JP6339787B2 - 核酸の分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸の塩基配列を決定するための分析方法に関する。より詳しくは、平面基板等の上に鋳型となる核酸（例えば、ＤＮＡライブラリー、トランスクリプトーム、又はゲノムの各配列）を提供し、核酸の塩基配列を決定することができる分析方法に関する。

一般に核酸を分析する各種方法及び装置は、試薬分注・精製・抽出・酵素反応・蛍光標識・温度調整・撹拌・遠心・検出等といった数多くの手順を踏む。これらの手順が実施されることにより、複雑に制御されている生物を理解することや解析や診断が実施される。

例えば、一つの解析として核酸配列決定方法が挙げられる。一般に核酸配列決定は、核酸増幅技術を用いてＤＮＡシーケンサ（非特許文献１）によって核酸配列決定がなされる。従来のＤＮＡシーケンサはガラスキャピラリ管内において蛍光修飾した核酸を電気泳動し、光照射によって得られる蛍光を読み取り解析してきた。

近年、平面基板上で酵素（ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼ等）を用いて核酸を合成し、蛍光・発光等をＣＣＤカメラ等の画像素子によって光検出を行い、超並列的に塩基配列を決定する技術をもとにした核酸配列決定法が登場してきている（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製５５００ ＳＯＬｉＤ^ＴＭシステム、ｉｌｌｕｍｉｎａ社製ＨｉＳｅｑ ２０００システム、Ｒｏｃｈｅ社製４５４シークエンシングシステム等）。

これらのＤＮＡシーケンサは蛍光や発光を読み取ることによって核酸配列決定を行うが、ＤＮＡポリメラーゼ反応における反応副産物である水素イオンを検出するＤＮＡシーケンサも登場してきた。このＤＮＡシーケンサも上記と同様にシーケンシング反応用の半導体（ＣＭＯＳ）チップ上に超並列的に無数のウェルが並べられ、ビーズ上で増幅した１本鎖ＤＮＡの鋳型とＤＮＡポリメラーゼをその無数の各ウェルに入れた後、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各塩基を各々に添加することにより、水素イオンを検知し配列決定を行う。１回の反応が終わると、次の塩基が入ることにより、ＤＮＡ合成は逐次的に実行されていく。ＤＮＡポリメラーゼ反応で生成した水素イオンは、ウェルの底にあるイオン感受性レイヤーに電荷を与え、その直下にある半導体センサであるイオンセンサがその電荷を電圧に変える。電圧変化はＣＭＯＳチップ内での計算により信号へと変換され、出力される（特許文献１）。

これらの超並列的に塩基配列を決定する方法では、高感度に検出するために、以下の二つの方法のどちらかを用いて、事前にサンプルを増幅するのが一般的である。一つは、油中水滴エマルジョンを利用し、油中の各水滴中にサンプルとなる鋳型核酸、プライマー、プライマーを固定したビーズ、酵素や基質等を閉じ込めた状態でＰＣＲ反応を行うことにより、単一ビーズ上に単一鋳型核酸の増幅産物が生成される。このエマルジョンＰＣＲと呼ばれる増幅により、単一ビーズから増幅された鋳型分の光が放たれるため、光検出の感度が改善される（特許文献２）。

もう一方の方法はブリッジＰＣＲと呼ばれ、サンプルとなる鋳型核酸の両末端に２種類のアダプター配列を付加させる。この１本鎖鋳型核酸を平面基板上に結合させ、平面基板上でＰＣＲを繰り返すことにより、局所的にＤＮＡ増幅産物のクラスターを作製する方法である。この平面基板上には、プライマーとして２種のアダプター配列の相補鎖が固定されているため、鋳型核酸は固定化されているプライマーに相補的に結合する（特許文献３）。

特表２０１０−５１３８６９号公報 特表２００７−５３５８９２号公報 米国特許第８，１４３，００８号明細書

Nature, 361, 565-566(1993)

一般にサンプルの増幅工程においては、ビーズや平面基板上に固定したプライマーの数に相当する鋳型核酸配列が合成増幅される。核酸配列決定においては、合成増幅された鋳型核酸を元に信号が得られるが、鋳型核酸から発せられる蛍光・発光や水素イオンによる電荷は、合成増幅される鋳型量に依存する。つまり、核酸増幅反応により増幅される鋳型配列はビーズや平面基板に固定されるプライマーに対応する鋳型配列に限られ、核酸配列決定時にプライマー数以上の鋳型信号を得ることはできないという限界がある。

例えば、サンプルから得られる信号がバックグラウンドとされる様々なノイズに対して強ければ高性能な解析が可能になることは明白である。ノイズの一例として、増幅された鋳型核酸を元に、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼ等）を用いて逐次的に反応を進め、蛍光・発光シグナルや水素イオンによる電荷シグナルを得るが、一つのビーズもしくは平面基板上で増幅した鋳型クラスターにおける全ての鋳型核酸が正しく逐次的に反応しないことに起因するノイズが挙げられる。例えば、一塩基ずつ逐次的に核酸配列読取反応を進めていく際、ある一定の割合で本来合成されるべき時に塩基が取り込まれない事象がある一定の割合で発生する。それは、本来得られるべき信号が得られず、弱いシグナルとして検出される。さらに次の反応として、さらに一塩基伸長を繰り返すと塩基が取り込まれなかった鋳型核酸から得られるシグナルは、一塩基分遅れて得られるため本来のシグナルではなく、ノイズとして得られる。その結果、シグナルとノイズの比が悪化し、解析精度が低下する。このような反応ミスは一塩基伸長を繰り返す毎に積み上げられ、最終的にはシグナルとノイズが同等レベルになると、その塩基配列を特定できなくなる。この例に限らず、背景から得られるノイズ、電気的な回路から得られるノイズ等様々なノイズがあるがこれらが積み上がり、結果としてノイズに対しシグナルが弱くなることにより、読取塩基長が短く限定される。

これらを改善するために例えば、ビーズを大きくしビーズ当たりのプライマー数を増やすことや、平面基板上に添加する鋳型核酸の量を少なくし、ブリッジＰＣＲにより生成されるクラスターを大きくすることも可能ではある。しかし、検出時に用いる画像素子やＣＭＯＳチップ単位当たりに得られるデータ量が損なわれることを意味しており、超並列的に読み取ることにより多くのデータを算出することが最大のメリットを持つこれらのＤＮＡシーケンサの特徴が失われ、スループットの低下を招く。

単純に固定するプライマーの濃度を高めることも可能であるが、合成により生成されるプライマー分のコストが余計にかかるという課題を抱える。

核酸配列を決定する方法は、複数存在するがいずれも読取塩基長に限界がある。読取塩基長以上の鋳型核酸を用意し、増幅等を行い両末端から配列を読み取ることにより、一つの鋳型核酸で両末端分の配列情報を効率的に得ることが可能であるが、ビーズによるエマルジョンＰＣＲを用いた方法では、増幅されビーズに付与される鋳型ＤＮＡは片鎖の配列のみであるため、５’末端から配列を読み取ることは可能であるが３’末端から配列を読み取ることは一般にＤＮＡポリメラーゼが伸長しないため困難である。また、ブリッジＰＣＲのように平面基板上に鋳型核酸の両末端の配列を持つプライマーを固定化し、エマルジョンＰＣＲを用いることも可能である。しかし、このような方法は単位面積当たりに５’末端からの解析用の鋳型と３’末端からの解析用の鋳型を用意することを意味しており、固定化したプライマー当りに１つの鋳型核酸が合成増幅されないため、単位面積当たりから得られるシグナルが半減し、限定されるという課題を抱えている。

上記に示した増幅法のうち、ビーズを用いる方法は一般にエマルジョンＰＣＲを用いるため、増幅後のビーズを精製する工程が必要であり煩雑な工程が必要である。そのため、増幅工程を含んだ装置を提供する場合、ビーズを精製するための複雑な機構を用いる必要がある。ビーズではなく、平板基板上で増幅可能であることがより好ましい。

これらの解決策として、鋳型の増幅法としてＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号公報）を適用することもアイデアとして考えることができる。ＬＡＭＰ法を用い、増幅後の反応生成物をＤＮＡチップ上に固定化し、高いシグナルを期待する方法が知られている。しかし、鋳型の増幅法としてＬＡＭＰ法を用いて鋳型を増幅した後、固相上に固定化する方法では、固定化する工程が増え、解析時間の増加や増幅物の固定化効率が求められ、増幅産物を失う問題もある。また、単一ビーズ上もしくは平面基板上に重複せずに単一鋳型を敷き詰める工程も求められ、さらに時間と効率が課せられるという問題もある。

