es dazu in der Lage ist, Basenpaare mit einer komplementären Kette auszubilden, und die erforderliche Spezifität unter dem gegebenen Umfeld in den verschiedenen Reaktionen des Synthetisierens von Nukleinsäure, die nachfolgend beschrieben sind, beizubehalten. Insbesondere besteht das Oligonukleotid aus 5 bis 200 Basenpaaren, vorzugsweise aus 10 bis 50 Basenpaaren. Die Kettenlänge von einem Primer, der die bekannte Polymerase erkennt, welche die Sequenz-abhängige Synthesereaktion der Nukleinsäure katalysiert, beträgt wenigstens etwa 5 Basen, so dass die Kettenlänge des sich anlagernden Teils länger als dies sein sollte. Zusätzlich ist eine Länge von 10 oder mehr Basen statistisch gesehen erwünscht, um eine Spezifität der Nukleotidsequenz zu erwarten. Andererseits ist die Herstellung von einer zu langen Nukleotidsequenz mittels chemischer Synthese schwierig und daher ist die oben beschriebene Kettenlänge als eine gewünschte Bereichsangabe beispielhaft erläutert. Diese beispielhaft erläuterte Kettenlänge bezieht sich auf die Kettenlänge von einem Teil, der sich an eine komplementäre Kette anlagert. Wie nachfolgend beschrieben ist, kann sich das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung schließlich an wenigstens zwei Regionen individuell anlagern. Demgemäß ist es so zu verstehen, dass die hier beispielhaft erläuterte Kettenlänge die Kettenlänge von jeder Region ist, welche das Oligonukleotid ausmacht.
Ferner kann das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer bekannten Markierungssubstanz markiert sein. Die Markierungssubstanz schließt Bindungsliganden, wie beispielsweise Digoxin und Biotin, Enzyme, fluoreszierende Substanzen und lumineszierende Substanzen und Radioisotope ein. Die Techniken des Ersetzens einer Base, welche ein Oligonukleotid ausmacht, durch ein fluoreszierendes Analogon ist ebenfalls bekannt ( WO95/05391 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644–6648, 1994).
Andere Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können auch an eine feste Phase gebunden sein. Alternativ kann ein willkürlicher Teil von dem Oligonukleotid mit einem Bindungsliganden wie beispielsweise Biotin markiert sein und das Oligonukleotid kann indirekt über einen Bindungspartner, wie beispielsweise immobilisiertes Avidin, immobilisiert sein. Wenn das immobilisierte Oligonukleotid als der Ausgangspunkt der Synthese verwendet wird, wird die Nukleinsäure des synthetisierten Reaktionsproduktes an der festen Phase gefangen, was dessen Trennung erleichtert. Das abgetrennte Produkt kann durch einen Nukleinsäure-spezifischen Indikator oder durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde detektiert werden. Fragmente der Zielnukleinsäure können auch durch Verdau des Produktes mit willkürlich ausgewählten Restriktionsenzymen wiedergewonnen werden.
Der Begriff ”Matrize”, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bedeutet eine Nukleinsäure, die als eine Matrize zum Synthetisieren einer komplementären Kette dient. Eine komplementäre Kette, welche eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu der Matrize ist, hat die Bedeutung als eine Kette, die der Matrize entspricht, aber diese Beziehung zwischen den beiden ist rein relativ. Das heißt, eine Kette, die als die komplementäre Kette synthetisiert wurde, kann wiederum als eine Matrize verwendet werden. Das heißt, die komplementäre Kette kann selbst eine Matrize werden.
Das Oligonukleotid, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ist nicht limitiert auf die zwei Regionen, die oben beschrieben sind, und kann eine zusätzliche Region enthalten. Während X2 und X1c an dem 3'- bzw. 5'-Ende angeordnet sind, kann eine willkürliche Sequenz dazwischen liegen. Zum Beispiel kann diese eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, ein Promoter, der von RNA-Polymerase erkannt wird, oder DNA, die für Ribozyme kodiert, sein. Wenn eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym verwendet wird, kann die Nukleinsäure des Syntheseproduktes der vorliegenden Erfindung, die eine komplementäre Sequenz aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft ist, in doppelstrangige Nukleinsäuren von der gleichen Länge gespalten werden. Durch Anordnen einer Promotersequenz, die von RNA-Polymerase erkannt wird, dient das Syntheseprodukt von der vorliegenden Erfindung als eine Matrize, um ferner Transkription in RNA zu ermöglichen. Wenn ferner DNA, die für ein Ribozym kodiert, angeordnet wird, realisiert man ein System, in welchem das transkriptionale Produkt sich selbstspaltend ist. Diese zusätzlichen Nukleotidsequenzen sind solche, die in Funktion treten, nachdem diese in einer doppelstrangigen Kette ausgebildet wurden. Demgemäß haben diese Sequenzen keine Funktion, während die einzelstrangige Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung eine Schleife ausgebildet hat. Sie erfüllen keine Funktion, bis die Nukleinsäure verlängert wurde und sich, in Abwesenheit von einer Schleife, an eine Kette mit einer komplementären Nukleotidsequenz anlagert.
Wenn ein Promoter mit dem Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung in solch einer Richtung kombiniert wird, dass dies die Transkription von der synthetisierten Region ermöglicht, realisiert das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung, in welchem sich die gleiche Nukleotidsequenz wiederholt, ein effizientes Transkriptionssystem. Wenn man dieses System mit einem geeigneten Expressionssystem kombiniert, ist ebenfalls eine Translation in ein Protein praktikabel. Das heißt, das System kann zur Transkription und Translation in ein Protein in Bakterien oder tierischen Zellen oder in vitro eingesetzt werden.
Das Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung, das die oben beschriebene Struktur aufweist, kann chemisch synthetisiert sein. Alternativ kann eine natürliche Nukleinsäure gespalten werden, beispielsweise mit Restriktionsenzymen, und so modifiziert werden, dass diese aus der oben beschriebenen Nukleotidsequenz besteht oder in diese ein- bzw. angebunden ist.
Das grundsätzliche Prinzip von der Reaktion zum Durchführen der Synthese durch Verwenden der verwendbaren Oligonukleotide, die oben beschrieben sind, zusammen mit DNA-Polymerase, die eine Strangverdrängungsaktivität aufweist, in der Reaktion zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist beschrieben mit Bezug auf die 5 bis 6. Das oben beschriebene Oligonukleotid (erstes Oligonukleotid FA in 5) lagert sich an X2 (entsprechend F2) an die Nukleinsäure der Matrize an, um den Ausgangspunkt der Synthese der komplementären Kette bereitzustellen. In 5 wird eine komplementäre Kette, die von FA als dem Ausgangspunkt der Synthese synthetisiert wurde, verdrängt durch die Synthese der komplementären Kette (nachfolgend beschrieben) ausgehend von einem äußeren Primer (erster äußerer Primer F3), um eine einzelstrangige Kette (5-A) auszubilden. Wenn die Synthese der komplementären Kette bis zu der resultierenden komplementären Kette weiter fortgeführt wird, weist das 3'-Ende der Nukleinsäure, die als komplementäre Kette in 5-A synthetisiert wurde, eine Nukleotidsequenz auf, die komplementär zu dem ersten Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung ist. Das heißt, weil das 5'-Ende von dem ersten Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung die gleiche Sequenz wie eine Region X1c (entsprechend F1c) aufweist, weist das 3'-Ende von der Nukleinsäure, die mit dem ersten Oligonukleotid synthetisiert wird, eine komplementäre Sequenz X1 (F1) auf. 5 zeigt, dass die komplementäre Kette, die vom zweiten Oligonukleotid R1 als dem Ausgangspunkt der Synthese synthetisiert wurde, verdrängt wird durch die Synthese der komplementären Kette mittels eines zweiten äußeren Primers R3 als dem Ausgangspunkt der Synthese. Wenn der 3'-terminale Bereich durch diese Verdrängung für eine Basenpaarung zugänglich gemacht ist, lagert sich X1 (F1) an dem 3'-Ende an X1c (F1c) in der gleichen Kette an, und die Verlängerungsreaktion (Elongation) mit sich selbst als Matrize läuft ab (5-B). Dann ist X2c (F2c), das an dem 3'-Ende davon angeordnet ist, als eine Schleife übrig, die nicht an Basenpaarung beteiligt ist. X2 (F2) in dem ersten Oligonukleotid gemäß der vorliegenden Erfindung lagert sich an diese Schleife an und eine komplementäre Kette wird synthetisiert mit besagtem ersten Oligonukleotid als dem Ausgangspunkt der Synthese (5-B). Ein Produkt der Synthesereaktion der komplementären Ketten mit dem zuvor synthetisierten Produkt als Matrize wird verdrängt durch die Strangverdrängungsreaktion, so dass dieses Produkt für eine Basenpaarung zugänglich gemacht ist.
Durch diese grundlegende Ausgestaltung, welche eine Art von Oligonukleotid und einen willkürlichen Rückwärtsprimer verwendet, welcher Rückwärtsprimer dazu in der Lage ist, eine Nukleinsäuresynthese auszuführen, bei der eine komplementäre Kette, die mit besagtem Oligonukleotid als ein Primer synthetisiert werden, als eine Matrize verwendet wird, können eine Vielzahl von Nukleinsäuresyntheseprodukte, wie sie in 6 gezeigt sind, erhalten werden. Wie in 6 zu sehen ist, ist (D) das erwünschte Nukleinsäureprodukt der Erfindung, das komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind. Wenn dieses Produkt erst in eine einzelstrangige Kette durch eine Behandlung, wie beispielsweise Hitzedenaturierung umgewandelt wurde, dienen die anderen Produkte (E) erneut als eine Matrize zur Ausbildung von (D). Wenn das Produkt (D) als Nukleinsäure in der Form von einer doppelstrangigen Kette in eine einzelstrangige Kette durch Hitzedenaturierung umgewandelt wird, erfolgt ein Anlagern innerhalb der gleichen Kette mit einer hohen Wahrscheinlichkeit ohne Ausbilden der ursprünglichen doppelstrangigen Kette. Dies ist der Fall, weil eine komplementäre Kette, welche die gleiche Schmelztemperatur (Tm) aufweist, bevorzugt eine intramolekulare Reaktion anstatt einer intermolekularen Reaktion durchführt. Jede einzelstrangige Kette, die von dem Produkt (D) abgeleitet wird, das sich in der gleichen Kette anlagert, lagert sich in der gleichen Kette an und kehrt in den Zustand von (B) zurück, und jede Kette stellt ferner ein Molekül aus (D) bzw. (E) entsprechend bereit. Durch Wiederholen dieser Schritte ist es möglich, sukzessive die Nukleinsäure zu synthetisieren, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind. Die Matrize und das Produkt, die in einem Zyklus ausgebildet werden, steigen exponentiell an, wodurch diese Reaktion sehr effizient ist.
Um den Zustand der 5(A) zu realisieren, sollte die ursprünglich synthetisierte Kette, zumindest in dem Teil, an welchen sich der Rückwärtsprimer anlagert, für eine Basenpaarung zugänglich sein. Dieser Schritt kann durch ein beliebiges Verfahren erreicht werden. Das heißt, ein erster äußerer Primer (F3), der sich an die erste Matrize in einer Region F3c anlagert, die an der 3'-Seite von der Region F2c liegt, an welche sich das erste Oligonukleotid der vorliegenden Erfindung anlagert, wird separat hergestellt. Wenn dieser erste äußere Primer verwendet wird als der Ausgangspunkt für die Synthese zum Synthetisieren einer komplementären Kette durch eine Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung zur Synthese einer komplementären Kette katalysiert, wird die komplementäre Kette verdrängt, die ausgehend von F2c als dem Ausgangspunkt der Synthese gemäß der Erfindung synthetisiert wurde, und als ein Ergebnis ist die Region R1c, an welche sich R1 Anlagern soll, zugänglich gemacht für Basenpaarung (5). Durch Verwendung von der Strangverdrängungsreaktion kann die Reaktion bis hierher unter isothermen Bedingungen ablaufen.
Wenn ein äußerer Primer verwendet wird, sollte die Synthese von dem äußeren Primer (F3) nach der Synthese ausgehend von F2c gestartet werden. In dem einfachsten Verfahren ist die Konzentration von dem inneren Primer höher als die Konzentration von dem äußeren Primer. Insbesondere werden die Primer gewöhnlich in 2- bis 50-fach, vorzugsweise 4- bis 10-fach unterschiedlichen Konzentration verwendet, wodurch die Reaktion wie erwünscht ablaufen kann. Ferner ist die Schmelztemperatur (Tm) von dem äußeren Primer niedriger ausgelegt als die Tm von dem X1 (entsprechend F1 und R1) des inneren Primers, wodurch die Zeitsteuerung der Synthese kontrolliert werden kann. Das heißt, (äußerer Primer F3:F3c) ≤ (F2c/F2) ≤ (F1c/F1) oder (äußerer Primer/Region an der 3'-Seite in der Matrize) ≤ (X2c:X2) ≤ (X1c:X1). Hierbei ist die Ursache dafür, dass (F2c/F2) ≤ (F1c/F1) ist, dass das Anlagern zwischen F1c/F1 vor dem Anlagern von F2 an die Schleife erfolgt. Die Anlagerung zwischen F1c/F1 ist eine intramolekulare Reaktion und kann daher bevorzugt bei einer hohen Wahrscheinlichkeit ablaufen. Es ist jedoch bedeutsam Tm zu berücksichtigen, um mehr erwünschte Reaktionsbedingungen zu erzielen. Selbstverständlich sollten vergleichbare Bedingungen auch bei dem Design von einem Rückwärtsprimer berücksichtigt werden. Unter Verwenden solch eines Verhältnisses können statistisch ideale Reaktionsbedingungen erhalten werden. Wenn die anderen Bedingungen festgelegt sind, kann die Schmelztemperatur (Tm) theoretisch berechnet werden durch eine Kombination von der Länge einer sich anlagernden komplementären Kette und den Basen, welche Basenpaarungen ausbilden. Demgemäß können die Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung bevorzugte Bedingungen auf der Basis von der Offenbarung dieser Beschreibung herleiten.
Ferner kann auch das ”Contiguous Stacking” genannte Phänomen angewendet werden, um den Zeitpunkt des Anlagerns von dem äußeren Primer zu regeln. Contiguous Stacking ist ein Phänomen, bei welchem ein Nukleotid, das nicht dazu in der Lage ist, sich unabhängig anzulagern, in die Lage versetzt wird, sich anzulagern, wenn dieses benachbart zu dem Teil von einer doppelstrangigen Kette ist (Chiara Borghesi-Nicoletti et al., Bio Techniques, 12, 474–477 (1992)). Das heißt, der äußere Primer ist so auszugestalten, dass er benachbart zu F2c (X2c) ist, und nicht dazu fähig ist, sich unabhängig anzulagern. Wenn man dieses tut, findet ein Anlagern von dem äußeren Primer solange nicht statt, bis F2c (X2c) sich anlagert und somit findet das Anlagern von F2c (X2c) zuerst statt. Auf der Grundlage von diesem Prinzip zeigen die Beispiele das Einrichten von der Nukleotidsequenz von einem Oligonukleotid, das als ein Primer für eine Reihe von Reaktionen erforderlich ist. Dieser Schritt kann ebenfalls durch Denaturierung bei Hitze oder mit einer DNA-Helikase erreicht werden.
Wenn die Matrizen-Nukleinsäure, die F2c (X2c) aufweist, RNA ist, kann der Zustand der 5-(A) auch mittels eines anderen Verfahrens realisiert werden. Wenn zum Beispiel diese RNA-Kette gespalten wird, wird R1 zugänglich gemacht für Basenpaarung. Das heißt, F2 ist an F2c in der RNA angelagert und eine komplementäre Kette wird als DNA synthetisiert durch eine Reverse-Transkriptase. Die RNA, die als Matrize dient, wird durch alkalische Denaturierung oder durch eine enzymatische Behandlung mit einer Ribonuklease, die auf die RNA in einer doppelstrangigen Kette von DNA/RNA einwirkt, abgebaut, wobei die DNA, die ausgehend von F2 synthetisiert wurde, als eine einzelstrangige Kette ausgebildet wird. Als das Enzym, welches RNA in einer doppelstrangigen Kette von DNA/RNA selektiv zersetzt, kann die Ribonukleaseaktivität von RNase H oder einiger Reverse-Transkriptasen verwendet werden. Auf diese Weise kann der Rückwärtsprimer an R1c, welches für eine Basenpaarung zugänglich gemacht wurde, angelagert werden. Demgemäß wird der äußere Primer, welcher R1c für eine Basenpaarung zugänglich macht, überflüssig.
Alternativ kann die Strangverdrängungsaktivität von der Reverse-Transkriptase verwendet werden, um die Strangverdrängung durch einen äußeren Primer, wie oben beschrieben, auszunutzen. In diesem Fall kann ein Reaktionssystem nur durch eine Reverse-Transkriptase ausgemacht werden. Das heißt, bei Verwenden von RNA als Matrize ist es möglich, durch eine Reverse-Transkriptase, eine komplementäre Kette ausgehend von F2, das an F2c in der Matrize angelagert ist, zu synthetisieren und eine komplementäre Kette von dem äußeren Primer F3 als dem Ausgangspunkt der Synthese, der an F3c angelagert ist, das sich an der 3'-Seite von F2c befindet, zu synthetisieren, und gleichzeitig die zuvor synthetisierte komplementäre Kette zu verdrängen. Wenn die Reverse-Transkriptase die Reaktion des Synthetisierens einer komplementären Kette mit DNA als Matrize durchführt, laufen alle die Reaktionen des Synthetisierens komplementärer Ketten durch die Reverse-Transkriptase ab, einschließlich der Synthese von einer komplementären Kette mit R1 als dem Ausgangspunkt der Synthese, das an R1c in der verdrängten komplementären Kette als die Matrize angelagert ist, der Synthese von einer komplementären Kette mit R3 als dem Ausgangspunkt der Synthese, das an R3c angelagert ist, welches an der 3'-Seite von R1c lokalisiert ist, und der gleichzeitigen Verdrängungsreaktion. Wenn es nicht möglich ist zu erwarten, dass die Reverse-Transkriptase eine DNA/RNA Strangverdrängungsaktivität unter gegebenen Reaktionsbedingungen aufweist, kann eine DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, wie oben beschrieben, damit kombiniert werden. Die Ausführungsform des Erhaltens einer ersten einzelstrangigen Nukleinsäure mit RNA als Matrize, wie oben beschrieben, stellt eine bevorzugte Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung dar. Andererseits, wenn eine DNA-Polymerase, wie beispielsweise Bca DNA-Polymerase, die beides, Strangverdrängungsaktivität und Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist, verwendet wird, läuft nicht nur die Synthese von einer ersten einzelstrangigen Nukleinsäure aus RNA, sondern auch die anschließende Reaktion mit DNA als eine Matrize durch das gleiche Enzym ab.
Das oben beschriebene Reaktionssystem führt verschiedene Variationen von dem Rückwärtsprimer, der eine spezielle Struktur aufweist, herbei, die der vorliegenden Erfindung zu eigen sind. Die effektivste Variation wird nachfolgend beschrieben. Das heißt, das Oligonukleotid, welches wie in [5] beschrieben erstellt wurde, wird als der Rückwärtsprimer in der am vorteilhaftesten Ausführung von der vorliegenden Erfindung verwendet. Das Oligonukleotid gemäß [5] ist ein Oligonukleotid, worin willkürliche Regionen R2c und R1c in einer komplementären Kette, die mit F2 als ein Primer synthetisiert wurden, X2c bzw. X1c sind. Bei Verwenden von solch einem Rückwärtsprimer läuft eine Reihe von Reaktionen zum Ausbilden einer Schleife und zum Synthetisieren und Verdrängen einer komplementären Kette von dieser Schleife in beiden Ketten, der Vorwärts-(sense) und der Rückwärts-(antisense)Kette (Vorwärtsseite und Rückwärtsseite) ab. Als ein Ergebnis ist die Reaktionseffizienz zur Synthese von der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelnen einzelstrangigen Kette verknüpft sind, wesentlich verbessert, während eine Reihe von diesen Reaktionen unter isothermen Bedingungen durchführbar ist. Hieran anschließend wird diese Ausführungsform beschrieben in einer detaillierteren Weise unter Bezugnahme auf die 1 bis 3, wo diese Ausführung zusammengefasst ist.
In der folgenden Ausführung werden zwei Arten von Oligonukleotiden auf Grundlage der vorliegenden Erfindung präpariert. Zur Erklärung werden diese FA und RA genannt. Die Regionen, welche FA und RA ausmachen, sind wie folgt:

X2 X1c

FA F2 F1c

RA R2 R1c
Hierbei ist F2 eine komplementäre Nukleotidsequenz zu einer Region F2c in der Nukleinsäure der Matrize. R2 ist eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer willkürlichen Region R2c ist, die in einer komplementären Kette enthalten ist, die mit F2 als Primer synthetisiert wird. F1c und R1c sind willkürliche Nukleotidsequenzen, die abwärts von F2c bzw. R2c lokalisiert sind. Der Abstand zwischen F2 und R2 kann willkürlich sein. Selbst wenn dessen Länge in etwa 1 kbp ist, ist eine ausführbare Synthese unter geeigneten Bedingungen möglich, wobei dies abhängig ist von der Synthese-Aktivität der DNA-Polymerase zur Durchführung der Synthese von einer komplementären Kette. Insbesondere wenn Bst DNA-Polymerase verwendet wird, wird das erwünschte Produkt sicherlich synthetisiert, wenn der Abstand zwischen F2 und R2c 800 bp beträgt, vorzugsweise 500 bp oder weniger. In einer PCR, welche einen Temperaturzyklus einschließt, wird die Reduktion der enzymatischen Aktivität, die durch den Stress der Temperaturänderungen bedingt ist, erachtet, die Effizienz von der Synthese von einer langen Nukleotidsequenz zu reduzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung ist ein Temperaturzyklus in dem Schritt des Amplifizierens von Nukleinsäure nicht erforderlich, und somit kann die Synthese und die Amplifikation von selbst langen Nukleotidsequenzen sicherlich erreicht werden.
Zuerst wird F2 in FA an die Nukleinsäure der Matrize angelagert und als der Ausgangspunkt der Synthese von einer komplementären Kette verwendet. Die anschließenden Reaktionsschritte bis 1(4) sind die gleichen wie in der zuvor beschriebenen Basis-Ausführung (5) der vorliegenden Erfindung. Die Sequenz, die als F3 in 1(2) angelagert ist, ist der erste äußere Primer, der oben beschrieben ist. Eine DNA-Polymerase zum Durchführen der Synthese, von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese von einer komplementären Kette mit diesem Primer als dem Ausgangspunkt der Synthese wird verwendet, so dass die komplementäre Kette, die ausgehend von FA synthetisiert wurde, verdrängt und für eine Basenpaarung zugänglich gemacht wird.
Wenn R2c in (4) für eine Basenpaarung zugänglich gemacht ist, lagert sich das zweite Oligonukleotid RA als Rückwärtsprimer daran in der Kombination von R2c/R2 an. Die Synthese von einer komplementären Kette mit dieser Stelle als dem Ausgang von der Synthese läuft ab, bis die Kette F1c an dem 5'-Ende von FA erreicht. Anschließend an diese Reaktion des Synthetisierens einer komplementären Kette lagert sich der zweite äußere Primer R3 für die Verdrängung daran an, um eine komplementäre Kette zu synthetisieren, während welcher ebenfalls Strangverdrängung auftritt, so dass die komplementäre Kette, die ausgehend von RA als dem Ausgangspunkt der Synthese synthetisiert wurde, verdrängt wird. In der komplementären Kette, die so verdrängt wurde, ist RA an deren 5'-Seite lokalisiert und eine Sequenz, die komplementär zu FA ist, ist an ihrem 3'-Ende lokalisiert.
An der 3'-Seite von der einzelstrangigen Nukleinsäure, die so verdrängt wurde, ist eine Sequenz F1, die komplementär ist zu F1c in der gleichen Kette. F1 lagert sich schnell an F1c in dem gleichen Molekül an, um die Synthese von einer komplementären Kette zu initiieren. Wenn das 3'-Ende (F1) sich an F1c in der gleichen Kette anlagert, wird eine Schleife enthaltend F2c ausgebildet. Wie aus 2-(7) ebenfalls ersichtlich ist, bleibt ein Teil von dieser Schleife zugänglich für Basenpaarung. Das erste Oligonukleotid FA gemäß der Erfindung, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu F2c ist, lagert sich an diesen Teil von der Schleife an und dient als der Ausgangspunkt der Synthese von einer komplementären Kette (7). Die Synthese von einer komplementären Kette läuft ausgehend von der Schleife ab, während das Reaktionsprodukt der zuvor von F1 ausgehend abgelaufenen Synthese der komplementären Ketten verdrängt wird. Als ein Ergebnis wird die komplementäre Kette, die mit sich selbst als Matrize synthetisiert wurde, für eine Basenpaarung an dem 3'-Ende erneut zugänglich gemacht. Dieses 3'-Ende ist versehen mit einer Region R1, die dazu in der Lage ist, sich an R1c in der gleichen Kette anzulagern, und die Zwei lagern sich bevorzugt aufgrund der schnell ablaufenden intramolekularen Reaktion aneinander an. Die gleiche Reaktion, wie die oben beschriebene Reaktion, die von dem 3'-Ende ausgeht, das mit FA als Matrize synthetisiert wurde, läuft in dieser Region ebenfalls ab. Als ein Ergebnis wird die Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in der gleichen einzelstrangigen Kette angeordnet sind, von R1 als dem Startpunkt an dem 3'-Ende durch sukzessive Synthese von einer komplementären Kette und anschließender Verdrängung dieser fortlaufend verlängert. Da R2c immer in der Schleife enthalten ist, die durch intramolekulares Anlagern von dem 3'-terminalen R1 ausgebildet wird, lagert sich das zweite Oligonukleotid (RA), das mit R2 versehen ist, an diese Schleife an dem 3'-Ende in der anschließenden Reaktion an.
Wenn man die Nukleinsäure beachtet, die als komplementäre Kette synthetisiert wird von dem Oligonukleotid, das sich an die Schleife in der einzelstrangigen Nukleinsäure anlagert, die mit sich selbst als Matrize verlängert wurde, läuft auch hier die Synthese von der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in der gleichen einzelstrangigen Kette verknüpft sind, ab. Das heißt, die Synthese von einer komplementären Kette ausgehend von der Schleife wird vollendet, wenn die Synthese RA in, zum Beispiel 2-(7), erreicht. Dann, wenn die Nukleinsäure, die durch diese Nukleinsäuresynthese verdrängt wurde, die Synthese einer komplementären Kette initiiert (3-(8)), erreicht die Reaktion die Schleife, welche einmal der Ausgangspunkt der Synthese gewesen war, und Verdrängung wird erneut ausgelöst. Auf diese Weise wird auch die Nukleinsäure verdrängt, die ausgehend von der Schleife initiiert wurde synthetisiert zu werden, und als ein Resultat erhält man das 3'-terminale R1, das dazu in der Lage ist, sich in der gleichen Kette anzulagern (3-(10)). Dieses 3'-terminale R1 lagert sich an R1c in der gleichen Kette an, um die Synthese von einer komplementären Kette zu starten. Diese Reaktion ist die gleiche wie in 2-(7), mit der Ausnahme, dass F anstelle von R verwendet wird. Demgemäß kann die Struktur, die in 3-(10) gezeigt ist, als eine neue Nukleinsäure fungieren, welche die Selbst-Verlängerung und Ausbildung neuer Nukleinsäure fortsetzt.
Die Reaktion des Synthetisierens von Nukleinsäure, ausgehend von der in 3-(10) gezeigten Nukleinsäure, bewirkt die Verlängerung von dem 3'-terminalen F1 als dem Ausgangspunkt der Synthese, im Unterschied zu der oben beschriebenen Reaktion. Das heißt, in der vorliegenden Erfindung, wenn eine Nukleinsäure verlängert wird, läuft die Reaktion des Fortsetzens zum Bereitstellen einer neuen Nukleinsäure, welche eine Verlängerung initiiert, getrennt weiter. Während die Kette verlängert wird, werden ferner eine Vielzahl von schleifen-bildenden Sequenzen bereitgestellt, nicht nur an den Enden, sondern auch in der gleichen Kette. Wenn diese schleifen-bildenden Sequenzen für eine Basenpaarung zugänglich gemacht sind durch die Strangverdrängungssynthesereaktion, lagert sich ein Oligonukleotid daran an, um als Basis für die Reaktion des Ausbildens einer neuen Nukleinsäure zu dienen. Ferner wird eine effiziente Amplifikation durch die Synthesereaktion erzielt, die nicht nur an den Enden, sondern auch in der Kette startet. Das zweite Oligonukleotid RA gemäß der vorliegenden Erfindung ist kombiniert als der Rückwärtsprimer, wie oben beschrieben, wobei Verlängerung und anschließende Ausbildung von einer neuen Nukleinsäure stattfinden. In der vorliegenden Erfindung wird ferner diese neu ausgebildete Nukleinsäure selbst verlängert und ermöglicht die anschließende Ausbildungen von einer neuen Nukleinsäure. Die Reihe von diesen Reaktionen setzt sich theoretisch permanent fort, um eine sehr effiziente Amplifikation von Nukleinsäure zu erreichen. Zusätzlich kann die Reaktion gemäß der vorliegenden Erfindung unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden.
Die so angesammelten Reaktionsprodukte weisen eine Struktur auf, die eine Nukleotidsequenz zwischen F1 und R1 aufweist, und deren komplementäre Sequenzen abwechselnd darin verknüpft sind. Jedoch weisen beide Enden von der Wiederholungseinheit eine Region auf, die aus den sich anschließenden Nukleotidsequenzen F2-F1 (F2c-F1c) und R2-R1 (R2c-R1c) besteht. In 3-(9) sind zum Beispiel die Sequenzen (R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c) in dieser Reihenfolge ausgehend von der 5'-Seite miteinander verknüpft. Dies kommt daher, weil die Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung auf dem Prinzip basiert, dass die Reaktion eingeleitet wird von F2 (oder R2) mit einem Oligonukleotid als dem Ausgangspunkt der Synthese und dann eine komplementäre Kette durch die Synthesereaktion von F1 (oder R1) mit dem 3'-Ende als Ausgangspunkt der Synthese verlängert wird.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wurden hierbei die Oligonukleotide FA und RA gemäß der vorliegenden Erfindung als Oligonukleotide, die sich an den Teil von einer Schleife anlagern, verwendet. Jedoch, selbst wenn diese Oligonukleotide, die eine limitierte Struktur aufweisen, nicht verwendet werden, kann die Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden durch Verwenden von einem Oligonukleotid, das dazu in der Lage ist, die Synthese von einer komplementären Kette ausgehend von der Schleife zu starten. Das heißt, das sich verlängernde 3'-Ende, wenn es erst einmal durch eine komplementäre Kette, die ausgehend von der Schleife synthetisiert wurde, verdrängt wurde, wird erneut zu einem Teil von einer Schleife. Weil die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, immer als eine Matrize in der Synthese der komplementären Kette, die von der Schleife startet, verwendet wird, ist es offensichtlich, dass die gewünschte Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert werden kann. Jedoch führt die Nukleinsäure, die so synthetisiert wurde, die Synthese von einer komplementären Kette unter Ausbilden einer Schleife nach der Verdrängung durch, aber da ist kein 3'-Ende für die anschließende Ausbildung von einer Schleife vorhanden, und somit kann dieses nicht als neue Matrize dienen. Demgemäß kann von dem Produkt in diesem Fall, anders als die Nukleinsäure, die durch FA oder RA initiiert wurde, synthetisiert zu werden, nicht erwartet werden, dass diese exponentiell vervielfältigt wird. Aus diesem Grund ist ein Oligonukleotid mit der Struktur von FA oder RA nützlich zur höchst effizienten Synthese von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung.
Eine Reihe von diesen Reaktionen läuft durch Zugeben der folgenden Komponenten zu einer einzelstrangigen Nukleinsäure als Matrize und dem anschließenden Inkubieren der Mischung bei solch einer Temperatur, dass die Nukleotidsequenz, welche FA und RA ausmacht, eine stabile Basenpaarung mit deren komplementärer Nukleotidsequenz ausbildet, während die Enzymaktivität erhalten bleiben kann, ab.