また、ＬＡＭＰ増幅した鋳型に対し、ＤＮＡポリメラーゼやライゲース等の酵素と核酸配列決定用のプライマーを用いて反応を行った場合、核酸配列決定用のプライマーから伸長した塩基からの信号以外に、増幅時に使用したＬＡＭＰ法よって形成された鋳型の３’末端も同時に伸長するためにノイズとして得られる信号も存在するという問題がある。

さらに、鋳型増幅法としてＬＡＭＰ法を実施した場合、増幅した産物は様々な長さになる。この様々な長さの増幅産物は、核酸配列読取のための光検出や水素検出時にある一定の範囲で検出を行う場合に、信号が強い箇所と弱い箇所においてバックグラウンドが異なるため、バックグランドを算出する領域の範囲を小さくする必要がある。これは情報処理の演算を複雑にし、解析時間を長くしてしまう問題を生ずる。また、過剰に伸長した核酸が隣り合う増幅産物領域にかぶさる場合は検出の際のノイズとなり誤検出の要因の一つとなる問題もある。

上記の問題点に鑑み、本発明は、単位面積当たりに得られるシグナルを増やすことができる核酸の分析方法を提供することを目的とする。

この課題は、ビーズや平面基板を用いた核酸配列決定技術に限定されるものではない。単位面積当たりのシグナル量を必要とする分析法において共通する課題である。

なお、本明細書において核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらを構成するヌクレオチドが誘導体等に置換されているもの、あるいは各種修飾されたＤＮＡやＲＮＡであって、合成増幅のための鋳型として機能するものをいう。これらは、動物、植物、微生物、ウイルス、血液、血清、血漿、唾液、組織、細胞等から抽出されるか化学的に合成されるものである。

上記課題を解決するため、本発明の核酸の分析方法では、以下の４つの成分（１）〜（４）を混合し、インキュベートを行い、鋳型核酸を増幅させた後もしくは増幅中に、増幅産物の３’末端の不活化処理を行い、その後に核酸配列を決定する。
（１）以下の特徴（ａ）〜（ｄ）を有する鋳型核酸、
（ａ）少なくとも一対の相補的な塩基配列からなる標的塩基配列を有している。
（ｂ）前記（ａ）の相補的な塩基配列がハイブリダイズしたときに、ループ構造を形成することができる。
（ｃ）３’末端が自身にアニールしてループ構造を形成することができる。
（ｄ）自身にアニールした３’末端は自身を鋳型とする相補鎖合成の起点になることができる。
（２）鋳型核酸のループ構造において、相補鎖合成の起点を与えることができる少なくとも２種類のプライマーであって、そのうち少なくとも１種は固相に固定化されている前記プライマー、
（３）鎖置換を伴う相補鎖合成をするためのＤＮＡポリメラーゼ、及び
（４）相補鎖合成のための基質。

本発明によれば、核酸配列決定における鋳型核酸の単位面積当たりの量を多くすることが可能であるため、核酸配列読取において強い信号が得ることができ、読取塩基長の増大及び読取精度が改善されるという効果がある。上記した以外の課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。

核酸に核酸アダプターを付加する工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 鋳型核酸の生成工程及び増幅工程を示す図である。 増幅産物に核酸配列決定用プライマーが結合する状態を示す図である。 クラスターが形成される状態を示す図である。 フローセル容器を示す図である。 核酸配列を決定する工程を説明するための図である。 鋳型核酸を増幅する工程から核酸配列を決定する工程への手順を示すフローチャートである。 増幅産物を固相から解離させる方法の一例を示す図である。

発明の実施の形態

以下、本発明を詳細に説明する。
（分析方法の概要）
本発明は、特定の構造をもつ鋳型核酸と、この核酸の特定の領域に相補鎖合成の起点を与えることができる、５’末端を固相に固定したプライマーを組み合わせることによって、迅速な相補鎖合成を可能とするとともに、固定したプライマー当りに増幅される鋳型核酸及び相補鎖配列を少なくとも１つ以上とすることにより、核酸配列決定時における単位面積当たりの光もしくは水素イオン等の信号を増やすことを可能とした。

（鋳型核酸の用意）
図１に合成増幅に用いる鋳型核酸を生成するための前処理工程の一例を示す。生体試料等から抽出された核酸１０１を、超音波による切断、細孔を通すことによる物理的切断、制限酵素による切断等を用いて好ましい長さに断片化する。核酸の断片化の手段は、上記に限定されるものではなく公知のいずれかの手段を使用しても良い。アガロースゲル等を用いた電気泳動によって、断片化された核酸１０２の断片長を揃えても良い。断片化された核酸１０２の両末端構造は断片毎に不揃いであるため、平滑化しても良い。例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの５’末端→３’末端のポリメラーゼ活性と３’末端→５’末端のエクソヌクレアーゼ活性を利用して平滑化することができる。また、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ等を用いて断片化を行った場合は、３’末端の突出が生じるため、突出部分の相補鎖を酵素Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを用いて埋めることにより平滑化しても良い。平滑化した核酸１０３と、本発明における増幅法に適した配列を持つ核酸アダプター１０４とにより、ライゲーション等の反応を行い合成増幅に用いる核酸１０５を得る。核酸アダプター１０４は本発明の増幅法を成し得る配列を有する必要がある。ここでは、両末端を揃える例として平滑化を示したが、これに限定されるものではない。核酸アダプターをライゲーションする構造であれば良い。同様に核酸アダプターも核酸断片とライゲーション可能である構造であれば良い。例えば、各種制限酵素による断片化構造に対する相補的な塩基配列を持つ突出末端を核酸アダプターに持たせても良い。また、両端に異なる配列の核酸アダプターを結合させたい場合は、上記等のライゲーション反応の後に、各々の両端の配列を持つＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲにて増幅した産物を用いても良い。この場合、両端に同じ配列を持つ核酸アダプターが結合したものは増幅されないので、目的の核酸のみを得ることができる。

（鋳型核酸の説明）
本発明において、合成増幅の対象とする特定構造の鋳型核酸は、１本鎖上に互いに相補的な塩基配列を有している。これらの相補的な塩基配列の間にはループ構造が形成される。本発明においては、この配列をループ形成配列と呼ぶ。そして、本発明によって合成増幅される核酸は、前記ループ形成配列によって同一の１本鎖上に互いに相補的な塩基配列が合成増幅される。相補的な塩基配列を持つことにより、同一１本鎖上で塩基対結合を形成することが一つの特徴である。１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸が、同一鎖上で塩基対結合させることによって得られる分子内塩基対結合生成物は、見かけ上２本鎖を構成する領域と、塩基対結合を伴わないループ構造の領域とを有する。すなわち、本発明における１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸とは、同一鎖上でアニールすることが可能な相補的な塩基配列を含み、そのアニール生成物は折れ曲がった部分に塩基対結合を伴わないループ構造を構成する１本鎖核酸と定義することができる。そして塩基対結合を伴わないループ構造には、相補的な塩基配列を持つプライマーがアニールすることができる。

（ループ構造の説明）
また、合成増幅物である鋳型核酸は、他分子との間のアニールではなく自己アニールを優先的に行うことが好ましく、相補的な配列である両領域の距離が不必要に離れないほうが望ましい。例えば、両領域の位置関係は、０から５００塩基分の距離を介して連続することが望ましい。その反面、両領域があまりにも接近している場合には望ましい状態のループの形成を行うには不利となるケースも想定されるため、適宜設定される。

図２−３（８）に示すループ構造を詳細に説明する。ループ構造は、新たなプライマー配列とのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う合成増幅反応が容易である構造であることが求められる。したがって、領域Ｆ２ｃ又はＲ２ｃと、その５’側に位置する領域Ｆ１ｃ又はＲ１ｃとの距離が、０から１００塩基、望ましくは１０から７０塩基となるように設計することが好ましい。上記特定の塩基配列を持つ核酸に対して、プライマーを構成する領域Ｆ２とＦ１ｃ又はＲ２とＲ１ｃは、通常は重複することなく連続して配置される。あるいは、もし両者の塩基配列に共通の部分があるのであれば、部分的に両者を重ねて配置しても良い。Ｆ２又はＲ２は鋳型核酸に結合する機能を有する必要があるため、これらの領域はプライマーにおいて常に３’末端となるようにしなければならない。一方Ｆ１ｃ又はＲ１ｃは、後に述べるように、これを鋳型として合成された相補鎖の３’末端にプライマーとしての機能を与える必要があるため、５’末端に配置する。このプライマーを合成起点として得られる相補鎖は、次のステップにおいては逆向きからの相補鎖合成の鋳型となり、最終的には本発明によるプライマー部分も鋳型として相補鎖に写し取られる。写し取られることによって生じる３’末端は塩基配列Ｆ１又はＲ１を備えており、同一鎖上のＦ１ｃ又はＲ１ｃにアニールするとともに、ループ構造を形成する。このループ構造は常に一本鎖の状態でもたらされるため、このループ構造に塩基対結合可能なプライマーを添加することにより増幅を加速しても良い。

本実施形態においては便宜上ＦやＲと記載しているが、以下Ｒ及びＦ双方に共通していえる点に関しては、Ｘとして説明する。

（反応要素の説明）
上記の増幅反応工程は、合成増幅に用いる核酸に対して、少なくともＦＡプライマー、ＲＡプライマー、アウトサイドプライマーＦ３、及びアウトサイドプライマーＲ３、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチドを加え、ＦＡプライマー及びＲＡプライマーを構成する塩基配列と相補的な塩基配列との間に塩基対結合を形成させ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートするだけで合成反応がなされる。

これらの増幅反応は、酵素として例えば鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、ＰＣＲのような温度変化を行う必要はない。したがって加温機構も簡便なシステムで済むという特徴がある。又は、プライマーのアニール効率を調整するために温度を変化させても良い。ここで各所の塩基対結合をもたらす条件は、例えば融解温度以下に設定することが一般的である。一般に融解温度は、互いに相補的な塩基配列を持つ核酸の５０％が塩基対結合した状態となる温度とされている。鋳型とすべき核酸が２本鎖である場合には、プライマーがアニールすることが可能な状態とすることが好ましい。一般に加熱変性が行われるが、これは反応開始前の前処理として行っても良い。この増幅反応は、酵素に適したｐＨを与える緩衝剤や酵素の触媒活性の維持やアニールのために用いる塩成分、酵素の保護剤、さらには必要に応じて融解温度の調整剤等を共存させた条件下で実施する。ｐＨ緩衝剤の一例として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものを用いても良い。ｐＨは用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の特性に応じて調整する。塩成分としてはＫＣｌ、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４等を、酵素の活性維持と核酸の融解温度調整のために適宜添加しても良い。酵素の保護のために、糖類やウシ血清アルブミンを用いても良い。さらに融解温度の調整には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）やホルムアミドが一般に利用される。これらを融解温度の調整剤として利用することによって、各プライマーのアニールを限られた温度条件の下で調整することが可能になる。さらに、天然の浸透性保護剤としてベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン）を利用することができる。これにより、Ｇ＋Ｃの塩基配列を多く含んだ領域の溶融温度を、Ａ＋Ｔの塩基配列を多く含んだ領域と同じ溶融温度に下げることができる。その他の融解温度調整剤として、プロリン、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド等が知られている。２本鎖ＤＮＡの不安定化をもたらすことによって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインの添加量は、反応液中０．２Ｍ〜３．０Ｍ、好ましくは０．５Ｍ〜１．５Ｍ程度である。これにより、本発明の核酸増幅反応の促進作用が期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するため、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切な反応を与える条件を経験的に設定し実施する。また、図７に示すように、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるｄＮＴＰ（デオキシヌクレオシド三リン酸）の他に伸長反応阻害物質としてｄｄＮＴＰ（ジデオキシヌクレオシド三リン酸）をある一定の濃度で含めても良い。含有するｄｄＮＴＰの濃度によって、増幅される鋳型の長さを制限することができる。例えば、高濃度のｄｄＮＴＰを含有することにより、増幅反応の初期にｄｄＮＴＰが取り込まれ伸長反応が停止する。ｄｄＮＴＰの濃度が薄い場合は、ｄＮＴＰが優先してポリメラーゼに取り込まれるため、ある程度増幅伸長してから伸長反応が停止される。必要な増幅産物長に応じて、ｄｄＮＴＰの濃度を調整することができる。

（プライマーの説明）
本発明におけるプライマーとは、相補的な塩基対結合を形成できること、そしてその３’末端において合成増幅反応の起点となる水酸基を与えること、の２つの条件を満たすものを意味する。合成増幅酵素によって反応し相補的な塩基結合を形成可能である形態であれば、ペプチド核酸や類似体であっても良い。本発明におけるプライマーは、反応の起点となるだけでなく、相補鎖合成の鋳型として機能するものであることが望ましい。

本発明におけるプライマーの種類は、アニール時の各プライマーの３’末端の領域が相互に異なっている少なくとも３種以上のプライマーを用いることができる。

したがって、アニールに必要な塩基配列を部分的に重複させることもできる。しかしながら、アニールに必要な領域が重複する場合にはプライマーの間で競合を生じるため、できるだけ相互に独立した領域に対してアニールできるようにプライマーの塩基配列を設計することが望ましい。さらに、核酸におけるアニールの対象となる領域についても、できるだけ重複しないようにプライマーの塩基配列を設計することにより、より迅速な合成反応を期待することができる。したがって、例えば鋳型核酸と、その鋳型核酸を鋳型として生成する増幅産物とを形成するには、少なくとも３種類以上のプライマーの組み合わせが必要である。

（固定プライマーの説明）
本発明によるプライマーを固定化させる場合、それ自身を固相に固定させておく。あるいは、プライマーの任意の部分をビオチンのような結合性のリガンドで標識しておき、これを固相化アビジンのような結合対象によって間接的に固相化しても良い。

固相として、例えばガラス基板、樹脂基板、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の天然高分子担体、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子担体、その他、金属コロイド、磁性粒子等の機能性粒子等が挙げられる。

プライマーの固定化手段は、上記に限定されるものではなく、公知のいずれかの手段を使用して良い。例えば、スポッティング法及び光固相化法等を使用しても良い。基板等には、プライマー等の核酸を固定化するために適切な表面処理、例えば、ポリＬリジン処理、アミノシラン処理及び酸化膜処理等の表面処理を行うことが可能である。所望の核酸プローブを固定化するための手段は、固相の材質により、公知のいずれかの手段を使用することができる。

ビーズ状の粒子を平面基板に固定化する場合には、それ自体公知のいずれの手段を使用しても良い。例えば、ビーズが磁性粒子であることが好ましく、あらかじめ所望の位置に磁石を固定化しておくことにより、磁力でビーズを固定することも可能である。また、ビーズ表面は、プローブを結合させた後、不活性化処理を行うことにより非特異的な結合を防止しておくことができる。この不活性化処理はサケ精子ＤＮＡ部分分解物、ランダムオリゴヌクレオチド、牛血清アルブミン等で処理する方法や、未反応の官能基をエタノールアミン等の公知の方法で処理することにより達成しても良い。

固定させるプライマーは、１種類以上のプライマーもしくは合成増幅反応を構成する全てのプライマーを固定しても良い。固定したプライマーと同じプライマーを、一部固定化せずに浮遊させた状態で反応を実施しても良い。固定化するプライマーは、目的によって使い分けても良い。少なくとも２つの領域Ｘ２及びＸ１ｃとで構成され、Ｘ２の５’側にＸ１ｃが連結されたオリゴヌクレオチドからなるプライマーを固定化すると、プライマーの延長線上には、一つ以上の核酸配列が増幅される。また、各種プライマーの一部を固定化しても良い。例えば、第１プライマーの一部を固定化し、さらに固定化しない第１プライマーを含んだ状態で増幅反応を実施しても良い。