• 4 Arten von Oligonukleotiden: FA (erstes Oligonukleotid), RA (zweites Oligonukleotid), erster äußerer Primer F3, und zweiter äußerer Primer R3,
• DNA-Polymerase zum Durchführen der Synthese, von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese von einer komplementären Kette,
• ein Oligonukleotid, das als Substrat für die DNA-Polymerase dient.

Demgemäß ist ein Temperatur-Zyklus, wie beispielsweise in der PCR, nicht erforderlich. Die stabile Basenpaarung, auf die sich hierin bezogen wird, bedeutet einen Zustand, in welchem wenigstens ein Teil von einem Oligonukleotid, das in dem Reaktionssystem vorhanden ist, den Ausgangspunkt der Synthese von der komplementären Kette leisten kann. Zum Beispiel ist die gewünschte Bedingung zum Ausbilden stabiler Basenpaarung festgesetzt auf unterhalb der Schmelztemperatur (Tm). Im Allgemeinen wird die Schmelztemperatur (Tm) angesehen als die Temperatur, bei welcher 50% der Nukleinsäuren, die gegenseitig komplementäre Nukleotidsequenzen aufweisen, basengepaart sind. In der vorliegenden Erfindung ist die Einstellung auf die Schmelztemperatur (Tm) oder weniger keine essentielle Bedingung, aber dies ist eine von den Reaktionsbedingungen, die zum Erhalten einer hohen Effizienz der Synthese zu berücksichtigen sind. Wenn die Nukleinsäure, die als Matrize verwendet werden soll, eine doppelstrangige Kette ist, sollte die Nukleinsäure, zumindest in einer Region, an welche sich die Oligonukleotide anlagern, für eine Basenpaarung zugänglich gemacht sein. Dazu wird prinzipiell Hitzedenaturierung durchgeführt und dies kann nur einmal als Vorbehandlung durchgeführt werden, bevor die Reaktion initiiert wird.
Diese Reaktion wird durchgeführt in der Gegenwart von einem Puffer, der einen geeigneten pH für die Enzymreaktion einstellt, Salzen, die zum Anlagern oder zum Instandhalten der katalytischen Aktivität von den Enzymen notwendig sind, einem Schutzstoff für die Enzyme, und, wenn notwendig, einem Regulator für die Schmelztemperatur (Tm). Als Puffer wird zum Beispiel Tris-HCl verwendet, das eine Pufferwirkung im neutralen bis leicht alkalinen Bereich aufweist. Der pH wird in Abhängigkeit von der verwendeten DNA-Polymerase eingestellt. Als Salze sind KCl, NaCl, (NH₄)₂SO₄ usw. in geeigneter Form hinzugefügt, um die Aktivität der Enzyme beizubehalten, und um die Schmelztemperatur (Tm) der Nukleinsäure zu regulieren. Als Schutzstoff für die Enzyme kommen Rinderserumalbumin oder Zuckern zum Einsatz. Ferner wird Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Formamid prinzipiell als Regulator der Schmelztemperatur (Tm) verwendet. Durch Verwenden von dem Regulator der Schmelztemperatur (Tm) kann ein sich Anlagern von den Oligonukleotiden unter begrenzten Temperaturbedingungen geregelt werden. Ferner ist Betain (N,N,N-trimethylglycin) oder ein tetraalkylisches Ammoniumsalz durch deren Isostabilisation ebenfalls effektiv zum Verbessern der Effizienz der Strangverdrängung. Durch Hinzufügen von Betain in einer Menge von 0,2 bis 3,0 M, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 M zu der Reaktionslösung kann dessen fördernde Wirkung auf die Nukleinsäure-Amplifikation gemäß der vorliegenden Erfindung erwartet werden. Weil diese Schmelztemperatur-Regulatoren so wirken, dass die Schmelztemperatur heruntergesetzt wird, werden solche Bedingungen, die eine geeignete Stringenz und Reaktivität erzielen, empirisch ermittelt unter Berücksichtigung von den Konzentrationen der Salze, der Reaktionstemperatur etc.
Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass eine Reihe von Reaktionen nicht ablaufen, bis nicht die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von einer Vielzahl von Regionen erreicht ist. Durch dieses Merkmal werden unspezifische Synthesereaktionen, die von der unspezifischen Synthese von komplementären Ketten begleitet werden, effektiv verhindert. Das heißt, selbst wenn eine bestimmte unspezifische Reaktion abläuft, ist die Wahrscheinlichkeit minimiert, dass dieses Produktes als ein Startmaterial im folgenden Amplifikationsschritt dient. Die Steuerung des Fortschreitens der Reaktionen durch viele Regionen bewirkt ferner die Wahrscheinlichkeit, dass ein Detektionssystem, das zur strengen Identifikation von dem gewünschten Produkt in analogen Nukleotidsequenzen in der Lage ist, willkürlich verfasst werden kann.
Dieses Merkmal kann zur Detektion von Mutationen in einem Gen verwendet werden. In der Ausführung der vorliegenden Erfindung, in welcher der äußere Primer verwendet wird, werden 4 Primer, das heißt, 2 äußere Primer und zwei Primer bestehend aus den Oligonukleotiden der vorliegenden Erfindung, verwendet. Das bedeutet, bis nicht die 6 Regionen, die in den 4 Oligonukleotiden enthalten sind, wie beabsichtigt arbeiten, läuft die Synthesereaktion der vorliegenden Erfindung nicht ab. Insbesondere sind die Sequenzen an dem 3'-Ende von jedem Oligonukleotid, als die Ausgangspunkte der Synthese einer komplementären Kette, und an dem 5'-Ende von der X1c Region, wo die komplementäre Kette als Ausgangspunkt der Synthese dient, wichtig. Daher sind diese wichtigen Sequenzen so ausgestaltet, dass diese einer zu detektierenden Mutation entsprechen, und das Produkt der Synthesereaktion von der vorliegenden Erfindung beobachtet wird, wodurch das Vorhandensein oder das Fehlen von einer Mutation, wie beispielsweise einer Basendeletion oder Insertion, oder genetischer Polymorphismen, wie beispielsweise SNPs, verständlich analysiert werden können. Insbesondere sind die Basen, von welchen vermutet wird, dass diese eine Mutation oder ein Polymorphismus aufweisen, so gestaltet, dass diese der Umgebung von dem 3'-Ende von einem Oligonukleotid entsprechen, das als der Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette dient, oder von dessen 5'-Ende, wenn eine komplementäre Kette der Ausgangspunkt der Synthese ist. Wenn ein Mismatch an dem 3'-Ende des Ausgangspunktes der Synthese der komplementären Kette oder in dessen Umgebung vorhanden ist, wird die Reaktion der Synthese einer komplementären Kette zu Nukleinsäure signifikant inhibiert. In der vorliegenden Erfindung wird ein hoher Grad an Amplifikationsreaktion nicht erreicht, bis die Struktur von den Enden von einem Produkt in der ersten Reaktion wiederholte Reaktionen bewirkt. Demgemäß wird, selbst wenn eine fehlerhafte Synthese abläuft, die Synthese der komplementären Kette, welche die Amplifikationsreaktion ausmacht, immer unterbrochen in einigen von den Schritten, und somit wird kein hoher Grad an Amplifikationsreaktion in Gegenwart von einem Mismatch erreicht. Als ein Ergebnis inhibiert das Mismatch effektiv die Amplifikationsreaktion und ein genaues Resultat wird letztendlich erzielt. Das heißt, es kann gesagt werden, dass die Amplifikationsreaktion von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung einen höchst vollständigen Mechanismus zum Prüfen der Nukleotidsequenz hat. Diese Merkmale sind ein Vorteil, der nur schwerlich in beispielsweise dem PCR-Verfahren erwartet werden kann, wo die Amplifikationsreaktion in nur 2 Regionen erfolgt.
Die Region X1c, welche die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonukleotide charakterisiert, kann als der Ausgangspunkt der Synthese dienen, nachdem eine komplementäre Kette synthetisiert ist, und diese komplementäre Kette lagert sich an diese Sequenz X1 in der gleichen neu synthetisierten Kette an, wobei eine Synthesereaktion mit sich selbst als Matrize abläuft. Deshalb wird, selbst wenn das so genannte Primer-Dimer, welches oftmals problematisch im Stand der Technik ist, ausgebildet wird, dieses Oligonukleotid keine Schleife ausbilden. Demgemäß können unspezifische Amplifikationen, die dem Primer-Dimer zuzuordnen sind, theoretisch nicht passieren, und somit stellt das vorliegende Oligonukleotid eine Verbesserung in der Spezifität von der Reaktion bereit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die äußeren Primer, die als F3 (1-(2)) oder R3 (2-(5)) gezeigt sind, ferner kombiniert, wobei eine Reihe von Reaktionen, die oben beschrieben sind, unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden können. Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Amplifizieren von Nukleinsäure, die komplementäre Sequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, bereit, welches die Schritte, die im obigen Gegenstand 9 gezeigt sind, umfasst. In diesem Verfahren werden Temperaturbedingungen ausgewählt, bei denen stabile Anlagerungen auftreten zwischen F2c/F2, zwischen R2c/R2, zwischen F1c/F1, und zwischen R1c/R1, und bevorzugt werden F3c/F3 und R3c/R3 so festgelegt, dass es diesen gemäß dem Phänomen des Contiguous Stacking, erst durch Anlagern von F2c/F2 bzw. R2c/R2 ermöglicht ist, sich anzulagern.
In der vorliegenden Erfindung werden die Begriffe ”Synthese” und ”Amplifikation” von Nukleinsäure verwendet. Die Synthese von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet die Verlängerung von Nukleinsäure ausgehend von einem Oligonukleotid, das als der Ausgangspunkt der Synthese dient. Wenn nicht nur diese Synthese, sondern ebenfalls die Ausbildung von anderen Nukleinsäuren und die Elongationsreaktionen von diesen gebildeten Nukleinsäuren gleichzeitig ablaufen, wird eine Reihe von diesen Reaktionen üblicherweise Amplifikation genannt.
Die einzelstrangige Nukleinsäure, welche an ihrem 3'-Ende mit einer Region F1 versehen ist, die dazu in der Lage ist, sich an einen Teil F1c in der gleichen Kette anzulagern, und welche beim sich Anlagern der Region F1 an F1c in der gleichen Kette dazu in der Lage ist, eine Schleife auszubilden, die eine Region F2c enthält, welche zur Basenpaarung in der Lage ist, ist ein wichtiges Element der vorliegenden Erfindung. Solch eine einzelstrangige Nukleinsäure kann auch gemäß dem folgenden Prinzip bereitgestellt werden. Das heißt, der Synthese von einer komplementären Kette wird es gestattet, auf der Basis von einem Primer mit der folgenden Struktur abzulaufen. 5'-[Region X1 angelagert an die Region X1c, die im Primer lokalisiert ist]-[schleifen-bildende Sequenz, die für Basenpaarung zugänglich ist]-[Region X1c]-[Region, die eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Matrize ist]-3'.
Als die Region, die eine Sequenz aufweist, die komplementär zu einer Matrize ist, werden zwei Nukleotidsequenzen hergestellt, das heißt, eine Nukleotidsequenz (Primer FA), die komplementär zu F1 ist, und eine Nukleotidsequenz (Primer RA), die komplementär zu R1c ist. Die Nukleotidsequenz, welche die zu synthetisierende Nukleotidsequenz ausmacht, enthält eine Nukleotidsequenz, die sich von der Region F1 zu der Region R1c erstreckt, und eine Nukleotidsequenz, die sich von der Region R1, die eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu dieser Nukleotidsequenz ist, bis zu der Region F1c erstreckt. X1c und X1, die dazu in der Lage sind, sich an der Innenseite von dem Primer anzulagern, können willkürliche Sequenzen sein. In dem Bereich zwischen Primern FA und RF ist jedoch die Sequenz bevorzugt abweichend von der Region X1c/X1.
Zuerst wird die Synthese von einer komplementären Kette durch den Primer FA ausgehend von der Region F1 in der Matrizen-Nukleinsäure durchgeführt. Danach ist die Region R1c in der synthetisierten komplementären Kette für Basenpaarung zugänglich gemacht, an welche sich der andere Primer anlagert, um den Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette auszubilden. Das 3'-Ende von der komplementären Kette, die in diesem Schritt synthetisiert wird, weist eine Nukleotidsequenz auf, die komplementär zu dem Primer FA ist, der das 5'-Ende von der ursprünglich synthetisierten Kette ausmachte, und so ist die komplementäre Kette an deren 3'-Ende mit der Region X1 versehen worden, welche sich an die Region X1c in der gleichen Kette anlagert, um eine Schleife auszubilden. Die charakteristische 3'-terminale Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung ist somit bereitgestellt, und die anschließenden Reaktionen legen das Reaktionssystem fest, das zuvor als die am meisten bevorzugte Ausführungsform gezeigt wurde. Das Oligonukleotid, das sich an den Teil der Schleife anlagert, ist an seinem 3'-Ende mit der Region X2 versehen, die komplementär zu der Region X2c ist, die in der Schleife lokalisiert ist, und an seinem 5'-Ende mit der Region X1 versehen. In dem vorherigen Reaktionssystem wurden die Primer FA und RA verwendet, um eine Kette zu synthetisieren, die komplementär zu einer Matrizen-Nukleinsäure ist, und dabei eine Schleifenstruktur an dem 3'-Ende von der Nukleinsäure auszubilden. In diesem Verfahren wurde die terminale Struktur, die für die vorliegende Erfindung charakteristisch ist, durch die kurzen Primer zur Verfügung gestellt. In dieser Ausführungsform wird andererseits eine Nukleotidsequenz, welche eine Schleife ausmacht, in Gänze von einem Primer zur Verfügung gestellt, und die Synthese von diesem längeren Primer ist erforderlich.
Wenn eine Nukleotidsequenz, die Restriktionsenzym-Erkennungsregionen enthält, als ein Rückwärtsprimer verwendet wird, kann eine andere Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung erstellt werden. Die Reaktion mit einem Rückwärtsprimer, der eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz enthält, ist im Speziellen unter Bezugnahme auf 6 beschrieben. Wenn 6-(D) vervollständigt ist, wird durch ein Restriktionsenzym ein Strangbruch erzeugt, der einer Erkennungsstelle eines Restriktionsenzyms in dem Rückwärtsprimer entspricht. Die Reaktion von der Art der Strangverdrängung zum Synthetisieren einer komplementären Kette wird eingeleitet ausgehend von diesem Strangbruch als dem Ausgangspunkt der Synthese. Weil die Rückwärtsprimer an den beiden Enden von der doppelstrangigen Nukleinsäure lokalisiert sind, die (D) ausmacht, wird die Reaktion des Synthetisierens komplementärer Ketten ebenfalls von den beiden Enden eingeleitet. Auch wenn dies prinzipiell auf dem SDA-Verfahren basiert, das als Stand der Technik beschrieben ist, hat die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, die als Matrize dient, eine Struktur, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd verknüpft sind, so dass das Nukleinsäure-Synthesesystem, welches der vorliegende Erfindung eigen ist, aufgestellt wird. Ein Teil, der als eine komplementäre Kette für den Rückwärtsprimer dient, der einen Strangbruch aufweisen soll, sollte so ausgestaltet sein, dass dieser Teil eine dNTP-Derivat enthält, so dass diesem Teil eine Nuklease-Resistenz verliehen wird, um die Aufspaltung von der doppelstrangigen Kette durch das Restriktionsenzym zu verhindern.
Es ist ferner möglich, einen Promoter für RNA-Polymerase in den Rückwärtsprimer einzufügen. Die Transkription von den beiden Enden in 6-(D) wird durchgeführt durch eine RNA-Polymerase, welche diesen Promoter erkennt, in diesem Fall ebenfalls vergleichbar mit der vorherigen Ausführung, wo das SDA-Verfahren angewendet wurde.
Die Nukleinsäure, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wird, ist eine einzelstrangige Kette, die aber aus partiell komplementären Sequenzen besteht, und daher die Mehrzahl von diesen Sequenzen Basenpaarungen eingeht. Durch Verwenden von diesem Merkmal kann das Syntheseprodukt detektiert werden. Wenn man das Verfahren des Synthetisierens von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung in der Gegenwart von einem fluoreszierenden Pigment, das ein Doppelstrang-Ketten-spezifischer Interkalator ist, wie beispielsweise Ethidiumbromid, SYBR Green I oder Pico Green, wird eine erhöhte Fluoreszenzdichte beobachtet, wenn sich die Menge des Produktes erhöht. Durch Überwachen der Fluoreszenzdichte ist es möglich, die Synthesereaktion in einem geschlossenen System in Echtzeit zu verfolgen. Die Anwendung von dieser Art eines Detektionssystems für das PCR-Verfahren wird auch berücksichtigt, es wird jedoch erachtet, dass da viele Probleme bestehen, weil das Signal von dem Produkt nicht vom Signal von Primer-Dimern etc. unterschieden werden kann. Wenn dieses System jedoch auf die Erfindung angewendet wird, ist die Möglichkeit des Ansteigens unspezifischer Basenpaarung sehr gering, und daher können eine hohe Sensitivität und geringe Störsignale gleichzeitig erwartet werden. Gleichartig zum Verwenden von dem Doppelstrang-Ketten-spezifischen Interkalator kann auch der Übergang der Fluoreszenzenergie für ein Verfahren zum Realisieren eines Detektionssystems in einem uniformen System verwendet werden.
Das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung wird unterstützt durch die DNA-Polymerase, welche eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung zur Synthese einer doppelstrangigen Kette katalysiert. Während der oben beschriebenen Reaktion ist ebenfalls ein Reaktionsschritt enthalten, der nicht notwendigerweise die Polymerase von der Art der Strangverdrängung erfordert. Zur Vereinfachung von einem grundlegenden Reagenz und aus ökonomischer Sicht ist es jedoch vorteilhaft, nur eine Art von DNA-Polymerase zu verwenden. Als diese Art von DNA-Polymerase sind die folgenden Enzyme bekannt. Ferner können verschiedene Mutanten von diesen Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung insoweit verwendet werden, als diese sowohl die Sequenz-abhängige Aktivität für die Synthese einer komplementären Kette als auch die Strangverdrängungsaktivität aufweisen. Die Mutanten, auf welche hierin verwiesen wird, schließen auch solche ein, die nur eine Struktur aufweisen, welche die katalytische Aktivität, die von dem Enzym gefordert wird, bewirkt, oder solche mit Modifikationen der katalytischen Aktivität, Stabilität oder Thermostabilität durch zum Beispiel Mutationen in Aminosäuren.
Bst DNA Polymerase
Bca (exo-)DNA Polymerase
DNA Polymerase I Klenow Fragment
Vent DNA Polymerase
Vent (exo-)DNA Polymerase (Vent DNA Polymerase mit einer ungenügenden Exonuklease-Aktivität)
Deep Vent DNA Polymerase
Deep Vent (exo-)DNA Polymerase (Deep Vent DNA Polymerase mit einer ungenügenden Exonuklease-Aktivität)
Φ29 Phagen DNA Polymerase
MS-2 Phagen DNA Polymerase
Z-Taq DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.)
KOD DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.)
Unter diesen Enzymen sind Bst DNA Polymerase und Bca (exo-)DNA Polymerase besonders erwünschte Enzyme, weil diese einen bestimmten Grad an Thermostabilität und eine hohe katalytische Aktivität aufweisen. Die Reaktion gemäß dieser Erfindung kann isothermisch in einer bevorzugten Ausführungsform ablaufen, aber wegen der Anpassung der Schmelztemperatur (Tm) etc. ist es nicht immer möglich, Temperaturbedingungen zu verwenden, die für die Stabilität von dem Enzym erwünscht sind. Demgemäß ist es eine von den gewünschten Bedingungen, dass das Enzym thermostabil ist. Auch wenn die isothermische Reaktion praktikabel ist, kann Hitzedenaturierung durchgeführt werden, um Nukleinsäure als erste Matrize bereitzustellen, und in dieser Hinsicht erweitert die Verwendung von einem thermostabilen Enzym auch die Auswahlmöglichkeiten des Assay-Protokolls.
Vent (exo-)DNA-Polymerase ist ein Enzym, das beides, Strangverdrängungsaktivität und einen hohen Grad an Thermostabilität, aufweist. Es ist bekannt, dass die Synthesereaktion der komplementären Kette, welche eine Strangverdrängung durch DNA-Polymerase beinhaltet, begünstigt wird durch Hinzufügen eines Proteins, das Einzelstränge bindet (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225–232, Juli, 1998). Diese Wirkung wird auf die vorliegende Erfindung angewendet und durch Hinzufügen des Einzelstrang-bindenden Proteins kann der Effekt des Förderns der Synthese der komplementären Kette erwartet werden. Zum Beispiel ist T4 Gen 32 wirksam als ein Einzelstrang-bindendes Protein für Vent (exo-)DNA-Polymerase.
Für eine DNA-Polymerase, die keine 3'-5'-Exonukleaseaktivität aufweist, gibt es ein bekanntes Phänomen, wo die Synthese der komplementären Kette nicht an dem 5'-Ende von der Matrize anhält, was zu der Herstellung von einem Ein-Basen Überhang führt. In der vorliegenden Erfindung ist dieses Phänomen nicht wünschenswert, weil, wenn die Synthese von der komplementären Kette das Ende erreicht, die Sequenz des 3'-Endes die Initiierung der nächsten Synthese einer komplementären Kette ausführt. Weil eine Base ”A” mit großer Wahrscheinlichkeit an das 3'-Ende durch die DNA-Polymerase angefügt wird, kann die Sequenz so ausgewählt werden, dass die Synthese von dem 3'-Ende am ”A” startet, so dass da kein Problem auftritt, wenn eine zusätzliche Base fälschlicherweise durch dATP hinzugefügt wird. Ferner, selbst wenn das 3'-Ende überhängt während der Synthese der komplementären Kette, kann die 3' → 5' Exonuklease-Aktivität verwendet werden zum Abbauen des Überhangs, um die Enden stumpf zu machen. Weil die natürliche Vent DNA-Polymerase diese Aktivität aufweist, kann dieses Enzym zum Beispiel in einem Gemisch mit Vent (exo-)DNA-Polymerase verwendet werden, um dieses Problem zu lösen.
Verschiedene Reagenzien, die für das Verfahren zum Synthetisieren oder Amplifizieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung notwendig sind, können zuerst verpackt werden und als ein Kit bereitgestellt werden. Insbesondere wird ein Kit für die vorliegende Erfindung bereitgestellt, das verschiedene Arten von Oligonukleotiden, die als Primer zur Synthese der komplementären Kette und als äußere Primer zur Verdrängung notwendig sind, dNTP als ein Substrat zur Synthese der komplementären Kette, eine DNA-Polymerase zum Ausführen der Synthese der komplementären Kette nach Art der Strangverdrängung, ein Puffer, der geeignete Bedingungen für die Enzymreaktion bereitstellt, und gegebenenfalls Reagenzien, die zum Detektieren des Synthesereaktionsproduktes notwendig sind, umfasst. Insbesondere ist die Zugabe von Reagenzien während der Reaktion notwendig gemäß einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung, und somit werden die Reagenzien, die für eine Reaktion notwendig sind, nach Pipettieren in ein Reaktionsgefäß bereitgestellt, wodurch die Reaktion gestartet werden kann nur durch Hinzugeben einer Probe. Durch Verfassen eines Systems, in welchem das Reaktionsprodukt in situ detektiert werden kann in einem Reaktionsgefäß durch Verwenden eines Lumineszenzsignals oder eines Fluoreszenzsignals, ist es nicht notwendig, das Gefäß nach der Reaktion zu öffnen und zu schließen. Dies ist sehr wünschenswert zur Vermeidung von Kontamination.
Die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, welche gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wird, hat zum Beispiel die folgende Nützlichkeit. Das erste Merkmal ist die Anwendung des Vorteils, der aus der speziellen Struktur mit komplementären Sequenzen in einem Molekül ergibt. Dieses Merkmal sollte zu einer erleichterten Detektion führen. Das heißt, es gibt ein bekanntes System zum Detektieren von Nukleinsäure, wobei das Signal in Abhängigkeit von den Basenpaarungen mit einer komplementären Nukleotidsequenz variiert. Durch die Kombination, zum Beispiel, mit dem Verfahren des Verwendens eines Doppelstrang-Ketten-spezifischen Interkalators als ein Detektor, wie dies oben beschrieben ist, kann ein Detektionssystem realisiert werden, das die Charakteristika von dem Syntheseprodukt der vorliegenden Erfindung voll ausnutzt. Wenn das Produkt der Synthesereaktion gemäß der vorliegenden Erfindung einmal im besagten Detektionssystem Hitze-denaturiert ist, und man zu der Ausgangstemperatur zurückkehrt, erfolgt bevorzugt ein intramolekulares sich Anlagern und somit wird es komplementären Ketten gestattet, schnell Basenpaarungen einzugehen. Wenn unspezifische Reaktionsprodukte vorliegen, weisen diese keine komplementären Ketten in ihrem Molekül auf, so dass, nachdem sie in zwei oder mehr Moleküle durch Hitze-Denaturierung getrennt wurden, diese nicht unmittelbar in die ursprüngliche doppelstrangige Kette zurückkehren können. Durch Vorsehen des Schrittes der Hitze-Denaturierung vor der Detektion können Störsignale, welche die unspezifische Reaktion begleiten, reduziert werden. Wenn eine DNA-Polymerase, die nicht resistent gegenüber Hitze ist, verwendet wird, bedeutet der Schritt des Hitzedenaturierens die Beendigung von der Reaktion und dies ist vorteilhaft für die Regelung von der Reaktionstemperatur.