（プライマーの詳細説明）
本発明に使用するプライマーの一例を、図２を用いて説明する。以下の説明では、仮にＲ２及びＲ１ｃからなる第１のプライマー（ＲＡ）、並びにＦ２及びＦ１ｃからなる第２のプライマー（ＦＡ）を用いて、本発明における鋳型ポリヌクレオチドを合成増幅する工程を例示する。以下の説明においては、第１のプライマー及び第２のプライマーを、それぞれ仮にＲＡ及びＦＡと名づける。第１のプライマーＲＡは、その３’末端において標的塩基配列を構成する一方の鎖の３’側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることができ、かつ第１のプライマーＲＡの５’側には、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備え、且つ固相に固定される。ＲＡの３’側の領域をＲ２、５’側の領域をＲ１ｃとする。一方、第２のプライマーＦＡは、その３’末端において前記第１のプライマーＲＡを起点とする伸長生成物における標的塩基配列の３’側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることができる塩基配列を備え、かつ第２のプライマーＦＡの５’側には、このプライマーを起点とする相補鎖合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備える。ＦＡの３’側をＦ２とし、５’側をＦ１ｃとする。さらにＲＡとＦＡの３’側と５’側を構成する各領域は、それぞれ次のような領域に対して相補的な塩基配列から構成される。
ＲＡの３’側（Ｒ２）： Ｒ２ｃ
ＲＡの５’側（Ｒ１ｃ）： Ｒ１
ＦＡの３’側（Ｆ２）： Ｆ２ｃ
ＦＡの５’側（Ｆ１ｃ）： Ｆ１
すなわち、ＲＡプライマーは標的塩基配列のＲ２ｃとＲ１によって、またＦＡは標的塩基配列におけるＦ２ｃとＦ１によってそのプライマー構造が決定される。

したがって、本発明においては、標的塩基配列は、少なくともその一部の塩基配列が明らかとなっているか、あるいは推測が可能な状態にある塩基配列であることが求められる。

塩基配列を明らかにすべき部分とは、ＲＡとＦＡの構造を決定する各領域、あるいはその相補的な塩基配列からなる領域である。例えば、核酸配列決定時には、増幅させたい標的配列に対し両端にＲＡ及びＦＡプライマーがアニール可能な塩基配列（例えば核酸アダプター１０４）を、ライゲーション反応等を用いて結合させることにより効率良く合成増幅反応を進めることが可能である。Ｒ２ｃとＲ１ｃ（又はＦ２ｃとＦ１ｃ）は、連続して存在しても良いし、離れて存在しても良い。両者の相対的な位置関係により、合成増幅物であるポリヌクレオチドが自己アニールしたときに形成されるループ部分の状態が決定される。ここで示す自己アニールとは、１本鎖ポリヌクレオチドの３’末端を含む領域が、そのポリヌクレオチド自身の相補的な塩基配列に対し塩基対結合を形成し、自身を鋳型とする合成増幅の起点となることを意味する。

ループ構造は、新たなプライマーとのアニールと、それを合成起点とする鎖置換を伴う相補鎖合成反応が容易に開始できる構造であることが望ましい。上記標的塩基配列に対してＲＡ及びＦＡを構成する領域Ｒ２とＲ１ｃ（又はＦ２とＦ１ｃ）は、通常は重複することなく連続して配置される。あるいはもしも両者の塩基配列に共通の部分があるのであれば、部分的に両者を重ねて配置しても良い。Ｒ２（又はＦ２）はプライマーとして機能する必要があることから、常に３’末端となるようにしなければならない。一方、Ｒ１ｃ（又はＦ１ｃ）は、後に述べるように、これを鋳型として合成された相補鎖の３’末端にプライマーとしての機能を与える必要があることから、５’末端に配置する。このオリゴヌクレオチドを合成起点として得られる相補鎖は、次のステップにおいては逆向きからの相補鎖合成の鋳型となり、最終的にはＲＡとＦＡも鋳型として相補鎖に写し取られる。写し取られることによって生じる３’末端は塩基配列Ｒ１（又はＦ１）を備えており、同一鎖上のＲ１ｃ（又はＦ１ｃ）にアニールするとともに、ループを形成する。

本発明に有用なプライマーには、前記２つの領域だけではなく、機能的な領域を付加しても良い。例えばＦ２とＦ１ｃとがそれぞれ３’末端と５’末端に配置され、その両者の間に任意の配列を付加させる。例えば、蛍光プローブを認識する配列を付加することにより、増幅後の工程に有利な機能をもたらしても良い。蛍光プローブを認識する配列を配置することにより、増幅反応完了後、核酸配列決定工程に移る前に蛍光プローブをハイブリダイズさせることにより、ハイブリダイズした蛍光プローブの数（検出としては、蛍光検知）によって増幅の度合いを確認することが可能になる。

（工程の詳細説明）
図２−１（１）
図１に示すような工程を実施し、合成増幅に用いる核酸を用意する。
図２−１（２）
まず、１本鎖とされた標的塩基配列におけるＸ２ｃに対し、固定化されたＲＡプライマーやＦＡプライマーのＸ２がアニールし、相補鎖合成が行われる。例えば８５〜１００℃程度に一旦加熱した後に、プライマーをアニールさせても良い。
図２−１（３）
ＲＡやＦＡプライマーを起点とする伸長生成物から、例えばアウトサイドプライマーＲ３やＦ３を使用して鎖置換伸長反応を行うことによってＲＡやＦＡプライマーを起点とする１本鎖を作製する。
図２−２（４）
そのＲＡやＦＡプライマーを起点とする１本鎖のＸ２ｃに、第１及び第２のプライマーであるＲ２やＦ２をアニールさせて相補鎖合成を行う。
図２−２（５）
相補鎖合成は、図２−１（３）で合成したＲＡやＦＡプライマーを起点とする伸長生成物の５’末端に達したところで終了する。図２−２（５）において合成される伸長生成物は、その３’末端にＲ１又はＦ１を備えている。この図２−２（５）において合成される伸長生成物から、例えばアウトサイドプライマーＲ３やＦ３を使用して鎖置換伸長反応を行うことによって１本鎖を作製する。
図２−３（６）
鎖置換伸長反応によって、両端にループ構造を形成可能な一本鎖核酸が得られる。
図２−３（７）
両端にループ構造を形成可能な一本鎖核酸は、３’末端において自身にアニールして相補鎖合成の起点となり、自身を鋳型とする相補鎖合成が行われる。
図２−３（８）
自身を鋳型に相補鎖合成がなされることにより、核酸配列読取の標的塩基配列とその相補鎖からなる１組の相補的な塩基配列を備え、それがハイブリダイズしたときには塩基対結合が可能なループを形成する。これらの構造において、その３’末端には、自身のＲ１ｃもしくはＦ１ｃに相補的な塩基配列からなるＲ１及びＦ１を備えている。Ｒ１及びＦ１は、図２−２（４）においてアニールしたプライマーのＲ１ｃ及びＦ１ｃを鋳型として合成された領域である。図２−３（８）の生成物が本発明における鋳型核酸である。ここで、固定化したＲＡプライマーの延長線上には、核酸配列読取対象となる相補的な配列１組が生成されている。
図２−４（９）
これら生成物のループには、固定化された第１のプライマーＲＡのＲ２や第２のプライマーＦＡのＦ２がアニールし、鎖置換反応による相補鎖合成が行われる。
図２−４（１０）
ＦＡ及びＲＡプライマーがアニールした生成物は、鎖置換によって１本鎖とされ、３’末端のＲ１及びＦ１は自身に自己アニールしてループ構造を形成する。そのループは相補鎖合成の起点となり、自身を鋳型とする相補鎖合成が行われる。元の生成物と固定化プライマーの延長上の生成物は上記相補鎖合成により解離する。

図２−５（１１）
解離後、自身を鋳型に相補鎖合成がなされる。その結果、図２−３（８）に示す２つの生成物と同じ生成物が合成される。さらに、核酸配列読取の標的塩基配列とその相補鎖からなる２組の相補的な塩基配列を備え、それがハイブリダイズしたときには塩基対結合を形成可能なループ構造をもつ生成物が、固定ＲＡプライマー上に１つと浮遊生成物として１つ合成される。
ここで、図２−３（８）と同じ生成物が得られることから、この生成物を元に再度合成反応が進む。このサイクルが繰り返されることにより標的塩基配列は増幅される。本実施形態においては、増幅される場合に、固定プライマーの延長線上には最大、標的塩基配列とその相補鎖からなる２組の相補的な塩基配列が得られる。この効果により、一つの標的塩基配列を元に増幅を実施した場合、増幅される単位面積当たりに得られる信号には上限が課せられ均一化される。また、ブリッジＰＣＲを行った場合、単位面積として固定化したプライマー４本に付き標的塩基配列が２つ、相補的な配列が２つ増幅される。本手法では、多くの固定化したプライマー上の生成物は図２−３（８）の左図、図２−５（１１）の右図に示す生成物が増幅される。したがって、標的塩基配列が４もしくは８本、相補的な配列が４もしくは８本に増幅される。例えば、図３に示すようにこれらに核酸配列決定用プライマー３０１をアニールし、伸長反応を行い光検出や水素イオン検知等を行う場合には２〜４倍の信号を得ることができる。また、得られる信号量の幅も２〜４倍に抑えることが可能である。