Das zweite Merkmal ist, dass immer eine Schleife gebildet wird, die zur Basenpaarung in der Lage ist. Die Struktur von einer Schleife, die zur Basenpaarung in der Lage ist, ist in 4 gezeigt. Wie in 4 zu sehen ist, besteht die Schleife aus der Nukleotidsequenz F2c (X2c), an welche sich der Primer anlagern kann, und einer Nukleotidsequenz, welche zwischen F2c-F1c (X1c) tritt. Die Sequenz zwischen F2c-F1c (oder zwischen X2c-X1c in einer allgemeineren Form) ist eine Nukleotidsequenz, die von der Matrize abgeleitet ist. Wenn demgemäß eine Sonde, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, mit dieser Region hybridisiert, ist eine Matrizen-spezifische Reaktion möglich. Zusätzlich ist diese Region immer für Basenpaarung zugänglich, und daher ist Hitzedenaturierung vor der Hybridisierung nicht erforderlich. Die Nukleotidsequenz, welche eine Schleife in dem Produkt der Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung ausmacht, kann eine willkürliche Länge haben. Wenn demgemäß eine Hybridisation mit einer Sonde erwünscht ist, werden eine Region, an die der Primer hybridisieren soll, und eine Region, an die sich die Sonde anlagern soll, getrennt voneinander angeordnet, um deren Konkurrenz zu verhindern, wodurch ideale Reaktionsbedingungen festgelegt werden können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung sind eine große Anzahl von Schleifen, die zur Basenpaarung fähig sind, in einem einzelnen Strang von Nukleinsäure vorhanden. Dies bedeutet, dass eine große Anzahl von Sonden mit einem Molekül der Nukleinsäure hybridisieren kann, um eine hohe Detektionsempfindlichkeit zu erlauben. Es ist somit möglich, nicht nur die Empfindlichkeit zu verbessern, sondern auch ein Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäure, das auf einem speziellen Reaktionsprinzip, wie beispielsweise Aggregation, basiert, zu verbessern. Zum Beispiel wird eine Sonde, die auf kleinen Partikeln, wie beispielsweise Polystyrollatex, immobilisiert ist, zu dem Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung hinzugegeben, und die Aggregation von Latex-Partikeln wird beobachtet, wenn die Hybridisierung von dem Produkt mit der Sonde abläuft. Eine hochsensitive und quantitative Beobachtung ist möglich durch optisches Messen der Stärke von der Aggregation. Weil die Aggregation ebenso mit dem bloßen Auge beobachtet werden kann, kann auch ein Reaktionssystem, das keine optischen Messgeräte verwendet, eingesetzt werden.
Ferner ermöglicht das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung, welches es gestattet, viele Marker pro Nukleinsäuremolekül daran zu binden, eine chromatographische Detektion. Auf dem Gebiet der Immunoassays wird normalerweise ein Analyseverfahren (Immunochromatographie) eingesetzt, welches ein chromatographisches Medium verwendet, das einen visuell detektierbaren Marker verwendet. Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass ein Analyt zwischen einem Antikörper, der auf einem chromatographischen Medium immobilisiert ist, und einem markierten Antikörper angeordnet wird, und die markierten Stoffe, die nicht reagiert haben, ausgewaschen werden. Das Reaktionsprodukt der vorliegenden Erfindung macht dieses Prinzip anwendbar zur Analyse von Nukleinsäure. Das heißt, eine markierte Sonde für einen Teil von einer Schleife wird hergestellt und auf ein chromatographisches Medium immobilisiert, um eine Einfang-Sonde zum Fangen herzustellen, wodurch eine Analyse in dem chromatographischen Medium erlaubt wird. Als die Einfang-Sonde kann eine Sequenz, die komplementär zu dem Teil von der Schleife ist, verwendet werden. Weil das Reaktionsprodukt der vorliegenden Erfindung eine große Anzahl an Schleifen aufweist, bindet das Produkt eine große Anzahl von markierten Sonden, und gibt ein visuell erkennbares Signal.
Das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung, welches immer eine Region einer Schleife aufweist, die zur Basenpaarung fähig ist, ermöglicht eine große Vielzahl von anderen Detektionssystemen. Zum Beispiel ist ein Detektionssystem, welches Oberflächenplasmonresonanz verwendet, möglich beim Verwenden einer immobilisierten Sonde für diesen Schleifenabschnitt. Ferner, wenn eine Sonde für den Schleifenabschnitt mit einem für doppelstrangige Ketten spezifischen Interkalator markiert ist, kann eine sensitivere Fluoreszenzanalyse durchgeführt werden. Alternativ ist es auch möglich, die Fähigkeit der Nukleinsäure, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wird, eine Schleife auszubilden, die zur Basenpaarung fähig ist, an beiden, der 3'- und der 5'-Seite positiv auszunutzen. Zum Beispiel wird eine Schleife so ausgestaltet, dass diese eine herkömmliche Nukleotidsequenz von einem normalen Typ und einem abnormalen Typ aufweist, während die andere Schleife so ausgestaltet ist, dass ein Unterschied zwischen diesen beiden Typen ausgestaltet wird. Es ist möglich, ein charakteristisches analytisches System zu verfassen, in welchem die Gegenwart von einem Gen durch die Sonde für den herkömmlichen Teil bestätigt wird, während die Gegenwart von einer Abnormalität in der anderen Region bestätigt wird. Weil die Reaktion zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung auch isothermisch ablaufen kann, ist es ein sehr wichtiger Vorteil, dass eine Echtzeitanalyse mit einem herkömmlichen Fluoreszenz-Photometers ausgeführt werden kann. Vordem ist die Struktur der Nukleinsäure bekannt, die sich in der gleichen Kette anlagern soll. Die Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die in einer einzelstrangigen Kette abwechselnd verknüpft sind, die man gemäß der vorliegenden Erfindung erhält, ist jedoch insofern neu, als dass diese eine große Anzahl von Schleifen aufweist, die zur Basenpaarung mit anderen Oligonukleotiden in der Lage sind.
Andererseits kann die große Anzahl von Schleifen selbst, die durch das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung gegeben sind, als Sonden verwendet werden. In einem DNA-Chip sollten zum Beispiel Sonden in hoher Dichte auf einer begrenzten Fläche angehäuft sein. Bei den derzeitigen Technologien ist jedoch die Anzahl an Oligonukleotiden, welche auf einer bestimmten Fläche immobilisiert werden können, limitiert. Durch Verwenden von dem Reaktionsprodukt von der vorliegenden Erfindung kann somit eine große Anzahl von Sonden, die zum Anlagern in der Lage sind, in hoher Dichte immobilisiert werden. Das heißt, das Reaktionsprodukt gemäß der vorliegenden Erfindung kann als Sonden auf einem DNA-Chip immobilisiert werden. Nach der Amplifikation kann das Reaktionsprodukt durch eine aus dem Stand der Technik bekannte Technik immobilisiert werden, oder das immobilisierte Oligonukleotid wird als das Oligonukleotid in der Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, was zu der Erzeugung des immobilisierten Reaktionsprodukts führt. Durch Verwenden der so immobilisierten Probe kann eine große Anzahl von Proben DNAs auf einer begrenzten Fläche hybridisiert werden und als ein Ergebnis sind starke Signale zu erwarten.
Kurze Beschreibung von den Abbildungen
1 ist eine Darstellung von einem Teil (1) bis (4) von dem Reaktionsprinzip in einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine Darstellung von einem Teil (5) bis (7) von dem Reaktionsprinzip in einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung.
3 ist eine Darstellung von einem Teil (8) bis (10) von dem Reaktionsprinzip in einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung.
4 ist eine Darstellung von der Struktur von einer Schleife, die durch die einzelstrangige Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ausgebildet wird.
5 ist eine Darstellung von einem Teil (A) bis (B) in einer Basisform von der vorliegenden Erfindung.
6 ist eine Darstellung von einem Teil (C) bis (D) in einer Basisform von der vorliegenden Erfindung.
7 ist eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Nukleotidsequenz zeigt, welche ein Oligonukleotid in der Zielnukleotidsequenz von M13mp18 ausmacht.
8 ist eine Photographie, welche das Ergebnis einer Agarose-Elektrophorese von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure mit M13mp18 als Matrize gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Bahn 1: XIV Größenmarker
Bahn 2: 1 fmol M13mp18 dsDNA
Bahn 3: Kein Ziel
9 ist eine Photographie, welche das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese des Produktes von einem Restriktionsenzym-Verdau zeigt, welches Produkt in Beispiel 1 durch die Nukleinsäuresynthesereaktion gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Bahn 1: XIV Größenmarker
Bahn 2: BamHI-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
Bahn 3: PvuII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
Bahn 4: HindIII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
10 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von M13mp18 als eine Matrize in der Gegenwart von Betain zeigt. 0, 0,5, 1 und 2 gibt die Konzentration (M) an, in welcher Betain zu der Reaktionslösung hinzugefügt wurde. N gibt die Negativkontrolle an, und –21 gibt die Konzentration 10^–21 mol der Matrizen-DNA an.
11 ist eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Nukleotidsequenz zeigt, welche ein Oligonukleotid in einer Zielnukleotidsequenz ausmacht, die von HVB abgeleitet ist.
12 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei HBV-M13mp18, integriert in M13mp18, als eine Matrize verwendet wurde.
Bahn 1: XIV Größenmarker
Bahn 2: 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
Bahn 3: Kein Ziel
13 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Gelelektrophorese von einem Basedenaturierten Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.
Bahn 1: HindIII-verdautes Fragment von einem Lambda-Phagen
Bahn 2: Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.
Bahn 3: Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 3.
14 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese von einem Produkt zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren von einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wobei die Konzentration des Ziels M13mp18 variiert wurde. Die obere und die untere Photographie zeigen das Ergebnis von der Reaktion nach 1 bzw. 3 Stunden.
Bahn 1: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–15 mol/Röhrchen
Bahn 2: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–16 mol/Röhrchen
Bahn 3: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–17 mol/Röhrchen
Bahn 4: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–18 mol/Röhrchen
Bahn 5: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–19 mol/Röhrchen
Bahn 6: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–20 mol/Röhrchen
Bahn 7: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–21 mol/Röhrchen
Bahn 8: M13mp18 dsDNA 1 × 10^–22 mol/Röhrchen
Bahn 9: Kein Ziel
Bahn 10: XIV Größenmarker
15 ist eine Zeichnung, welche die Stelle von einer Mutation und welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Region zu einer Zielnukleotidsequenz (Ziel) zeigt. Das unterstrichene Guanin ist ersetzt durch Adenin in der Mutante.
16 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese eines Produktes gemäß der Amplifikationsreaktion von der vorliegenden Erfindung zeigt:
M: 100 bp Leiter (New England Biolabs)
N: Keine Matrize (Reinstwasser)
WT: 1 fmol Wildtyp-Matrize M13mp18
MT: 1 fmol Mutanten-Matrize M13mp18FM
17 ist eine Zeichnung, welche die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Nukleotidsequenz zeigt, die ein Oligonukleotid in einer Nukleotidsequenz ausmacht, die für die Ziel-mRNA kodiert.
18 ist eine Photographie, die das Ergebnis von einer Agarose-Gelelektrophorese eines Produktes zeigt, das durch das Verfahren zum Synthetisieren einzelstrangiger Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von mRNA als Ziel erhalten wurde.
Beste Ausführungsform zum Durchführen der Erfindung
Beispiel 1. Amplifikation von einer Region in M13mp18
Das Verfahren zum Synthetisieren der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette angeordnet sind, wurde untersucht unter Verwendung von M13mp18 als eine Matrize. Vier Arten von Primern, nämlich M13FA, M13RA, M13F3 und M13R3 wurden in dem Experiment verwendet. M13F3 und M13R3 waren die ersten und zweiten äußeren Primer zum Verdrängen der ersten und der zweiten Nukleinsäure, die entsprechend mit dem ersten Oligonukleotid M13FA bzw. dem zweiten Oligonukleotid M13RA als dem Ausgangspunkt für die Synthese erhalten wurden. Weil die äußeren Primer Primer sind, die als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette nach der Synthese mit M13FA (oder M13RA) dienen, wurden diese durch Verwenden von dem Phänomen des ”Contiguous Stacking” so ausgestaltet, dass sie sich an einer Region anlagern, die benachbart zu M13FA (oder M13RA) ist. Ferner wurde die Konzentration von diesen Primern so hoch angesetzt, dass das sich Anlagern von M13FA (oder M13RA) bevorzugt ablief.
Die Nukleotidsequenz, welche jeden Primer ausmacht, ist in dem Sequenzprotokoll gezeigt. Die strukturellen Charakteristika von den Primern sind nachfolgenden zusammengefasst. Ferner ist die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Region hinsichtlich der Zielnukleotidsequenz (Ziel) in 7 gezeigt.

Primer: Region an der 5'-Seite/Region an der 3'-Seite
M13FA: Die gleiche wie die Region F1c in der komplementären Kette, die durch M13FA synthetisiert wird/komplementär zu der Region F2c in M13mp18
M13RA: Die gleiche wie die Region R1c in der komplementären Kette, die durch M13RA synthetisiert wurde/komplementär zur Region R2c in der komplementären Kette, die durch M13FA synthetisiert wird
M13F3: Komplementär zu F3c, die benachbart an der 3'-Seite von der Region F2c in M13mp18 ist
M13R3: Komplementär zu R3c, die benachbart zu der 3'-Seite von der Region F2c in der komplementären Kette ist, die durch M13FA synthetisiert wird.

Mit solchen Primern wird Nukleinsäure synthetisiert, in welcher eine Region, die sich von F1c bis R1c in M13mp18 erstreckt, und dessen komplementäre Nukleotidsequenz, abwechselnd über eine schleifen-bildende Sequenz, die F2c enthält, in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind. Die Zusammensetzung von einer Reaktionslösung für das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure mittels dieser Primer gemäß der vorliegenden Erfindung ist nachfolgend gezeigt.
Zusammensetzung von der Reaktionslösung (in 25 μL)

20 mM Tris-HCl pH 8,8
10 mM KCl
10 mM (NH₄)₂SO₄
6 mM MgSO₄
0,1% Triton X-100
5% Dimethylsulfoxid (DMSO)
0,4 mM dNTP

Primer:

800 nM M13FA/Seq. ID Nr.: 1
800 nM M13RA/Seq. ID Nr.: 2
200 nM M13F3/Seq. ID Nr.: 3
200 nM M13R3/Seq. ID Nr.: 4

Ziel: M13mp18 dsDMA/Seq. ID Nr.: 5

Reaktion: Die obige Reaktionslösung wurde auf 95°C für 5 Minuten erhitzt und das Ziel wurde in eine einzelstrangige Kette denaturiert. Die Reaktionslösung wurde in eiskaltes Wasser transferiert und 4 U von Bst DNA-Polymerase (NEW ENGLAND Biolabs) wurde dazu hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 65°C für 1 Stunde reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Reaktion bei 80°C für 10 Minuten beendet und erneut in eiskaltes Wasser überführt.
Bestätigung von der Reaktion: 1 μl Beladungspuffer wurde zu 5 μl der obigen Reaktionslösung hinzugefügt und die Probe wurde einer Elektrophorese unterzogen für 1 Stunde bei 80 mV auf einem 2% Agarose-Gel (0,5% TBE). Als molekularer Gewichtsmarker wurde XIV (100 bp Leiter, Boehringer Mannheim) verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um die Nukleinsäure zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt. Die entsprechenden Bahnen entsprechen den folgenden Proben.

1. XIV Größenmarker
2. 1 fmol M13mp18 dsDNA
3. Kein Ziel

In Bahn 3 wurde keine Bande bestätigt, außer dass die nicht reagierten Primer angefärbt wurden. In Bahn 2 wurden, in der Gegenwart von dem Ziel, die Produkte bestätigt als eine Leiter von Banden mit geringer Größe, als eine verschmierte Verfärbung bei einer hohen Größe und als eine Bande, die nur schwer in dem Gel elektrophoretisch getrennt wurde. Unter den Banden kleiner Größen entsprechen die Banden im Bereich von 290 bp und 450 bp den Produkten, die in der Synthesereaktion gemäß dieser Erfindung erwartet wurden, das heißt, die doppelstrangigen Ketten gemäß Seq. ID Nr. 11 und 12 (entsprechend der doppelstrangigen Ketten, die so ausgebildet wurden, wie in 2-(7) und 2-(10) gezeigt) und eine einzelstrangige Kette von Seq. ID Nr. 13 (entsprechend der langen einzelstrangigen Kette aus 3-(9)), und es wurde somit bestätigt, dass die Reaktion so ablief, wie erwartet. Es wurde erwartet, dass die Elektrophoreseergebnisse von dem verschmierten Muster bei der hohen Größe und die Bande, was nicht elektrophoresiert wurde, zu Stande kamen, weil diese Reaktion prinzipiell eine kontinuierliche Reaktion war, welche variierende Molekulargewichte von den Reaktionsprodukten gestattet, und ferner weil das Produkt eine komplexe Struktur hat, die eine teilweise einzelstrangige Kette und einen doppelstrangigen Komplex aufweist.
Beispiel 2. Bestätigung von den Reaktionsprodukten durch Verdau mit Restriktionsenzymen
Zum Zwecke des Klarstellens der Struktur von der Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, welche in Beispiel 1 gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, wurde ein Verdau von dem Produkt mit Restriktionsenzymen durchgeführt. Wenn die Fragmente durch Verdau der Produkte mit Restriktionsenzymen theoretisch generiert werden und wenn gleichzeitig das verschmierte Muster mit hoher Größe und die Bande, die nicht elektrophoretisch getrennt wurde, wie sie in Beispiel 1 beobachtet wurden, verschwinden, dann kann erwartet werden, dass jedes von diesen Produkten die Nukleinsäuren sind, welche komplementäre Ketten aufweisen, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, welche gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden.
Die Reaktionslösung (200 μl) aus 8 Röhrchen des Beispiels 1 wurde zusammengefügt und aufgereinigt durch Behandlung mit Phenol und Ausfällen mit Ethanol. Die erhaltenen Niederschläge wurden wiedergewonnen und erneut aufgelöst in 200 μl TE-Puffer und ein 10 μl Aliquot wurde verdaut bei 38°C für 2 Stunden mit den Restriktionsenzymen BamHI, PvuII und HindIII. Der Verdau wurde für 1 Stunde bei 80 mV auf einem 2% Agarose-Gel (0,5% TBE) elektrophoretisch getrennt. Als ein molekularer Marker wurde Super Ladder-Low (100 bp Leiter) (Gensura Laboratories, Inc.) verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um die Nukleinsäure zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben.

1. XIV Größenmarker
2. BamHI-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
3. PvuII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt
4. HindIII-Verdau von dem aufgereinigten Produkt

Es wird angenommen, dass die Nukleotidsequenzen, welche relativ kurze Amplifikationsprodukte ausmachen, diejenigen der Seq. ID Nr. 13, 14, 15 und 16 sind. Von diesen Nukleotidsequenzen sind die geschätzten Größen von jedem Fragment, das mit den Restriktionsenzymen verdaut wurde, in Tabelle 1 gezeigt. ”L” in der Tabelle bezeichnet, dass dessen Position in der Elektrophorese nicht ermittelt wurde, weil L ein Fragment ist, das eine Schleife enthält (einzelstrangige Kette). Tabelle 1. Fragmente des Restriktionsenzym-Verdaus von den Amplifikationsprodukten gemäß der vorliegenden Erfindung

Seq. ID Nr.	BamHI	PvuII	HindIII
13	177 + L	56 + L	147 + L
14	15 + 101 + L	-	142 + L
15	171 + 101 + L	56 + L	147 + 161 + L
16	11 + 101 + 230 + L	237 + L	142 + 170 + L
Zusammenfassung	101, 177, 230	56, 237	142, 147, 161, 170

(11, 15; nicht bestätigt)

Weil nahezu alle Banden, die vor dem Verdau sichtbar waren, umgewandelt wurden in die zu erwartenden Banden, wurde es bestätigt, dass die beabsichtigten Reaktionsprodukte vervielfältigt wurden. Ferner wurde es ebenfalls gezeigt, dass eine oder nur wenig unspezifische Produkte vorhanden waren.
Beispiel 3. Unterstützung der Amplifikationsreaktion durch Zugabe von Betain
Es wurde ein Experiment durchgeführt, um den Effekt von Betain (N,N,N-trimethylglycin, Sigma), das zu der Amplifikationsreaktionslösung hinzugefügt wird, auf die Amplifikationsreaktion der Nukleinsäure zu untersuchen. Die Synthese von der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, die komplementäre Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, wurde durchgeführt unter Verwendung von M13mp18 als eine Matrize, entsprechend dem Beispiel 1, in der Gegenwart von Betain bei verschiedenen Konzentrationen. Die in dem Experiment verwendeten Primer waren identisch zu denen, die in Beispiel 1 verwendet wurden. Die Menge von der Matrizen-DNA war 10^–21 mol (M13mp18) und Wasser wurde als Negativkontrolle verwendet. Betain wurde in Konzentrationen von 0, 0,5 und 1 und 2 M zu der Reaktionslösung hinzugefügt. Die Zusammensetzung von der Reaktionslösung ist nachfolgend gezeigt.
Zusammensetzung von der Reaktionslösung (in 25 μL)

20 mM Tris-HCl pH 8,8
4 mM MgSO₄
0,4 mM dNTPs
10 mM KCl
10 mM (NH₄)₂SO₄
0,1% Triton X-100

Primer:

Ziel: M13mp18 dsDMA/Seq. ID Nr.: 5

Die Polymerase, die Reaktionsbedingungen, und die Bedingungen der Elektrophorese nach der Reaktion waren identisch zu denen, die in Beispiel 1 beschrieben sind.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Bei der Reaktion in der Gegenwart von Betain in einer Konzentration von 0,5 oder 1,0 M war die Menge des Amplifikationsproduktes erhöht. Ferner, wenn die Konzentration auf 2,0 M Betain erhöht wurde, wurde keine Amplifikation beobachtet. Es wurde somit gezeigt, dass die Amplifikationsreaktion gefördert wurde in der Gegenwart von Betain bei einer geeigneten Konzentration. Der angenommene Grund dafür, dass die Menge des Amplifikationsproduktes gesunken war, wenn die Konzentration von Betain 2 M war, ist, dass die Schmelztemperatur zu gering wurde.
Beispiel 4. Amplifikation einer HBV-Gensequenz
Das Verfahren zum Synthetisieren der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, wurde, wobei M13mp18 dsDNA, die eine Teilsequenz des HBV-Gens darin integriert aufweist, als eine Matrize verwendet wurde. Vier Arten von Primern, nämlich HB65FA (Seq. ID Nr. 6), HB65RA (Seq. ID Nr. 7), HBF3 (Seq. ID Nr. 8) und HBR3 (Seq. ID Nr. 9) wurden in dem Experiment verwendet. HB65F3 und HB65R3 waren die ersten und zweiten äußeren Primer zum Verdrängen der ersten und der zweiten Nukleinsäure, die entsprechend mit dem ersten Oligonukleotid HB65FA bzw. dem zweiten Oligonukleotid HB65RA als dem Ausgangspunkt für die Synthese erhalten wurden. Weil die äußeren Primer Primer sind, die als Ausgangspunkt der Synthese einer komplementären Kette nach der Synthese mit M13FA (oder M13RA) dienen, wurden diese so ausgestaltet, dass sie sich durch Verwenden von dem Phänomen des ”Contiguous Stacking” an einer Region anlagern, die benachbart zu HB65FA (oder HB65RA) ist. Ferner wurde die Konzentration von diesen Primern so hoch angesetzt, dass das sich Anlagern von HB65FA (oder HB65RA) bevorzugt ablief. Die Zielsequenz (430 bp) dieses Beispiels, die von HBV abgeleitet ist, welches in M13mp18 integriert wurde, ist in Seq. ID Nr. 10 gezeigt.
Die Nukleotidsequenz, welche jeden Primer ausmacht, ist in dem Sequenzprotokoll gezeigt. Die strukturellen Charakteristika von den Primern sind nachfolgenden zusammengefasst. Ferner ist die die Lage betreffende Anordnungsbeziehung von jeder Region hinsichtlich der Zielnukleotidsequenz (Ziel) in 7 gezeigt.

Primer: Region an der 5'-Seite/Region an der 3'-Seite
HB65FA: Die gleiche wie die Region F1c in der komplementären Kette, die durch HB65FA synthetisiert wird/komplementär zu der Region F2c in HBV-M13mp18
HB65RA: Die gleiche wie die Region R1c in der komplementären Kette, die durch HB65RA synthetisiert wurde/komplementär zur Region R2c in der komplementären Kette, die durch HB65FA synthetisiert wird
HBF3: Komplementär zu F3c, die benachbart an der 3'-Seite von der Region F2c in HBV M13mp18 ist
HBR3: Komplementär zu R3c, die benachbart zu der 3'-Seite von der Region F2c in der komplementären Kette ist, die durch HB65FA synthetisiert wird.

Mit solchen Primern wird Nukleinsäure synthetisiert, in welcher eine Region, die sich von F1c bis R1c in M13mp18, das eine Teilsequenz von dem HBV-Gen darin integriert aufweist (HBV-M13mp18), erstreckt, und dessen komplementäre Nukleotidsequenz über eine schleifenbildende Sequenz, die F2c enthält, abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind. Die Reaktion wurde durchgeführt unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1, mit der Ausnahme, dass die oben beschriebenen Primer verwendet wurden, und die Reaktionslösung wurde Mittels Agarose-Elektrophorese analysiert. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben.

1. XIV Größenmarker
2. 1 fmol HBV-M13mp18 dsDNA
3. Kein Ziel

Entsprechend zu Beispiel 1 wurden Produkte nur in Gegenwart von dem Ziel bestätigt als eine Leiter von Banden geringer Größe, als eine verschmierte Färbung mit hoher Größe und als eine Bande, die nur schwerlich in dem Gel elektrophoretisch getrennt wurde (Bahn 2). Unter den Banden geringer Größe stimmen die Banden in der Nähe von 310 bp und 480 bp mit den erwarteten Produkten der synthetischen Reaktion gemäß dieser Erfindung überein, das heißt den doppelstrangigen Ketten gemäß Seq. ID Nr. 17 und 18, und es wurde somit bestätigt, dass die Reaktion wie erwartet abläuft. Wie bereits bei den Ergebnissen von Beispiel 1 beschrieben, ist es anzunehmen, dass das verschmierte Muster mit hoher Größe und die Bande, die nicht elektrophoretisch getrennt wurde, verursacht wurden durch die Struktur von dem Syntheseprodukt, das für die vorliegende Erfindung charakteristisch ist. Mit diesem Experiment wurde es bestätigt, dass die vorliegende Erfindung durchgeführt werden kann, selbst wenn eine andere Sequenz (Ziel) für die Amplifikation verwendet wird.
Beispiel 5. Bestätigung der Größe von den Produkten der Synthesereaktion
Um die Struktur von der Nukleinsäure zu bestimmen, die gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde, wurde deren Länge Mittels Elektrophorese unter alkalisch-denaturierenden Bedingungen analysiert. 1 μl alkaliner Beladungspuffer wurde zu 5 μl von jeder Reaktionslösung in der Gegenwart von dem Ziel des Beispiels 1 oder 4 hinzugefügt, und bei 50 mA in 0,7% Agarosegel (50 mM NaOH, 1 mM EDTA) für 14 Stunden elektrophoretisch getrennt. Als Größenmarker für das Molekulargewicht wurden HindIII-verdaute Lambda-Phagenfragmente verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit 1 M Tris, pH 8 neutralisiert und mit SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um die Nukleinsäure zu bestätigen. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben.

1. HindIII-verdautes Fragment vom Lambda-Phagen
2. Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 1.
3. Das Reaktionsprodukt aus Beispiel 4.

Wenn das Reaktionsprodukt unter alkalisch-denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch getrennt wurde, konnte dessen Größe in dem einzelstrangigen Zustand bestätigt werden. Es wurde bestätigt, dass die Größen von den Hauptprodukten in sowohl Beispiel 1 (Bahn 2) als auch Beispiel 4 (Bahn 3) beide im Bereich von 2 kBasen waren. Ferner wurde aufgezeigt, dass das Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung verlängert worden ist auf eine Größe von wenigstens 6 kBasen oder mehr innerhalb des Bereichs, den diese Analyse zu bestätigen in der Lage ist. Zusätzlich wurde erneut bestätigt, dass die Banden, die unter nicht-denaturierenden Bedingungen in Beispiel 1 und 4 nicht elektrophoretisch getrennt wurden, in dem denaturierten Zustand in einzelne einzelstrangige Ketten von geringerer Größe aufgetrennt wurden.
Beispiel 6. Bestätigung der Amplifikation in Abhängigkeit von der Konzentration von einem Ziel bei der Amplifikation von einer Region in M-13mp13
Der Einfluss von unterschiedlichen Konzentrationen des Ziels auf das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung wurde untersucht. Das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die Menge von M13mp18 dsDNA als das Ziel von 0 bis 1 fmol war und die Reaktionsdauer 1 Stunde oder 3 Stunden betrug. Entsprechend zu Beispiel 1 wurde die Probe elektrophoretisch in einem 2% Agarosegel (0,5% TBE) getrennt und mit SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) angefärbt, um die Nukleinsäure zu bestätigen. Als ein molekularer Größenmarker wurde XIV (100 bp Leiter, Boehringer Mannheim) verwendet. Die Ergebnisse sind 14 gezeigt (oben: 1-stündige Reaktion, unten: 3-stündige Reaktion). Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben:

1. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–15 mol/Röhrchen
2. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–16 mol/Röhrchen
3. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–17 mol/Röhrchen
4. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–18 mol/Röhrchen
5. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–19 mol/Röhrchen
6. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–20 mol/Röhrchen
7. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–21 mol/Röhrchen
8. M13mp18 dsDNA 1 × 10^–22 mol/Röhrchen
9. Kein Ziel
10. XIV Größenmarker

Eine gemeinsame Bande tauchte in den einzelnen Bahnen in dem unteren Teil des elektrophoretischen Profils auf und zeigt die nicht reagierten angefärbten Primer. Unabhängig von der Reaktionszeit wurde kein Amplifikationsprodukt beobachtet in der Abwesenheit von dem Ziel. Ein Färbungsmuster der Amplifikationsprodukte, abhängig von der Konzentration des Ziels, wurde nur in der Gegenwart von dem Ziel erhalten. Ferner konnten Amplifikationsprodukte bei niedrigen Konzentrationen bestätigt werden, wenn die Reaktionszeit verlängert wurde.
Beispiel 7. Detektion von einer Punktmutation
(1) Herstellung von M13mp18FM (Mutante)
Die verwendete Ziel-DNA war M13mp18 (Wildtyp) und M13mp18FM (Mutante). Für die Erzeugung von der Mutante M13mp18FM wurde das LA PCR^TM in vitro Mutagenesekit (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet, um ein Nukleotid für die Mutation zu ersetzen. Danach wurde die Sequenz durch Sequenzieren bestätigt. Die Sequenz von der F1-Region ist nachfolgend gezeigt:
(2) Ausgestaltung der Primer
Die FA-Primer, die für den Wildtyp und die Mutante verwendet wurden, wurden an deren 5'-Ende von der Region F1c mit entsprechend verschiedenen Nukleotidsequenzen versehen. Die Lage von der Mutation und die die Lage betreffenden Anordnungsbeziehung von jeder Region hinsichtlich der Ziel-Nukleotidsequenz (Target) sind in 15 gezeigt.
(3) Amplifikationsreaktion
Ein Experiment wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob eine Matrizen-spezifische Amplifikationsreaktion abläuft unter Verwendung einer Kombination von spezifischen Primern, die nachfolgend gezeigt sind, durch Verwenden von M13mp18 (Wildtyp) und M13mp18FM (Mutante) als Primern.
Primersatz für die Amplifikation des Wildtyps: FAd4, RAd4, F3, R3
Primersatz für die Amplifikation der Mutante: FAMd4, RAd4, F3, R3
Die Nukleotidsequenz von jedem Primer ist wie folgt:
(4) Detektion von der Punktmutation in M13mp18

Die Zusammensetzung von der Reaktionslösung ist wie folgt:

		Endkonzentration
D2W	3,75 μL
10 × Thermo pol Puffer (NEB)	2,5 μL	20 mM Tris-HCl pH 8,8
		10 mM KCl
		10 mM (NH₄)₂SO₄
		6 mM MgSO₄
		0,1% TritonX-100
2,5 mM dNTP	4 μl	400 μM
100 mM MgSO₄	0,5 μL
4 M Betain	6,25 μL	1 M
M13FAd4 Primer (10 pmol/μL oder
M13FAMd4 Primer (10 pmol/μL)	2 μL	800 nM
M13RAd4 Primer (10 pmol/μL)	2 μL	800 nM
M13F3 Primer (10 pmol/μL)	0,5 μL	200 nM
M13R3 Primer (10 pmol/μL)	0,5 μL	200 nM
Gesamtmenge	22 μL

1 fmol (2 μl) von dem Ziel M13mp18 oder M13mp18FM wurde zu der Reaktionslösung hinzugeben und auf 95°C für 5 Minuten erhitzt, wodurch das Ziel in eine einzelstrangige Kette denaturiert wurde. Die Reaktionslösung wurde ein eiskaltes Wasser überführt und 1 μl (8 U) von Bst DNA-Polymerase (NEW ENGLAND Biolab) wurde dazu hinzugefügt und eine Reaktion wurde für 1 Stunde bei 68°C oder 68,5°C durchgeführt. Nach der Reaktion wurde die Reaktion beendet bei 80°C für 10 Minuten, und die Reaktionslösung wurde erneut in eiskaltes Wasser über führt.
Wie in 16 gezeigt ist, wurde eine effektive Amplifikation nur in der Gegenwart von der Wildtyp-Matrize beobachtet, wenn FAd4 für den Wildtyp als der FA Primer verwendet wurde. Andererseits, wenn FAMd4 für die Mutante als der FA Primer verwendet wurde, wurde eine effektive Amplifikation nur in der Gegenwart von der Wildtyp [sic.!]-Matrize beobachtet.
Mit den oben beschriebenen Ergebnissen wurde gezeigt, dass die Punktmutation effizient detektiert werden kann, bei Verwenden der Amplifikationsreaktion gemäß der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 8. Amplifikationsreaktion von mRNA als ein Ziel
Das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung wurde untersucht unter Verwenden von mRNA als die Ziel-Nukleinsäure. Um die Ziel-mRNA herzustellen wurden Zellen der Prostatakrebs-Zelllinie LNCaP (ATCC Nr. CRL-1740), welche das Prostata-spezifische Antigen (PSA) exprimieren, gemischt mit Zellen der chronischen myeloischen Leukämiezelllinie K562 (ATCC Nr. CCL-243) als nicht-exprimierende Zellen bei 1:10⁶ bis 100:10⁶, gefolgt von der Extraktion von der Gesamt-RNA durch Verwenden von dem RNeasy Mini Kit von Qiagen (Deutschland). Vier Arten von Primern, nämlich PSAFA, PSARA, PSAF3 und PSAR3, wurden in diesem Experiment verwendet. PSAF3 und PSAR3 sind äußere Primer zum Verdrängen der ersten Nukleinsäure, die entsprechend mit PSAFA bzw. PSARA als dem Ausgangspunkt der Synthese erhalten wurden. Ferner wurden die Konzentrationen von diesen Primern so hoch gesetzt, dass die Anlagerung von PSAFA (oder PSARA) bevorzugt ablief. Die Nukleotidsequenzen, welche die entsprechenden Primer ausmachen, sind wie folgt.
Primer:
Die strukturellen Merkmale von den Primern sind nachfolgend zusammengefasst. Ferner sind die die Lage betreffende Anordnungsbeziehungen von jedem Primer hinsichtlich der DNA-Nukleotidsequenz, welche für die Ziel-mRNA kodiert, und die Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym Sau3Al in 17 gezeigt.