上記までに示した工程は、固定化するプライマーが１つでそのプライマー全てが固定されている例を示した。固定化するプライマーをＲＡ及びＦＡの２つのプライマーとし、ＲＡを全て固定化しＦＡは一部を固定化すると、固定プライマーの延長線上には反応要素の枯渇や失活しない限り制限なく複数組の相補的な塩基配列を得ることが可能である。これは、単位面積当たりにより多くの信号を得たい場合に有効である。その例を図２−５（１２）を用いて説明する。

図２−５（１２）
固定化するプライマーをＲＡ及びＦＡの２つのプライマーとし、ＲＡを全て固定化しＦＡは一部を固定化し合成反応を進めると、図２−１（１）から図２−５（１１）までと同様の反応が進む。固定化したＦＡプライマーの延長線上にも同様の生成物が合成されるのは明らかである。ここで、図２−５（１１）で生成される合成浮遊物にはＦ２ｃもしくはＲ２ｃのループ構造を有しているため、固定化されたＦＡもしくはＲＡプライマーがアニールする。図２−５（１２）には固定化したＦＡプライマーがアニールした状態を示すがＦＡプライマーのみに限定される訳ではなく、固定化したＲＡプライマーにおいても同様である。

図２−６（１３）
ＦＡプライマーがアニールした生成物は、鎖置換合成によって部分的に１本鎖となる。生成物とアニールしたＦＡプライマー自身は、生成物に対し相補的な配列を生成し延長上に二本鎖を形成する。この二本鎖の部分は、部分的に１本鎖となった３’末端を起点とする相補鎖合成により解離される。

図２−６（１４）
相補鎖合成により解離され、伸長反応が進んだ結果、浮遊する標的塩基配列とその相補鎖からなる４組の相補的な塩基配列と、固定したＦＡプライマーの延長線上に標的塩基配列とその相補鎖からなる２組の相補的な塩基配列が得られる。これら２つの生成物は、ＦＡプライマーによるさらなる鎖置換合成によって、標的塩基配列とその相補鎖からなる複数組の相補的な塩基配列が合成され、増幅が繰り返される。

固定化されたＲＡプライマーのＲ２がアニールし、相補鎖合成が行われることを図２−５（１１）まで示したが、逆鎖側のＦＡプライマーを固定化し、Ｆ２がアニールし、相補鎖合成が行われる工程も同様に実施される。したがって同様に、鎖置換伸長反応によって、ループを有する鎖伸長生成物が得られるとともに、前記ループにアニールした固定化した第２及び第１のプライマーを起点とする伸長生成物が置換されて、これらを元にさらに鋳型は増幅が繰り返される。

図４に、平面基板上に核酸が上記工程により増幅し、増幅産物が二次元的にクラスターを形成する態様を示す。図４（１）は、増幅反応を実施する平面基板４０１の一部を示す。平面基板４０１の表面には固定化プライマーが一面に敷き詰められている。そこへ鋳型核酸４０２やその他のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼが添加され合成増幅反応が開始される。図４（２）に示す矢印は、鋳型核酸が添加され合成増幅を開始する位置から増幅核酸が四方八方に拡散する向きを示す。図４（３）は、適切にコントロールされた温度下に合成増幅反応が行われ、平面的に核酸が広がっている態様を示す。増幅した核酸が形成するクラスター４０３は、鋳型核酸の配列と相補的な配列を含んでいる。図４（４）では、異なる鋳型核酸由来により合成増幅により広がったクラスター４０３が接触している態様を示す。接触している状態では、固定化プライマーには既に合成増幅された核酸が付与されているため、異なる鋳型を元に増幅した領域と交わる位置から広がることができない。よって、各反応成分が合成増幅反応によって枯渇するか、反応副産物によって反応が阻害されたり、酵素の失活等がない限り、敷き詰められた固定化プライマー上に増幅反応が広がる。

（増幅産物の説明）
本発明によって、固定プライマーの延長線上に増幅される核酸を構成する相補的な塩基配列の数は、少なくとも１つであり整数倍となることもある。この場合、本増幅法のループ形成配列により、理論的には、核酸を構成する相補的な塩基配列のペアの数に上限なく増幅することも可能である。

本発明によって、固定プライマーの延長線上に増幅される１本鎖上に相補的な塩基配列が交互に連結した核酸は、天然の核酸と同じ構造に限定されない。核酸合成酵素によって核酸を合成するときに、基質として核酸誘導体を利用することにより、核酸の誘導体の合成が可能であることは公知である。このような核酸誘導体の例として、放射性同位体で標識したヌクレオチドや、ビオチンやジゴキシンのような結合性リガンドで標識したヌクレオチド誘導体等が挙げられる。これらの核酸誘導体を用いることにより、生成物である核酸誘導体の標識が達成される。又は、蛍光性のヌクレオチドを基質として用いることによって、生成物である核酸を蛍光性の誘導体とすることもできる。この増幅産物は、ＤＮＡ又はＲＮＡでも良い。

（アウトサイドプライマーの説明）
次に、鋳型ポリヌクレオチドを合成するための反応における図２−１（３）の工程、すなわち図２−１（２）の工程で合成された、第１のプライマーＲＡ及び第２のプライマーＦＡを起点とする伸長生成物について、図２−２（４）におけるプライマーがアニールすべき領域を塩基対結合が可能な状態とするための工程を行うには、アウトサイドプライマーの利用が望ましい。図２−１（３）におけるＦ３及びＲ３を指し、アウトサイドプライマーとは、標的塩基配列に対してアニールする第１のプライマー及び第２のプライマーより上流に対して相補的な塩基配列からなるプライマーである。上流とは、鋳型における３’側を意味する。したがって、アウトサイドプライマーがアニールするのは、第１のプライマー及び第２のプライマーから見れば５’側の領域が上流となる。

アウトサイドプライマーは、任意の数でも良い。本発明において、一般的なアウトサイドプライマーは、第１のプライマー及び第２のプライマーのそれぞれに対して上流に相補鎖合成の起点を与えることができる２つのアウトサイドプライマーから構成される。しかし、いずれかの第１のプライマー及び第２のプライマーに対してのみアウトサイドプライマーを配置して、本発明の方法を実施することも可能である。あるいは、第１のプライマー及び第２のプライマーのそれぞれ、あるいは一方に対して、複数のアウトサイドプライマーを組み合わせることもできる。いずれにせよ、より上流からの相補鎖合成を伴う場合に、第１のプライマー及び第２のプライマーを合成増幅の起点とする反応の生成物を効率良く得ることが可能になる。

アウトサイドプライマーからの合成増幅は、第１のプライマー及び第２のプライマーを複製起点とする合成増幅よりも後に開始されることが好ましい。例えば、第１のプライマー及び第２のプライマーの濃度をアウトサイドプライマーの濃度よりも高くすることにより第１及び第２プライマーからの合成が優先される。例えば、２〜５０倍、望ましくは４〜１０倍の濃度差で各プライマーを用いることにより、第１のプライマー及び第２のプライマーからの相補鎖合成を優先的に行わせることができる。また、アウトサイドプライマーの融解温度を第１のプライマー及び第２のプライマーの融解温度より低く設定することによって合成のタイミングをコントロールしても良い。同様に自己アニールする箇所においても同様に考慮すべき点である。さらに、アウトサイドプライマーのアニールするタイミングについてcontiguous stackingと呼ばれる現象を応用しても良い（Chiara Borghesi-Nicoletti et al., Bio Techniques, 12, 474-477, 1992）。具体的には、アウトサイドプライマーを第１のプライマー及び第２のプライマーに隣接させる。そして、アウトサイドプライマー単独ではインキュベーションの条件下ではアニールできないように設計しておく。こうすれば、第１のプライマー及び第２のプライマーがアニールしたときに初めてアウトサイドプライマーのアニールが可能となるため、必然的に第１のプライマー及び第２のプライマーのアニールが優先される。上記の点を考慮することにより、確率的に理想的な反応条件を達成することが可能である。融解温度は、他の条件が一定であればアニールする相補鎖の長さと塩基対結合を構成する塩基の組み合わせによって算出することも可能である。したがって当業者は、本明細書の開示に基づいて望ましい条件を導くことができる。

（鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの説明）
上記反応に最も望ましい酵素は、鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼである。反応工程中には、必ずしも鎖置換型のポリメラーゼを必要としない反応ステップも含まれてはいる。しかし、合成増幅反応を行う試薬構成を簡素化するには、１種類のＤＮＡポリメラーゼを用いるのが最も好ましい。鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼとして、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社製）等が一般的に知られている。

上記の鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するＤＮＡポリメラーゼの必要とする触媒活性を持ち、構造等一部機能のみを取り出したものや、アミノ酸の変異等によって触媒活性、安定性、あるいは耐熱性を改変した各種変異体を用いても良い。各種変異体が配列依存型の相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する限り、本発明に利用することが可能である。

これらの酵素の中で最も本合成増幅に好ましい酵素としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼやＢｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素は、ある程度の耐熱性を持ち、触媒活性も高いという特徴がある。合成増幅反応は、好ましい態様においては等温で実施可能だが、融解温度の調整等のために必ずしも酵素が安定な温度条件で反応を実施するとは限らない。したがって、酵素が耐熱性であることは好ましい条件の一つである。また、等温反応が可能ではあるが、鋳型となる核酸の形態（例えば二本鎖ＤＮＡ）によって加熱変性が行われることが望ましく、その点においても耐熱性酵素の利用は反応条件の選択の幅を広げる。例えば、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性と共に高度な耐熱性を備えた酵素として知られている。また、このようなＤＮＡポリメラーゼによる鎖置換を伴う相補鎖合成反応は、１本鎖結合タンパク質を添加することによって促進されることが知られている（Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, July, 1998）。この効果を本発明に応用し、１本鎖結合タンパク質を添加することによって合成増幅の促進を実施しても良い。例えば、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼに対しては、１本鎖結合タンパク質としてＴ４ ｇｅｎｅ ３２が有効であることが知られている。

これらのＤＮＡポリメラーゼのうち、３’−５’エクソヌクレアーゼ活性を持たない酵素等は、合成産物の５’末端に達した部分で停止せず、１塩基突出させた状態まで合成が進むことは公知である。これは本増幅法において、合成が末端に至ったときの３’末端の配列を次の合成の開始点とするため、このような現象は好ましくない。しかし、ＤＮＡポリメラーゼによる３’末端への塩基の付加は、高い確率でアデニンを付加する。したがって、ｄＡＴＰが１塩基付加することを考慮し、予め３’末端からの合成がアデニンで開始するように塩基配列を設計することが好ましい。また、相補鎖合成時に３’末端がたとえ突出しても、突出部を消化して平滑末端とする３’→５’エクソヌクレアーゼ活性を利用しても良い。例えば、天然型のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼはこのような活性を持つことが知られており、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼと混合して反応することにより、この問題を回避しても良い。

（増幅反応後の洗浄工程）
上記に示す合成増幅反応によって得られる、固定化されたプライマー上に鋳型核酸の相補的な塩基配列が交互に連結された核酸には、例えば次のような有用性がある。第一には、増幅後に平面基板、もしくはビーズの洗浄を行った後に、固相上に増幅した核酸のみを用いる核酸配列決定における面積当たりの信号の強化である。

従来の並列化したサンプルの核酸配列決定方法では、固定化されたプライマー上において、鋳型核酸の相補的な配列のみ合成増幅されるが、本発明による増幅法では図２−１〜図２−６に示すように、相補的な配列のみならず、鋳型と同じ配列も合成増幅する。さらに、これらの合成増幅される配列は原理上、上限なく増幅されることもある。増幅工程終了後に、核酸配列決定工程に用いることも可能である。

増幅工程後に、核酸決定工程に必要な固定化されたプライマーの延長線上にある核酸以外の浮遊する合成生成物を取り除くため、洗浄を行う。増幅を行う平面基板の一例として図５を示す。平面基板は、試薬の置換が容易なフローセル容器５０１であることが好ましい。洗浄は、フローセル入口５０２より核酸配列決定工程に行われる反応を阻害しない溶液を流し込み、フローセル出口５０３から排出することが好ましい。洗浄液の一例を下記に示す。このような洗浄溶液で洗浄した後、核酸配列決定反応に用いる緩衝液で再度洗浄しても良い。

洗浄液の組成
１０×トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ５．０ｍＬ
２０％ＳＤＳ ５．０ｍＬ
５Ｍ ＮａＣｌ ０．５ｍＬ
ヌクレアーゼフリー水 ３９．５ｍＬ

これらの洗浄液は、図６に示す試薬分注ノズル６０１等により注ぎ込まれて洗浄が行われる。ここで、固定プライマーを搭載した容器例として図５に示す容器を示したが、これに限定されるものではない。反応容器のレーンは複数あってもかまわない。また、水素イオンを検出する核酸配列決定においては、容器底面が半導体チップ上の半導体センサになっている。例えば、半導体チップとしてＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社３１４、３１６、３１８チップ等が知られ、一塩基伸長時の反応副産物である水素イオンを検知することができる。半導体センサ上には、ビーズを半導体チップ上に捕捉したり半導体センサ上の固定化プライマーの面積を増やすことを目的として立体的なウェル構造を形成しても良い。

（３’末端の不活化及び蛍光プローブによる増幅状態の確認）
フローセル容器内で本発明の合成増幅反応を実施した後、固定化されたプライマーの延長線上の増幅産物３’末端からの再度の合成増幅反応が起きないように、不活化の処理として３’末端を加工することができる。例えば、図７の（２）に示すように、反応直後に伸長反応阻害物質としてｄｄＮＴＰを添加し、再度酵素反応を行うことにより増幅産物３’末端にｄｄＮＴＰを取り込み、伸長反応を停止する。又は、図７の（１）に示すように、増幅反応溶液にｄｄＮＴＰを初めから添加し、増幅反応実施中にｄｄＮＴＰを取り込むことにより伸長反応を停止させても良い。その他の例として、増幅反応後に３’末端にポリメラーゼが伸長反応を進めることのできない物質を付加しても良い。３’末端の不活化後に、核酸配列決定反応が実施される。

洗浄後もしくは３’末端不活化後に、合成増幅産物に対し相補的な塩基配列をもつ蛍光プローブをハイブリダイズさせ、合成増幅された産物量等を検出して望ましく反応が実施されたか否かを評価してから次の核酸配列読取工程に進んでも良い。例えば、合成増幅後に浮遊する増幅産物を一度洗浄し、合成増幅産物のループ構造に対して相補的な塩基配列をもつ蛍光プローブをハイブリダイズさせた後、図６に示す核酸配列読取時に用いる検出系を用いて光検出を行い、ある一定以上の信号が得られるか否かによって合成増幅反応工程が正しく実施されたか否かを確認する。合成増幅工程が不十分である場合は再度、増幅工程を実施しても良い。

（核酸配列決定工程）
フローセル容器内の鋳型となる固定化されたプライマー延長線上の増幅産物に対して、少なくとも核酸配列決定用プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチドを加え、最適な温度でインキュベートし、合成反応と、光検出もしくは水素イオン等の検出を繰り返して核酸配列決定がなされる。核酸配列決定用プライマーのみ事前に添加し、加熱冷却を行ってアニールしても良い。例えば、２分間９５℃で加熱した後、２分間３７℃に冷却及び静置する。又は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅法を応用しても良い（特許文献Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３５８，５６３、特許第４３４０５４３号公報、特許第５０８９４６６号公報）。例えば、核酸配列決定用プライマーとリコンビナーゼ因子とを接触させ、増幅産物に核酸配列決定用プライマーをアニールさせた後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鎖置換合成を行うことにより核酸配列を決定しても良い。リコンビナーゼ因子を用いて核酸配列決定用プライマーをアニールすることは、高温（例えば９５℃）に加熱することが不要であるため、そのような装備を備える必要がなくなるという利点を持つ。通常、増幅産物内に相補的な配列を有するがゆえに、コンパクトに折りたたまれる構造を持つ。しかし、加熱及び冷却による核酸配列決定用プライマーのアニールは、隣り合う増幅産物同士の絡み合いや、反応効率を低下させる可能性がある。リコンビナーゼ因子によりアニールの操作は部分的な解離のみ行われ、上記問題が回避される。