Primer: Region an der 5'-Seite/Region an der 3'-Seite
PSAFA: Die gleiche wie Region F1c in der komplementären Kette, die durch PSAFA synthetisiert wird/komplementär zur Region F2c in der Ziel-Nukleotidsequenz
PSARA: Die gleiche wie Region R1c in der komplementären Kette, die mit PSARA synthetisiert wird/komplementär zur Region R2c in der komplementären Kette, die mit PSAFA synthetisiert wird
PSAF3: Komplementär zu F3c, die benachbart zu der 3'-Seite der Region von der Region F2c in der Ziel-Nukleotidsequenz ist
PSAR3: Komplementär zu R3c, die benachbart zu der 3'-Seite von der Region R2c in der komplementären Kette ist, die mit PSAFA synthetisiert wird

Die Zusammensetzung von einer Reaktionslösung für das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:
Zusammensetzung der Reaktionslösung (in 25 μL)

20 mM Tris-HCl pH 8,8
4 mM MgSO₄
0,4 mM dNTPs
10 mM KCl
10 mM (NH₄)₂SO₄
0,1% Triton X-100
0,8 M Betain
5 mM DTT
1600 nM PSAFA & PSARA Primer
200 nM PSAF3 & PSAR3 Primer
8 U Bst DNA-Polymerase
100 U Rever Tra Ace (Toyobo Co., Ltd., Japan)
5 μg Total RNA

Alle Inhaltsstoffe wurden auf Eis gemischt. In diesem Experiment wurde mRNA (einzelstrangige Kette) als ein Ziel verwendet und somit ist der Schritt des Herstellens einer einzelstrangigen Kette durch Hitzedenaturierung nicht erforderlich. Die Reaktion wurde durchgeführt bei 65°C für 45 Minuten und die Reaktion wurde beendet bei 85°C für 5 Minuten. Nach der Reaktion wurden 5 μl von der Reaktionslösung in 2% Agarose elektrophoretisch getrennt und detektiert durch SYBR Green I.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt. Die einzelnen Bahnen entsprechen den folgenden Proben.

Bahn	Bst	Rt	Anzahl von LNCaP Zellen/10⁶ K562 Zellen
1	–	+	0
2	–	+	10
3	+	–	0
4	+	–	10
5	+	+	0
6	+	+	1
7	+	+	10
8	Sau3Al-Verdau von einem 1 μL Aliquot von der Reaktionslösung der Bahn 6
9	Sau3Al-Verdau von einem 1 μl Aliquot von der Reaktionslösung der Bahn 7
10	Größenmarker, 100 bp Leiter (New England Biolabs)

In der Abwesenheit von entweder Bst DNA Polymerase oder Rever Tra Ace, konnten keine Amplifikationsprodukte erhalten werden (Bahnen 1 bis 4). In der Gegenwart von beiden Enzymen wurde ein Amplifikationsprodukt detektiert (Bahnen 5 bis 7), wenn die von LNCaP abgeleitete RNA vorhanden war. RNA, die von einer LNCaP Zelle pro eine Millionen K562 Zellen extrahiert wurde, konnte detektiert werden (Bahn 6). Wenn das Amplifikationsprodukt an den Stellen des Restriktionsenzyms Sau3Al verdaut wurde, die im Inneren von dem Ziel liegen, wurde das Produkt in ein Fragment der erwarteten Größe verdaut (Bahnen 8 und 9).
Mit den oben beschriebenen Ergebnissen wurde bestätigt, dass das erwünschte Reaktionsprodukt in dem Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden kann, selbst wenn RNA als ein Ziel verwendet wird.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß dem neuen Kit von Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung und dem Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure durch Verwenden besagter Oligonukleotide wird ein Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure, die komplementäre Nukleotidsequenzen aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, bereitgestellt, ohne dass eine komplizierte Temperaturregelung erforderlich ist. Eine komplementäre Kette, die mit dem Oligonukleotid als einen Primer basierend auf der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde, dient als der Ausgang zum Synthetisieren einer neuen komplementären Kette mit dem 3'-Ende von besagter synthetisierter Kette als eine Matrize. Dies wird begleitet durch die Ausbildung von einer Schleife, welche das sich Anlagern von einem neuen Primer bewirkt, und ein Produkt von der Reaktion des Synthetisierens einer komplementären Kette mit der zuvor synthetisierten Kette als eine Matrize wird durch die Synthese der komplementären Kette ausgehend von der Schleife wieder verdrängt und wird für Basenpaarung zugänglich gemacht. Die somit erhaltene Nukleinsäure, die mit sich selbst als Matrize synthetisiert wurde, wird kombiniert mit zum Beispiel einem bekannten Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure, wie beispielsweise SDA, um zu einer Verbesserung der Effizienz der Nukleinsäuresynthese beizutragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform von der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure bereitgestellt, welches eine Verbesserung der Effizienz von bekannten Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure erreicht, welches keine komplizierte Temperaturregelung erfordert, von welchem erwartet wird, dass es eine hohe Amplifikationseffizienz aufweist, und welches eine hohe Spezifität erzielt. Das heißt, die Oligonukleotide von dem Kit gemäß der vorliegenden Erfindung werden auf einer Zielkette und deren komplementäre Kette angewendet, wodurch Nukleinsäure, die komplementäre Ketten aufweist, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, erfolgreich synthetisiert werden kann. Diese Reaktion setzt sich theoretisch solange fort, bis das Ausgangsmaterial, das für die Synthese erforderlich ist, verbraucht ist, während dieser Reaktion wird kontinuierlich neue Nukleinsäure ausgebildet, deren Synthese von der Schleife gestartet wird. Die Verlängerung von dem Oligonukleotid, das sich an die Schleife angelagert hat, führt eine Strangverdrängung aus, um 3'-OH für die Elongation von langen einzelstrangigen Nukleinsäuren bereitzustellen (das heißt, Nukleinsäure, die viele Paare von komplementären Ketten aufweist, die darin verknüpft sind). Auf der anderen Seite führt die 3'-OH von der langen einzelstrangigen Kette die Reaktion des Synthetisierens der komplementären Kette mit sich selbst als eine Matrize aus, wobei deren Verlängerung erzielt wird, während derer eine neue komplementäre Kette, deren Synthese von der Schleife startet, verdrängt wird. Solch ein Schritt der Amplifikationsreaktion läuft unter isothermen Bedingungen ab, während eine hohe Spezifität erhalten bleibt.
Die Oligonukleotide in dem Kit der vorliegenden Erfindung können, wenn zwei benachbarte Regionen so wie ausgelegt angeordnet sind, als Primer für die Reaktion zur Synthese von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung fungieren. Dies trägt signifikant zur Erhaltung der Spezifität bei. Beim Vergleich mit, zum Beispiel PCR, wo eine unspezifische Amplifikationsreaktion ausgelöst wird durch unspezifisches Falsch-Anlagern, unabhängig von der beabsichtigten die Lage betreffenden Anordnungsbeziehung der zwei Primer, kann es einfach erklärt werden, dass eine hohe Spezifität der vorliegenden Erfindung zu erwarten ist. Dieses Merkmal kann dazu verwendet werden, SNPs mit hoher Sensitivität und Genauigkeit zu detektieren.
Die charakteristischen Merkmale von der vorliegenden Erfindung liegen darin, dass diese Reaktion einfach erreicht werden kann durch eine sehr einfache Beschaffenheit der Reagenzien. Zum Beispiel haben die Oligonukleotide von dem Kit gemäß der vorliegenden Erfindung eine spezielle Struktur, aber dies ist eine Frage der Auswahl der Nukleotidsequenz, und es ist ein einfaches Oligonukleotid als Stoff. Ferner kann, in einer bevorzugten Ausführungsform, die Reaktion mit nur einer DNA-Polymerase ablaufen, welche eine Reaktion nach Art der Strangverdrängung zur Synthese komplementärer Ketten katalysiert. Ferner, wenn die vorliegende Erfindung mit RNA als eine Matrize durchgeführt wird, wird eine DNA-Polymerase, wie beispielsweise Bca DNA-Polymerase, die beides, Reverse-Transkriptase-Aktivität und DNA-Polymerase-Aktivität nach Art der Strangverdrängung aufweist, verwendet, so dass alle Enzymreaktionen durch ein einziges Enzym durchgeführt werden können. Das Reaktionsprinzip zum Realisieren des hohen Grades an Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion durch solch eine einfache Enzymreaktion ist nicht bekannt. Selbst für die Anwendung von der vorliegenden Erfindung für eine bekannte Nukleinsäure-Synthesereaktion, wie beispielsweise SDA, ist kein zusätzliches Enzym für deren Kombination erforderlich, und solch eine einfache Kombination mit den Oligonukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene Reaktionssysteme angewendet werden. Demgemäß kann gesagt werden, dass das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung auch vorteilhaft in Bezug auf die Kosten ist.
Wie oben beschrieben, stellt das Verfahren zum Synthetisieren von Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung und stellen die Oligonukleotide dafür ein neues Prinzip dar, das gleichzeitig eine Vielzahl von schwierigen Problemen löst, wie beispielsweise die Funktionsfähigkeit (Temperaturregelung ist nicht erforderlich), Verbesserung der Effizienz der Synthese, Einsparung und hohe Spezifität.
SEQUENZLISTE

Claims

Ein Kit für die Synthese von einer Nukleinsäure, die komplementäre Ketten besitzt, die abwechselnd in einer einzelstrangigen Kette verknüpft sind, enthaltend die folgenden Elemente: i) ein erstes Oligonukleotid umfassend wenigstens zwei Regionen F2 und F1c, wobei F1c mit der 5'-Seite von F2 verbunden ist, und wobei F2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär ist zu einer willkürlichen Region F2c in einer Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, und F1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie eine Region F1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region F2c in Matrizen-Nukleinsäure, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, angeordnet ist; ii) ein zweites Oligonukleotid umfassend wenigstens zwei Regionen R2 und R1c, wobei R1c mit der 5'-Seite von R2 verbunden ist, und wobei R2 eine Region ist, die eine Nukleotidsequenz besitzt, die komplementär ist mit einer willkürlichen Region R2c in einer komplementären Kette, synthetisiert mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangpunkt der Synthese, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, und R1c eine Region ist, die im wesentlichen dieselbe Nukleotidsequenz wie eine Region R1c besitzt, die an der 5'-Seite von der Region R2c in der komplementären Kette, die eine spezifische Nukleotidsequenz besitzt, lokalisiert ist; iii) ein erster äußerer Primer mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Region F3c, die lokalisiert ist an der 3'-Seite von der Region F2c in der Nukleinsäure, die als Matrize dient; iv) eine DNA-Polymerase, die eine Reaktion von der Art einer Strangverdrängung, zur Synthese einer komplementären Kette katalysiert; v) ein Nukleotid, das als Substrat für das Element iv) dient, und vi) ein zweiter äußerer Primer mit einer Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer Region R3c, die lokalisiert ist an der 3'-Seite von der willkürlichen Region R2c in der komplementären Kette, die mit dem ersten Oligonukleotid als Ausgangspunkt für die Synthese synthetisiert wird.
Das Kit gemäß Anspruch 1 umfassend ein Nachweismittel zum Nachweisen des Produktes von der Nukleinsäuresynthesereaktion.
Ein Verfahren zum Synthetisieren eines Nukleinsäuremoleküls umfassend: a. Zugeben der Elemente i) bis vi) von dem Kit gemäß Anspruch 1 zu einer einzelstrangigen oder doppelstrangigen Nukleinsäure, die als Matrize dient; und b. Inkubieren des Gemisches von Schritt a) bei solch einer Temperatur, dass die Nukleotidsequenz, welche das erste Oligonukleotid und das zweite Oligonukleotid ausbildet, stabile Basenpaarung mit dessen komplementären Nukleotidsequenzen bilden kann, während die Enzymaktivität erhalten bleiben kann.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Gemisch ferner einen Regulator für die Schmelztemperatur umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Regulator für die Schmelztemperatur Betain ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei 0,2 bis 3,0 M Betain vorhanden ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei das Gemisch ferner umfasst ein Nachweismittel zum Nachweisen des Produktes von der Nukleinsäuresynthese, welche gemäß dem Verfahren nach Anspruch 3 erstellt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Matrizen-Nukleinsäure RNA ist und die DNA-Polymerase Reverse-Transkriptase-Aktivität aufweist.