光検出の例を図６に示すと、光源６０２によって励起され、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸配列決定反応によりサンプルから発せられる蛍光等を対物レンズ６０３、ダイクロイックミラー６０４、フィルタ６０５、レンズ６０６等を経由し、例えばＣＣＤカメラ等の画像素子といった検出器６０７を用いて検出する。試薬溶液は試薬分注ノズル６０１を用いて、フローセル容器に注入される。核酸配列決定に適したプライマーとＤＮＡポリメラーゼ等を各レーンに注入し、酵素反応に適した温度でインキュベートし、合成増幅を行った鋳型に核酸配列決定用のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを結合させ、標識したＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各塩基の注入、蛍光検出等、標識部の削除、洗浄等を繰り返し行い、核酸配列決定反応を行う。核酸配列は、１塩基取り込みの反応が終わると、次の塩基が入ることにより取り込む順序が検出され、ＤＮＡ合成が逐次的に実行されることによって認識される。

一方、水素イオンの検出は、核酸配列決定反応用の半導体（ＣＭＯＳ）チップに無数のウェルが並べられ、ビーズ上で増幅した１本鎖ＤＮＡの鋳型とＤＮＡポリメラーゼを各ウェルに入れた後、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各塩基を順番に入れることにより、核酸配列決定反応を行う。初めの塩基取り込みの反応が終わると、次の塩基が入ることにより取り込む順序が管理され、ＤＮＡ合成が逐次的に実行されていく。ＤＮＡポリメラーゼ反応で生成した水素イオンが、ウェルの底にあるイオン感受性レイヤーに電荷を与え、その直下にある半導体センサであるイオンセンサがその電荷を電圧に変える。電圧変化はＣＭＯＳチップ内での計算により信号へと変換され出力されることによって配列が決定される（参考文献：特表２０１０−５１３８６９号公報）。

上記で取り上げた半導体センサであるイオンセンサとしてはしばしば、イオン感受性の電界効果トランジスタであるＩＳＦＥＴ（又はｐＨＦＥＴ）が用いられる。ＩＳＦＥＴは、慣用的には、（通常は「ｐＨ」として示される）溶液の水素イオン濃度の測定を容易とするが、イオンセンサとして以外に、温度センサ等も含まれる。また、いくつかの態様においては、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を直接測定しても良い。いくつかの態様において、ＰＰｉは、ＰＰｉ受容体の非存在下で測定しても良い。あるいは、反応副産物である無機リン酸（Ｐｉ）を測定しても良い。さらに、他の態様において、本明細書に示されるように、半導体センサは、副生成物のあらゆる組み合わせの変化、任意に他のパラメータを伴う組み合わせの変化を検出するものを含む。

これらの方式で標的核酸配列の読取が完了した後、その配列の相補的な核酸配列を読み取る場合は、核酸配列決定用プライマー３０１から伸長した核酸を加熱やホルムアミドといった変性剤を用いて解離させた後、相補的核酸配列決定用プライマー３０２を再度アニールさせ配列させる。

上記に示す核酸配列決定方法に本発明は限定されるものではない。核酸配列決定に使用する酵素は、鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼに限定されない。増幅後のＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応に限定されず、ライゲーション酵素を用いたライゲーション反応やハイブリダイゼーション等を用い、光検出もしくは水素イオンの検出といった増幅産物や反応副産物を検出する塩基配列決定方法を用いても良い。

図３は、配列決定反応において増幅産物に核酸配列決定用プライマー３０１が結合し、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進行する状態を示す図である。従来は、固定化されたプライマー１つに対し、核酸配列決定用プライマーが１つのみアニールし、一塩基伸長と共に信号を得ていた。しかしながら、本増幅法においては図３に示すように、固定化されたプライマー１つに対し、核酸配列決定用プライマーが２つアニールするため、図３に示す態様では理論上、従来の倍の信号を得ることが可能である。また、従来手法であるブリッジＰＣＲによる増幅では、固定化されたプライマー上には鋳型の相補的な配列もしくは同じ配列が１つのみ合成されるため、理論上固定化されたプライマー２つに鋳型の相補的な配列が１つと同じ配列が１つのみ合成増幅される。しかし、本増幅法では、理論上固定化されたプライマー２つには、鋳型の相補的な配列が１つ以上と、同じ配列が１つ以上合成増幅される。したがって、従来法に比べ、単位面積当たりに検出される信号がより強くなる。

このような特徴のある増幅産物は他の分析法にも有効である。例えば、ナノポアと呼ばれる、ナノメートルサイズの細孔を用いて、核酸や蛋白質等の高分子ポリマーを分析する方法である（Kasianowicz J.J.; Brandin E.; Branton D.; Deamer D.W.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 13770-13773）。検出の方式としては、封鎖電流方式、トンネル電流方式、キャパシタンス方式等が知られている。さらに、ナノポア入口に微小金属構造体を備え、表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering）効果を利用し、塩基配列の読取等を行う検出方法も用いることができる。

本発明を用いて得られる図３に示すような増幅した核酸を固相から切り離したものを試料として用いることにより、標的核酸の配列の２回分、相補鎖配列の２回分の信号を、一つの試料がナノポアを一度通過することで得ることができる。つまり、同じ配列を４回分析することによって精度の高い分析を可能とする。

本発明によって作製した解析対象は、既知の配列である各種プライマー配列と標的核酸配列もしくは相補的な配列が繰り返されて配置されている。つまり、解析したい配列の前後等に既知の配列が配置されるため、この配列を標準物質として扱っても良い。例えば、既知の塩基配列がＡＣＧＴである場合、そこから得られる電気信号の時間、変化量から各種の塩基を認識しても良い。

検出がラマン光スペクトルにより行われる場合は、各塩基のラマン光スペクトルのピークの波数情報等から各塩基を認識しても良い。ラマン光スペクトルで検出する場合、この既知塩基配列のラマンスペクトルもしくは一つ以上のピークから波数校正を行っても良い。波数校正とは、通常ラマン光スペクトルを分析する場合に、標準物質としてシリコン単結晶を測定し、シリコン単結晶の特徴であるラマン波長のピークを用いて、検出器のどの素子にどの波長の信号が得られるかを認識させることである。つまり、既知配列を有することにより、標準物質としてシリコン単結晶の測定を行わなくとも波数校正が可能になる。さらに、検出する前には、核酸を抽出する工程や増幅する工程に使用した試薬が混入することにより、得られる電流やキャパシタ、ラマン光といった信号にノイズとして影響がある。そこで、既知の配列の信号にかぶさってくるノイズの影響を把握し、ノイズ信号の除去を行うこと等により塩基配列のみから得られる信号を高精度に分析することも可能である。また、既知の配列によって得られる信号から、単一核酸配列によって得られる信号量や一塩基当たりのピーク形状、ピーク本数等の信号態様や通過速度の情報に基づいて演算処理を行い、標的配列を分析しても良い。ここで、既知配列の通過速度を知ることは大きな意味を持つ。例えば、同じ塩基配列が連なる時は同じ電気信号やラマンスペクトルが連続し、何塩基連続したかを判断する際に、各塩基の通過速度を用いることによって何塩基連続したかを解析することができる。既知配列による波数校正は、本手順に限定されるものではない。測定対象に既知の配列や物質を付加し、既知の配列や物質のラマン光スペクトルもしくは一つ以上のピークから波数校正を行うことができる。例えば、既知の配列をライゲーション反応によって付加しても良い。

さらに、本発明によって作製した解析対象は、一つの標的核酸配列を元に一本鎖上に「標的配列の相補鎖配列」と「標的配列」とを複製する。つまり、検出時には、間違いなく単一由来の配列を繰り返し検出することが可能であるため、繰り返し読み取った信号を各々照合して精度良く信号を演算処理し分析することが可能である。ここで、既知配列の通過速度を知ることは大きな意味を持つ。例えば、同じ塩基配列が連なる時は同じ電気信号やラマン光スペクトルが連続し、何塩基連続したかを判断する際に、各塩基の通過速度を用いることにより何塩基連続したかを解析することができる。

図３の増幅した核酸をそのまま分析に用いるには、増幅した核酸に適したナノポアを用意する必要がある。そこで、増幅した核酸を固相から解離させることが望ましい。解離させる方法の一例を図８に示す。核酸８０２に、固相８０１に固定化したＲＡもしくはＦＡのプライマー８０３を光架橋で結合させる。光反応によって架橋を生じるＤＮＡの光架橋剤（光クロスリンク剤）としてソラレンが古くから用いられている。ソラレンの光架橋反応は、核酸二本鎖中の５’−ＴＡ−３’配列に対して優先的に起こる。ソラレンは、光連結波長として３５０ｎｍ、光開裂波長として２５０ｎｍの光を照射することにより光架橋剤として使用することができる。又は、カルバゾール構造にビニル基が付加された特徴的な構造を光反応性の人工核酸塩基として有する核酸類（光架橋性核酸類）を使用する方法も知られている。核酸類は相補的な塩基配列を有する配列とハイブリダイズして二重らせんを形成することができ、形成した二重らせんに光照射を行うと、光架橋性核酸類の相補鎖における、本発明に係る光反応性の人工核酸塩基と対応して塩基対となるべき塩基から１塩基分だけ３’末端側にある塩基と光架橋を形成する。また、同様に光照射により解離する。なお、光架橋剤は上記の説明に限定されるものではない。

また、メチル化ＤＮＡ特異的制限酵素を用いても良い。例えば、メチル化したプライマーを固相に固定化させ、本発明による増幅を行った後に、メチル化ＤＮＡ特異的制限酵素を用いて固相から増幅した核酸配列を解離させる。メチル化ＤＮＡ特異的制限酵素の例としては、アルスロバクター・オキシダンス２５Ｋ由来のＡｏｘ ＩやＧｌａｃｉａｌ ｉｃｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＬ２４由来のＧｌｕ ＩやＫｏｃｕｒｅａ ｒｏｓｅａ ３０７由来のＫｒｏ Ｉ等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。このように、メチル化ＤＮＡプライマーを固相に配置し、解離される側の配列にメチル化ＤＮＡを付加した状態にした場合、既知の配列の信号検出の時にメチル化されたＤＮＡの信号も得ることが可能であり、それらを演算処理し高精度に塩基配列決定することも可能である。

その他の解離の方法として、アダプターに制限酵素の認識配列を用意し、制限酵素で切断しても良い。例えば、ＦＡプライマーのＦ２の配列に制限酵素認識配列を用意し切断する。その場合は、得られる信号は標的核酸の配列を１回分、相補鎖配列を１回分の信号が得られる。これは、全てのプライマーを固定せずに増幅を行った後に実施しても良い。

また、本発明による増幅産物は二本鎖を形成しやすいため、二本鎖を解離する条件として温度、ｐＨ、イオン強度の条件を設定するか、もしくはホルムアミド等の変性剤を用いてナノポアを通過させても良い。一本鎖に変性するための方法は、これらに限定されるものではない。

このようにプライマーを固定し、増幅反応、制限酵素や光照射による増幅産物の解離、ナノポア等を用いた検出により、同じ配列を複数回検出することができ、塩基の誤検出、塩基検出の見落としを防ぎ、精度の高い分析を可能とする。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、ある実施形態の構成の一部を他の実施形態の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施形態の構成に他の実施形態の構成を加えることも可能である。また、各実施形態の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。

１０１ 核酸
１０２ 断片化された核酸
１０３ 平滑化した核酸
１０４ 核酸アダプター
１０５ 合成増幅に用いる核酸
３０１ 核酸配列決定用プライマー
３０２ 相補的核酸配列決定用プライマー
４０１ 平面基板
４０２ 鋳型核酸
４０３ クラスター
５０１ フローセル容器
５０２ フローセル入口
５０３ フローセル出口
６０１ 試薬分注ノズル
６０２ 光源
６０３ 対物レンズ
６０４ ダイクロイックミラー
６０５ フィルタ
６０６ レンズ
６０７ 検出器
８０１ 固相
８０２ 核酸
８０３ プライマー

Claims (14)

1. 以下の４つの成分（１）〜（４）を混合し、インキュベートを行い、鋳型核酸を増幅させた後もしくは増幅中に、増幅産物の３’末端の不活化処理を行い、その後に、前記増幅産物に対し酵素を用いて伸長反応を行い、光検出又は水素イオン検出により核酸配列を決定する核酸の分析方法。
   （１）以下の特徴（ａ）〜（ｄ）を有する鋳型核酸、
   （ａ）少なくとも一対の相補的な塩基配列からなる標的塩基配列を有している。
   （ｂ）前記（ａ）の相補的な塩基配列がハイブリダイズしたときに、ループ構造を形成することができる。
   （ｃ）３’末端が自身にアニールしてループ構造を形成することができる。
   （ｄ）自身にアニールした３’末端は自身を鋳型とする相補鎖合成の起点になることができる。
   （２）鋳型核酸のループ構造において、相補鎖合成の起点を与えることができる少なくとも２種類のプライマーであって、そのうち少なくとも１種は固相に固定化されており、少なくとも１種は固相に固定化されていない前記プライマー、
   （３）鎖置換を伴う相補鎖合成をするためのＤＮＡポリメラーゼ、及び
   （４）相補鎖合成のための基質。
2. 前記固相が、天然高分子担体、合成高分子担体、金属コロイド、磁性粒子、ガラス基板又は樹脂基板である請求項１に記載の核酸の分析方法。
3. 前記鋳型核酸が、自身の塩基配列の任意の領域に対して相補的な塩基配列をその５’末端に備えている請求項１に記載の核酸の分析方法。
4. 前記鋳型核酸が、以下に示す工程によって生成される請求項１に記載の核酸の分析方法。
   ａ）標的塩基配列に、第１のプライマーをアニールし、そのアニールした前記第１のプライマーを起点として相補鎖を合成する工程であって、前記第１のプライマーは、その３’末端において標的塩基配列を構成する鎖の３’側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることができ、前記第１のプライマーの５’側には、このプライマーを起点として相補鎖を合成する反応によって生成される伸長生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備える、前記工程、
   ｂ）前記工程ａ）において合成された第１のプライマーを起点とする伸長生成物における第２のプライマーがアニールすべき領域を、塩基対結合が可能な状態とする工程であって、前記第２のプライマーは、その３’末端において前記第１のプライマーを起点とする伸長生成物における標的塩基配列の３’側を規定する領域に相補鎖合成の起点を与えることができる塩基配列を備え、前記第２のプライマーの５’側には、このプライマーを起点として相補鎖を合成する反応によって生成される伸長生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を備える、前記工程、
   ｃ）前記工程ｂ）において塩基対結合が可能となった領域に第２のプライマーをアニールし、そのアニールした前記第２のプライマーを起点として相補鎖を合成する工程、及び
   ｄ）前記工程ｃ）によって合成された第２のプライマーを起点とする伸長生成物の３’末端を自身にアニールさせ、自身を鋳型とする相補鎖を合成する工程。
5. 前記工程ｂ）及び／又は工程ｃ）において、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーの上流に相補鎖合成の起点を与えるアウトサイドプライマーからの相補鎖合成によって、第１のプライマー及び／又は第２のプライマーを起点とする伸長生成物を置換して１本鎖とする請求項４に記載の核酸の分析方法。
6. 前記工程ａ）が、ベタイン、プロリン、ジメチルスルホキシド及びトリメチルアミン−Ｎ−オキシドよりなる群から選択される少なくとも１種の融解温度調整剤の存在下で行われる請求項４に記載の核酸の分析方法。
7. 前記鋳型核酸を増幅させた後、浮遊物を洗浄除去し、増幅した前記鋳型核酸を起点として再度増幅反応を行う請求項１に記載の核酸の分析方法。
8. 前記増幅産物の３’末端の不活化処理が、増幅後に伸長反応阻害物質を結合させることにより行われる請求項１に記載の核酸の分析方法。
9. 前記伸長反応阻害物質が、ジデオキシヌクレオシド三リン酸である請求項８に記載の核酸の分析方法。
10. 前記増幅産物の３’末端の不活化処理が、増幅中に伸長反応阻害物質を取り込ませ反応を停止させることにより行われる請求項１に記載の核酸の分析方法。
11. 前記伸長反応阻害物質が、ジデオキシヌクレオシド三リン酸である請求項１０に記載の核酸の分析方法。
12. 前記増幅産物を標識することによって、増幅工程を管理する請求項１に記載の核酸の分析方法。
13. 前記酵素を用いた伸長反応が、リコンビナーゼ因子の存在下で行われる請求項１に記載の核酸の分析方法。
14. 前記核酸配列の決定において、既知の配列から得られる信号を元にノイズ除去及び／又は演算処理が行われる請求項１に記載の核酸の分析方法。

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